KR100191224B1 - C말단 아미드화에 관여하는 효소 - Google Patents

Abstract

일반식(I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체에 작용하여 일반식(II)의 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체를 생성하는 효소 및 일반식(II)의 화합물에 작용하여 일반식(III)의 C 말단 아미드화된 펩티드를 생성하는 효소.

상기식에서, A는 천연 α-아미노산으로부터 α-아미노기 또는 아미노기 및 α-카복실기를 제거시킴으로써 형성된 잔기를 나타내고, X는 수소원자이거나 카보닐기를 통하여 N 원자와 결합하는 아미노산 유도체의 잔기를 나타낸다.

Description

[발명의 명칭]

C 말단 아미드화에 관여하는 효소

[발명의 상세한 설명]

[기술분야]

본 발명은 펩티드 C 말단 글리신 부가체의 C 말단 아미드화에 관여하는 신규 한 효소, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다. C 말단 아미드화는 펩티드 C 말단 글리신 부가체를 이의 펩티드 C 말단 아미드화물로 전환시키는 어떤 단계를 촉진시키는 작용을 말한다.

[배경기술]

종래에 생체내 효소반응에 따른 펩타이드 C 말단 글리신 부가체(C 말단 잔기에 글리신이 펩티드 결합된 화합물)의 C 말단 아미드화에 관여하는 효소는 펩티딜글리신-α-아미디틴모노옥시게나제(펩타이드 C 말단 아미드화 효소) (EC. 1, 14, 17, 3)로 호칭되며(Bradbury 등, Nature, 298, 686, 1982 : Glembotski 등, J. Biol. Chem., 259, 6385, 1984) 다음과 같은 반응을 촉매작용하는 것으로 생각된다.

글리옥실산 생체내에서 아미드화 기전의 해명 및 재조합 DNA 기술에 따라 생산되는 펩티드를 C 말단이 아미드화되어 최초로 생리활성을 나타내는 펩티드류, 예를 들면 칼시토닌, 가스트린 등으로 생체 밖에서 전화시키는 방법으로 이용할만하며 본 효소를 정제하려는 시도가 수행되고 있다. 이와같은 효소의 예로서는 소 뇌하수체 중엽(Murthy 등, J. Biol. Chem., 261, 1815, 1986), 돼지 뇌하수체(Kizer 등, Endocrinology. 118, 2262, 1986 : Bradbury 등, Eur. J. Biochem., 169, 579, 1987), 돼지 심방(Kojima 등, J. Biochem., 105, 440, 1989), 아프리카 발톱 개구리 몸체 표피(Mizuno 등, Biochem. Biophys. Res. Commun., 137, 984, 1984), 래트 갑상선 종양(Mehta 등, Arch. Biochem. Biophys., 261, 44, 1988)으로부터 유래된 것이 보고되어 있다.

또한 이러한 정제효소를 다량으로 입수하는 것이 곤란하므로 최근 일반적으로 수행되어지는 재조합 DNA 기술을 사용하여 이들 효소 발현에 필요한 대응하는 cDNA의 단리 및 이들을 이용한 당해 효소를 제조하는 것을 시도하고 있다. 예를 들면, Eipper B. A. 등은 문헌[참조: Mol. Endocrinol 1, 777 내지 790, 1987]에서 Ohsuye, K 등은 [참조: Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 1275 내지 1281, 1988]에서 Stoffers, D. A. 등은 문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. VSA, 86, 735 내지 739, 1989]에서 그리고 Glauder, J. 등은 문헌[참조: Biochem. Biophys. Res. Commun, 169, 551 내지 558 1990]에서 각자 소의 하수체, 개구리 피부, 래트의 심방 및 사람의 갑상선 세포 유래의 펩티드 C 말단 아미드화 효소 cDNA를 공표하고 있으며 또한 이의 생산성에 대해서 반드시 만족할 수 있는 것은 아니지만 개구리 유래 및 소 유래의 cDNA를 이용한 재조합 DNA 기술을 이용한 펩티드 C 말단 아미드화 효소의 생산 실시예도 공지되어 있다(예: 일본국 공개특허공보 89-104168호, 국제공개공보 제 WO89/02460호 및 Perkins 등, Mol. Endocrinol. 4, 132 내지 139, 1990).

한편, 이러한 단백질은 각각의 채취방법 등의 상이함에 따라 소 유래의 것이 38, 42 또는 54KDa의 분자량, 개구리 유래의 것이 39KDa의 분자량, 래트에서는 41, 50 또는 75KDa의 분자량을 갖는다고 보고되어 있으며 예를 들면, 상기한 Bradbury 등의 문헌, Ramer 등의 문헌[참조: J. Am. Chem. Soc., 110, 8526-8532 (1988)] 및 Young 등의 문헌[참조: J. Am. Chem. Soc., 111, 1933-1934 (1989)]에서 반응 중간체의 존재도 시사되고 있다. 그러나 현재에는 이러한 중간체의 단리 및 이의 중간체와 아미드화 효소의 관계를 명백하게 나타낸 예는 없다.

상기한 바와 같이 펩티드 C 말단 아미드화 효소는 생체내에서 대단히 흥미를 끄는 작용을 나타내며 특정한 생체기관에서 유래하는 일정한 순도를 갖는 조성물도 공지되어 있다. 그러나 이러한 조성물을 생체외에서 펩티드 C 말단 아미드화물의 생산에 사용하는데는 이의 순도 및 안정성과 함께 제조원가의 면에서 충분하다고 할 수 없다. 본 발명자들은 이러한 과제를 해결하는데는 당해 효소에 관한 기초적 견해의 수집, 즉 C 말단 아미드화 반응을 수행하는 반응 기전을 해명할 필요가 있다고 생각되며 중간생성물의 단리를 시도한 바, 중간체를 단리하여 구조결정을 하는데 성공했다. 그 결과, 펩티드 C 말단 아미드화 반응은 종래에 고찰된 바와 같은 1단계의 반응은 아니며 중간체(대응하는 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체)를 개재시킨 2 단계의 반응인 것을 발견했다. 따라서 각각의 반응에서 촉매인 효소를 적당한 조건으로 개별 또는 조합시켜 사용하면 펩티드 C 말단 글리신 부가체의 대응하는 아미드화물로 전환되는 것을 효율적으로 실시할 수 있는 것이 예측되므로 이러한 효소를 제공하는 것이 요망된다. 또한 이들 효소의 존재가 확인될 수 있는 경우에는 이러한 효율적 제조방법을 제공하는 것도 요망된다.

[발명의 개시]

본 발명에 따르면 하기 일반식(I)의 C 말단 글리신 부가체에 작용하여 하기 일반식(II)의 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체를 생성하는 효소(이하, 효소 I로 호칭한다) 및 하기 일반식(II)의 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체에 작용하여 하기 일반식(III)의 C 말단 아미드화물과 글리옥실산의 생성에 관여하는 효소(이하, 효소-II 로 호칭한다)를 제공한다.

상기식에서,

A는 천연의 α-아미노산으로부터 유래한 α-아미노기 또는 이미노기 및 α-카복실기 이외의 잔기이며,

X는 수소원자 또는 카보닐기를 개입시켜 N 원자와 결합하는 아미노산 유도체의 잔기이다.

또한 일반식(I), (II) 및 일반식(III)의 형태내의 수소 원자(H)는 A가 α-이미노기를 갖는 α-아미노산으로부터 유래하는 경우에는 수소원자를 갖지 않는 것을 의미한다.

이러한 효소를 개별적으로 또는 조합시켜 사용함으로써 일반식(I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체에서 일반식(III)의 대응하는 펩티드 C 말단 아미드화물로 전환되는 것을 효율적으로 실시할 수 있게 된다.

또한 본 발명에 따르면 특정한 리간드를 담체로 하는 기질 친화성을 사용하여 상기한 효소 함유물로부터 이러한 효소를 제조하는 방법 및 이러한 효소 활성 폴리펩티드를 암호화한 cDNA를 이용하여 각각의 효소를 효율적으로 제조하는 방법이 제공된다.

또한 본 발명은 상기한 효소 활성을 측정하는 방법 및 이러한 효소 함유물의 탐색방법을 제공한다.

또한 본 발명은 말로부터 유래하는 상기한 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 cDNA를 제공한다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 FGFG를 기질로 하고 본 발명의 효소-I을 사용하여 FGFhyG를 제조할 때의 HPLC 패턴이며(본 명세서 및 도면에서 아미노산 서열을 1 문자로 표시하는 경우에 각 부호는 당해 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미이며 hyG는 α-하이드록시 글리신이다),

제2도는 제조된 FGFhyG의 분자구조를 확인하기 위해 수행하는 FAB-MS 스펙트럼 분석의 결과이며,

제3도는 Mono Q 칼럼 크로마토그래피에 따른 본 발명의 효소-I과 효소-II의 분리를 도시한 크로마토그래피 패턴이며(완전 4각의 플로트는 효소-II의 활성을 나타내며 흑색 원의 플로트는 효소-I의 활성을 나타내고 파선은 염화나트륨의 직선농도 구배 이다),

제4도는 FGFhyG를 기질로 하고 본 발명의 효소-II를 사용하여 FGF-NH₂를 제조할 때에 경시적인 HPLC 패턴이며,

제5도는 사람, 말, 소, 래트 개구리로부터 클로닝된 펩티드 C 말단 아미드화 효소 cDNA에서 추정된 아미노산 서열을 1 문자 표시로 나타낸 것이며,

제6도는 래트 하수체 mRNA로부터 클로닝된 C 말단 아미드화 효소 cDNA의 염기 서열 및 이에 따라 추정된 아미노산 서열을 나타낸 것이며,

제7도는 래트 하수체 mRNA로부터 클로닝된 5개의 C 말단 아미드화 효소 cDNA를 모식적으로 도시한 것이며[추정된 효소가 암호화된 영역을 박스로 나타내며 숫자는 번역 개시점을 1로한 염기수(bp)이며 TM은 막관통 영역에 대응하는 부분을 나타내며 KK는 라이신-라이신 서열을 나타내며 제한효소는 각각 아래의 약호이다.

B (BamH I), N (Nsi I), RI (EcoR I), RV (EcoR V),

S (Sph I), X (Xma I)],

제8도, 제9도, 제10도는 각각 플라스미드 SV-a, SV-b, SV-203에 따라 발현된 효소의 세파클릴 S-200 칼럼 크로마토그래피 패턴을 도시한 것이며,

제11도, 제12도는 PheGlyPheGly를 기질로 할 때의 α-하이드록실글리신체, C 말단 아미드화체를 생산할 때의 경시변화를 도시한 것이며,

제13도는 단리된 말 유래의 펩티드 C 말단 아미드화 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화한 cDNA 내에서 가장 긴 cDNA 단편의 염기서열 및 여기에 암호화된 아미노산 서열을 1 문자 표시로 나타낸 것이며,

제14도 및 제15도는 각각 상이한 제한효소로 분해시켜 프로브로서 사용한 래트 유래의 펩티드 C 말단 아미드화 효소를 암호화한 cDNA 일부의 염기서열이다.

[발명을 실시하기 위한 최상의 형태]

본 발명에서 일반식(I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체, 즉 본 발명의 효소 기질로서는 일반적으로 상기식의부분이 천연 또는 합성인 아미노산 유도체류, 특히 펩티드 또는 단백질류로부터 유래하고 이의 C 말단 아미노산 잔기[-H(H)-A-CO-로 나타낸다]에 글리신이 펩티드 결합된 화합물을 열거할 수 있다. 이러한 C 말단 아미노산 잔기로서는 천연의 α-아미노산, 특히 단백질 구성 아미노산, 예를 들면, 글리신, 알라닌과 같은 지방족 아미노산; 발린, 로이신, 이소로이신과 같은 측쇄 아미노산; 세린, 트레오닌과 같은 하이드록시아미노산; 아스파라긴산, 글루타민산과 같은 산성 아미노산; 아스파라긴, 글루타민과 같은 아미드; 라이신, 하이드록시라이신, 아르기닌과 같은 염기성 아미노산; 시스테인, 시스틴, 메티보닌과 같은 황 함유 아미노산; 페닐알라닌, 티로신과 같은 방향족 아미노산; 트립토판, 히스티딘과 같은 복소환식 아미노산; 프롤린, 4-하이드록시프로린과 같은 이미노산에 유래하는 잔기를 열거할 수 있다. 또한 이러한 아미노산 잔기인 α-아미노기 또는 이미노기에 결합된 수소원자 또는 아미노산 유도체의 잔기[X-로 나타낸다]인 당해 잔기로서는 단일 아미노산 또는 α-아미노기를 개재시켜 펩티드 결합을 할 수 있는 펩티드류인 경우 이의 구성 아미노산 잔기의 종류 및 펩티드의 쇄 길이에 제한이 없으며 또한 이의 구성 아미노산 잔기에 인산이나 당 또는 기타 치환기가 공유 결합되어도 양호하며 또한 지방질과 복합체를 형성해도 양호하다. 상기한 치환기의 구체적인 것으로는 각각의 아미노산 잔기에 대응하여 아르기닌 잔기인 구아니딘기에선 치환하는 기, 예를 들면, 메틸기 또는 에틸기 등의 알킬기 또는 아데노신2인산리보스, 시트룰린 또는 오르니틴으로부터 유래하는 잔기; 라이신 잔기인 ε-아미노기에서 치환하는 기, 예를 들면, 글루코실기, 피리독실기, 비오티닐기, 리포일기 또는 아세틸기 또는 인산, δ-수산기를 갖는 화합물, δ-글루코실기를 갖는 화합물, 글루탈알데히드 또는 무수 시트라콘산에서 유래하는 잔기; 히스티딘 잔기인 이미다졸기에서 치환하는 기, 예를 들면, 메틸기, 인산기 또는 요오드 원자 또는 플라빈에서 유래하는 잔기; 프롤린 잔기에서 치환하는 기, 예를 들면, 수산기, 이수산기 또는 글리코실옥시기, 페닐알라닌 잔기인 벤젠환에서 치환하는 기, 예를 들면, 수산기 또는 글리코실옥시기; 티로신 잔기인 수산기에서 치환하는 기, 예를 들면, 글리코실옥시기, 설폰산기, 요오드 원자, 브롬 원자이거나 염소원자 또는 수산기를 갖는 화합물, 비스에테르, 아데닌, 우리신 또는 RNA(리보헥산)에서 유래하는 잔기; 세린 잔기인 수산기에서 치환하는 기, 예를 들면, 메틸기, 글리코실기, 포스포판테테인기, 아데노신2인산리보실 또는 인산기, 트레오닌 잔기인 수산기에서 치환하는 기, 예를 들면, 글리코실기, 메틸기 또는 인산기; 시스테인 잔기인 SH 기에서 치환하는 기, 예를 들면, 글리코실기, 시스티닐기, 데하이드로알라닐기 또는 셀렌원자 또는 글루타민산, 아스파라긴산 또는 글루타민산 잔기인 카복실기에서 치환하는 기, 예를 들면, 메틸기, 글리코실기는 γ-카복실기이고, 아스파라긴 또는 글루타민기의 아미드기에 치환한 기, 예를 들면, 글리코실기, 피롤리디닐기 또는 이미노기 등을 열거할 수 있다.

