ES2264132T3 - Proteina que se une a atp y a acidos nucleicos con propiedades de helicasa y atpasa. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TIENE COMO OBJETO LA IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION BIOMOLECULAR Y BIOQUIMICA DE UNA PROTEINA DE UNION AL ATP Y A LOS ACIDOS NUCLEICOS CON LAS CARACTERISTICAS DE HELICASA Y ATPASA, ASI COMO UN PROCEDIMIENTO PARA SU OBTENCION Y UTILIZACION EN SISTEMAS FARMACOLOGICAMENTE RELEVANTES DE ENSAYOS Y PRUEBAS.

Description

Proteína que se une a ATP y a ácidos nucleicos con propiedades de helicasa y ATPasa.

La presente invención tiene por objeto la identificación y caracterización biomolecular y bioquímica de una proteína que se une a ATP y a ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa, así como procedimientos para su preparación y uso en sistemas de ensayo farmacológicamente relevantes.

La modulación de la estructura del ARN es un proceso regulatorio esencial en muchos procesos celulares como, por ejemplo, escisión de pre-mARN, estructuración de espliceosomas, estructuración de ribosomas, traducción de proteínas que se pueden resumir bajo el concepto general de "Regulación de la expresión génica a nivel de ARN". La familia de proteínas llamada "DEAD-Box" de ARN-helicasas putativas, denominada según el motivo característico de aminoácidos Asp-Glu-Ala-Asp (en el código de una letra DEAD), desempeña aquí (en especial para la modulación de la estructura secundaria y terciaria de mARN) un papel clave. A pesar de que los miembros de esta familia y algunas subfamilias poseen diferencias en su función específica y la localización celular, muestran, además de las homologías características de secuencia, también propiedades bioquímicas similares (F.V. Fuller-Pace, Trends in Cell Biology, Vol 4, 1994, 271-274). Las secuencias de proteínas características se conservan arriba en la evolución (S.R. Schmid and P. Lindner, Molecular and Cellular Biology, Vol 11, 1991, 3463-3471). Los miembros de esta familia de proteínas se hallan en diversos virus, bacterias, levaduras, insectos, moluscos, animales vertebrados inferiores hasta mamíferos y son responsables de una gran cantidad de funciones celulares. El hecho de que ya organismos relativamente simples como, por ejemplo, la levadura Saccharomyces cerevisiae, expresen numerosas proteínas de la familia de proteínas DEAD-Box y sus subfamilias, indica que posiblemente cada una de estas proteínas contribuya con la interacción específica con determinadas familias de ARN o ARN (I. lost and M. Dreyfus, Nature Vol 372, 1994, 193-196). Los factores de traducción como, por ejemplo, eIF-4A así como las proteínas comprometidas en el proceso de escisión pre-mARN reconocen en cierta forma secuencias o estructuras blanco de ARN específicas. Sin embargo, hasta ahora sólo había poca información sobre la estructura y la conformación de secuencias características de ARN, que requieren las proteínas DEAD para el reconocimiento y la reacción de ATPasa/ARN-helicasa (A. Pause y N. Sonenberg, Current Opinion in Structural Biology Vol 3, 1993, 953-959).

La familia de proteínas DEAD-Box es actualmente una clase de enzimas en permanente desarrollo que participa en múltiples reacciones para la regulación postranscripcional de la expresión génica. Debido al elevado número de diferentes proteínas DEAD-Box celulares se ha de esperar que determinadas clases de productos génicos, por ejemplo proteínas virales, proteínas de choque térmico, proteínas de anticuerpos y MHC, receptores, ARN, etc., se asignen a ARN-helicasas específicas. Este hecho recomienda miembros de esta familia de proteínas como interesantes blancos farmacológicos para el desarrollo de principios activos.

Dos de las subclases de las proteínas DEAD-Box son proteínas DEAH (con un intercambio específico de aminoácidos) y DEXH (con dos intercambios de aminoácidos en el motivo principal, en donde X es cualquier aminoácido), familias que también colaboran con la replicación, recombinación, reparación y expresión de los genomas de ADN y ARN (Gorbalenya, A.E., Koonin, E.V., Dochenko, A.P., Blinov, V.M., 1989: Nucleic Acids Res. 17, 4713-4729). Las proteínas DEAD-Box y sus subfamilias se reúnen frecuentemente como superfamilia de helicasa II (Koonin, E.V., Gorbalenya, A.E., 1992: FEBS 298, 6-8). Todas comparten siete regiones altamente conservadas. En general, a esta superfamilia II en permanente crecimiento pertenecen hasta ahora más de 70 miembros.

Una representación esquemática de las familias DEAD, DEAH y DEXH (Schmid, S.R., Lindner P., 1991: Molecular and Cellular Biology 11, 3463-3471) muestra la similitud entre las familias. (Los números entre estas regiones muestran las distancias en aminoácidos (AS). X es cualquier AS. De ser conocidas, a las áreas se asignaron funciones.)

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El motivo ATPasa (AXXXXGKT) es una región conservada aminoterminal y se presenta en la mayoría de las proteínas que se unen a nucleótidos, así también en otras proteínas con interacción de ADN y ARN como ADNB (parte del primosoma), UvrD (endonucleasa), factor de elongación 1 y factor de terminación de la transcripción Rho (Ford M.J., Anton, I.A., Lane, D.P., 1988: Nature 332, 736-738).

La segunda región conservada es la llamada DEAD-Box o DEAH, DEXH o DEXX en otras familias de las helicasas y ATPasas dependientes de ácidos nucleicos. Esta región representa el motivo de la ATPasa B. En el mecanismo de reacción, el primer ácido aspártico se une a través de una molécula de agua Mg^{2+} (Pai, E. F., Krengel, U., Petsko, G. A., Gody, R. S., Katsch, W., Wittinghofer, A., 1990: EMBO J. 9, 2351-2359). Mg^{2+} forma, a su vez, un complejo con el fosfato \beta y \gamma del nucleótido y es esencial para la actividad de ATPasa. Las sustituciones de los primeros restos de la región de DEAD en eIF-4A impiden la hidrólisis de ATP y la actividad de ARN-helicasa, pero no el enlace con ATP (Pause, A., Sonenberg, N., 1992: EMBO J. 11, 2643-2654). La región DEAD acopla, además, la actividad de la ARN-helicasa con la actividad de la ATPasa.

La tercera región investigada es la región SAT (a veces también TAT). Por mutación en esta área se suprime la actividad de la ARN-helicasa, pero se mantienen otras propiedades bioquímicas (Pause A. & Sonenberg N., 1992).

La región más carboxiterminal es la región HRIGRXXR que es necesaria para la unión de ARN e hidrólisis de ATP.

De las relaciones antes expuestas, resulta que las ARN-helicasas específicas son blancos atractivos para principios activos farmacéuticos. Dado que se sabe de determinados virus patógenos que pueden causar enfermedades en el ser humano, los animales o las plantas, por ejemplo que llevan en el genoma su propia ARN-helicasa requerida para la replicación precisa (E. V. Koonin, 1991), se supone una aplicación también en la fitoprotección (F. V. Fuller-Pace, Trends in Cell Biology, Vol. 4, 1994, 271-274).

El derivado de isoxazol leflunomida muestra propiedades inhibidoras de la inflamación e inmunosupresoras, sin causar un daño de las funciones existentes del sistema inmune (HWA486; R. R. Bartlett, G. Campion, P. Musikic, T. Zielinski, H. U. Schorlemmer en: A. L. Lewis y D.E. Furst (editores), Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs, Mechanisms and Clinical Uses; C. C. A. Küchle, G. H. Thoenes, K. H. Langer, H. U. Schorlemmer, R. R. Bartlett, R. Schleyerbach, Transplant Proc. 1991, 23:1083-6; T. Zielinski, H. J. Müller, R. R. Bartlett, Agents Action 1993, 38:C80-2). Muchas actividades como la modificación de la activación celular, la proliferación, la diferenciación y la cooperación celular, que se pueden observar en caso de enfermedades autoinmunes, se modulan por leflunomida o bien su metabolito activo A77 1726.

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Algunos estudios acerca del mecanismo de acción molecular de este principio activo remiten a una influencia sobre el metabolismo de las pirimidinas. Dado que la leflunomida se pasa muy rápidamente al organismo en A77 1726, ambas denominaciones en la presente solicitud prácticamente se toman como sinónimos. Es decir, por ejemplo, los término "resistencia a leflunomida" y "resistencia a A77 1726" son idénticos según su sentido.

Los nucleótidos de pirimidina y purina desempeñan un papel clave en procesos biológicos. De esta manera, son portadores de la información genética como componentes de ADN y ARN. La biosíntesis de las pirimidinas contiene la oxidación irreversible del dihidroorotato en orotato, que se cataliza por la enzima dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH). En total seis enzimas se requieren para la síntesis de novo del monofosfato de uridina (UMP). El UMP desempeña un papel clave para la síntesis de las demás pirimidinas: citidina y timidina. La inhibición de DHODH lleva, por este motivo, a una inhibición de la síntesis de novo de la pirimidina. Son afectadas en especial las células inmunes que poseen una gran demanda de nucleótidos, pero sólo pocos de ellos pueden cubrirla por vías secundarias (salvage patway). Los estudios de unión con análogos de leflunomida radiactivamente marcados identificaron la enzima DHODH como posible sitio de acción de A77 1726 y así, la inhibición de DHODH representa un enfoque importante para explicar las actividades inmunomoduladoras observadas a través de leflunomida.

A fin de identificar otros sitios de acción intracelular potenciales de leflunomida, se desarrolló una línea celular resistente a leflunomida (ver también el Ejemplo 1).

Esta resistencia se indujo en la línea celular altamente proliferativa A20.2J (linfoma de células B murino) a A77 1726. Gradualmente se aumentó la concentración de la sustancia en un sistema de cultivo libre de suero, lo cual llevó finalmente al establecimiento de una sublínea estable de nombre A20R. La línea A20R tolera concentraciones de leflunomida 30 a 40 veces mayores que la línea celular original A20.2J (ED_{50} 130 \muM frente a 4 \muM).

