JPH09173087A

JPH09173087A - Ａｔｐおよび核酸に結合し、ヘリカーゼおよびａｔｐアーゼの性質を有すると推定される蛋白質

Info

Publication number: JPH09173087A
Application number: JP8336280A
Authority: JP
Inventors: Bernd Dr Kirschbaum; ベルント・キルシユバウム; Stefan Dr Muellner; シユテフアン・ミユルナー; Robert Bartlett; ロバート・バートレツト
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1995-12-04
Filing date: 1996-12-03
Publication date: 1997-07-08
Also published as: US5942429A; US6403299B1; DK0778347T3; PT778347E; DE19545126A1; AU719576B2; EP0778347A3; EP0778347A2; AU7407696A; ATE327334T1; US6251645B1; CA2191827C; CA2191827A1; DE59611349D1; MX9606065A; EP0778347B1; ES2264132T3

Abstract

(57)【要約】【課題】核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡ
ＴＰアーゼの性質を有し、レフルノミドの影響下でその
ｍＲＮＡおよびその翻訳産物が増大した程度まで発現す
る蛋白質に対する遺伝子を含むＤＮＡの提供。【解決手段】このＤＮＡは（ａ）表２に表されるＤＮＡ配列を含み、（ｂ）表
３に表されるＤＮＡ配列を含み、（ｃ）（ａ）または
（ｂ）に表されるＤＮＡ分子とストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし得るＤＮＡ配列を含み、または、
（ｄ）遺伝子コードの縮合を考えると（ａ）、（ｂ）
または（ｃ）に表されるＤＮＡ分子とは異なるが、
（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に表されるＤＮＡ分子によ
り対応して発現される蛋白質の発現を可能にするＤＮＡ
配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＡＴＰおよび核酸に結合し、ヘ
リカーゼ(helicase)およびＡＴＰアーゼ(ATPase)の性質
を有すると推定される蛋白質の同定並びに分子生物学的
および生化学的性状決定に関し、その調製方法および薬
理学的に関連する試験系における使用に関する。

【０００２】ＲＮＡの構造の調節は、例えば、前ｍＲＮ
Ａのスプライシング、スプライセオームの集合、リボソ
ームの集合、蛋白質の翻訳といった多くの細胞の現象に
おける本質的な調節過程であり、一般的な表現では「Ｒ
ＮＡレベルにおける遺伝子発現の調節」として要約する
ことができる。ＲＮＡヘリカーゼと推定される、いわゆ
る「ＤＥＡＤボックス」蛋白質ファミリーは特徴的なア
ミノ酸モチーフであるＡｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ
（一文字表記ではＤＥＡＤ）に因んで命名されたが、こ
の文脈において、（特にｍＲＮＡの二次および三次元構
造の調節に対し）重要な役割を果たす。このファミリー
やサブファミリーに属する各蛋白質は、その特異的な機
能と細胞内の局在において相違するが、それに加えて、
それぞれが類似した生化学的な性質を示すところの特徴
的な配列相同性を有する（F. V.Fuller-Pace, Trends i
n Cell Biology，Vol.4, 1994, 271-274)。ＤＥＡＤ蛋
白質の特徴的な蛋白質配列は進化の過程において高度に
保存されてきた（S.R. Schmid and P. Lindner, Molecu
lar and Cellular Biology, Vol.11, 1991, 3463-347
1)。この蛋白質ファミリーの各蛋白質は、様々なウィル
ス、バクテリア、酵母、昆虫、軟体動物、下級脊椎動物
から哺乳動物に至るまで見いだされており、おびただし
い数の細胞機能を担っている。例えば、酵母サカロミセ
ス・セルビシエのような比較的単純な生物でさえＤＥＡ
Ｄボックス蛋白質ファミリーおよびそのサブファミリー
に属する多くの蛋白質を発現するという事実は、これら
の蛋白質の各々が特定のＲＮＡ群やＲＮＡファミリーの
特異的な相互作用に貢献していることが考えられるとの
事実を示している（I. lost and M. Dreyfus, Nature V
ol. 372, 1994, 193-196)。例えば、ｅｌＦ−４Ａのよ
うな翻訳因子と前−ｍＲＮＡスプライシング過程に関与
する蛋白質が、特異的なＲＮＡ標的配列と構造を認識す
ることが判明してきた。にもかかわらず、現在のとこ
ろ、認識やＡＴＰアーゼ／ＲＮＡヘリカーゼ反応にＤＥ
ＡＤ蛋白質を必要とする特徴的なＲＮＡ配列の構造と合
成に関する情報は、ほんの僅かしかない（A. Pause and
N. Sonenberg,Current Opinion in Structural Biolog
y Vol.3, 1993, 953-959)。

【０００３】ＤＥＡＤボックス蛋白質ファミリーは、現
在も連続して数が増え続け、遺伝子発現の転写後の調節
のための様々な反応に関与する酵素のクラスである。極
めて多くの異なった細胞ＤＥＡＤボックス蛋白質がある
ために、特異的なＲＮＡヘリカーゼが、例えば、ウィル
ス蛋白質、熱ショック蛋白質、抗体やＭＨＣ蛋白質、レ
セプター、ＲＮＡ等の特定のクラスの遺伝子産物に指定
されていることが期待される。この事実は、この蛋白質
ファミリーに属する各蛋白質が、活性化合物を開発する
上での興味ある薬理学的標的であることを支持してい
る。

【０００４】ＤＥＡＤボックス蛋白質の二つのサブクラ
スは、ＤＥＡＨ（一つの特異的なアミノ酸置換を有す
る）およびＤＥＸＨ蛋白質（主要モチーフにおいて二つ
のアミノ酸置換を有し、Ｘは任意の所望アミノ酸たり得
る）ファミリーであり、これらも、ＤＮＡおよびアミノ
酸ゲノムの複製、再結合、修復および発現に重要な役割
を果たす（Gorbalenya, A. E., Koonin, E. V., Dochen
ko, A. P., Blinov, V.M., 1989：Nucleic Acids Res.
17, 4713-4729)。

【０００５】ＤＥＡＤボックス蛋白質およびそのサブフ
ァミリーは、しばしば、ヘリカーゼ・スーパーファミリ
ーIIとして要約される（Koonin, E. V., Gorbalenya,
A. E., 1992：FEBS 289, 6-8)。それらはすべて７つの
高度に保存された領域に分割される。概して、現在ま
で、７０以上の蛋白質が、この連続して増え続けている
スーパー・ファミリーIIに属している。ＤＥＡＤ、ＤＥ
ＡＨおよびＤＥＸＨファミリーを模式的に図示すると
（Schmid, S. R., Lindner P., 1991：Molecular andCe
llular Biology 11, 3463-3471)、これらのファミリー
間の類似性が示される（これら領域間の数字はアミノ酸
（ＡＡ）の距離を示している。Ｘは任意の所望のアミノ
酸である。機能が知られている場合は、その領域に付し
てある）。

【０００６】

【化１】

【０００７】ＡＴＰアーゼ・モチーフ（ＡＸＸＸＸＧＫ
Ｔ）は、アミノ末端に保存されている領域であり、ヌク
レオチドに結合する多くの蛋白質や、ＤＮＡＢ（プリモ
ゾームの一部）、ＵｖｒＤ（エンドヌクレアーゼ）、伸
長因子１および転写終結因子ＲｈｏのようなＤＮＡおよ
びＲＮＡと相互作用する他の蛋白質にも生じる（FordM.
J., Anton, I. A. Lane, D. P., 1988：Nature 332, 7
36-738)。

【０００８】２番目の保存領域はいわゆるＤＥＡＤボッ
クスであり、ヘリカーゼや核酸依存性ＡＴＰアーゼの他
のファミリーにおける、ＤＥＡＨ、ＤＥＸＨまたはＤＥ
ＸＸである。この領域はＡＴＰアーゼＢモチーフを現し
ている。反応メカニズムにおいて、最初のアスパラギン
酸は水分子を介してＭｇ²⁺に結合する（Pai, E. F.,Kre
ngel, U., Petsko, G. A., Gody, R. S., Katsch, W.,
Wittinghofer, A., 1990：EMBO J. 9, 2351-2359)。Ｍ
ｇ²⁺は、次いで、そのヌクレオチドβ−およびγ−りん
酸と複合体を構成し、ＡＴＰアーゼ活性の発現に必須で
ある。ｅｌＦ−４ＡのＤＥＡＥ領域の最初の二つのラジ
カルの置換は、ＡＴＰの加水分解とＲＮＡヘリカーゼ活
性を阻害するが、ＡＴＰの結合は阻害しない（Pause,
A., Sonenberg, N., 1992：EMBO J. 11, 2643-2654)。
ＤＥＡＤ領域は、ＲＮＡヘリカーゼ活性をＡＴＰアーゼ
活性と結びつける。

【０００９】調べられた３番目の領域はＳＡＴ領域（Ｔ
ＡＴとすることもある）である。この領域の突然変異の
結果、ＲＮＡヘリカーゼ活性は抑制されているが、他の
生化学的性質は保持されている(Pause A. & Sonenberg
N., 1992)。それ以降のカルボキシ末端領域はＨＲＩＧ
ＲＸＸＲ領域であり、ＲＮＡの結合とＡＴＰの加水分解
に必要である。

【００１０】上記に記載した関係より、特異的なＲＮＡ
ヘリカーゼは薬理学的活性を有する化合物として魅力あ
る標的であることが分かる。すでに知られているよう
に、例えば、ヒトや動物、植物に疾病を起こし得る特定
の病因ウィルスにおいては、そのゲノムにおいてそれら
ウィルスが、正確な複製に必要である自分自身のＲＮＡ
ヘリカーゼを所持しているので（E. V. Koonin, 199
1）、植物の保護における使用が示唆されている（F. V.
Fuller-Pace, Trends in Cell Biology, Vol. 4, 199
4, 271-274)。

【００１１】イソキサゾール誘導体であるレフルノミド
は、免疫系に存在する機能の損傷を引き起こすことな
く、抗炎症および免疫抑制の性質を示す（HWA 486：R.
R. Bartlett, G. Campion, P. Musikic, T. Zielinski,
H. U. Schorlemmer in：A. L.Lewis and D. E. Furst
(editors), Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs, M
echanisms and Clinical Uses；C. C. A. Kuechle, G.
H. Thoenes, K. H. Langer, H. U. Schorlemmer, R. R.
Bartlett, R. Schleyerbach, Transplant Proc.1991,
23：1083-6；T. Zielinski, H. J. Mueller, R. R. Bar
tlett, Agents Action 1993, 38：C80-2)。細胞の活性
化、幼若化、分化および細胞協働のような多くの活性
は、自己免疫疾患において観察されるが、レフルノミド
やその活性代謝物、Ａ７７１７２６により調節され
る。

【００１２】

【化２】

【００１３】その活性化合物の作用の分子メカニズムの
研究は、ピリミジン代謝の影響を示している。レフルノ
ミドは極めて迅速にＡ７７１７２６体に変換されるの
で、両者の名前は本出願人においては相互に同意語とし
て用いられる。このように、例えば、「レフルノミド抵
抗性」と「Ａ７７１７２６抵抗性」はその意義におい
て同一である。

【００１４】ピリミジンとプリン・ヌクレオチドは生物
学的過程において重要な役割を果たす。ＤＮＡおよびＲ
ＮＡの構造単位として、これらは遺伝子情報の担い手と
なる。ピリミジンの生合成は、ジヒドロオロチン酸エス
テル(dihydroorotate)からオロチン酸エステル(orotat
e)への不可逆的な酸化からなるが、これは酵素ジヒドロ
オロテートデヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）により触媒
される。概して、６つの酵素がウリジン・一りん酸（Ｕ
ＭＰ）のde novo合成に必要とされている。ＵＭＰは、
他のピリミジン、すなわち、シチジンとチミジンの合成
に中心的な役割を果たす。このようにＤＨＯＤＨの阻害
はピリミジンのde novo合成の阻害につながる。特に影
響を受けるのは免疫細胞であり、これらはヌクレオチド
に対する要求性が極めて高いが、副ルート（サルベージ
回路）によってはこのde novo合成は僅かにカバーされ
るだけである。放射能標識したフルノミド類縁体を用い
結合を調べる研究により、酵素ＤＨＯＤＨのＡ７７１
７２６が作用すると考えられる位置が同定され、故に、
レフルノミドによるＤＨＯＤＨの阻害は、観察される免
疫調節活性の解明の重要な出発点である。

【００１５】レフルノミドが作用する、それ以外の潜在
的な細胞内の部位を同定するために、レフルノミド抵抗
性の細胞株が開発されてきた（実施例１を参照）。この
抵抗性は、極めて幼若化された細胞株Ａ２０.２Ｊ（マ
ウスＢ細胞リンフォーマ）において、Ａ７７１７２６
に対し誘導されてきた。この物質の濃度は無血清培養系
においてステップ・ワイズに増加され、最終的にＡ２０
Ｒと命名された安定なサブラインの確立につながった。
Ａ２０Ｒ細胞株は、元の細胞株Ａ２０.２Ｊよりも３０
〜４０倍高い濃度のレフルノミドに対し寛容であった
（ＥＤ₅₀ ４μMに比較してＥＤ₅₀ １３０μM）。

【００１６】今では驚くべきことに、白血球細胞株を、
高いがしかし毒性を示さない濃度の抗幼若化化合物レフ
ルノミドで処理することにより、従来知られていなかっ
た推定上のＲＮＡヘリカーゼの発現が刺激され、これに
より細胞が、物質の効果にもかかわらず、おそらくは存
在する転写物を効率的に使用することにより幼若化が可
能になることが見いだされてきている。それ故、本発明
は、後に安定した細胞株において活性化合物に関連する
選択圧によりＤＥＡＨボックス蛋白質として特徴づけら
れる推定上のＲＮＡヘリカーゼを生成し、対応する蛋白
質を同定し、従来使用されておりかつ文献から公知の方
法で蛋白質全体、蛋白質の部分、および、蛋白質分解ま
たはペプチド合成により得られるペプチド配列に対する
モノクローナルおよびポリクローナル抗体を調製し、そ
の機能的酵素に対しての精製工程を実施し、従来使用さ
れておりかつ文献から公知の方法に従いこの蛋白質に対
する遺伝子または遺伝子サブ配列を単離かつクローニン
グし、好適な発現系でその遺伝子または遺伝子のサブ配
列を発現し、ならびに、分子生物学的にかつ生化学的に
そのものを構造的かつ機能的に特徴づけるとの目的を有
していた。