상기한 기질로서의 펩티드 C 말단 글리신 부가체, 즉 C 말단 잔기에서 글리신이 펩티드 결합된 펩티드 또는 이의 유도체는 천연에서 추출한 것도 화학합성에 따라 생산한 것도 또한 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산해도 양호하다. 따라서 본 발명의 기질 일반식(I)의 화합물로서는 펩티드류, 예를 들면, 아미노산 잔기의 수가 2 내지 100 정도인 펩티드, 카제인, 프로테인키나제, 아데노바이러스 EIA 단백질, RAS 단백질 등으로 대표되는 인산펩티드 및 이의 가수분해물, 트롬보플라스틴, α₁리보단백질, 리보비테린 등으로 대표되는 리보단백질 및 이의 가수분해물, 헤모글로빈, 미오글로빈, 헤모시아닌, 클로로필, 피코시아닌, 플라빈, 로돕신 등으로 대표되는 금속 단백질 및 이의 가수분해물, 콜라겐, 라미닌, 인터페론 α, 세로글리코이드, 아비딘 등으로 대표되는 당단백질 및 이의 가수분해물과 함께 기타 C 말단 카복실기가 아미드화되어 성숙형의 생리활성 펩티드, 예를 들면, 칼시토닌, 세크레틴, 가스트린, 혈관 작용성 소장 펩티드(VIP), 콜레시스토기닌, 셀루레인, 췌장 폴리펩티드, 성장 호르몬 방출인자, 부신 피질 자극 호르몬 방출인자, 칼시토닌 유전자 관련 펩티드 등을 형성하는 펩티드류 각각의 C 말단 글리신 부가체(즉, C 말단 카복실기와 글리신의 아미드 결합 화합물)를 열거할 수 있다. 이중에서 본 발명의 효소의 효소활성을 확인하기 위해 바람직한 기질로서는 예를 들면, D-티로실발릴글리신, D-티로실트립토파닐글리신, 글리실페닐알라닐글리실, 페닐알라닐글리실페닐알라닐글리신, D-티로실로이실아스파라기닐글리신, 아르기닐페닐알라닐글리신, 아르기닐알라닐아르기닐로이실글리신, 로이실메티오닐글리신, 글리실로이실메티오닐글리신, 페닐알라닐글리실로이실메티오닐글리신, 아스파라기닐아르기닐페닐알라닐글리신, 트립토파닐아스파라기닐아르기닐페닐알라닐글리신, 알라닐페닐알라닐글리신, 라이실알라닐페닐알라닐글리실, 세릴라이실알라닐페닐알라닐글리신, 아르기닐티로실글리신, 글리실메티오닐글리신, 글리실티로실글리신, 글리실히스티딜글리신, 히스티딜글리실글리신, 트립토파닐글리실글리신 및 글리실시스테이닐글리신 등을 열거할 수 있다(또한, 글리신을 제외하고 D-라고 특별히 표시하지 않은 것은 L-형을 나타낸다). 한편, 본 발명의 효소를 유효하게 이용하는데 바람직한 기질로서는 상기한 C 말단 카복실기가 아미드화되어 형성된 성숙형의 생리활성 펩티드이다. 이러한 C 말단 카복실기에서 글리신이 펩타이드 결합된 펩티드류를 열거할 수 있다.

본 발명의 효소-I은 상기한 기질에 작용하여 하기 일반식(II)의 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체를 생성시킬 수 있다.

상기식에서,

부분의 구체적인 예는 상기 일반식(I)에 대해서 정의한 바와 같은 의미를 갖는다.

일반식(II)의 화합물은부분에 악영향을 미치지 않는 조건하에서 가수분해하거나 하기한 본 발명의 효소-II로 처리함으로써 대응하는 C 말단 아미드화물로 전환시킬 수 있다.

또한 상기한 효소-I 은 각각 기원에 따라 상이하며 예를 들면, 겔 여과를 사용하는 분자량 결정법에 따르면 하기한 당해 효소활성 함유물로부터 분리 정제하면 말에서 약 25킬로달톤(KDa)이며 래트는 약 36KDa의 분자량을 갖는다. 또한 본 발명의 cDNA를 이용하여 생산되는 당해 효소의 분자량은 경우에 따라 부가염기서열에서 유래하는 아미노산 서열을 수반하므로 동등하거나 약간 큰 분자량을 갖는다. 즉, 당해 분자량은 자체 공지된 겔 여과법[예: 세이카가쿠짓켄고자 5, 고소갠큐보, 상권, 283 내지 298 페이지, 도쿄가가쿠도진(1975)]에 따라 결정할 수 있다. 구체적으로는 100mM의 염화칼륨을 함유하는 50mM의 트리스-염산(pH 7.4)을 평형화 및 용출액으로서 사용하며 도요팔 HW-55S (도소사 제품)에서 겔 여과를 수행하며 β-아밀라제 (M.W. 200,000), 알코올데하이드로게나제(M,W. 150,000), BSA (M.W. 66,000), 카보닉안하이드라제(M.W. 29,000) 및 시토크롬 C (M.W. 15,400)을 지표로서 결정한다.

본 발명의 효소-I은 기원에 따라 상이하지 않으며 하기의 이화학적 성질에 따라 특정화된다. 즉,

(a) 적절한 pH가 약 5 내지 7인 동시에 안정된 pH가 4 내지 9이며,

(b) 작용 적정온도가 25 내지 40℃의 범위이며,

(c) 금속이온 및 아스코르브산을 보인자로 한다.

상기한 (a) 및 (b)의 성질은 통상적으로 사용되는 완충액이며 구체적으로는 트리스-염산, 메스-수산화칼륨, 테스-수산화나트륨, 헤페스-수산화칼륨 완충액을 사용하여 측정한다. 또한 본 발명의 효소 조성물은 1℃ 내지 55℃의 온도범위 내에서 상기한 반응의 촉매로서 작용하며 56℃에서는 약 10분 동안에 활성을 잃고 40℃ 부근에서도 활성을 약간 잃는 것이 보여진다.

금속 이온으로서는 Cu²⁺, Zn²⁺, Ni²⁺, Co³⁺, Fe³⁺등이 적당하며 특히 Cu²⁺, Zn²⁺가 바람직하다.

본 발명은 또한 하기의 또다른 1종의 효소도 제공한다. 즉, 상기식(II)의 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체에 작용하여 하기 일반식(III)의 펩티드 C 말단 아미드화물과 글리옥실산을 생성시키는 효소-II가 제공된다.

상기식에서, A 및 X는 전술한 바와 같다.

이러한 효소도 또한 그 기원에 따라 분자량은 상이하지만 하기한 당해 효소 활성 함유물로부터 분리 정제하는 경우에 예를 들면, 겔 여과를 이용하는 분자량 결정법에 따르면 말에서 약 40KDa이며 래트에서 약 43KDa의 분자량을 갖는 펩티드 C 말단 글리신 부가체의 C 말단 아미드화에 관여하는 효소이다. 또한 cDNA를 이용하여 생산하는 당해 효소의 분자량은 효소-I와 동일하게 약간 큰 경우도 있다. 이 효소가 특정하게 사용되는부분의 의미는 효소-I의 특정하게 사용된 것과 동일하다. 또한 효소-II의 효소활성을 확인하기 위해서 바람직한 기질로서는 상기한 효소-I에 대해서 구체적으로 열거한 기질에 대응하는 C 말단 α-하이드록실글리신화물을 열거할 수 있다. 예를 들면, 이의 구체적인 것으로서는 D-티로실발릴 α-하이드록시글리신, D-티로실트립토파닐 α-하이드록시글리신, 글리실페닐알라닐 α-하이드록시글리신, 페닐알라닐글리실페닐알라닐 α-하이드록시글리신, D-티로실로이실아스파라기닐 α-하이드록시글리신, 아르기닐알라닐아르기닐로이실 α-하이드록시글리신, 로이실메티오닐 α-하이드록시글리신, 글리실로이실메티오닐 α-하이드록시글리신, 페닐알라닐글리실로이실메티오닐 α-하이드록시글리신, 아스파라기닐아르기닐페닐알라닐 α-하이드록시글리신, 트립토파닐아스파라기닐아르기닐페닐알라닐 α-하이드록시글리신, 알라닐페닐알라닐 α-하이드록시글리신, 라이실알라닐페닐알라닐 α-하이드록시글리신, 세릴라이실알라닐페닐알라닐 α-하이드록시글리신, 아르기닐티로실 α-하이드록시글리신, 글리실메티오닐 α-하이드록시글리신, 글리실티로실 α-하이드록시글리신, 글리실히스티딜 α-하이드록시글리신, 히스티딜글리실 α-하이드록시글리신, 트립토파닐글리실 α-하이드록시글리신 및 글리실시스테이닐 α-하이드록시글리신 등을 열거할 수 있다. 또한 효소-II는 기타 이화학적 성질로서 다음의 성질을 보유함으로써 특정된다. 즉,

(a) 적절한 pH가 약 5 내지 6인 동시에 안정된 pH는 4 내지 9이며,

(b) 작용 적정온도가 15 내지 35℃의 범위이다.

상기한 (a) 및 (b)의 성질은 통상적으로 사용하는 완충액이며 구체적으로는 트리스-염산, 메스-수산화칼륨, 테스-수산화나트륨, 헤페스-수산화칼륨 완충액을 사용하여 측정한다. 또한 본 발명의 효소 조성물은 1℃ 내지 55℃의 온도범위 내에서 상기한 반응의 촉매로서 작용하거나 56℃에서는 약 10분 동안에 활성을 잃고 40℃ 부근에서도 활성을 약간 잃는 것을 볼 수 있다.

[효소의 제조]

상기에서 설명한 본 발명의 효소-I 및 효소-II는 당해 효소활성 함유물로부터 자체 공지된 효소의 분리정제법에 따라 제조할 수 있으며 바람직하게는 본 명세서에서 개시한 하기한 본 발명의 제조방법에 따라 수득할 수 있다. 즉, 효소-I 또는 효소-II의 효소활성 함유물을 상기식(I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체를 리간드로 하는 기질 친화성 크로마토그래피 및 음이온 교환 크로마토그래피로 처리함을 특징으로 하는 효소-I 또는 효소-II의 제조방법을 이용할 수 있다.

본 방법에서 사용하는 효소활성 함유물은 본 발명의 효소를 함유하는 것이면 모두 대조하는데 사용할 수 있으며 천연적으로 발견되거나 인공적으로 제공되는 어떠한 것도 양호하다. 일반적으로 천연에서 발견되는 것으로서는 이러한 효소활성을 갖는 생물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 양, 토끼, 염소, 래트 및 마우스 등의 포유류, 닭, 들닭 및 카와라 비둘기 등의 조류, 돌거북, 살모사, 방울뱀 및 코브라 등의 파충류, 영원, 아프리카 발톱개구리, 소개구리 및 두꺼비 등의 양서류, 칠성장어, 장님뱀장어, 기름상어, 쉬비레 홍어, 나비 상어, 청어, 연어, 뱀장어, 범복, 도미 등의 어류, 원형무늬 바퀴벌레, 누에나방, 초파리 및 꿀벌 등의 곤충에 유래하는 제조물을 열거할 수 있다. 이와 같이 바람직한 제조물의 구체적인 것으로서는 포유류의 뇌, 하수체, 위, 심장 및 간장 등의 기관에 유래하는 균질화 물과 함께 혈액 및 림프액 등의 체액 등을 함유하는 생물학적 유체를 열거할 수 있다.

즉, 상기한 바와 같은 본 효소를 갖는 생물학적 유체를 하기 일반식(I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체를 리간드로 하는 기질 유사체 친화성 크로마토그래피를 사용하여 필요에 따라 효소의 정제에 통상적으로 사용된다.

상기식에서,

A 및 X는 상기한 바와 같이 동일하다.