Sorprendentemente se halló que, a través de este tipo de tratamiento de una línea celular leucocítica con dosis crecientes pero no tóxicas del principio activo antiproliferativo leflunomida, se estimula la expresión de una ARN-helicasa putativa hasta ahora desconocida, que probablemente le permita a la célula proliferarse por utilización más eficiente de transcripciones existentes, a pesar de la influencia de la sustancia. La presente invención tenía por objeto, por este motivo, generar la ARN-helicasa caracterizada más tarde como proteína DEAH-Box por presión de selección condicionada por el principio activo en una línea celular apropiada, identificar la correspondiente proteína, preparar los anticuerpos monoclonales y policlonales contra la proteína total, partes de la proteína y secuencias peptídicas obtenidas por digestión proteolítica o síntesis de péptidos de una forma convencional y conocida en la literatura, elaborar un procedimiento de purificación para la enzima funcional, identificar, aislar y clonar el gen o secuencias parciales génicas de esta proteína de acuerdo con métodos convencionales y conocidos en la literatura, expresar el gen o secuencias parciales génicas en un sistema apropiado de expresión y caracterizar de forma biomolecular como de forma bioquímicamente estructural y funcional.

En especial, es objeto de la presente invención poner a disposición nuevas helicasas y genes que codifican helicasas, lo cual se logró por medio de secuencias de ADN aisladas de acuerdo con la reivindicación 1 y con proteínas que se unen a ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 7.

Al poner a disposición esta proteína y ARN-helicasas afines, se pueden hallar nuevos principios activos anticancerogénicos, antiateroscleróticos, inmunosupresores, antiinflamatorios, antivirales, antifúngicos y antibacterianos. Se requieren de modo indispensable para una terapia eficaz de un sinnúmero de enfermedades tales como, por ejemplo, mal de Alzheimer, cáncer, reuma, artrosis, aterosclerosis, osteoporosis, enfermedades infecciosas agudas y crónicas, enfermedades autoinmunes, diabetes y después de trasplantes de órganos.

Por ello, un objeto de la invención es una proteína que se une con el ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa de acuerdo con la reivindicación 7, cuyo mARN se expresa marcadamente bajo la influencia de leflunomida o compuestos de acción similar, que proviene preferentemente de un derivado de la línea celular murina A20.2J, y que contiene, con preferencia especial, la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la tabla 2 o partes de ella.

Otro objeto de la invención es DANN de acuerdo con la reivindicación 1, que codifica una proteína que se une a un ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa o partes de ella, en especial con la secuencia de ADN de acuerdo con la tabla 2.

Además, es objeto de la invención un ADN que hibrida en condiciones rigurosas, en especial a 68ºC en solución ExpressHyb (Clontech) en la secuencia de ADN de acuerdo con la tabla 2 o partes de ella.

Otro objeto de la invención es un ADN que, en virtud de su degenerabilidad del código genético, es diferente de las moléculas de ADN que se describieron en los últimos tres párrafos, pero que permite la expresión de las proteínas expresables de acuerdo con las correspondientes moléculas de ADN que se describieron en los últimos tres párrafos.

Más allá de ello, es objeto de la invención un vector que contiene el ADN que codifica la proteína que se une a ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa o partes de ella, y que es apropiado para la expresión de dicha proteína en una célula huésped adecuada que es otro objeto de la invención. Asimismo es objeto de la invención un vector de expresión antisentido que hibrida en condiciones celulares un ARN antisentido que se puede derivar de las moléculas de ADN antes mencionadas.

Otro objeto de la invención son procedimientos para preparar la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa por expresión de la proteína por medio de los vectores mencionados y posterior aislamiento de la proteína con métodos usuales.

Las proteínas que se unen con los ácidos nucleicos con propiedades de helicasa y ATPasa, en especial de las preparadas por técnicas genéticas, se pueden usar, por ejemplo, en un sistema de pruebas o ensayos para hallar nuevas sustancias o identificar sustancias ya conocidas respecto de su acción anticancerogénica, antiaterosclerótica, inmunsupresora, antiinflamatoria, antiviral, antifúngica o antibacteriana para el tratamiento de mal de Alzheimer, cáncer, reuma, artrosis, aterosclerosis, osteoporosis, enfermedades infecciosas agudas y crónicas, enfermedades autoinmunes, diabetes o las consecuencias de un trasplante de órganos.

El sistema de ensayo mencionado se puede conformar de modo tal que se pueden expresar cantidades suficientes de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa, que posiblemente también pueda unir también ARN o proteínas que pueden influir sobre la homeostasis de ARN, de acuerdo con procedimientos de técnica genética, cristalizar la proteína obtenida, clarificar con métodos usuales su estructura tridimensional y luego desarrollar con métodos usuales del "Molecular Modelling" sustancias inhibidoras específicas que interactúan preferentemente con la proteína que se une a ácidos nucleicos con propiedades de helicasa y ATPasa en su sitio de unión con ATP, el sitio de unión con el sustrato o en un sitio que influye sobre estos epitopos funcionales. La prueba de la actividad de la ARN-helicasa se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos conocidos por el especialista, por ejemplo, se pueden fijar oligorribonucleótidos sintéticos a una matriz e hibridarlos con oligorribonucleótidos marcados complementarios, tras lo cual la proteína que se une a ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa puede liberar en presencia o no en presencia de posibles moduladores de su actividad de helicasa una cantidad determinada medible de oligorribonucleótidos marcados, no fijados a la matriz. Un ensayo de este tipo se puede llevar a cabo en placas de microtitulación, con lo cual se pueden evaluar con mucha eficacia el efecto de una gran cantidad de posibles moduladores.

Otro ensayo para moduladores de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa es una mediación de resistencia a leflunomida de células en sí no resistentes a leflunomida por expresión de la proteína recombinante que se une a ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa, con posterior medición de la influencia de posibles moduladores de la proteína respecto de la supervivencia de tales células que se volvieron resistentes en un medio de cultivo con contenido de leflunomida.

Otro ensayo para moduladores de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa son ensayos de ATPasa o de escisión en los que se ensaya la influencia de las propiedades de ATPasa o de escisión de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa por posibles moduladores.

Otro objeto de la invención es el uso de la proteína que se une al ácido nucleico para aislar ARN que se unen específicamente con esta proteína o para calcular su secuencia de oligorribonucleótidos, con preferencia acoplando dicha proteína o partes de ella con una matriz y utilizando la matriz de afinidad preparada de esta manera para enriquecer los ARN, que se unen específicamente con la proteína acoplada o partes de ella, a partir de mezclas de ARN y, con preferencia especial, proveyendo adicionalmente las moléculas de ARN enriquecidas con ligadores de PCR, realizando un enriquecimiento por PCR y analizando los fragmentos de PCR obtenidos de esta manera.

Otro objeto de la invención es el uso del gen para la proteína que se une a ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa como marcador de selección, con preferencia como componente de vectores. En este objeto de la invención, se hace hincapié en que en un análisis Southern-Blot de ADN genómico de células A20R en comparación con ADN genómico de las células A20.2J, el gen, que codifica la proteína que se une con el ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa, ha sufrido una amplificación. La amplificación del gen observada en el ejemplo de este gen por leflunomida o análogos de leflunomida debe utilizarse, entre otras cosas, para la selección de células, así como en la terapia génica. En estos ejemplos, tienen influencia tanto el resultado de la formación de resistencia relativa, como también el resultado del incremento de la expresión.

Por hibridación en condiciones rigurosas se entiende en la presente solicitud la hibridación a 68ºC, solución ExpressHyb (Clontech). El posterior lavado se realiza como se indica en el Ejemplo 6.

Un vector de expresión de una célula huésped adecuado es un vector que, en la célula huésped correspondiente está capacitada para la expresión génica heteróloga y para la replicación (ambas con gran eficacia), ya sea constitutivamente o luego de inducción por medio de métodos usuales.

Un vector de expresión antisentido es un vector que en una correspondiente célula huésped (ver arriba) expresa un ARN antisentido deseado, ya sea constitutivamente o luego de la inducción por medio de métodos usuales.

La invención se detallará ahora por medio de figuras, tablas y ejemplos, sin estar limitada a ellos.

Las figuras y las tablas se describen de la siguiente manera:

Leyendas de las figuras

Figura 1: SDS-PAGE (12% de acrilamida). Las tres huellas de gel izquierdas están coloreadas con un gel de color azul Coomassie, las tres huellas de gel derechas, con un gel de color plateado. M: marcador (Combitek de Boehringer Mannheim); A20.2 J: células A20 normales; A20R: células A20 que son resistentes a 100 \muM de leflunomida. En el caso del gel de color azul Coomassie, se aplicaron por bolsa de gel 100 \mug de proteína, en el caso del gel de color plateado, 5 \mug de proteína. La flecha caracteriza la proteína que se expresa marcadamente en las células A20 resistentes.

Figura 2: Separación peptídica por HPLC. La HPLC se llevó a cabo según las condiciones indicadas en el Ejemplo 1f. En el perfil de elución se numeraron de corrido los seis picos que corresponden a los péptidos 1-6 del Ejemplo 1g. En el eje Y, se indican las unidades de absorción relativa con una longitud de onda de 206 nm, en el eje X se indica el tiempo en minutos.

Figura 3: (A) Curso temporal de la expresión de la ARN-helicasa putativa bajo la influencia de leflunomida con células A20.2J normales en comparación con células A20R resistentes a leflunomida. La hibridación se llevó a cabo con la sonda de ADN radiomarcada A20-5/-6b, cuya secuencia contiene las áreas conservadas de la subfamilia DEAH de proteínas DEAD-Box de la ARN-helicasa putativa. Como marcación de peso molecular se usó el estándar I de longitud de ARN de Boehringer Mannheim. En la primera traza, se aplicó el ARN total de A20R, en la segunda traza, ARN total de A20.2J sin tratamiento de las correspondientes células con A77 1726, en la tercera a sexta traza, ARN total de A20.2J con una incubación de diferente duración de las correspondientes células con 5 \muM de A77 1726 (1 hora, 8 horas, 16 horas, 24 horas). Se aplicaron de cada tanda 20 \mug de ARN total. En la parte (B) se hibridó el mismo Blot que en (A) con una muestra de \beta-actina para control.