【００１７】この蛋白質および関連するＲＮＡヘリカー
ゼを供給することにより、新規な、抗発癌性、抗アテロ
ーマ性動脈硬化症、免疫抑制、抗炎症、抗ウィルス、抗
菌性および抗バクテリア活性を有する化合物が見いださ
れる。これらは、例えば、アルツハイマー病、癌、リュ
ーマチ、関節炎、アテローマ性動脈硬化症、骨多孔症、
急性および慢性感染症、自己免疫性疾患、糖尿病および
組織移植後の後遺症のような疾患に罹った宿主全体の効
率的な治療に対し緊急に必要とされている。

【００１８】この発明の一つの目的は、従って、核酸に
結合し推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を
有し、そのｍＲＮＡはレフルノミドまたは類似の作用を
有する化合物の影響下で発現が増大し、哺乳動物細胞
株、好適には特にヒト細胞株またはマウス細胞株Ａ２
０.２Ｊの誘導体に由来し、特に好適には表２または表
３のアミノ酸配列またはその部分を含む蛋白質である。

【００１９】本発明の別の主題は、核酸に結合し推定上
のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質
またはその一部をコードし、特に表２のＤＮＡ配列を有
するＤＮＡである。この発明の主題は、さらに、ストリ
ンジェントな条件下、特に６８℃で、エキイプレスＨｙ
ｂ溶液（クローンテック）中にて表２のＤＮＡ配列また
はその一部にハイブリダイズＤＮＡである。

【００２０】この発明の別の主題は、前の３個のパラグ
ラフにおいて記載されたＤＮＡ分子の遺伝コードの縮合
のため異なっているが、前の３個のパラグラフにおいて
記載されたＤＮＡ分子を用いての発現に対応するその蛋
白質の発現を可能にするＤＮＡである。

【００２１】さらに、この発明は、核酸に結合し推定上
のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質
をコードするＤＮＡまたはその一部を含み、本発明の別
の主題である好適な宿主細胞で該蛋白質の発現に好適な
ベクターに関する。同様に、本発明は、前述したＤＮＡ
分子より誘導され得るＲＮＡに細胞条件下でハイブリダ
イズするアンチセンスＲＮＡを発現するアンチセンス発
現ベクターに関する。

【００２２】本発明は、さらに、記載されたベクターと
宿主細胞による蛋白質発現および慣用手段を用いてのこ
れに続く蛋白質の単離による、核酸に結合し推定上のヘ
リカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質の調
製方法に関する。

【００２３】この発明は、さらに、アルツハイマー病、
糖、リューマチ、関節炎、アテローマ性動脈硬化症、骨
多孔症、急性および慢性感染症、自己免疫性疾患、糖尿
病および組織移植の後遺症のための、抗発癌性、抗アテ
ローマ性動脈硬化症、免疫抑制、抗ウィルス、抗菌性お
よび抗バクテリア作用に関して新規な物質を見いだし、
または、すでに公知の物質を同定するための試験系また
はアッセイ系における、核酸に結合し推定上のヘリカー
ゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質、特に、遺
伝子操作により調製される蛋白質の使用に関する。

【００２４】該アッセイ系は、ＲＮＡのホメオスタシス
に影響を与え得るＲＮＡまたは蛋白質に結合し得る、核
酸に結合し推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性
質を有する適量の蛋白質が遺伝子操作法で発現され、そ
の得られた蛋白質が結晶化され、その三次元構造が慣用
方法を用いて解明され、それから「分子生物学」の慣用
方法を用いて、そのＡＴＰ結合部位、基質結合部位また
はこれらの機能的なエピトープにおいて、核酸に結合し
推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する
蛋白質と好適に反応する特異的な阻害剤が開発されるよ
うにデザインすることができる。ＲＮＡヘリカーゼ活性
の試験は、合成オリゴリボヌクレオチドがマトリックス
上に固定化され、相補的な標識オリゴリボヌクレオチド
とハイブリダイズされ、その後核酸に結合し推定上のヘ
リカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質が、
そのヘリカーゼ活性の可能な調節因子の存在下または非
存在下で、マトリックスで固定化されていない、一定か
つ測定可能な量の標識オリゴリボヌクレオチドを拡散す
るといった、当業者に知られた方法で行うことができ
る。このようなアッセイはミクロタイタープレート上で
も行うことができ、この手段によれば多くの調節因子の
作用が効率よく試験することができる。

【００２５】核酸に結合し推定上のヘリカーゼおよびＡ
ＴＰアーゼの性質を有する蛋白質の調節因子の他のアッ
セイは、核酸に結合し推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰ
アーゼの性質を有する組換蛋白質の発現により、レフル
ノミド非抵抗性細胞にレフルノミド抵抗性を付与し、そ
れに続きレフルノミド含有培養液中で抵抗性となった細
胞の生存率に対し蛋白質調節因子の効果を測定するもの
である。

【００２６】核酸に結合し推定上のヘリカーゼおよびＡ
ＴＰアーゼの性質を有する蛋白質の調節因子の別のアッ
セイは、核酸に結合し推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰ
アーゼの性質を有する蛋白質のＡＴＰアーゼまたはスプ
ライシングの性質の効果が可能な調節因子により試験さ
れる、ＡＴＰアーゼまたはスプライシングの試験であ
る。

【００２７】この発明の別の主題は、核酸に結合する蛋
白質の、この蛋白質に特異的に結合するＲＮＡの単離と
そのオリゴリボヌクレオチド配列の決定のための使用で
あり、好適には、該蛋白質またはその一部をマトリック
スに連結し、このように調製したアフィニティー・マト
リックスを、ＲＮＡ混合液から、連結した蛋白質または
その一部に特異的に結合するＲＮＡを濃縮するために用
いることによる、特に好適には、さらに追加的に、この
ように濃縮したＲＮＡ分子をＰＣＲリンカーとともに提
供し、ＰＣＲ濃縮を行い、このように得られたＰＣＲ断
片を解析することによる使用である。

【００２８】この発明の別の主題は、核酸に結合し推定
上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白
質をコードする遺伝子の選択マーカーとしての使用であ
り、好適にはベクターの構成成分としての使用である。
この発明のこの主題において使用とは、Ａ２０.２Ｊ細
胞のゲノムＤＮＡと比較してのＡ２０Ｒ細胞のゲノムＤ
ＮＡのサザン・ブロット解析において、核酸に結合し推
定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋
白質をコードする遺伝子が増幅されたとの観察からな
る。レフルノミドまたはレフルノミド類縁体による観察
された遺伝子増幅は、この遺伝子に例示されるように、
なかんづく、細胞の選択および遺伝子治療における使用
を見いださなければならない。これらの実施例におい
て、相対的な抵抗性の形成の発現および発現増幅の発現
の両方が何らかの影響を有する。

【００２９】ストリンジェントな条件下でのハイブリダ
イゼーションとは、この出願では、６８℃、エキスプレ
スＨｙｂ溶液（クロンテック）中でのハイブリダイゼー
ションの意味と理解される。これに続く洗浄は、実施例
６に示されたように実施される。

【００３０】好適な宿主細胞に対する発現ベクターは、
好適な宿主細胞で、恒常的にまたは慣習的な方法による
誘導の後に、異種性の遺伝子発現と複製の（いずれも高
い効率での）能力を有するベクターである。アンチセン
ス発現ベクターとは、好適な宿主細胞（上記参照）で、
恒常的または慣習的な方法による誘導の後のいずれかを
問わず、所望のアンチセンスＲＮＡを発現するベクター
である。

【００３１】以下、本発明を図、表および実施例により
詳述するが、本発明はこれらに限定されない。図１：ＳＡＤ−ＰＡＧＥ（１２％アクリルアミド）。左
の３つのゲル・トレースはクマシー・ブルー染色ゲルか
ら、右の３つのゲル・トレースは銀染色したゲルからの
ものである。Ｍ：マーカー（ベーリンガー・マンハイム
社のコンビテック）；Ａ２０.２Ｊ：正常Ａ２０細胞；
Ａ２０Ｒ：１００μMレフルノミドに抵抗性のＡ２０細
胞。クマシー・ブルー染色ゲルにおいて、それぞれのケ
ースで１００μgの蛋白質がゲル・ポケットに供され
た。銀染色したゲルにおいてはそれぞれのケースで５μ
gだった。矢印は、抵抗性Ａ２０細胞において増大され
た程度にまで発現されている蛋白質を表す。

【００３２】図２：ＨＰＬＣによるペプチドの分離。Ｈ
ＰＬＣは、実施例１ｆで示された条件に従い実施され
た。溶出図において実施例１ｇのペプチド１〜６に対応
する６つのピークが連続的に番号が付されている。波長
２０６nmにおける相対的な吸収単位はＹ軸に示され、分
単位の時間がＸ軸に示されている。

【００３３】図３：レフルノミド−抵抗性Ａ２０Ｒ細胞
に比較して正常Ａ２０.２Ｊ細胞におけるレフルノミド
影響下での推定上ＲＮＡヘリカーゼの発現の経時変化。
ハイブリダイゼーションは放射能標識されたＤＮＡプロ
ーブＡ２０−５／−６ｂを用いて実施され、その配列は
推定上のＲＮＡヘリカーゼのＤＥＡＨサブファミリーの
ＤＥＡＤボックス蛋白質の保存領域を含んでいた。使用
された分子量マーカーは、ベーリンガー・マンハイム社
からのＲＮＡ鎖長スタンダードＩだった。１番目のトラ
ックにはＡ２０Ｒの完全ＲＮＡ、２番目のトラックには
Ａ２０.２Ｊの完全ＲＮＡが供されたが、いずれもＡ７
７１７２６で対応する細胞を処理しなかった。３番目
から６番目のトラックには、５μMのＡ７７１７２６を
用い、様々な長さで対応する細胞をインキュベートした
（１時間、８時間、１６時間、２４時間）、Ａ２０.２
Ｊの完全ＲＮＡが供されている。各バッチに完全ＲＮＡ
２０μgが供された。図４：コントロールとして図３と同様のブロットがβ−
アクチン標本とハイブリダイズされた。

【００３４】図５：レフルノミド−抵抗性Ａ２０Ｒにお
いてレフルノミドを除去した場合の推定上ＲＮＡヘリカ
ーゼの発現に対するノザン実験。コントロールは、１０
０μMレフルノミドでインキュベートされたＡ２０Ｒ細
胞のＲＮＡ（トラック１）だった。ハイブリダイゼーシ
ョンは、ＤＮＡプローブＡ／２０−５／６ｂを用いて実
施された。トラック２、３、４、５、６、７および８
は、それぞれ、１、２、３、４、５、１４日および５か
月間レフルノミド無添加でインキュベートしたＡ２０Ｒ
細胞からの完全ＲＮＡ１５μgを含んでいた。図６：β−アクチン標品を用いた図５のものと同じブロ
ットのコントロールのハイブリダイゼーション。ブロッ
トは常に適切な定量評価とともに示される。

【００３５】図７：各トラックごと２μgの、８種の異
なるヒト組織よりのポリ（Ａ）ＲＮＡを用いたノザン・
ブロット。トラック１〜８は、左から右方向へ、心臓、
脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓からの組織を
含む。ＲＮＡは、変性１.２％強度のアガロース・ゲル
上で電気泳動的に分離され、正に荷電したナイロン・メ
ンブレン上にブロットされ、ＵＶ架橋により固定され、
ハイブリダイゼーションは、Ａ２０−５／６ｂＤＮＡ
プローブを用いて実施された。ブロットの下に適切な定
量的評価が示される。

【００３６】図８：（Ａ）単離された陽性クローンの初
期配列決定と制限酵素マッピングの結果。クローン１か
ら４は重複し、挿入物の中にｈｓ１／ｈｓ２配列を有す
る。１／３と２は共通のＳｐｈＩ切断部位を有する。ｃ
ＤＮＡ４は完全にｃＤＮＡ２中に存在する。クローン５
は、サイズ（６.５kb）、制限酵素切断およびｈｓ１／
ｈｓ２ｃＤＮＡがないという点で他のクローンと異な
る。（Ｂ）ｃＤＮＡ配列における相同性ドメイン。相同
性ドメインが組み立てられ、ドメイン間のアミノ酸の距
離が示されている。９つのＤＥＡＨボックスの相同性ド
メインが示されている。ドメインＮＬＳはＴ抗原からの
「核局在部位」に相同性がある。

【００３７】表１：（Ａ）増大した程度まで発現されて
いる、Ａ２０Ｒからの１３５kDa蛋白質のサブ領域のプ
ライマーの構築。それぞれのケースの上の文字列は、一
文字表記のアミノ酸を特徴づける；この下にヌクレオチ
ド配列が示されている。かっこ内に記載されたアミノ酸
配列は、そのＣ末端より開始してリストされており、こ
こでもたらされたプライマー配列に相補的なＤＮＡ配列
に由来している。それぞれのケースにおいて、縮合した
遺伝コードがもたらされている。そのコドンの三番目の
塩基はしばしば明確でないので、それぞれのケースで対
応するＡＡに対し適切な塩基を得るために、すべての可
能な塩基の混合物が合成された。Ｎはすべての４塩基
（Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）に対する略号である。Ｉはイノシン
に対する略号であり、プリンとピリミジン塩基とともに
塩基対に入る。Ｒ＝Ａ、Ｇ；Ｙ＝Ｔ、Ｃ；Ｓ＝Ｇ、Ｃ.
Ａ２０−２、Ａ２０−３、Ａ２０−４およびＡ２０−５
は、上流に位置する縮合プライマーである。Ａ２０−６
ａおよびＡ２０−６ｂは下流に位置するプライマーであ
る。上流および下流に位置するプライマーと他のプライ
マーとの平均距離は約６００ヌクレオチドである。６の
下に示されるプライマーＡ−２０−６ｂの場合には、１
６番目のヌクレオチドは不注意でＮと同等とされ、故に
ここでは対応する相補的ストランドはイソロイシン（Ａ
ＴＴ、ＡＴＣ、ＡＴＡ）およびメチオニン（ＡＴＧ）の
両方をコードすることになる。この事実は実施されたＰ
ＣＲの成功には影響を与えなかったが、このように、表
２の配列中の最後より６番目のアミノ酸としてメチオニ
ンは誤っており、イソロイシンが正しいように考えられ
る。（Ｂ）ヒトｃＤＮＡクローンＢ１８５に由来するプ
ライマー；７＝下流のプライマー；８＝上流のプライマ
ー。