(1) 침전에 따른 분획

(2) 헤파린 친화성 크로마토그래피

(3) 투석, 겔 여과 등에 따라 분자량 분획방법 및/또는

(4) 이온 교환 크로마토그래피를 조합시켜 사용함으로써 본 발명의 효소(효소-I 및 효소-II)를 수득할 수 있다.

상기한 리간드로서는 상기 일반식(I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체이면 모두 사용할 수 있지만 상기한 효소 활성을 확인하기 위해 바람직한 것으로서 구체적으로 열거한 글리신을 포함하여 2 내지 6개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드류를 열거할 수 있다. 이중에서 D-Tyr-Trp-Gly, Phe-Gly-Phe-Gly 및 Gly-Phe-Gly가 보다 바람직하며 Phe-Gly-Phe-Gly를 리간드로 하거나 본 발명의 효소(본 효소로 호칭한다)에서 강한 친화성을 갖기 때문에 특히 바람직하다.

이러한 리간드는 통상적으로 수불용성 담체에 결합시켜 사용하지만 리간드로서 사용하는 펩티드의 C 말단 글리신 잔기의 카복실기는 유리상태인 것이 본 효소와의 결합에서 중요하며 N 말단의 아미노산 잔기의 아미노기를 개재시켜 담체와 결합시킬 필요가 있다. 즉, 담체로서는 펩티드의 아미노기와 결합할 수 있는 것이면 어떤 것도 양호하며 또한 아미노기와 반응하는 활성기를 담체에서 화학적으로 도입시키거나 이미 도입된 시판하는 담체를 사용해도 양호하다. 화학적으로 도입시키는 방법은 일반적으로 사용되는 방법으로 좋으며 예를 들면 문헌[참조: 세이가카쿠짓켄보 제5권 상권 257 내지 281 페이지 가사이저도쿄가가쿠도진(1975)]에 기재되어 있는 바와 같이 예를 들면, 아가로스에 브롬화시안을 사용하여 이미드카복실기를 도입한다. 시판되는 활성화 담체는 기재를 지표로 하면 예를 들면, 아가로스계, 셀룰로스계, 친수성 폴리비닐계 등이 있으며 이들 어떤 것을 사용해도 상관없다. 아가로스계 담체로서는 리간드의 아미노기와의 결합방법에서 CNBr 법을 사용하는 CNBr 활성화 세팔로스 4B (파마시아사제), 카보이미드법을 사용하여 CH-세팔로스 4B, ECH-세팔로스 4B (이상, 파마시아사제), 아피겔 10, 아피겔 15 (이상, 바이오라드사제), 트레실클로라이드법을 사용하는 트레실 활성화 세팔로스 4B (파마시아사제) 등을 열거할 수 있다. 친수성 폴리비닐계 담체로서는 카보디이미드법을 사용하는 AF-카복시도요팔 650, 포르밀법을 사용하는 AF-포르밀도요팔 650, 트레실클로라이드법을 사용하는 AF-트레실도요팔 650, 에폭시 활성화법을 사용하는 AF-에폭시도요팔 650 (이상, 도소사제)등을 열거할 수 있다. 리간드와의 결합 반응은 각각의 담체의 사용설명서에 따라 반응시키면 양호하다.

이중에서 아피겔 10에 관한 제조방법을 기재한다. 아피겔 10과 펩티드의 반응은 0.001 내지 1M이며 바람직하게는 0.1M 모프스-수산화칼륨 등의 완충액 속에서 수행한다. 반응 조건은 0 내지 20℃, 10분 내지 24시간, pH 3 내지 11 정도가 가능하지만 바람직하게는 4℃, 4 내지 24시간, pH 5 내지 9의 조건에서 수행한다. 아피겔 10과의 결합에서 사용하는 펩티드의 혼합비는 아피겔 1ml에 대하여 펩티드가 약 25μmol 까지는 많이 가할수록 많이 결합하므로 그 범위내에서 몇개라도 좋지만 결합 효율의 점에서 1 내지 20μmol 정도가 편리하게 사용된다. 반응시킨 다음, 반응시에 사용된 완충액으로 충분하게 세정한 다음, 트리스-염산(pH 8.0)을 최종 농도가 50mM이 되도록 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 진탕시키는 등의 방법으로 미반응의 활성기를 봉쇄시킨다. 상기에서 기질 유사체 친화성 겔이 제조된다.

기질 친화성 크로마토그래피는 배치식으로도 칼럼에 충전시켜 연속식으로 수행해도 좋다. 시료와 겔을 접촉시키는 시간은 본 효소가 충분하게 흡착되는 정도이면 양호하며 통상적으로 20분 내지 24시간이다. 겔의 평형화에 사용한 것과 동일한 조성의 저이온강도에서 pH가 6.0 내지 11.0, 바람직하게는 7.0 내지 9.0의 완충액, 예를 들면, 10mM의 헤페스-수산화칼륨(pH 7.0)으로 비흡착 성분을 세척해 낸다. 이중에서 본 효소활성이 존재하는 분획을 용출시킨다. 용출액은 본 효소가 효율적으로 수득되는 조성이면 어떤 것도 좋지만 바람직한 것은 1 내지 40% 정도의 아세토니트릴과 함께 0.1 내지 10M 염화나트륨을 함유하는 pH 7.0 내지 9.0 사이의 완충액, 예를 들면, 20% 아세토니트릴, 0.4M 염화나트륨을 함유하는 10mM 헤페스-수산화나트륨(pH 7.0)을 열거할 수 있다. 또한 용출은 칼럼에 충전시킨 경우, 농도 구배 전체에 걸쳐도 상관없다.

또한, 경우에 따라 상기한 기질 유사체 친화성 크로마토그래피[이하, (5)로 나타낸다]공정을 실시하기 전 또는 후이거나 전후 모두 미리 건져낸 침전에 따른 분획[이하, (1)로 나타낸다], 헤파린 친화성 크로마토그래피[이하, (2)로 나타낸다] 투석, 겔 여과등에 따른 분자량 분획[이하, (3)으로 나타낸다] 및/또는 이온교환 크로마토그래피[이하, (4)로 나타낸다] 공정을 실시해도 양호하다. 이와같이 본 효소(효소-I 및 효소-II)는 기타 사이에 긴 잡물로부터 분리할 수 있지만 당해 효소-I과 효소-II의 분리에는 (3) 및/또는 (4)의 공정을 실시하는 것이 유효하다. 일반적으로 이러한 전체 1 내지 6 공정을 실시한 다음, 상기 (5) 또는 (3) 공정을 최종 단계에서 실시하는 것이 바람직하다. 각 공정을 조합시킨 구체적인 예로서는 (5)만으로,

의 순으로 공정을 진행시키는 것이 보다 바람직하다.

하기에 상기한 (1) 내지 (4) 공정에 대해서도 상세하게 설명한다. 또한 이들은 모두 0℃ 내지 10℃, 바람직하게는 4℃에서 수행한다.

(1)의 침전에 따른 분획에서 사용하는 물질은 황산 암모늄 등의 염류, 에탄올, 아세톤 등의 유기용매, 폴리에틸렌 글리콜 등의 중합체류를 열거할 수 있다. 첨가하는 농도는 특별히 제한하지 않으며 본 효소를 양호한 수율로 회수할 수 있으며 또한 기타 단백질 성분과 분리시킬 수 있는 조건이 바람직하다. 예를 들면, 30 내지 50% 포화 황산암모늄, 10 내지 15%(W/V)의 폴리에틸렌글리콜 6000의 첨가에서는 본 효소는 침전분획으로 되는 것에 대해 대다수의 단백질은 상등 부분에 존재하므로 효율적으로 정제할 수 있다. 또한 첨가할 때는 교반기로 교반하면서 서서히 수행하는 것이 바람직하다. 첨가를 종료시킨 다음, 적어도 1시간 이상 정치시킨 다음, 원심분리 함으로써 본 효소에 존재하는 분획을 회수한다. 침전 분획을 회수할 때에는 이를 적당한 완충액으로 용해시킨다. 완충액은 pH가 6.0 내지 11.0이며 바람직하게는 pH가 7.0 내지 9.0이면 어떠한 조성도 양호하며 예를 들면, 트리스-염산, 헤페스-수산화칼륨, 테스-수산화나트륨 등을 열거할 수 있다. 또한 농도는 완충 능력을 유지시키는 범위이면 특별한 제한은 없으며 5 내지 50mM 정도가 바람직하다.

(1)에 따라 수득한 활성 분획은 이어서 (1)을 재차 수행해도 (2) 내지 (5) 중에서 어떠한 하나의 공정으로 진행시키면 양호하지만 (1)의 분획에 황산암모늄 등의 염류를 사용하여 (2)나 (4) 또는 (5)로 진행시킬 때는 (3)의 공정이나 적당한 완충액을 첨가하여 다음 공정으로 사용하는 겔에서 본 효소가 결합할 수 있는 염농도로 낮출 필요가 있다. 또한 침전을 용해시켜 1시간 이상 정제한 경우나 투석을 수행한 경우에는 불용성 물질이 생길 수 있으므로 예를 들면, 원심분리나 여과로써 이를 제거한다.

(2)의 헤파린 친화성 크로마토그래피에 대해서는 배치식으로도 칼럼에 겔을 충전시켜 연속식으로 수행해도 양호하다. 헤파린을 리간드로 한 겔은 시판된 것으로서 헤파린세파로스 CL-6B (파마시아사제), 아피겔헤파린(바이오라드사제), 헤파린아가로스(시그마사제), AF-헤파린도요팔 650 (도소사제) 등이 있다.

생체 추출액을 직접 또는 (1)에 기재한 침전에 따라 분획의 처리를 수행한 다음, 헤파린 친화성 겔과 접촉시킨다. 접촉시간은 본 효소가 충분하게 흡착되는 정도이면 양호하며 통상적으로는 20분 내지 12시간이다. 헤파린에 친화성이 없는 성분을 본 효소가 용출되지 않는 정도로 이온 강도가 낮으며 pH가 6.0 내지 11.0 바람직하게는 7.0 내지 9.0의 완충액, 예를 들면, 10mM의 헤페스-수산화칼륨(pH 7.0)으로 충분하게 제거시킨다. 이중에서 본 효소를 함유하는 분획을 용출시킨다. 용출액으로서는 본 효소 활성의 회수율이 높은 것이 좋으며 예를 들면, 0.5M-2M의 염화나트륨, 염화칼륨, 황산암모늄 등, 일반적으로 효소 정제에 사용하는 염류를 함유하는 pH 6.0 내지 11.0인 것이 바람직하다. 용출은 칼럼에 충전시키는 경우, 염농도 구배에 따르거나 1단계 용출을 수행하여도 상관없다. 예를 들면, 0.3 내지 2.0M의 염화나트륨을 함유하는 10mM의 헤페스-수산화칼륨 완충액(pH 7.0)으로 용출시킨다.

(2)의 공정에서 수득한 활성 분획은 이어서 (1) 내지 (4)의 어떠한 공정에 제공해도 양호하지만 재차(2)를 수행하거나 (4) 또는 (5)로 진행시키는 경우에는 (3)을 미리 수행하거나 다량으로 50mM 이하의 저이온 강도인 pH 6.0 내지 11.0, 바람직하게는 7.0 내지 9.0의 완충액, 예를 들면 5mM 헤페스-수산화나트륨(pH 7.0) 등을 가하여 (2), (4) 또는 (5)에서 사용하는 겔에 본 효소가 흡착할 수 있는 이온 강도까지 낮출 필요가 있다.

(3)의 투석, 겔 여과 등에 따른 저분자 물질의 제거 공정에서 투석의 경우, 사용하는 막은 본 효소가 통과할 수 없을 정도의 분획 분자량의 것이면 양호하지만 1,000 내지 10,000이 바람직하다. 투석의 방법은 예를 들면, 문헌[참조: 세이카가쿠짓켄고자 제5권 상권 252 내지 253페이지 사유다 저 도쿄가가쿠도진(1975)]에 기재된 바와 같이 일반적으로 사용되는 것이 양호하며 수시간 내지 수일동안, 이온 강도가 낮으며 pH 6.0 내지 11.0, 바람직하게는 pH 7.0 내지 9.0의 완충액, 예를 들면 10mM의 헤페스-수산화칼륨(pH 7.0), 10mM의 트리스-염산(pH 7.5) 등에 대해서 수행한다. 또한, 투석할 때에 불용성의 물질이 석출된 경우에는 예를 들면, 원심분리, 여과 등으로써 제거한다.

겔 여과에 대해서는 일반적으로 겔 여과용 담체로서 사용할 수 있는 것이면 어떤 것도 상관없다. 예를 들면, 세파덱스 G-10, G-15, G-25, G-50, G-75, G-100, 세파크릴 S-200, S-300(이상, 파마시아사제), 도요팔 HW-40, HW-55(도소사제), 바이오겔 P-2, P-4, P-6, P-10, P-30, P-60, P-100(이상, 바이오라드사제)등이 바람직하다. 또한, 사용할만한 완충액은 투석할 때에 사용하려는 조성과 동일하다. 단, 이온 강도가 상당히 낮으면 본 효소의 겔에 대한 흡착을 일으킨다고 생각되므로 농도를 5 내지 200mM, 바람직하게는 10 내지 20mM로 한다. 겔 여과의 방법은 예를 들면, 문헌[참조: 세이카가쿠짓켄고자 제5권 상권 283 내지 298페이지 사유다 저 도쿄가가쿠도진(1975)]에 기재된 바와 같이 수행하면 양호하다. 겔 여과 담체의 베드 체적에 대해 충분한 분리 능력이 수득되는 양의 시료를 첨가한 다음, 용출을 수행하며 본 효소활성이 존재하는 분획을 회수한다.