Figura 4: (A) Experimento Northern para la expresión de la ARN-helicasa putativa con depósito de leflunomida en el caso de células A20R resistentes a leflunomida. El control era el ARN de células A20R que se habían incubado con 100 \muM de leflunomida (traza 1). Se hibridó con la sonda de ADN A20-5/6b. Las trazas 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 8 contenían cada una 15 \mug de ARN total de células A20R que habían sido incubadas sin leflunomida durante los períodos de 1, 2, 3, 4, 5, 14 días y 5 meses. (B) Hibridación de control del mismo Blot con una muestra de \beta-actina. Los Blots siempre se muestran con la correspondiente evaluación cuantitativa.

Figura 5: Northern-Blot con aprox. 2 \mug de Poli (A) ARN por traza de ocho distintos tejidos humanos. Las trazas 1-8 contienen de derecha a izquierda tejido de corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas. El ARN se separó por electroforesis en un gel de agarosa desnaturalizado al 1,2%, y luego se sometió a blot sobre una membrana de nylon cargada positivamente, luego se fijó por reticulación cruzada con UV. Se hibridó con la sonda de ADN A20-5/6b. Se indica la correspondiente evaluación cuantitativa en el Blot.

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Figura 6: (A) Resultados de la secuenciación y el mapeo de restricción de los clones positivos aislados. Los clones 1 a 4 se superponen y tiene la secuencia hs1/hs2 en el inserto. 1/3 y 2 tienen un sitio de intersección Sph I común. cADN 4 está completo en cADN 2. El clon 5 se distingue por el tamaño (6,5 kb), los sitios de restricción y el faltante hs1/hs2-cADN de los demás clones. (B) Dominios de homología en la secuencia de cADN. Los dominios de homología están enmarcados y entre los dominios se indica la distancia en aminoácidos. El dominio NLS posee homología con el "nuclear localisation site" del antígeno T.

Tabla 1: (A) Construcción del cebador de un área parcial de la proteína 135 kDa de A20R sobreexpresada. Las series de letras anteriores caracterizan los aminoácidos en un código de una letra, debajo se indica la secuencia de nucleótidos. Las secuencias de aminoácidos escritas entre paréntesis se detallan comenzando con su extremo C-terminal y se derivan de secuencias de ADN que son complementarias a las secuencias de cebadores indicadas aquí. Se indica en cada caso el código genético degenerado. Dado que la tercera base del codón a menudo no es clara, se sintetizó una mezcla de todas las bases que se tienen en cuenta, para obtener en cada caso la correspondiente base para el correspondiente AS. N es la abreviatura para las cuatro bases (G, A, T, C). I es la abreviatura de inosina, cuyos pares de bases están acompañados tanto de bases de purina como de pirimidina. R = A, G; Y = T, C; S = G, C. En el caso de A20-2, A20-3, A20-4 y A20-5 se trata de un cebador degenerado corriente arriba. A20-6a y A20-6b son cebadores corriente abajo. La distancia media de los cebadores corriente arriba y corriente abajo entre sí es de aprox. 600 nucleótidos. En el caso del cebador A-20-6b indicado en 6, se igualó a propósito el nucleótido 16 con N, de modo que aquí en la cadena complementaria correspondiente se codifica tanto isoleucina (ATT, ATC, ATA) como también metionina (ATG). Este hecho no modificó el éxito de la PCR realizada, pero de esta manera aparece erróneamente una metionina como el último de los seis aminoácidos en la secuencia de acuerdo con la tabla 2 y no la correcta isoleucina. (B) Cebadores, derivados del clon humano cADN B 185; 7 = cebador corriente abajo; 8 = cebador corriente arriba.

Tabla 2: Secuenciación del área parcial de la ARN-helicasa putativa de células A20R resistentes a leflunomida. Por debajo de la secuencia de bases (1-612) se indica la correspondiente secuencia de aminoácidos con el código de una letra. Como último de los seis aminoácidos es correcta la isoleucina y no la metionina; Para explicación, ver las leyendas de las figuras de la tabla 1. El fragmento de ADN indicado se usó como sonda A20-5/-6b para los experimentos de hibridación.

Tabla 3: Secuencia del área codificadora del cADN total (4272 bp de longitud total). De la posición de las homologías con la secuencia de ratón, resultó que era correcto el primer marco de lectura. Las secuencias codificadoras están entre la posición 148 y 3831 y dan como resultado una secuencia de 1227 aminoácidos. (* = detención).

Tabla 4. Similitudes de la proteína humana hallada con las proteínas DEAH-Box.

Ejemplo 1

Preparación de las células resistentes a leflunomida Medio

El cultivo de la línea de partida, el cultivo de la sublínea A20R resistente, así como los ensayos de proliferación para controlar la resistencia cruzada de las células A20R se efectuaron en un medio sin suero de preparación propia. El medio seco para 10 litros de medio Iscove (Biochrom, Berlín) se disolvió en 10 litros de agua bidestilada. A la solución se añadieron luego:

13,95 g de NaCl

11,43 g de NaHCO_{3}

700 mg de KCl

10 ml de solución de NaOH al 35%

0,5 ml de solución de mercaptoetanol 1 molar

y el medio se filtró en condiciones de esterilidad (todas las sustancias de Riedel de Häen). Antes de usar, se añadió un litro de medio Iscove:

32 mg de holo-transferrina humana

1 g de albúmina bovina

1,5 ml de lípidos

(todas las sustancias de Sigma).

Descripción de la línea de partida A20.2J

A20.2J es una sublínea de linfoma de células B de ratón A20 (ATCC TIB-208) y como línea de fusión en ATCC se describe para la línea celular LS 102.9 (ATCC HB-97). Las células se caracterizaban por una alta proliferación (tiempo de duplicación aprox. 10 horas) y una elevada sensibilidad (50% de inhibición de la proliferación de las células en 2 \muM de sustancia) respecto de A77 1726 (el metabolito principal de leflunomida). Como línea celular que crece de forma no adherente, las células se podían cultivar fácilmente.

Descripción del cultivo de la resistencia

Las células A20.2J se cultivaron en principio durante 5 días en medio Iscove con 1 \muM de A77 1726 (concentración por debajo del 50% de inhibición de la proliferación) y se controló el crecimiento celular, así como la vitalidad de las células. Cada 2 ó 3 días se transfirieron las células a medio fresco, al que se había añadido la misma concentración de A77 1726. Cuando después de 5 días de cultivo se podía reconocer un crecimiento de las células y ningún índice elevado de mortalidad (máximo 30% de células muertas), se aumentó gradualmente la concentración de A77 1726. Al estancarse la proliferación de las células, se usó la concentración del último pasaje. Después de cultivar durante un año, se había establecido una sublínea A20R resistente estable que mostraba, en presencia de 100 \muM de A77 1726, una proliferación constante y ninguna diferencia morfológica con la línea de partida A20.2J.

Prueba de proliferación

5\cdot10^{5} células se incubaron en 5 ml de medio Iscove en placas de 6 cavidades (Greiner) durante 48 horas a 37ºC y 10% de CO_{2}.

Una cavidad se aplicó como valor de referencia positivo:

- Para A20.2J: células en medio Iscove

- para A20R: células en medio Iscove + 100 \muM de A77 1726. A las células de las cavidades restantes se pipetearon sustancias de ensayo en diversas concentraciones. Después del tiempo de incubación, las células se resuspendieron en la cavidad, se extrajeron 100 \mul de suspensión celular y se diluyeron en solución de eosina al 1% (1 g de eosina amarillenta de Riedel de Häen en 100 ml de solución isotónica estéril de cloruro de sodio). Las células se contaron en una cámara de recuento de Neubauer y se calculó la proporción de células muertas (coloreadas con eosina). La modificación de la proliferación inducida por la sustancia se calculó respecto del control positivo.

Prueba 2

4\cdot10^{3} células se pipetearon en un volumen de 100 \mul de medio Iscove en placas de microtitulación de fondo redondo de 96 cavidades (Nunc). Las sustancias de ensayo se aplicaron con doble concentración a partir de la concentración de ensayo deseada y se pipetearon 100 \mul de esta solución a las células. Las placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC y 10% de CO_{2}. La proliferación se determinó por marcación radiactiva de células que dividen su ADN. A ello se añadió, después del tiempo de incubación, a cada cavidad 25 \mul de ^{3}H-timidina (10 \muCi/ml; actividad específica 29 Ci/mMol; empresa Amersham) y se incubó durante otras 16 horas. Para ponderar el ensayo, se recogieron células de las placas por medio de un equipo recolector de células (Skatron) sobre filtro de fibra de vidrio (Pharmacia), en donde no se midió ^{3}H-timidina introducida en frascos especiales de residuos y donde sólo se midió la radiactividad celular unida a ADN. Los filtros se termosoldaron en bolsas plásticas y para la medición se cerraron herméticamente en casetes de recuento tras añadir 10 ml de centelleador (Pharmacia). La medición se realizó en un contador beta (Beta-Plate-System 1206 de la empresa Wallac). Tal como se indicó en el Ensayo 1, se calculó la modificación de la proliferación de las sustancias de ensayo respecto de los correspondientes controles positivos.

Ejemplo 2

Ensayo de la resistencia de las células A20R

1. Resistencia cruzada respecto de las sustancias antiproliferativas conocidas en la literatura: Se ensayaron diversas sustancias antiproliferativas conocidas en la literatura en diversas concentraciones (como se describió en el ensayo de proliferación 2) en cuanto a su propiedad antiproliferativa de células A20R y A20.2J. En la siguiente tabla, se representa la inhibición calculada de una concentración de estas sustancias en ambas líneas celulares. En comparación con la línea de partida A20.2J, se debe exponer si en las células A20R había una mayor resistencia general frente a las sustancias antiproliferativas.

