WO1991002790A1 - Enzymes which participate in c-terminal amidation, and production and use thereof - Google Patents

Description

明 細 書

C末端ア ミ ド化に関与する酵素ならびに それらの製造方法および使用

〔技術分野〕

本発明は、 ペプチ ド c末端グリ シン付加体の C末端ア ミ ド 化に関与する新規酵素、 それらの製造方法および使用に関す る。 c末端ァ ミ ド化に関与するとは、 ぺプチ ド C末端グリ シ ン付加体をそのペプチ ド C末端ア ミ ド化物に転化するいずれ かの段階を促進する作用を有することをいう。 〔背景技術〕

従来、 生体内酵素反応によるぺブチ ド C末端グリ シ ン付加 体、 （ c末端残基にグリ シ ンがペプチ ド結合した化合物） の C末端ァ ミ ド化に関与する酵素は、 ぺブチジルダリ シ ン一 o —ァ ミデーテ ィ ングモノ ォキ シゲナーゼ （ぺプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素）（EC.1.14.17.3) と呼ばれており （Bradbury ら、 Nature, 298, 686, 1982： Glembotski J. Biol . Chem. , 259, 6385, 1984)、 次のような反応を触媒していると考えら れてきた。

-CHCONHCHzCOOH ~→— CHC0NH₂+グリ オキ シル酸 生体内でのア ミ ド化機構の解明、 ならびに組換え D N A技術 によって生産されるペプチ ドを C末端がア ミ ド化されて初め て生理活性を示すペプチ ド類、 例えばカルシ ト ニ ン、 ガス ト リ ンなどへ生体外で転化する方法に利用すベく、 本酵素を精 製する試みがなされてきた。 このような酵素の例としては、 ゥ シ脳下垂体中葉（Murthy ら、 J . B i o 1. Chem . , 261, 1815 = 1986 ) 、 ブタ脳下垂体（Kizerら、 Endocrinology. ϋ^, 2262, 1986 : Bradburyら、 Eur. J. Biochem. , 169. 579, 1987)、ブタ 心房（Kojimaら、 J. Biochem., 105, 440, 1989)、 アフ リ カ ッ メガエノレ体皮 (Mizunoら、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 137 984, 1986)、 ラ ッ ト甲状腺腫瘍（Mehtaら、 Arch. Biochem. Bio- Phys., 261, 44, 1988 ) 由来のものが報告されている。

また、 これらの精製酵素を多量に入手することが困難であ ることから、 近年、 一般に行われるようになった組換え D N A技術を用い、 これらの酵素の発現に必要な対応する cDNAの 単離およびそれらを利用した該酵素の製造が試みられている。 例えば、 Eipper B丄 らは、 Mol . Endocrinol 1， 777 〜790, 1987で、 Ohsuye , K りは、 Biochem. Biophys. Res. Commun. ΙοΟ, 1275〜： 1281, 1988で、 Stoffers, D.A.らは、 Proc. Natl . Acad. Sci.USA, 86, 735〜739, 1989 で、 そして Glauder, J. らは Biochem. Biophys. Res. Commun, 169， 551〜558 1990、 で、 そ れぞれゥ シの下垂体、 力エルの皮廣、 ラ ッ トの心房およびヒ トの甲状腺細胞由来のぺプチ ド C末端アミ ド化酵素 cDNAを公 表しており、 また、 必ずしもその生産性において満足できる ものでないが、 力エル由来およびゥシ由来の cDNAを利用した 組換え D N A技術を用いたぺプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素の生 産例も知られている （例えば、 それぞれ特開平 1 — 104168号 および国際公開 W089/02460 号公報、 ならびに Perkins ら、 Mol. Endocrinol, 4, 132〜139, 1990)。

他方、 これらの蛋白質は、 それぞれの採取方法などの相違 によりゥシ由来のものが 38 , 42または 54KDa の分子量、 カェ ル由来のものが 39KDa の分子量、 ラ ッ トでは 41 , 50または 75 KDa の分子量を有すると報告され、 例えば、 前記 Bradburyら の文献、 Ramer ら、 J. Am. Chem. Soc. , 110, 8526-8532 (1988) および Young ら、 J. Am. Chem. Soc. , 111, 1933-1934(1989) に よれば反応中間体の存在も示唆されている。 しかし、 現在の ところ、 かかる中間体の単離ならびにその中間体とア ミ ド化 酵素との関係を明らかにした例はない。

前述のように、 ペプチ ド C末端ァミ ド化酵素は、 生体内で 非常に興味深い作用を示し、 特定の生体器官に由来する一定 の純度を有する組成物も知られている。 しかし、 これらの組 成物を生体外におけるペプチ ド C末端ア ミ ド化物の生産に用 いるには、 その純度および安定性ならびに製造原価の面で十 分なものとはいえない。 本発明者らは、 これらの課題を解決 するには当該酵素に閬する基礎的知見の収集、 すなわち、 C 未端アミ ド化反応をおこなう反応機構の解明をおこなう こと が必要と考え、 中間生成物の単離を試みたところ、 中間体を 単離し構造決定することに成功した。 この結果、 ペプチ ド C 末端ァ ミ ド化反応は、 従来考えられていたような 1段階の反 応ではな く、 中間体 （対応する C末端 or— ヒ ドロキシルグリ シン付加体） を介した 2段階の反応であることを見い出した, ところで、 それぞれの反応を触媒する酵素を適当な条件で個 々 にまたは組み合わせて使用するとペプチ ド C末端グ リ シ ン 付加体の対応するア ミ ド化物への転化を効率よ く実施できる こ とが予測される こ とからこれらの酵素の提供が望まれるで あろう。 また、 これらの酵素の存在が確認できた場合には、 それらの効率のよい製造方法を提供するこ とも望まれるであ ろう。

〔発明の開示〕

本発明によれば、 次式 （ I )

(H)

I .

X-N-A-C0NHCH₂C00H ( I )

(上式中、 Aは、 天然の 一ア ミ ノ酸に由来する ff —ァ ミノ 基もし く はィ ミ ノ基および or—カルボキシル基以外の残基を 表しており、 Xは、 水素原子またはカルボ二ル基を介して N 原子と結合するア ミノ酸誘導体の残基を表す） で示される C 末端グリ シン付加体に作用して、 次式 （ II )

(H) 0H

I I

X-N- A-C0NHCHC00H ( Π )

(上式中、 Aおよび Xは、 前記の意味を表す） で示される C 末端 α—ヒ ドロキシルダリ シン付加体の生成に関与する酵素 (以下、 「酵素一 I 」 ともいう ） 、 ならびに前記式 （ Π ) で 示される C末端 o —ヒ ドロキシルグリ シン付加体に作用して 次式 （ m )

(H)

X-N-A-CONHz ( I )

(上式中、 Aおよび Xは、 前記の意味を表す） で示される C 末端ア ミ ド化物とグリ オキシル酸の生成に関与する酵素 （以 下、 「酵素一 Π 」 ともいう ） が提供される。

なお、 式 （ I ) および （ π ) ならびに下記式 （ m ) のカ ツ コ内の水素原子 （ H ) は、 Aが α —イ ミ ノ基を有する or—ァ ミ ノ酸に由来する場合には水素原子を有しないことを意味す る。

これらの酵素を個々にまたは組み合わせて使用する こ とに よって、 式 （ I ) のべプチ ド C末端グリ シン付加体から式 ( ΙΠ ) の対応するペプチ ド C未端ァ ミ ド化物への転化を効率 よ く 実施するこ とが可能になる。

また、 本発明によれば特定のリ ガン ドを担持する基質親和 性を使用して前記酵素含有物からのこれらの酵素の製造方法， およびこれらの酵素活性ポリ べプチ ドをコ一ドする cDNAを利 用してそれぞれの酵素を効率よ く製造する方法が提供される, また、 本発明によれば前記酵素活性の測定方法およびかか る酵素含有物の探索方法が提供される。

またさ らに、 本発明によれば、 ゥマに由来する前記酵素活 性を有するボリ ペプチ ドをコー ドする cDNAが提供される。

〔図面の簡単な説明〕

第 1 図は、 FGFGを基質と し、 本発明の酵素一 I を用いて、 FGFhyGを製造する ときの HPLCパターンである。 なお、 本明細 書及び図面においてァ ミ ノ酸配列を一文字表示する場合の各 符号は当該技術分野で通常用いられている意味を表し、 そし て h y Gは α —ヒ ドロキシグリ シ ンを意味する。 第 2図は、 調製した FGFhyGの分子構造を確認するためにお こなった FAB- MSスぺク ト ル分析の結果を示す。

第 3図は、 Mono Qカ ラムのク ロマ トグラフ ィ 一による本発 明の酵素— I と酵素— Dの分離を示したク ロマ トパターンで ある。 白四角のプロ ッ トは酵素— Πの活性を示し、 黒丸のプ ロ ッ トは酵素一 I の活性を示し、 破線は食塩の直線濃度勾配 を示す。

第 4図は、 FGFhyGを基質とし、 本発明の酵素— Πを用いて FGF-NIh を製造するときの経時的な HPLCパターンである。

第 5図は、 ヒ ト、 ゥマ、 ゥ シ、 ラ ッ ト、 力エルより ク ロー ユングされたぺブチ ド C末端ァ ミ ド化酵素 cDNAより推定され たァミノ酸配列を一文字表示で示したものである。

第 6図はラ ッ ト下垂体 mRNAよりクローユングした C未端ァ ミ ド化酵素 cDNAの塩基配列およびそれにより推定されたァ ミ ノ酸配列を示したものである。

第 7図はラ ッ ト下垂体 mRNAよりクローニングされた 5つの C末端アミ ド化酵素 cDNAを模式的に示したものである。 推定 される酵素がコー ドされる領域をボックスで示した。 数字は 翻訳開始点を 1 とした塩基数 （bp) を示す。 T Mは膜貫通領 域に対応する部分を示し、 K Kはリ ジン—リ ジン配列を示す, なお、 制限酵素はそれぞれ次の略号で示した。

B (BamH I ) , N ( Hs I ) , R I ( EcoR I ) ,

R V (EcoR V ) , S (Sph I ) , X ( ma I )

第 8図、 第 9図、 第 10図は、 それぞれ、 プラス ミ ド SV-a , SV-b , SV-203により発現した酵素のセフ ァ ク リ ル S-200 力 ラ ムク ロマ トグラフ イ ーバターンを示した。

第 11図、 第 12図は、 PheGlyPheGlyを基質と したときの、 α —ヒ ドロキ シルグ リ シ ン体、 C末端ア ミ ド化体の産生の経時 変化を示した。

第 13図は、 単離したゥマ由来のペプチ ド C末端ア ミ ド化酵 素活性を有するポリ ぺプチ ドをコ一ドした cDNAの中で、 最も 長い cDNA断片の塩基配列およびそれにコー ドされるア ミ ノ酸 配列を一文字表示で示した。

第 14図および第 15図は、 それぞれ異なる制限酵素で消化し、 プローブと して使用したラ ッ ト由来のぺプチ ド C末端ァ ミ ド 化酵素をコ一ドする cDNAの一部の塩基配列を示した。

〔発明を実施するための最良の形態〕

本発明における式 （ I ) で示されるペプチ ド C末端グリ シ ン付加体、 すなわち本発明の酵素の基質としては、 一般的に.

(H)

前記式の X— N— A— CO— 部が天然または合成のア ミ ノ酸誘導 体類、 特に、 ペプチ ドまたは蛋白質類に由来し、 その C末端 ァ ミ ノ酸残基 〔一 H(H)— A— CO— で示される〕 にグリ シンが ペプチ ド結合した化合物が挙げられる。 これらの C末端ア ミ ノ酸残基と しては天然の α—ア ミ ノ酸、 特にタ ンパク質構成 ア ミ ノ酸、 例えばグリ シン、 ァラニンのような脂肪族ァ ミ ノ 酸 ； ノ リ ン、 ロイ シ ン、 イ ソ ロイ シ ンのよう な分技ア ミ ノ酸 セ リ ン、 ス レオニ ンのよ う な ヒ ドロキ シア ミ ノ 酸 ； ァ ス ノ、'ラ ギン酸、 グルタ ミ ン酸のような酸性ア ミ ノ酸 ； ァスパラギン グルタ ミ ンのよ う なア ミ ド ； リ ジ ン、 ヒ ド ロキ シ リ ジ ン、 ァ ルギニ ンのよ う な塩基性ァ ミ ノ酸 ； システィ ン、 シスチン、 メ チォニンのような舍硫ア ミ ノ酸 ； フエ二ルァラニン、 チロ シンのような芳香族ア ミ ノ酸 ； ト リ ブ ト フ ァ ン、 ヒ スチジ ン のよ うな複素環式ァ ミ ノ酸 ； プロ リ ン、 4 ー ヒ ド ロキ シプロ リ ンのようなィ ミ ノ酸に由来する残基が挙げられる。 また、 このア ミ ノ酸残基の 一ア ミ ノ基も し く はィ ミ ノ基に結合す る水素原子またはア ミ ノ酸誘導体の残基 〔 X—で示される〕 の該残基としては、 単一のア ミ ノ酸または α —ア ミ ノ基を介 してペプチ ド結合し得るペプチ ド類であれば、 その構成ア ミ ノ酸残基の種類およびべプチ ドの鎖長に制限はな く、 さ らに その構成ア ミ ノ酸残基にリ ン酸もし く は糖またはその他の置 換基が共有結合していてもよ く、 また脂質と複合体を形成し ていてもよい。 前記置換基の具体的なものとしては、 それぞ れのァ ミ ノ酸残基に対応して、 ァルギニン残基のグァニジノ 基に置換する基、 例えば、 メ チル基も し く はェチル基などの アルキル基またはアデノ シンニリ ン酸リ ボース、 シ トルリ ン もし く はオル二チンに由来する残基 ； リ ジ ン残基の ε —ア ミ ノ基に置換する基、 例えば、 ダルコ シル基、 ピリ ドキシル基 ピオチュル基、 リ ボイ ル基も し く はァセチル基またはリ ン酸 —水酸基を有する化合物、 一ダルコ シル基を有する化合 物、 ダルタルアルデヒ ドもし く は無水シ ト ラコ ン酸に由来す る残基 ； ヒスチジン残基のィ ミダゾール基に置換する基、 例 えば、 メ チル基、 リ ン酸基も し く はョー ド原子またはフ ラ ビ ンに由来する残基 ； プロ リ ン残基に置換する基、 例えば、 水 酸基、 ジ水酸基も し く はグリ コ シルォキシ基 ； フユ二ルァラ ニン残基のベンゼン環に置換する基、 例えば、 水酸基も し く はグリ コ シルォキシ基 ； チロ シン残基の水酸基に置換する基、 例えば、 グリ コ シルォキ シ基、 スルホン酸基、 沃素原子、 臭 素原子もし く は塩素原子または水酸基を有する化合物、 ビス エーテル、 アデニン、 ゥ リ ジンもし く は R N A ( リ ボ核酸） に由来する残基 ； セ リ ン残基の水酸基に置換する基、 例えば、 メ チル基、 グリ コ シル基、 ホスホバンテテイ ン基、 アデノ シ ンニリ ン酸リ ボシルもし く はリ ン酸基 ； ス レオニン残基の水 酸基に置換する基、 例えば、 グリ コ シン基、 メ チル基もし く はリ ン酸基 ； システィ ン残基の S H基に置換する基、 例えば、 グリ コ シル基、 シスチニル基、 デヒ ドロアラニル基もし く は セ レン原子またはヘムもし く はフラビンに由来する残基 ； ァ スパラギン酸またはグルタ ミ ン酸残基のカルボキシル基に置 換する基、 例えば、 メ チル基、 リ ン酸基もし く は r一カルボ キシル基 ； ァスバラギンまたはグルタ ミ ン残基のァ ミ ド基に 置換する基、 例えば、 グリ コ シル基、 ピロ リ ドニル基も し く はィ ミ ノ基などが挙げられる。

上記基質としてのペプチ ド C末端グリ シン付加体、 すなわ ち C末端残基にダリ シンがペプチ ド結合したぺプチ ドまたは その誘導体は天然から抽出したものでも、 化学合成によって 生産したものでもまた組換え D N A技術を用いて生産したも のでもよい。 従って、 本発明の基質、 式 （ I ) で示される化 合物としては、 ペプチ ド類、 例えば、 ア ミ ノ酸残基数 2 〜： L00 程度のペプチ ド、 カゼイ ン、 プロテイ ンキナーゼ、 アデノ ウ ィルス E I A蛋白質、 RAS 1蛋白質などで代表される リ ン酸 ペプチ ドおよびその加水分解物、 ス ロ ンボブラ スチ ン、 , リ ボ蛋白質、 リ ポビテ リ ンなどで代表される リ ポ蛋白質およ びその加水分解物、 ヘモグロ ビン、 ミオグロ ビン、 へモ シァ ニ ン、 ク ロ ロ フ イ スレ、 フ ィ コ シァニ ン、 フ ラ ビン、 ロ ドプシ ンなどで代表される金属蛋白質およびその加水分解物、 コ ラ —ゲン、 ラ ミ ニ ン、 イ ンターフェ ロ ン α、 セ ロ グリ コ イ ド、 ア ビジンなどで代表される糖蛋白質およびその加水分解物な らびにその他の C末端カルボキ シル基がァ ミ ド化されて成熟 型の生理活性ペプチ ド、 例えばカルシ ト ニ ン、 セク レチ ン、 ガス ト リ ン、 血誊作用性小腸べプチ ド（V I P ) 、 コ レシス トキ ニ ン、 セルレイ ン、 滕ポ リペプチ ド、 成長ホルモ ン放出因子， 副腎皮質刺激ホルモ ン放出因子、 カルシ ト ニ ン遺伝子関連べ プチド等を形成するペプチ ド類各々の C末端グリ シン付加体 (すなわち、 C末端カルボキ シル基とグリ シ ンのア ミ ド結合 化合物） が挙げられる。 これらのう ち、 本発明の酵素の酵素 活性を確認するために好ましい基質としては、 例えば、 D— チロ シノレノ リ ノレグ リ シ ン、 D —チロ シノレ ト リ フ ' ト フ ァ ニノレグ リ シン、 グリ シルフ ェニルァ ラニルグリ シ ン、 フ エ二ルァ ラ 二ルグリ シルフェニルァ ラニルグリ シ ン、 D —チロ シルロ イ シルァスノ、 ·ラギニルグリ シン、 アルギニルフ エ 二ルァ ラ 二ル グリ シ ン、 ァ ノレギニノレアラニノレア ノレギニノレロ イ シノレグリ シ ン . ロ イ シノレメ チォニノレグリ シ ン、 グリ シノレロ イ シルメ チォニル グリ シ ン、 フエニノレア ラニノレグリ シルロ イ シルメ チォニルダ リ シン、 ァ スノ、'ラギニルアルギニルフ エ二ルァ ラ 二ルグリ シ ン、 ト リ プ ト フ ァ ニルァスノヽ 'ラギニルアルギニルフ エニルァ ラ ニルグリ シ ン、 ァ ラ ニルフ エ二ルァ ラ 二ノレグ リ シ ン、 リ ジ ルァ ラユルフ ェ二ルァ ラ 二ルグリ シ ン、 セ リ ルリ ジルァ ラ 二 ルフ ヱ二ルァ ラ 二ルグリ シ ン、 ァノレギニルチロ シルグ リ シ ン、 グリ シルメ チォニルグリ シ ン、 グリ シルチコ シルグリ シ ン、 グリ シルヒスチジルグリ シ ン、 ヒスチジルグリ シルグリ シ ン、 ト リ プ ト フ ァ ニルダリ シルグ リ シ ン、 およびグリ シルシステ ィ ニルグリ シ ン等が挙げられる （なお、 グリ シ ンを除き D— と特に示さないものは L一型を示す） 。 一方、 本発明の酵素 の有効利用に好ま しい基質としては、 前記 C未端カルボキ シ ル基がァ ミ ド化されて成熟型の生理活性べプチ ドを形成する。 その C末端カルボキ シル基にグ リ シ ンがぺプチ ド結合したぺ プチ ド類が挙げられる。