(3)의 공정에 따라 수득한 활성분획은 특별히 처리하지 않고 (1) 내지 (5)의 각 공정으로 진행시킬 수 있다.

이온교환 크로마토그래피에 관해서는 일반적으로 시판되는 이온교환 크로마토그래피용 담체이면 하등 상관이 없다. 예를 들면, Aminex, Dowex, Amberlite, SP-Sephacryl M, Asahipak, DEAE-Toyopearl, DEAE-Sephadex, CM-Sepharose, DEAE, Bio-Gel A, CM-Cellulose, DEAE-Cellulofine, Partisil SCY, Mono Q 및 Mono S 등이 바람직하다. 또한 사용하려는 완충액 및 사용방법은 헤파린 친화성 겔의 항에 기재된 방법에 준하는 것이 양호하다. 또한 기본적인 조작방법은 문헌[참조: 신키소세이카가쿠짓켄보 2, 추출·정제 분석 I(마루젠, 1988)] 등에 기재된 일반적인 방법에 따르면 양호하다.

(4)의 공정에서 수득한 활성분획을 이어서 (1) 내지 (5)의 어떤 공정에 제공해도 양호하지만 재차(4)를 수행하거나 (2) 또는 (5)로 진행시키는 경우에는 (3)을 미리 실시하거나 다량으로 50mM 이하의 저이온 강도인 pH 5.0 내지 11.0, 바람직하게는 6.0 내지 8.0의 완충액, 예를 들면, 헤페스-수산화나트륨(pH 7.0) 등을 가하여 (2), (4) 또는 (5)에서 사용하는 겔에 본 효소가 흡착될 수 있는 이온 강도까지 낮출 필요가 있다. 상기한 정제공정을 경유함으로써 본 발명의 효소의 조생성물이 수득된다. 이러한 효소의 조생성물은 또한 (3)의 겔 여과공정을 이용하는 단백질 분리 수단으로써 분자량이 약 25,000 및 분자량 약 40,000에서 각각 피크를 이루는 분획으로 단리하여 본 효소 표준품으로서 할 수 있다.

상기한 각 공정은 각각 하기한 또 하나의 본 발명인 효소 활성의 측정방법에 준하여 일반식(I) 또는 일반식(II)의 화합물을 기질로 사용하고 효소-1 및/또는 효소-II의 활성에 따라 활성 분획을 수득함으로써 실시된다.

본 발명의 효소-I 및 효소-II는 당해 효소를 암호화하는 cDNA를 함유하는 동시에 이를 발현시킬 수 있는 플라스미드로써 형질전환된 숙주 세포를 배양함으로써 상기한 효소를 생산 축적시킨 배양물로부터 이들 효소의 양쪽 또는 한쪽을 채취함으로써 제조할 수 있다.

이러한 방법으로 이용할 수 있는 본 발명의 효소를 암호화하는 cDNA는 사람, 소, 말, 돼지, 양, 토끼, 산양, 래트, 마우스 등의 포유류, 닭, 칠면조 등의 조류, 개구리 등의 양서류, 뱀 등의 파충류, 정어리, 고등어, 뱀장어, 연어 등의 어류들에 존재하는 DNA에 유래하고 이러한 cDNA의 거의 중앙 부근에서 Lys-Lys의 서열이 존재하며 이의 기원은 문제되지 않으며 바람직한 것으로는 포유류 유래의 것을 열거할 수 있다. 보다 구체적으로는 현재 공지되어 있는 펩티드 C 말단 아미드화 효소의 아미노산 서열을 아미노산의 1 문자 표시로 또한 종류간의 상동성을 높게 하도록 결핍부분(-로 표시한다)을 임의로 삽입하여 제5도에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 단편이며 이러한 C 말단, 근방의 소수성 아미노산 영역에 상당하는 부분을 제외시킨 cDNA가 유리하게 사용될 수 있다. 또한 각 cDNA는 사람, 말, 소, 래트, 개구리 I 및 개구리 II에 대해서 각각 문헌[참조: Biochem, Bioph ys. Res. Commun, 169, 551 내지 558, 1990; 일본국 특허원 제90-76331호 명세서; Mol. Endocrinal. 1, 777 내지 790페이지, 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 735 내지 739페이지, 1989; Biochem. Biophys. Res. Commum., 148, 546 내지 552페이지, 1987; 및 Biochem, Biophys. Res. Commun., 150, 1275 내지 1281 페이지, 1988]에 기재되어 있다. 이중에서 예를 들면, 제5도의 말의 서열에서 441과 442번째가 상기한 K(라이신), K(라이신) 서열에 해당된다. 이러한 서열은 사람, 말, 소, 래트의 cDNA로써 양호하게 보존된다. 이러한 서열로부터 전반 부분(5'측)의 cDNA는 일반식(I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체에 작용하여 일반식(II)의 펩티드 C 말단 α-하이드록시글리신 부가체를 생산하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하며 또한 본 KK 서열로부터 후반부분(3'측)의 cDNA는 일반식(II)의 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체에 작용하여 일반식(III)의 C 말단 아미드화물과 글리옥실산을 생성시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하고 있다. 이러한 KK 서열 근방의 부위에서 자체 공지된 제한효소를 사용하여 cDNA를 전반부와 후반부로 분리시킬 수도 있다.

또한 상기한 소수성 아미노산 영역은 예를 들면, 제5도 내의 말의 서열에 따르면 880번째의 V (발린) 내지 901번째의 I (이소로이신)에 해당하며 당해 영역에 상당하는 부분을 본 명세서에서는 막 관통 영역이라 한다. 이러한 영역에 상당하는 부분을 제외한 cDNA 단편을 이용하면 놀랍게도 생산되는 효소를 숙주세포 외부로 분비할 뿐만아니라 전체적인 생산량도 현저하게 증대되므로 본 발명에서 사용하는 cDNA로는 상기한 영역을 제외한 cDNA가 특히 바람직하다. 또한 본 발명의 효소-I 및 효소-II는 상기한 바와 같이 인접하여 cDNA에 암호화되지만 이들 효소는 세포에서 분비과정의 가공처리로써 개별적으로 방출되므로 상기한 막 관통 영역을 제외한 cDNA를 사용하는 것이 바람직하다. 이와 같은 cDNA는 공지된 대응 cDNA로부터 자체 공지된 제한효소를 사용하여 그 부분을 절제하여 제조한 것도 양호하며 또한 당해 cDNA의 클로닝 단계에서 mRNA의 스플라이싱의 차이에 따라 생기는 각종 cDNA로부터 선택할 수도 있다. 또한 cDNA는 효소-I 및 효소-II를 각각 독립하여 암호화하는 cDNA를 상기한 바와 같이 분리한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 이용하는 cDNA의 클로닝은 자체 공지된 방법에 따라 상기한 각종 동물의 제조직을 사용하여 실시할 수 있다. 구체적으로는 +, -법, 하이브리드화 법, PCR법 등, 일반적으로 사용되는 방법(참조: Methods in Enzymology, vol. 152; Guide to Molecular Cloning Teehniques, S.L. Berger et A.R. Kimmel편, 1987, Academic Press. Inc.; Methods in Molecular Biology, vol. 4; New Nucleic Acid Techniques, J.M. Walker 편, 1988, The Humana Press Inc.; Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd Ed. J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis 편, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 따라 실시하며 수득된 cDNA 클론의 염기 서열을 결정함으로써 단백질을 암호화하는 cDNA 영역을 결정하고 필요에 따라 상기한 막 관통 영역에 상당하는 부분이 제거된 곳에서 선택하고 상기한 중앙 부분의 KK 서열 부근에서 cDNA를 분할함으로써 목적하는 cDNA를 수득할 수 있다.

래트를 예로서 설명하면 펩타이드 C 말단 아미드화 효소를 다량으로 생산하는 조직, 예를 들면, 래트의 하수체를 구아디닐티오시아네이트와 함께 균질화 함으로써 세포를 파쇄하고 염화세슘 평형밀도구배 초원심분리로써 RNA 분획을 수득한다. 이어서 올리고 dT 셀룰로스를 담체화한 친화성 크로마토그래피로써 상기한 RNA 분획으로부터 폴리 A를 갖는 RNA (폴리 A⁺RNA)를 단리시킨다.

이러한 폴리 A RNA를 주형으로서 사용하고 공지된 방법, 바람직하게는 오카야마-Berg의 방법(Mol. Cell. Biol. 2, 161, 1982)에 따라 cDNA 라이브러리를 수득한다. 이러한 라이브러리로부터 적당한 프로브를 사용하여 양성 클론을 스크리닝 하고 증폭된 cDNA 라이브러리로부터 적당한 프로브를 사용하며 재스크리닝하여 수득한 양성 cDNA 클론을 단리하고 이러한 제한효소 지도 작성 및 서열 분석 등으로써 목적하는 cDNA를 구조 결정할 수 있다. 또한 상기한 cDNA를 발현 벡터에 삽입하고 이로써 형질전환시킨 숙주의 펩티드 C 말단 아미드화 효소의 생산성을 평가함으로써 목적하는 cDNA를 함유하는 플라스미드를 선택할 수도 있다.

이러한 cDNA를 발현시키는 숙주로서는 대장균, 고초균, 효모 등의 미생물, 곤충, 동물 등에 유래하는 배양세포 시스템 등, 통상적으로 사용되는 세포를 열거할 수 있다. 발현 플라스미드는 이들 세포속에서 cDNA를 효율적으로 발현시킬 수 있는 플라스미드이면 모두 양호하다. 예를 들면, 하기에 기재한 문헌들로부터 적절하게 선택할 수 있다.

조쿠세이카가쿠짓켄고자, 이덴시캔큐보 II, -재조합 DNA 기술 - 제7장 조환체의 발현(1986), 닛뽄세이카가쿠편, 도쿄가가쿠도진; Recombinant DNA, Part D, Section II, Vectors for expression of Cloned Genes, (1987) RayWu 및 Lawrence Grossman 편, Academic Press, INC; Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed. Book 3, (1989) J. Sambrook, E. F. Fritsch 및 T. Maniatis 편, Cold Spring Harbor Laboratory Press 등.

예를 들면, 동물 배양세포로서 사용되는 CV-1을 숙주로서 사용하는 경우에는 pSV, pL2n, pCol 형의 프로모터 및 필요에 따라 선택 마커를 배열한 것을 사용할 수 있다. 또한 대장균에 대해서는 pGH, pKYP, pHUB형 벡터를 효모에 대해서는 YRp, YEp형의 것을 사용할 수 있다. 이들 벡터의 cDNA에 따른 재조합 및 재조합 플라스미드에 따른 숙주세포의 형질전환, 형질도입은 각각 상기한 문헌들에 기재된 자체 공지된 수준에 따라 수행할 수 있다. 이와 같이 수득된 형질전환세포는 유래된 세포를 증식하는데 통상적으로 사용되는 배지 및 배양조건하에서 배양시킬 수 있다.

이와 같은 배양물로부터 생산 축적시킨 펩티드 C 말단 아미드화 효소의 채취는 예를 들면, 동물 배양세포를 사용하는 경우에는 생산효소가 세포 외부로 분비되므로 세포를 제거한 다음에 배양액으로부터 용이하게 채취할 수 있으며 필요에 따라 세포 용해물에서 채취해도 양호하다. 이러한 채취, 정제는 통상적인 효소 정제법, 예를 들면 침전에 따른 분획, 헤파린 친화성 크로마토그래피 및 투석 등을 조합시켜 실시할 수 있으며 또한 상기한 생물학적 유체에서 본 효소를 채취하는 방법, 펩티드 C 말단 글리신 부가체를 리간드로 하는 기질 친화성 크로마토그래피를 조합시켜 사용하는 것이 바람직하다.

이와 같이 수득한 본 발명의 효소-I은 제5도를 인용하면 효소-I에 대해서 사람, 말, 소, 래트에서는 각각 42 잔기째의 P 또는 S에서 442 잔기째의 K까지, 또는 말, 소에서는 42 잔기째의 P 또는 S에서 231 잔기째의 K까지 아미노산 서열에 관한 것이다. 한편, 효소-II는 사람, 말, 소, 래트에서는 각각 443째의 D에서 830 잔기째의 K까지 아미노산 서열에 대응하는 것을 수득할 수 있다.

본 명세서에서 대응하는 것이란 본 발명의 효소가 경우에 따라 이의 아미노산 서열의 아스파라긴산에 N-아세틸글로코사민을 개재시켜 당을 결합시킨 것을 포함한다.

[효소의 사용]

본 발명의 효소의 사용, 즉 상기식(I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체를 상기한 효소-I로 처리함을 특징으로 하는 상기식(II)의 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체의 제조방법 및 일반식(II)의 상기한 부가체를 효소-II로 처리함을 특징으로 하는 상기식(III)의 펩티드 C 말단 아미드화물의 제조 방법을 제공할 수 있다.

또한 이들 효소-I 및 효소-II는 병용함으로써 단일 반응조성물 중에서 일반식(I)의 화합물을 일반식(III)의 화합물로 전환시킬 수 있다. 일반식(I)로부터 일반식(III)의 화합물로의 전환공정에 효소-II를 사용하는 것은 효소-I 형의 효소만의 존재하에서는 일반식(II)에서 일반식(III) 화합물로의 전환에 있어서 화학적 가수분해조건으로할 필요가 있음에 비해서 보다 완화된 효소반응 조건하에서 상기 전환이 달성될 수 있다는 점에 유의한 것임이 분명하다. 특히, 알칼리 조건하에서 불안정한 기질류의 처리에 적합하다.