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Sustancias de		% de inhibición	% de inhibición
ensayo		de A20.2J	de A20R
Metotrexato	(0,15 \muM)	75,9	65,2
Cisplatino	(10 \muM)	44,7	91,1
Ciclosporina A	(0,25 \muM)	69,9	77,5
Ácido micofenólico	(0,15 \muM)	89,8	76,8

2. Resistencia cruzada respecto de sustancias con estructura afín, símil A77 1726. Como no había una resistencia general de las células A20R a las sustancias antiproliferativas, se debía probar si análogos con estructura afín de A77 1726 poseían la misma propiedad inhibidora de la proliferación de células A20R, como de células A20.2J. En ensayo se realizó por medio de la prueba de proliferación 1. En la siguiente tabla se detallan comparativamente valores de IC-50 (la concentración de una sustancia que inhibe la proliferación de las células en un 50%).

Sustancias de	Valor de IC-50	Valor de IC-50
ensayo	de A20.2J	de A20R
A77 1726	2-3 \muM	130 \muM
X92 0715	8 \muM	120 \muM
X91 0279	10 \muM	120 \muM
X91 0325	10 \muM	75 \muM

Las células A20R muestran una resistencia cruzada que se reduce gradualmente a análogos de A77 1726B con estructura afín, lo cual permite deducir una resistencia específica de la estructura.

3. Resistencia cruzada de las células A20R a brequinar:

Los ensayos previos respecto del mecanismo de acción de leflunomida indicaron paralelismos con brequinar (Dupont-Merck). Por este motivo, brequinar se incluyó en las pruebas de resistencia cruzada de A20R.

Se calcularon los valores de IC-50 de las células A20.2J y A20R respecto de la sal sódica de brequinar con ayuda del ensayo de proliferación 1.

	Valor de IC-50	Valor de IC-50
	de A20.2J	de A20R
Sal de Na^{+} de brequinar	0,2 \muM	50-75 \muM

En resumen, se puede decir que las células A20R muestran, respecto de su comportamiento de crecimiento, una resistencia cruzada a análogos de A77 1726 y brequinar, una sustancia que inhibe DHODH.

Ejemplo 3

Ensayo de células A20R respecto de proteínas MDR

Las separaciones electroforéticas en gel de las proteínas celulares de las células A20.2J y A20R mostraron que se sobreexpresó una proteína con un peso molecular de aprox. 135 kDa (calculado con marcadores ricos en proteína) en la línea resistente (ver también Figura 1). La primera suposición era que, en este caso, se trata de un fenómeno MDR (Multi-Drug-Resistance, "resistencia a multifármacos").

La MDR (Multi-Drug-Resistance) se define como una resistencia de las células a las sustancias antineoplásicas estructuralmente no afines. Las células tumorales reaccionan por sobreexpresión de una glucoproteína de la membrana plasmática que puede bombear sustancias tóxicas celulares dependientes de ATP fuera de la célula. Por sobreexpresión de estas proteínas de MDR (135-180 KD), las células sobreviven también en grandes concentraciones de sustancias antiproliferativas.

Las proteínas MDR pueden inhibirse por medio de bloqueadores del canal de calcio en su función como bombas de esclusión, lo cual conduce a una acumulación de la sustancia en la célula. A ambas líneas celulares se añadieron, por este motivo, bloqueadores del canal de calcio conocidos en la literatura y asimismo sustancias asociadas a MDR, a fin de verificar si la línea resistente sobreexpresa proteínas MDR. Como bloqueadores del canal de calcio se usaron verapamil, como sustratos de MDR daunorrubicina y doxorrubicina. Los resultados se representan más abajo en forma de tabla como % de inhibición de la proliferación y se calcularon con la ayuda del ensayo 2.

\vskip1.000000\baselineskip

Adición de 300 nM de	Adición de 300 nM de
daunorrucibina	doxorrubicina
Verapamil (nM)	A.20.2J	A20R	A20.2 J	A20R
0	10,7%	6,8%	2,7%	9,1%
100	33,4%	20,7%	19,9%	24,9%
200	49,6%	31,7%	30,4%	48,7%
400	54,0%	42,4%	40,4%	47,3%

\vskip1.000000\baselineskip

Ambas líneas celulares se inhiben por medio de las dos sustancias en igual medida. Las células A20R resistentes no muestran una gran aceptación por medio de una mayor expresión de MDR.

Se seleccionó la misma tanda de ensayo para verificar su A77 1726 es una molécula transportadora de MDR.

\vskip1.000000\baselineskip

Verapamil	A20.2J + 1,6 \muM	A20R + 62,5 \muM
(nM)	de A77 1726	de A77 1726
0	16,4%	10,3%
100	14,3%	6,4%
200	12,5%	9,9%
400	7,9%	13,9%

\vskip1.000000\baselineskip

En el caso de las líneas celulares se pudo comprobar que A77 1726 no es transportado por proteínas MDR.

Ejemplo 4

Purificación micropreparativa de una proteína 135 kD a.) Preparación de las muestras para la determinación de las proteínas a.1) Determinación de las proteínas según Popov

(Popov et al.: Acta Biol. Med. Germ. 34, p.1441-1461)

Principio: Se precipitan soluciones diluidas de proteínas con negro de amida/metanol/ácido acético como pellet coloreado, se lavan, se toman en NaOH 0,1 M y se mide la extinción a 620 nm.

El cálculo del contenido proteico resulta por medio de una curva de calibración con soluciones de BSA (BSA = albúmina de suero bovino).

Observación: Esta determinación de proteínas no se ve influida por detergentes (SDS, Nonidet, etc.), asimismo no perturba la presencia de \beta-mercaptoetanol. Se deberían utilizar recipientes originales Eppendorf®, ya que la adhesión del pellet a la superficie del plástico es fuerte y, así, se evitan pérdidas de proteína por desprendimiento del pellet al verter las soluciones de lavado.

Se requieren las siguientes soluciones:

"Solución Popov 1":

0,65 g de negro de amida

Agitar 50 ml de Popov 2 por lo menos durante 1 h, se puede conservar sólo una semana.

\vskip1.000000\baselineskip

"Solución Popov 2":

50 ml de ácido acético glacial

450 ml de metanol

\vskip1.000000\baselineskip

"Solución Popov 3":

4 ml de Popov 1

36 ml de Popov 2, luego filtrar

\vskip1.000000\baselineskip

Confección de la curva de calibración:

Aplicar la solución de BSA: se aplica albúmina bovina, de Sigma, al 98-99% en una concentración de 1 mg/ml en solución al 5% de SDS. Se prepara una gran cantidad de solución que se deposita en porciones de 1 ml a -25ºC. Se derrite una porción de 1 ml y luego se agita vigorosamente durante 10 minutos a 95ºC en el Thermomixer (Eppendorf Thermomixer 5436). Después de enfriar, se realizaron las siguientes diluciones:

\vskip1.000000\baselineskip

10 \mul de solución	990 \mul de solución de	0,010 mg de
de BSA.	SDS al 5%.	BSA/ml
25 ''	975 ''	0,025 ''
50 ''	950 ''	0,050 ''
75 ''	925 ''	0,075 ''
100 ''	900 ''	0,100 ''
150 ''	850 ''	0,150 ''
200 ''	800 ''	0,200 ''
sin ''	1000 ''	valor ciego

\vskip1.000000\baselineskip

De todas las 8 soluciones, se extraen dos veces 200 \mul (determinación doble) por vez, se mezclan con 600 \mul de "Popov 3", luego se mezcla breve y vigorosamente (vortex).

A continuación: centrifugar durante 5 minutos a 14000 rpm en una centrífuga de mesa (Eppendorf), se descarta el sobrenadante. Luego se lava el pellet tres veces con 750 \mul de "Popov 2" por vez y se centrifuga. Después del último proceso de lavado, se extrae el pellet en 1 ml de NaOH 0,1 M y se mide la extinción en una cubeta de plástico (d = 1 cm) respecto del valor ciego a 620 nm (fotómetro espectral de la empresa Kontron).

Ejemplo para una serie de medición:

Concentración de BSA	Extinción a 620 nm
(mg/ml)
0	0
0,010	0,0459
0,025	0,1154
0,050	0,2442
0,075	0,4025
0,100	0,4964
0,150	0,6856
0,200	0,9534

El coeficiente de correlación en la evaluación: La concentración de proteína/extinción es, según la experiencia, de 0,995-0,999 (en este ejemplo, de 0,998)

a.2) Preparación de muestras/determinación de proteínas de las células A 20

Se centrifugan 10^{7} células A20 (el término células A20 significa A20.2J y A20R), presentes en 1 ml de tampón PBS, en un palso de 5 a 10 segundos con 10^{4} rpm en la centrífuga de mesa (Eppendorf modelo 5415 C). El sobrenadante se descarta, el pellet se mezcla con 1 ml de solución de SDS al 5%, se absorbe varias veces con una pipeta y así se homogeneiza y se agita vigorosamente durante aprox. 95ºC en el Thermomixer y luego se enfría.

De esta solución se mezclan:

20 \mul con 980 \mul de solución de SDS al 5% - dilución de 50 veces, así como 50 \mul con 950 \mul '' '' \rightarrow 20 veces '' y se agita vigorosamente durante 10 minutos a 95ºC en el Thermomixer y se enfría. Luego se extraen de cada solución para determinaciones dobles dos veces 200 \mul, se mezclan con 600 \mul de "Popov 3" y se sigue tratando tal como se describió previamente para BSA. La evaluación se realiza por medio de la curva de calibración recién descrita.

