JPH03262484A - ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ - Google Patents
ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ウマ由来のペプチドＣ末端アミド化酵素活性
を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡに関する。
を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡに関する。
生体内酵素反応によるペプチドＣ末端グリシン付加体の
Ｃ末端アミド化に関与する酵素は、ペプチジルグリノン
−α−アミデーティングモノオキシゲナーゼ（ペプチド
Ｃ末端アミド化酵素） （ＥＣ。
Ｃ末端アミド化に関与する酵素は、ペプチジルグリノン
−α−アミデーティングモノオキシゲナーゼ（ペプチド
Ｃ末端アミド化酵素） （ＥＣ。
１、１４．１７．３）と呼ばれており （Ｂｒａｄｂｕ
ｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ２９８、 ６８６． １９８
２ ： Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ ら、 Ｊ、Ｒｉ
ａｌ、Ｃｈｅｍ、。
ｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ２９８、 ６８６． １９８
２ ： Ｇｌｅｍｂｏｔｓｋｉ ら、 Ｊ、Ｒｉ
ａｌ、Ｃｈｅｍ、。
２５９、６３８５．１９８４＞ 、次のような反応を触
媒していると考えられている。
媒していると考えられている。
−ＣＨＣ口Ｎ１（ＣＨ，ＣＯＤ口→−［１，ＨＣ口ＮＨ
，＋グリオキシル酸生体内でのアミド化機構の解明、な
らびに組換えＤＮＡ技術によって生産されるペプチドで
Ｃ末端がアミド化されて初めて生理活性を示すペプチド
類、例えばカルシトニン、ガストリンなどへ生体外で転
化する方法に利用すべく、本酵素を精製する試みがなさ
れている。例えば、ウシ脳下垂体中葉（Ｍｕｒｔｈｙら
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ２６１． １８１５
１９８６） 、ブタ脳下垂体（Ｋｉｚｅｒら、εｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ。
，＋グリオキシル酸生体内でのアミド化機構の解明、な
らびに組換えＤＮＡ技術によって生産されるペプチドで
Ｃ末端がアミド化されて初めて生理活性を示すペプチド
類、例えばカルシトニン、ガストリンなどへ生体外で転
化する方法に利用すべく、本酵素を精製する試みがなさ
れている。例えば、ウシ脳下垂体中葉（Ｍｕｒｔｈｙら
、Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、、 ２６１． １８１５
１９８６） 、ブタ脳下垂体（Ｋｉｚｅｒら、εｎｄｏ
ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ。
上１８． ２２６２． １９８６ ：Ｂｒａｄｂｕｒｙ
ら、Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 。
ら、Ｅｕｒ、 Ｊ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 。
１６９、５７９．１９８７）、ブタ心房（Ｋｏ ｊ ｉ
ｍａら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １０５．４４０．
１９８９）、アフリカッメカ′エル体皮（Ｍｉｚｕｎｏ
ら、［３ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏ＋ｎ＋＋＋ｕｎ１３７、９８４１９８６） 、ラッ
ト甲状腺腫瘍（Ｍｅｈｔａら、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 ２６１，４４．１９８８）
由来のものが報告されている。
ｍａら、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、 １０５．４４０．
１９８９）、アフリカッメカ′エル体皮（Ｍｉｚｕｎｏ
ら、［３ｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、
Ｃｏ＋ｎ＋＋＋ｕｎ１３７、９８４１９８６） 、ラッ
ト甲状腺腫瘍（Ｍｅｈｔａら、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、、 ２６１，４４．１９８８）
由来のものが報告されている。
しかしながら、これらの精製酵素を利用して前述のＣ末
端アミド化ペプチドを生産することは可能であるとはい
え、生物体組織等からこれらを抽出し、分ｎ精製するこ
とが前提となる。従って、酵素の製造コストが高くなる
ため、これらを工業的製造工程に利用するには各種の難
点が存在した。
端アミド化ペプチドを生産することは可能であるとはい
え、生物体組織等からこれらを抽出し、分ｎ精製するこ
とが前提となる。従って、酵素の製造コストが高くなる
ため、これらを工業的製造工程に利用するには各種の難
点が存在した。
一方、一般に行われるようになった組換えＤＮＡ技術を
用いるペプチドＣ末端アミド化酵素の大量生産に供すべ
く、その発現に必要な該酵素類ｃＤＮＡの単離が報告さ
れている。例えば、Ｅｉｐｐｅｒ ＢＡ、らは、Ｍｏｌ
、 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １．７７７〜７９０． １
９８７で０ｈｓｕｙｅ、 Ｋ らは、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、 Ｃａｍｍｕｎ１５０、
１２７５〜１２８１．．１９８８で、そして５ｔｏｆｆ
ｅｒｓ、 Ｄ、Ａらは、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｃｌ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８６．７３５〜７３９゜１
９８９で、それぞれウシの下垂体、カエルの皮膚及びラ
ットの心房由来のペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ
を公表している。
用いるペプチドＣ末端アミド化酵素の大量生産に供すべ
く、その発現に必要な該酵素類ｃＤＮＡの単離が報告さ
れている。例えば、Ｅｉｐｐｅｒ ＢＡ、らは、Ｍｏｌ
、 Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １．７７７〜７９０． １
９８７で０ｈｓｕｙｅ、 Ｋ らは、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、 Ｃａｍｍｕｎ１５０、
１２７５〜１２８１．．１９８８で、そして５ｔｏｆｆ
ｅｒｓ、 Ｄ、Ａらは、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｃｌ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、 ８６．７３５〜７３９゜１