이들의 제조방법은, 본 발명의 효소를 함유하는 것이면 그의 농도, 순도를 불문하고 사용할 수 있으나, 반응혼합물로부터의 생성물, 일반식(II)의 화합물의 단리정제를 고려할때 협잡 단백질이 대폭 제거된 본 발명의 효소를 사용하는 것이 유리하다.

일반식(I) 또는 일반식(II)의 화합물로서는 상술한 것이 모두 포함되지만, 이들의 제조방법에서 사용하기 적합한 것으로서는 특히 이들의 최종 생성물, 일반식(III)의 화합물 예를 들면, 알키닌 바소토신(AVT), 황체 형성호르몬 방출 호르몬(LH-RH), 옥시토신, 가스트린, 가스트린 분비 촉진 펩티드(GGRP), 칼시토닌(CT), 혈관작용성 소장 펩티드(VIP), 갑상선 자극 호르몬 방출 호르몬(TRH), 흑색 소포 자극 호르몬(MSH), MSH 방출 억제 호르몬(MIH), 콜레시스토키닌옥타헵타이드(CCK-8), 섭스탠스 P(SP), 지방동원호르몬, 취폴리펩티드(PP), 성장호르몬 방출인자, 세크레틴, 셀룰레인, 연체동물성 심장 흥분성 신경 펩티드, 바소프레신, 부신 피질 자극호르몬(ACTH), 변색 호르몬, 본베신, 명순응 호르몬, 모틸린, 아파민, 아리데신, 에레도이신, 캇시닌, 그래뉼리베린 R, 스코트호빈, 히란베이트셀룰레인, 비만세포 탈과립 펩티드, 피살레민, 피로셀룰레인, 피로메즈신, 프로멜리틴, 본비닌, 마스트파란, 마스트파란-X, 멜리틴-1, 라나텐신 및 라나텐신-R 에 대응하는 화합물이 바람직하다.

상기 처리는 통상의 완충액중에서 특히 효소-I을 사용하는 반응에서는 반응액에 아스코르브산 및 카탈리아제를 첨가하여 실시할 수 있으나, 하기에 나타내는 효소활성의 측정 방법 조건을 고려하여 실시하는 것이 바람직하다.

[효소활성의 측정방법 및 이를 사용하는 신규 효소의 탐색방법]

상술한 본 발명의 효순-I 및 효소-II는 이하의 활성 측정방법에 의해 추적할 수 있고, 또한 이 측정방법은 상술한 본 발명의 효소의 제조방법을 합리적으로 실시하는데 유용하다.

물론, 이들 측정방법은 펩티드 C 말단 아미드화 반응이 종래 공지된 바와 같은 1단계의 반응이 아니라, 중간체(펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체)를 매개하는 2단계 반응이라는 점에 근거를 둔것이다.

먼저 최초로, 효소-I의 활성은 (a) 그 활성을 갖는 것이 예측될 수 있는 피검체를 pH 5 내지 8로 완충화하는 공정 및 (b) 이러한 완충용액에 상기 일반식(I)로 표시되는 펩티드 C 말단 글리신 부가체 및 L-아스코르브산 및 카탈리아제를 첨가하여 인큐베이션 하는 공정을 포함하며, 이와같이 하여 수득되는 반응혼합물로부터 후술하는 그 자체 공지된 각종 크로마토그래피를 사용하여 상기 일반식(II)로 표시되는 생성물을 단리 측정하든가, 또는 일반식(II)의 화합물을 알칼리 조건하에서 일반식(III)의 화합물로까지 전환시킨 후 이를 단리 측정함으로써 결정할 수 있다. 이러한 바람직한 단리 측정 방법으로서는 반응생성물을 아세토니트릴-함유 완충액(pH 6 내지 10)을 사용하는 HPLC로 검출하는 공정을 들 수 있다.

또한, 효소-II의 활성은, (a) 그 활성을 갖는 것이 예측될 수 있는 피검체를 pH 4 내지 8로 완충화 하는 공정, 및 (b) 이 완충용액에 일반식(II)로 표시되는 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체를 첨가하여 인큐베이션하는 공정을 포함하며, 이와 같이 하여 수득되는 반응생성물, 일반식(III) 또는 글리옥실산을 그자체로 공지된 측정방법에 의해 결정할 수 있다. 효소-II의 활성도 또한 상기 HPLC로 검출하는 것이 바람직하다.

이들 측정방법에 있어서 피검체로서는 효소활성을 가진 유체이면 어느것이라도 포함되며, 특히 이러한 활성을 가진 생물학적 유체, 즉 생물의 기관의 균질화물, 및 체액, 예를 들면 혈액 및 림파액, 추가로 이들의 정제처리등의 처리액을 들 수 있다. 또한, 미생물 세포에서 유래된 처리액도 생물학적 유체에 포함된다.

이들 피검체의 완충화에 사용하는 완충제는 특별히 제한되지 않으며, 통상적으로 사용되는 것이 사용될 수 있다. 예를 들면, 트리스-염산, 헤페스-수산화칼륨이 있다. 완충용액 중의 완충제의 농도는 완충작용이 달성될 수 있는한 어떠한 농도에서도 좋으나 통상적으로는 20 내지 200mM이 적당하다.

각각의 완충용액은 전자의 경우 pH 6 내지 8, 바람직하게는 pH 6.5 부근으로 조절하고, 후자의 경우는 pH 4 내지 8, 바람직하게는 pH 6 부근으로 조절한다. 이와 같이하여 제조된 완충용액에 전자에서 첨가되는 펩티드 C 말단 글리신 부가체로서는 당해효소의 기질이며, 상술한 효소-I의 활성을 확인하기 위해 바람직한 기질로서 열거된 일반식(I)로 표시되는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 이 화합물의 농도는 일반적으로 0.1μM 내지 2mM 정도가 적당하다. 또한, 보인자로서 기능하는 것으로 생각되는 L-아스코르브산, 활성화제로서 카탈라아제의 첨가가 필요하다. 일반적으로, L-아스코르브산의 농도는 0.5 내지 2mM이 바람직하고, 또한 카탈라아제의 농도는 40 내지 100㎍/ml가 적당하다. 또한, 완충용액에 금속 이온을 첨가하여도 좋지만, 이러한 첨가는 본 활성 측정에 특히 요구되는 것은 아니지만, 첨가에 의해 무첨가의 경우보다는 더 높은 활성이 수득될 수 있기 때문에 첨가하는 것이 바람직하다. 사용하는 금속 이온으로서는 Zn²⁺, Cu²⁺, Ni²⁺, Co³⁺, Fe³⁺등이 적당하며 특히 Cu²⁺, Zn²⁺가 바람직하다. 금속 이온의 완충용액중의 농도는 0 내지 1000μM, 바람직하게는 0 내지 10μM가 적당하다. 한정하는 것은 아니지만, 이러한 금속 이온을 제공하는 화합물은 CuSO₄, CuCl₂, ZnCl₂, NiCl₂, CoCl₂, FeCl₃등이 있다.

이러한 반응 조성물의 구체적인 것으로서는 예를 들면 후술하는 예 7의 반응 조성액 A가 참고로 될것이다. 한편, 후자에 있어서 반응조성물은 상기 일반식(I)의 화합물 대신에 대응하는 일반식(II)의 화합물을 사용하여 제조한다. 이 경우, 아스코르브산, 카탈라아제 등의 보인자는 필요하지 않다.

양쪽 측정방법 모두 피검체의 사용량은 특별히 제한하지 않으며 여러가지로 변화시킬 수 있으나, 반응계에 존재하는 기질의 양(a 나노몰(nmol)로 한다)에 대해 바람직하게는 a pmol/hr 이상, 보다 바람직하게는 10 X a pmol/hr 이상, 한층 더 바람직하게는 10 X a pmol/hr 내지 a mol/hr [단위는 효소 활성을 나타내며, 37℃, 1시간으로 반응하는 기질량(예를 들면 피코몰(pmol))로 표시한다]의 효소활성을 함유하도록 조정하는 것이 적절하다.

인큐베이션은 1 내지 55℃, 특히 전자에서는 바람직하게는 25 내지 40℃, 특히 바람직하게는 30℃ 부근에서 진탕하면서 2 내지 24시간 반응시키고, 후자에서는 바람직하게는 15 내지 35℃, 보다 바람직하게는 25℃ 부근에서 정치시켜 1분 내지 48시간 수행한다.

이상의 공정에서, 각각 생성되는 일반식(II)의 화합물 및 일반식(III)의 화합물의 검출은 이들 기질과 생성물, 예를 들면 전자에서는 일반식(I)의 화합물과 일반식(II)의 화합물, 후자에서는 일반식(II)의 화합물과 일반식(III)의 화합물을 분리측정할 수 있는 방법이면 어느 방법이라도 사용할 수 있다. 일반적으로 분리 측정은 이하의 크로마토그래피로 분리, 정제하여 수행할 수 있다. 상기에서 사용할 수 있는 크로마토그래피로서는 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 겔투과, 친화성 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC), 박층 크로마토그래피(TLC) 등이 있다. 후자의 반응계에 있어서 일반식(II)로 표시되는 기질과 일반식(III)으로 표시되는 아미드화된 생성물은 펩티드 C 말단이 각각 카복실기와 아미드기이며, 전하가 상이하다. 이러한 성질을 사용한 이온 교환 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피등이 적합하다. 또한, 생성물의 항체를 사용한 친화성 크로마토그래피도 유효하다. 그러나, 전자의 반응계에서는 일반식(I)로 표시되는 기질과 일반식(II)로 표시되는 생성물은 통상의 크로마토그래피 처리로는 분리가 매우 곤란하지만, 본 발명자들에 의해 개발된 아세토니트릴 함유 완충액(pH 6 내지 10, 바람직하게는 pH 9)을 용출액으로서 사용하는 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의하면 유리하게 분리측정할 수 있다. 용출액은, 특히 아세토니트릴 농도의 직선 농도 구배를 곱하여 수행하는 것이 좋다. HPLC의 컬럼으로서는 본 목적에 적합한 것이면 시판중인 어떠한 종류의 컬럼을 사용할 수도 있으나, 특히 캡슐 팩 C18SG, 300Å(시세이도(제))을 사용하는 것이 유리하다.

이렇게하여, 각각 분리된 기질과 생성물은 이들중 (필요에 따라 결합된) 어느것의 화학적 또는 물리적 특성에 대하여 측정하면 좋다. 이러한 측정에는 공지된 특성, 공지된 측정법이 사용될 수 있고, 일반적으로는 기질 펩티드를 구성하는 아미노산에서 유래된 UV 흡수를 이용하는 것이 적합할 것이다.

이상의 측정방법은 정확하며 간편하므로, 이들을 상술한 생물학적 유체에 적절히 사용하므로써 각각 효소-I 또는 효소-II의 활성을 가진 효소의 탐색을 수행할 수 있다.

탐색의 대상이 되는 생물학적 유체는 상술한 효소활성을 갖는 것이 예측될 수 있음은 물론이고, 그외의 동식물의 생체세포, 조직, 추출액도 모두 포함한다. 예를 들면, 추출액은 실험 생물학 강좌 6, 세포분획법 (환선, 1984), 생화학 실험 강좌 5, 효소 연구법(상) (동경화학동인, 1975), 기초 생화학 실험법 1, 생물재료의 취급법 (환선, 1974) 등에 기술된 일반적인 추출법을 기준으로 조제하면 좋다.

[말에서 유래된 효소-I 및 효소-II에 관한 DNA 서열]

본 발명에 따르면, 효소-I 및 효소-II의 효소활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화 하는 cDNA 서열이 제공된다. 이들 효소는 당해 기술분야에서 공지되어 있는 펩티드 C 말단 아미드화 효소 보다도 활성, 안정성에서 우수할 가능성이 있기 때문에 (국제공개: WO 89/12096호 공보 참조), 이들을 생산하는 관점에서 상기 DNA 서열을 제공하는 의의가 확인될 수 있다. 이러한 효소의 기원은 이들이 존재하는 기관 또는 조직이라면 그 종류에 상관없이 주로 심방, 하수체, 뇌 또는 위에서 유래된 것을 대상으로 한다.

본 발명에 따른 펩티드 C 말단 아미드화 효소활성을 가진 폴리펩티드를 암호화한 cDNA는 구체적으로는 제13도에 나타내었다. 이 도면에서는 가장 긴 cDNA 단편의 염기 서열 및 여기에 암호화된 아미노산 서열을 일문자 표시로 나타내었다. 즉, 도면중의 [ ] 안은 몇개의 cDNA를 해석한 결과 밝혀진 mRNA 스플라이싱의 차이에 의해 생긴 것으로 여겨지는 cDNA 결실부분이다. 따라서, 본 발명에 따른 cDNA는 암호화할 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해서도 수종 존재하고 있다. 예를 들면, 본 발명에서 제공되는 말에서 유래된 본 발명 효소의 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 아미노산 서열은 적어도 하기와 같이 일정한 쇄길이 까지 공통적인 서열을 가지며, 또한 그의 하류에 각각 4종의 서열중 어느것을 포함하는 4종이 존재한다.

이들 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드는 단순히 4종의 cDNA 서열에 의해 해독될 뿐만아니라 동일한 아미노산을 암호화하는 상이한 코돈을 조합한 DNA를 사용하여서도 해독할 수 있기 때문에, 본 발명의 DNA 서열은 그들 전부를 포함한다. 더욱이, C 말단 아미드화 효소활성이 상실되지 않을 정도로 아미노산 서열의 일부가 치환, 추가 또는 제거에 의해 변경되어도 본 발명의 본래의 목적에 부합하는 것으로 해석된다. 이들의 구체예로서는 하기의 공통 염기 서열을 가지며 그의 하류에 각각 하기의 상이한 염기 서열부를 갖는 것을 들 수 있다 :

본 발명의 cDNA의 클로닝은 상술한 래트에 대해서 설명한 것과 동일하게, 상술한 말의 각 조직을 사용하여 그 자체 공지된 방법으로 실시할 수 있다.