【００３８】表２：レフルノミド−抵抗性Ａ２０Ｒ細胞
の推定上のＲＮＡヘリカーゼのサブ領域の配列決定。塩
基配列（１−６１２）の下に、対応するアミノ酸配列が
一文字表記で記載されている。最後より６番目のアミノ
酸としてメチオニンではなくイソロイシンが正しい；説
明として、表１の説明を参照されたい。ここで示された
ＤＮＡ断片は、ハイブリダイゼーション実験のためにＡ
２０−５／−６ｂとして用いられた。

【００３９】表３：完全ｃＤＮＡ（全長４２７２bp）コ
ード領域の配列。マウスの配列に相同であるとの見地か
ら、１番目のリーディング・フレームは正しいことが判
明した。コード配列は位置１４８と３８３１の間に存在
し、１２２７アミノ酸の配列を生ずる（＊＝ストッ
プ）。表４：ＤＥＡＨボックス蛋白質に見られるヒト蛋白質の
類似性。

【００４０】実施例１レフルノミド−抵抗性細胞の調製培地：出発細胞株の培養、抵抗性サブ細胞株Ａ２０Ｒの
育成およびＡ２０Ｒ細胞交差−抵抗性をチェックするた
めの幼若化試験は、自分で調製した無血清培地で実施さ
れた。１０リッター用のイスコブ培地（バイオクロム、
ベルリン）の乾燥培地は、二度蒸留した水１０リッター
に溶解した。１８.９５ｇのＮａＣｌ１１.４３ｇのＮａＨＣＯ₃ ７００mgのＫＣｌ１０mlの３５％強度のＮａＯＨ溶液０.５mlの１モルメルカプトエタノール溶液がその後溶液に添加され、培地は無菌的に濾過された
（すべての物質は、リーデル・デ・ヘーンより求め
た）。使用の前に、３２mgのヒト・ホロ−トランスフェ
リン、１ｇの牛アルブミン、１.５mlの脂質（すべての
物質はシグマ社より求めた）は、１リッターのイスコブ
培地に添加された。

【００４１】出発細胞株Ａ２０.２Ｊの記載：Ａ２０.２
ＪはマウスＢ細胞リンフォーマＡ２０（ＡＴＣＣＴＩ
Ｂ−２０８）のサブラインであり、ＡＴＣＣにおいて細
胞株ＬＳ１０２.９（ＡＴＣＣＨＢ−９７）の融合細胞
株として記載される。この細胞は高い幼若化（倍化時間
約１０時間）および７７１７２６（レフルノミドの主
代謝物）に対する高い感受性（細胞幼若化５０％阻害が
２μM物質）により区別される。この細胞は非付着性−
成長細胞株として培養が容易である。抵抗性育成の記載：Ａ２０.２Ｊ細胞は、初めに１μMの
Ａ７７１７２６（幼若化の５０％阻害以下の濃度）含
有イスコブ培地において５日間培養し、細胞増殖と細胞
の生存率がチェックされた。毎２日または３日ごとに、
細胞は同じ濃度のＡ７７１７２６が添加された新鮮培
地に継代された。５日間培養した後、細胞の増殖と低い
死亡率（最大３０％の死亡細胞）が観察され、Ａ７７
１７２６の濃度はステップ・ワイズに増加された。細胞
の幼若化が低下しない限り最後の継代における濃度が使
用された。１年間培養した後、１００μMのＡ７７１７
２６存在下で恒常的な幼若化を示し、出発細胞株Ａ２
０.２Ｊと形態学的に差がない、安定な、抵抗性サブラ
インＡ２０Ｒが確立された。

【００４２】幼若化の検出５×１０⁵細胞が、３７℃および１０％ＣＯ₂で４８時
間、６ウエルプレート（グライナー）中の５mlのイスコ
ブ培地でインキュベートされた。一つのウエルは正の比
較値として設けられた。 −Ａ２０.２Ｊ：イスコブ培地中の細胞 −Ａ２０Ｒ：イスコブ培地＋１００μM Ａ７７１７２
６中の細胞様々な濃度の被験物質が残りのウエルの細胞へピペット
注入された。インキュベーション時間の後に、細胞はウ
エル中に再懸濁され、１００μlの細胞懸濁液が採ら
れ、１％強度のエオシン溶液（リーデル・デ・ヘーンよ
り求めたエオシン（黄色）１ｇが無菌の等張生理食塩水
１００mlに溶解された）に希釈された。細胞数はノイバ
オアー計測機により計測され、（エオシンにより染色さ
れた）死亡細胞の画分が決定された。幼若化の物質−誘
導変化がそれぞれの正のコントロールとの比較により算
定された。

【００４３】試験２：４×１０³細胞が、９６ウエルの
丸底ミクロタイター・プレート中（ヌンク社）に、イス
コブ培地中で容量１００μｌとなるように注入された。
被験物質は、所望の試験濃度の２倍濃度で供され、この
溶液１００μlが各細胞溶液に注入された。プレートは
３７℃および１０％で４８時間インキュベートされた。
幼若化は分裂細胞のＤＮＡの放射能標識により決定し
た。これを行うため、インキュベーション終了後、２５
μlの³Ｈ−チミジン（１０μCi／ml；比活性２９Ci／mm
ol；アマーシャム社）が各ウエルに添加され、混合液は
さらに１６時間インキュベートされた。この試験を評価
するために、セル・ハーベスター（スカトロン）により
プレートの各溶液はガラス・ファイバー・フィルター
（ファルマシア）上に集められ、未吸収の³Ｈ−チミジ
ンは別の廃液フラスコに集められ、細胞のＤＮＡに結合
した放射活性のみが測定された。フィルターはプラスチ
ックのバックで熱シールされ、１０mlのシンチレーター
（ファルマシア）を添加した後、測定のための計測カセ
ット中でシールされた。測定はベータ・カウンター（ワ
ラックから求めたベータ・プレート・システム１２０
６）にて実施された。試験１で示された通り、被験物質
の幼若化における変化は、それぞれの正のコントロール
に対して算定された。

【００４４】実施例２Ａ２０Ｒ細胞の抵抗性試験１．文献公知の抗幼若化物質に対する交差抵抗性：文献
公知の抗幼若化物質は（幼若化試験２で記載されたよう
に）Ａ２０Ｒ細胞およびＡ２０.２Ｊ細胞に対するその
抗幼若化の性質をみるため、様々な濃度で試験された。
次に表で、これらの物質の両細胞に対する算定された阻
害濃度が示される。出発物質株Ａ２０.２Ｊ細胞と比較
して、Ａ２０Ｒ細胞で抗幼若化物質に対する一般的に高
い抵抗性が存在するか示されなければならない。被験物質 A20.2Jの％阻害 A20Rの％阻害メトトレキセイト(0.15μM) 75.9 65.2 シスプラチン(10μM) 44.7 91.1 シクロスポリンA(0.25μM) 69.9 77.5 ミコフェノール酸(0.15μM) 89.8 76.8

【００４５】２．Ａ７７１７２６に類似する構造的に
関連する物質への交差抵抗性抗幼若化物質に対するＡ２０Ｒの一般的な抵抗性は存在
しなかったので、Ａ７７１７２６の構造的に関連する
類縁体がＡ２０.２Ｊ細胞と同じようにＡ２０Ｒ細胞に
関しても同様の幼若化阻害を有するかについてチェック
しなくてはならない。幼若化試験１によりこれが調べら
れた。以下の表において、比較ＩＣ₅₀値（細胞の幼若化
を５０％阻害する物質濃度）が示される。被験物質 A20.2JのIC₅₀値 A20RのIC₅₀値 A77 1726 2〜3μM 130μM X92 0715 8μM 120μM X91 0279 10μM 120μM X91 0325 10μM 75μM Ａ２０Ｒ細胞は、構造的に関連するＡ７７１７２６類
縁体に対する交差−抵抗性が徐々に減少することを示
し、構造特異的な抵抗性を示唆している。

【００４６】３．Ａ２０Ｒ細胞のブレキナーに対する交
差−抵抗性レフルノミドの作用メカニズムに対する初期の研究は、
ブレキナー（デュポン−メルク）にとの類似性を示して
いる。この理由から、ブレキナーはＡ２０Ｒに対する交
差−抵抗性の研究に追加的に加えられた。Ａ２０.２Ｊ
およびＡ２０Ｒ細胞のブレキナー・ナトリウム塩に対す
るＩＣ₅₀値は幼若化試験１により決定された。要約すると、Ａ２０Ｒ細胞は、その成長の挙動に関し
て、Ａ７７１７２６の類縁体およびブレキナー、すな
わち、ＤＨＯＤＨを阻害する物質に対し交差−抵抗性を
示すといえる。

【００４７】実施例３ＭＤＲ蛋白質のＡ２０Ｒ細胞の調査Ａ２０.２ＪおよびＡ２０Ｒ細胞の細胞蛋白質の電気泳
動による分離により、上記１３５kDa(蛋白質の検定マー
カーを用いて決定した）の分子量を有する蛋白質が、抵
抗性細胞株で過剰発現していることが示された（図１参
照）。最初の疑念は、この事実に関与するものはＭＤＲ
（multi-drug resistance：複合的−薬剤抵抗性）現象
ではないかということだった。ＭＤＲ（multi-drug res
istance：複合的−薬剤抵抗性）は構造的に関連のない
抗幼若化物質に対する細胞の抵抗性として定義される。
腫瘍細胞は、ＡＴＲ依存性細胞毒性物質を細胞からポン
プのようにくみ出す原形質膜糖蛋白質の過剰発現により
反応する。これらのＭＤＲ蛋白質（１３５−１８０kD）
を過剰発現することにより、細胞は抗幼若化物質が比較
的高い濃度で存在するときでも生存することができる。
分泌ポンプとしてのＭＤＲ蛋白質の機能は、カルシウム
・チャンネル・ブロッカーにより阻害され、細胞内にお
けるその物質の蓄積につながる。文献公知のカルシウム
・チャンネル・ブロッカーおよびＭＤＲ−関連物質は、
抵抗性細胞株がＭＤＲ蛋白質を過剰発現していたかをチ
ェックするため両方の細胞株に加えられた。使用された
カルシウム・チャンネル・ブロッカーはベラパミルであ
り、使用されたＭＤＲの基質はダウノルビシンおよびド
キソルビシンだった。この結果は幼若化の％阻害として
下記の表に示され、試験２の援用により決定された。

【００４８】

【表１】両細胞は、二つの物質により同程度阻害される。抵抗性
Ａ２０Ｒ細胞は、ＭＤＲの発現の増大により、高い受容
性を示さない。Ａ７７１７２６がＭＤＲにより輸送さ
れた分子か否かをチェックするため、同じ試験溶液が選
ばれた。ベラパミル(μM) A20.2J＋1.6μM A77 1726 A20R＋62.5μM A77 1726 0 16.4％ 10.3％ 100 14.3％ 6.4％ 200 12.5％ 9.9％ 400 7.9％ 13.9％細胞株の場合は、Ａ７７１７２６がＭＤＲ蛋白質によ
り輸送されていないことを決定するのは可能だった。

【００４９】実施例４１３５kD蛋白質の微量調製のための精製ａ．蛋白質の決定のための標品の調製ａ．１）ポポフの方法による蛋白質の決定(PoPov et
al.：Acta Biol. Med. Germ. 34, pp. 1441-1461) 原理：希釈された蛋白質溶液は、ナプトール・ブルー／
ブラック／メタノール／酢酸を用いて付色されたペレッ
トとして沈殿し、洗浄し、０.１ＭＮａＯＨ中に採取
し、吸光度が６２０nmで測定された。蛋白質濃度はＢＳ
Ａ（ＢＳＡ：牛血清アルブミン）溶液を用いて検定曲線
により計算された。注意：この蛋白質の決定は、界面活性剤（ＳＤＳ、Noni
det等）によっては影響を受けず、同様にβ−メルカプ
トエタノールの存在も妨害しない。ペレットのプラスチ
ック表面への付着が強く、洗浄溶液を流し出す際のペレ
ットの不溶化による蛋白質の損失を避けるために、本来
のエッペンドルフ^R 容器が使用されるべきである。

【００５０】以下の溶液が必要とされる。「ポポフ１溶液」０.６５ｇのナフトール・ブルー・ブラック＋５０mlポポフ２を少なくとも１時間撹拌、この溶液は
１週間だけ保存可能である。「ポポフ２溶液」５０ml氷酢酸＋４５０mlメタノール「ポポフ３溶液」４mlポポフ１＋３６ml ポポフ２、その後濾過検定曲線のプロット：ＢＳＡ溶液の調製：シグマ社からの牛アルブミン（９８
から９９％純度）が５％強度のＳＤＳ溶液で１mg／ml濃
度にて調製された。比較的多量の溶液が調製され、−２
５℃で１mlずつ保存される。１mlが解かされ、サーモ・
ミキサー（エッペンドルフ・サーモミキサー５４３６）
にて９５℃で１０分間強く振られた。冷却後、以下の希
釈が行われた。 BSA溶液の10μl＋５％強度SDS溶液の990μl BSA／mlの
0.010mg BSA溶液の25μl＋５％強度SDS溶液の975μl BSA／mlの
0.025mg BSA溶液の50μl＋５％強度SDS溶液の950μl BSA／mlの
0.050mg BSA溶液の75μl＋５％強度SDS溶液の925μl BSA／mlの
0.075mg BSA溶液の100μl＋５％強度SDS溶液の900μl BSA／ml
の0.100mg BSA溶液の150μl＋５％強度SDS溶液の850μl BSA／ml
の0.150mg BSA溶液の200μl＋５％強度SDS溶液の800μl BSA／ml
の0.200mg BSA溶液なし＋５％強度SDS溶液の1000μl ブランク
値８溶液すべてについて２００μlがそれぞれ２回ずつ使
用され（２度反復実験）、６００μlの「ポポフ３」と
混合され、簡単にかつ強く混合された（ボルテック
ス）。