Valores medidos obtenidos:

Dilución	Extinción a 620 nm	Concentración de proteínas \times
		factor de dilución (mg/ml)
50 veces	0,0972	0,915
20 veces	0,1800	0,720

Resultado: las células A20 contienen aprox. 800 \mug de proteína.

b.) Preparación de las muestras para SDS-PAGE

Se centrifugan 10^{7} células A20, presentes en 1 ml de tampón de PBS, en un lapso de 5 a 10 segundos con 10^{4} rpm en la centrífuga de mesa (Eppendorf modelo 5415 C).

b.1) Lisis directa

Se descarta el sobrenadante, el pellet se mezcla con 400 \mul de tampón de muestra y se homogeneiza por múltiple absorción con la pipeta, se agita vigorosamente (agitador Vortex) y se agita durante 5 a 10 minutos a 95ºC en el termoagitador antes mencionado o en baño de agua. La concentración de proteínas de esta solución altamente viscosa es de aprox. 2 mg/ml. Para un gel coloreado de Coomassie se requieren de esta solución 40 a 50 \mul/sobre de muestra, correspondientes a 80 - 100 \mug de proteína. Para geles coloreados de Ag, se diluye luego la solución descrita 1 : 20, 40 a 50 \mul corresponden así a una concentración de proteínas de 4 a 5 \mug/sobre de muestra.

Composición del tampón de muestra:

\vskip1.000000\baselineskip

Millipore-H_{2}O	2,7 ml
Glicerina, al 98%	10,0 ml
0,25 M de Tris/1 M de glicina	9,0 ml
25% de solución de SDS	6,8 ml
0,1% de solución de azul de bromofenol	2,5 ml
2-Mercaptoetanol	4,0 ml

\vskip1.000000\baselineskip

b.2) Congelamiento de las células y posterior lisis

El pellet celular se sumerge de inmediato en el recipiente Eppendorf hermético durante aprox. 1 minuto en nitrógeno líquido y se conserva a -80ºC. Para la lisis, el tampón de muestra se vierte directamente sobre el pellet celular congelado.

c.) SDS-PAGE

Se usaron distintos geles de poliacrilamida (10%, 12%, 4 a 22,5% de PAA). Se obtuvieron los mejores resultados en cuanto a la nitidez de banda con geles de gradiente, cuyo contenido de PAA era del 4 al 10%. Las técnicas/soluciones necesarias para ello se describen a continuación:

Gel de separación

Composición de las soluciones de gel para gel de gradiente al 4 - 10% de AA para un gel (aprox. 24 ml):

\vskip1.000000\baselineskip

Componente	4% de solución	10% de solución
	de AA	de AA
H_{2}O	7 ml	-
Glicerina	-	6,1 g
Solución madre 1	1,6 ml	4 ml
3 M de Tris, pH 8,8	3 ml	3 ml
10% de APS	80 \mul	40 \mul
10% de SDS	120 \mul	120 \mul
TEMED	10 \mul	10 \mul
Solución madre 1: 30% de acrilamida/0,5% de N,N-metilenbisacrilamida
Enlace cruzado: 1,7%
APS: persulfato de amonio
Gel colectivo

Composición de la solución de gel con 3,8% de AA para dos geles (aprox. 10,5 ml):

Componente
H_{2}O	3,7 ml
Solución madre 2	4,0 ml
0,5 M de Tris, pH 6,8	2,5 ml
10% de APS	200 \mul
10% de SDS	100 \mul
TEMED	12 \mul

El gel se vierte de acuerdo con métodos estándar y se fija en una cámara de electroforesis vertical después de una suficiente polimerización. Para un gel coloreado de Coomassie/plata, se vierten de la muestra A20 descrita en b) 40 \mul = 80 \mug/4 \mug de proteína por cada sobre de muestra.

Como estándar de peso molecular sirvieron los marcadores "Combitek" de Boehringer Mannheim, cuyo intervalo de peso molecular en el tampón de muestra reductor alcanza de 170 a 14 kD.

Composición del tampón eluyente de electroforesis:

Dilución lista para usar con Milli Q-H_{2}O

SDS	0,1%
Tris	50 mM
Glicina	200 mM

Condiciones de corriente: aprox. 5 horas a 35 mA/gel (tensión de 400 V) al utilizar un gel con las dimensiones 17 x 18 x 0,1 cm.

Coloraciones:

1. Coloración de Coomassie

Secuencia	Tiempo	Composición de la solución
Fijación/coloración	20-30 min	\begin{minipage}[t]{75mm} 0,2% de azul brillante de Coomassie R 250 en 50% de metanol/10% de ácido acético/40% de H_{2}O\end{minipage}
Decoloración	indistinta, cambiar la	20% de i-propanol, 7% de ácido acético, 3% de glice-
	solución varias veces	rina, 70% de H_{2}O

\vskip1.000000\baselineskip

2. Coloración de Ag (coloración transformada de Heukeskoven)

Secuencia	Tiempo	Composición de la solución
Fijación	30 min	\begin{minipage}[t]{75mm} 40% de etanol, 10% ácido acético, 50% de H_{2}O\end{minipage}
Incubación	2-24 h	\begin{minipage}[t]{75mm} 0,40 g de tiosulfato de sodio *5 H_{2}O + 5,00 g de acetato de sodio + 60 ml de etanol justo antes de usar: + 1,0 ml de glutardialdehído (al 25%), completar con H_{2}O hasta 200 ml\end{minipage}

(Continuación)

Secuencia	Tiempo	Composición de la solución
Lavado	3 x 5-10 min	H_{2}O
Coloración	45 min	\begin{minipage}[t]{75mm} 200 mg de nitrato de plata justo antes de usar: + 40 ml de glutardialdehído al 35%, completar con H_{2}O hasta 200 ml\end{minipage}
Lavado	10 s	H_{2}O
Desarrollo	2-10 min	\begin{minipage}[t]{75mm} 5 g de carbonato de sodio justo antes de usar: + 20 ml de glutardialdehído al 35%, completar con H_{2}O hasta 200 ml\end{minipage}
Detención	10 min	Na_{2}EDTA al 1,5% * 2 H_{2}O

Todas las etapas antes mencionadas se llevan a cabo con un ligero movimiento (mesa de agitación) en 200 ml/gel.

Antes de fotografiar/escanear/secar o fundir en bolsas de plástico, el gel se incuba durante varias horas hasta la noche en H_{2}O bidestilada.

Conservación: Los geles fundidos se conservan a temperatura ambiente o bien en un refrigerador (temp: >0ºC) apilados, dentro de lo posible, protegidos de la luz.

Ponderación/evaluación de los geles

En el intervalo molecular alto (entre bandas marcadoras 170 y 116 kD), se pueden reconocer bandas de proteínas que se expresan mucho más en el caso de las células A20 resistentes. Esto se puede observar tanto con la coloración de Coomassie como de plata (ver Fig. 1).

Afirmación acerca del peso molecular

De los ocho estándares de calibración, se aplicó la distancia de cada una de las proteínas en el gel del 4 al 10% en relación con el logaritmo del peso molecular. De la banda de proteínas antes mencionada con distancia conocida, se pudo calcular así el peso molecular. La distancia total era de 11,2 cm.

Den. de proteínas del	M_{r} (D)/log	Distancia	Valor
marcador Combitek	M_{r}	(cm)	R_{f}
\alpha_{2}-Macroglobulina	170000/5,230	4,37	0,39
(plasma de caballo)
\beta-Galactosidasa (E. coli)	116353/5,066	5,78	0,516
Fructosa-6-fosfato-quinasa	85204/4,930	7,20	0,643
(músculo de conejo)
Glutamato-deshidrogenasa	55562/4,745	8,35	0,746
(hígado bovino)
Aldolasa (músculo de conejo)	39212/4,593	9,17	0,819
Triosafosfato-isomerasa	26626/4,425	10,00	0,893
(músculo de conejo)
Inhibidor de tripsina (soja)	20100/4,303	10,33	0,922
Lisozima (albúmina de huevo)	14307/4,156	10,63	0,949
Proteína desconocida,	?	5,58-	0,500
5 aplicaciones		5,655,60

El valor medio de los cinco valores de aplicación de la proteína desconocida está indicado entre paréntesis. El coeficiente de correlación era de 0,977. El peso molecular calculado es de M_{r} 135 kDa.

Ponderación densitométrica para la indicación de cantidades

En el sistema Bio Image® (empresa Millipore, Eschborn) se realizó en el "whole band-menu" una cuantificación de las bandas de un gel de PAA coloreado con Coomassie (4 al 10%) con células A 20 resistentes (A20R). Resultado con cinco vías ponderadas con diferente contenido proteico:

\vskip1.000000\baselineskip

Cantidad de	IOD = densidad óptica integrada, (%)
proteína total (\mug)	de 135 kD de banda de proteínas
80	1,07
80	1,03
60	1,05
60	1,04
40	1,32

\vskip1.000000\baselineskip

Según ello, la proporción de la proteína de 135 kD en células A20 resistentes es de aprox. 1%. En células A20 normales (A20.2 J), no se pudo calcular cuantitativamente esta banda con una aplicación de 80 \mug de proteína, ya que se pueden reconocer sólo levemente en comparación con las células resistentes.

Otras informaciones que se obtienen con SDS-PAGE: En el caso de una elaboración de muestras, se modificó el tampón de muestra descrito en a) al no añadir mercaptoetanol. En esta condición, las proteínas no se separan en subunidades que se forman por puentes S-S.

Resultado: No se produjo alteración alguna del peso molecular de la proteína 135 kD.

d.) Acumulación micropreparativa de la proteína 135 kDa

La cantidad de proteína necesaria para la secuenciación se indica en general con 100 pMol, ello equivale a aprox. 14 \mug de proteína. Con una cuidadosa ponderación (en comparación con la concentración del marcador), se estimó la concentración de la proteína 135 kDa con una aplicación total de 80 \mug en 0,3 \mug. Se prepararon 16 geles (PAA 4 al 10%) con un total de 104 de las bandas de 135 kDa. La cantidad de proteína total aplicada era siempre de
80 \mug.

e.) Digestión de la proteasa en el gel de poliacrilamida

Después de la coloración de SDS-PAGE y Coomassie, se recortaron las bandas de gel y, en el lapso de un día, se lavaron hasta neutralidad cambiando varias veces el H_{2}O. Las piezas de gel se prensaron luego a través de un tamiz de 32 \mum (en una punta sin cánula). La pasta fina de gel se evaporó luego en una centrífuga al vacío hasta casi sequedad.