９８９で、それぞれウシの下垂体、カエルの皮膚及びラ
ットの心房由来のペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ
を公表している。
本発明者らもまた、各種生物体起源に由来するペプチド
Ｃ末端アミド化酵素について研究していたところ、ウマ
由来の前記酵素がその活性、安定性等に優れていること
を見い出していた（例えば、国際公開： ＷＯ３９／１
’２０９６号公報参照）。
Ｃ末端アミド化酵素について研究していたところ、ウマ
由来の前記酵素がその活性、安定性等に優れていること
を見い出していた（例えば、国際公開： ＷＯ３９／１
’２０９６号公報参照）。
ところで、前述のｃＤＮＡを用いたペプチドＣ末端アミ
ド化酵素の製造およびその使用が一般的なものとなって
いない現状を鑑みると、より優れた酵素をコードするｃ
ＤＮＡの提供又はその応用範囲を広げる上でさらなるｃ
ＤＮＡの提供はいまだ必要であるといえる。
ド化酵素の製造およびその使用が一般的なものとなって
いない現状を鑑みると、より優れた酵素をコードするｃ
ＤＮＡの提供又はその応用範囲を広げる上でさらなるｃ
ＤＮＡの提供はいまだ必要であるといえる。
そこで、本発明の目的は従来技術とは別異の起源に由来
するｃＯＮＡの提供にある。
するｃＯＮＡの提供にある。
本発明によれば、ウマ由来のペプチドＣ末端アミド化酵
素活性を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡ配列が
提供される。この酵素の起源は、それが存在する器官ま
たは組織であればその種類を問わないが、主に心房、下
垂体、脳または胃に由来するものを対象とする。
素活性を有するポリペプチドをコードしたＤＮＡ配列が
提供される。この酵素の起源は、それが存在する器官ま
たは組織であればその種類を問わないが、主に心房、下
垂体、脳または胃に由来するものを対象とする。
本発明に係るペプチドＣ末端アミド化酵素活性を有する
ポリペプチドをコードしたｃＤＮＡは、具体的には第１
図で示される。この図では、最も長いｃＤＮＡ断片の塩
基配列及びそれにコードされたアミノ酸配列を一文字表
示で示している。なお、図中の〔〕内はいくつかのＣＤ
ＮＡを解析した結果具い出したｍＲＮＡスプライソング
の差異により生じたものと思われるｃＤＮＡ欠失部分で
ある。従って、本発明に係るｃＤＮＡは、コードするポ
リペプチドのアミノ酸配列についても数種存在している
。例えば、本発明で記載しているウマ由来のペプチドＣ
末端アミド化酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸
配列は、少なくとも下記のごとく一定の鎖長まで共通の
配列を有し、かつその下流にそれぞれ４種の配列を有す
る４種存在する。
ポリペプチドをコードしたｃＤＮＡは、具体的には第１
図で示される。この図では、最も長いｃＤＮＡ断片の塩
基配列及びそれにコードされたアミノ酸配列を一文字表
示で示している。なお、図中の〔〕内はいくつかのＣＤ
ＮＡを解析した結果具い出したｍＲＮＡスプライソング
の差異により生じたものと思われるｃＤＮＡ欠失部分で
ある。従って、本発明に係るｃＤＮＡは、コードするポ
リペプチドのアミノ酸配列についても数種存在している
。例えば、本発明で記載しているウマ由来のペプチドＣ
末端アミド化酵素活性を有するポリペプチドのアミノ酸
配列は、少なくとも下記のごとく一定の鎖長まで共通の
配列を有し、かつその下流にそれぞれ４種の配列を有す
る４種存在する。
共通アミノ酸配列
ＴｈｒＶａ ］ＴｒｐＬｙｓＰｈｅＴｈｒＳｅｒＴｈｒ
Ｇ Ｉ ｕ（１１ン ９７ｆ） ＰｒｏＳｅｒＳｅｒＳｅｒ 相違する領域のアミノ酸配列 （ｉ） ８１０ Ｂ２０Ｔ ｈｒＡ
ｌａＧ １ｎＶａ ＩＴ ｒｐＰｈｅＰｒｏＧ Ｉ
ｙＶａ １ＡｓｐＬｅｕＨ＋ｓＨ＋５ＳｅｒＳｅｒＶａ
ＩＡ １ａｃｅ ｔＬｅｕＴ ｒｐＴｒｐＧＩ ｎＬ
ｅｕＴｈｒＴｙｒＬｙｓＬｙｓＡｒｇＬｙｓｌ ｌｅＡ
ｓｐＡｓｎＡｒｇＣｙｓＴｙｒＬｅｕＡｒｇＡｌａＡｓ
ｎＬｅｕＰｒｏＧＩｎＧ］ｎＭｅｔＬｙｓＬｙｓＬｙｓ
ＡｒｇシａｌＧｌｕＨ＋ｓ＾ｒｇＳｅｒＶａｌＬｙｓＬ
ｙｓＡｌａＧｌｙｌ ］ｅＧ］ｕＶａ ｌＧ１ｎＧ１
ｕＩ ］ｅＬｙｓＧ １ｕｓｅｒＧｌｕＡｌａＶａ １
ＬａＩＧ ｌｕＴｈｒＬｙｓＭｅｔＧ］ｕＡｓｎＬｙｓ
Ｐｒｏ＾１ａＳｅｒＳｅｒＧ ］ ｕＬｅｕＧ ］ｎＬ
ｙｓＭｅｔＧ ｌ ｎＧ ］ ｕＬｙｓＧ ］ ｎＬ
ｙｓＬｅｕ ｌ １ｅＬｙｓＧ ｌ ｕＰｒｏＧ ｌ
ｙＳｅｒ Ｇ ｌ ｙＶａ １ＰｒｏＶａ ｌ Ｖａ
Ｉ Ｌｅｕ Ｉ ＩｅＴｈｒＴｈｒＬｅｕＬｅｕＬ ａ
ｌ Ｉ １ｅＰｒｏｌ’ａ ｌνａｌＶａｌＬｅｕＬ
ｅｕＡｌａｌｌｅＡｌａ Ｉ １ｅＰｈｅｌ ］ｅＡｒ
ｇＴｒｐＬｙｓＬｙｓＳｅｒ＾＋４ＡｌａＰｈｅＧｌｙ
ＧｌｕＳｅｒＧ］ｕＨｉｓＬｙｓνａｌＧｌｕＡｌ ａ
ＳｅｒＳｅｒＧ］ ｙＡｒｇＶａ １ＬｅｕＧ］ ｙＡ
ｒｇＬｅｕＡｒｇＧｌ ｙＬｙｓＧＩ ｙＳｅｒＧ］
ｙＧｌ ｙＬｅｕＡｓｎＬｅｕＧ ｌ ｙＡｓｎＰｈｅ
ＰｈｅＡ ｌａｓｅｒＡｒｇＬｙｓＧ ｌ ｙＴ ｙｒ
ＳｅｒＡｒ ｇＬｙｓＧ Ｉ ｙＰｈｅＡｓｐＡｒｇＬ
ｅｕＳｅｒＴｈｒＧＩｕＧｌｙｓｅｒＡｓｐＧ！ｎＧｌ
ｕＬｙｓＡｓｐＧ］ ｕＡｓｐＡｓｐＧｌｙｓｅｒＧｌ
ｕｓｅｒＧｌｕＧｌｕＧ １ｕＴｙｒｓｅｒＡ］ａＰｒ
ｏＬｅｕＰｒｏＡｌａＰｒｏＶａ］ＰｒｏＳｅｒＳｅｒ
Ｓｅｒ（ｉｉｉ ） ＳｅｒＧ ｌ ｕＨ＋ ５ＬｙｓＶａ ＩＧ Ｉ ｕＡ
ｌ ａＳｅｒＳｅｒＧ ｌ ｙＡｒｇＶａ １Ｌｅｕ
Ｇ ］ ｙＡｒｇＬｅｕＡｒｇＧ １ｙＬｙｓＧ ｌ
ｙこれらのアミノ酸配列を持つポリペプチドは、単に４
種のｃＤＮＡ配列により翻訳されるだけでなく、同一ア
ミノ酸をコードする異なるコドンを組合せたＤＮＡを用
いても翻訳できるので、本発明のＤＮＡ配列はそれらの
全てを包含する。さら１こ、Ｃ末端アミド化酵素活性が
失われない程度１ご、アミノ酸配列の一部が置き換え、
追加、または除去により変更されても、本発明の本来の
目的に沿うものと解される。これらの具体例としては、
下言己の共通塩基配列を有し、その下流にそれぞれ下記
の相違する塩基配列部を有するものが挙げられる：共通
塩基配列 ＣＧＧＣＧＴＧＧＡ ＣＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣＡ
ＧＡＧＣＡ ＧＣＴＧＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＡＡＡＧ＾
＾＾ＣＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＣＣＡＧＴＣＡＴ ＴＣＣ
ＴＡＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＴＣＡ ＣＡＣＣＴ＾＾
＾ＣＡＴＴＴＧＣＣ＾＾ＴＧ Ｇ人ＴＧＡＧＧＡＡＡ
ＧＣＡＴＧＧＡＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＴＣＣＡＣ
ＴＧＧＡＡ ＧＴＴＡＣＴＧＧＴＴＣＴＴＣＧＴＡＧＣ
ＣＴＧＣＴＡＧＴＴＣＴＴＴＴＣＡＧＡＡＧＣＣＣＡＣ
ＴＴＴＣＴＧＣＡＴＴＴＴＣＣＡＡ ＴＧＡＡＴＧＴ