【００５１】次に、ベンチ・トップ遠心機（エッペンド
ルフ）にて毎分１４０００回転で５分間遠心し、上清が
除去された。ペレットは毎回７５０μlの「ポポフ２」
で３回洗浄し、遠心した。最後の遠心操作後に、ペレッ
トは１mlのＮａＯＨに採取され、６２０nmのブランク値
に対するプラスチック・キュベット（ｄ＝１cm）で測定
された吸光度が測定された（コントロンから求めた分光
光度計）。一連の測定例：BSA濃度（mg／ml） 620nmの吸光度 0 0 0.010 0.0459 0.025 0.1154 0.050 0.2442 0.075 0.4025 0.100 0.4964 0.150 0.6856 0.200 0.9534 この評価における相関係数：蛋白質濃度／吸光度は、経
験によれば、０.９９５〜０.９９９（この例では０.９
９８）であった。

【００５２】ａ．２）Ａ２０Ｒの標品調製／蛋白質決
定：１mlのＰＢＳ緩衝液中の１０⁷Ａ２０細胞（Ａ２０
細胞なる述語は、Ａ２０.２ＪおよびＡ２０Ｒを意味す
る）は、ベンチ・トップ遠心機（エペンドルフ・モデル
５４１５Ｃ）にて毎分１０⁴回転で５から１０秒遠心し
た。上清が除かれ、ペレットは１mlの５％ＳＤＳ溶液と
混合し、混合液はピペットで数回吸い上げられて均一化
され、サーモミキサーで約９５℃で１０分間強く振ら
れ、その後冷却された。この溶液から：２０μlは９８０μlの５％ＳＤＳ溶液と混合された−５
０倍希釈５０μlは９５０μlの５％ＳＤＳ溶液と混合された−２
０倍希釈この混合液はサーモミキサーで約９５℃で１０分間強く
振られ、その後冷却された。各溶液２００μlが２度反
復実験のために２回採取され、６００μlの「ポポフ溶
液３」と混合され、上述のＢＳＡと同様に処理された。
すでに記載された検定曲線を援用し、評価がなされた。測定結果：希釈 620nmの吸光度蛋白質濃度×希釈率(mg／ml) 50-fold 0.0972 0.915 20-fold 0.1800 0.720 結果：Ａ２０細胞は、約８００μg蛋白質を含む。

【００５３】ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥのための標品の調
製１mlのＰＢＳ緩衝液に存在する１０⁷ Ａ２０細胞は、ベ
ンチ・トップ遠心機（エッペンドルフ・モデル５４１５
Ｃ）にて毎分１０⁴ 回転で５から１０秒遠心した。ｂ．１）直接溶解上清が除かれ、ペレットは４００μlのサンプル・バッ
ファーに混合され、ピペットで数回吸い上げられて均一
化され、混合液は強く振られ（ボルテックス・シェーカ
ー）、前述のサーモミキサーまたは水浴槽で９５℃で５
から１０分間強く振られた。この極めて粘着性の溶液の
蛋白質濃度は約２mg／mlだった。クマシー・ブルー染色
ゲルに対しては８０から１００μgの蛋白質に対応す
る、この溶液の４０から５０μl／サンプル・バッグが
必要である。Ａｇ染色ゲルに対して、ここで記載された
溶液は次に１：２０に希釈され、従って４０から５０μ
lが４から５μg／サンプル・ポケットの蛋白質濃度に対
応する。サンプル・バッファーの組成：ミリポアＨ₂Ｏ２.７ml グリセロール、９８％強度１０.０ml ０.２５Ｍトリス／１Ｍグリシン９.０ml ２５％ＳＤＳ溶液６.８ml ０.１％ブロモフェノール・ブルー溶液２.５ml ２−メルカプトエタノール４.０ml

【００５４】ｂ．２）細胞の凍結とこれに続く溶解細胞のペレットは密閉したエッペンドルフ容器中で即座
に液体窒素に約１分間浸され、−８０℃で保存された。
溶解する際、この極度に冷凍された細胞ペレットにサン
プル・バッファーが直接添加された。

【００５５】ｃ．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ様々なポリアクリルアミド・ゲルが使用された（１０
％、１２％、４から２２.５％ＰＡＡ）。シャープなバ
ンドに関する最良の結果は、ＰＡＡ含量が４から１０％
のグラディエント・ゲルを使用して得られた。これに必
要な技術／溶液は以下に記載される。分離ゲル４から１０％のＡＡのグラディエント・ゲルのゲル溶液
の組成(約２４ml)：成分４％AA溶液 10％AA溶液水 7ml − グリセロール − 6.1g ストック溶液１ 1.6ml 4ml ３Ｍトリス、pH8.8 3ml 3ml 10％APS 80μl 40μl 10％SDS 120μl 120μl TEMED 10μl 10μl ストック溶液１：３０％アクリルアミド／０.５％−Ｎ,
Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドクロスリンキング：１.７％ＡＰＳ：過硫酸アンモニウム採取ゲル二つのゲルに対する３.８％ＡＡのゲル溶液の組成（約
１０.５％）成分水 3.7ml ストック溶液２ 4.0ml 0.5ＭトリスpH6.8 2.5ml 10％APS 200μl 10％SDS 100μl TEMED 12μl ゲルは公知の標準的な方法に従い脱気され、適切な架橋
の後、垂直の電気泳動層に固定された。クマシーブルー
／銀−染色ゲルに対し、ｂ）に記載されたＡ２０標品そ
れぞれ４０μl＝各サンプル・ポケットごと８０μg／４
μgが供された。

【００５６】使用された分子量のスタンダードは、ベー
リンガー・マンハイムから求めた「コンビテック」マー
カーであり、その分子量範囲は、還元されたサンプル・
バッファー中で１７０から１４kDであった。電気泳動操作バッファーの組成：ミリＱＨ₂Ｏを用いて使用前に希釈ＳＤＳ０.１％トリス５０mM グリシン２００mM 操作条件：１７×１８×０.１cmのゲルを使用した場合
３５mA／ゲル（電圧４００Ｖ）で約５時間

【００５７】染色：１．クマシー・ブルー染色

【表２】

【００５８】２．銀染色（ホイケスコーフェン染色変
法）

【表３】上記のすべてのステップは、それぞれ200ml／ゲルにて
（振盪テーブルで）ゆっくり振盪しながら実施された。
撮影／スキャニング／乾燥またはブラスチック・バッグ
中での熱シーリングの前に、ゲルは２倍希釈された蒸留
水の中で数時間からオーバー・ナイトでインキュベート
された。保存：熱シールされたゲルは、可能な限り遮光し、室温
で保存されるか、冷蔵庫（Ｔ：＞０℃）で面を重ねて保
存される。

【００５９】ゲルの評価分子量の大きな範囲（マーカー・バンド１７０および１
１６kDの間）では、抵抗性Ａ２０細胞においては、より
強く発現される蛋白質のバンドが検出された。これはク
マシー・ブルーと銀染色の両方で観察できた（図１参
照）。分子量についての結論８個の検出スタンダードのうち、４から１０％ゲル中の
個々の蛋白質の泳動距離が分子量の対数に関連して図示
された。このように公知の泳動距離を有する前述の蛋白
質バンドの分子量を算定することが可能であった。トー
タルの泳動距離は１１.２cmであった。

【００６０】

【表４】未知の蛋白質を５回供与した平均値がかっこ内に示され
ている。相関係数は０.９７７であった。算定される分
子量はＭ_r１３５kDであった。

【００６１】定量的データのデンシトメトリーによる評
価バイオ・イメージ^R システム（ミリポア、エシュボー
ン）の上で、抵抗性Ａ２０細胞（Ａ２０Ｒ）についての
クマシー・ブルーで染色されたＰＡＡゲル（４から１０
％）のバンドの定量は「ホール・バンド・メニュー」に
て実施された。５つの評価されたトラックにおける結果
は、蛋白質の内容が異なっていた。蛋白質の全量(μg) IOD＝光学密度、135kD蛋白質バンドの(％) ８０１.０７８０１.０３６０１.０５６０１.０４４０１.３２このように、抵抗性Ａ２０細胞における１３５kD蛋白質
の比率は約１％であった。正常Ａ２０細胞（Ａ２０.２
Ｊ)においては、８０μgの蛋白質を供与した場合でもこ
のバンドを定量的に決定することは、それが抵抗性細胞
に比較してまったくほんの僅かしか検出できないので、
不可能であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて得られた他の情報：あるサン
プルにおいては、ａ）に記載したサンプル・バッファー
はメルカプト・エタノールを加えないように修正され
た。この条件下で、Ｓ−Ｓ架橋により形成された蛋白質
はサブ・ユニットに分かれなかった。結果：１３５kD蛋白質の分子量には変化がなかった。

【００６２】ｄ）１３５kD蛋白質の微量調製による濃
縮一般に配列決定に必要な蛋白質の量は、１００pmolとさ
れており、それは約１４μgの蛋白質に対応している。
注意深い評価により（マーカーの濃度に比較して）、１
３５kDa蛋白質の濃度は８０μgの全供与量上０.３μgと
評価された。全部で１０４本の１３５kDaのバンドを有
する１６のゲル（ＰＡＡ４から１０％）が調製され
た。供与された蛋白質の全量は、常に８０μgであっ
た。

【００６３】ｅ）ポリアクリルアミドゲル中の蛋白質
の切断ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクマシー・ブルーの後、ゲル・
バンドが切り出され、Ｈ₂Ｏを何回も交換することによ
り一日以内中性になるまで洗浄された。ゲル断片は（針
のない注射器で）３２μmの篩いに圧力をかけて通され
た。細かいパスタ状のゲルは真空の遠心機で、ほぼ乾燥
状態になるまで脱水・乾燥した。次に酵素／緩衝液が加
えられ、１０倍量のエンドプロティナーゼＬＹＳ−Ｃ
（ベーリンガー・マンハイム）が添加された。反応液は
３７℃で６から７時間インキュベートされ、次に、１ml
の６０％アセトニトリル／０.１％ＴＦＡを使用して数
時間３７℃で溶出した。上清はピペットで採取され、溶
出操作は室温でオーバーナイトで繰り返された。上清は
ピペットで採取され初めの上清と合わされ、０.０２μm
フィルター（メルク社より求めたアナトップ^R）を通し
て濾過され、真空の遠心機で脱水・乾燥した。ＨＰＬＣ
に注入する前に、残留物は１０から２０％の蟻酸で希釈
された。

【００６４】ｆ）ＨＰＬＣにおけるペプチド分離測定条件：カラム： Superspher^R 60 RP Select B 溶出液Ａ：Ｈ₂Ｏ中の０.１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶出液Ｂ：アセトニトリル中の０.１％ＴＦＡ勾配：ｔ〔分〕％Ｂ００６０６０６５７０流速：０.３ml／分測定波長：２０６nm

【００６５】ｇ）エドマン法に従った自動Ｎ末端蛋白
質配列分析（ベックマン分析機）ペプチド１ＫＬＧＤI ＭＧＶＫＫＥ（配列番号：
１）ペプチド２ＫＬＧＤI ＭＧＶＫＫＥＴＥＰＤＫ（配
列番号：２）ペプチド３ＫＬIＶＴＳＡＴＭＤＡＥＫ（配列番
号：３）ペプチド４ＤＡＴＳＤＬＡIIＡＲＫ（配列番号：４）ペプチド５ＫIＦＱＫ（配列番号：５）ペプチド６ＴＰＱＥＤＹＶＥＡＡＶ（配列番号：
６）ペプチド１〜６に対応するピークは図２に記されてい
る。

【００６６】ｈ）公知のペプチド配列とのデータ・バ
ンクを用いての比較あるケースにおいて得られたペプチド配列は、カエノロ
ハビチチス・エレガンス（Caenorhabtitis elegans）の
遺伝子配列から得られた、機能が未知である蛋白質に高
い相同性を示した。この配列に対応しないアミノ酸が印
を付されている（ｇ項参照）。ペプチド３のC. elegans
との極端に強い相同性（文献より、このＳＡＴボックス
はバクテリアから哺乳動物までのＤＥＡＤボックス蛋白
質において高度に保存されていることが知られてい
る）。並びにペプチド４およびペプチド２との対応がな
いかまたは極めて少ないことは本発明に対応する蛋白質
は、ＤＥＡＤボックス蛋白質のクラスの新規な一例であ
るという事実を明確に確認するものである。

【００６７】以下の実施例は、実施された分子生物学的
な実験を記載する。たとえば、「Molecular Cloning-A
Laboratory Manual, 2nd Edition by Sambrook at al.,
appearing in Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s：分子クローニング−実験室マニュアル、第２版サム
ブルクら、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラト
リー出版」にて記載された基本的な分子生物学的標準的
方法は公知のものとされる。このような方法とは、例え
ば、プラスミドＤＮＡの調製、プラスミド微量調製、プ
ラスミド大量調製、アガロース・ゲルからのＤＮＡの溶
出、濾過による溶出、吸着による溶出、ＤＮＡの酵素的
修飾、制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡの切断、大
腸菌の形質転換、ＲＮＡの調製、一段階法を使用する
（チョムチンスキーの方法による）ＲＮＡの調製、ダイ
ナビーズ^Ｒを使用するｍＲＮＡの調製、ＲＮＡのゲル電
気泳動、ノザン・ブロット、ＤＮＡの放射能標識、〔α
−³²Ｐ〕ｄＡＴＰを使用する「ランダム・プライム」Ｄ
ＮＡの標識、ダイデオキシ法によるＤＮＡの配列決定、
全ＲＮＡからのｃＤＮＡの調製、核酸の非放射能標識、
ディゴキシゲニン（ＤＩＧ）を使用する「ランダム・プ
ライム」ＤＮＡの標識、ＤＩＧ−標識核酸の検出であ
る。