本発明の酵素一 I は、 前記基質に作用して次式 （ Π )

(H) 0H

X - N - A - C0NHCHC00H ( H )

(H)

I

〔上式中、 X— N— A— CO 部の具体例は前記式 （ I ) について 定義したような意味を有する〕 で示される C末端 α—ヒ ドロ キ シルダリ シ ン付加体を生成する こ とができ る。

(Η)

式 （ Π ) で示される化合物は、 X— Ν— A _ C0 部に悪影響を を及ぼさない条件下で加水分解するか、 後述する本発明の酵 素一 Dで処理する こ とによ り対応する C末端ァ ミ ド化物に転 化するこ とができる。 また、 前記酵素一 I は、 それぞれ起源により異なり、 例え ばゲル濾過を使用する分子量決定法によれば、 後述の該酵素 活性舍有物から分離精製するとゥマで約 25キ口ダル ト ン（KDa) であり、 ラ ッ トでは約 36KDa の分子量を有する。 なお、 本発 明の cDNAを利用して産生される該酵素の分子量は、 場合によ つて付加塩基配列に由来するァ ミノ酸配列を伴うので同等か または若干大きい分子量を有する。 すなわちこの分子量は、 それ自体公知のゲル濾過法 〔例えば、 "生化学実験講座 5、 酵素研究法、 上巻、 283〜298 頁" 、 東京化学同人（1975)〕 に従い決定することができる。 具体的には、 lOOmMの塩化力 リ ゥムを舍む 50mMの ト リス—塩酸 （pH7.4 ) を平衡化および 溶出液として用い、 トヨバール HW— 55S (東ソ一社製） 上でゲ ル濾過を行い、 ーア ミ ラーゼ（M.W.200, 000) 、 アルコール デヒ ドロゲナーゼ（M.W. 150, 00) 、 BSA(M.W.66,000) 、 カル ボニックアンヒ ドラーゼ（M.W.29，000)およびチ トクローム C (M.W.15，400)を指標として決定した。

本発明の酵素一 I は、 起源により相違することなく、 ほぼ 以下の理化学的性質により特定される。 すなわち、

( a ) 至適 pHが約 5〜 7でかつ安定 pHが 4〜 9にあり、

( b ) 作用適温が 25〜40'Cの範囲にあり、

( c ) 金属イオンおよびァスコルビン酸を補因子とする。 上記 （ a ) および （ b ) の性質は、 通常使用される緩衝液、 具体的には、 ト リ ス—塩酸、 メ ス—水酸化カ リ ウム、 テス一 水酸化ナ ト リ ウム、 へぺス一水酸化力 リ ゥム緩衝液を用いて 測定したものである。 なお、 本発明の酵素組成物は、 l 'C〜 55 'Cの温度範囲内で前記反応を触媒するが、 56 'Cでは約 10分 で失活し、 40て付近でも若干の失活がみられる。

金属イオ ンと しては、 Cu²⁺ , Zn²⁺ , i²⁺ , Co^2t , Fe^{3 +}等が 適当であり、 特に Cu²⁺ , Zn^{z +}が好ま しい。

本発明はさ らに、 次のもう一種の酵素も提供する。 すなわ ち、 前記式 （ Π ) で示されるペプチ ド C末端 or—ヒ ドロキシ ルグリ シン付加体に作用して、 次式 （ ΙΠ )

(H)

X-N-A-CONHz ( I )

(上式中、 Aおよび）（は、 前記の意味を表す） で示されるぺ プチ ド C末端ア ミ ド化物とグリオキシル酸を生成する酵素一 Πが提供される。 この酵素もまたその起源により分子量は異 なるが、 後述の該酵素活性舍有物から分離精製する と、 例え ばゲル濾過を用いる分子量決定法によれば、 ゥマで約 40KDa であり、 ラ ッ トで約 43KDa の分子量を有するぺブチ ド C末端 グリ シン付加体の C末端ア ミ ド化に関与する酵素である。 ま た、 cDNAを利用して産生される該酵素の分子量は酵素— I と 同様に若干大きい場合もある。 この酵素の特定に使用される (H)

X— N— A— CO—部の意味は、 酵素一 I の特定に用いたのと同 一である。 なお、 酵素— Π の酵素活性を確認するために好ま しい基質と しては、 前記酵素一 I について具体的に列挙した 基質に対応する C末端 or—ヒ ドロキ シルグリ シン化物が挙げ られる。 例えば、 これらの具体的なものとしては、 D—チロ シルバリ ノレ なーヒ ドロキ シグリ シン、 D—チロ シノレ ト リ フ' ト フ ァ ニル or — ヒ ドロキ シグリ シ ン、 グリ シルフ ェニルァ ラ ニ ル — ヒ ド ロキ シグリ シ ン、 フ エ二ルァ ラ 二ルグ リ シルフ ェ ニルァ ラニル or — ヒ ドロキ シグリ シ ン、 D —チロ シノレロ イ シ ルァス ノヽ *ラギニル or — ヒ ドロキ シグリ シ ン、 アルギニノレフ エ ニルァラ ニル o — ヒ ドロキ シグリ シ ン、 アルギニルァ ラニル アルギニルロ イ シル α — ヒ ド ロキ シグリ シ ン、 ロ イ シルメ チ ォニル ー ヒ ドロキ シグリ シ ン、 グリ シルロ イ シルメ チォニ ル or — ヒ ドロキ シグリ シ ン、 フエ二ルァ ラニルグリ シノレロ イ シルメ チォニル or — ヒ ドロキ シグリ シン、 ァ スノ、'ラギニルァ ルギニルフ エニルァ ラ ニル or — ヒ ドロキ シグリ シ ン、 ト リ プ ト フ ァ ニルァ スノヽ*ラギニルアルギニルフエニルァ ラニル 一 ヒ ドロキ シグリ シ ン、 ァ ラユルフェニルァ ラニル α — ヒ ドロ キ シグリ シ ン、 リ ジルァ ラユルフェニルァ ラニル ー ヒ ドロ キ シグリ シン、 セ リ ルリ ジルァ ラニルフエニルァ ラニル 一 ヒ ドロキ シグリ シン、 アルギニルチロ シ レ α — ヒ ド ロキ シグ リ シ ン、 グリ シルメ チォニノレ o — ヒ ドロキ シグリ シ ン、 グリ シノレチロ シノレ or — ヒ ド ロキ シグリ シ ン、 グリ シノレ ヒ スチジノレ α — ヒ ドロキ シグリ シ ン、 ヒ スチジルグリ シル ー ヒ ドロキ シグリ シ ン、 ト リ ブ ト フ ァ ニルグリ シル or — ヒ ド口キ シグリ シ ンおよびグリ シルシスティ ニル or — ヒ ドロキ シグリ シ ン等 が挙げられる。 また酵素一 ]!はその他の理化学的性質として 次の性質を有すことにより特定される。 すなわち、

( a ) 至適 pHが約 5〜 6でかつ安定 pHが 4〜 9にあり、 そ して

( b ) 作用適温が 15〜35ての範囲にある。 - 上記 （ a ) および （ b ) の性質は、 通常使用される緩衝液、 具体的には、 ト リ スー塩酸、 メ ス一水酸化カ リ ウム、 テス一 水酸化ナ ト リ ウム、 へぺス一水酸化カ リ ウム緩衝液を用いて 測定したものである。 なお、 本発明の酵素組成物は、 1 て〜 55 'Cの温度範囲内で前記反応を触媒するが、 56てでは約 10分 で失活し、 40 'C付近でも若干の失活がみられる。

酵素の調製

以上で説明した本発明の酵素一 I および酵素— Π は、 該酵 素活性含有物からそれ自体公知の酵素の分離精製法により調 製するこ とができるが、 好ま し く は、 本明細書で開示する以 下の本発明の調製方法により得る こ とができる。 すなわち、 酵素一 I または酵素一 Πの酵素活性含有物を、 前記式 （ I ) で示されるペプチ ド C末端グリ シン付加体をリ ガン ドする基 質親和性ク ロマ トグラフ ィ ー、 および陰イオ ン交換ク ロマ ト グラフ ィ一で処理することを特徴とする酵素一 1 または酵素 一 Dの調製方法が利用できる。

この方法に用いる酵素活性舍有物は、 本発明の酵素を舍む ものであればすべて対照にすることができ、 天然に見い出さ れる ものまたは人工的に提供される もののいずれであっても よい。 一般に、 天然に見い出される ものと してはこれらの酵 素活性を有する生物、 例えば、 ヒ ト、 ゥ シ、 ゥマ、 ブタ、 ヒ ッジ、 ゥサギ、 ャギ、 ラ ッ トおよびマウスなどの哺乳類、 二 ヮ ト リ、 ャケィおよびカヮラバ トなどの鳥類、 イ シガメ 、 マ ムシ、 ガラガラへビおよびコブラなどの爬虫類、 ィ モ リ、 ァ フ リ カツメ ガエル、 ゥ シガエルおよびヒキガエルなどの両性 類、 ャッメ ゥナギ、 メ ク ラ ウナギ、 アブラザメ 、 シビレエイ 、 チ ョ ウザメ 、 二シ ン、 サケ、 ゥ ナギ、 ト ラ フグおよびタ イ な どの魚類、 ヮモ ンゴキブ リ 、 カ イ コ、 シ ョ ウ ジヨ ウバエおよ よびミツバチなどの昆虫に由来する調製物が挙げられる。 こ のような好ましい調製物の具体的なものとしては、 哺乳類の 脳、 下垂体、 胃、 心臓および肝臓などの器官に由来する均質 化物ならびに血液およびリ ンパ液などの体液などを含む生物 学的流体が挙げられる。

すなわち、 前述のような本酵素を有する生物学的流体を、 次式 （ I )

(H)

I

X - N - A - CONHCH z COOH ( I )

(上式中、 Aおよび Xは前記の意味を有する） で示されるぺ プチ ド C末端ダリ シ ン付加体をリ ガン ドとする基質類似体親 和性クロマ トグラフィーを用い、 必要により、 酵素の精製に 常用される

( 1 ) 沈殺による分画、

( 2 ) へバリ ン親和性ク ロマ ト グラ フ ィー、

( 3 ) 透折、 ゲル濾過等により分子量分画方法、 および Z または

( 4 ) イ オ ン交換ク ロマ ト グラ フ ィーとを組み合わせて使 用することにより本発明の酵素 （酵素一 I および酵素— D ) を得ることができる。

前記のリ ガン ドとしては、 前述の式 （ I ) で示されるぺプ チ ド C末端グリ シン付加体であればすべて使用できるが、 前 記酵素活性を確認するために好ま しいものと して具体的に列 挙したダリ シ ンを含め 2〜 6個のァ ミノ酸残基からなるぺプ チ ド類が挙げられる。 これらのう ち、 D- Tyr-Trp- Gly, Phe - Gly-Phe-Gly および Gly-Phe-Gly がより好ま しいものである が、 Phe-Gly-Phe-Gly をリ ガン ドとするものが、 本発明の酵 素 （本酵素ともいう ） に強い親和性を有するこ とから特に好 ま しい。

これらのリ ガン ドは、 通常、 水不溶性担体に結合せしめて 使用されるが、 リ ガン ドと して用いられるペプチ ドの C末端 グリ シン残基のカルボキシル基は、 遊離の状態である こ とが 本酵素との結合に重要であり、 N末端のア ミ ノ酸残基のア ミ ノ基を介して担体と結合させる必要がある。 すなわち、 担体 と しては、 ぺプチ ドのァ ミ ノ基と結合可能なものであれば何 でもよ く 、 またア ミ ノ基と反応する活性基を担体に化学的に 導入しても、 また、 既に導入された市販の担体を使用しても よい。 化学的に導入する方法は、 一般に使用されている方法 でよ く、 例えば、 "生化学実験法第 5巻上巻 257頁〜 281頁 笠井著 東京化学同人（1975)に記載されているよう に、 例え ばァガロースに臭化シア ンを用いて、 ィ ミ ドカルボキシル基 を導入する。 市販されている活性化された担体は、 基材を指 標とすると、 例えばァガロース系、 セルロース系、 親水性ボ リ ビニール系等がある力 これらのどれを用いても構わない, ァガロース系担体と しては、 リ ガン ドのァ ミ ノ基との結合方 法に CNBr法を用いる CNBr活性化セファ ロース 4 B (フア ルマ シァ社製） 、 カルボジィ ミ ド法を用い C H—セファ ロ一ス 4 B、 E C H —セファ ロ一ス 4 B (以上、 フア ルマ シア社製） ァフ ィ ゲル 10、 ァフ ィ ゲル 15 (以上、 バイ オ ラ ッ ド社製） 、 ト レシルク 口 ラ イ ド法を用いる ト レシル活性化セフ ァ ロース 4 B (フ ア ルマシア社製） 等が挙げられる。 セルロース系担 体としては、 ホルミ ル法を用いるホル ミ ノレセノレロフア イ ン

(チッ ソ社製） が挙げられる。 親水性ポリ ビニール系担体と しては、 カルボジィ ミ ド法を用いる A F —力ルボキ シ ト ヨノ、' 一ル 650 、 ホルミル法を用いる A F —ホルミ ル ト ヨパール 650 、 ト レシルク 口 ラ イ ド法を用いる A F — ト レシル ト ヨ ノ 一ル 650 、 エポキシ活性化法を用いる A F —エポキシ ト ヨバ ール 650(以上東ソ一社製） 等が挙げられる。 リ ガン ドとの結 合反応はそれぞれの担体の使用説明書に従い反応させれば良 い。

このう ち、 ァフ ィ ゲル 10について作製方法を記載する。 ァ フィゲル 10とぺブチ ドとの反応は 0.001〜 1 M好ま し く は 0. 1 Mのモ ップス一水酸化力 リ ゥム等の緩衝液中で行う。 反 応条件は 0〜20· (：、 10分〜 24時間、 ΡΗ 3〜11程度が可能であ るが、 好ま し く は 4 て、 4〜24時間、 ρΗ 5〜 9 の条件で行う。 ァフ ィゲル 10と結合に用いるぺプチ ドの混合比は、 ァフ ィゲ ル 1 に対し、 ぺプチ ドが約 25〃 mo £までは多 く加える程多 く結合するので、 その範囲内でい く らでもよいが、 結合効率 の点から 1〜20 mo 程度が好都合に用いられる。 反応後、 反応時に用いた緩衝液で十分に洗浄後、 ト リ ス —塩酸 (PH 8. 0 ) を最終濃度 50mMになるよう に添加し、 4 てで 1 時間振 盪させる等の方法で未反応の活性基をブロ ッ クする。 以上で 基質類似体親和性ゲルが作製される。

基質親和性ク 口マ トグラフ ィ 一は、 バッチ式でもカ ラムに 充塡して連続式に行ってもよい。 試料とゲルを接触させる時 間は、 本酵素が十分に吸着する程度であればよいが、 通常、 20分〜 24時間である。 ゲルの平衡化に用いたものと同じ組成 の低ィォ ン強度で PHが 6. 0〜11.0好ま し く は 7. 0〜 9. 0 の緩 衝液、 例えば 10mMへぺス一水酸化力 リ ウム （pH 7. 0 ) で非吸 着成分を十分に洗い出す。 そのう ち、 本酵素活性の存在する 画分を溶出する。 溶出液は、 本酵素が効率良く得られる組成 であれば何でもよいが、 好ま しいものとしては、 1 〜40%程 度のァセ トニ ト リ ルと共に 0. 1 〜10M塩化ナ ト リ ゥムを舍む pH 7. 0〜 9. 0 の間の緩衝液、 例えば 20%ァセ トニ ト リ ル、

0. 4 M塩化ナ ト リ ウムを舍む 10mMへぺス—水酸化ナ ト リ ウム

( PH 7. 0 ) が挙げられる。 また、 溶出はカラムに充塡した場 合、 濃度勾配をかけても構わない。

また、 場合により、 前記基質類似体親和性ク 口マ トグラフ ィ ー 〔以下、 （ 5 ) で表す） 工程を実施する前または後、 あ るいは前後両方に先に掲げた沈殺による分画 〔以下、 （ 1 ) で表す〕 、 へパリ ン親和性ク ロマ トグラフィー 〔以下、 （ 2 ) で表す〕 透析、 ゲル濾過等による分子量分画 〔以下、 （ 3 ) で表す〕 及びノまたは、 イオン交換ク ロマ トグラ フ ィ ー 〔以 下、 （ 4 ) で表す〕 工程を実施してもよい。 こう して本酵素

(酵素一 I および酵素— Π ) は他の夾雑物から分離する こ と ができるが、 その酵素一 I と酵素一 Π の分離には、 （ 3 ) お よび/または （ 4 ) の工程を実施するこ とが有効である。 一 般的に、 これらの総数 1〜 6工程を実施し、 さ らに上記 （ 5 ) または （ 3 ) 工程を最終段階に実施する ことが好ま しい。 各 工程の組み合わせの具体例としては、 （ 5 ) のみ、 （ 1 ) ■→ ( 5 ), ( 5 ) — ( 3 ), ( 2 ) — ( 5 ), ( 1 ) — ( 3 ) — ( 5 )

( 2 ) — ( 3 ) — ( 5 ), ( 1 ) — ( 5 ) — ( 3 ), ( 2 ) -→ ( 5 ) — ( 3 ), ( 2 ) → ( 1 ) → ( 5 ), ( 1 ) — ( 2 卜

( 3 ) — ( 5 ), ( 1 卜 （ 2 ) — ( 5 卜 （ 3 ), ( 1 ) — ( 3 ) — ( 5 ) — ( 3 ), ( 1 ) — ( 2 卜 （ 1 ) — ( 5 ), ( 1 ) — ( 2 ) — ( 1 ) — ( 3 ) — ( 5 ), ( 2 ) — ( 1 ) — ( 5 ) - ( 3 ), ( 2 ) — ( 1 ) — ( 3 卜 （ 5 ), ( 2 ) — ( 1 卜 （ 3 ) — ( 5 卜 （ 3 ), ( 1 ) — ( 2 ) — ( 3 ) — ( 5 ) — ( 3 ), ( 1 ) — ( 3 卜 （ 2 ) — ( 3 ) — ( 5 ), ( 1 ) -→ ( 3 ) — ( 2 ) -→ ( 3 ) -→ ( 5 ) — ( 3 ), ( 4 ) — ( 3 卜 （ 5 )， （ 5 卜 （ 3 ) — ( 5 卜 （ 3 ), ( 1 ) — ( 5 ) -→ ( 3 ) — ( 5 ) — ( 3 ), ( 4 卜 （ 5 ), ( 1 ) — ( 3 卜 （ 5 卜 （ 4 卜 （ 3 ), ( 1 ) ^ ( 3 ) - ( 4 ) —