ＣＴＴＴＣＡＴＣＡＧＡＴＴ ＴＴＧＣＡＴＴＧＧ＾Ｇ
ＴＣＴＧＡＴＡＣＡ ＴＡＣＴＴＣＴＧＣ＾ＣＣＴＴ
ＣＧＴＧＡＴ ＴＧＡＣＴＴＣＡ＾＾＾ＴＧＴＴＡＣＴ
ＴＴ Ｔ、ＴＧＧＴＴＧＣ＾＾ＴＴＧＴＧＡＴＧ＾＾Ｇ
ＧＣＧＴＣＴＧＴ＾ＣＣＴＣＣＴＴＧＴＴ ＴＣＴＴＴＡＡＧＡＧ ＧＧＴ八ＣへＡＣＣ＾ ＴＡＴＴＣＧＣＡＴＧ ＴＧＴＣＧＡＴＧＣＧ ＣＣＴＣＧＴＧＣＣ八 ＴＡＴＧＣＣＣＴＣ＾ ［＾ＧＡＣＡＡＡＧＣ ＣＡＡＴＡＴＴＣＴＣＴＡＴＧＣＣＴＧＧＧ ＣＡＡＧ
ＡＡＡＴＧＣＴＣＣＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＣＴＣＣＣＣ
＾＾ＡＧＧＴＧＴＴＧＧ ＡＴＴＣＡＧＡＧＴＴ
ＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡ Ｃ丁ＧＧＡＡＧＴ＾＾ ＾Ｔ
ＡＣＴＴＣＧＴＡＣＴＡＣ＾＾ＧＴＡＣＡＣＴＡＴＧＧ
ＧＧＡ ＴＡＴＴＡＧＴＧＣＴ ＴＴＴＡＧＡＧＡＴＡ
ＡＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＴＴＣＴＧＧＴ ＧＴＧ
ＴＣＣＴＴＡＣＡＣＣＴＣＡＣＡＣＧ ＣＣＴＧＣＣＡ
ＣＡＧ ＣＣＴＴＴＡＡＴＴＧＣＴＧＧ［：ＡＴＧＴＡ
ＣＣＴＴＡＴＧＡＴＧ ＧＣＴＣＴＴＧＡＣＡ ＣＴ
ＧＴＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧ＾＾＾ＧＴＧＧ
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ＴＡＴＡＡＡＡＡＧＴ ＡＣＣＣＡＡＴＧＣ＾ＴＧＴ
ＣＴＴＴＧＣＣＴＡＴＡＧＡＧＴＴＣＡＣＡＣＴＣＡＣ
ＣＡ ＴＴＴＡＧＧＴ＾＾Ｇ ＧＴＡＧＴＡＡＧＴＧＧ
［：ＴＡＣＡＧＡＧＴ ＡＡＧＡＡＡＴＧＧＡ ＣＡＧ
ＴＧＧＡＣＡＣＴＧＡＴＴＧＧＡＣＧ ＴＣＡＧＡＧＩ
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ＴＣＡＧＴＴＴＴＧＧＴＧＡＣＡＴＡ ＣＴＧＧＣＡＧ
ＣＡＡ ＧＡＴＧＴＧＴＧＴＴ ＣＡＣＴＧＧＴＧＡＡ
ＧＧＡＡＧＧＡＣＡＧ＾＾ＧＣＣＡＣＧＣＡ ＣＡ
ＴＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＴＣＴＡＧＴＧ ＡＴＧＡＡ
ＡＴＧＴＧ ＣＡＡＣＴＴＡＴＡＣ＾ＴＴＡＴＧＴＡ
Ｔ丁 ＾ＣＡＴＧＧＡＡＧＣＣ＾＾ＧＣＡＣＧＣＡ
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ＧＡ＾ＣＣＡＴＶ：ＣＣＣＣＣＡ ＧＡＧＧＣＣ＾＾Ｔ
＾ＴｔＣＣＡＡＴＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＴＣＣＧＡＣＡ
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ＴＴＣＡＧＧ ＧＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＡＴＧＴＧＴＧ
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ＧＴＧＣＧＡＧ＾＾ＴＴＴＧＣＡＡＴＴ ＴＣＧＴＡＴ
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ＧＴＴＡＣＣＴＣＡＧＡＡＴＡＡＣＣＴＧＧＴＧＡＴＴ
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ＡＧＴＴＣＡＣＴＴ ＣＧＡＣＴＧＡＡ相違する塩基
配列部 ＡＣＡＧＣＣＣＡＧＧＴＣ ＴＧＧＴＴＣＣＣＧＧ ＧＴＧＴＧＧＡＣＣＴ ＡＣＡ
ＴＣＡＣＴＣＧ ＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡ ＴＧＣＴＧＴ
ＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＣＡＣＡ ＴＡＣＡＡＡＡＡＧ
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ＧＡＧＣＡ ＴＣＧＡＴＣＡＧＴＴ＾ＡＡＡＡＧＧＣＴ
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ＣＴＣＡＴＴＡＣＡＡ ＣＣＣＴＴＣＴＧＧＴ Ｔ
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ＡＡ ＡＡＴＣＡＡＧＧＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧＡＧ Ｔ
ＣＴＧＡＡＣＡＣＡ＾＾ＧＴＣＧＡＧＧＣＡＡＧＴＴＣ
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Ｇ ＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡ＾ＧＴＧＧＡＧＧＣＴ Ｔ
ＡＡＡＣＣＴＣＧＧ ＡＡＡＴＴＴＣＴＴＴ ＧＣ
ＧＡＧＣＣＧＴ人 人ＡＧＧＣＴＡＣＡＧＴＣＧＧＡ＾
＾ＧＧＧ Ｔ丁ＴＧＡＣＣＧＧＣＴＣＡＧＣＡＣＣＧ
Ａ ＧＧＧＧＡＧＴＧＡＣＣＡＧＧＡＧＡＡＡＧ＾Ｔ
ＧＡＧＧＡＴＧＡ ＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡ ＴＣＡＧＡ
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公知の方法により、前述したウマの諸組織を用いて実施
することができる。具体的には、＋、−法、ハイブリダ
イゼーンヨン法、ＰＣＲ法など一般に用いられている方
法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ−１
ｏｇｙ、 ｖｏｌ、 １５２ ；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
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ａｎａＭａｎｉａｔｉｓ編、１９８９． Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ参照）に従って行い、得られたｃ［ｌＮＡクロ
ーンの塩基配列を決定することにより蛋白質をコードす
るＣＤＮＡ領域を決定し、次いでその必要領域を限定す
る。
Ｇ Ｉ ｕ（１１ン ９７ｆ） ＰｒｏＳｅｒＳｅｒＳｅｒ 相違する領域のアミノ酸配列 （ｉ） ８１０ Ｂ２０Ｔ ｈｒＡ
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種のｃＤＮＡ配列により翻訳されるだけでなく、同一ア
ミノ酸をコードする異なるコドンを組合せたＤＮＡを用
いても翻訳できるので、本発明のＤＮＡ配列はそれらの
全てを包含する。さら１こ、Ｃ末端アミド化酵素活性が
失われない程度１ご、アミノ酸配列の一部が置き換え、
追加、または除去により変更されても、本発明の本来の
目的に沿うものと解される。これらの具体例としては、
下言己の共通塩基配列を有し、その下流にそれぞれ下記
の相違する塩基配列部を有するものが挙げられる：共通
塩基配列 ＣＧＧＣＧＴＧＧＡ ＣＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＴＴＣＡ
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公知の方法により、前述したウマの諸組織を用いて実施
することができる。具体的には、＋、−法、ハイブリダ
イゼーンヨン法、ＰＣＲ法など一般に用いられている方
法（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏ−１
ｏｇｙ、 ｖｏｌ、 １５２ ；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ ＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ、 Ｓ、（、、ＢｅｒｇｅｒおよびＡ、 Ｒ，Ｋ
１ｍ１７Ｉｅ１編、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、 Ｊ、Ｍ
、１ｌｌａｌｋｅｒ編、１９８８． Ｔｈｅ Ｈｕｍ
ａｎａＭａｎｉａｔｉｓ編、１９８９． Ｃｏ１ｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐ
ｒｅｓｓ参照）に従って行い、得られたｃ［ｌＮＡクロ
ーンの塩基配列を決定することにより蛋白質をコードす
るＣＤＮＡ領域を決定し、次いでその必要領域を限定す
る。
以下本発明のＣＤＮＡ調製方法についてより具体的に説
明する。
明する。
ウマにおいて、ペプチドＣ末端アミド化酵素を多く生産
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配超遠心分離によりＲＮＡ分画を得る。続いてオリゴｄ
Ｔセルロースを担持したアフィニティークロマトグラフ
ィーにより、前記ＲＮＡ分画からポリＡを持つＲＮＡ
（ポリＡ″ＲＮＡ）を単離する。
する組織（以下「プラス組織」という）、例えば、ウマ
の心房をグアニジルチオシアネートと共にホモジナイズ
することにより細胞を破砕し、塩化センラム平衡密度勾
配超遠心分離によりＲＮＡ分画を得る。続いてオリゴｄ
Ｔセルロースを担持したアフィニティークロマトグラフ
ィーにより、前記ＲＮＡ分画からポリＡを持つＲＮＡ
（ポリＡ″ＲＮＡ）を単離する。
このポリ＾”ＲＮＡを鋳型として使用し、公知の方法、
好ましくは岡山−Ｂｅｒｇの方法（Ｍｏｌ、 Ｃｅｌ
ｉ、 Ｂｉｏ１２、１６１．１９８２）によって、ｃＤ
ＮＡ ライブラリーを得る。岡山−Ｂｅｒｇの方法は以
下のように実施する。
好ましくは岡山−Ｂｅｒｇの方法（Ｍｏｌ、 Ｃｅｌ
ｉ、 Ｂｉｏ１２、１６１．１９８２）によって、ｃＤ
ＮＡ ライブラリーを得る。岡山−Ｂｅｒｇの方法は以
下のように実施する。
すなわち、岡山−ＢｅｒｇのベクターのポＩＪ Ｔ部分
にポＩＪ Ａ”ＲＮＡのポリＡＢ分を吸着させ、逆転写
酵素を反応させて、ｃＤＮＡを合成する。ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーセてオリゴｄＣ
をｃ［］ＮＡの３′末端に付加した後、制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩ［でベクターＤＮＡを切断する。オリゴｄＧリン
カ−を連結してからベクターを環状化した後、ＲＮＡ部
分をＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡに置換し、ｃＤＮＡ含
有プラスミドを得る。これらのプラスミドを用いて、塩
化カルシウム法（Ｓｔｒｉｋ、 Ｐ、等、Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、１３８．１０３３． １９７９＞などの方
法により大腸菌を形質転換する。アンピシリン添加平板
培地にてアンピシリン耐性株を選択することにより、プ
ラスミド受容菌を取得する。
にポＩＪ Ａ”ＲＮＡのポリＡＢ分を吸着させ、逆転写
酵素を反応させて、ｃＤＮＡを合成する。ターミナルデ
オキシヌクレオチジルトランスフェラーセてオリゴｄＣ
をｃ［］ＮＡの３′末端に付加した後、制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩ［でベクターＤＮＡを切断する。オリゴｄＧリン
カ−を連結してからベクターを環状化した後、ＲＮＡ部
分をＤＮＡポリメラーゼでＤＮＡに置換し、ｃＤＮＡ含
有プラスミドを得る。これらのプラスミドを用いて、塩
化カルシウム法（Ｓｔｒｉｋ、 Ｐ、等、Ｊ、Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ、１３８．１０３３． １９７９＞などの方
法により大腸菌を形質転換する。アンピシリン添加平板
培地にてアンピシリン耐性株を選択することにより、プ
ラスミド受容菌を取得する。
一方、前記のプラス組織すなわちＣ末端アミド化酵素を
多く生産する組織と、Ｃ末端アミド化酵素をあまり生産
しない組織（以下、「マイナス組織」という）、例えば
、ウマの肝臓を用意し、それぞれの細胞から上述の方法
などによってポリＡ”ＲＩＪＡを単離する。ポリヌクレ
オチドキナーゼと［：Ｔ −”） ＰＡＴＰとを用いて
ＲＮＡの５′○Ｈを３２Ｐでラベルし、これをプローブ
とする。
多く生産する組織と、Ｃ末端アミド化酵素をあまり生産
しない組織（以下、「マイナス組織」という）、例えば
、ウマの肝臓を用意し、それぞれの細胞から上述の方法
などによってポリＡ”ＲＩＪＡを単離する。ポリヌクレ
オチドキナーゼと［：Ｔ −”） ＰＡＴＰとを用いて
ＲＮＡの５′○Ｈを３２Ｐでラベルし、これをプローブ
とする。
次に、コロニーハイブリダイゼーション法（Ｈａｎａｈ
ａｎ、 Ｄｏ等、Ｇｅｎｅ、 １０．６３．１９８０）
により、上述のｃＤＮＡライブラリーの中からプラス
組織由来のプローブと相補性があり、しかもマイナス組
織由来のプローブと相補性がないコロニーを選択する。
ａｎ、 Ｄｏ等、Ｇｅｎｅ、 １０．６３．１９８０）
により、上述のｃＤＮＡライブラリーの中からプラス
組織由来のプローブと相補性があり、しかもマイナス組
織由来のプローブと相補性がないコロニーを選択する。
こうして選択したコロニーからプラスミドＤＮＡを取得
し、ジデオキシヌクレオチド法（Ｍ ｅ ｓ ｓ＋ｎｇ
、 Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１０１．２０． １９８３）などにより、塩基配列を
決定する。
し、ジデオキシヌクレオチド法（Ｍ ｅ ｓ ｓ＋ｎｇ
、 Ｊ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
１０１．２０． １９８３）などにより、塩基配列を
決定する。
これらがペプチドＣ末端アミド化酵素のＣＤＮＡである
かは、そのアミノ酸配列をコードする領域を大腸菌、枯
草菌、酵母、動物培養細胞等の発現ベクター系に組込み
、ｃＤＮＡにコードされる蛋白質を生産させ、次いでそ
のアミド化酵素活性（例えば、ＰＣＴ／ＪＰ８９１００
５２１号朗細書参照）を測定することにより確認するこ
とができる。また、得られたＣＤＮＡは前述の既知のＣ
末端アミド化酵素ｃＤＮＡとの相同性を比較することに
より選別してもよい。さらに、国際公開ＷＯ３９／１２
０９６号公報に記載されるウマＣ末端アミド化酵素の精
製法を用いて精製した酵素の一部アミノ酸配列を、ペプ