【００６８】実施例５見いだされたアミノ酸配列に対応するｃＤＮＡ断片のＰ
ＣＲ濃縮反応はペキン・エルマー・サイクラーにて実施
された。ＰＣＲの標識的な１回の反応液５０μｌに対
し、以下の組成成分が氷上にピペットで注入され、５０
μｌの鉱物油にコートされた。

【００６９】１μｌの鋳型ＤＮＡ（０.５〜２.５μｇ）１μｌの順方向のプライマー（３０pmol／μｌ）１μｌの逆方向のプライマー（３０pmol／μｌ）５μｌのｄＮＴＰ混合液（ヌクレオチドごとに２mM）５μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液３６.５μｌのＨ₂Ｏ０.５μｌのＴａｑポリメラーゼ（２.５単位）

【００７０】増幅は以下の条件下で４０サイクル実施さ
れた。第１段階：９４℃、３０秒間ＤＮＡ２本鎖の変性第２段階：５０℃、２分間ＤＮＡ１本鎖へのプライマ
ーの添加第３段階：７２℃、３分間ＤＮＡ合成最終サイクルにおいてＤＮＡの合成は５分間実施され、
一回分の反応液は４℃に冷却された。分析のため、一回
の反応液の１０μｌは１から２％強度のアガロース・ゲ
ルにて分析された。

【００７１】順方向プライマー：Ａ２０−２、Ａ２０−
３、Ａ２０−４、Ａ２０−５（表１参照）逆方向プライマー：Ａ２０−６ａ、Ａ２０−６ｂ（表１
参照）マトリックス・Ａ２０Ｒ−全ＲＮＡ順方向および逆方向のプライマーは、それぞれ、ＰＣＲ
反応でペアとして組み合わされた。一回の反応Ａ２０−
３／Ａ２０−６ｂは約６３０ｂｐのｃＤＮＡの増幅につ
ながり、それはプライマーＡ２０−３、Ａ２０−４およ
びＡ２０−５の組み合わせとの特異性をチェックするた
めプライマーＡ２０−６ｂにより再増幅された。強度を
増すため、再増幅には添加温度として５５℃が選択さ
れ、３５ＰＣＲサイクルだけが実施された。得られた断
片（名前：Ａ２０−５／−６ｂ）をクローニングおよび
配列決定した後、表２に示される配列データが得られ
た。

【００７２】実施例６ノザン・ハイブリダイゼーション使用されたハイブリダイゼーション溶液は、クロンテッ
クより求めた随時調製用エキスプレスＨｙｂ^Ｒ溶液であ
り、この溶液は、あらかじめ標識された遺伝子プローブ
（放射活性であろうが非放射活性であろうが）を、ハイ
ブリダイゼーション時間または１時間内に、担体フィル
ター上に存在する相補的ＤＮＡ配列と結合させる。

【００７３】さらに必要な試薬：２０×ＳＳＣ：３ＭＮａＣｌ；０.３Ｍクエン酸ナト
リウム（pH７.０）洗浄溶液１：２×ＳＳＣ；０.５％ＳＤＳ洗浄溶液２：０.１×ＳＳＣ；０.１％ＳＤＳ洗浄溶液３：２×ＳＳＣ；０.１％ＳＤＳ

【００７４】１．エキスプレスＨｙｂ^Ｒ溶液（クロンテ
ック）を使用する非放射標識遺伝子とのハイブリダイゼ
ーションエキスプレスＨｙｂ^Ｒ溶液は６８℃まで温められ同時
に、沈殿物が残らないように撹拌された。膜（１０×１
０cm）は３０分間６８℃で少なくとも５mlのエキスプレ
スＨｙｂ^Ｒ溶液中でハイブリダイゼーション・オーブン
で連続的に混和することによりプレ・ハイブリダイゼー
ションされた。放射標識されないＤＮＡプローブは、５
mlの新鮮エキスプレスＨｙｂ^Ｒ溶液と混和された。次に
プレ・ハイブリダイゼーション溶液は、このエキスプレ
スＨｙｂ^Ｒ溶液と交換され、ブロットは１時間ハイブリ
ダイゼーション・オーブン中で６８℃でインキュベート
された。インキュベートの後、２０mlの洗浄溶液３（１
００cm²の膜に対して）を使用して３０分間、室温での
洗浄が実施され、溶液は一度交換された。２番目の洗浄
工程は洗浄溶液２を使用し、５０℃で３０分間実施され
た。ここでも溶液は一度交換された。それから過剰の洗
浄溶液を膜にしたたらせ、その後この膜を化学蛍光検出
に直接使用することが可能だった。

【００７５】２．エキスプレスＨｙｂ^Ｒ溶液（クロンテ
ック）を使用した放射標識遺伝子プローブとのハイブリ
ダイゼーション放射標識ＤＮＡプローブの場合と同様、ハイブリダイゼ
ーションが実施された。インキュベートの後、洗浄は洗
浄溶液１を用いて３０から４０分間、室温で溶液を数回
交換して行われた。２回目の洗浄工程は、５０℃で４０
分洗浄溶液２により行われた。この場合、溶液は一回交
換された。この後、過剰の洗浄溶液を膜にしたたらせ、
ブロットはプラスチック・フィルムに熱シールされた。
ブロットはエキスポージャー・カセット中で−７０℃で
感光され、フォスフォイメージャー（バイオラド）で分
析された。ＲＮＡおよび使用されたハイブリダイゼーシ
ョン・プローブは、それぞれ図の説明分の中に記載され
ている。

【００７６】３．Ａ２０.２ＪおよびＡ２０Ｒ細胞中で
のレフルノミドの影響下での推定上のＲＮＡヘリカーゼ
のｍＲＮＡの経時変化実験は図３および４およびその説明文に示されている。
すべての細胞（Ａ２０.２ＪおよびＡ２０Ｒ）中で４.４
kDのサイズのバンドが観察された。Ａ２０Ｒ細胞は極め
て強いシグナルを発し、Ａ２０.２Ｊ細胞は極めて弱い
シグナルのみを発したが、しかるにこれらの細胞をＡ７
７１７２６で１から８時間処理すると、このシグナル
はいくぶん強くなった。Ａ７７１７２６はここで調べ
られたｍＲＮＡの形成を顕著に誘導しない。

【００７７】４．Ａ７７１７２６を除去した場合の推
定上のＲＮＡヘリカーゼのｍＲＮＡの経時変化実験は図５５および６および説明文に示されている。Ａ
７７１７２６を除去した場合、調べられたｍＲＮＡの
レベルは、観察された期間下がった（５か月まで）。

【００７８】５．８種の異なったヒト組織における推定
上のＲＮＡヘリカーゼのｍＲＮＡレベル実験は図７と対応する説明文に記載されている。調べら
れた組織におけるｍＲＮＡレベルがそれぞれ異なってい
ることが観察される。ｍＲＮＡの発現はレフルノミド抵
抗性と相関があるので（３参照）、心臓や骨格筋のよう
な筋組織はレフルノミドに対する感受性が低い。

【００７９】実施例７推定上のマウスＲＮＡヘリカーゼのヒトｃＤＮＡクロー
ンに対する相同性レフルノミド−抵抗性Ａ２０Ｒ細胞において特異的に発
現された推定上のＡ２０Ｒヘリカーゼのサブ領域からの
アミノ酸配列ＫＬＧＤＩＭＧＶＫＫは、ＥＭＮＥＷ（Ｅ
ＭＢＬ−新登録）データパンクにおけるｃＤＮＡクロー
ンＢ１８５（ホモ・サピエンス）の登録に見いだされ
た。これにより、対応するヒトの推定上のＲＮＡヘリカ
ーゼに対するｃＤＮＡに対応するｃＤＮＡを増幅するた
めのマトリックスとしてヒトｃＤＮＡパンクを使用する
ＰＣＲにおいて使用されたＰＣＲのための好適なプライ
マーの調製が可能だった。新規な上流および下流のプラ
イマーはプライマー番号７および８として表１に示され
ている（７＝ｈｓ１、８＝ｈｓ２）。

【００８０】プライマーは目的配列に相補的なので、Ｐ
ＣＲの条件はストリンジェントに保たれた。ハイブリダ
イゼーションは４５秒間５５℃、変性は３０秒間９４
℃、合成は４５秒間だけ７２℃で行われた。変性や合成
フェーズが短かった理由は、予期される挿入物の長さが
知られていることによる（２４６bp）。ＰＣＲの濃縮の
比率は、実施例５のスタンダードに応じて選択された。
使用されたマトリックスは、３つの異なるヒトｃＤＮＡ
バンクであった（１．末梢Ｔ細胞、２．ＰＭＡ−刺激Ｈ
Ｉ−６０ミエロイド前駆体細胞、３．胎盤）。それぞ
れ、２４６bpのＰＣＲ断片が得られたが、その配列は、
表３のヌクレオチド１４３１から１６７２に対応してい
る。

【００８１】実施例８核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼ
の性質を有する蛋白質の遺伝子をコードする完全ヒトｃ
ＤＮＡクローンのコロニー・ハイブリダイゼーションに
よる採取ノザン・ブロット実験の結果（実施例６）を基にして、
ヒト骨格筋から調製されたｃＤＮＡバンクがスクリーニ
ングに用いられた。採用されたプローブは配列ｈｓ１／
ｈｓ２だった。標識プローブＤＮＡの合成のため、プラ
イマーｈｓ１およびｈｓ２およびｈｓ１／ｈｓ２クロー
ン（ベクター：ｐＣＲ^TMII）を鋳型として使用するＰＣ
Ｒにより増幅され、アガロースゲル電気泳動とフェノー
ル溶液により精製された。ランダム・プライマーの援用
によるＤＩＧ標識（「ランダム・プライムド・ラベリン
グ」）のために、１μｇのｈｓ１／ｈｓ２ＤＮＡが鋳
型として採用され、２０時間の反応時間後、１μｇの鋳
型に対し、約２μｇの標識プローブＤＮＡが得られた。
ブローブの特異性をチェックするために、ｈｓ１／ｈｓ
２ＤＮＡの０.１pgから１０ngの段階希釈がナイロン膜
の上に固定され、ＤＩＧで標識されたｈｓ１／ｈｓ２プ
ローブとハイブリダイズされた。１０pgのｈｓ１／ｈｓ
２ＤＮＡを適切に検出し、１００pg以上のｈｓ１／ｈ
ｓ２ＤＮＡ（ハイボンドＮ＋）を明確に検出するため
に、１mlのハイブリダイゼーション溶液当たり５〜２５
ngのプローブで十分であることが観察された。

【００８２】ジーン・バンクの最初のスクリーニングの
ために、１５０mmのアガロース・プレートに約４０,０
００のコロニーが撒かれ、２０のマスター・プレートが
調製され、その結果約８００,０００の個々のコロニー
が撒かれた。このコロニーを計測するに際し、手作業に
よりもたらされた１.１×１０⁶の独立したコロニーのう
ち、これらのうちのクローン種は完全に撒かれたとする
確立は適切だと思われた。それぞれのプレートについて
２つ、全体で４０のレプリカ・フィルター調製され、そ
れらはＤＩＧプローブとのハイブリダイゼーションに供
された。このハイブリダイゼーションのため、２５ng／
mlのプローブ濃度が採用された。検出のため、膜は２時
間Ｘ−線に感光された。５つの異なったプレート上で、
全部で１９個の陽性クローンが得られた。一次スクリー
ニングよりの１９の陽性クローンのうち、二次スクリー
ニングで５のクローンが確認された。これらのクローン
は単離され性状決定された。それぞれのクローンに対
し、以下の挿入サイズが評価された。クローン１１.６kb クローン２３.５kb クローン３１.６kb クローン４０.９kb クローン５６.５kb

【００８３】さらに性状決定を行うため、各クローンは
初期の配列決定が行われ、得られたサブ配列と制限酵素
地図がお互いに比較された。お互いに配列の比較をした
ところ、クローン１とクローン３はほとんど同一である
との疑問が確認された。クローン１から４は、ｈｓ１／
ｈｓ２ｃＤＮＡ配列からなり、評価鎖長４.５kbに対応
する遺伝子配列に対応していたことが判明した。完全な
５′−末端とｍＲＮＡのポリＡテールが追加的に含まれ
ていると考えられた。全長の長さより、このものは１３
５kD蛋白質の発現に必要な完全配列であるとの疑問が生
じた。模式図は、互いのｃＤＮＡの方向性とスクリーニ
ングに使用された配列ｈｓ１／ｈｓ２の位置を示してい
る（図８Ａ）。

【００８４】他のクローンと比較して、クローン５は相
違を示しているようである。このクローンの初期の配列
決定は他の配列との重複をまったく生ぜず、このクロー
ンの中でのｈｓ１／ｈｓ２配列の位置を全く示さなかっ
た。制限酵素の解析でも、プラスミド５は他のクローン
と同じ遺伝子に由来していないのではとの疑問を生じさ
せる、特別の特徴を示した。挿入物の長さが６.５kbと
評価され異常に長いことも、ハイブリダイゼーションの
人工物に基づく単離ｃＤＮＡであることを支持し、その
結果この調査は一時的に延期された。クローン１とクロ
ーン２は、完全に配列決定された。配列データは表３に
示されている。