A continuación se realizó la adición de enzima/tampón; se añadió endoproteinasa LYS-C (Boehringer Mannheim) con un exceso de 10 veces. Se incubó durante 6 a 7 horas a 37ºC, luego se eluyó durante varias horas con 1 ml: 60% de acetonitrilo/0,1% de TFA, a 37ºC. Se retiró el sobrenadante con pipeta y se repitió la elución durante la noche a temperatura ambiente. El sobrenadante se retiró con pipeta, se combinó con el primer sobrenadante, se filtró repetidas veces a través de un filtro de 0,02 \mum (Anatop® de Merck) y se evaporó en una centrífuga al
vacío.

Antes de inyectar en la HPLC, se diluye con 10-20% de ácido fórmico.

f.) Separación de péptidos en la HPLC Condiciones de medición

Columna:	Superspher® 60 RP Select B
Eluyente A:	0,1% de TFA (ácido trifluoroacético) en H_{2}O
Eluyente B:	0,1% de TFA en acetonitrilo
Columna:	Superspher® 60 RP Select B
Gradiente:	t [min]	% de B
	0	0
	60	60
	65	70
Flujo:	0,3 ml/min
Longitud de onda de medición:	206 nm

El resultado se muestra en la Figura 2.

g.) Análisis automático de secuencias de proteínas N-terminales según Edmanr (analizador Beckmann)

Péptido 1	KLG DI MGVK KE (SEQ ID NO: 1)
Péptido 2	KLG DI MGVK KETEPDK (SEQ ID NO: 2)
Péptido 3	KLIVTSATMDA E K (SEQ ID NO:3)
Péptido 4	DATSDLAIIARK (SEQ ID NO:4)
Péptido 5	KIFQ K (SEQ ID NO:5)
Péptido 6	TP O EDYV E AAV (SEQ ID NO:6)

Los picos correspondientes a los péptidos 1 a 6 están marcados en la Figura 2.

h.) Comparación de bancos de datos con secuencias de proteínas conocidas

Las secuencias peptídicas obtenidas muestran parcialmente una fuerte homología con una proteína derivada de la secuencia génica de Caenorhabtitis elegans, cuya función es desconocida. Están marcados los aminoácidos que no concuerdan con esta secuencia (ver punto g.). La homología extraordinariamente potente del péptido 3 (se sabe de la literatura que esta SAT-Box en proteínas DEAD-Box de bacterias a mamíferos está muy conservada) con la secuencia de C. elegans y la faltante o débil concordancia con el péptido 4 o el péptido 2 son un claro indicio de que la proteína según la invención es un nuevo representante de la clase de las proteínas DEAD-Box.

Los siguientes ejemplos describen experimentos biomoleculares realizados. En este caso, se suponen conocidos los métodos estándar biomoleculares de base, que están descritos, por ejemplo, en "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", 2.ª edición de Sambrook et al., publicados en Cold Spring Harbor Laboratory Press. Estas técnicas son, por ejemplo, preparación ADN de plásmido, minipreparación de plásmido, maxipreparación de plásmido, elución de fragmentos de ADN de geles de agarosa, elución por filtración, elución por adsorción, modificación enzimática de ADN, digestión de ADN por endonucleasas de restricción, transformación de E. coli, preparación de ARN, preparación de ARN con el método monoetapa (según Chomzynski), preparación de mARN con Dynabeads®, electroforesis de ARN en gel, Northern-Blot, marcación radiactiva de ADN, marcación de ADN "Random primed" con [\alpha-32P]dATP, secuenciación de ADN según el método de didesoxi, preparación de cADN a partir de ARN total, marcación no radiactiva de ácido nucleico, marcación de ADN "Random primed" con digoxigenina (DIG), detección de los ácidos nucleicos marcados con DIG.

\newpage

Ejemplo 5

Acumulación por PCR de un fragmento de cADN correspondiente a las secuencias de aminoácidos halladas

Las reacciones se llevaron a cabo con un ciclador Perkin Elmer. Para 50 \mul de una tanda estándar de PCR, se pipetearon los siguientes componentes en hielo y se recubrieron con 50 \mul de aceite mineral:

1 \mul de DNS de plantilla (0,5-2,5 ng)

1 \mul de cebador hacia adelante (30 pmol/\mul)

1 \mul de cebador de reversa (30 pmol/\mul)

5 \mul de mezcla de dNTP (2 mM por nucleótido)

5 \mul de 10x tampón de PCR

36,5 \mul de H_{2}O

0,5 \mul de Taq-polimerasa (2,5 unidades)

La amplificación se realizó en 40 ciclos en las siguientes condiciones:

1.

Etapa: Desnaturalización de la doble cadena de ADN a 94ºC, 30 s.

2.

Etapa: Depósito del cebador en las cadenas individuales de ADN a 50ºC, 2 min.

3.

Etapa: Síntesis de ADN a 72ºC, 3 min.

En el último ciclo, se realizó la síntesis de ADN durante 5 min y la tanda se enfrió luego hasta 4ºC. Para el análisis se analizaron 10 \mul de la tanda sobre un gel de agarosa al 1 - 2%.

Cebador hacia adelante: A20-2, A20-3, A20-4, A20-5 (ver tabla 1)

Cebador de reversa: A20-6a, A20-6b (ver tabla 1)

Matriz: A20R-ARN total

Los cebadores hacia adelante y de reversa se combinaron de a pares en reacciones de PCR. La tanda A20-3/A20-6b llevó a la acumulación de un aADN de aprox. 630 bp, que se reamplificó para verificar su especificidad con combinaciones de los cebadores A20-3, A20-4 y A20-5 con el cebador A20-6b. Para aumentar la exigencia, se seleccionó en la reamplificación una temperatura de depósito de 55ºC y se realizaron únicamente 35 ciclos de PCR. Después de la clonación y secuenciación del fragmento obtenido (nombre: A20-5/-6b) con métodos estándar, se obtienen los datos de secuencias mostrados en la tabla 2.

Ejemplo 6

Hibridación Northern

Como solución de hibridación se empleó una solución ExpressHyb® lista para usar de la empresa Clontech que une en una hora de tiempo de hibridación la sonda génica antes marcada (radiactiva o no radiactiva) con la secuencia de ADN complementaria eventualmente existente del filtro de soporte.

Reactivos requeridos de forma adicional:

20xSSC: 3 M de NaCl; 0,3 M de citrato de sodio (pH 7,0)

Solución de lavado 1: 2x SSC; 0.05% de SDS

Solución de lavado 2: 0,1x SSC; 0,1% de SDS

Solución de lavado 3: 2x SSC; 0,1% de SDS

1. Hibridación con sondas génicas no marcadas radiactivamente con la solución ExpressHyb® (Clontech)

La solución ExpressHyb® se calentó hasta 68ºC y se agitó para que no quedaran precipitados. Después se prehibridó la membrana (10x10-cm) en al menos 5 ml de solución ExpressHyb®, mezclando a 68ºC durante una media hora de forma continua en un horno para hibridación. La sonda de ADN no marcada radiactivamente se combinó con 5 ml de solución frasca ExpressHyb®. Luego se reemplazó la solución de prehibridación por esta solución ExpressHyb® y se dejó en incubación el Blot durante una hora a 68ºC en el horno para hibridación. Después de la incubación, se lavó a temperatura ambiente durante 30 min con 20 ml de la solución de lavado 3 (por 100 cm^{2} de membrana), y se reemplazó la solución una vez. La segunda etapa de lavado se realizó a 50ºC durante 30 min con solución de lavado 2. También aquí se reemplazó la solución una vez. Después se dejó chorrear la solución de lavado excedente de la membrana y luego se pudo usar la membrana directamente para la detección con quimioluminiscencia.

2. Hibridación con sondas génicas marcadas radiactivamente con la solución ExpressHyb® (Clontech)

La hibridación se realizó como en el caso de la sonda de ADN no marcada radiactivamente. Después de incubar, se lavó con solución de lavado 1 durante 30-40 min a temperatura ambiente con reemplazo múltiple de la solución. La segunda etapa de lavado se realizó con solución de lavado 2 durante 40 min a 50ºC. En este caso se reemplazó la solución una vez. Luego se dejó chorrear aquí la solución de lavado excedente y se fundió el Blot en una lámina plástica. El Blot se expuso en un casete de exposición a -70ºC o se ponderó en un Phosphoimager (BIORAD).

El ARN y la sonda de hibridación utilizados se indican en cada caso en las leyendas de las figuras.

3.) Curso temporal del nivel de mARN de la ARN-helicasa putativa bajo la influencia de leflunomida en células A20.J y A20R

El experimento está representado en la Figuras 3A y 3B y la correspondiente leyenda de figura. En este caso, se muestra en todas las células investigadas (A20.2J y A20R) una banda del tamaño 4,4 kb. Las A20R emiten una señal muy fuerte, las células A20.2J sólo una señal débil pero que, después del tratamiento de estas células, se hace algo más fuerte durante una u ocho horas con A77 1226. A77 1226 no induce significativamente la formación del mARN aquí ensayado.

4.) Curso temporal del nivel de mARN de la ARN-helicasa putativa con depósito de A77 1226

El experimento está representado en la Figuras 4A y 4B y la correspondiente leyenda. Después de depositarse A77 1226, se reduce el nivel de mARN del mARN ensayado en el período de observación (hasta 5 meses).