チドシーケンサ−等で決定し、ＣＤＮＡから推定される
アミノ酸配列と同じであることを確認してもよい。また
さらに、精製酵素を抗原とした抗体をウサギ、ラット等
で作製し、次いで上述のｃＤＮＡより大腸菌等で発現さ
せた蛋白質と抗原抗体反応を行うことにより確言忍して
もよい。
かは、そのアミノ酸配列をコードする領域を大腸菌、枯
草菌、酵母、動物培養細胞等の発現ベクター系に組込み
、ｃＤＮＡにコードされる蛋白質を生産させ、次いでそ
のアミド化酵素活性（例えば、ＰＣＴ／ＪＰ８９１００
５２１号朗細書参照）を測定することにより確認するこ
とができる。また、得られたＣＤＮＡは前述の既知のＣ
末端アミド化酵素ｃＤＮＡとの相同性を比較することに
より選別してもよい。さらに、国際公開ＷＯ３９／１２
０９６号公報に記載されるウマＣ末端アミド化酵素の精
製法を用いて精製した酵素の一部アミノ酸配列を、ペプ
チドシーケンサ−等で決定し、ＣＤＮＡから推定される
アミノ酸配列と同じであることを確認してもよい。また
さらに、精製酵素を抗原とした抗体をウサギ、ラット等
で作製し、次いで上述のｃＤＮＡより大腸菌等で発現さ
せた蛋白質と抗原抗体反応を行うことにより確言忍して
もよい。
これらの確認手段は、それらの特性を利用したｃＤＮＡ
クローニングの手法として用いることもできる。すなわ
ち、既知の異種のＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡの中で、
それらの種間で相同性が高い領域は、ウマ由来のＣＤＮ
Ａでも相同性が高いと考え、このような領域のＤＮＡを
プローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
する方法；λｇｔｌｌファージを用いるｃＤＮ＾クロー
ニングシステムで抗体をプロブとするスクリーニング法
：精製酵素の一部アミノ酸配列より、その対応するコド
ンを連結した台底ＤＮＡ （数種類となる）をＤＮＡ合
或合成で作製し、これをプローブとしてプラスミド、フ
ァージ等を用いて作製するｃＤＮ＾ライブラリーのスク
リーング法などである。
クローニングの手法として用いることもできる。すなわ
ち、既知の異種のＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡの中で、
それらの種間で相同性が高い領域は、ウマ由来のＣＤＮ
Ａでも相同性が高いと考え、このような領域のＤＮＡを
プローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
する方法；λｇｔｌｌファージを用いるｃＤＮ＾クロー
ニングシステムで抗体をプロブとするスクリーニング法
：精製酵素の一部アミノ酸配列より、その対応するコド
ンを連結した台底ＤＮＡ （数種類となる）をＤＮＡ合
或合成で作製し、これをプローブとしてプラスミド、フ
ァージ等を用いて作製するｃＤＮ＾ライブラリーのスク
リーング法などである。
こうして調製される本発明のペプチドＣ末端アミド化酵
素活性を有する蛋白質をコードしたＤＮＡ配列は、その
ＤＮＡを適当な発現ベクターに連結し、大腸菌、枯草菌
、酵母、動物細胞等を宿主として発現させることにより
ペプチドＣ末端アミド化酵素を大量に生産することがで
きる。
素活性を有する蛋白質をコードしたＤＮＡ配列は、その
ＤＮＡを適当な発現ベクターに連結し、大腸菌、枯草菌
、酵母、動物細胞等を宿主として発現させることにより
ペプチドＣ末端アミド化酵素を大量に生産することがで
きる。
次に以下の例によって本発明をさらに詳細に説明する。
ウマ心房を摘出後すみゃかに切り刻み、その約２ｇを５
０−プラスチックチューブ（ｐａｌｃｏｎ社製Ｎ。
０−プラスチックチューブ（ｐａｌｃｏｎ社製Ｎ。
２０７０）に入れ、液体窒素中で凍結した。２０−のチ
オシアン酸グアニジン溶液（４Ｍチオシアン酸グアニジ
ン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．
５％ラウリルザルコシンナトリウム、Ｏ，１％アンチフ
オームＡ、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）を加え
、ポＩＪ ）ロン（セントラル科学貿易）を用いて細胞
破砕した後、１８Ｇの注射針を付けた１０１ｎｆ！シリ
ンジ（テルモ社製）で破砕液を数回出し入れした。低速
遠心分離（３００Ｘｇ、５分）により沈渣を除き、上ｉ
’＃７．：Ｍを３．７−のＣ５ＴＦＡ容器（ファル−ｒ
シフａＬ ０．５ ＭＥＤＴＡヲ含むセシウムトリフ
ルオロ酢酸水溶液、密度を１．６４ｇ／ｍｌに調製）に
重層し、スイングローターＲＰＳ−４０Ｔを用いた超遠
心分離機（日立製作新製、５ＣＰ８５Ｈ） １．：ｍヨ
リ、３３．００Ｏｒｐｍにて１６時間処理した。沈殿を
３ｒｎｆ！の４Ｍグアニシン溶液、次いで３ｍｆ２９５
％エタノールで洗浄した後、↓、 ５ ｍｌ Ｃ５ＴＦ
Ａ溶液に溶解した。６０ｔ１１の５ＭＮａ１Ｊ溶液、３
．９−のエタノールを加え、−８０℃にて３０分間エタ
ノール沈殿をおこない、１６．０００Ｘｇで１５分間の
遠心分離を行って沈殿を得、７０％エタノールで洗浄後
、コンセントレータ−（サクマ製作所製、ＥＣ−５７Ｃ
）により乾燥させた。滅菌蒸留水に溶解後、２６０７ｍ
の吸光度を測定してＲＮＡ量を定量した。この方法によ
り、ウマ心房組織約２ｇから３５０ｎのＲＮＡを得るこ
とができた。
オシアン酸グアニジン溶液（４Ｍチオシアン酸グアニジ
ン、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．
５％ラウリルザルコシンナトリウム、Ｏ，１％アンチフ
オームＡ、０．１Ｍ２−メルカプトエタノール）を加え
、ポＩＪ ）ロン（セントラル科学貿易）を用いて細胞
破砕した後、１８Ｇの注射針を付けた１０１ｎｆ！シリ
ンジ（テルモ社製）で破砕液を数回出し入れした。低速
遠心分離（３００Ｘｇ、５分）により沈渣を除き、上ｉ
’＃７．：Ｍを３．７−のＣ５ＴＦＡ容器（ファル−ｒ
シフａＬ ０．５ ＭＥＤＴＡヲ含むセシウムトリフ
ルオロ酢酸水溶液、密度を１．６４ｇ／ｍｌに調製）に
重層し、スイングローターＲＰＳ−４０Ｔを用いた超遠
心分離機（日立製作新製、５ＣＰ８５Ｈ） １．：ｍヨ
リ、３３．００Ｏｒｐｍにて１６時間処理した。沈殿を
３ｒｎｆ！の４Ｍグアニシン溶液、次いで３ｍｆ２９５
％エタノールで洗浄した後、↓、 ５ ｍｌ Ｃ５ＴＦ
Ａ溶液に溶解した。６０ｔ１１の５ＭＮａ１Ｊ溶液、３
．９−のエタノールを加え、−８０℃にて３０分間エタ
ノール沈殿をおこない、１６．０００Ｘｇで１５分間の
遠心分離を行って沈殿を得、７０％エタノールで洗浄後
、コンセントレータ−（サクマ製作所製、ＥＣ−５７Ｃ
）により乾燥させた。滅菌蒸留水に溶解後、２６０７ｍ
の吸光度を測定してＲＮＡ量を定量した。この方法によ
り、ウマ心房組織約２ｇから３５０ｎのＲＮＡを得るこ
とができた。
（２）ポリＡ”ＲＮＡの調製
全ＲＮＡからのポリＡ”ＲＮＡの調製は、ｒｍＲＮＡ精
製キット」（ファルマシア社製）を用い、その添付プロ
トコールに従っておこなった。オリゴ（ｄＴ）カラムに
よりアフィニティークロマトグラフィーは２回おこない
、３５０４のウマ心房全ＲＮＡより１３ｆｆのポリＡ”
ＲＮＡを得た。
製キット」（ファルマシア社製）を用い、その添付プロ