이하, 본 발명의 cDNA 제조방법에 대해 구체적으로 설명한다.

말에 있어서, 펩티드 C 말단 아미드화 효소를 다수 생산하는 조직(이하, 양성조직 이라고 함), 예를 들면 말의 심방을 구아니딜티오시아네이트와 함께 균질화 함으로써 세포를 파쇄하고 염화세슘 평형밀도구배 초원심분리에 의해 RNA를 분획하여 수득한다. 이어서 올리고 dT 셀룰로오즈를 담지한 친화성 크로마토그래피에 의해 상기 RNA 분획으로부터 폴리 A를 가진 RNA(폴리 A RNA)를 단리한다.

이러한 폴리 A⁺RNA를 주형으로 사용하여 공지의 방법, 바람직하게는 오카야마-Berg의 방법(Mol. Cell. Biol. 2, 161, 1982)에 의해 cDNA 라이브러리를 수득한다. 오카야마-Berg의 방법은 이하와 같이 실시한다. 즉, 오카야마-Berg의 벡터의 폴리 T 부분에 폴리 A⁺RNA의 폴리 A 부분을 흡착시키고 역전사 효소를 반응시켜 cDNA를 합성한다. 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라아제로 올리고 dC를 cDNA의 3' 말단에 부가한 후, 제한효소 Hind III로 벡터 DNA를 절단한다. 올리고 dG 링커를 연결하고나서 벡터를 환형화한 후, RNA 부분을 DNA 폴리머라제로 DNA에 치환하고 cDNA 함유 플라스미드를 수득한다. 이들 플라스미드를 사용하여 염화칼슘법(Strik, P. 등, J. Bacteriol. 138, 1033, 1979)등의 방법에 의해 대장균을 형질전환시킨다. 암피실린 첨가 평판 배지에서 암피실린 내성주를 선택하므로써 플라스미드 수용균을 취득한다.

한편, 상기의 양성조직, 즉 C 말단 아미드화효소를 다량 생산하는 조직과, C 말단 아미드화효소를 별로 생산하지 않는 조직(이하, 음성조직으로 언급), 예를 들어 말의 간장을 준비하여 각각의 세포로부터 상술한 방법 등에 따라 폴리 A⁺RNA를 단리한다. 폴리뉴클레오티드 키나아제와 [γ^-32] PATP를 이용하여 RNA의 5' OH를³²P로 라벨링시키고 이를 프로브로 한다.

다음, 콜로니 하이보리드화법[참조: Hanahan, D. 등, Gene, 10, 63, 1980]에 따라 상술한 cDNA 라이브러리 중에서 양성조직 유래의 프로브와 상보성이 있으나 음성조직 유래의 프로브와 상보성이 없는 콜로니를 선택한다. 이렇게 하여 선택한 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 취득하여 디데옥시뉴클레오티드법[참조: Messing, J. Methods in Enzymology 101, 20, 1983] 등에 따라 염기서열을 결정한다.

이들이 펩티드 C 말단 아미드화효소의 cDNA인가는, 이의 아미노산 서열을 암호화하는 영역을 대장균, 고초균, 효모 동물 배양세포등의 발현 벡터계에 도입시켜서 cDNA에서 암호화되는 단백질을 생산시킨 다음 이의 아미드화효소 활성[참조: 예를 들어, PCT/JP 89/00521호 명세서]을 측정함에 의해 확인할 수 있다. 또한, 수득된 cDNA는 전술한 공지의 펩티드 C 말단 아미드화 효소 cDNA와의 상동성을 비교함에 의해 선별하여도 좋다. 더우기, 국제 공개 WO 89/12096호 공보에 기재되어 있는 말 C 말단 아미드화 효소의 정제법을 이용하여 정제한 효소의 일부 아미노산 서열을, 펩티드 서열 분석기등으로 판정하고, cDNA로부터 추정된 아미노산 서열과 동일한 것을 확인하는 것도 좋다. 또한 더우기, 정제효소를 항원으로 한 항체를 래빗, 래트 등에서 작제한 다음 상술한 cDNA에 의해 대장균 등에서 발현된 단백질과 항원 항체 반응을 수행함에 의해 확인하여도 좋다.

이들 확인 수단은, 이들의 특성을 이용한 cDNA 클로닝의 수법으로서 이용할 수 있다. 즉, 공지의 이종 C 말단 아미드화 효소 cDNA중, 이들 종간에서 상동성이 높은 영역은 말 유래의 cDNA라도 상동성이 높다고 여겨지며, 이와 같은 영역의 DNA를 프로브로서 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 방법; λgt 11 파아지를 이용하는 cDNA 클로닝 시스템으로 항체를 프로브로 하는 스크리닝법; 정제 효소의 일부 아미노산 서열에 의해 대응하는 코돈을 연결한 합성 DNA(수종류로 된다)를 DNA 합성기 등으로 작제하여 이를 프로브로서 플라스미드, 파아지 등을 이용하여 작제하는 cDNA 라이브러리의 스크리닝법등이다.

이렇게 제조된 본 발명의 펩티드 C 말단 아미드화 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화한 DNA 서열은, 이의 DNA를 적당한 발현 벡터에 연결하여 대장균, 고초균, 효모, 동물 세포 등을 숙주로서 발현됨에 의해 효소-I 및/또는 효소-II를 다량으로 생산할 수 있다.

[실시예]

다음, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

그러나, 본 발명은 이들에 의해 한정되지 않는다.

[실시예 1]

[기질유사체 친화성 크로마토그래피용 겔의 제조]

5ml의 아피겔 10을, 이소프로판올을 채운 10ml용 에코노 컬럼(바이오래드사 제품)에 가하여 취한다.

이소프로판올을 유출시킨 후, 50ml의 10mM 초산 나트륨 완충액(pH 4.5), 이어서 10ml의 0.1M 모푸스-수산화나트륨 완충액(80mM 염화칼륨을 함유, pH 7.5)로 세정한다. 겔을 20ml용의 병에 옮긴 후, 40mg (약 100μmol)의 페닐알라닐글리실페닐알라닐글리신(Phe-Gly-Phe-Gly, 시그마사 제품)을 용해한 상기 모푸스-수산화나트륨 완충액 10ml와 혼합하여 4℃에서 18시간 진탕 반응시킨다.

그후, 0.5ml의 1M 트리스-염기완충액(pH 8.0)을 가하여 4℃에서 1시간 진탕 반응시키고, 미반응 활성기를 불활성화시킨다. 겔을 상기 모푸스-수산화나트륨 완충액, 이어서 이온교환수로 세정한 후, 0.02% NaN₃에 헌탁시켜서 컬럼에 충전시키고, 4℃에 보존한다. 반응에 사용한 펩티드(Phe-Gly-Phe-Gly)의 양과 회수된 용액 중의 펩티드 양으로부터 겔 1ml당 약 10μmol이 결합하고 있다고 산출되었다.

[실시예 2]

[기질로서의 페닐알라닐글리실페닐알라닐하이드록실글리신의 제조]

페닐알라닐글리실페닐알라닐글리신(FGFG)(시그마사 제품) 3mg을 측정하여 취해서, 50mM 헤페스-수산화칼륨 완충액 (pH 5.5), 3mM 아스코르브산, 10mM 요오드화 칼륨, 0.25mg/ml 카탈라제, 0.25nM 황산구리, 7.5% 아세토니트릴 및 국제 특허 출원 JP 89-00521호 명세서의 실시예 2에 기재된 바와 같은 말 혈청 유래의 아미드화 효소 조성물을 200㎕ 첨가하여 총량 10ml로 하고, 30℃에서 20시간동안 호기적으로 아미드화 반응시킨다. 반응을 10% 포름산 첨가로 정지시키고, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 페닐알라닐글리실페닐알라닐하이드록실글리신(FGFhyG)을 분리 수득한다. HPLC의 컬럼은 캡슐파크 C 18SG, 300Å (자생당 제품)을 이용한다. 용출 용매는 1mM 탄산수소암모늄(pH 9.0) 및 아세토니트릴을 사용하고, 아세토니트릴을 0%로부터 40% 까지 30분으로 증가시켜 직선 농도 구배를 건다. 펩티드는 214nm의 흡수에서 검출한다. 결과를 제1도에 나타낸다. 10.7분의 페닐알라닐글리실페닐알라닐 글리실의 피크는 C 말단 아미드화 반응에 의해 거의 소멸한다. 이에 수반하여 9.9분의 α-하이드록시글리신 유도체 및 14.5분의 아미드화체의 피크가 발견된다. 이들 물질은 FAB-MS 스펙트럼 분석 및 NMR 분석에 의해 구조 확인된다. 제2도에, 글리세린 용액중의 FAB-MS 스펙트럼의 결과를 나타낸다. 친피크는 분자량 442를 나타내고 있으며, 여기서 분절화 결과, C 말단에 존재하는 -OH기가 1 또는 2개 빠진 425 및 408m/z의 단편이 확인되며, α-하이드록실글리신 부가체인 것을 나타내고 있다. 9.9분의 피크를 분취하여 신속하게 10% 포름산 용액으로 하여 동결건조함에 의해 본 발명의 효소-II의 기질을 제조한다. 이 기질은 상기 아미드화 효소 조성물 대신에 본 발명의 효소-I 함유물을 이용하여도 동일하게 제조할 수 있다. 상술한 바와 같이, α-하이드록실글리신 유도체는 산성 조건에서는 안정하나 알칼리 조건에서는 불안정하며, 산소 반응과는 무관하게 아미드화물과 글리옥실산에 분해된다. 따라서, 본 실시예의 최초에 수행한 C 말단 아미드화 반응은 산성 조건에서 실시한다. 그후, pH 7.5 이상에서 반응시키면 α-하이드록실글리신 유도체는 확인할 수 없게 된다. 공지의 C 말단 아미드화 효소가 전술한 일반식(I)로 표시되는 펩티드 C 말단 글리신 부가체로부터 일반식(III)으로 표시되는 펩티드 C 말단 아미드화물과 글리옥실산으로 변환한다고 여겨지는 것은, 이의 알칼리 조건에서의 비산소적 변환이 포함되어 있기 때문이며, 산소 자체의 촉매 반응은 일반식(I)로 표시되는 펩티드 C 말단 글리신 부가체로부터 일반식(II)로 표시되는 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체로의 변환반응이다. 따라서, 종래의 펩티드 C 말단 아미드화 효소에 의한 산성 조건하에서의 아미드화 반응의 수율은 일반적으로 낮다.

[실시예 3]

[말 혈청으로부터의 효소-I의 제조]

(1) 시판 말 혈청(기부코사 제품) 100ml에 폴리에틸렌 글리콜 6000(제품) 25% 수용액(w/v)을 100ml, 즉 최종 농도 12.5%가 되도록 교반하면서 서서히 첨가한다. 이하 모두 4℃에서 조작을 수행한다. 12시간 정치한 후, 원심분리(10,000 x g, 10분)하여 수득된 침전물을 120ml의 10mM 헤페스-수산화칼륨 완충액(pH 7.0)에 용해시키고, 다시 2시간 정치한 후 생성된 불용성 물질을 재 원심분리(10,000 x g, 10분)로 제거하여 효소-I을 함유하는 상등액(127ml)을 수득한다.

(2) 상기(I)에서 수득된 활성 분획을 10mM 헤페스-수산화칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 헤파린세파로스 CL-6B(파마시아사 제품)을 충전한 컬럼(1.6 x 15cm)에 건다. 동일한 완충액 96ml로 비흡착 물질을 세척해낸 후, 0.5M 염화나트륨을 함유하는 10mM 헤페스-수산화칼륨 완충액(pH 7.0)으로 용출시킨다(유속 30ml/시간). 제3도에 용출 패턴을 나타낸다. 0.5M 염화나트륨 함유 완충액에 의해 효소-I은 용출된다[분획 번호 No. 14 내지 16을 수집한다(100ml)].

(3) 상기 분획을 Sephadex G-25 파인(파마시아사 제품) 컬럼 크로마토그래피 (5cmφ x 23cm)를 이용하여 겔 여과시킨다. 용매는 10mM 헤페스-수산화칼륨)(pH 7.0)을 이용하여 유속 2ml/분으로 용출시킨다. 단백질은 280nm의 흡광도에서 검출하여 단백질을 함유하는 분획 100ml를 수집한다

(4) 실시예 1에 따라 제작한 아피겔 10-Phe-Gly-Phe-Gly 겔 5ml를 컬럼에 충전시키고(1.0x6.3cm), 0.1M 염화나트륨을 함유하는 10mM 헤페스-수산화칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화시킨다. 이 컬럼에 상기 (3)에서 수득된 시료(18.1ml)를 건다. 효소-I을 충분하게 겔에 흡착시키기 위해 컬럼을 통과한 액을 몇회 컬럼을 통과하도록 순환시킨다(유속 20ml/시간). 12시간 후, 순환을 중지시키고, 비흡착 물질을 35ml의 평형화에 이용한 완충액으로 세척해낸 후, 0.4M 염화나트륨, 20% 아세토니트릴을 함유하는 8mM 헤페스-수산화칼륨 완충액(pH 7.0)으로 용출시킨다(유속 20ml/시간). 효소-I의 활성은 용출 분획(10ml)에서만 확인된다.