【００８５】全長４.３kbのＤＮＡ配列が一つあり、ク
ローン１は正確に１５９０bpでクローン２は正確に３２
１０bpであり５３０bpの範囲で重複している。それ以前
に知られていた配列ｈｓ１／ｈｓ２は、１４３０と１６
７２の位置の間に存在していた。この配列の位置は、６
個の可能なリーディング・フレームの第１番目（第１番
の塩基より開始）が正しいものだったとの事実を示して
いる。このフリーディング・フレーム中に二つの終始コ
ドンがあった：一つは塩基５８（ＴＧＡ）におけるもの
であり、一つは塩基３７２９（ＴＧＡ）におけるもので
あり、その後に約３００塩基対のポリ−Ａテールが下流
に続いている。初めの終始コドンの後、位置１４８にお
いて、翻訳の可能な開始コドンと思われるメチオニン・
コドンが続く。それは配列中で最初のＡＴＧコドンであ
るばかりでなく、コザックの出発配列の特徴、すなわ
ち、位置−３におけるプリン残基（Ｇ）および位置＋４
におけるＧ、の特徴を有していたからである。丁度１０
００塩基対下流にさらに別のＡＴＧコドン、さらに正確
には配列中に二つのメチオニンコドンが見られた。−３
におけるＡおよび＋４におけるＧとの状況を考えると、
２番目のコドンも同様に開始コドンたり得る。公知の哺
乳動物ｍＲＮＡの翻訳が、各ケースの９０〜９５％にお
いてリーディング・フレームに最初に見られるメチオニ
ン・コドンより開始するので、これは今回のケースにも
仮定できる。この仮定から始まると、この配列は１２２
７ＡＡの蛋白質をコードしているだろう。アミノ酸の平
均分子量が１１０ダルトンとすると、一つの蛋白質がま
さに１３５kDに対応しているであろう。この蛋白質のサ
イズ、妨害されないリーディング・フレームおよび相対
的に遠い開始コドンを考えると、この配列が完全ｃＤＮ
Ａである可能性は高い。

【００８６】別の検討によれば、マウス配列０５／６ｂ
と相補性ある領域を決定することが可能であった。マウ
ス細胞株Ａ２０Ｒからの配列０５／６ｂをヒト配列と比
較すると、２４５アミノ酸中１５アミノ酸で相違がみら
れ、約６％の平均的相違に対応していた。

【００８７】実施例９ヒト配列中に見られるホモロジー
・ドメインおよび他の蛋白質との類似性可能なヘリカー
ゼのスーパー・ファミリーIIのホモロジー・ドメインと
の配列の比較により、ＤＥＡＨ蛋白質ファミリーのすべ
ての保存ドメインがヒト配列中に存在していることを示
された（図８Ｂ）。第１ドメイン−６６５番目のアミノ
酸から開始するＡＴＰアーゼＡ・モチーフである。この
ドメインにおいて、全部で僅か２アミノ酸がホモロジー
（相同性）配列と異なるのみである。ドメインIVのスレ
オニンに代わるプロリンとドメインVIのイソロイシンに
代わるセリンである。さらに、Ｎ末端からの初めのホモ
ロジー・ドメインの距離は、以前に知られていたＤＥＡ
Ｈボックス蛋白質におけるよりも１５０残基大きい。こ
れ以外の僅かな相違は、ドメインIVとＶの距離である：
７５から８０のアミノ酸エステルの代わりに、この間に
は僅か７４のラジカルがあったのみである。それ以外の
点では、ヒトｃＤＮＡに由来する蛋白質は、ここで示さ
れた相同性を考慮し、明確にＤＥＡＨボックス蛋白質と
して分類され得るだろう。加えて、配列のＮ末端には、
ＳＶ４０Ｔ抗原の「核局在部位（nuclear localizatin
site: NLS）」に強い相同性を有するアミノ酸配列が同
定された。このＮＬＳ相同性は、６９アミノ酸から開始
し、１０残基の長さであった。

【００８８】さらに推定上のヘリカーゼ配列の性状決定
を行うために、ＤＮＡおよび蛋白質レベルで「genemb
l」、「swissprot」および「pir」を用いたＧＣＧプロ
グラムにおいて配列の比較が行われた。ジーン・バンク
の分析により、ＤＥＡＨ蛋白質ファミリーがいくつかの
公知蛋白質に相同性を有することがわかった（表４）。

【００８９】もっとも強い相同性を有する蛋白質は、C.
elegansからのＫ０３Ｈ１.２と同定された。この部分
に対して、この蛋白質は存在するホモロジー・ドメイン
に基づき可能なＤＥＡＨボックス蛋白質（Wilson et a
l., 1944, Nature 368:32-38）として分類された。Ａ２
０Ｒ細胞から１３５kD蛋白質の初めに配列されたペプチ
ド断片は同様にC. elegansからの配列に類似性を有して
いた。この拘束は早くより、Ａ２０Ｒにおいて過剰発現
された蛋白質がＲＮＡヘリカーゼたり得るとの示唆を生
んでいた。加えて、ＤＮＡレベルで６０％相同な蛋白質
が同定され、これは１９９４年にヒーラ細胞からクロー
ン化され、可能なヒトＲＮＡヘリカーゼと同様に、ＨＲ
Ｈ１と命名されている（Ono et al., 1994, Molecular
and Cellular Biology. 14: 7611-7620）。別に、ＤＥ
ＡＨファミリーに属する蛋白質と同様、サッカロミセス
・セレビシェ（S. cerevisiae）からのスプライス因子
ＰＲＰ２、１６および２２に、蛋白質レベルで約５０％
の相同性が見いだされた（Chen and Lin, Nucl. Acids
Res. 18: 6447, 1990; Schwer and Guthrie, Nature 34
9: 494-499, 1991: Company et al., Nature 349: 487-
493, 1991）。さらに、D. melanogasterからのＤＥＸＨ
蛋白質ＭＬＥ（Kuroda et al., 1991, Cell66: 935-94
7）および牛からの可能な核ＤＮＡヘリカーゼII−ＮＤ
Ｈ II（蛋白質レベルで４２〜４３％）に有意な相同性
が見いだされた（Zhang et al., 1995, J. Bio1. Chem.
270: 16422-19427）。

【００９０】実施例１０ヒト推定上ＲＮＡヘリカーゼの試験管内発現ウサギ網状赤血球ライゼートにより、得られたｃＤＮＡ
の試験管内翻訳が行われた。この目的のため、さまざま
な０.５および２.０μｇの線状または環状ＤＮＡが採用
された。使用された正のコントロールは、プロメガから
追加的に求められたルシフェラーゼＤＮＡだった。翻訳
はＴ７ポリメラーゼを使用して行われた。遺伝子産物は
³⁵Ｓ−メチオニンの吸収により標識され、変性ＳＤＳ−
ＰＡＡゲル上の分離後、オートラジオグラフィーにより
可視的にされた（データは示さず）。

【００９１】採用されたＤＮＡの量には無関係に、すべ
ての実験は良好な結果を提供し、環状ＤＮＡは線状ＤＮ
Ａよりやや効率的に翻訳された。正のコントロールは６
１kDにおいて予期されるルシフェラーゼ・バンドを示
し、ＤＮＡを導入しなかったゼロ・コントロールは、予
期される通りまったくシグナルを示さなかった。ヘリカ
ーゼｃＤＮＡの遺伝子産物においては、明らかに最大の
蛋白質濃度の合成蛋白質のメイン・バンドは、蛋白質ス
タンダード９７.４および２２０kDの間だった。これら
の中に、おそらく蛋白質またはｍＲＮＡ合成の早期の終
結により形成される比較的小さな翻訳産物があった。こ
れらの不完全な翻訳産物はこのサイズの蛋白質として予
想される。

【００９２】Ａ２０Ｒ細胞からの天然蛋白質と試験管内
翻訳の遺伝子産物の直接の比較は、このものが実際に完
全ｃＤＮＡであるとの結果をもたらさなければならな
い。この目的のため、Ａ２０.２ＪおよびＡ２０Ｒの平
行した細胞ライゼートとクローン化されたｃＤＮＡ配列
の試験管内翻訳産物およびゼロ・コントロールがＳＤＳ
−ＰＡＡゲルに供与された。５０μｌの網状赤血球ライ
ゼートの中に１５０から５００ngの間の量の蛋白質が生
産され（ルシフェラーゼ・コントロールに関するプロメ
ガからのデータ）、各バッチの1／10倍量がゲル・ポケ
ットに供されたので、クマシー・ブルーによる染色（１
００ngの蛋白質よりバンドが染色される）は遺伝子産物
を検出するのに十分でなかった。ゆえに、クマシー・ブ
ルー・ブルーの染色の後、Ｘ線フィルムによるオートラ
ジオグラフィーが行われた。フィルムを乾燥ゲルに供す
ることが可能であり、それにより蛋白質バンドの直接の
比較が可能であった（データは示していない）。ヘリカ
ーゼ遺伝子産物を有する、または有しない５μｌの網状
赤血球ライゼート、２０μｌのＡ２０Ｒのライゼートお
よび２３μｌのＡ２０.２Ｊのライゼート（それぞれの
容量はＳＤＳサンプル・バッファーにより３０μｌにさ
れた）が７.５％のＳＤＳゲル（分離ゲル：５％）に供
与された。使用されたマーカーは「レインボー・マーカ
ー」および「クマシー・ブルー・マーカー」だった。Ａ
２０Ｒ細胞ライゼートにおける約１３５kDの、ＲＮＡヘ
リカーゼの過剰発現遺伝子の蛋白質バンドがクマシー・
ブルー染色ゲルにおいて見いだされた。同じゲルについ
て平行して行われたオートラジオグラフィーより、ｃＤ
ＮＡの全長クローンの遺伝子産物のバンドは、Ａ２０Ｒ
における１３５kD蛋白質と同じ高さにあることが示され
た。

【００９３】

【表５】

【００９４】

【表６】

【００９５】

【表７】

【００９６】

【表８】

【００９７】

【表９】

【００９８】

【表１０】

【００９９】

【表１１】

【０１００】

【表１２】

【０１０１】

【表１３】

【０１０２】

【表１４】

【０１０３】

【表１５】

【０１０４】

【表１６】

【０１０５】

【表１７】

【０１０６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：ペプチド存在位置: 1..１１

【０１０７】配列番号：２配列の長さ：１６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：ペプチド存在位置: 1..１６配列 Lys Leu Gly Asp Ile Met Gly Val Lys Lys Glu Thr Glu Pro Asp Lys 1 5 10 15

【０１０８】配列番号：３配列の長さ：１３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：ペプチド存在位置: 1..１３配列 Lys Leu Ile Val Thr Ser Ala Thr Met Asp Ala Glu Lys 1 5 10

【０１０９】配列番号：４配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：ペプチド存在位置: 1..１２

【０１１０】配列番号：５配列の長さ：５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：ペプチド存在位置: 1..５

【０１１１】配列番号：６配列の長さ：１１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：ペプチド存在位置: 1..１１

【０１１２】配列番号：７配列の長さ：１７塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..１７配列ＡＴＧＧＧＮＧＴＮＡＡＲＡＡＲＧＧ 17

【０１１３】配列番号：８配列の長さ：１７塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..１７配列ＧＡＴＡＴＹＡＴＳＧＧＮＧＴＮＡＡ 17

【０１１４】配列番号：９配列の長さ：２０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..２０配列ＡＴＧＧＴＮＧＴＮＡＡＲＡＡＲＧＡＲＡＣ 20

【０１１５】配列番号：１０配列の長さ：２０塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..２０配列ＡＡＲＧＡＲＡＣＮＧＡＲＣＣＮＧＡＹＡＡ 20

【０１１６】配列番号：１１配列の長さ：１８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..１８配列ＲＴＣＣＡＴＮＧＴＮＧＣＮＧＡＮＧＴ 18

【０１１７】配列番号：１２配列の長さ：１８塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..１８配列ＮＧＴＡＧＣＮＧＡＮＧＴＮＡＣＮＡＴ 18

【０１１８】配列番号：１３配列の長さ：２７塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..２７配列ＴＧＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＡＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣ 27

【０１１９】配列番号：１４配列の長さ：２７塩基対配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..２７配列ＧＣＣＧＧＴＧＡＴＴＧＣＣＡＧＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＣＡ 27

【０１２０】配列番号：１５配列の長さ：６１２塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..６１２配列 AAGGAGACGG AGCCGGACAA AGCTATGACA GAAGACGGGA AAGTGGACTA CAGGACGGAG 60 CAGAAGTTTG CAGATCACAT GAAGGAGAAA AGCGAGGCCA GCAGTGAGTT TGCCAAGAAG 120 AAGTCGATCC TGGAGCAGAG GCAGTACCTG CCCATCTTTG CCGTGCAGCA GGAGCTCGTC 180 ACCATCATCA GAGACAACAG CATTGTGGTC GTGGTCGGGG AGACAGGGAG TGGCAAGACC 240 ACTCAGCTGA CCCAGTACTT GCATGAAGAT GGTTACACGG ACTATGGGAT GATCGGGTGT 300 ACCCAGCCCC GGCGTGTGGC TGCCATGTCA GCGGCCAAGA GAGTCAGTGA AGAGATGGGG 360 GGCAACCTTG GAGAAGAGGT GGGCTATGCC ATCCGCTTTG AGGACTGCAC TTCGGAAAAC 420 AACTTGATCA AGTACATGAC GGATGGGATC CTGCTGCGCG AGTCCCTCCG GCAGGCTGAC 480 CTGGACCACT ACAGCGCCGT CATCATGGAT GAGGCCCACG AGCGCTCCCT CAACACCGAC 540 GTGCTTTTTG GGCTGCTCCG GGAGGTTGTG GCTCGAGGCT CAGACCTGAA GCTCATGGTT 600 ACATCGGCTA CT 612

【０１２１】配列番号：１６配列の長さ：２０４配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列の特徴：タンパク質存在位置: 1..２０４配列 Lys Glu Thr Glu Pro Asp Lys Ala Met Thr Glu Asp Gly Lys Val Asp 1 5 10 15 Tyr Arg Thr Glu Gln Lys Phe Ala Asp His Met Lys Glu Lys Ser Glu 20 25 30 Ala Ser Ser Glu Phe Ala Lys Lys Lys Ser Ile Leu Glu Gln Arg Gln 35 40 45 Tyr Leu Pro Ile Phe Ala Val Gln Gln Glu Leu Val Thr Ile Ile Arg 50 55 60 Asp Asn Ser Ile Val Val Val Val Gly Glu Thr Gly Ser Gly Lys Thr 65 70 75 80 Thr Gln Leu Thr Gln Tyr Leu His Glu Asp Gly Tyr Thr Asp Tyr Gly 85 90 95 Met Ile Gly Cys Thr Gln Pro Arg Arg Val Ala Ala Met Ser Ala Ala 100 105 110 Lys Arg Val Ser Glu Glu Met Gly Gly Asn Leu Gly Glu Glu Val Gly 115 120 125 Tyr Ala Ile Arg Phe Glu Asp Cys Thr Ser Glu Asn Asn Leu Ile Lys 130 135 140 Tyr Met Thr Asp Gly Ile Leu Leu Arg Glu Ser Leu Arg Gln Ala Asp 145 150 155 160 Leu Asp His Tyr Ser Ala Val Ile Met Asp Glu Ala His Glu Arg Ser 165 170 175 Leu Asn Thr Asp Val Leu Phe Gly Leu Leu Arg Glu Val Val Ala Arg 180 185 190 Gly Ser Asp Leu Lys Leu Met Val Thr Ser Ala Thr 195 200