( 3 ) — ( 5 ), ( 1 ) — ( 2 ) — ( 3 ) -→ ( 5 ) -→ ( 3 ) -→

( 4 ) , ( 1 卜 （ 2 ) — ( 3 ) — ( 5 卜 （ 4 卜 （ 3 ) 、 または （ 4 ) → ( 5 ) — ( 3 ) 、 等が挙げられる。 これらの う ち、 （ 1 ) — ( 2 ) — ( 3 ) — ( 5 ), ( 1 ) — ( 2 ) —

( 3 卜 （ 5 ) — ( 3 ), ( 1 ) -→ ( 3 ) -→ ( 2 ) — ( 3 ) — ( 5 ) または （ 1 ) — ( 3 ) 一 （ 2 ) ~→ ( 3 ) 一 （ 5 ) ~→ ( 3 ), ( 1 ) — ( 2 ) — ( 3 ) — ( 5 ) — ( 4 ) — ( 3 ) 、 の順に工程を進めるのがより好ま しい。

以下、 前記 （ 1 ) 〜 （ 4 ) 工程についても詳細に説明する。 なお、 これらはすべて 0 ' [：〜 10て、 好ま し く は 4 てで行う。

( 1 ) の沈澱による分画に使用される物質と しては、 硫酸 ア ンモニゥム等の塩類、 エタノ ール、 アセ ト ンなどの有機溶 媒、 ポリ エチレングリ コール等のポリ マ一類が挙げられる。 添加する濃度は、 特に制限はないが、 本酵素が収率良く 回収 でき、 しかも他の蛋白質成分と分離できる条件が好ま しい。 例えば、 30〜50 %飽和硫酸ア ンモニゥム、 10〜15 % ( w / V ) ポリ エチレングリ コール 6000の添加では、 本酵素は沈澱画分 に来るのに対し、 多 く の蛋白質は上澄部分に存在するので、 効率よ く精製される。 なお添加は、 スターラーで撹拌しなが ら序々に行う のが好ま しい。 添加終了後少な く とも 1 時間以 上静置したのち、 遠心分離により、 本酵素の存在する画分を 回収する。 沈澱画分を回収した時には、 これを適当な緩衝液 に溶解する。 緩衝液、 P H 6. 0〜11 . 0、 好ま し く は pH 7. 0〜

9. 0であれば組成は何でもよ く 、 例と しては、 ト リ ス—塩酸、 へぺス—水酸化力 リ ウム、 テス—水酸化ナ ト リ ゥム等が挙げ られる。 また濃度は、 緩衝能を保てる範囲であれば特に制限 はないが、 5 〜50mM程度が好ま しい。

( 1 ) によつて得た活性画分は、 次に、 再度 （ 1 ) を行つ ても （ 2 ) 〜 （ 5 ) のう ちの 1 つの工程いずれに進んでもよ いが、 （ 1 ) の分画に硫酸ア ンモニゥム等の塩類を使用し、 ( 2 ) か （ 4 ) または （ 5 ) に進む時は、 （ 3 ) の工程か、 あるいは適当な緩衝液を添加して次の工程で用いるゲルに本 酵素が結合可能な塩濃度に下げる必要がある。 また、 沈殺を 溶解して 1 時間以上静置した場合や、 透析を行った場合には、 不溶性の物質が生じることがあるので、 これを例えば、 遠心 分離や濾過を行って除まする。

( 2 ) のへパリ ン親和性クロマ トグラフィ一については、 バッチ式でもカ ラムにゲルを充塡して連続式に行ってもよい。 へパリ ンをリガン ドとしたゲルは、 市販されている ものと し て、 へバリ ンセファ ロ一ス CL-6B (フア ルマシア社製） 、 ァフ ィ ゲルへノ、'リ ン （バイオラ ッ ド社製） 、 へパリ ンァガロース (シグマ社製） 、 A F —へバリ ン トョパール 650(東ソ一社製） 等がある。

生体抽出液を直接、 あるいは （ 1 ) に示した沈殺による分 画の処理を行ったのち、 へパリ ン親和性ゲルと接触させる。 接触時間は、 本酵素が十分に吸着する程度であればよいが、 通常は 20分〜 12時間である。 へバリ ンに親和性のない成分を、 本酵素が溶出されない程度にィォン強度が低く、 PHが 6. 0〜 11.0好ましく は 7. 0〜 9. 0 の緩衝液、 例えば、 lOmMのへぺス —水酸化カリ ウム (PH 7. 0 ) で十分に除去する。 そののち、 本酵素を舍む画分を溶出する。 溶出液としては、 本酵素活性 の回収率が高いものがよ く、 例えば、 0. 5 M— 2 Mの塩化ナ ト リ ウム、 塩化カ リ ウム、 硫酸ァンモニゥム等一般に酵素精 製に用いられる塩類を舍む PH 6. 0〜： 11.0を有するものが好ま しい。 溶出は、 カ ラムに充填してある場合、 塩濃度勾配によ つても一段階溶出を行っても構わない。 例えば、 0. 3 — 2. 0 Mの塩化ナ ト リ ゥムを舍む lOmMへぺス—水酸化力 リ ゥム緩衝 液 （PH 7. 0 ) で溶出する。

( 2 ) の工程で得た活性画分は、 次に （ 1 ) 〜 （ 4 ) いず れの工程に供してもよいが、 再度 （ 2 ) を行ったり、 （ 4 ) または （ 5 ) に進む場合には、 （ 3 ) を先に行う力、、 多量の 50mM以下の低ィォン強度の pH 6. 0 〜： 11.0、 好ま し く は 7. 0〜 9. 0 の緩衝液、 例えば 5 mMへぺス—水酸化力 リ ウム （pH 7. 0 ) 等を加えて （ 2 )， ( 4 ) または （ 5 ) で使用するゲルに本酵 素が吸着できるイ オ ン強度にまで下げる必要がある。

( 3 ) の透折、 ゲル濾過等による低分子物質の除ま工程で あるが、 透析の場合、 使用する膜は、 本酵素が通過できない 程度の分画分子量のものであればよいが、 1, 000〜10, 000が 好ま しい。 透折の方法は、 例えば、 "生化学実験講座第 5巻 上卷 252頁〜 253頁" 左右田著 東京化学同人（1975)に記さ れているよう な一般に使用されるものでよ く 、 数時間〜数日、 イ オン強度の低い、 PH 6. 0〜11.0、 好ま し く は pH 7. 0〜 9. 0 の緩衝液、 例えば 10mMへぺス一水酸化力 リ ウム （pH7. 0 ) 、 10mM ト リ ス—塩酸 （pH7. 5 ) 等に対して行う。 また、 透折の 際、 不溶性の物質が析出した場合には、 例えば遠心分離、 濾 過等によって除去する。

ゲル濾過については、 一般的にゲル濾過用担体と して用い られる ものであれば何でも構わない。 例えばセフアデックス G-10 , G-15 , G-25 , G-50 , G-75 , G- 100、 セ フ ァ タ ，) ル S-200, S-300 (以上フ ア ルマシア社製） ト ヨパール HW- 40, HW-55 (東 ソ一社製） 、 バイ オゲル P-2, P-4, P-6, P-10, P-30, P-60, P- 100 (以上バイォラ ッ ド社製） 等が好ま しい。 なお、 使用す べき緩衝液は、 透析の際に用いるべき組成と同様である。 た だし、 イオン強度があまり に低いと本酵素のゲルへの吸着が 起こることが考えられるので、 濃度を 5 〜200mM 好まし く は 10〜20mMにする。 ゲル濾過の方法は、 例えば、 "生化学実験 講座第 5巻上巻 283頁〜 298頁" 左右田著 東京化学同人

(1975)に記載されているように行えば良い。 ゲル濾過担体の ベッ ド体積に対し十分な分離能が得られる量の試料を添加後、 溶出を行い、 本酵素活性の存在する画分を回収する。

( 3 ) の工程によって得られた活性画分は、 特別な処理な しに （ 1 ) 〜 （ 5 ) の各工程に進めることができる。

イ オ ン交換ク ロマ ト グラ フ ィーについては、 一般に市販さ れているィォン交換ク口マ トグラフィ一用担体であれば何で も構わない c 例； =Lは、 minex, Dowex, Amberl i te, SP-Sepha- cry 1 M, Asahipak, DBAE- Toyopear 1 , DEAE-Sephadex, CM- Sepharose, DEAB, Bio-Gel A, CM - Cel lulose, DEAE-Cel lulo- f ine, Partisil SCY, Mono Qおよび Mono S等が好ましい。 な お、 使用すべき緩衝液および使用方法は、 へバリ ン親和性ゲ ルの項に記載した方法に準じれば良い。 また、 基本的な操作 方法は、 「新基礎生化学実験法 2、 抽出 ·精製 · 分折 I 」 (丸善、 1988) などに記載された一般的な方法に従えば良い < ( 4 ) の工程で得た活性画分を、 次に （ 1 ) 〜 （ 5 ) いず れかの工程に供しても良いが、 再度 （ 4 ) を行ったり、 ある いは （ 2 ) または （ 5 ) に進む場合には、 （ 3 ) を先に行う か、 多量の 50mM以下の低イ オ ン強度の pH5. 0〜： 11.0、 好まし く は 6. 0 〜 8. 0の緩衝液、 例えばへぺス—水酸化ナ ト リ ウム (pH7. 0 ) 等を加えて、 （ 2 ), ( 4 ) または （ 5 ) で使用す るゲルに本酵素が吸着できるィォン強度にまで下げる必要が ある。 以上の精製工程を経る こ とにより、 本発明の酵素の粗 生成物が得られる。 かかる、 酵素の粗生成物は、 さ らに、 ( 3 ) のゲル濾過工程を用いるタ ンパク質分離手段により、 分子量約 25 , 000および分子量約 40，000にそれぞれピークを有 する画分に単離して、 本酵素標品とする こ とができる。

以上の各工程は、 それぞれ後述のもう一つの本発明である 酵素の活性の測定方法に準じ、 式 （ I ) または式 （ Π ) の化 合物を基質に使用して酵素一 I およびノまたは酵素一 Π の活 性を追い、 活性画分を得る こ とによって実施される。

本発明の酵素一 I および酵素— II は、 これらの酵素をコー ドする cDNAを舍み、 かっこれを発現することができるブラス ミ ドで形質転換された宿主細胞を培養するこ とにより前記酵 素を生産蓄積させた培養物からこれらの酵素の両方または一 方を採取することによって製造するこ ともできる。

この方法で用いるこ とができる本発明の酵素をコー ドする cDNAは、 ヒ ト、 ゥ シ、 ゥマ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥサギ、 ャギ、 ラ ッ ト、 マウス等の哺乳類、 ニヮ ト リ、 シチメ ンチヨ ウ等の 鳥類、 力エル等の両生類、 へビ等のハ虫類、 イ ワシ、 サバ、 ゥナギ、 サケ等の魚類などに存在する D N Aに由来し、 その cDNAのほぼ中央付近に Lys - Lys の配列が存在するものであれ ばその起源は問わないが、 好ま しいものと しては哺乳類由来 のものが挙げられる。 より具体的には、 現在知られているべ プチ ド C末端ァ ミ ド化酵素のァ ミ ノ酸配列をァ ミ ノ酸の 1 文 字表示で、 しかも種間での相同性を高く するように欠落部分 (一で示す） を任意に挿入して第 5図に示されるようなア ミ ノ酸配列をコー ドする D N A断片であって、 それらの C末端 近傍の疎水性ァ ミノ酸領域に相当する部分を除いた cDNAが有 利に使用できる。 なお、 各 cDNAは、 ヒ ト、 ゥマ、 ゥシ、 ラ ッ ト、 力エル I および力エル Πについて、 それぞれ Biochem, Biophys.Res.Commun.169, 551〜558, 1990 ί 特願平 2 — 76331号明細書 ； Mol.Endocrinal.丄， 777〜790ページ、 1987 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86» 735〜739ページ、 1989； Biochem. Biophys. Res. Commum. ,148, 546〜552ページ、 1987 ； および Biochem, B i ophys . Res . Commun . , 150, 1275〜： L281ぺ ージ、 1988に記載されている。 これらのう ち例えば、 第 5図 のゥマの配列で 441と 442番目が前記 K (リ ジン） 、 K (リ ジン） 配列に該当する。 この配列は、 ヒ ト、 ゥマ、 ゥシ、 ラ ッ トの cDNAで良く保存されている。 この配列より、 前半部分

( 5 ' 側） の cDNAは、 式 （ I ) で示されるペプチ ド C末端グ リ シン付加体に作用して、 式 （ D ) で示されるペプチ ド C末 端 α—ヒ ドロキシルダリ シン付加体を生産する活性を持つ蛋 白質をコー ドしており、 また、 この K K配列より後半部分

( 3 ' 側） の cDNAは、 式 （ Π ) のペプチ ド C末端 α—ヒ ドロ キシルグリ シン付加体に作用して式 （ ΒΙ ) で示される C末端 ア ミ ド化物とダリオキシル酸を生成する活性を持つ蛋白質を コードしている。 この K K配列近傍の部位でそれ自体公知の 制限酵素を用い、 cDNAを前半部と後半部に分離することもで きる o

なお、 前記疎水性アミノ酸領域は、 例えば、 第 5図中のゥ マの配列によれば 880番目の V (バリ ン） から 901番目の I (イ ソ ロイ シ ン） までに該当し、 この領域に相当する部分を 本明細書では膜貫通領域という。 この領域に相当する部分を 除いた cDNA断片を利用すれば、 驚く べき こ とに、 生産する酵 素を宿主細胞外に分泌するだけでな く 全体的な生産量も著し く 増大するので、 本発明で使用する cDNAと しては前記領域を 除いた cDNAが特に好ま しい。 また、 本発明の酵素— I および 酵素— Π は、 前述したように隣接して cDNAにコー ドされてい るが、 これらの酵素は細胞における分泌過程のプロセ ッ シ ン グにより個別に放出されるので、 前記膜貫通領域を除いた cDNAを使用するのが好ま しい。 このような cDNAは、 既知の対 応する cDNAからそれ自体公知の制限酵素を用いその部分を切 除して調製されたものでもよ く、 また当該 cDNAのク ローニン グ段階で mRNAのスプラィ シングの差異により生じる各種 cDNA から選ぶこ ともできる。 また、 cDNAは、 酵素一 I および酵素 一 Hをそれぞれ独立してコ一 ドする cDNAを前述のように分離 したものを使用するこ とができる。

本発明で利用される cDNAのク ローニングは、 それ自体公知 の方法により、 前述した各種動物の諸組織を用いて実施する こ とができる。 具体的には、 + > —法、 ハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ン法、 P C R法など一般に用いられている方法 （例えば、 Methods in Enzyraology, vol.152 ； Guide to Molecular Cloning Techniques, S ·し · Bergerおよび/ \ · R · K i mme 1編 1987, Academic Press , INC. ； Methods in Molecular Biology, vol.4 ； New Nucleic Acid Techniques , J . M · Wa 1 ker編、 1988, The Humana Press Inc. ； Molecular Cloning A Laboratory Manual 2nd Ed . J . Sambrook , E. F . Fr i tsch , T*Maniatis編、 1989， Cold Spring Harbor Laboratory Press 参照） に従つ て行い、 得られた cDNAク ローンの塩基配列を決定する こ とに より蛋白質をコー ドする cDNA領域を決定し、 必要により、 前 述の膜貫通領域に相当する部分が除去されている ものから選 び、 そして前述の中央部の K K配列付近で cDNAを分割する こ とで目的の cDNAは得られる。

ラ ッ トを例に説明すると、 ぺプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素を 多 く生産する組織、 例えば、 ラ ッ トの下垂体をグァニジルチ オシァネー ト と共にホモジナイ ズするこ とにより細胞を破碎 し、 塩化セシゥム平衡密度勾配超遠心分離により R N A分画 を得る。 続いてオリ ゴ d Tセルロースを担持したァフ ィ ニテ ィーク ロマ トグラフィ 一により、 前記 R N A分画からポリ A をもつ R N A (ポリ A + RNA)を単離する。

このポリ A + RNA を踌型と して使用し、 公知の方法、 好ま し く は岡山— Bergの方法（Mol. Cell. Biol.2, 161, 1982)によつ て、 cDNAライ ブラ リーを得る。 これらのライ ブラ リーから適 当なプローブを使用してポジティ ブなク ローンをスク リー二 ングし、 増幅した cDNAライ ブラ リーから適当なプローブを使 用して再スク リーニングして得たポジティ ブな cDNAク ローン を単離し、 これらの制限酵素マツ ビングおよびシークェ ンシ ングなどによつて目的の cDNAを構造決定することができる。 また、 前記 cDNAを発現べクタ一に組込み、 このもので形質転 換した宿主のペプチ ド C末端ア ミ ド化酵素の生産性を評価す る こ とにより 目的の cDNAを舍むブラス ミ ドを選択する こ とも できる。

この cDNAを発現させる宿主と しては、 大腸菌、 枯草菌、 酵 母などの微生物、 昆虫、 動物などに由来する培養細胞系など 通常用いられる細胞が挙げられる。 発現プラス ミ ドは、 これ らの細胞中で cDNAを効率良く発現できるプラス ミ ドであれば、 何でも良い。 例えば、 次に示す成書に記載のものなどから適 当に選ぶことができる。

続生化学実験講座 1 、 遺伝子研究法 Π、 一組換え D N A技 術一第 7章組換え休の発現、 （1986)、 日本生化学会編、 東京 化学同人 ； Recombinant DNA, Part D, Section Π , Vectors for Express i on of Cloned Genes , (1987) RayWu および

Lawrence Grossman 編、 Academic Press , INC. ； Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd Ed. Book 3, (1989) J. Sambrook, E. F. Fri tsch および T. Maniatis編、 Cold Spring Harbor Laboratory Press など。

例えば、 動物培養細胞として常用されている CV-1が宿主と して使用される場合は、 PSV， L2n, pCol 型のプロモーター および必要により選択マーカーを配したものが使用できる。 また、 大腸菌については pGH, pKYP, pHUB 型のベクター力、'、 酵母については YRp, YEp型のものが使用できる。 これらのベ クタ一の cDNAによる組換え、 および組換えプラス ミ ドによる 宿主細胞の形質転換、 形質導入はそれぞれ前述の文献等に記 載されるそれ自体公知の手順によって行う ことができる。 こ う して得られる形質転換された細胞は、 由来する細胞を増殖 するのに通常使用される培地および培養条件下で培養するこ とができる。

このような培養物から産生蓄積せしめたペプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素の採取は、 例えば、 動物培養細胞を用いる場合に は産生酵素が細胞外に分泌されるので、 細胞を除去した後の 培養液から容易に採取できるが、 必要により細胞溶解物から 採取してもよい。 この採取 · 精製は通常の酵素精製法、 例え ば沈殺による分画、 へバリ ン親和性ク ロマ トグラフ ィーおよ び透析等を組み合わせて実施する こ とができ、 さ らに前述の 生物学的流体からの本酵素の採取方法、 ぺプチ ド C末端ダリ シン付加体をリガン ドとする基質親和性ク 口マ トグラフ ィ ー を組み合わせて使用することが好ま しい。