5.) Nivel de mARN de la ARN-helicasa putativa en ocho tejidos humanos diferentes

El experimento está descrito en la figura 5 y la correspondiente leyenda. Se muestra que los niveles de mARN en los tejidos investigados son diferentes. Como la expresión de mARN está correlacionada con la resistencia a leflunomida (ver 3), los órganos musculares como el corazón y la musculatura esquelética son posiblemente menos sensibles a la leflunomida.

Ejemplo 7

Homologías de la ARN-helicasa putativa murina con un clon humano de cADN

La secuencia de aminoácidos KLGDIMGVKK de un área parcial de la ARN-helicasa putativa de células A20R resistentes a leflunomida expresada de modo diferencial se halló en un registro del clon de cADN B 185 (Homo sapiens) en el banco de datos de EM NEW (nuevos registros EMBL). De esta manera era posible preparar cebadores apropiados para la PCR que servían en una PCR con un banco de cADN humano como matriz para enriquecer un cADN correspondiente a una ARN-helicasa putativa humana. Los nuevos cebadores corriente arriba y corriente abajo están reproducidos en la tabla 1 como cebadores Nros. 7 y 8 (7 = hs1, 8 = hs2).

Las condiciones de PCR se mantuvieron rigurosas, ya que los cebadores eran complementarios a la secuencia blanco. La hibridación se realizó durante 45 s a 55ºC, la desnaturalización durante 30 s a 94ºC y la síntesis sólo durante 45 s a 72ºC. El motivo para la breve fase de desnaturalización y síntesis era la conocida longitud del inserto esperable (246 bp). Las relaciones de concentración de la PCR se seleccionaron según el estándar de acuerdo con el Ejemplo 5. Como matrices sirvieron tres distintos bancos de cADN humanos (preparados a partir de 1. células T periféricas, 2. células precursoras mieloides HI-60 estimuladas con PMA, 3. placenta). Se obtuvo en cada caso un fragmento de 246 bp de longitud por PCR, cuya secuencia responde a la de los nucleótidos 1431 a 1672 de la Tabla 3.

Ejemplo 8

Obtención del clon de cADN humano completo que codifica el gen de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa putativas por hibridación de colonias

Debido a los resultados de los experimentos de Northern Blot (Ejemplo 6), se usó para el control un banco de cADN preparado a partir de músculo esquelético humano. Como sonda se utilizó la secuencia hs1/hs2. Para la síntesis de sondas de ADN marcadas se amplificó hs1/hs2 ADN por medio de PCR con los cebadores hs1 y hs2 y el clon hs1/hs2 (vector: pCR™II) como plantillas y luego se purificó con electroforesis de gel de agarosa y elución fenólica. Para la marcación de DIG con ayuda de cebadores aleatorios ("random primed labeling") se empleó 1 \mug de hs1/hs2-ADN com plantilla y después de 20 horas de tiempo de reacción, se obtuvieron aprox. 2 \mug de sondas de ADN marcadas por 1 \mug de rendimiento de plantilla. Para verificar la especificidad de la sonda, se fijó una serie de diluciones de hs1/hs2 ADN de 0,1 pg a 10 ng sobre una membrana de nylon y se hibridó con la sonda hs1/hs2 marcada con DIG. Se mostró que 5-25 ng de sonda por ml de solución de hibridación eran suficientes para detectar débilmente 10 pg de hs1/hs2 ADN y claramente a partir de 100 pg de hs 1/hs2 ADN (Hybond N +).

Para el primer control del banco de genes, se plaquearon por 150 mm de placa de agar aprox. 40000 colonias, en total se prepararon 20 placas maestras, de modo que se plaquearon aprox. 800000 colonias individuales. Con esta cantidad de colonias, parecía suficiente la probabilidad de que con una cantidad dada por el fabricante de clones independientes de 1,1x10^{6} estaba el clon buscado entre los plaqueados. Se prepararon 2 de un total de 40 filtros de replicación que se sometieron a hibridación con sonda DIG. Para esta hibridación se utilizó una concentración de sonda de 25 ng/ml. Para la detección se expusieron las membranas durante 2 horas a películas de rayos X. Resultaron, en 5 placas diferentes, un total de 19 clones positivos. De 19 clones positivos del control primario, se confirmaron 5 clones en el control secundario. Estos clones se aislaron y caracterizaron. Resultaron para los clones los siguientes tamaños estimados de insertos:

Clon 1	1,6 kB
Clon 2	3,5 kB
Clon 3	1,6 kB
Clon 4	0,9 kB
Clon 5	6,5 kB

Por medio de otra caracterización, se secuenciaron los clones y se compararon las secuencias parciales obtenidas, así como los mapas de restricción. La comparación de las secuencias entre sí confirmó la suposición de que el clon 1 y el clon 3 eran casi idénticos. Resultó que los clones 1 a 4 correspondían a una secuencia génica que contenía la secuencia de hs1/hs2-cADN y tenía una longitud estimada de 4,5 kB. Parecía estar incluida la terminal completa 5' y la cola poli-A del mARN. La longitud total permitía inferir que se trataba de la secuencia total que sería necesaria para la expresión de una proteína 135 kD. Una representación esquemática muestra la orientación de los cADNs entre sí y la ubicación de la secuencia hs1/hs2 utilizada para el control (Figura 6A).

En comparación con los demás clones, el clon 5 parecía presentar diferencias. La secuenciación de este clon no dio como resultado superposiciones con las otras secuencias y no hay indicio de la posición de la secuencia hs1/hs2 en el clon. Ya en el curso del análisis de restricción, el plásmido 5 mostraba características especiales que dejaban suponer que no provenía del mismo gen como los demás clones. También la longitud extraordinaria del inserto de 6,5 kB estimados habló por un cADN aislado en virtud de artefactos de hibridación de modo que se retrotraería transitoriamente su investigación.

El clon 1 y el clon 2 se secuenciaron por completo. Los datos de la secuenciación están representados en la tabla 3.

Se trataba de una secuencia de ADN de 4,3 kB de longitud total, en donde el clon 1 era igual a 1590 y el clon 2 igual a 3210 pares de bases de longitud y se superponían en un área de 530 pares de bases. La secuencia conocida hasta ahora hs1/hs2 estaba entre la posición 1430 y la posición 1672. La ubicación de esta secuencia era un indicio de que el primero de los seis marcos de lectura (que comenzaba con la primera base) era el correcto. En este marco de lectura había dos codones de parada: uno en la posición de la base 58 (TGA) y uno en la posición 3729 (TGA), tras lo cual siguió una cola poli-A corriente abajo a aprox. 300 pares de bases. Después de la primera detención, siguió en la posición 148 un codón de metionina, que parece ser un posible codón de inicio para la traducción, ya que no sólo era el primer codón ATG en la secuencia, sino que también presentaba características de una secuencia de inicio Kozak, a saber un resto de purina (G) en la posición -3 y G en la posición +4. Casi 1000 pares de bases más adelante aparece el siguiente codón ATG, más precisamente dos codones de metionina. El segundo codón podría ser asimismo un codón de inicio debido al ambiente -una A en -3 y una G en +4-. Como en el 90-95% de los casos de iniciación de la traducción de mARN de animales vertebrados el primer codón de metionina que aparece en el marco de lectura es al mismo tiempo el codón de inicio, también se tomó esto para el presente caso. Partiendo de esta suposición, la secuencia codificaría una proteína de 1227 AS de largo. Con un peso medio de 110 Dalton por aminoácido, esto equivaldría a una proteína de casi 135 kD. Debido al tamaño de la proteína, el marco de lectura ininterrumpido y el codón de inicio relativamente claro, en el caso de la secuencia se trata muy probablemente del cADN completo.

Con una observación más precisa, se pudo determinar el área de homología con la secuencia murina 05/6b. La comparación de la secuencia 05/6b de la línea celular murina A20R con la secuencia humana hallada dio una discrepancia de 15 aminoácidos de 245, lo cual equivalía a una discrepancia porcentual de aprox. el 6%.

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Ejemplo 9

Dominios de homología en la secuencia humana hallada y similitudes con otras proteínas

La comparación de secuencias con los dominios de homología de la superfamilia II de posibles helicasas dio como resultado que todos los dominios conservados de la familia de proteínas DEAH estaban presentes en la secuencia humana (figura 6B).

El primer dominio -el motivo ATPasa A comienza con el aminoácido 655. En los dominios, discrepan sólo un total de dos aminoácidos de la secuencia de homología: Una prolina en lugar de una treonina en el dominio IV y un serina en lugar de una isoleucina en el dominio VI. Además, la distancia del primer dominio de homología con el término N con 654 aminoácidos era 150 restos más grande que en el caso de las proteínas DEAH-Box conocidas hasta la fecha. Otra discrepancia leve es la distancia entre los dominios IV y V: En vez de 75 a 80 restos de aminoácidos, hay aquí sólo 74 restos entre medio. Por lo demás, la proteína derivada del cADN humano se puede clasificar claramente debido a las homologías mostradas en la familia de las proteínas DEAH-Box. Por otra parte, en el término N de la secuencia se identificó una secuencia de aminoácidos que presenta, respecto del "nuclear localisation site" (NLS) del antígeno T des SV 40, fuertes homologías. Esta homología NLS comienza con el aminoácido 69 y tiene 10 restos de longitud.

Para la siguiente caracterización de la secuencia de helicasa putativa, se realizó una comparación de secuencias en el programa GCG con "genembl", "swissprot" y "pir" a nivel de ADN y proteínas.

El análisis de banco de genes dio homologías con algunas proteínas ya conocidas de la familia de proteínas DEAH (Tabla 4).