【０１２２】配列番号：１７配列の長さ：３６８４塩基対配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：exon 存在位置: 1..３６８４配列 ATGGGGGACA CCAGTGAGGA TGCCTCGATC CATCGATTGG AAGGCACTGA TCTGGACTGT 60 CAGGTTGGTG GTCTTATTTG CAAGTCCAAA AGTGCGGCCA GCGAGCAGCA TGTCTTCAAG 120 GCTCCTGCTC CCCGCCCTTC ATTACTCGGA CTGGACTTGC TGGCTTCCCT GAAACGGAGA 180 GAGCGAGAGG AGAAGGACGA TGGGGAGGAC AAGAAGAAGT CCAAAGTCTC CTCCTACAAG 240 GACTGGGAAG AGAGCAAGGA TGACCAGAAG GATGCTGAGG AAGAGGGCGG TGACCAGGCT 300 GGCCAAAATA TCCGGAAAGA CAGACATTAT CGGTCTGCTC GGGTAGAGAC TCCATCCCAT 360 CCGGGTGGTG TGAGCGAAGA GTTTTGGGAA CGCAGTCGGC AGAGAGAGCG GGAGCGGCGG 420 GAACATGGTG TCTATGCCTC GTCCAAAGAA GAAAAGGATT GGAAGAAGGA GAAATCGCGG 480 GATCGAGACT ATGACCGCAA GAGGGACAGA GATGAGCGGG ATAGAAGTAG GCACAGCAGC 540 AGATCAGAGC GAGATGGAGG GTCAGAGCGT AGCAGCAGAA GAAATGAACC CGAGAGCCCA 600 CGACATCGAC CTAAAGATGC AGCCACCCCT TCAAGGTCTA CCTGGGAGGA AGAGGACAGT 660 GGCTATGGCT CCTCAAGGCG CTCACAGTGG GAATCGCCCT CCCCGACGCC TTCCTATCGG 720 GATTCTGAGC GGAGCCATCG GCTGTCCACT CGAGATCGAG ACAGGTCTGT GAGGGGCAAG 780 TACTCGGATG ACACGCCTCT GCCAACTCCC TCCTACAAAT ATAACGAGTG GGCCGATGAC 840 AGAAGACACT TGGGGTCCAC CCCGCGTCTG TCCAGGGGCC GAGGAAGACG TGAGGAGGGC 900 GAAGAAGGAA TTTCATTTGA CACGGAGGAG GAGCGGCAGC AGTGGGAAGA TGACCAGAGG 960 CAAGCCGATC GGGATTGGTA CATGATGGAC GAGGGCTATG ACGAGTTCCA CAACCCGCTG 1020 GCCTACTCCT CCGAGGACTA CGTGAGGAGG CGGGAGCAGC ACCTGCATAA ACAGAAGCAG 1080 AAGCGCATTT CAGCTCAGCG GAGACAGATC AATGAGGATA ACGAGCGCTG GGAGACAAAC 1140 CGCATGCTCA CCAGTGGGGT GGTCCATCGG CTGGAGGTGG ATGAGGACTT TGAAGAGGAC 1200 AACGCGGCCA AGGTGCATCT GATGGTGCAC AATCTGGTGC CTCCCTTTCT GGATGGGCGC 1260 ATTGTCTTCA CCAAGCAGCC GGAGCCGGTG ATTCCAGTGA AGGATGCTAC TTCTGACCTG 1320 GCCATCATTG CTCGGAAAGG CAGCCAGACA GTGCGGAAGC ACAGGGAGCA GAAGGAGCGC 1380 AAGAAGGCTC AGCACAAACA CTGGGAACTG GCGGGGACCA AACTGGGAGA TATAATGGGC 1440 GTCAAGAAGG AGGAAGAGCC AGATAAAGCT GTGACGGAGG ATGGGAAGGT GGACTACAGG 1500 ACAGAGCAGA AGTTTGCAGA TCACATGAAG AGAAAGAGCG AAGCCAGCAG TGAATTTGCA 1560 AAGAAGAAGT CCATCCTGGA GCAGAGGCAG TACCTGCCCA TCTTTGCAGT GCAGCAGGAG 1620 CTGCTCACTA TTATCAGAGA CAACAGCATC GTGATCGTGG TTGGGGAGAC GGGGAGTGGT 1680 AAGACCACTC AGCTGACGCA GTACCTGCAT GAAGATGGTT ACACGGACTA TGGGATGATT 1740 GGGTGTACCC AGCCCCGGCG TGTAGCTGCC ATGTCAGTGG CCAAGAGAGT CAGTGAAGAG 1800 ATGGGGGGAA ACCTTGGCGA GGAGGTGGGC TATGCCATCC GCTTTGAAGA CTGCACTTCA 1860 GAGAACACCT TGATCAAATA CATGACTGAC GGGATCCTGC TCCGAGAGTC CCTCCGGGAA 1920 GCCGACCTGG ATCACTACAG TGCCATCATC ATGGACGAGG CCCACGAGCG CTCCCTCAAC 1980 ACTGACGTGC TCTTTGGGCT GCTCCGGGAG GTAGTGGCTC GGCGCTCAGA CCTGAAGCTC 2040 ATCGTCACAT CAGCCACGAT GGATGCGGAG AAGTTTGCTG CCTTTTTTGG GAATGTCCCC 2100 ATCTTCCACA TCCCTGGCCG TACCTTCCCT GTTGACATCC TCTTCAGCAA GACCCCACAG 2160 GAGGATTACG TGGAGGCTGC AGTGAAGCAG TCCTTGCAGG TGCACCTGTC GGGGGCCCCT 2220 GGAGACATCC TTATCTTCAT GCCTGGCCAA GAGGACATTG AGGTGACCTC AGACCAGATT 2280 GTGGAGCATC TGGAGGAACT GGAGAACGCG CCTGCCCTGG CTGTGCTGCC CATCTACTCT 2340 CAGCTGCCTT CTGACCTCCA GGCCAAAATC TTCCAGAAGG CTCCAGATGG CGTTCGGAAG 2400 TGCATCGTTG CCACCAATAT TGCCGAGACG TCTCTCACTG TTGACGGCAT CATGTTTGTT 2460 ATCGATTCTG GTTATTGCAA ATTAAAGGTC TTCAACCCCA GGATTGGCAT GGATGCTCTG 2520 CAGATCTATC CCATTAGCCA GGCCAATGCC AACCAGCGGT CAGGGCGAGC CGGCAGGACG 2580 GGCCCAGGTC AGTGTTTCAG GCTCTACACC CAGAGCGCCT ACAAGAATGA GCTCCTGACC 2640 ACCACAGTGC CCGAGATCCA GAGGACTAAC CTGGCCAACG TGGTGCTGCT GCTCAAGTCC 2700 CTCGGGGTGC AGGACCTGCT GCAGTTCCAC TTCATGGACC CGCCCCCGGA GGACAACATG 2760 CTCAACTCTA TGTATCAGCT CTGGATCCTC GGGGCCCTGG ACAACACAGG TGGTCTGACC 2820 TCTACCGGGC GGCTGATGGT GGAGTTCCCG CTGGACCCTG CCCTGTCCAA GATGCTCATC 2880 GTGTCCTGTG ACATGGGCTG CAGCTCCGAG ATCCTGCTCA TCGTTTCCAT GCTCTCGGTC 2940 CCAGCCATCT TCTACAGGCC CAAGGGTCGA GAGGAGGAGA GTGATCAAAT CCGGGAGAAG 3000 TTCGCTGTTC CTGAGAGCGA TCATTTGACC TACCTGAATG TTTACCTGCA GTGGAAGAAC 3060 AATAATTACT CCACCATCTG GTGTAACGAT CATTTCATCC ATGCTAAGGC CATGCGGAAG 3120 GTCCGGGAGG TGCGAGCTCA ACTCAAGGAC ATCATGGTGC AGCAGCGGAT GAGCCTGGCC 3180 TCGTGTGGCA CTGACTGGGA CATCGTCAGG AAGTGCATCT GTGCTGCCTA TTTCCACCAA 3240 GCAGCCAAGC TCAAGGGAAT CGGGGAGTAC GTGAACATCC GCACAGGGAT GCCCTGCCAC 3300 TTGCACCCCA CCAGCTCCCT TTTTGGAATG GGCTACACCC CAGATTACAT AGTGTATCAC 3360 GAGTTGGTCA TGACCACCAA GGAGTATATG CAGTGTGTGA CCGCTGTGGA CGGGGAGTGG 3420 CTGGCGGAGC TGGGCCCCAT GTTCTATAGC GTGAAACAGG CGGGCAAGTC ACGGCAGGAG 3480 AACCGTCGTC GGGCCAAAGA GGAAGCCTCT GCCATGGAGG AGGAGATGGC GCTGGCCGAG 3540 GAGCAGCTGC GAGCCCGGCG GCAGGAGCAG GAGAAGCGCA GCCCCCTGGG CAGTGTCAGG 3600 TCTACGAAGA TCTACACTCC AGGCCGGAAA GAGCAAGGGG AGCCCATGAC CCCTCGCCGC 3660 ACGCCAGCCC GCTTTGGTCT GTGA 3684