こう して得られる本発明の酵素一 I は、 第 5図を引用する と、 酵素一 I について、 ヒ ト、 ゥマ、 ゥ シ、 ラ ッ トでは、 そ れぞれ 42残基目の Pまたは Sから 442残基目の まで、 また ゥマ、 ゥ シでは 42残基目の Pまたは から 231残基目の Kま でのア ミ ノ酸配列に対応するものである。 一方、 酵素— II は ヒ ト、 ゥマ、 ゥ シ、 ラ フ トでは、 それぞれ 443残基目の Dか ら 830残基目の Kまでのア ミ ノ酸配列に対応するものが得ら れる。 こ こで、 対応する とは、 本発明の酵素が場合によって そのァ ミ ノ酸配列のァスパラギン酸に、 N—ァセチルダルコ サミ ンを介して糖が結合したものをも包舍するこ とを意味す る。

酵素の使用

本発明の酵素の使用、 すなわち前記式 （ I ) で示されるぺ プチ ド C末端グリ シン付加体を、 前記酵素一 I で処理するこ とを特徴とする前記式 （ II ) で示されるペプチ ド C末端 α— ヒ ドロキシルグリ シン付加体の製造方法、 ならびに式 （ Π ) で示される前記付加体を酵素一 Πで処理する こ とを特徴とす る前記式 （ DI ) で示されるペプチ ド C末端ア ミ ド化物の製造 方法が提供できる。 またこれらの酵素一 I および酵素— Π は 併用する こ とにより単一反応組成物中で式 （ I ) の化合物を 式 （ IE ) の化合物まで転化する こ とができる。 式 （ I ) から 式 （ m ) の化合物への転化工程に酵素一 ]!を使用するこ とは、 酵素一 I 型の酵素のみの存在下では式 （ II ) から式 （ 1Π ) の 化合物への転化に際し、 化学的加水分解条件にさ らす必要が あるのに比べ、 より緩和な酵素反応条件下で前記転化が達成 できるので有意であることが明らかであろう。 特に、 アル力 リ条件下で不安定な基質類の処理に適する。

これらの製造方法は、 本発明の酵素を舍有するものであれ ばその濃度、 純度を問う ことな く使用できるが、 反応混合物 からの生成物、 式 （ Π ) の化合物の単離精製を考慮すると、 夾雑タ ンパク質が大幅に除去された本発明の酵素を使用する のが有利である。

式 （ I ) または式 （ Π ) の化合物と しては、 前述のものが 全て含まれる力 これらの製造方法で使用に適するものと し ては、 特にそれらの最終生成物、 式 （ m ) の化合物が、 例え ばアルギニ ンバソ ト シ ン（A VT ) 、 黄体形成ホルモ ン放出ホル モ ン（LH - RH ) 、 ォキ シ ト シ ン、 ガス ト リ ン、 ガス ト リ ン分泌 促進べプチ ド（GGRP)、 カルシ ト ニ ン （ C T ) 、 血管作用性小 腸ペプチ ド（V I P) 、 甲状腺剌激ホルモ ン放出ホルモ ン（TRH)、 黒色素胞剌激ホルモ ン（MSH) 、 M S H放出抑制ホルモ ン（M I H) コ レ シス ト キニ ンォク タ ぺプタ イ ド（CCK - 8 ) 、 サブスタ ンス P ( S P ) 、 脂肪動員ホルモ ン、 塍ボ リ ペプチ ド （ P P ) 、 成長ホルモ ン放出因子、 セク レチ ン、 セルレイ ン、 軟体動物 性心臓興奮性神経ペプチ ド、 バソブレ ツ シ ン、 副腎皮質刺激 ホルモ ン（ACTH)、 変色ホルモ ン、 ボンべシ ン、 明順応ホルモ ン、 モチ リ ン、 ァ ノ、' ミ ン、 ァ リ テシ ン、 エ レ ドイ シ ン、 カ ツ シニ ン、 グラニユ リ べリ ン R、 スコ トホビン、 ヒ ラ ンべー ト セルレイ ン、 肥満細胞脱顆粒ペプチ ド、 フ ィ サ レ ミ ン、 フ ィ ロセルレイ ン、 フ ィ ロメ ズシ ン、 プロメ リ チ ン、 ポンビニ ン、 マス トバラ ン、 マス トノヽ ·ラ ン一 X、 メ リ チ ン一 1 、 ラナテン シンおよびラナテ ンシン一 Rに対応する化合物が好ましい。 前記処理は、 通常の緩衝液中、 特に酵素一 I を用いる反応 では反応液にァスコルビン酸およびカタラーゼを添加して実 施することができるが、 次に示す酵素活性の測定方法の条件 を考慮して実施することが好ま しい。

酵素活性の測定方法およびそれを用いる新規酵素の探索方法 前述の本発明の酵素一 I および酵素一 Πは、 以下の活性の 測定方法により追跡することができ、 またこの測定方法は、 前述の本発明の酵素の製造方法を合理的に実施するのに役立 つ。

無論、 これらの測定方法は、 ペプチ ド C末端ア ミ ド化反応 が従来考えられていたような 1段階の反応ではなく、 中間体 (ペプチ ド C末端 ο:—ヒ ドロキシルグリ シン付加体） を介し た 2段階反応であるとの知見に基づく ものである。 まず最初に、 酵素一 I の活性は、 （ a ) その活性を有する こ とが予測される被験体を PH 5 〜 8 に緩衝化する工程および ( b ) この緩衝溶液に前記式 （ I ) で示されるペプチ ド C末 端グリ シ ン付加体ならびに L —ァスコルビン酸および力タ ラ ーゼを添加してィ ンキュベ一ショ ンする工程を含んでなり、 こ う して得られる反応混合物から後述するそれ自体公知の各 種ク ロマ トグラフ ィ ーを用いて前記式 （ Π ) で示される生成 物を単離測定するか、 あるいは式 （ D ) の化合物をアルカ リ 条件下で式 （ ΙΠ ) の化合物まで転化した後それらを単離測定 するこ とによって決定する こ とができる。 このような好ま し い単離測定方法としては、 反応生成物をァセ トニ ト リ ル舍有 緩衝液 （PH 6〜： 10 ) を使用する HPLCで検出する工程が挙げら れる。

また、 酵素一 Π の活性は、 （ a ) その活性を有するこ とが 予測される被験体を PH 4 〜 8 に緩衝化する工程、 および （ b ) この緩衝溶液に式 （ Π ) で示されるペプチ ド C末端 α—ヒ ド ロキシルグリ シン付加体を添加してィ ンキュベーショ ンする 工程を含んでなり、 こ う して得られる反応生成物、 式 （ ΠΙ ) またはグリオキシル酸をそれ自体公知の測定方法によつて決 定する こ とができる。 酵素— Πの活性もまた前記 HPLCで検出 するのが好ま しい。

これらの測定方法にいう被験体と しては、 それらの酵素活 性を有する流体であればいずれも包含され、 特に、 それらの 活性を有する生物学的流体、 すなわち生物の器官の均質化物、 ならびに体液、 例えば血液およびリ ンパ液、 さ らにこれらの 精製処理などの処理液が挙げられる。 また、 微生物細胞に由 来する処理液も生物学的流体に包含される。

これらの被験体の緩衝化に使用する緩衝剤は特に制限され ず通常使用されるものが用いられる。 例えば、 ト リ スー塩酸. へぺス一水酸化カ リ ウムがあげられる。 緩衝溶液中の緩衝剤 の濃度は緩衝作用が達成される限りいかなる濃度でもよいが- 通常は 20〜200mM が適当である。

それぞれの緩衝溶液は、 前者については pH 6〜 8、 好まし く は pH 6. 5付近に調節し、 後者については pH 4〜 8、 好まし く は PH 6付近に調節する。 こう して調製した緩衝溶液に前者 で添加されるべプチ ド C末端ダリ シン付加体としては、 当該 酵素の基質であって、 前述の酵素一 I の活性を確認するため に好ましい基質として列挙した式 （ I ) で示されるものを用 いるのが好ましい。 この化合物の濃度は、 一般に 0. 1 rf1〜 2 mM程度が適当である。 さらに、 補因子として機能することが 考えられる L ーァスコルビン酸、 活性化剤としてカタラーゼ の添加が必要である。 一般に、 L—ァスコ ルビン酸の濃度は. 0. 5〜 2 mMが好ましく、 またカタラーゼの濃度は 40〜 100 Zfflgが適当である。 また、 緩衝溶液に金属イ オ ンを添加して もよいが、 この添加は本活性測定に特に要求されるものでな く、 添加により無添加の場合より もより高い活性が得られる ことがあるので添加することが好ま しい。 使用する金属ィォ ンとしては Zn^{z +} , Cu^{z +} , Ni²⁺ , Co^{z +} > Fe^{3 +}等が適当であり特 に Cu^{2 +}および Zn^{2 +}が好ましい。 金属イ オ ンの緩衝溶液中の濃 度は 0 〜： 1000/*1、 好ましく は 0 〜 10^が適当である。 限定さ れる ものでないが、 かかる金属イ オ ンを提供する化合物は、 CuS0₄, CuC £ _z, ZnC £ _Z) NiC £ ₂, CoC £ _Z) FeC ί ₃ 等力く げ られる。

このよう な反応組成物の具体的なものとしては、 例えば、 後述の例 7 の反応組成液 Aが参考となろう。 一方、 後者にお ける反応組成物は、 前記式 （ I ) の化合物に代え対応する式 ( Π ) の化合物を使用して調製する。 この場合、 ァスコルビ ン酸、 力タ ラ一ゼ等の補因子は必要でない。

両測定方法とも、 被験体の使用量は特に限定されるもので な く種々変化させる こ とができるが、 反応系に存在する基質 の量 （ a ナノ モル（nmo£ ) とする） に対し、 好ま し く は

a pmo £ /hr以上、 さ らに好ま し く は 10 X a pmo £ /hr以上、 もっとも好ま し く は lOXa pmo £ Zhr〜a mo £ /hr 〔単位は 酵素活性を示し、 37 'C 1 時間で反応しう る基質量 （例えば、 ピコモル（pmo£ ) で表示する〕 の酵素活性を舍有するよう に 調整するのが適当である。

イ ンキュベーショ ンは、 1 〜55'C、 特に前者では好ま し く は 25〜40· (：、 特に好ま し く は 30'C付近で振盪しながら 2〜24 時間反応させ、 後者では好ま し く は 15〜35て、 もっ とも好ま し く は 25'C付近で静置して 1 分〜 48時間行う。

以上の工程で、 それぞれ生成する式 （ Π ) の化合物および 式 （ ΠΙ ) の化合物の検出は、 それらの基質と生成物、 例えば、 前者では式 （ I ) の化合物と式 （ Π ) の化合物、 後者では式

( π ) の化合物と式 （ m ) の化合物を分離測定できる方法で あればどのような方法でも使用できる。 一般に分離測定は、 以下のク ロマ トグラフ ィ ーで分離、 精製して行う ことができ る。 上記に使用できるク ロマ トグラフ ィ ーと しては、 イオン 交換クロマ トグラフ ィ ー、 逆相ク ロマ トグラフ ィー、 ゲル濾 過、 ァフィ 二ティーク ロマ トグラフィ ー、 高速液体ク ロマ ト グラフ ィ ー（HPLC)、 薄層ク ロマ トグラフ ィ ー（TLC ) などが挙 げられる。 後者の反応系における式 （ Π ) で示される基質と 式 （ ΠΙ ) で示されるア ミ ド化された生成物は、 ペプチ ド C末 端がそれぞれカルボキシル基とァ ミ ド基であり、 電荷が異な つている。 この性質を用いたィ ォン交換ク ロマ トグラフ ィ 一、 逆相ク 口マ トグラフィ 一などが好適である。 また、 生成物の 抗体を用いたァフ ィ ニティ ーク ロマ トグラフ ィ一も有効であ る。 しかしながら、 前者の反応系における式 （ I ) で示され る基質と式 （ Π ) で示される生成物は、 通常のク ロマ ト処理 では分離がかなり困難であるが、 本発明者らによつて開発さ れたァセ トニ ト リ ル舍有緩衝液 （pH 6〜10、 好ま し く は pH 9 ) を溶出液と して用いる高速液体ク ロマ トグラフ ィ 一（HPLC)に よれば有利に分離測定できる。 溶出液は、 特にァセ トニ ト リ ル濃度の直線濃度勾配をかけて行うのがよい。 HPLCの力 ラム としては、 本目的に適するものであれば市販のどのような種 類のカラムを使用するこ ともできるが、 特に、 カプセルパッ ク C 18SG , 300人 （資生堂製） を使用するのが有利である。

かく して、 それぞれ分離された基質と生成物は、 それらの (必要により結合された） いずれかの化学的または物理的標 識について測定すればよい。 この測定には、 既知の標識、 既 知の測定法が使用でき、 一般には基質ぺプチ ドを構成するァ ミノ酸に由来する U V吸収を利用するのが好都合であろう。 以上の測定方法は正確かつ簡便であるので、 これらを前述 の生物学的流体に適用することにより、 それぞれ酵素一 I ま たは酵素一 IIの活性を有する酵素の探索を行う ことができる。 探索の対象となる生物学的流体は、 前述の酵素活性を有す ることが予測されるものは無論のこと、 その他動植物の生体 細胞、 組織、 抽出液のいずれをも包舍する。 例えば、 抽出液 は、 「実験生物学講座 6、 細胞分画法」 （丸善、 1984 ) 、 「生化学実験講座 5、 酵素研究法 （上） 」 （東京化学同人、 1975 ) 、 「基礎生化学実験法 1、 生物材料の取扱い方」 （丸 善 1974 ) 、 などに記載の一般的な抽出法に準じて調製すれば 良い。

ゥマに由来する酵素一 I および酵素— Πに閲する D N A配列 本発明によれば、 酵素一 I および酵素一 Πの酵素活性を有 するポリぺプチ ドをコ一ドした cDN A配列が提供される。 これ らの酵素は、 当該技術分野で知られているペプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素より も活性、 安定性に優れている可能性がある 国際公開 ： W089 / 12096 号公報参照） ので、 これらを生産す る観点から前記 D N A配列を提供する意義が認められるであ ろう。 かかる酵素の起源は、 それが存在する器官または組織 であればその種類を問わないが、 主に心房、 下垂体、 脳また は胃に由来するものを対象とする。

本発明に係るぺプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素活性を有するポ リペプチ ドをコー ドした cDNAは、 具体的には第 13図で示され る。 この図では、 最も長い cD NA断片の塩基配列及びそれにコ ー ドされたァ ミノ酸配列を一文字表示で示している。 なお、 図中の 〔 〕 内はいくつかの cDNAを解析した結果見い出した

mRNAスプライ シ ングの差異により生じたものと思われる cDNA

欠失部分である。 従って、 本発明による cDNAは、 コードする ポリ ペプチ ドのァミノ酸配列についても数種存在している。

例えば、 本発明で提供されるゥマに由来する本発明の酵素の 酵素活性を有するボリペプチ ドのァ ミ ノ酸配列は、 少な く と も下記のごと く一定の鎮長まで共通の配列を有し、 かつその 下流にそれぞれ 4種の配列のいずれかを舍む 4種が存在する, 共通アミノ酸配列

10 20

MetAlaGlyLeuArgSerLeuLeuVaiし euLeuLeuValPheGlnSerSeruysLeuiily

30 40 PheArgSerProLeuSerValPheし ysArgPheし ysGluThrThrArgProPheSerAsn

50 60 GluCysLeuGlyThrThrArgProVslIleProIleAspSerSerAspPheAlsteuAsp

70 80 IleArgMetProGlyValThrProLysGlnSerAspThrTyrPheCysMetSerMetArg

90 100 LeuProMetAspGluGluThrPheVslIleAspPhetysProArgAlsSerMetAspThr

110 120 ValHisHisMetLeuLeuPheGlyCysAsnMetProSerSerThrGlySerTyrTrpPhe

130 140 CysAspGluGlyValCysThrAspLysAlaAsnlleLeuTyrAlaTrpAlaArgAsnAla

150 160 ProProThrArgLeuProLysGlyValGlyPheArgValGlyGlyGluThrGlySerLys

170 180 TyrPheValLeuGlnValHisTyrGlyAspIleSerAlaPheArgAspAsnHisLysAsp

190 200 CysSerGlyValSerし euHisLeuThrArgLeuProGlnProLeuIleAlaGlyMetTyr 210 220 LeuMetMetAlaLeuAspThrVallleProAlaGlyGluLysValValAsnSerAspLeu

230 240 SerCysHisTyrLysLysTyrProMetHisValPheAlaTyrArgValHisThrHisHis

250 260 LeuGlyLysValValSerGlyTyrArgValArgAsnGlyGlnTrpThrLeuI leGl Arg

270 280 GlnSerProGlnLeuProGlnAlaPheTyrProValGluHisProValAspValSerPhe

290 300 GlyAspI leLeuAlaAlaArgCysValPheThrGlyGluGlyArgThrGluAlaThrHis

310 320 I leGlyGlyThrSerSerAspGlu etCysAsnLeuTyrl leMetTyrTyrMetGluAla

330 340 LysHisAlaValSerPheMetThrCysThrGlnAsnValAlaProGluMetPheArgThr

350 360 I leProProGluAlaAsnlleProIleProValLysSerAspMetValMetMetHisGl

370 380 HisHistysGluThrGluAsntysAspLysThrSerLeuGlnGlnProLysGlnGluGlu

390 400 GluValLeuGluGlnGlyAspPheTyrSerLeuLeuSerLysLeuLeuGlyGluArgGlu

410 Ϊ20 AspValValHisValHisLysThyAsnProThrGluLysAlaGluSerGluSerAspLeu

430 440 Val AlaGluI leAlsAsnVal ValGlnし ysし ysAspし euGlyArgSerAspAlaArgGlu

450 460 SerAlaGluHisGluAspArgGlyAsnAlalleLeuValArgAspArglleHisLysPhe

470 480 HisArgLeuGluSerThrLeuArgProThrGluSerArgVal I leSerValProGlnPro

490 500 LeuProGlyGluGlyThrTrpGluProGluHisThrGlyAspPheHisValGluGluAla

510 520 LeuAspTrpProGlyValTyrLeuLeuProGlyGlnValSerGlyValAlaLeuAspLeu

530 540 GlnAsnAsnし euVal I lePheHisArgGlyAspHisValTrpAspGI yAsnSerPheAsp 550 560 SerLysPheValTyrGlnGlnArgGlyLeuGlyProI leGluGluAspThrl leLeuVal

570 580 IleAspProAsnAsnAlaAlaValLeuGlnSerSerGlyし ysAsnLeuPheTyrし euPro

590 600 HisGlyLeuSerlleAspLysAspGlyAsnTyrTrp alThrAspValAlaLeuHisGln

610 620 ValPheし ysteuAspProAsnSerし ysGluGlyProLeuLeuIleLeuGlyArgSerMet

630 640 GlnProGlySerAspGlnAsnHisPheCysGlnProThrAspValAlaValAspProAsn

650 660 ThrGlyThrl lePheValSerAspGl TyrCysAsnSerArgl leValGlnPheSerPro

670 680 ThrGlyArgPhelleThrGlnTrpGlyGluGluSerSerGluSerAsnProLysProGly

690 700 GlnPheArgValProHisSerLeuAlaLeuValProHisLeuGlyGlnLeuCysValAla

710 720 AspArgGluAsnGlyArgl leGlnCysPheLysThrAspThrLysGluPheValArgGlu

730 740 IleLysHisAlaSerPheGlyArgAsnValPheAlal leSerTyrl leProGlyLeuし eu

750 760 PheAlaValAsnGlyLysProTyrPheGlyAspGlnLysProValGlnGlyPheValMet

770 780 AsnPheSerSerGlyGluI lei leAspValPheし ysProValArgLysHisPheAspMet

790 800 ProHisAspI leThrAlaSerGluAspGlyThrValTyrValGlyAs A laHisThrAsn

ThrValTrpLysPheThrSerThrGlu

相違する領域のァ ミ ノ酸配列

( i )