Como proteína con las más fuertes homologías se identificó K03H1.2 de C. elegans. Esta proteína se clasificó, a su vez, debido a dominios de homología existentes, como posible proteína DEAH-Box (Wilson et al., 1994, Nature 368: 32-38). Fragmentos de péptidos originalmente secuenciados de la proteína 135 kD de células A20R presentaron asimismo similitudes con la secuencia de C. elegans. Este resultado había proporcionado precozmente indicios de que se podría tratar, en el caso de la proteína sobreexpresada en A20R, de una posible ARN-helicasa. Además, se identificó una proteína homóloga en un 60% a nivel de ADN, que fue clonada en 1994 a partir de células HeLa y denominada HRH1 (Ono et al., 1994, Molecular and Cellular Biology. 14: 7611-7620) - asimismo una posible ARN helicasa humana-. Otros homologías de aprox. el 50% a nivel de proteínas se comprobaron a nivel de las proteínas respecto de los factores de escisión PRP 2, 16 y 22 de S. cerevisiae, asimismo miembros de la familia DEAH (Chen y Lin, Nucl. Acids Res. 18: 6447, 1990; Schwer y Gutrie, Nature 349: 494-499, 1991; Company et al., Nature 349: 487-493, 1991). También se hallaron significativas homologías con las proteínas DEXH MLE de D. melanogaster (Kuroda et al., 1991, Cell 66: 935-947) y la posible ADN-helicasa II nuclear -NDH II- de bovino (42 y 43% a nivel de proteínas) (Zhang et al., 1995, J. Biol. Chem. 270: 16422-16427).

Ejemplo 10

Expresión in vitro de la ARN-helicasa putativa humana

Por medio de lisado de reticulocito de conejo se realizó una traducción in vitro del cADN obtenido. Para ello se aplicaron en diversas tandas de ADN linealizado y circular entre 0,5 y 2,0 \mug. Como control positivo sirvió ADN de luciferasa provisto por Promega. La traducción se realizó con T7-polimerasa. Por introducción de ^{35}S-metionina se marcó el producto génico y así se pudo visualizar en el autorradiograma después de separación en un gel desnaturalizado de SDS-PAA (no se muestra).

Todas las tandas dieron, de modo independiente de la cantidad de ADN aplicadada, buenos resultados, con lo cual el ADN circular se tradujo algo más eficazmente que el ADN linealizado. El control positivo mostró la banda esperada de luciferasa a 61 kD, el control cero sin ADN no dio, según la invención, ninguna señal. En el caso de los productos génicos de helicasa-cADN, la banda principal de proteína sintetizada con la concentración de proteína más fuerte estaba entre los estándares de proteínas de 97,4 y 220 kD. Por debajo se podían reconocer bandas más débiles de productos de traducción, que probablemente se habían producido por la rotura precoz de la síntesis de proteína o de mARN. Estos productos de traducción incompletos han de esperarse con una proteína de este tamaño.

Una comparación directa entre la proteína nativa de células A20R y el producto génico de la traducción in vitro debería asegurar que efectivamente se trataba del cADN completo. Para ello se aplicaron en un gel de SDS-PAA lisados celulares paralelos de células A20.2J y A20R, así como el producto de traducción in vitro de la secuencia clonada de cADN y el control cero. Como en la tanda de 50 \mul del lisado de reticulocitos se produjeron cantidades de proteínas de entre 150 y 500 ng (datos de Promega respecto del control de luciferasa) y 1/10 de la tanda se aplicó sobre una bolsa de gel, la coloración de Coomassie (a partir de un contenido de proteína de 100 ng se pueden colorear las bandas) no fue suficiente para la detección del producto génico. Por ello se confección adicionalmente a la coloración de Coomassie un autorradiograma con una película de rayos X. La película se pudo colocar luego sobre el gel seco, con lo cual fue posible una comparación directa de las bandas de proteínas (no se muestra). Sobre el gel de SDS al 7,5% (gel de separación: 5%) se aplicaron 5 \mul de lisado de reticulocitos con y sin producto génico de helicasa, 20 \mul de lisado de A20R y 23 \mul de lisado de A20.2J (volúmenes completados en cada caso con tampón de SDS hasta 30 \mul). Como marcadores se usaron un "Rainbow-Marker" y un marcador de Coomassie. Se mostró que con aprox. 135 kD en lisados celulares A20R, la banda de proteína del gen sobreexpresado de la ARN-helicasa aparece en el gen coloreado con Coomassie. El mismo gel superpuesto con el correspondiente autorradiograma muestra que la banda del producto génico del clon de cADN de longitud total está a la misma altura que la proteína 135 kD en A20R.

TABLA 1

4

TABLA 2 (SEQ ID NO:15 + 16)

5

TABLA 2 (continuación)

6

TABLA 3 (SEQ ID NO:17 + 18)

7

8

9

10

11

12

13

14

\newpage

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr
\cr}

15

TABLA 4

Proteína/	Organismo	Concordancias	Funciones en	Propiedades
secuencia			la célula	bioquímicas
K03h1.2	C. elegans	65%	posible ARN- helicasa	?
			dependiente de ATP
HRH1	Hombre	60%	homólogo humano de PRP 22	?
PRP16	S. cerevisiae	51%	segunda etapa en escisión	ATPasa de
			pre-mARN; supresor de	pendiente de
			mutaciones en "branch point"	ARN
PRP2	S. cerevisiae	50%	primera etapa en escisión	ATPasa de
			pre-mARN;	pendiente de
				ARN
PRP22	S. cerevisiae	49%	liberación de mARNn	?
			escindido del espleisosoma
MLE	D. melanogaster	43%	compensación de dosificación -	?
			compensación del cromosoma
			X faltante en machos
NDH II	bovino	42%	desconocido	actividad de
				ARN- y ADN-
				helicasa

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Hoechst Aktiengesellschaft

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: -

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

LUGAR: Francfurt

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO FEDERADO: -

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Alemania

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 65926

\vskip0.500000\baselineskip

(G)

TELÉFONO: 069-305-3005

\vskip0.500000\baselineskip

(H)

TELEFAX: 069-35-7175

\vskip0.500000\baselineskip

(I)

TELEX: 4 1 234 700 ho d

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA SOLICITUD: Proteína que se une a ATP y a ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa putativas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

CANTIDAD DE SECUENCIAS: 18

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(iv)

FORMA LEGIBLE POR COMPUTADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

SOPORTE DE DATOS: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPA)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..11

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Gly Asp Ile Met Gly Val Lys Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\newpage

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..16

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Gly Asp Ile Met Gly Val Lys Lys Glu Thr Glu Pro Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..13

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Ile Val Thr Ser Ala Thr Met Asp Ala Glu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..12

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Ala Thr Ser Asp Leu Ala Ile Ile Ala Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 5 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..5

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ile Phe Gln Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: péptidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..11

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Pro Gln Glu Asp Tyr Val Glu Ala Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..17

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGGNGTNA ARAARGG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ONS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..17

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATATYATSC GNGTNAA

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..20

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGTNGTNA ARAARGARAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..20

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AARGARACNG ARCCNGAYAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..18

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

RTCCATNGTN GCNGANGT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..18

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NGTAGCNGAN GTNACNAT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..27

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTGATCTGC AAACATCTGC ACTGTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..27

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGGTGATT GCCAGTGAAG GATGCCA

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 612 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..612

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 204 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..204

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3684 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNS (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: exón

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..3684

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1227 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

FORMA DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: proteína

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 1..1227

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

22

23

24

25

26

Claims (15)

1. ADN aislado que contiene el gen para una proteína que se une a ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa, seleccionado del grupo compuesto por:

a) un ADN que contiene una secuencia de ADN de acuerdo con la tabla 2;

b) un ADN que contiene una secuencia de ADN que está en condiciones de hibridar con la molécula de ADN según (a) en condiciones rigurosas;

c) un ADN que contiene una secuencia de ADN que es distinta de las moléculas de ADN en virtud de la degenerabilidad del código genético de acuerdo con (a) o (b), pero que permite la expresión de las proteínas expresables de acuerdo con las moléculas de ADN de acuerdo con (a) y (b);

d) partes de moléculas de ADN de acuerdo con (a), (b) o (c).

2. ADN de acuerdo con la reivindicación 1, cuyo mARN y producto génico se expresan más marcadamente bajo la influencia de leflunomida.

3. Vector que contiene un ADN de acuerdo con al menos una de las reivindicaciones 1 y 2.

4. Vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 3 para la expresión de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa en una célula huésped apropiada.

5. Vector de expresión antisentido de acuerdo con la reivindicación 3 para la expresión de un ARN antisentido que hibrida con el mARN que es codificado por el ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2.

6. Célula huésped que contiene un ADN de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 ó 2 o un vector de acuerdo con una de las reivindicaciones 3 a 5.

7. Proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa, cuyo mARN y cuyo producto de traducción se expresan más marcadamente bajo la influencia de leflunomida, que contiene la secuencia de aminoácidos de acuerdo con la tabla 2 o partes de ella con propiedades de helicasa y ATPasa.

8. Proteína que se une con el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, que proviene de una línea celular de mamífero.

9. Proteína que se une con el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7, que proviene de un derivado de la línea celular murina A20.2J.

10. Procedimiento para la preparación de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque

a)

se cultiva una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6 y

b)

se aísla la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa.

11. Uso de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 9 para aislar ARN que se unen específicamente a esta proteína o calcular su secuencia de oligorribonucleótidos.

12. Uso de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque

a) se acopla dicha proteína o partes de ella con una matriz,

b) se usa la matriz de afinidad preparada de esta manera para acumular los ARN, que se unen específicamente con la proteína acoplada o partes de ella, a partir de mezclas de ARN.

13. Uso de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque se proveen adicionalmente a las etapas (a) y (b) de la reivindicación 12

a) las moléculas de ARN enriquecidas de esta manera con ligadores de PCR,

b) se realiza un enriquecimiento por PCR y

c) se analizan los fragmentos de PCR obtenidos de esta manera.

14. Uso del gen de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 11 como marcadores de selección en la selección de células respecto de leflunomida o análogos de leflunomida.

15. Uso del gen de la proteína que se une al ácido nucleico con propiedades de helicasa y ATPasa de acuerdo con una de las reivindicaciones 7 a 11 como marcadores de selección como componente de un vector en la selección de células respecto de leflunomida o análogos de leflunomida.