トコールに従っておこなった。オリゴ（ｄＴ）カラムに
よりアフィニティークロマトグラフィーは２回おこない
、３５０４のウマ心房全ＲＮＡより１３ｆｆのポリＡ”
ＲＮＡを得た。
ｒｃＤＮＡ合ｔンステムプラス」（アマジャム社製、Ｒ
ＰＮ１２５６Ｙ）を用い、ウマ心房ポリ＾＋ＲＮＡ５ｆ
ｆを使用することによりｃＤＮ八合へ合成こなった。合
成手順は、添付プロトコールに忠実に従った。ブライマ
ーとしてオリゴｄＴヌクレオチドを用い、〔α−”Ｐ：
］−ｄＣＴＰを含んだ合成糸にて放射活性よりｃＤ’Ｎ
Ａ合或効率合計効率たところ、逆転写効率が約２０％で
セカンドストランド合成効率は９０％以上であった。
ＰＮ１２５６Ｙ）を用い、ウマ心房ポリ＾＋ＲＮＡ５ｆ
ｆを使用することによりｃＤＮ八合へ合成こなった。合
成手順は、添付プロトコールに忠実に従った。ブライマ
ーとしてオリゴｄＴヌクレオチドを用い、〔α−”Ｐ：
］−ｄＣＴＰを含んだ合成糸にて放射活性よりｃＤ’Ｎ
Ａ合或効率合計効率たところ、逆転写効率が約２０％で
セカンドストランド合成効率は９０％以上であった。
（２）ｃＤＮＡライブラリーの作製
ファージＤＮＡへの連結については、ｒｃＤＮＡクロー
ニングシステムλｇｔｌＱ、 ｖｅｒｓｉｏｎ２． Ｏ
Ｊ （アマジャム＞［、ＲＰＮ１２５７＞ 、ファー
ジへのパッケージングについては、「ギガバック；コー
ルド」（ストラタジーン社製）を用い、これらの添付プ
ロトコールに従って、合１ｃＤＮＡよりｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。
ニングシステムλｇｔｌＱ、 ｖｅｒｓｉｏｎ２． Ｏ
Ｊ （アマジャム＞［、ＲＰＮ１２５７＞ 、ファー
ジへのパッケージングについては、「ギガバック；コー
ルド」（ストラタジーン社製）を用い、これらの添付プ
ロトコールに従って、合１ｃＤＮＡよりｃＤＮＡライブ
ラリーを作製した。
（３）大腸菌の感染
宿主菌としては、大腸菌Ｙ１０８９ （ＡＴＣＣ３７１
９６）を使用し、コンピテント細胞は次のように調製し
た。
９６）を使用し、コンピテント細胞は次のように調製し
た。
シングルコロニーの細胞を、０．２％マルトースを加え
たＮＺＹ培地（０，５％ＮａＣｆ、１％ＮＺ７ミン、タ
イプＡ（和光純薬〉０．５％酵母エキス（Ｄ＋ＦＣＯ）
、０．２％硫酸マグネシウム、ｐＨ７，５）５−に接
種し、−夜３７℃で振とう培養した。１００ＩＬ’を新
鮮な同じ培地５ｒｎｌに植えつぎ、３７℃で０Ｄ６６゜
＝０．５となるまで培養した後、遠心分離により集菌し
た。１ｒｎ！！、の１０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液に懸
濁してコンピテント細胞とした。
たＮＺＹ培地（０，５％ＮａＣｆ、１％ＮＺ７ミン、タ
イプＡ（和光純薬〉０．５％酵母エキス（Ｄ＋ＦＣＯ）
、０．２％硫酸マグネシウム、ｐＨ７，５）５−に接
種し、−夜３７℃で振とう培養した。１００ＩＬ’を新
鮮な同じ培地５ｒｎｌに植えつぎ、３７℃で０Ｄ６６゜
＝０．５となるまで培養した後、遠心分離により集菌し
た。１ｒｎ！！、の１０ｍＭ硫酸マグネシウム溶液に懸
濁してコンピテント細胞とした。
コンピテント細胞懸濁波０゜２−に、（２）で調製した
ファージ溶液Ｑ、１ｒｎｌを加え、５６℃に１呆温した
ト・ンプアガロース（０，７％タイプＩ −ＬｏｗＥ巳
０アガロース（シグマ社製）を含むＮＺＹ培地）３−と
混和後、ＮＺＹアガーブレー）（１，５％ノイクトアガ
ー（ＤＩＦＣＯ社製）を含むＮＺＹ培地３０−をＦａｌ
ｃｏｎ社製１００５プレートに添加）の上部に流し込ん
だ。トップアガロースの固化後、３７℃で一夜静置培養
した。プラークを確認することによりファージ感染細胞
を確認した。
ファージ溶液Ｑ、１ｒｎｌを加え、５６℃に１呆温した
ト・ンプアガロース（０，７％タイプＩ −ＬｏｗＥ巳
０アガロース（シグマ社製）を含むＮＺＹ培地）３−と
混和後、ＮＺＹアガーブレー）（１，５％ノイクトアガ
ー（ＤＩＦＣＯ社製）を含むＮＺＹ培地３０−をＦａｌ
ｃｏｎ社製１００５プレートに添加）の上部に流し込ん
だ。トップアガロースの固化後、３７℃で一夜静置培養
した。プラークを確認することによりファージ感染細胞
を確認した。
以上の方法により、２゜０ＸＩＯ７個のウマ心房ｃＤＮ
パライブラリ−を作製することができた。
パライブラリ−を作製することができた。
例３．Ｃ末端アミド化酵素ｃＤＮＡの単離ラット由来の
ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡは既に単離され、
その塩基配列は報告されている（Ｄ、＾、５ｏｆｆｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、［ｌＳＡ
、 ８６゜７３５−７３９ （１９８９） 、加藤ら
、生化学、６１．８４２（１９８９））。
ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡは既に単離され、
その塩基配列は報告されている（Ｄ、＾、５ｏｆｆｅｒ
ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、［ｌＳＡ
、 ８６゜７３５−７３９ （１９８９） 、加藤ら
、生化学、６１．８４２（１９８９））。
ラットｃＤＮ＾とウマ由来のペプチドＣ末端アミド化酵
素ｃＤＮＡは、ある程度相同性があると考え、ラットＣ
ＤＮＡの一部を人手し、これをプローブとしてウマｃＤ
ＮＡの単離を進めた。ラッ） ｃＤＮＡは、東北大学医
学部（加藤ら、生化学、６１．８４２（１９８９））よ
り、分与を受け、これを制限酵素ＥｃｏＲＩと旧ｎｃ■
ならびにＮ５ｉＩとＳｐｈ Ｉで消化し、それぞれ第２
図および第３図に示したＤＮＡ断片を単離し、マルチプ
ライムＤＮＡ標識キット （アマジャム社製）により３
２ｐラベルしてプローブとした。
素ｃＤＮＡは、ある程度相同性があると考え、ラットＣ
ＤＮＡの一部を人手し、これをプローブとしてウマｃＤ
ＮＡの単離を進めた。ラッ） ｃＤＮＡは、東北大学医
学部（加藤ら、生化学、６１．８４２（１９８９））よ
り、分与を受け、これを制限酵素ＥｃｏＲＩと旧ｎｃ■
ならびにＮ５ｉＩとＳｐｈ Ｉで消化し、それぞれ第２
図および第３図に示したＤＮＡ断片を単離し、マルチプ
ライムＤＮＡ標識キット （アマジャム社製）により３
２ｐラベルしてプローブとした。
（２）プラークハイブリダイゼーション実施例２ （３
）大腸菌の感染に示した方法に従って、直径１５ｃｍの
プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、Ｎｏ、１０５８）１枚に
つき約５０万個のプラークを形成させた。このとき、プ
ラーク形成のための培養は、３７℃４時間でおこなった
。プレートを４℃２時間放置した後、ニトロセルｏ−ス
フ イ／’ター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆５ｃｈｕｅ
ｌ１社製、ＢＡ８５）を接着し、ファージＤＮＡをフィ
ルターに移行した後、アルカリ溶液（０，５Ｍ苛性ソー
ダ、１．５ Ｍ塩化ナトリウム）中でＤＮＡを変性させ
た。中和液（１，５Ｍ食塩、０．５ Ｍ ）リス塩酸緩
衝液、ｐＨ７，０）で中和後、２ Ｘ５ＳＣ溶液（０，
３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ７，０）ですすぎ、風乾後に減圧下８０℃２時間