810 820

ThrAlaGlnValTrpPheProGl ValAspLeuHisHisSerSerValAlaMetLeuTrp 830 840

TrpGlnLeuThriyrLysLysArgLysIleAspAsnArgCysTyrLeuArgAlaAsnLeu 850 860

ProGlnGlnMetLysLystysArgValGluHisArgSerVaUysLysAlaGlylleGlu 870 880

ValGlnGluIleLysGluSerGluAlaValValGluThrLysMetGluAsnLysProAla 890 900

SerSerGluLeuGlnLysMetGlnGluLysGlnLysLeuIleLysGluProGlySerGly 910^ し 920 し

930 940

AlallePhelleArgTrpLysLysSerArgAlaPheGl GluSerGluHisLysValGlu 950 960

AlaSerSerGlyArgValLeuGlyArgLeuArgGlyLysGlySerGlyGlyLeuAsnLeu 970 980

GlyAsnPhePheAlaSerArgLysGlyTyrSerArgし ysGlyPheAspArgLeuSerThr 990 1000

GluGlySerAspGlnGluLysAspGluAspAspGlySerGluSerGluGluGluTyrSer

1010 1020

AlsProし euProAlsProVslProSerSerSer

( ii )

810 820

ArgValGluHisArgSerValLysLysAlaGlylleGluValGlnGluIleLysGluSer 830 840

GluAlaValValGluThrLysMetGluAsnLysProAlaSerSerGluLeuGlnlysMet 850 860

GlnGluLysGlnLysLeuIleLysGluProGl SerGl ValProValValLeuI leThr 870 880

ThrLeuLeuVallleProValValValLeuLeuAlalleAlallePhelleArgTrpLys 890 900

LysSerArgAlaPheGlyGluSerGluHisLysValGluAlaSerSerGlyArgValLeu 910 920

GlyArgLeuArgGlyLysGlySerGlyGlyLeuAsnLeuGlyAsnPhePheAlaSerArg 930 940

LysGlyTyrSerArgLysGlyPheAspArgLeuSerThrGluGl SerAspGlnGluLys o>m 亩 、 - 4 (I

,ミ

006 068

niS^J9S^19dsvdsvni9dsvs{qni9ui9dsvjasiIDni9-im-^I8Sⁿ⁸T³-^IVdsvaqd

088 OLS

098 098

0f8 0S8 ni3^eI /s 9ΐιπΐ3ΐπίΗΒΑ^ηΙ39Ι I3ei /s s siHⁿIfHBA3

028 018

096 096

0 0S6

026 0T6

006 068

088 OLS

nt3aiI^I3^BT ^s'ⁱT^s'^t1I^BA-^I8S^3jV^siHⁿI9I^eA³-^{I si}T^s^1^s'ⁱ1i⁸W^uI3^u13^OJd

098 0S8

0^8 088 dJ n3T^9weivieAaaS-i3S^silistHnaqds ieAii90Jd8q₍idJ ieAUi9BiVjqi

028 018

( !B )

IBAOJdBtVOJd^nsl^OJd⁸H^JaS-^I^XⁿI3ⁿI9ⁿ10-^I3SⁿI9-ⁱaS^l9dsvdsvni3dsy

096 096

ZV

9£0l0/0ddf/J3d 06Ζ,Ζ0/16 O cDNA配列により翻訳されるだけでな く 、 同一ア ミ ノ酸をコー ドする異なるコ ドンを組合せた D N Aを用いても翻訳できる ので、 本発明の D N A配列はそれらの全てを包舍する。 さ ら に、 C末端ア ミ ド化酵素活性が失われない程度に、 ア ミ ノ酸 配列の一都が置き換え、 追加、 または除去により変更されて も、 本発明の本来の目的に沿う ものと解される。 これらの具 体例と しては、 下記の共通塩基配列を有し、 その下流にそれ ぞれ下記の相違する塩基配列部を有するものが挙げられる ： 共通塩基配列

CGGCGTGGA CATGGCTGGC CTTCGTAGCC TGCTAGTTCT CCTCCTTGTT TTTCAGAGCA GCTGTTTGGG TTTCAGAAGC CCACTTTCTG TCTTTAAGAG GTTTAAAGAA ACTACCAGAC CATTTTCCAA TGAATGTCTT GGTACCACCA GACCAGTCAT TCCTATTGAT TCATCAGATT TTGCATTGGA TATTCGCATG CCTGGAGTCA CACCTAAACA GTCTGATACA TACTTCTGCA TGTCGATGCG TTTGCCAATG GATGAGGAAA CCTTCGTGAT TGACTTCAAA CCTCGTGCCA GCATGGATftC TGTCCATCAT ATGTTACTTT TTGGTTGCAA TATGCCCTCA TCCACTGGAA GTTACTGGTT TTGTGATGAA GGCGTCTGTA CAGACAAAGC CAATATTCTC TATGCCTGGG CAAGAAATGC TCCCCCCACC AGACTCCCCA AAGGTGTTGG ATTCAGAGTT GGAGGAGAGA CTGGAAGTAA ATACTTCGTA CTACAAGTAC ACTATGGGGA TATTAGTGCT TTTAGAGATA ATCACAAGGA CTGTTCTGGT GTGTCCTTAC ACCTCACACG CCTGCCACAG CCTTTAATTG CTGGCATGTA CCTTATGATG GCTCTTGACA CTGTTATACC AGCAGGAGAG AAAGTGGTGA ATTCTGACCT TTCATGCCAT TATAAAAAGT ACCCAATGCA TGTCTTTGCC TATAGAGTTC ACACTCACCA TTTAGGTAAG GTAGTAAGTG GCTACAGAGT AAGAAATGGA CAGTGGACAC TGATTGGACG TCAGAGCCCC CAGCTGCCAC AGGCTTTCTA CCCTGTGGAA CACCCAGTAG ATGTCAGTTT TGGTGACATA CTGGCAGCAA GATGTGTGTT CACTGGTGAA GGAAGGACAG AAGCCACGCA CATTGGTGGC ACATCTAGTG ATGAAATGTG CAACTTATAC ATTATGTATT ACATGGAAGC CAAGCACGCA GTTTCTTTCA TGACCTGTAC CCAGAATGTA GCTCCAGAAA TGTTCAGAAC CATCCCCCCA GAGGCCAATA TTCCAATTCC TGTGAAGTCC GACATGGTTA TGATGCATGG ACATCACAAA GAAACAGAGA ACAAAGATAA GACTTCACTA CAACAGCCAA AACAAGAAGA AGAAGTGTTA GAACAGGGTG ATTTCTATTC ACTGCTTTCC AAGCTGCTAG GAGAAAGGGA AGATGTTGTT CATGTGCATA AATATAACCC TACAGAAAAG GCAGAATCAG AGTCAGACCT GGTAGCTGAG ATTGCAAATG TAGTCCAAAA GAAGGATCTC GGTCGATCTG ATGCCAGAGA GAGTGCAGAG CATGAGGACA GGGGCAATGC TATTCTTGTC AGAGACAGAA TTCACAAATT CCACAGACTA GAATCTACTT TGAGGCCAAC AGAGAGCAGA GTTATCTCAG TACCGCAGCC CCTACCTGGT GAAGGCACCT GGGAACCAGA ACACACAGGA GATTTCCATG TAGAAGAGGC ACTGGATTGG CCTGGAGTAT ACTTGTTACC AGGCCAGGTT TCTGGGGTAG CTCTGGACCT TCAGAATAAC CTGGTGATTT TCCACAGAGG TGACCATGTC TGGGATGGAA ACTCTTTTGA CAGCAAGTTT GTGTACCAGC AAAGAGGACT CGGGCCAATT GAAGAAGATA CTATTCTTGT CATAGATCCA AATAATGCTG CAGTCCTCCA GTCCAGTGGA AAAAATCTGT TTTACTTGCC ACATGGCTTG AGCATAGACA AAGATGGAAA TTATTGGGTC ACAGACGTGG CTCTCCATCA GGTGTTCAAA CTGGATCCAA ACAGTAAAGA AGGCCCTCTG TTGATCCTGG GAAGAAGCAT GCAACCAGGC AGTGACCAGA ATCACTTCTG TCAACCCACC GATGTGGCTG TAGATCCAAA CACTGGGACC ATCTTTGTAT CAGATGGTTA CTGCAACAGT CGGATCGTGC AGTTTTCACC AACTGGAAGG TTCATCACAC AGTGGGGAGA AGAGTCTTCT GAGAGCAATC CTAAACCAGG CCAGTTCAGG GTTCCTCACA GCTTGGCCCT TGTGCCTCAT TTGGGCCAAT TATGTGTGGC CGACCGGGAA AATGGTCGGA TCCAGTGTTT TAAAACTGAC ACCAAAGAAT TTGTGCGAGA GATTAAGCAT GCATCATTTG GAAGAAATGT ATTTGCAATT TCGTATATAC CAGGTTTGCT CTTTGCCGTA AATGGGAAGC CTTACTTTGG GGACCAAAAA CCAGTACAAG GATTTGTGAT GAACTTTTCC AGTGGGGAAA TTATAGATGT CTTCAAGCCA GTGCGCAAGC ACTTTGACAT GCCTCATGAC ATTACTGCAT CTGAAGACGG GACTGTGTAT GTTGGAGATG CTCACACCAA CACCGTGTGG AAGTTCACTT CGACTGAA

相違する塩基配列部

( i )

AC AGCCCAGGTC

TGGTTCCCGG GTGTGGACCT ACATCACTCG TCAGTGGCCA TGCTGTGGTG GCAGCTCACA TACAAAAAGA GGAAGATTGA CAACAGATGT TATCTCAGGG CCAATCTTCC TCAGCAAATG ftAAAAAAAAA GAGTGGAGCA TCGATCAGTT AAAAAGGCTG GCATTGAGGT CCAGGAAATC AAAGAATCCG AGGCAGTTGT TGAAACCAAA ATGGAGAACA AACCCGCCTC CTCAGAATTG CAGAAGATGC AAGAGAAACA GAAACTGATC AAAGAGCCAG GCTCGGGAGT GCCCGTTGTT CTCATTACAA CCCTTCTGGT TATTCCGGTG GTTGTCCTGC TGGCCATTGC CATATTTATT CGGTGGAAAA AATCAAGGGC CTTTGGAGAG TCTGAACACA AAGTCGAGGC AAGTTCAGGA AGAGTACTGG GAAGACTTAG AGGAAAAGGA AGTGGAGGCT TAAACCTCGG AAATTTCTTT GCGAGCCGTA AAGGCTACAG TCGGAAAGGG TTTGACCGGC TCAGCACCGA GGGGAGTGAC CAGGAGAAAG ATGAGGATGA CGGAAGTGAA TCAGAAGAAG AATATTCAGC ACCTCTGCCC GCACCTGTAC CTTCCTCCTC CTGAAAACTG GGCTTTGATT TAGTTGATGA GATTTACCAA GAATGCCAGG TTCCTTTCCC TTTAGCACGA TTAGAGTTTT 19VDV39Ili 33D90VV3iV VV fVV99133 OXXVXIItflV 33DIIVD399

X3D13013IX 39X9333IIV IX99X0IX33 3VV0VIIV3I 3II9XX5330

9IDVD993X3 99V33DV9Vtf V3Ii?3I3VVV 3V3VVV9V9 /

0DXIVV3V31 03I30930DV VV3VV9V99X X101I9V399

3I99tf9iX\/0 99X399VtfVtf VXX9V3IVD3

( Ϊ! )

VVVVVtf 爾 爾 VVVVIVV X

VV9VDIVV3I VI¥X9I3D9I 11D1DVDVD3

XDI3X399V0 1VVVV13I9I VOyiVOVIiO 3V9VVI33DV 33VVVVVXIV

VV0VIV3I09 VX9IV1I9II V0IVVVVI1V I9HV13I19

XDIVVS3V/V 丄 3 31VVDX3VI3 3VVV3X9V91 XVDV3V33VV

V1V3VXIVVI VVI9III10V XVIDIXllOD 39IXIIIVV3

09IX1IVX9X DV9V3I9X09 V1IVD0V9VD IIIIDI9VVV IVVXOIOXXX

VVIDIVV9I0 IVV9V0IXXI 19I0V3VXI3 DltfSVlIXlI

VXI3I91^99 9I1XXI9X91 99IIDVIH3 XXOXIXXVVtf IXXIiXilOI

XtfVVXXXVIO X0I3VVVVVV 9VVV999VV3 VVODXXVIVX IV0VVX3VDX

v xvioiioiio IVVVIOSIOD VVDOVSOVDO vovxoaisii

3DDV0IDI1V 3DV3119I03 III039I99X

XI3XIX3I9I 9V033X1V30 II0V39VXVV 333IXlI3i9 VQV0V931X3

9I0I3IIV03 033VXVVV19 I99VI9I3II IX0V9VDIIX IV0VXXIV3I

39IXX03VV9 3XV3XVVXII VVI0V1I93V 31V03II3XX 3100I9V0VV

V3V9V1VV9V XV3VV9X0IV IIX3X9IXV3 3DIDV3VVIV 0II9VVVVX3

1X93I3IIX9 I31X399IID VIXi93IIXI SOIXDVXXXtf

IIIXV0V3VI 31QV333X9I DIDIDVX3VX 9I3VVVX9IX VVIIXVI9X3

9 £0I0/06df/IOd 06.Z0/16 OAV CTGAACACAA AGTCGAGGCA AGTTCAGGAA GAGTACTGGG AAGACTTAGA GGAAAAGGAA GTGGAGGCTT AAACCTCGGA AATTTCTTTG CGAGCCGTAA AGGCTACAGT CGGAAAGGGT TTGACCGGCT CAGCACCGAG GGGAGTGACC AGGAGAAAGA TGAGGATGAC GGAAGTGAAT CAGAAGAAGA ATATTCAGCA CCTCTGCCCG CACCTGTACC TTCCTCCTCC TGAAAACTGG GCTTTGATTT AGTTGATGAG ATTTACCAAG AATGCCAGGT TCCTTTCCCT TTAGCACGAT TAGAGTTTTG TGTATTTAAT TGTAAACTGT ACTAGTCTGT GTGGGACTGT ACACATTTTA TTTACTTCGT TTTGGTTTAG TTGGCTTCTG TTTCTGGTTG AGGAGTTTCC TAAAAGTTCA TAACAGTGCC ATTGTCTTTA TCTGAACATA GAATAGAGAA ACAGTCCTCT TCTTCCATCA CGTTACTAAT TTAATGATGG AAGCTTTGCT CATTTACATT TTGAGACTTT TCTGTAGGTG TAAATAGCCC CATTCTCTGC TTGGACACAG TCTTTTCCCA ATAGCACTTC CATTGCCAGT GTCTTTCTTT GGTGCCTTTC CTGTTCAGCA TTCTCAGCCT GTGGCAGTAA AGAGAAACTT TGTGCTACAC GACGACGAAG CTGCTAAATC TTCTTCTATT TTTTTAAAAT CACTAACATT ATATTGCAAC AAGGGAAAGA AAAAAGTCTC TATTTAAATT CTTTTTTTTA AATTTTCTTC TTTAGTTGGT GTGTTTTTGG GATGTCTTAT TTTTAGATGG TTACACTGTT AGAACACTAT TTTCAGAATC TGAATGTAAT TTGTGTAATA AAGTGTTTTC AGAGCATTAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A

( iii )

AC AGCCCAGGTC

TGGTTCCCGG GTGTGGACCT ACATCACTCG TCAGTGGCCA TGCTGTGGTG GCAGCTCACA TACAAAAAGA GGAAGATTGA CAACAGATGT TATCTCAGGG CCAATCTTCC TCAGCAAATG AAAAAAAAAA GAGTGGAGCA TCGATCAGTT AAAAAGGCTG GCATTGAGGT CCAGGAAATC AAAGCAGAGT CTGAACACAA 3> i-3 a* •-3 ·-→ cn »→ -3 •"3 Ο t~ T3 3= a> •-3 cn cn t-3 a» o cn cn

3 CD 3=· CD •—9 ►—9 t— 9 3 b *— 9 3» *— 9 It*

•—9 3 »— 3 •—9 •—3 *— 9 *— 9 •—9 C T3 CD J

3> •—9 3=» 3> C7D 3* t—9 Et It* *— 3 *— 9 i& *— 9 io J ΐι» 9 t-9 a ►-9 •—3 3> •—3 ic> •—9 T3 j it*

3» »—3 CTi 3» 3> o *— 3 »— 3 9 ~3

3 u> ΐϊ 3> *— 9 •—3 ΐ£> 3 "3 5> 3 ^ J J

75 - Ο >— 3 •—9 5» *— 9 "3 "3 5* ·&·

cn n ic> »— 3 ΐΐ CD 3> t— 9 ¾ 9 3» *— 9 "3 ~>

n c t-3 « 3> t-3 a CD •-9 »-3 »→ cn

3> a ¾ t-3 3 t-3 »→ 5» cn cn cn

3> n •—3 3 U» CD •—9 CT¾ ►—5 *— ¾ *— 9

»— 9 •—3 a=» >— 9 n C 5 •—9 >— i i

cn ff EE* C*3 EC t *^ Et>

3* 5> cn 3 ·— 5* t~3 n h»9 ·— 3 o o 3* »— 3 ~> 3 i

^> n ♦—3 3» 3 8 •—3

5 3» •—3 3» o C ~> 3

9

oo

( iv )

AG AGTGGAGCAT

CGATCAGTTA AAAAGGCTGG CATTGAGGTC CAGGAAATCA AAGCAGAGTC TGAACACAAA GTCGAGGCAA GTTCAGGAAG AGTACTGGGA AGACTTAGAG GAAAAGGAAG TGGAGGCTTA AACCTCGGAA ATTTCTTTGC GAGCCGTAAA GGCTACAGTC GGAAAGGGTT TGACCGGCTC AGCACCGAGG GGAGTGACCA GG'AGAAAGAT GAGGATGACG GAAGTGAATC AGAAGAAGAA TATTCAGCAC CTCTGCCCGC ACCTGTACCT TCCTCCTCCT GAAAACTGGG CTTTGATTTA GTTGATGAGA TTTACCAAGA ATGCCAGGTT CCTTTCCCTT TAGCACGATT AGAGTTTTGT GTATTTAATT GTAAACTGTfl CTAGTCTGTG TGGGACTGTA CACATTTTAT TTACTTCGTT TTGGTTTAGT TGGCTTCTGT TTCTGGTTGA GGAGTTTCCT AAAAGTTCAT AACAGTGCCA TTGTCTTTAT CTGAACATAG AATAGAGAAA CAGTCCTCTT CTTCCATCAC GTTACTAATT TAATGATGGA AGCTTTGCTC ATTTACATTT TGAGACTTTT CTGTAGGTGT AAATAGCCCC ATTCTCTGCT TGGACACAGT CTTTTCCCAA TAGCACTTCC ATTGCCAGTG TCTTTCTTTG GTGCCTTTCC TGTTCAGCAT TCTCAGCCTG TGGCAGTAAA GAGAAACTTT GTGCTACACG ACGACGAAGC TGCTAAATCT TCTTCTATTT TTTTAAAATC ACTAACATTA TATTGCAACA AGGGAAAGAA AAAAGTCTCT ATTTAAATTC TTTTTTTTAA ATTTTCTTCT TTAGTTGGTG TGTTTTTGGG ATGTCTTATT TTTAGATGGT TACACTGTTA GAACACTATT TTCAGAATCT GAATGTAATT TGTGTAATAA AGTGTTTTCA GAGCATTAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA

本発明の cDN Aのク ローニングは、 前述のラ ッ トについて説 明したのと同様に、 前述したゥマの諸組織を用いてそれ自体 公知の方法により実施するこ とができる。 以下本発明の cDNA調製方法についてより具体的に説明する, ゥマにおいて、 ぺプチ ド C未端ァ ミ ド化酵素を多く生産す る組織 （以下 「プラス組織」 という ） 、 例えば、 ゥマの心房 をグァニジルチオシァネー ト と共にホモジナイ ズするこ とに より細胞を破砕し、 塩化セシゥム平衡密度勾配超遠心分離に より R N A分画を得る。 続いてオ リ ゴ d Tセルロースを担持 したァフ ィ 二ティ ーク ロマ トグラフ ィ ーにより、 前記 R NA 分画からポリ Aを持つ R N A (ボリ A+RNA)を単離する。

このボリ A + RNA を鐯型と して使用し、 公知の方法、 好ま し く は岡山— Bergの方法（Mol. Cell. Biol.2, 161, 1982)によつ て、 cDNAライ ブラ リ 一を得る。 岡山一 Bergの方法は以下のよ うに実施する。 すなわち、 岡山一 Bergのベクターのボリ T部 分にボリ A+RNA のボリ A部分を吸着させ、 逆転写酵素を反応 させて、 cDNAを合成する。 ターミナルデォキシヌク レオチジ ル ト ラ ンスフヱラーゼでオ リ ゴ d Cを cDNAの 3 ' 末端に付加 した後、 制限酵素 HindlEでべクタ一 D N Aを切断する。 オ リ ゴ d Gリ ンカ一を連結してからべクターを環状化した後、 R N A部分を D N Aポリ メ ラーゼで D N Aに置換し、 cDNA舍 有ブラス ミ ドを得る。 これらのプラス ミ ドを用いて、 塩化力 ルシゥム法（Strik, P.等、 J.Bacteriol.138, 1033, 1979)な どの方法により大腸菌を形質転換する。 ア ンビシリ ン添加平 板培地にてァンビシリ ン耐性株を選択するこ とにより、 ブラ ス ミ ド受容菌を取得する。

一方、 前記のブラス組織すなわち C末端ア ミ ド化酵素を多 く生産する組織と、 C末端ア ミ ド化酵素をあまり生産しな-い 組織 （以下、 「マイ ナス組織」 という ） 、 例えば、 ゥマの肝 臓を用意し、 それぞれの細胞から上述の方法などによってポ リ A + RNA を単離する。 ポリ ヌ ク レオチ ドキナーゼと 〔 r — ³²〕 PATPとを用いて R N Aの 5 ' O Hを³² Pでラベルし、 これを プローブとする。

次に、 コ ロニーハイ ブリ ダィゼ一シヨ ン法（Hanahan, D.等、 Gene, 10, 63, 1980 ) により、 上述の cDNAラ イ ブラ リーの中 からプラス組織由来のプローブと相補性があり、 しかもマイ ナス組織由来のプローブと相補性がないコ ロニーを選択する。 こう して選択したコ ロニーからプラス ミ ド D N Aを取得し、 シテオキ シヌ ク レ ナ K"fe(Messing, J. Methods in Enzyraology 101, 20, 1983)などにより、 塩基配列を決定する。

これらがぺプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素の cDNAであるかは、 そのア ミ ノ酸配列をコー ドする領域を大腸菌、 枯草菌、 酵母、 動物培養細胞等の発現ベクター系に組込み、 cDNAにコー ドさ れる蛋白質を生産させ、 次いでそのア ミ ド化酵素活性 （例え ば、 PCTZJP89/00521 号明細書参照） を測定するこ とによ り確認することができる。 また、 得られた cDNAは前述の既知 のペプチ ド C末端ア ミ ド化酵素 cDNAとの相同性を比較する こ とにより選別してもよい。 さ らに、 国際公開 W089Z12096 号 公報に記載されるゥマ C末端ア ミ ド化酵素の精製法を用いて 精製した酵素の一部ァ ミ ノ酸配列を、 ペプチ ドシーケ ンサー 等で決定し、 cDNAから推定されるァ ミ ノ酸配列と同じである ことを確認してもよい。 またさ らに、 精製酵素を抗原と した 抗体をゥサギ、 ラ ッ ト等で作製し、 次いで上述の cDNAより大 腸菌等で発現させた蛋白質と抗原抗体反応を行う こ とにより 確認してもよい。

これらの確認手段は、 それらの特性を利用した cDNAク ロー ユングの手法として用いるこ ともできる。 すなわち、 既知の 異種の C末端ァ ミ ド化酵素 cDNAの中で、 それらの種間で相同 性が高い領域は、 ゥマ由来の cDNAでも相同性が高いと考え、 このような領域の D N Aをブローブとして cDN Aライ ブラ リ一 をスク リー二ングする方法 ； zl g tl lファージを用いる cDNAク ローニングシステムで抗体をプローブとするスク リ 一二ング 法 ； 精製酵素の一部ァ ミノ酸配列より、 その対応するコ ドン を連結した合成 D N A (数種類となる） を D N A合成機等で 作製し、 これをプローブとしてプラス ミ ド、 ファージ等を用 いて作製する cDNAライ ブラ リーのスク リ一ユング法などであ る。

こ う して調製される本発明のぺプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素 活性を有する蛋白質をコー ドした D N A配列は、 その D N A を適当な発現ベクターに連結し、 大腸菌、 枯草菌、 酵母、 動 物細胞等を宿主として発現させるこ とにより酵素— I および ノまたは酵素一 Πを大量に生産する こ とができる。

〔実施例〕

次に実施例によつて本発明をさ らに詳細に説明する。 なお 本発明はこれによって限定されるものではない。

例 1 基質類似体親和性ク 口マ トグラフ ィ一用ゲルの調製

5 ffifiのァフ ィゲル 10を、 イ ソプロバノ ールを満たした l O ffig 容ェコノ カ ラム （バイ オラ ッ ド社製） に計り取った。 ィ ソプ ロバノ ールを流し出したのち、 50/δβの 10mM酢酸ナ ト リ ウム緩 衝液 （PH 4. 5 ) 、 次いで lO の 0. 1 Mモ ッブス一水酸化ナ ト リ ゥム緩衝液 （80mM塩化カルシゥムを舍む、 _PH 7. 5 ) で洗浄 した。 ゲルを 20 容のビンに移したあと、 40mg (約 100 mo £ ) のフヱニルァラ二ルグリ シルフヱ二ルァラ二ルグリ シン（Phe -Gly-Phe-Gly. シグマ社製） を溶解した上記モ ップス一水酸 化ナ ト リ ゥム緩衝液 10 と混合し、 4 てで 18時間振盪反応さ せた。 そののち、 0. 5 ffi£の 1 M ト リ ス一塩酸緩衝液 （PH 8. 0 ) を加えて 4 てで 1時間振盪反応し、 未反応の活性基を不活化 した。 ゲルを前記モ ップスー水酸化ナ ト リ ウム緩衝液、 次い でイオン交換水で洗浄後、 0.02%NaN₃に懸濁し、 カラムに充 塡、 4 てで保存した。 なお、 反応に供したペプチ ド（Phe- Gly -Phe-Gly ) の量と回収された溶液中のペプチ ド量から、 ゲル

1 あたり約 10 ^ mo £結合している と算出された。

例 2 基質としてのフヱニルァラ二ルグリ シルフェニルァラ ニルヒ ドロキシルグリ シンの調製

フエ二ルァラ二ルグリ シルフヱ二ルァラ二ルグリ シン（FGFG)

(シグマ社製） 3 i を測り取り、 50mMへぺス一水酸化力 リ ゥ ム緩衝液 （PH 5. 5 ) 、 3 mMァスコルビン酸、 10mMヨウ化カ リ ゥム、 0.25mg/ ^カタラーゼ、 0.25nM硫酸銅、 7. 5 %ァセ ト 二 ト リ ル及び国際特許出願 JP89-00521号明細書の実施例 2 に 記載するようなゥマ血清由来のア ミ ド化酵素組成物を 200 添加し総量 ΙΟίώと し、 30'Cで 20時間、 好気的にア ミ ド化反応 をおこなった。 反応は 10%ギ酸添加で停止させ、 高速液休ク 口マ トグラフ ィ ー（HPLC)を用いて、 フエ二ルァラニルダリ シ ルフエ二ルァラニルヒ ドロキシルグリ シン（FGFhyG)を分取し た。 HPLCのカラムはカプセルパッ ク C18SG, 300 A (資生堂製） を用いた。 溶出溶媒は、 1 mM炭酸水素アンモニゥム （pH9. 0 ) およびァセ トニ ト リ ルを使用し、 ァセ トニ ト リ ルを 0 %から 40%まで 30分で増加させる直線濃度勾配をかけた。 ぺプチ ド は 214nmの吸収で検出した。 結果を第 1図に示した。 10.7分 のフエ二ルァラ二ルグリ シルフェニルァラニルグリ シンのピ —クは、 C末端ア ミ ド化反応によりほとんど消滅した。 それ に伴ない、 9. 9分の α—ヒ ド口キシグリ シン誘導体および

14.5分のア ミ ド化体のビークが見られた。 これらの物質は、 FAB- MSスぺク トル分折および N M R分折により構造確認した。 第 2図に、 グリ セ リ ン溶液中の FAB- MSスぺク トルの結果を示 した。 親ピークは分子量 442をあらわしており、 そしてフラ グメ ンテーシヨ ンの結果、 C末端に存在する— 0 H基が 1つ または 2つ飛んだ 425および 408m/ zのフラグメ ン トが確 認され、 なーヒ ドロキシルグリ シン付加体であることを示し ていた。 9. 9分のビークを分取し、 すみやかに 10%ギ酸溶液 とし、 凍結乾燥することにより本発明の酵素— Π用の基質を 調製した。 この基質は、 前記アミ ド化酵素組成物に代え、 本 発明の酵素一 I舍有物を用いても同様に調製することができ た。 前述のごと く 、 o —ヒ ドロキシルグリ シン誘導体は酸性 条件では安定であるが、 アルカ リ条件では不安定であり、 酸 素反応とは無関係にァ ミ ド化物とグリォキシル酸に分解する。 従って、 本例の最初におこなった C末端アミ ド化反応は、 -酸 性条件で実施した。 こ のとき、 PH7. 5以上で反応させると、 ct—ヒ ドロキシルグリ シン誘導体は確認できな く なる。 公知 の C末端アミ ド化酵素が前述の式 （ I ) で示されるペプチ ド C末端グ リ シ ン付加体から式 （ 1Π ) で示されるペプチ ド C末 端ァ ミ ド化物とグリオキ シル酸に変換すると考えられていた のは、 このアルカ リ条件での非酵素的変換が舍まれていたた めであり、 酵素自体の触媒反応は、 式 （ I ) で示されるぺプ チ ド C末端グリ シ ン付加体から式 （ Π ) で示されるぺプチ ド C末端 or— ヒ ド ロキ シルダ リ シ ン付加体への変換反応である。 従って、 従来のペプチ ド C末端ア ミ ド化酵素による酸性条件 下でのア ミ ド化反応の収率は、 一般に低いものであった。

例 3 ゥマ血清からの酵素— I の調製

( 1 ) 市販のゥマ血清 （ギブコ社製） 100 に、 ポリエチ レ ングリ コール 6000 (和光純薬） 25%水溶液 （ w / V ) を 100 i 、 すなわち最終濃度 12.5%になるように撹拌しながら序々 に添加した。 なお、 以下すベて 4 'Cにて操作を行った。 12時 間静置後、 遠心分離 （10，000 X g、 10分） し、 得られた沈殺 を 120ffl£の 10mMへぺス—水酸化カ リ ウム緩衝液 （pH7. 0 ) に 溶解した、 さらに 2時間静置後、 生成した不溶性物質を再び 遠心分離 （ΙΟ,ΟΟΟΧ g、 10分） で除き、 酵素一 I を舍む上澄 (127BZ£ ) を得た。

( 2 ) 上記 （ 1 ) で得た活性画分を、 10mMへぺス一水酸化 カ リ ウム緩衝液 （PH 7. 0 ) で平衡化したへパリ ンセ フ ァ ロー ス CL-6B (フ ア ルマ シア社製） を充塡したカ ラム ( 1. 6 X 15cm ) にかけた。 同緩衝液 96 で非吸着物質を洗い出した後、 0. 5 M塩化ナ ト リ ウムを舍む lOmMへぺス一水酸化力 リ ゥム緩衝液 (pH7. 0 ) で溶出を行った （流速 30 ノ hr) 。 第 3図に溶出 パターンを示した。 0. 5 M塩化ナ ト リ ゥム舍有緩衝液によつ て酵素— I は溶出された 〔フラク ショ ン番号 Νο.14〜16を集め る（lOOfflH 〕

( 3 ) 上記画分を、 Sephadex G-25 ファ イ ン （フア ルマシ ァ社製） カ ラムク ロマ トグラフ ィー （ 5 η 0 X23cm) を用い てゲル濾過をおこなった。 溶媒は、 lOmMへぺス—水酸化カリ ゥム (pH7. 0 ) を用い流速 2 Zmin で溶出した。 蛋白質は 280nmの吸光で検出し、 蛋白質を舍むフラク ショ ン lOOraeを 集めた。

( ) 例 1 に従って作製したァフ ィ ゲル 10- Phe- Gly- Phe- Gly ゲル 5 »z£をカラムに充塡し （ 1. 0 X 6. 3 cm ) 、 0. 1 M塩 化ナ ト リ ゥムを舍む 10mMへぺス—水酸化力 リ ゥム緩衝液 （pH 7. 0 ) で平衡化した。 このカラムに上記 （ 3 ) で得た試料

(18.1 ) をかけた。 酵素一 I を十分にゲルに吸着させるた めに、 カラムを通過した液を何回もカ ラムを通るように循環 させた （流速 20 Zhr) 。 12時間後、 循環を止め、 非吸着物 質を 35^の平衡化に用いた緩衝液で洗い出したのち、 0. 4 Μ 塩化ナ ト リ ウム、 20%ァセ トニ ト リルを舍む 8 mMへぺス—水 酸化力 リ ゥム緩衝液 （PH 7. 0 ) で溶出を行った （流速

hr) 。 酵素— I の活性は溶出画分 （ΙΟηώ) にのみ認められた,

( 5 ) 上記 （ 4 ) で得た精製物を、 再び上記 （ 3 ) の処理 を行った後、 10mMへぺス一水酸化力 リ ゥム緩衝液 （pH7. 0 ) で平衡化した Mono Qカ ラム （フアルマシア製 0. 5 X 5 cm ) に のせ、 同一緩衝液中で Nac の直線濃度勾配を第 3図のよう にかけ、 蛋白質を溶出させた。 このとき、 流速は 0. 5 mfi/min と した。

第 1表に、 上記 （ 1 ) 〜 （ 5 ) で行った精製の各工程での 全蛋白質量、 全酵素活性、 比活性、 収率および精製倍率を示 した。 第 1表 ゥマ血清からの酵素一 _1 の調製 階 全蛋白質 全活性 比活性 収 率 精製

( mg ) ( U ) ( Ό /mg ) (%) 倍率 血 清 7,500 10,500' 1.4 100

(1) ボ リ エチレ ン 4, 100 9,020 2.2 86 1.6 グリ コール

6000沈殺

(2) へバリ ンセフ 1,400 5,740 4.1 55 2.9 ァ 口ース CL- 6B

(3) セフ ァ テ ッ ク 1, 100 3,960 3.6 38 2.6 ス G- 25

(4) ァフ ィ ゲル 10 2.0 800 400 290 -Phe-Gly-Phe-

Gly

(5) Mono Qカ ラム 0,5 350 700 500 血清中に存在する蛋白質分解酵素の影響によるかも知 れないが、 基質及び生成物が一部分解したため、 相対 的に活性が低い。

活性測定法は、 実施例 2に記載の FGFGから FGFhyGの調製方 法に準ずる反応を各精製物について実施し、 そ こに記載の

HPLCにより FGFhyGを定量することで行った。 酵素活性 1 Uは、 1 nmole の FGFhyGが 37'C 1時間で生成する量とした。

なお、 蛋白質量の測定は、 口一リーの改良法（Bensadounら Anal.Biochem. , 70, 265, 1976)を用い、 標準曲線は牛血清 アルブ ミ ン （フ ラ ク ショ ン V、 シグマ社製） で作製した。 第 1表で示したように本酵素は、 収率 2 %で約 500倍に精 製できた。 さらに精製が必要な場合には前記工程 （ 3 ) 〜 ( 5 ) を繰り返すか、 それらのいずれかの工程を橾り返せば よい。

例 4 ゥマ血清からの酵素一 Πの調製

各精製工程を酵素一 Πの活性を追いながら行った以外は例 3 と同様にゥマ血清を処理した。

各精製工程 （ 1 ) 〜 （ 5 ) の全蛋白質、 全酵素活性、 比活 性、 収率および精製位率を第 2表に示す。

第 2表 ゥマ血清からの酵素一 Πの調製 段 階 全蛋白質 全活性 比活性 収 率 精製

( mg ) ( U ) ( U/mg) (%) 1口 血 清 7,500 2,100' 0.28

(1) ボリ エチレン 4,000 5,300 1.3 250 4.6 グリ コール

6000沈殺

(2) へバ リ ンセフ 1, 500 3,800 2.5 180 9.0 ア ロース CL- 6B

(3) セフ ァ テ ッ ク 1,200 3,000 2.5 140 9.0 ス G - 25

(4) ァフ ィ ゲル 10 1.2 360 300 17 1070 -Phe-Gly-Phe- Gly

(5) Mono Qカ ラ ム 0.1 50 500 1790

* 血清中に存在する蛋白質分解酵素の影響によるかも知

れないが、 基質及び生成物が一部分解したため、 相対 的に活性が低い。

活性測定は、 lOmMへぺス一水酸化力 リ ウム (pH6. 5 ) 中に 例 1 で得たフ エ二ルァ ラ ニルダリ シルフ ェニルァ ラ ニルヒ ド ロキシルグリ シン（FGFhyG)を 5 mM濃度に溶解し、 各段階の試 料を添加し、 総量 と して 30'Cで反応させた。 1 時間反 応後 10%ギ酸添加により反応を停止し、 実施例 2 の条件を用 い HPLCで反応生成物を定量した。 この とき、 試料無添加のコ ン ト ロールの反応もおこない、 非酵素的変換がほとんど進ん でいないことを確認した。 反応溶液の HPLCパターンを第 4図 に示す （図中の反応条件は、 37'C PH6. 9で反応時間は図中に 示した） 活性はユニッ ト （ U ) で表示した _β 1 Uは、 l nmole の FGF- NH₂ を 30て 1時間で生成する酵素量と定義した。