(5) 상기 (4)에서 수득된 정제물을, 다시 상기 (3)의 처리를 수행한 후, 10mM 헤페스-수산화칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 Mono Q 컬럼(파마시아사 제품 0.5x5cm)에 놓고, 동일 완충액 중에서 NaCl의 직선 농도 구배를 제3도와 같이 걸어서 단백질을 용출시킨다. 이때 유속은 0.5ml/분으로 한다.

표 1에 상기 (1) 내지 (5)에서 수행한 정제의 각 공정에서의 전단백질량, 전 효소활성, 비활성, 수율 및 정제 배율을 나타낸다.

* 혈청중에 존재하는 단백질 분해 효소의 영향에 의한 것인지 공지되어 있지 않으나, 기질 및 생성물이 일부 분해하기 때문에 상대적으로 활성이 낮다.

활성 측정법은 실시예 2에 기재한 FGFG로부터 FGFhyG의 제조방법에 준한 반응을 각 정제물에 대해 실시하고 여기에서 기술한 HPLC에 의한 FGFhyG를 정량함으로써 수행한다. 효소활성 1U는 1nmol의 FGFhyG가 37℃에서 1시간 동안 생성한 양으로 한다.

또한, 단백질양의 측정은 로우리의 개량법[참조: Bensadoun 등, Anal. Biochem., 70, 265, 1976]을 이용하고, 표준곡선은 소 혈청 알부민(분획 V, 시그마사 제품)으로 작제한다.

표 1에 나타낸 바와 같이, 본 효소는 수율 2%로 약 500배로 정제할 수 있다. 더우기, 정제가 필요한 경우에는 상기 공정 (3) 내지 (5)를 반복하나, 이들중 어느 것의 공정을 반복한다면 좋다.

[실시예 4]

[말 혈청으로부터의 효소-II의 제조]

각 정제공정을 효소-II의 활성을 추적하면서 수행한 이외는 실시예 3과 동일하게 말 혈청을 처리한다.

각 정제 공정 (1) 내지 (5)의 전단백질, 전효소활성, 비활성, 수율 및 정제 배율을 표 2에 나타낸다.

* 혈청중에 존재하는 단백질 분해 효소의 영향에 의한 것인지 공지되어 있지 않으나, 기질 및 생성물이 일부 분해하기 때문에 상대적으로 활성이 낮다.

활성 측정은 10mM 헤페스-수산화칼륨(pH 6.5)중에 실시예 1에서 수득된 페닐알라닐글리실페닐알라닐하이드록시글리신(FGFhyG)을 5mM 농도로 용해시키고, 각 단계의 시료를 첨가하여 총량 100㎕로서 30℃에서 반응시킨다. 1시간 반응시킨 후, 10% 포름산을 첨가하여 반응을 중지시키고, 실시에 2의 조건을 이용하여 HPLC로 반응 생성물을 정량한다. 이때 시료 무첨가 대조군의 반응도 수해하고, 비효소적 변환이 모두 진행되지 않음을 확인한다. 반응 용액의 HPLC 패턴을 제4도에 나타낸다(도표중의 반응조건은, 37℃, pH 6.9에서 반응시간은 도표중에 나타낸다). 활성은 유니트(U)로 표시한 1 U는 1nmol의 FGF-NH를 30℃에서 1시간 동안 생성하는 효소량으로 정의한다.

또한, 단백질양의 측정은 실시예 3과 동일하게 수행한다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 본 효소는 수율 2%로 약 1800배로 정제할 수 있다.

이하의 실시예에서, 래트 하수체 유래의 펩티드 C 말단 아미드화 효소 cDNA를 이용하는 당 효소의 생산에 관해 설명한다.

[실시예 5]

[발현 플라스미드의 제조]

래트 하수체 유래의 폴리 A RNA를 이용하여 cDNA 클로닝을 수행하여 분자량이 상이한 5개의 cDNA를 수득한다[참조: 제6도, 제7도, 생화학, 61, 842 (1989)]. cDNA 클론 205의 EcoR I-Xma I로 절단된 2.58kbp의 DNA 단편을, 동물 배양 세포계 발현 벡터 pSV2 벡터[참조: S. Subramani, R. Mulligan, P. Berg, Mol. Cell. biol. 1, 854 (1981)]의 Hind III-Bgl II 부위에 합성 링커를 개재시켜 삽입하고, 이 플라스미드를 SV-205로 명명한다. 이어서, SV-205의 Nsi I (700)-Xma I 단편을, cDNA 클론 201, 202, 203, 204 각각의 Nsi I (700)- Xma I 단편과 치환한다. 이들의 발현 플라스미드를 SV-201, SV-202, SV-203, SV-204로 한다. 이중, SV-203이 cDNA의 막관통 영역에 상당하는 부분이 제거되어 있음을 확인한다. 이리하여 수득된 SV-203 플라스미드 DNA부터 펩티드 C 말단 글리신 부가체에 작용하여 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체로 변환하는 효소를 발현하는 발현 플라스미드 SV-A를 구축한다. 중앙 부근의 KK 서열 부분을 암호화하는 cDNA 영역 근방에 존재하는 BamH I 부위 [제7도, B (1386)] 이외의 DNA 부분을, BamH I, Xma I [제7도, X (2948)] 분해에 의해 제거시키고, 절단 부위에 합성 DNA 링커를 삽입하고, 연결시키고, 이어서 SV-A 플라스미드를 완성한다. 합성 DNA는 ABI사 제품 DNA 합성기를 이용하여 통상의 방법에 따라 합성함으로써 정제한다. 이 합성 DNA는 BamH I 절단 부위-정제 코돈-Xma I 절단 부위로 구성되어 있다.

이어서, C 말단 α-하이드록실글리신 부가체를, C 말단 아미드화체와 글리옥실산으로 변환시키는 효소를 발현하는 본 발명에 따른 발현 플라스미드 SV-B를 구축한다. 시그날 펩티드를 암호화하는 영역 가까이 하부에 존재하는 Kpn I 부위 [제7도, N (175)] 및, 중앙의 KK 부위 근당에 상당하는 위치에 존재하는 BamH I 부위로 SV-203 DNA를 절단하고, 이 사이를 합성 DNA에 의해 연결하여 발현 플라스미드 SV-B로 한다. 그 결과, 시그날 펩티드 영역과 cDNA 후반부위의 프레임이 합하여 연결된다.

[실시예 6]

[동물 배양 세포중에서의 발현]

배양세포 COS-7은, 10% 소 태반 혈청을 함유하는 합성 배지(DMEM)중에서 생육시키고, 공지의 방법에 의해 실시예 1의 발현 플라스미드를 이용하여 형질전환시킨다[참조: C. Chen and H. Okayama, Mol. Cell, Biol. 7, 2745 (1987)]. 이때 세포 5 x 10⁵개에 대해 20㎍의 발현 플라스미드를 사용한다. 3% 이산화탄소, 35℃의 조건하에 24시간 배양한 후, 소 혈청 알부민(BSA) 0.2%를 함유하는 DMED 배지 10ml로 2회 세포를 세정한 후, 0.2% BSA를 함유하는 DMEM 배지 10ml중, 5% 이산화 탄소, 37℃의 조건 하에 48시간 다시 배양한다.

[실시예 7]

[재조합 세포에 의해 생산된 C 말단 아미드화효소 활성]

실시예 6에서 발현된 세포 배양액을 원심분리에 의해 세포와 상등액(배지)으로 나눈다. 상등액에 대해 효소 활성을 측정한다. 활성측정은 기본적으로는 문헌[참조: J. Biol. Chem., 265, 9602-9605, 1990]에 나타낸 HPLC를 이용한 방법에 따라 수행한다. 즉, C 말단 글리신 부가체의 α-하이드록실글리신 부가체로의 변환 활성은 다음과 같은 반응액 조성(A)으로 반응을 진행하여 일정 시간 반응후에 HPLC에 의해 기질(PheGlyPheGly) 및 생산물 (PheGlyPhehydroxyGly)을 정량하여 구한다.

[반응액 조성(A)]

15 μM PheGlyPheGly

5 mM CuSO₄

5 ㎕/반응액 1ml 카탈라제(시그마)

100 mM MES 완충액 (pH 5.6)

1 mM 아스코르브산

+ 배양 상등액 (배지)

또한, α-하이드록실글리신 부가체의 아미드화물 및 글리옥실산으로의 변환 활성은 다음 반응액 조성(B)를 이용하여 동일한 양식으로 측정한다.

[반응액 조성(B)]

15 μM PheGlyPhehydroxyGly^*

100 mM MES 완충액 (pH 5.6)

+ 배양 상등액 (배지)

* 반응액 조성(A)로의 반응을 진행하고 HPLC로 α-하이드록실글리신 부가체를 분취함에 의해 제조한다. 또한, hydroxyGly는 α-하이드록시글리신을 나타낸다.

측정 결과를 표 3에 제시한다.

SV-a 플라스미드에 의한 형질전환주에서는 현저히 향상된 α-하이드록실글리신 부가체 생산활성이 확인되며, α-하이드록실글리신 부가체를 기질로 한 반응에는 관여하지 않는다. 이에 대해, SV-b 플라스미드에 의해 형질전환된 주에서는 C 말단 글리신 부가체에서는 완전히 반응하지 않으며, α-하이드록실글리신 부가체를 아미드화물로 전환하는 활성만이 확인된다. cDNA의 거의 전영역을 갖는 플라스미드 SV-203에 의해 형질전환된 주에서는 양효소활성이 확인되나, 각각의 효소 활성은 SV-a, SV-b에 비교해 낮다.

다음으로, 이들의 형질전환주에 있어서, 발현하고 있는 효소가 단일한 계통인지를 겔여과 크로마토그래피에 의해 확인한다. 세파크릴 S-200(파마시아사 제품) 컬럼(1x95cm)을 이용하고, 용출 완충액 10mM HEPES-KOH (pH 7.0), 50mM NaCl로 평형화한다. 용출속도는 6ml/시간이고 1ml 분획을 수집한다. 양 효소활성 및 단백질양을 측정한 결과를 제8도 내지 제10도에 나타낸다. SV-a 유래(제8도), SV-b 유래(제9도)의 효소활성은 각각 단일 피크로 되며, 이의 측정된 분자량도 각각 36KDa, 및 54KDa로 각각의 플라스미드가 갖는 cDNA가 암호화하는 단백질의 분자량에 상당한다. 그러나, SV-203 플라스미드 유래의 단백질은 제10도에 나타낸 바와 같이 C 말단 글리신에 작용하여 α-하이드록실글리신 부가체를 생산하는 활성(□-□)과 α-하이드록실글리신 부가체에 작용하여 아미드화물과 글리옥실산을 생산하는 효소 활성(○-○)의 2개의 피크로 분리된다. 또한, 이들의 분자량은 제8도, 제9도에 나타낸 각각의 효소를 단독으로 발현시킨 것과 동일하다. 그 결과는 배양세포중에서 cDNA의 암호화하는 단백질의 중앙부에 위치한 KK 서열이 프로세싱에 의해 절단된 것을 나타내고 있다. 따라서, 이와 같은 전 cDNA 영역을 갖는 cDNA의 발현에 의해서도 본 발명에 따른 2종의 효소를 생산할 수 있음을 나타낸다.

다음, 펩티드 C 말단 아미드화반응에 있어서, 본 발명에서의 2종의 효소를 병용함에 의한 상승효과를 제11도, 제12도를 이용하여 나타낸다. 제11도 및 제8도는 PheGlyPheGly를 기질로 한 경우 아미드화물로의 변환의 시간에 따른 변화를 나타내고 있다. 효소 시료는, SV-a, SV-b 플라스미드와 발현에 의해 수득된 배지 상등액을 상술한 겔 여과에 의해 정제하고, 각각의 활성 분획을 농축하여 제조한다. 제11도에는 SV-a 유래의 것을 나타내나, α-하이드록실 부가체만이 생산되며 아미드화물은 생산되지 않음을 나타내고 있다. 제12도에는, SV-b 유래 만을 사용한 경우(☆), 및 SV-a 유래와 SV-b 유래를 병용한 경우를 나타낸다. SV-b 유래만에서는 α-하이드록실 부가체도 아미드화물도 모두 생산되지않으나, 양 효소를 병용하면 (효소 첨가량은 동량) α-하이드록실 부가체도 아미드화물도 동시에 순조롭게 생산됨을 알 수 있다. 또한, 여기서 더욱 주목해야할 것은, 반응 4시간 이내에 병용한 경우에 반응 효율은 상승하며, 9시간 반응시에는 제7도에 나타낸 SV-a 유래 단독의 경우에 비교해 1.5배 이상의 변환율을 나타낸다는 것이다. 이와 같이 양 효소의 병용은, C 말단 아미드화 반응을 효율적으로 수행하기 때문에 매우 유효한 수단이다.

하기의 실시예로 말에서 유래하는 효소-1 및 효소-II (말 C 말단 아미드화 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 제조에 관해 설명한다.