加熱し、次いでフィルターにＤＮＡを固定した。
）大腸菌の感染に示した方法に従って、直径１５ｃｍの
プレート（ＦＡＬＣＯＮ社製、Ｎｏ、１０５８）１枚に
つき約５０万個のプラークを形成させた。このとき、プ
ラーク形成のための培養は、３７℃４時間でおこなった
。プレートを４℃２時間放置した後、ニトロセルｏ−ス
フ イ／’ター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆５ｃｈｕｅ
ｌ１社製、ＢＡ８５）を接着し、ファージＤＮＡをフィ
ルターに移行した後、アルカリ溶液（０，５Ｍ苛性ソー
ダ、１．５ Ｍ塩化ナトリウム）中でＤＮＡを変性させ
た。中和液（１，５Ｍ食塩、０．５ Ｍ ）リス塩酸緩
衝液、ｐＨ７，０）で中和後、２ Ｘ５ＳＣ溶液（０，
３Ｍ塩化ナトリウム、３０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝
液ｐＨ７，０）ですすぎ、風乾後に減圧下８０℃２時間
加熱し、次いでフィルターにＤＮＡを固定した。
ファージＤＮＡを固定したニトロセルロースフィルター
に、（１）で調製したプローブを用いてプラークハイブ
リダイゼーションをおこなった。
に、（１）で調製したプローブを用いてプラークハイブ
リダイゼーションをおこなった。
フィルターをラッピーバッグ（イワタニ製）に入れ、３
０ｍ１のプレハイブリダイゼーション液（０，７５Ｍ塩
化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
１，４，５ｒｎＭＥＤＴＡ、 ０．０５％フィコール、
０．０５％ポリビニルピロリドン、０．０５％ウシ血清
アルブミン（シグマ社製フラクションＶ）、０．１％Ｓ
ＤＳ。
０ｍ１のプレハイブリダイゼーション液（０，７５Ｍ塩
化ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ
１，４，５ｒｎＭＥＤＴＡ、 ０．０５％フィコール、
０．０５％ポリビニルピロリドン、０．０５％ウシ血清
アルブミン（シグマ社製フラクションＶ）、０．１％Ｓ
ＤＳ。
０．２ｍｇ／ｍ！サケ精子ＤＮＡ）を加え、シーラーで
密封し、次いで６５℃４時間加温した。ブレノ＼イブリ
ダイゼーション蔽を捨て、約１０００万ｃｐｍの放射活
性を持つプローブを含む３０−のハイブリダイゼーショ
ン液（０，７５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ’Ｊン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７，４，５ｍＭＥＤＴＡ、 ０．
０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、
０．０２％ウシ血膚アルブミン、０．１％ＳＤＳ、０．
１ｍｇ／−サケ精子ＤＮＡ）を加え、密封後、６５℃で
１５時間ハイブリダイゼーションをおこなった。フィル
ターを２５０ｍｊ’の洗浄液＜０．３Ｍ塩化ナトリウム
、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４，２ｍ
ＭＩＥＤＴ＾、０．１％５ＤＳ）で２回洗浄し、さらに
、２５０ｍｊ！の洗浄液（３０ｄ塩化ナトリウム、２ｍ
Ｍ＋Ｊン酸ナトリタナトリウム緩衝液ｐＨ７，２ｍＭＥ
ＤＴＡ、 ０．１％５ＤＳ）で２回洗浄し風乾した。ポ
ジティブクローンの検出は、Ｘ線フィルム（フジ、ＨＲ
−Ｈ）を用いて一８０℃−昼夜露光する条件下でのオー
トラジオグラフィーによりおこなった。
密封し、次いで６５℃４時間加温した。ブレノ＼イブリ
ダイゼーション蔽を捨て、約１０００万ｃｐｍの放射活
性を持つプローブを含む３０−のハイブリダイゼーショ
ン液（０，７５Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ’Ｊン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７，４，５ｍＭＥＤＴＡ、 ０．
０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、
０．０２％ウシ血膚アルブミン、０．１％ＳＤＳ、０．
１ｍｇ／−サケ精子ＤＮＡ）を加え、密封後、６５℃で
１５時間ハイブリダイゼーションをおこなった。フィル
ターを２５０ｍｊ’の洗浄液＜０．３Ｍ塩化ナトリウム
、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７，４，２ｍ
ＭＩＥＤＴ＾、０．１％５ＤＳ）で２回洗浄し、さらに
、２５０ｍｊ！の洗浄液（３０ｄ塩化ナトリウム、２ｍ
Ｍ＋Ｊン酸ナトリタナトリウム緩衝液ｐＨ７，２ｍＭＥ
ＤＴＡ、 ０．１％５ＤＳ）で２回洗浄し風乾した。ポ
ジティブクローンの検出は、Ｘ線フィルム（フジ、ＨＲ
−Ｈ）を用いて一８０℃−昼夜露光する条件下でのオー
トラジオグラフィーによりおこなった。
用いた２つのプローブについて、それぞれ２００万プラ
ークをスクリーニングしたところ、１０００個程度０ポ
ジティブクローンが得られた。ポジティブプラークより
ファージＤＮＡを回収し、再度、上記方法に従って大＃
Ｊ菌に感染させ、プラークハイブリダイゼーションを再
度おこない、この操作をプラークが単一になるまでくり
返した。通常、２回くり返すことにより単一プラークが
得られる。
ークをスクリーニングしたところ、１０００個程度０ポ
ジティブクローンが得られた。ポジティブプラークより
ファージＤＮＡを回収し、再度、上記方法に従って大＃
Ｊ菌に感染させ、プラークハイブリダイゼーションを再
度おこない、この操作をプラークが単一になるまでくり
返した。通常、２回くり返すことにより単一プラークが
得られる。
Ｍａｎｉａｔｉｓ、 Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、 Ｊ、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ ｆ（ａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 １９８２）、 ３７
１〜３７２ページ記載の方法に従い、クローニングした
ファージよりＤＮＡを分離精製した。制限酵素εｃｏＲ
ｒ（宝酒造製）によりＤＮＡを消化し、１．５％アガロ
ースゲル電気泳動によりファージＤＮＡからｃＤＮＡ挿
入ＤＮＡ断片を分離した。ＣＤＮＡ断片をゲルより抽出
し、大腸菌プラスミドｐＵｃ１１９ （宝酒造製）の巳
ｃｏＲ１部位に、ライゲーション反応により組み込んだ
。ｃＤＮＡ断片中にＥＣＯＲＩ切断部位が存在する場合
には、ファージＤＮＡをＥＣＯＲＩで部分消化すること
によりｃＤＮＡ断片を得た。プラスミドを増幅後、ｃＤ
Ｎ＾ＤＮＡＭ１３７７−ジｍｐ１３、ｍｐ１９ （宝酒
造製）にサブクローニングし、常法に従い一本鎖ＤＮＡ
を得た。５ｅｑｕｅｎａｓｅ （商品名、東洋紡績■製
）を用い、その使用説明書に従ってＤＮＡ塩基配列の決
定をおこなった。−本のＤ Ｎ Ａ 鎮の塩基配列決定
は約４００ベースとし、それを越える長さのＤＮＡ断片
については、適当な制限酵素部位を用いてサブクローニ
ングすることにより配列決定をおこなった。また、ｃＤ
ＮＡ断片は、２本鎖の両方鎖とも塩基配列を決定した。