なお、 蛋白質量の測定は、 例 3 と同様に行った。

第 2表で示したように本酵素は、 収率 2 %で、 約 1800倍に 精製できた。

以下の例で、 ラ ッ ト下垂体由来のペプチ ド C末端ア ミ ド 化酵素 cDNAを利用する該酵素の生産について説明する。

例 5 発現ブラス ミ ドの造製

ラ ッ ト下垂体由来のポリ A + を用いて cDNAクローニング をおこなったところ、 分子量の異なる 5本の cDNAが得られた (第 6図、 第 7図、 生化学、 61, 842 (1989)参照） 。 cDMク 口一ン 205 の EcoR I — Xma I で切断される 2.58kbp (キ口べ一 スペア） の D N A断片を、 動物培養細胞系発現ベク ター PSV2 ベクター S.Subramani, R. Mul 1 i gan , P . Berg , Mol . Cel 1. Bi o 1. 丄， 854 (1981) ) の Had II— i Π部位に合成リ ンカ一を介 して挿入し、 このプラスミ ドを SV-205と命名した。 次いで、 SV- 205の Ji l I (700) — n I断片を、 cDNAク ロー ン 201, 202， 203, 204それぞれの]^i I (700) — ^ I断片と置換した。 こ れらの発現ブラスミ ドを SV-201, SV-202, SV-203, SV-204と した。 このうち、 SV-203が cDNAの膜貫通領域に相当する部分 が除かれていることを確認した。 こう して得られた SV-203プ ラ スミ ド D N Aより、 ぺプチ ド C末端ダリ シ ン付加体に作用 して、 ペプチ ド C末端な—ヒ ドロキシルグリ シン付加体へ変 換する酵素を発現する発現プラスミ ド SV-Aを構築した。 中央 付近の K K配列部分をコードする cDNA領域近傍に存在する BamH I部位 〔第 7図、 B (1386)〕 以降の D N A部分を、 BamH I , Xma I 〔第 7図、 X (2948)〕 消化により欠除させ、 切断 部位に合成 D N Aリ ンカー 〖5' - CATCTGAAAC-3' \を挿入

I 3' -ACTTTGGGCC-5' } し、 ライゲーショ ンし、 次いで SV- Aブラスミ ドを完成した。 合成 D N Aは、 A B I社製 D N A合成機を用いる常法により 合成しそして精製した。 この合成 D N Aは、 BamH I 切断部位

—ス ト ップコ ドン—) (ma I切断部位で構成されている。

次に、 C末端 or—ヒ ドロキシルグリ シン付加体を、 C末端 ア ミ ド化体とダリオキシル酸に変換する酵素を発現する本発 明に係る発現プラス ミ ド SV-Bを構築した。 シグナルペプチ ド をコードする領域のすぐ下流に存在する Kpn I部位 〔第 7図、

Ν (175) 及び、 中央の Κ Κ部位近傍に相当する位置に存在 する BamH I部位で SV- 203 D N Aを切断し、 その間を合成 D N

A ( 5' -GATCGTAC-3' \ により連結して発現プラス ミ ド

\3' -CATGCTAG-5' /

SV- Bとした。 この結果、 シグナルペプチ ド領域と cDNA後半部 位のフレームが合って連結された。

例 6 動物培養細胞中での発現

培養細胞 C0S-7 は、 10%牛胎児血清を含む合成培地（DMEM) 中で生育させ、 公知の方法により例 1 の発現ブラス ミ ドを用 い形質転換した（ Chen and H. Okayama, Mol . Cel 1. Biol . 7,

2745 (1987 ) 参照） 。 このとき、 細胞 5 X10⁵ 個に対し、 20 の発現プラス ミ ドを使用した。 3 %二酸化炭素、 35ての条 件下で 24時間培養した後、 ゥ シ血清アルブミ ン（BSA) 0. 2 % 舍む DMEM培地 lOmfiで 2回細胞を洗浄した後、 0. 2 % BSAを舍 む DMEM培地 ΙΟίΗβ中、 5 %二酸化炭素、 37'Cの条件下で 48時間 さらに.培養した。

例 7 組換え細胞により生産された C末端ァ ミ ド化酵素活性 例 6で発現させた細胞培養液を遠心分離により細胞と上清 (培地） に分けた。

上清について酵素活性を測定した。 活性測定は基本的には 文献（J.Biol. Chem, 265- 9602-9605, 1990)に示した HPLCを 用いた方法に従っておこなった。 つまり、 C末端グリ シ ン付 加体の or—ヒ ドロキシルグリ シン付加体への変換活性は、 次 のような反応液組成 （A ) で反応を進め、 一定時間反応後に HPLCにより、 基質 （PheGlyPheGly) 及び生産物

(PheGlyPhehydroxyGly) を定量し求めた。

反応液組成 ( A )

15^M PheGlyPheGly

5 raM CuS0₄

5 W 反応液 1 カタ ラーゼ （ シグマ）

lOOmM M E S緩衝液 （pH5. 6 )

1 raM ァスコルビン酸

+ 培養上清 （培地）

また、 ーヒ ドロキシルグリ シン付加体のア ミ ド化物およ びグリオキ シル酸への変換活性は、 次の反応組成 （ B ) を用 いて、 同様に測定した。

反応液組成 ( B )

15 PheGlyPhehydroxyGly*

lOOmM M E S緩衝液 （_PH5. 6 )

+ 培養上清 （培地） * 反応液組成 （ A ) での反応を進め、 HPLCで or— ヒ ドロ キシルグリ シ ン付加体を分取したものよ り調製した。 なお、 hydroxyGlyは or— ヒ ドロキシグリ シ ンを表す。

測定結果を第 3表に示す。

第 3 表

醉 ¾ 活 性 nmole/h/mE medium

PheGlyPheGly PheGlyPhehydroxyGly ブラスミド

PheGlyPhe-hydroxyGly PheGlyPhe-NH₂+グリオキシノ l

SV-203 (シグナノ柳 J+N末 2.5 4.2

ドメイン十 C末ドメ

イン； ^)

SVa (シグナノ柳 J+N末 2.8 く 2

ドメイン； ）

SVb (シグナノ柳 J+C末 0.4 10.8

ドメイン；:^)

psv2 照） 0.3 く 2

O Plasmid 照） 0.5 <2

SV-aプラス ミ ドによる形質転換株では、 顕著に向上した or — ヒ ドロキシルグリ シ ン付加体生産活性が認められ、 α— ヒ ドロキシルグリ シン付加体を基質とした反応には閲与しなか つた。 これに対して、 SV-bプラスミ ドにより形質転換された 株では、 C末端グリ シ ン付加体には全く反応せず、 or— ヒ ド πキシルグリ シ ン付加体をァ ミ ド化物に変換する活性のみ認 められた。 cDNAのほぼ全領域を持つプラス ミ ド SV- 203により 形質転換した株では、 両酵素活性が認められたが、 それぞれ の酵素活性は、 SV-a , SV-bに比較して低いものであった _n 次に、 これらの形質転換株において発現している酵素が単 一なものかどうかをゲル濾過ク ロマ トグラフィ一により確認 した。 セファ ク リ ル S- 200 (フアルマシア製） カラム （ 1 X95 cm) を用い、 溶出バッファ一 10mM HEPES-KOH ( H7. 0 ) 、 50 mM NaC £で平衡化した。 溶出速度は 6 fflfi /時で 1 フラク シ ョ ンを集めた。 両酵素活性及び蛋白質量を測定した結果を、 第 8図から第 10図に示した。 SV-a由来 （第 8図） SV-b由来

(第 9図） の酵素活性はそれぞれ単一のビーク となり、 その 測定された分子量もそれぞれ 36KDa 、 及び 54KDa とそれぞれ のプラスミ ドが持つ cDNAがコー ドする蛋白質の分子量に相当 した。 しかし、 SV-203ブラスミ ド由来の蛋白質は、 第 10図に 示したように、 C末端ダリ シンに作用し or—ヒ ドロキシルグ リ シン付加体を生産する活性 （口—口） となーヒ ドロキシル グリ シン付加体に作用し、 アミ ド化物とグリオヰシル酸を生 産する酵素活性 （〇一〇） の 2つのビークに分離した。 しか も、 これらの分子量は、 第 8図、 第 9図に示したそれぞれの 酵素を単独に発現させたものと同一であった。 この結果は、 培養細胞中で cDNAのコ一ドする蛋白質の中央部に位置する K K配列がプロセ ッ シングにより切断されることを示してい た。 従って、 このような全 cDNA領域を持つ cDNAの発現によつ ても、 本発明に係る 2種の酵素を生産できることを示した。 次に、 ペプチ ド C末端ア ミ ド化反応において、 本発明にお ける 2種の酵素を併用することによる相乗効果を、 第 11図、 第 12図を用いて示した。 第 11図および 8図は PheGlyPheGlyを 基質としたときのア ミ ド化物への変換の経時変化を示してい る。 酵素試料は、 SV- a , SV-bブラス ミ ドと発現により得た培 地上清を上述のゲル濾過により精製し、 それぞれの活性画分 を濃縮し調製した。 第 11図には SV-a由来のものを示したが、 or—ヒ ドロキシル付加体のみ生産され、 アミ ド化物は生産さ れないことを示している。 第 12図には、 SV-b由来のみを使用 した場合 （☆ ) 、 と SV-a由来と SV-b由来を併用した場合を示 した。 SV-b由来のみでは、 or—ヒ ド口キシル付加体もア ミ ド 化物も全く生産されないが、 両酵素を併用する （酵素添加量 は、 同量） と or—ヒ ドロキシル付加体も、 ア ミ ド化物もとも に順調に生産されることが示された。 また、 ここでさらに注 目すべきことは、 反応 4時間以降で併用した場合に、 反応効 率は上昇しており、 9時間反応時には、 第 7図に示した SV- a 由来単独の場合に比較して 1. 5倍以上の変換率を示している ことである。 このように両酵素の併用は、 C末端ア ミ ド化反 応を効率的におこなうためには非常に有効な手段であつた。

以下の例で、 ゥマに由来する酵素一 I および酵素— Π (ゥ マ C末端ァ ミ ド化酵素） の活性を有するボリペプチ ドをコー ドする D N A配列の調製について説明する。

例 8 ゥマ心房からポリ A + RNA の調製

( 1 ) 全 R N Aの調製

ゥマ心房を摘出後すみやかに切り刻み、 その約 2 gを 50ffl£ プラスチックチューブ （Falcon社製 No.2070) に入れ、 液体窒 素中で凍結した。 20 のチオシアン酸グァニジン溶液 （ 4 M チォシア ン酸グァニジン、 25mMクェン酸ナ ト リ ウム (pH 7. 0 ) 0. 5 %ラウ リ ルザルコ シンナ ト リ ウム、 0. 1 %アンチフォー ム A、 0. 1 M 2 —メ ルカプトエタノール） を加え、 ボリ ト ロ ン （セン ト ラル科学貿易） を用いて細胞破碎した後、 18 Gの 注射針を付けた 10 シリ ンジ （テルモ社製） で破砕液を数回 出し入れした。 低速遠心分離（300xg、 5分） により沈渣を除 き、 上清 7. 3 fflfiを 3. 7 の CsTFA 容器 （フアルマシア製、

0. 5 MEDTAを舍むセシゥム ト リ フルォ口酢酸水溶液、 密度を 1.64 gノ に調製） に重層し、 スイ ングロータ一!? PS-40T を 用いた超遠心分離機 （日立製作所製、 SCP85H) により、 33,000 rpm にて 16時間処理した。 沈殺を 3 の 4 Mグァニジン溶液、 次いで 3 ¾£95%エタノールで洗浄した後、 1. 5 in£ CsTFA溶液 に溶解した。 60 の 5 M NaC £溶液、 3. 9 ffliのエタノールを 加え、 一 80てにて 30分間エタノール沈殺をおこない、 16,000 xgで 15分間の遠心分離を行って沈殺を得、 70%ェタノールで 洗浄後、 コ ンセン ト レーター （サクマ製作所製、 EC- 57C) に より乾燥させた。 滅菌蒸留水に溶解後、 260nmの吸光度を測 定して R N A量を定量した。 この方法により、 ゥマ心房組織 約 2 gから 350 の R N Aを得ることができた。

( 2 ) ポリ A + RNA の調製

全 R N Aからのボリ A + の調製は、 「raBM精製キッ ト j

(ファルマシア社製） を用い、 その添付プロ トコールに従つ ておこなった。 オ リ ゴ （ d T ) カラムによりァフ ィ 二ティ ー クロマ トグラフィーは 2回おこない、 350 のゥマ心房全

R N Aより 13 のポリ A + RNA を得た。 例 9 cDNAライ ブラ リ 一の作製

( 1 ) cDNAの作製

「cDNA合成システムブラ ス」 （アマ ンシャム社製、 RPN1256Y) を用い、 ゥマ心房ボリ A + BNA 5 Sを使用するこ とにより cDNA 合成をおこなった。 合成手順は、 添付プロ トコールに忠実に 従った。 ブライ マ一としてオリ ゴ d Tヌ ク レオチ ドを用い、

( or - ^Z P ) —dCTPを含んだ合成系にて放射活性より cDNA合 成効率を計算したところ、 逆転写効率が約 20%でセカ ン ドス ト ラ ン ド合成効率は 90%以上であつた。

( 2 ) cDNAライ ブラ リ一の作製

ファージ D N Aへの連結については、 「cDNAク ローニング システム ス gtlO, version 2. 0 」 （アマシャム社製、 RPN1257)、 フ ァ ージへのパ ッケージングについては、 「ギガバ ッ ク ； ゴ 一ル ド」 （ス ト ラタジーン社製） を用い、 これらの添付プ口 ト コールに従って、 合成 cDNAより cDNAライ ブラ リ一を作製し た。

( 3 ) 大腸菌の感染

宿主菌としては、 大腸菌 Y 1089 (ATCC37196)を使用し、 コ ンビテ ン ト細胞は次のように調製した。 シ ングルコ ロニーの 細胞を、 0. 2 %マル トースを加えた N Z Y培地 （ 0. 5 % NaC 、

1 % N Zァ ミ ン、 タイ プ A (和光純薬） 0. 5 %酵母エキス (DIFC0) 、 0. 2 %硫酸マグネ シウム、 pH7. 5 ) 5 m£に接種し、 一夜 37てで振とう培養した。 100 Wを新鮮な同じ培地 5 m£に 植えつぎ、 37てで 0D₆₆。 = 0. 5 となるまで培養した後、 遠心 分離により集菌した。 1 の 10mM硫酸マグネシゥム溶液に懸 濁してコ ンビテン ト細胞とした。

コ ンビテン ト細胞懸濁液 0. 2 に、 （ 2 ) で調製したファ ージ溶液 0. 1 を加え、 56てに保温した ト ッブァガロース

( 0.7 %タイプ I — LowEEO—ァガロース （シグマ社製） を舍 む N Z Y培地） 3 fflfiと混和後、 N Z Yァガ一プレー ト （ 1. 5 %バク トァガー（DIFC0社製） を舍む N Z Y培地 30/B«を Falcon 社製 1005プレー トに添加） の上部に流し込んだ。 ト ップァガ ロースの固化後、 37'Cで一夜静置培養した。 プラークを確認 することにより ファージ感染細胞を確認した。

以上の方法により、 2. 0 X 10⁷ 個のゥマ心房 cDNAラィブラ リ一を作製することができた。

例 10 C末端ア ミ ド化酵素 cDNAの単離

( 1 ) D N Aプローブの作製

ラ ッ ト由来のペプチ ド C末端アミ ド化酵素 cDNAは既に単離 され、 その塩基配列は報告されている （D.A.Sofferら、 Proc,

Natl. Acad. Sci. USA, 86. 735-739(1989) 、 加藤ら、 生化学、 61, 842(1989))。 ラ ッ ト cDNAとゥマ由来のペプチ ド C末端ァ ミ ド化酵素 cDNAは、 ある程度相同性があると考え、 ラ ッ ト cDNAの一部を入手し、 これをプローブとしてゥマ cDNAの単離 を進めた。 ラ ッ ト cDNAは、 東北大学医学部 （加藤ら、 生化学、 61' 842 (1989))より、 分与を受け、 これを制限酵素 EcoR I と Hinc Πならびに ^1 I と EIL I で消化し、 それぞれ第 14図お よび第 15図に示した D N A断片を単離し、 マルチブライ ム D N A標識キ ッ ト （アマシャム社製） により ³² P ラベルして プローブとした。 ( 2 ) プラークハイ ブリ ダィゼーシヨ ン

例 9 ( 3 ) 大腸菌の感染に示した方法に従って、 直径 15c のプレー ト （FALCON社製、 No.1058) 1枚につき約 50万個のプ ラークを形成させた。 このとき、 プラーク形成のための培養 は、 37'C 時間でおこなった。 プレー トを 4 て 2時間放置し た後、 ニ ト ロセノレロースフ イ ノレタ一（Schleicher & Schuell 社製、 BA85) を接着し、 フ ァ ージ D N Aをフ ィ ルターに移行 した後、 アルカ リ溶液 （ 0. 5 M苛性ソーダ、 1. 5 M塩化ナ ト リ ウム） 中で D N Aを変性させた。 中和液 （ L 5 M食塩、

0. 5 M ト リ ス塩酸緩衝液、 PH7. 0 ) で中和後、 2 XSSC溶液

( 0. 3 M塩化ナ ト リ ウム、 30mMクェン酸ナ ト リ ウム緩衝液

PH7. 0 ) ですすぎ、 風乾後に減圧下 80'C 2時間加熱し、 次い でフ ィ ルターに D N Aを固定した。

フ ァージ D N Aを固定した二 ト ロセルロースフ ィ ルターに、

( 1 ) で調製したプローブを用いてプラークハイ ブリ ダィゼ —シ ヨ ンをおこなった。 フ ィ ルターをラ ッ ピ一バッ グ （イ ワ タニ製） に入れ、 30ra£のプレハイ ブリ ダィゼーシヨ ン液

( 0.75M塩化ナ ト リ ウム、 50mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液、 pH 7. 4、 5 mMEDTA. 0.05%フ イ コール、 0.05%ボリ ビニルビ口 リ ドン、 0.05%ゥ シ血清アルブミ ン （ シグマ社製フラク ショ ン V ) 、 0. 1 % S D S、 0. 2 mg/ ^サケ精子 D N A ) を加え- シーラーで密封し、 次いで 65'C 4時間加温した。 プレハイ ブ リダィゼ—シ ョ ン液を捨て、 約 1000万 cpm の放射活性を持つ プローブを含む 30 ^のハイ ブリ ダィゼーシ ョ ン液 （ 0.75 M塩 化ナ ト リ ウム、 50mMリ ン酸ナ ト リ ゥム緩衝液、 pH7. 4、 5 mM EDTA、 0.02%フ イ コール、 0.02%ポリ ビュルピロ リ ド ン、

0.02%ゥ シ血清アルブ ミ ン、 0. 1 % S D S、 0. l mgZ ^サケ 精子 D N A ) を加え、 密封後、 65てで 15時間ハイ プリ ダイゼ ーシヨ ンをおこなった。 フ ィ ルターを 250ffl£の洗浄液 （ 0. 3

M塩化ナ ト リ ウム、 20mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液、 PH7. 4、 2 mMEDTA、 0. 1 % S D S ) で 2回洗浄し、 さ らに、 250ffl£の 洗浄液 （30mM塩化ナ ト リ ウム、 2 mMリ ン酸ナ ト リ ウム緩衝液 pH7. 4、 0. 2 niMEDTA. 0. 1 % S D S ) で 2回洗浄し風乾した。 ポジティ ブク ローンの検出は、 X線フ ィ ルム （フ ジ、 Ηβ-Η ) を用いて一 80'C—昼夜露光する条件下でのォー ト ラジオダラ フ ィ一によりおこなった。