[실시예 8]

[말 심방으로부터의 폴리 A RNA의 제조]

(1) 전 RNA의 제조

말 심방을 적출한 후 신속히 절개하여 약 2g을 50ml 플라스틱 튜브(Falcon사 제품 번호 2070)에 넣어 액체 질소 중에서 동결시킨다. 20ml의 티오시안산 구아니딘 용액(4M 티오시안산-구아니딘, 25mM 쿠엔산 나트륨(pH 7.0) 0.5% 라우릴자르코신나트륨, 0.1% 안티포름 A, 0.1M 2-머캅토 에탄올)을 가하고, 폴리토론(센트럴 과학 무역)을 이용하여 세포파쇄시킨 후, 18G의 주사침을 장착한 10ml 주사기 (테르모사 제품)로 파쇄액을 수회 뽑아낸다. 저속 원심분리 (300xg, 5분)에 의해 침전을 제거하고, 상등액 7.3ml을 3.7㎖의 Cs TFA 용기(파마시아사 제품), 0.5M EDTA를 함유한 세슘트리 플루오로아세트산 수용액, 밀도를 1.64g/ml로 제조)에 중층하고, 스윙 로타 RPS-40T를 이용한 초원심분리기(제품, SCP85H)에 의해 33,000rpm에서 16시간 처리한다. 침전을 3ml의 4M 구아니딘 용액, 이어서 3ml의 95% 에탄올로 세척한 후, 1.5ml의 Cs TFA 용액에 용해시킨다. 60㎕의 5M NaCl 용액, 3.9ml의 에탄올을 가하여 -80℃에서 30분간 에탄올 침전을 수행하고, 16,000xg에서 15분간 원심분리시켜 침전을 수득하여 70% 에탄올로 세척한 후, 농축기(사쿠마사 제품, EC -57C)에 의해 건조시킨다. 멸균 증류수에 용해시킨 후, 260nm의 흡광도를 측정하여 RNA 양을 정량한다. 이 방법에 의해 말 심방조직 약 2g으로부터 350㎍의 RNA를 수득할 수 있다.

(2) 폴리 A RNA의 제조

전 RNA로부터의 폴리 A RNA의 제조는 mRNA 정제 키트 (파마시아사 제품)를 이용하여 이의 첨부 프로토콜에 따라 수행한다. 올리고(dT) 컬럼에 의한 친화 크로마토그래피는 2회 수행하여 350㎍의 말 심방 전 RNA 보다 13㎍의 폴리 A RNA를 수득한다.

[실시예 9]

[cDNA 라이브러리의 작제]

(1) cDNA의 작제

cDNA 합성 시스템 프라스 (아머샴사제품, RPN 1256Y)를 사용하고, 말 심방 폴리 A RNA 51g을 사용함으로써 cDNA 합성을 수행한다. 합성 순서는 첨부 프로토콜에 충실히 따른다. 프라이머로서 폴리올리고 dT 뉴클레오티드를 사용하고 [α- P]-dCTP를 함유한 합성계로 방사활성에 의한 cDNA 합성 효율을 계산한 경우, 역전사효율이 약 20%이고 제2 본쇄 합성 효율은 90% 이상이다.

(2) cDNA 라이브러리 작제

파아지 DNA로의 연결에 관해서는, cDNA 클로닝 시스템 λgt 10, version 2.0 (아머샴사제품, RPN1257), 파아지로의 패키징에 관해서는, 기가팍; 골드 (스트라타진사 제품)을 사용하고 이들의 첨부 프로토콜에 따라 합성 cDNA에 의해 cDNA 라이브러리를 작제한다.

(3) 대장균의 감염

숙주균으로서는, 대장균 Y1089 (ATCC37196)를 사용하고 컴피턴트 세포는 다음과 같이 조제한다. 단일 콜로니 세포를, 0.2% 말토오스를 가한 NZY 배지 (0.5% NaCl, 1% NZ 아민, 타입 A (和光純藥)0.5% 효모 엑기스(DIFCO), 0.2% 황산 마그네슘, pH 7.5) 5ml에 접종하고 밤새 37℃에서 진탕배양한다.

100㎕를 신선한 동일 배지 5ml에 이식한 다음, 37℃에서 OD= 0.5가 될때 까지 배양한후, 원심분리에 의해 집균한다. 1ml의 10mM 황산 마그네슘 용액에 현탁시켜 컴피턴트 세포로 한다.

컴피턴트 세포 현탁액 0.2ml에 (2)에서 제조된 파아지 용액 0.1ml를 가하고, 56℃에서 보온시킨 탑 아가로오스(0.7% 타입 I-Low EEO-아가로오스(시그마사제품)를 함유하는 NZY 배지) 3ml와 혼합한후, NZY 아가플레이트(1.5% 바크트아가(DIFCO사 제품)를 함유하는 NZY배지 30ml를 Falcon사 제품 1005 플레이트에 첨가)의 상부에 유입한다. 탑아가로오스의 고화후, 37℃에서 밤새 정치 배양한다. 플라크를 확인함으로써 파아지 감염세포를 확인한다.

상기와 같은 방법으로, 2.0x10 개의 말 심방 cDNA 라이브러리를 작제할 수 있다.

[실시예 10]

[C 말단 아미드화 효소 cDNA의 단리]

(1) DNA 프로브에 작제

래트 유래된 펩티드 C 말단 아미드화 효소 cDNA는 이미 단리되어 있고, 그 염기서열은 보고되어 있다(D.A. Soffer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 735-739 (1989), 가도오 등, 생화학, 61, 842 (1989)). 래트 cDNA와 말 유래된 펩티드 C 말단 아미드화 효소 cDNA는 어느 정도의 상동성이 있는 것으로 생각되며, 래트 cDNA의 일부를 입수하고 이를 프로브로 하여 말 cDNA의 단리를 진행시킨다. 래트 cDNA는 도오복구대학 의학부(가도오등, 생화학, 61, 842(1989))로부터 입수하고 이를 제한효소 EcoR I와 Hin II 및 Nsil와 SPh I로 분해하고, 각각 제14도 및 제15도에 도시된 DNA 단편을 단리하고 멀티프라임 DNA 표시키트(아머샴사제품)에 의해 P 라벨하여 프로브로 한다.

(2) 플라크 하이브리드화

실시예 9(3) 대장균 감염에 지시된 방법에 따라 직경 15cm의 플레이트 (FALCON 사제품, No. 1058) 1매에 대해 약 50만개의 플라크를 형성시킨다. 이때, 플라크 형성을 위한 배양은 37℃, 4시간동안 수행한다. 플라크를 4℃, 2시간동안 방치한 후 니트로셀룰로오즈 필터(Schleicher Schuell사 제품, BA85)를 접착하고 파아지 DNA를 필터로 이행한후, 알칼리 용액(0.5M 가성 소오다, 1.5M 염화나트륨) 중에서 DNA를 변성시킨다. 중화액(1.5M 식염, 0.5M 트리스염산 완충액, pH 7.0)으로 중화후, 2xssc 총액 (0.3M 염화나트륨, 30mM 시트르산 나트륨 완충액 pH 7.0)으로 세정한 다음, 통풍 건조후에 감압하 80℃ 2시간가열하고, 이어서 필터에 DNA를 고정한다.

파아지 DNA를 고정시킨 니트로셀룰로오스 필터에, (1)에서 제조한 프로브를 사용하여 플라크 하이브리드화를 수행한다. 필터를 랩-백(이와다니사제품)에 넣고 30ml의 예비 하이브리화액(0.75M 염화나트륨, 50mM 인산나트륨 완충액, pH 7.4, 5mM EDTA, 0.05% 필터, 0.05% 폴리비닐피롤리돈, 0.05% 소혈청알부민(시그마사제품 플라크션 V), 0.1% SDS, 0.2mg/ml 연어정자 DNA)를 가하고 봉입제로 밀봉한 다음, 65℃ 4시간 가온한다. 예비 하이브리드화액을 버리고, 약 1000만 cpm의 방사활성을 갖는 프로브를 함유하는 30ml의 하이브리드화액 (0.75M 염화나트륨, 50mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.4, 5mM EDTA, 0.02% 피콜, 0.02% 폴리비닐피롤리돈, 0.02% 소혈청 알부민, 0.1% SDS, 0.1mg/ml 연어정자 DNA)를 가하고 밀봉후 65℃에서 15시간 하이브리드화를 수행한다. 필터를 250ml의 세정액(0.3M 염화나트륨, 20mM 인산 나트륨 완충액, pH 7.4, 2mMEDTA, 0.1% SDS)로 2회 세정하고, 다시 250ml의 세정액 (30mM 염화나트륨, 2mM 인산나트륨 완충액 7.4, 0.2mMEDTA, 0.1% SDS)로 2회 세정하여 통풍건조한다. 양성 클론의 검출은 X선 필름(후지, HR-H)를 사용하여 -80℃ 하루동안 광노출되는 조건하에 오토래디오그래피로 수행한다.

사용한 2개의 프로브에 대해서, 각각 200만 플라크를 스크린한 경우, 1000개 정도의 양성 클론이 수득된다. 양성 플라크에 의해 파아지 DNA를 회수하고, 재차, 상기 방법에 따라 대장균에 감염시키고, 플라크 하이브리드를 재차 수행하고 이 조작을 플라크가 단일하게 될때까지 반복한다. 통상, 2회 반복함으로써 단일 플라크가 수득된다.

[실시예 11]

[cDNA 염기서열의 결정]

문헌[참조: Molecular Cloning A Laboratory Manual(T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook편, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982), 371-372]에 기재된 방법에 따라, 클로닝된 파아지에 의해 DNA를 분리정제한다. 제한효소 EcoR I(호슈조 제품)에 의해 DNA를 분해하고 1.5% 아가로오스겔 전기영동에 의해 파아지 DNA로부터 cDNA 삽입 DNA 단편을 단리한다. cDNA 단편을 겔로부터 추출하고 대장균 플라스미드 pUC119(호슈조 제품)의 EcoR I 부위에 연결 반응에 의해 재조합한다. cDNA 단편중에 EcoR I 절단부위가 존재하는 경우에는 파아지 DNA를 EcoR I로 부분분해함으로써 cDNA 단편을 수득한다. 플라스미드를 증폭한 후, cDNA 단편을 M13 파아지 mp18, mp19(호슈조제품)에 아클로닝하고, 통상의 방법에 따라 일본쇄 DNA를 수득한다. Sequenase(상품명, 도오요오보오세키사 제품)를 사용하고, 그 사용 설명서에 따라 DNA 염기서열을 결정한다. 일본의 DNA쇄의 염기서열 결정은 약 400 염기로 하고 그것을 넘는 길이의 DNA 단편에 대해서는 적당한 제한효소 부위를 사용하여 아클로닝함으로써 서열결정을 한다. 또 cDNA 단편은 이본쇄의 양쪽쇄와도 염기서열을 결정한다.

제13도에 결정된 말 C 말단 아미드화 효소 cDNA 염기 서열(이 염기서열은 많은 DNA의 해석결과, 최장 cDNA 클론에 대해 도시한다) 및 이 염기서열로부터 예상된 아미노산 서열 (1문자 표시)를 나타낸다. 도면중[ ]로 나타낸 부분의 한쪽 또는 양쪽이 흠락된 cDNA도 확인될 수 있다. 이들의 cDNA는 mRNA 스플라이싱의 양식이 상이한 mRNA로부터 유래한다고 생각된다.

[산업상 이용가능성]

본 발명은 펩티드 C 말단 글리신 부가체로부터 대응하는 펩티드 C 말단 아미드화물의 제조에 이용할 수 있고, 이러한 펩티드 C 말단 아미드화물에는 많은 관심이 주목되는 생리활성 물질이 포함된다.

Claims (6)

1. 일반식 (I)의 펩티드 C 말단 글리신 부가체에 작용하여 일반식 (II)의 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체를 생성시키며, 첨부된 제5도의 사람, 말, 소 및 래트의 각각 42번째 잔기인 P 또는 S로부터 442번째 잔기인 K까지의 아미노산 서열에 대응하는 것중에서 선택되거나, 말 및 소의 각각 42번째 잔기인 P 또는 S로부터 231번째 잔기인 K까지의 아미노산 서열에 대응하는 것중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 펩티드 C 말단 글리신 부가체의 C 말단 아미드화에 관여하는 효소 I 및 일반식 (II)의 펩티드 C 말단 α-하이드록실글리신 부가체에 작용하여 일반식 (III)의 펩티드 C 말단 아미드화물과 글리옥실산을 생성시키며, 첨부된 제5도의 사람, 말, 소 및 래트의 각각 443번째 잔기인 D로부터 830번째 잔기인 K까지의 아미노산 서열에 대응하는 것중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 펩티드 C 말단 글리신 부가체의 펩티드 C 말단 아미드화에 관여하는 효소II 모두를 암호화하는 cDNA를 함유하여 이를 발현시킬 수 있는 플라스미드로 형질전환된 숙주를 배양하고, 효소 I 및 효소 II의 기능 모두를 갖는 효소가 축적된 배양물로부터 효소를 수거함을 포함하여, 효소 I 및 효소 II의 기능 모두를 갖는 효소를 제조하는 방법.

   상기식에서, A는 천연의 α-아미노산으로부터 유래한 α-아미노기 또는 이미노기 및 α-카복실기 이외의 잔기이며, X는 수소원자 또는 카보닐기를 개입시켜 N 원자와 결합하는 아미노산 유도체의 잔기이다.
2. 제1항에 있어서, cDNA가 포유동물로부터 유래된 방법.
3. 제1항에 있어서, 막 관통 영역(transmembrane region)에 상응하는 부분이 cDNA로부터 제거된 방법.
4. 제2항에 있어서, 포유동물이 래트 또는 말인 방법.
5. 말로부터 유리된 제1항에 기재된 효소 I 및 효소 II의 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열.
6. 제5항에 있어서, 폴리펩티드가 하기와 같은 공통된 아미노산 서열 및 이의 하부에 하기의 i) 내지 iv)에 나타낸 아미노산 서열로부터 각각 선택된 하나의 아미노산 서열을 갖는 DNA 서열.