Ｓａｍｂｒｏｏｋ編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ ｆ（ａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 １９８２）、 ３７
１〜３７２ページ記載の方法に従い、クローニングした
ファージよりＤＮＡを分離精製した。制限酵素εｃｏＲ
ｒ（宝酒造製）によりＤＮＡを消化し、１．５％アガロ
ースゲル電気泳動によりファージＤＮＡからｃＤＮＡ挿
入ＤＮＡ断片を分離した。ＣＤＮＡ断片をゲルより抽出
し、大腸菌プラスミドｐＵｃ１１９ （宝酒造製）の巳
ｃｏＲ１部位に、ライゲーション反応により組み込んだ
。ｃＤＮＡ断片中にＥＣＯＲＩ切断部位が存在する場合
には、ファージＤＮＡをＥＣＯＲＩで部分消化すること
によりｃＤＮＡ断片を得た。プラスミドを増幅後、ｃＤ
Ｎ＾ＤＮＡＭ１３７７−ジｍｐ１３、ｍｐ１９ （宝酒
造製）にサブクローニングし、常法に従い一本鎖ＤＮＡ
を得た。５ｅｑｕｅｎａｓｅ （商品名、東洋紡績■製
）を用い、その使用説明書に従ってＤＮＡ塩基配列の決
定をおこなった。−本のＤ Ｎ Ａ 鎮の塩基配列決定
は約４００ベースとし、それを越える長さのＤＮＡ断片
については、適当な制限酵素部位を用いてサブクローニ
ングすることにより配列決定をおこなった。また、ｃＤ
ＮＡ断片は、２本鎖の両方鎖とも塩基配列を決定した。
第１図に決定したウマＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ塩基
配列（この塩基配列は多くのｃＤＮＡの解析の結果、最
も長いｃＤＮＡクローンについて示す）及びこの塩基配
列から予想されるアミノ酸配列（１文字表示）を示した
。図中の〔〕で示した部分の一方または両方が欠落した
ＣＤＮＡも確認できた。これらのＣＤＮＡは、ｍＲＮＡ
スプライシングの様式の異なるｍＲＮＡに由来するもの
と考えている。
配列（この塩基配列は多くのｃＤＮＡの解析の結果、最
も長いｃＤＮＡクローンについて示す）及びこの塩基配
列から予想されるアミノ酸配列（１文字表示）を示した
。図中の〔〕で示した部分の一方または両方が欠落した
ＣＤＮＡも確認できた。これらのＣＤＮＡは、ｍＲＮＡ
スプライシングの様式の異なるｍＲＮＡに由来するもの
と考えている。
本発明によれば、上記のようにウマ心房よりペプチドＣ
末端アミド化酵素活性を有するポリペプチドをコードし
たｃＤＮＡが少なくとも提供される。
末端アミド化酵素活性を有するポリペプチドをコードし
たｃＤＮＡが少なくとも提供される。
本発明によるｃＤＮＡを用いれば、大腸菌、枯草菌、酵
母、動物培養細胞等でウマＣ末端アミド化酵素を大量に
発現することができる。
母、動物培養細胞等でウマＣ末端アミド化酵素を大量に
発現することができる。
第１図は、単離したウマ由来のペプチドＣ末端アミド化
酵素活性を有するポリペプチドをコードしたｃＤＮＡの
中で、最も長いｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコ
ードされるアミノ酸配列を一文字表示で図示したもので
あり、そして 第２図および第３図は、それぞれ異なる制限酵素で消化
し、プローブとして使用したラット由来のペプチドＣ末
端アミド化酵素をコードするｃＤＮＡの一部の塩基配列
を図示するものである。
酵素活性を有するポリペプチドをコードしたｃＤＮＡの
中で、最も長いｃＤＮＡ断片の塩基配列およびそれにコ
ードされるアミノ酸配列を一文字表示で図示したもので
あり、そして 第２図および第３図は、それぞれ異なる制限酵素で消化
し、プローブとして使用したラット由来のペプチドＣ末
端アミド化酵素をコードするｃＤＮＡの一部の塩基配列
を図示するものである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ウマ由来のペプチドＣ末端アミド化酵素活性を有す
るポリペプチドをコードしたＤＮＡ配列２、ポリペプチ
ドが共通する次のアミノ酸配列【遺伝子配列があります
】 を有し、かつ、その下流にそれぞれ次のアミノ酸配列か
ら選ばれる配列を有する請求項１記載のＤＮＡ配列。 【遺伝子配列があります】 および 【遺伝子配列があります】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6330690A JPH03262484A (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6330690A JPH03262484A (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03262484A true JPH03262484A (ja) | 1991-11-22 |
Family
ID=13225477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6330690A Pending JPH03262484A (ja) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH03262484A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03277285A (ja) * | 1990-03-26 | 1991-12-09 | Shiseido Co Ltd | ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ |
| US5871995A (en) * | 1989-08-15 | 1999-02-16 | Shiseido Company, Ltd. | Purified enzymes participating in C-terminal amidation |
-
1990
- 1990-03-14 JP JP6330690A patent/JPH03262484A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5871995A (en) * | 1989-08-15 | 1999-02-16 | Shiseido Company, Ltd. | Purified enzymes participating in C-terminal amidation |
| US6156555A (en) * | 1989-08-15 | 2000-12-05 | Shiseido Company Ltd. | Method of preparing an enzyme participating in C-terminal amidation |
| JPH03277285A (ja) * | 1990-03-26 | 1991-12-09 | Shiseido Co Ltd | ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ |
| JPH0722511B2 (ja) * | 1990-03-26 | 1995-03-15 | 株式会社資生堂 | ペプチドＣ末端アミド化酵素ｃＤＮＡ |
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