用いた 2つのプローブについて、 それぞれ 200万プラーク をスク リーニングしたところ、 1000個程度のポジティ ブク ロ —ンが得られた。 ポジティ ブプラークより ファージ D N Aを 回収し、 再度、 上記方法に従って大腸菌に感染させ、 ブラー クハイ ブリ ダィ ゼ一ショ ンを再度おこない、 この操作をプラ ークが単一になるまで く り返した。 通常、 2回く り返すこ と により単一ブラークが得られる。

例 11 cDNA塩基配列の決定

Molecular Cloning A Labora tory Manual (T. Mani atis ,

E. F. Fri tsch, J. Sambrook 編、 Cold Spring Harbor Labora tory： 1982) , 371〜372 ページ記載の方法に従い、 ク ローユングし たファージより D N Aを分離精製した。 制限酵素！ I

(宝酒造製） により D NAを消化し、 1. 5 %ァガロースゲル 電気泳動により ファージ D N Aから cDNA挿入 D N A断片を分 離した。 cDNA断片をゲルより抽出し、 大腸菌プラス ミ ド PUC119

(宝酒造製） の！^ R I部位に、 ライゲーシヨ ン反応により 組み込んだ。 cDNA断片中に！^ R I 切断部位が存在する場合 には、 ファージ D N Aを！ I で部分消化することにより cDNA断片を得た。 プラス ミ ドを増幅後、 cDNA断片を M13ファ —ジ mpl8 , m_P19 (宝酒造製） にサブク ローユングし、 常法に 従い一本鎖 D N Aを得た。 Sequenase (商品名、 東洋紡績㈱製） を用い、 その使用説明書に従って D N A塩基配列の決定をお こなった。 一本の D N A鎖の塩基配列決定は約 400ベースと し、 それを越える長さの D N A断片については、 適当な制限 酵素部位を用いてサブクローニングすることにより配列決定 をおこなった。 また、 cDNA断片は、 2本鎖の両方鎖とも塩基 配列を決定した。

第 13図に決定したゥマ C末端ァミ ド化酵素 cDNA塩基配列 (この塩基配列は多く の cDNAの解折の結果、 最も長い cDNAク ローンについて示す） 及びこの塩基配列から予想されるア ミ ノ酸配列 （ 1文字表示） を示した。 図中の 〔 〕 で示した部 分の一方または両方が欠落した cDNAも確認できた。 これらの cDNAは、 mRNAスプラィ シングの様式の異なる mRNAに由来する ものと考えている。

〔産業上の利用可能性〕

本発明は、 ぺプチ ド C末端ダリ シン付加体から対応するぺ プチ ド C末端アミ ド化物の製造に利用することができ、 かか るペプチ ド C末端ァ ミ ド化物には多く の興味深い生理活性物 質が包舍される

Claims

請 求 の 範 囲

1. 次式 （ I )

(H)

i ( I )

X— - A— C0NHCH₂C00H

(上式中、 Aは、 天然の o —ア ミノ酸に由来する なーァ ミノ 基もし く はィ ミノ基および α—カルボキシル基以外の残基を 表しており、 Xは、 水素原子またはカルボ二ル基を介して N 原子と結合するア ミノ酸誘導体の残基を表す） で示されるぺ プチド C末端グリ シン付加体に作用して、 次式 （ D )

(H) OH

I I ( Π )

X-N-A-C0NHCHC00H

(上式中、 Aおよび Xは、 前記の意味を表す） で示されるぺ プチ ド C末端な一ヒ ドロキシルグリ シン付加体を生成するぺ ブチ ド C末端グリ シ ン付加体のペプチ ド C末端ア ミ ド化に関 与する酵素。

2. 前記式 （ D ) で示されるペプチ ド C末端 α— ヒ ドロキ シルグリ シン付加体に作用して、 次式 （ IE )

(H)

I ( IE )

X-N- A-C0NH₂

(上式中、 Aおよび Xは、 前記の意味を表す） で示されるぺ プチ ド C末端ア ミ ド化物とダリオキ シル酸の生成するぺブチ ド C末端グリ シン付加体のぺプチ ド C末端ァ ミ ド化に関与す る酵素。

3. ( a ) 至適 pHが約 5〜 7でかつ安定 pHが 4〜 9にあり、 ( b ) 作用適温が 25〜40'Cの範囲にあり、

( c ) Cu^{z +} ， Zn^{2 +} , Ni²⁺ , Co^{2 +}および Fe^{3 +}のような金属ィ オンならびにァスコルビン酸を補因子とする請求項 1記載の

4. ( a ) 至適 pHが約 5〜 6でかつ安定 pHが 4〜 9にあり、 そして

( b ) 作用適温が 15〜35'Cの範囲にある請求項 2記載の酵 素。

5. 分子量が約 25KDa または約 36KDa である請求項 1記載 の酵素。

6. 分子量が約 40KDa または約 43KDa である請求項 2記載 の酵素。

7. 添付第 5図のヒ ト、 ゥマ、 ゥシおよびラ ッ トのそれぞ れ 42残基目の P もし く は Sから 442残基目の Kまでのァ ミノ 酸配列に対応するものからなる群より選ばれるか、 またはゥ マおよびゥシのそれぞれ 42残基目の Pもしく は Sから 231残 基目の Kまでのア ミノ酸配列に対応するものからなる群より 選ばれる請求項 1記載の酵素。

8. 添付第 5図のヒ ト、 ゥマ、 ゥシおよびラ ッ トのそれぞ れ 443残基目の Dから 830残基目の Kまでのアミノ酸配列に 対応するものからなる群より選ばれる請求項 2記載の酵素。

9. 請求項 1 または 2記載の酵素活性舍有物を、 前記式

( I ) で示されるぺプチ ド C末端ダリ シン付加体をリガン ド とする基質親和性クロマ トグラフィー、 および陰イオン交換 クロマ トグラフィーで処理することを特徴とする請求項 1 ま たは 2記載のペプチ ド C末端ア ミ ド化に関与する酵素の製造 方法。

10. 前記リ ガン ドが、 C末端グリ シン残基が遊離の状態に あり、 かつ N末端ア ミノ酸残基のア ミノ基を介して水不溶性 担体に結合されたペプチ ド類、 D- Tyr-Trp-Gly, Phe- Gly- Phe -Glyおよび Gly- Phe- Gly からなる群より選ばれる請求項 9記 載の方法。

11. 前記酵素活性舍有物が、 哺乳類の脳、 下垂体、 胃およ び心臓からなる群より選ばれる器官の均質化物または哺乳類 の血液である請求項 9記載の方法。

12. 前記酵素活性含有物が、 ゥマの血清である請求項 10記 載の方法。

13. 請求項 1記載の酵素および/または 2記載の酵素をコ 一ドする cDNAを舍み、 かっこれを発現することができるブラ スミ ドで形質転換された宿主細胞を培養するこ とにより前記 酵素を生産蓄積させた培養物から前記酵素の両方または一方 を採取することを特徴とする前記酵素の製造方法。

14. 前記宿主細胞が、 請求項 1記載の酵素および請求項 2 記載の酵素をコー ドする cDNAを舍み、 かっこれを発現するこ とができるプラス ミ ドで形質転換されたものである請求項 13 記載の方法。

15. 前記宿主細胞が、 請求項 1記載の酵素をコー ドする cDNAを舍み、 かっこれを発現することができるプラス ミ ドで 形質転換されたものである請求項 13記載の方法。

16. 前記宿主細胞が、 請求項 2記載の酵素をコー ドする cDNAを舍み、 かっこれを発現する こ とができるプラス ミ ドで 形質転換されたものである請求項 13記載の方法。

17. 前記 cDNAが哺乳類に由来する請求項 13から 16のいずれ かに記載の方法。

18. 前記 cDNAが膜貫通領域に相当する部分が除かれたもの である請求項 13〜18のいずれかに記載の方法。

19. 哺乳類がラ ッ トまたはゥマである請求項 17または 18記 載の方法。

20. 培養物を前記式 （ I ) で示されるペプチ ド C末端グリ シン付加体をリガン ドとする基質親和性ク ロマ トグラフ ィ ー で処理することを特徴とする請求項 13〜 19のいずれかに記載 の方法。

21. 前記式 （ I ) で示されるペプチ ド C末端グリ シン付加 体を請求項 1記載の酵素で処理することを特徴とする前記式

( Π ) で示されるペプチ ド C末端 or —ヒ ドロキシルグリ シン 付加体の製造方法。

22. 前記式 （ D ) で示されるペプチ ド C末端 or —ヒ ドロキ シルグリ シ ン付加体を請求項 2記載の酵素で処理するこ とを 特徴とする前記式 （ ΠΙ ) で示されるペプチ ド C末端ア ミ ド化 物の製造方法。

23. ( a ) 請求項 1記載の酵素の活性を有することが予測さ れる被験体を P H 5 〜 8 に緩衝化する工程、

( b ) この緩衝溶液に前記式 （ I ) で示されるペプチ ド C 末端グリ シン付加体、 L —ァスコルビン酸およびカタラーゼ を添加してイ ンキュベーシ ョ ンする工程、 ならびに ( c ) 生成する式 （ Π ) で示されるペプチ ド C末端 α— ヒ ドロキ シルグ リ シ ン付加体を検出する工程、 を舍むことを特 徴とする前記酵素活性の測定方法。

24. ( a ) 請求項 2記載の酵素活性を有することが予測され る被験体を PH 4〜 8に緩衝化する工程、

( ) この緩衝溶液に前記式 （ Π ) で示されるペプチ ド C 末端 α— ヒ ドロキ シグリ シ ン付加体を添加してィ ンキュベ一

ショ ンする工程、 ならびに

( c ) 生成する式 （m) で示されるペプチ ド c末端ア ミ ド 化物を検出する工程、 を舍むこ とも特徴とする前記酵素活性 の測定方法。

25. 請求項 23記載の測定方法を被験体に適用することを特 徴とする請求項 1記載の酵素の探索方法。

26. 請求項 24記載の測定方法を被験体に適用することを特 徴とする請求項 2記載の酵素の探索方法。

27. ゥマに由来する請求項 1および 2記載の酵素活性を有 するポリ ペプチ ドをコー ドする D N A配列。

28. 前記ポリ ぺプチ ドが共通する次のァミノ酸配列 ：

10 20

MetAlaGiyLeuArgSerLeuLeuValLeuLeuLeuValPheGlnSerSerCysLeuGly

30 40 PheArgSerProLeuSerVslPheし ysArgPheし ysGluThrThrArgProPheSerAsn

50 60 GluCysLeuGlyThrThrArgProVallleProIleAspSerSerAspPheAlaLeuAsp

70 80 IleArgMetProGlyValThrProLysGlnSerAspThrTyrPheCysMetSerMetArg

90 100 LeuProMetAspGluGluThrPheVal I leAspPheLys Pro ArgAlaSerMetAspThr 110 120 ValHisHisMetLeuLeuPheGl CysAsnMetProSerSerThrGlySerTyrTrpPhe

130 140 CysAspGluGlyValCysThrAspLysAlaAsnlleLeuTyrAlaTrpAlaArgAsnAla

150 160 ProProThrArgLeuProLysGl ValGl PheArgValGlyGlyGluThrGlySerLys

170 180 TyrPheValLeuGlnValHisTyrGl AspIleSerAlaPheArgAspAsnHisLysAsp

190 200 CysSerGlyValSerLeuHisLeuThrArgLeuProGlnProLeuIleAlaGlyMetTyr

210 220 LeuMetMetAlaし euAspThrVall leProAlaGl GluLysVal Val AsnSerAspLeu

230 240 SerCysHisTyrLysLysTyrProMetHisValPheAlaTyrArgValHisThrHisHis

250 260 LeuGlyLysValValSerGlyTyrArgValArgAsnGlyGlnTrpThrLeuI leGlyArg

270 280 GlnSerProGlnし euProGlnAlaPheTyrProValGluHisProValAspValSerPhe

290 300 GlyAs IleLeuAlaAlaArgCysValPheThrGlyGluGlyArgThrGluAlaThrHis

(Jl _{s A} ³¹⁰ し _T T T M ⁰

330 340 LysHisAlaValSerPheMetThrCysThrGlnAsnValAlaProGluMetPheArgThr

350 360 IleProProGluAlaAsnlleProIleProValLysSerAspMetValMetMetHisGly

370 380 HisHisLysGluThrGluAsnLysAspLysThrSerLeuGlnGlnProLysGlnGluGlu

390 400 GluValLeuGluGlnGlyAspPheTyrSerLeuLeuSerLysteuteuGlyGluArgGlu

410 420 AspVal ValHisValHisLysTyrAsnProThrGlutysAlaGluSerGluSerAspLeu

430 · 440

ValAlaGluIleAlaAsnValValGlnLysLysAspLeuGlyArgSerAspAlaArgGlu 450 460 SerAlaGluHisGluAspArgGlyAsnAlalleLeuValArgAspArglleHisLysPhe

470 480 HisArgLeuGluSerThrLeuArgProIhrGluSerArgVal IleSerValProGlnPro

490 500 LeuProGlyGluGlyThrTrpGluProGluHisThrGlyAspPheHisValGluGluAla

510 520 LeuAspTrpProGlyValTyrLeuteuProGlyGlnValSerGIyValAlateuAspLeu

530 540 GlnAsnAsnLeuValllePheHisArgGlyAspHisValTrpAspGlyAsnSerPheAsp

550 560 SerLysPheValTyrGlnGlnArgGlyLeuGlyProIleGluGluAspThrlleLeuVal

570 580 IleAspProAsnAsnAlaAlaValし euGlnSerSerGlyLysAsnLeuPheTyrteuPro

590 600 HisGlyし euSerlleAsptysAspGlyAsnTyrTrpValThrAspValAlaLeuHisGln

610 620 VslPheし ysLeuAspProAsnSertysGluGlyProLeuし euIleteuGlyArgSer et

630 640 GlnProGlySerAspGlnAsnHisPheCysGlnProThrAspValAlaValAspProAsn

650 ?60 ThrGlyThrllePheValSerAspGlyTyrCysAsnSerArglleValGlnPheSerPro

670 680 ThrGlyArgPhelleThrGlnTrpGlyGluGluSerSerGluSerAsnProLysProGly

690 700 GlnPheArgValProHisSerLeuAlaLeuValProHisLeuGl GlnLeuCysValAla

710 720 AspArgGluAsnGlyArglleGlnCysPheLysThrAspThrLysGluPheValArgGlu

730 740 IleLysHisAlaSerPheGlyArgAsnValPheAlalleSerTyrlleProGlyLeuLeu

750 760 PheAlaValAsnGlyLysProTyrPheGlyAspGIntysProValGlnGlyPheValMet

770 780 AsnPheSerSerGlyGluI lei leAspValPheLysProVal ArgLysHisPheAspMet 790 800 ProHisAspIleThrAlaSerGluAspGlyThrValTyrValGlyAspfllaHisThrAsn

ThrValTrpLysPheThrSerThrGlu

を有し、 かつ、 その下流にそれぞれ次のアミノ酸配列からな る群より選ばれる配列を有する請求項 25記載の D N A配列 ：

( i )

810 820

ThrAlaGlnValTrpPheProGl ValAspLeu

830 840 HisHisSerSerValAlaMetteuTrpTrpGlnLeuThrTyrLyslysArgLysIleAsp

850 860 AsnArgCysTyrLeuArgAlaflsnLeuProGlnbinMetLysLysLysArgValGluHis

870 880 ArgSerValLysLysAlaGl lleGluValGlnGluIleLysGluSerGluAlaVal al

890 900 GluThrLysMetGluAsnLysProAlaSerSerGluLeuGlnLysMetGlnGluLysGln

910 920 lysLeuIletysGluProGlySerGlyValProValValLeuIleThrThrLeuLeuVal

930 940 IleProValValValLeuLeuAlalleAlallePhelleArgTrpLysLysSerArgSla

950 960 PheGlyGluSerGluHisLysValGluAlaSerSerGlyArgValLeuGlyArgLeuArg

970 980 GlyLysGlySerGlyGlyLeuAsnLeuGl AsnPhePheAlaSerArgLysGlyTyrSer

990 1000 ArgLysGlyPheAspArgLeuSerThrGluGlySerAspGliiGluLysAspGluAspAsp

1010

Gl SerGluSerGluGluGluTyrSerAlaProLeuProAlaProValProSerSerSer ( ii )

810 820

ArgValGluHisArgSerVaUysLysAlaGly 830 840 IleGluValGlnGluIleLysGluSerGluAlaValValGluThrLysMetGluAsnLys

850 860 ProAlaSerSerGluleuGlnLysMetGlnGluLysGlnLysteuIletysGluProGly

870 880 SerGlyValProValValLeuIleThrThrLeuLeuVameProValValValLeuLeu

890 900 Al3lleAlaIlePheIleArgTrpLystysSerArgAlaPheGlyGluSerG】uHisし ys

910 920 VslGluAlsSerSerGlyArgVslし euGlyArgteuArgGlyし ysGlySerGlyGIyteu

930 940 AsnLeuGlyAsnPhePheAlaSerArgLysGlyTyrSerArgし ysGlyPheAspArgLeu

950 960 SerThrGluGlySerAspGlnGluLysAspGluAspAspGlySerGluSerGluGluGlu

970

TyrSerAlaProLeuProAlaProValProSerSerSerj

( iii )

810 820

ThrAlaGlnValTrpPheProGlyValAspLeu

830 840 HisHisSerSerValAlaMetLeuTrpTrpGlnLeuThrTyrし ysLysArgLysI leSsp

850 860 AsnArgCysTyrLeuArgAlaAsnLeuProGlnGlnMetLysLysLysArgValGluHis

870 880 ArgSerValLysLysAlaGlylleGluValGlnGluIletysAlaGluSerGluHisLys

890 900 ValGluAlaSerSerGlyArgValし euGIyArgLeuArgGlyし ysGlySerGlyGlyLeu

910 920 AsnLeuGlyAsnPhePheAlsSerArgし ysGlyTyrSerArgし ysGlyPheAspArgteu

930 940 SerThrGluGl SerAspGlnGluLysAspGluAs AspGl SerGluSerGluGluGlu

950 960 TyrSerAlsProし euProAlsProValProSerSerSer 、 および

3Sュ SSiQSOュ (Π^ΒΛΟ·Ι(ί

Hivojdⁿaio-^Id^eIV-^I9S^J'ⁱiⁿI9ⁿi9ⁿI3-^I3SⁿI9-^I9SⁱlO^dsV^{ds n}TD^dsV^s'ⁱ1ⁿI9

006 068

uigdsvaasAignigjq jasnsTSJVdsvaqd^lDSiqSJV-iQSJ^I^lDSilSJVJas

088 OLS

^Bl\/9ild⁹1d^usV'ⁱl9ⁿ⁹1^usVⁿ81^i9ii3Jas^I9sAqiig3J n3q3JvAt9n9TiBA

098 0S8

SJV^ID-taSJasenttlSieAsilsiHnigaasnigBnsiiaiiniguiaiBAnigQn

0^8 0S8

028 018

( A! )

28

9eOlO/06df/JOd 06Ζ.Σ0/16 OAV