【０１２３】配列番号：１８配列の長さ：１２２７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列の特徴：タンパク質存在位置: 1..１２２７配列 Met Gly Asp Thr Ser Glu Asp Ala Ser Ile His Arg Leu Glu Gly Thr 1 5 10 15 Asp Leu Asp Cys Gln Val Gly Gly Leu Ile Cys Lys Ser Lys Ser Ala 20 25 30 Ala Ser Glu Gln His Val Phe Lys Ala Pro Ala Pro Arg Pro Ser Leu 35 40 45 Leu Gly Leu Asp Leu Leu Ala Ser Leu Lys Arg Arg Glu Arg Glu Glu 50 55 60 Lys Asp Asp Gly Glu Asp Lys Lys Lys Ser Lys Val Ser Ser Tyr Lys 65 70 75 80 Asp Trp Glu Glu Ser Lys Asp Asp Gln Lys Asp Ala Glu Glu Glu Gly 85 90 95 Gly Asp Gln Ala Gly Gln Asn Ile Arg Lys Asp Arg His Tyr Arg Ser 100 105 110 Ala Arg Val Glu Thr Pro Ser His Pro Gly Gly Val Ser Glu Glu Phe 115 120 125 Trp Glu Arg Ser Arg Gln Arg Glu Arg Glu Arg Arg Glu His Gly Val 130 135 140 Tyr Ala Ser Ser Lys Glu Glu Lys Asp Trp Lys Lys Glu Lys Ser Arg 145 150 155 160 Asp Arg Asp Tyr Asp Arg Lys Arg Asp Arg Asp Glu Arg Asp Arg Ser 165 170 175 Arg His Ser Ser Arg Ser Glu Arg Asp Gly Gly Ser Glu Arg Ser Ser 180 185 190 Arg Arg Asn Glu Pro Glu Ser Pro Arg His Arg Pro Lys Asp Ala Ala 195 200 205 Thr Pro Ser Arg Ser Thr Trp Glu Glu Glu Asp Ser Gly Tyr Gly Ser 210 215 220 Ser Arg Arg Ser Gln Trp Glu Ser Pro Ser Pro Thr Pro Ser Tyr Arg 225 230 235 240 Asp Ser Glu Arg Ser His Arg Leu Ser Thr Arg Asp Arg Asp Arg Ser 245 250 255 Val Arg Gly Lys Tyr Ser Asp Asp Thr Pro Leu Pro Thr Pro Ser Tyr 260 265 270 Lys Tyr Asn Glu Trp Ala Asp Asp Arg Arg His Leu Gly Ser Thr Pro 275 280 285 Arg Leu Ser Arg Gly Arg Gly Arg Arg Glu Glu Gly Glu Glu Gly Ile 290 295 300 Ser Phe Asp Thr Glu Glu Glu Arg Gln Gln Trp Glu Asp Asp Gln Arg 305 310 315 320 Gln Ala Asp Arg Asp Trp Tyr Met Met Asp Glu Gly Tyr Asp Glu Phe 325 330 335 His Asn Pro Leu Ala Tyr Ser Ser Glu Asp Tyr Val Arg Arg Arg Glu 340 345 350 Gln His Leu His Lys Gln Lys Gln Lys Arg Ile Ser Ala Gln Arg Arg 355 360 365 Gln Ile Asn Glu Asp Asn Glu Arg Trp Glu Thr Asn Arg Met Leu Thr 370 375 380 Ser Gly Val Val His Arg Leu Glu Val Asp Glu Asp Phe Glu Glu Asp 385 390 395 400 Asn Ala Ala Lys Val His Leu Met Val His Asn Leu Val Pro Pro Phe 405 410 415 Leu Asp Gly Arg Ile Val Phe Thr Lys Gln Pro Glu Pro Val Ile Pro 420 425 430 Val Lys Asp Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ile Ile Ala Arg Lys Gly Ser 435 440 445 Gln Thr Val Arg Lys His Arg Glu Gln Lys Glu Arg Lys Lys Ala Gln 450 455 460 His Lys His Trp Glu Leu Ala Gly Thr Lys Leu Gly Asp Ile Met Gly 465 470 475 480 Val Lys Lys Glu Glu Glu Pro Asp Lys Ala Val Thr Glu Asp Gly Lys 485 490 495 Val Asp Tyr Arg Thr Glu Gln Lys Phe Ala Asp His Met Lys Arg Lys 500 505 510 Ser Glu Ala Ser Ser Glu Phe Ala Lys Lys Lys Ser Ile Leu Glu Gln 515 520 525 Arg Gln Tyr Leu Pro Ile Phe Ala Val Gln Gln Glu Leu Leu Thr Ile 530 535 540 Ile Arg Asp Asn Ser Ile Val Ile Val Val Gly Glu Thr Gly Ser Gly 545 550 555 560 Lys Thr Thr Gln Leu Thr Gln Tyr Leu His Glu Asp Gly Tyr Thr Asp 565 570 575 Tyr Gly Met Ile Gly Cys Thr Gln Pro Arg Arg Val Ala Ala Met Ser 580 585 590 Val Ala Lys Arg Val Ser Glu Glu Met Gly Gly Asn Leu Gly Glu Glu 595 600 605 Val Gly Tyr Ala Ile Arg Phe Glu Asp Cys Thr Ser Glu Asn Thr Leu 610 615 620 Ile Lys Tyr Met Thr Asp Gly Ile Leu Leu Arg Glu Ser Leu Arg Glu 625 630 635 640 Ala Asp Leu Asp His Tyr Ser Ala Ile Ile Met Asp Glu Ala His Glu 645 650 655 Arg Ser Leu Asn Thr Asp Val Leu Phe Gly Leu Leu Arg Glu Val Val 660 665 670 Ala Arg Arg Ser Asp Leu Lys Leu Ile Val Thr Ser Ala Thr Met Asp 675 680 685 Ala Glu Lys Phe Ala Ala Phe Phe Gly Asn Val Pro Ile Phe His Ile 690 695 700 Pro Gly Arg Thr Phe Pro Val Asp Ile Leu Phe Ser Lys Thr Pro Gln 705 710 715 720 Glu Asp Tyr Val Glu Ala Ala Val Lys Gln Ser Leu Gln Val His Leu 725 730 735 Ser Gly Ala Pro Gly Asp Ile Leu Ile Phe Met Pro Gly Gln Glu Asp 740 745 750 Ile Glu Val Thr Ser Asp Gln Ile Val Glu His Leu Glu Glu Leu Glu 755 760 765 Asn Ala Pro Ala Leu Ala Val Leu Pro Ile Tyr Ser Gln Leu Pro Ser 770 775 780 Asp Leu Gln Ala Lys Ile Phe Gln Lys Ala Pro Asp Gly Val Arg Lys 785 790 795 800 Cys Ile Val Ala Thr Asn Ile Ala Glu Thr Ser Leu Thr Val Asp Gly 805 810 815 Ile Met Phe Val Ile Asp Ser Gly Tyr Cys Lys Leu Lys Val Phe Asn 820 825 830 Pro Arg Ile Gly Met Asp Ala Leu Gln Ile Tyr Pro Ile Ser Gln Ala 835 840 845 Asn Ala Asn Gln Arg Ser Gly Arg Ala Gly Arg Thr Gly Pro Gly Gln 850 855 860 Cys Phe Arg Leu Tyr Thr Gln Ser Ala Tyr Lys Asn Glu Leu Leu Thr 865 870 875 880 Thr Thr Val Pro Glu Ile Gln Arg Thr Asn Leu Ala Asn Val Val Leu 885 890 895 Leu Leu Lys Ser Leu Gly Val Gln Asp Leu Leu Gln Phe His Phe Met 900 905 910 Asp Pro Pro Pro Glu Asp Asn Met Leu Asn Ser Met Tyr Gln Leu Trp 915 920 925 Ile Leu Gly Ala Leu Asp Asn Thr Gly Gly Leu Thr Ser Thr Gly Arg 930 935 940 Leu Met Val Glu Phe Pro Leu Asp Pro Ala Leu Ser Lys Met Leu Ile 945 950 955 960 Val Ser Cys Asp Met Gly Cys Ser Ser Glu Ile Leu Leu Ile Val Ser 965 970 975 Met Leu Ser Val Pro Ala Ile Phe Tyr Arg Pro Lys Gly Arg Glu Glu 980 985 990 Glu Ser Asp Gln Ile Arg Glu Lys Phe Ala Val Pro Glu Ser Asp His 995 1000 1005 Leu Thr Tyr Leu Asn Val Tyr Leu Gln Trp Lys Asn Asn Asn Tyr Ser 1010 1015 1020 Thr Ile Trp Cys Asn Asp His Phe Ile His Ala Lys Ala Met Arg Lys 1025 1030 1035 1040 Val Arg Glu Val Arg Ala Gln Leu Lys Asp Ile Met Val Gln Gln Arg 1045 1050 1055 Met Ser Leu Ala Ser Cys Gly Thr Asp Trp Asp Ile Val Arg Lys Cys 1060 1065 1070 Ile Cys Ala Ala Tyr Phe His Gln Ala Ala Lys Leu Lys Gly Ile Gly 1075 1080 1085 Glu Tyr Val Asn Ile Arg Thr Gly Met Pro Cys His Leu His Pro Thr 1090 1095 1100 Ser Ser Leu Phe Gly Met Gly Tyr Thr Pro Asp Tyr Ile Val Tyr His 1105 1110 1115 1120 Glu Leu Val Met Thr Thr Lys Glu Tyr Met Gln Cys Val Thr Ala Val 1125 1130 1135 Asp Gly Glu Trp Leu Ala Glu Leu Gly Pro Met Phe Tyr Ser Val Lys 1140 1145 1150 Gln Ala Gly Lys Ser Arg Gln Glu Asn Arg Arg Arg Ala Lys Glu Glu 1155 1160 1165 Ala Ser Ala Met Glu Glu Glu Met Ala Leu Ala Glu Glu Gln Leu Arg 1170 1175 1180 Ala Arg Arg Gln Glu Gln Glu Lys Arg Ser Pro Leu Gly Ser Val Arg 1185 1190 1195 1200 Ser Thr Lys Ile Tyr Thr Pro Gly Arg Lys Glu Gln Glu Glu Pro Met 1205 1210 1215 Thr Pro Arg Arg Thr Pro Ala Arg Phe Gly Leu 1220 1225

【図面の簡単な説明】

【図１】各細胞から取り出された蛋白質と、スタンダー
ドの「コンビテック」との電気泳動パターンを示す写
真。

【図２】ペプチド１〜６に対応するピークを示す図。

【図３】放射標識された遺伝子プローブをハイブリダイ
ズさせた結果得られるバンドを示す写真。

【図４】放射標識された遺伝子プローブをハイブリダイ
ズさせた結果得られるバンドを示す写真。

【図５】放射標識された遺伝子プローブをハイブリダイ
ズさせた結果得られるバンドを示す写真。

【図６】放射標識された遺伝子プローブをハイブリダイ
ズさせた結果得られるバンドを示す写真。

【図７】放射標識された遺伝子プローブを生体の各組織
から得られたものとハイブリダイズさせた結果得られる
バンドを示す写真。

【図８】単離クローンの配列決定および制限酵素マッピ
ングの結果をＡに、ｃＤＮＡ配列中に含まれるホモロジ
ードメインをＢに示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよ
びＡＴＰアーゼの性質を有し、レフルノミドの影響下で
そのｍＲＮＡおよび遺伝子産物が増大した程度まで発現
する蛋白質に対する遺伝子を含むＤＮＡ。
【請求項２】（ａ）表２に表されるＤＮＡ配列を含
み、（ｂ）表３に表されるＤＮＡ配列を含み、（ｃ）
（ａ）または（ｂ）に表されるＤＮＡ分子とストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ配列を
含み、または、（ｄ）遺伝子コードの縮合を考えると
（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に表されるＤＮＡ分子とは
異なるが、（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に表されるＤＮ
Ａ分子により対応して発現される蛋白質の発現を可能に
するＤＮＡ配列を含む、請求項１記載のＤＮＡまたはそ
の部分。
【請求項３】請求項１および２の少なくとも一つに記
載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項４】適当な宿主細胞において、核酸に結合
し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有
する蛋白質の発現のための、請求項３記載の発現ベクタ
ー。
【請求項５】請求項１および２の一つに記載されたＤ
ＮＡによりコードされるｍＲＮＡとハイブリダイズす
る、アンチセンスＲＮＡの発現に対する請求項３記載の
アンチセンス発現ベクター。
【請求項６】請求項１および２の一つに記載されたＤ
ＮＡまたは請求項３ないし５の一つに記載されたベクタ
ーを含む宿主細胞。
【請求項７】核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよ
びＡＴＰアーゼの性質を有し、レフルノミドの影響下で
そのｍＲＮＡおよびその翻訳産物が増大した程度まで発
現する蛋白質。
【請求項８】哺乳動物に由来し、請求項７に記載され
た、核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰア
ーゼの性質を有する蛋白質。
【請求項９】マウス細胞株Ａ２０.２Ｊの誘導株に由
来する、請求項７および８の一つに記載された、核酸に
結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質
を有する蛋白質。
【請求項１０】ヒト細胞株に由来し、請求項７および
８の一つに記載された、核酸に結合し、推定上のヘリカ
ーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質。
【請求項１１】表２に表されたアミノ酸配列またはそ
の一部を含むことからなり、請求項７、８および９の一
つに記載された、核酸に結合し、推定上のヘリカーゼお
よびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質。
【請求項１２】表３に表されたアミノ酸配列またはそ
の一部を含むことからなり、請求項７、８および９の一
つに記載された、核酸に結合し、推定上のヘリカーゼお
よびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質。
【請求項１３】ａ）請求項６に記載された宿主細胞
を培養し、およびｂ）核酸に結合し、推定上のヘリカ
ーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質を単離す
ることからなり、請求項７から１２の一つに記載され
る、核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰア
ーゼの性質を有する蛋白質の製造法。
【請求項１４】例えば、アルツハイマー病、癌、リュ
ーマチ、関節炎、アテローマ性動脈硬化症、骨多孔症、
急性および慢性感染症、自己免疫性疾患、糖尿病および
組織移植の後遺症の治療のための、抗発癌性、抗アテロ
ーマ性動脈硬化症、免疫抑制、抗炎症性、抗ウィルス、
抗菌性および抗バクテリア作用を有する新規な物質を見
いだし、または、すでに公知の物質を同定するためのア
ッセイ系の構成成分としての請求項７から１２の一つに
記載される、核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよび
ＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質の使用。
【請求項１５】請求項１４に記載される、核酸に結合
し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有
する蛋白質の使用であって、ａ）核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰ
アーゼの性質を有する蛋白質の充分量が遺伝子操作法に
より発現され、ｂ）得られた蛋白質は結晶化され、ｃ）その三次元構造が解明され、ｄ）「分子モデル」により、ＡＴＰ結合部位、基質結
合部位またはこれらの機能的エピトープに影響を与える
該蛋白質の活性部位と好適に反応することを目的とする
特異的な調節因子が開発され、そして、ｅ）合成オリゴリボヌクレオチドがマトリックス上に
固定化され相補的な標識オリゴリボヌクレオチドとハイ
ブリダイズされ、その後、核酸に結合し、推定上のヘリ
カーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質が、そ
のヘリカーゼの性質の可能な調節因子の存在下または非
存在下で、特定の測定可能な量の固定化されていない標
識オリゴリボヌクレオチドを拡散することができるとこ
ろの、ヘリカーゼ・アッセイが行われる使用。
【請求項１６】請求項１５に記載される、核酸に結合
し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有
する蛋白質の使用であって、そこでは項目ｅ）のヘリカ
ーゼ・アッセイの代わりにＡＴＰアーゼ・アッセイが行
われる使用。
【請求項１７】請求項１５に記載される、核酸に結合
し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有
する蛋白質の使用であって、そこではヘリカーゼ・アッ
セイの代わりにスプライシング・アッセイが行われる使
用。
【請求項１８】請求項１５から１７の一つに記載され
る、核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰア
ーゼの性質を有する蛋白質の使用であって、そこではア
ッセイがそれぞれの請求項の項目ｅ）のようにミクロタ
イター・プレート上で行われ、極めて多数の考えうる調
節因子が高い効率でその作用を試験される使用。
【請求項１９】請求項１４に記載される、核酸に結合
し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有
する蛋白質の使用であって、そこではヘリカーゼ・アッ
セイが、（ａ）核酸に結合し、推定上のヘリカーゼお
よびＡＴＰアーゼの性質を有する組換蛋白質の発現によ
り、レフルノミド−非抵抗性細胞株におけるレフルノミ
ド抵抗性が達成され、（ｂ）（ａ）において得られた
細胞株が、該蛋白質を不活性化しそれによりレフルノミ
ド抵抗性を消去する、該蛋白質の調節因子のスクリーニ
ングに使用されるような方法で行われる使用。
【請求項２０】核酸に結合し、推定上のヘリカーゼお
よびＡＴＰアーゼの性質を有する蛋白質に特異的に結合
するＲＮＡを単離し、または、そのオリゴリボヌクレオ
チド配列を決定するための、請求項７から１２の一つに
記載された該蛋白質の使用。
【請求項２１】請求項２０に記載された、核酸に結合
し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有
する蛋白質の使用であって、そこでは、（ａ）該蛋白
質またはその一部がマトリックスに連結され、（ｂ）
このように調製されたアフィニティー・マトリックス
が、ＲＮＡ混合物から得られ連結された蛋白質またはそ
の一部に特異的に結合するＲＮＡの増幅に使用される使
用。
【請求項２２】請求項２１に記載された、核酸に結合
し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰアーゼの性質を有
する蛋白質の使用であって、請求項２１の工程（ａ）お
よび（ｂ）に加えて、（ｃ）このようにして増幅され
たＲＮＡ分子は、ＰＣＲリンカーとともに用意され、
（ｄ）ＰＣＲ増幅が行われ、（ｅ）このようにして
得られたＰＣＲ断片が分析される使用。
【請求項２３】請求項７から１２の一つに記載され
る、核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰア
ーゼの性質を有する蛋白質の遺伝子の選択マーカーとし
ての使用。
【請求項２４】請求項７から１２の一つに記載され
る、核酸に結合し、推定上のヘリカーゼおよびＡＴＰア
ーゼの性質を有する蛋白質の遺伝子のベクター構成成分
としての選択マーカーとしての使用。