KR19990029028A - p16 발현 작제물 및 암 치료에서의 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양 생물학 및 암 치료 분야에서 시험관내 및 생체내 모두에서 용도가 밝혀진 다양한 유전자 작제물에 관한 것이다. 특히 발현 작제물은 p16 암호화 영역 및 p16 전사체의 발현에 필요한 또다른 조절 인자를 함유하도록 제공된다. 발현 작제물의 한 양태는 복제-결핍 아데노바이러스성 벡터이다. 또한 세포주의 형질전환 및 암세포 증식 억제 방법을 제공한다.

Description

ｐ16 발현 작제물 및 암 치료에서의 이의 용도
암은 매년 미국에서 526,000명의 사망에 관여하는 사람 질병의 주요 원인중 하나이다(참조: Boring et al., 1993). 폐암만으로 미국에서 매년 140,000명 이상의 사람이 사망한다. 최근에, 폐암으로부터 연령에 따른 치사도가 여성에 있어서의 유방 암의 치사도보다도 능가하였다. 비록 흡연-감소 프로그램의 이행이 흡연 유행을 감소시키고 있다고는 하나, 폐암 치사율은 21세기에 이르러서도 매우 높은 상태로 남아있다. 불행하게도, 방사선 치료요법, 수술 및 화학치료요법을 포함하는 현재의 암 치료방법은 제한된 효능을 갖는 것으로 공지되어 있다. 폐암에 대한 새로운 치료요법의 비례적인 발전은 분자 수준에서의 암 생물학의 개선된 이해도에 따른다.
분자 유전학 및 생물학에서의 발전과 더불어, 정상 유전자의 변형된 발현이 암 세포의 생성을 초래하는 형질전환 현상을 개시할 수 있음이 명백해졌다. 화학치료요법 및 방사선치료요법과 같은 악성종양에 대한 통상의 치료요법은 특수한 표적화없이 구성 세포를 사멸시키는데 집중되어 왔으며, 이는 흔히 위험한 부작용을 초래하였다. 암 치료요법에 있어서의 새로운 방향은 정상 유전자를 이동시켜 돌연변이된 유전자를 대체하거나 교정시킴으로써 형질전환된 세포의 악성 발현형을 변경하는 것이다. 몇개의 발현 작제물이 유전자를 체세포내로 고 효율로 이동시키기 위해 개발되어왔다.
세포는 양성(자극성) 및 음성(저해성) 방식 모두로 조절된다. 세포 성장의 음성 조절에 있어서의 상실은 흔히 악성 세포에서 발견된다. 축적되어진 분자 유전적 현상은 정상 세포에 있어서 음성 조절인자의 상실 또는 양성 조절인자의 증가가 이러한 세포 성장의 비정상화를 유발할 수 있음을 나타내고 잇다. 종양 서프레서라고도 불리어지는, 대부분의 음성 조절인자(참조: Marx, 1993; Grunicke and Maly, 1993)는 세포 주기의 직접적인 조절(즉, Rb, p53, WT-1) 또는 세포 성장과 분화를 이끄는 신호화 경로(즉, NF-1)에 관여함이 밝혀졌다. 또한, 최근의 데이타는 세포 구조 및 방향성의 유지와 관련한 유전자가 또한 종양 서프레서로서 작용할 수 있음을 제시하고 있다(참조: Marx, 1993; Fearon et al., 1990; Trofatter et al., 1993).
진핵 세포 주기의 주요 전이는 사이클린-의존성 키나제 또는 CDK's에 의해 개시된다. 하나의 CDK, 즉 사이클린-의존성 키나제 4 (CDK4)는 G1기를 통해 증식을 조절한다. 이러한 효소의 작용은 말기 G1기에서 Rb를 인산화시킬 수 있다. CDK4의 활성은 활성화 서브유니트, 즉 사이클린의 D-형의 활성화 및 억제성 서브유니트, 즉 p16INK4단백질에 의해 조절된다. p16INK4는 CDK4에 특이적으로 결합하여 이를 억제시킴으로써 Rb 인산화를 조절할수 있는 단백질로서 생화학적으로 특성화되어 있다(참조: Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). p16INK4단백질은 cdk4 억제인자이므로(참조: Serrano, 1993), 이러한 유전자의 결실은 CDK4의 활성을 증가시킬 수 있으며, 그 결과 Rb 단백질의 과인산화를 초래한다. p16은 또한 CDK6의 기능을 조절하는 것으로 공지되어 있다.
p16INK4는 또한 p15B, p21WAF1및 p27KIP1을 포함하는 CDK-억제성 단백질의 새로이 기술된 부류에 속한다. 9p21에 대한 p16INK4유전자 지도인, 염색체 영역은 많은 종양 형에서 흔히 결실된다. p16INK4유전자의 동형접합성 결실 및 돌연변이는 사람 종양 세포주에서 흔하다. 이러한 현상은 p16INK4유전자가 종양 서프레서 유전자임을 암시한다. 그러나, 이러한 해석은 p16INK4유전자 변형의 빈도가 배양된 세포주에서보다 배양되지 않은 1차 종양에서 매우 낮다는 관측에 의해 무너지고 있다(참조: Caldas et al., 1994; Cheng et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Kamb et al., 1994; Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Nobori et al., 1995; Orlow et al., 1994; Arap et al., 1995). 플라스미드 발현 벡터를 사용한 형질감염에 의한 야생형 p16INK4작용의 보유는 일부 사람 암 세포주에 의한 콜로니 형성을 감소시킨다(참조: Okamoto, 1994; Arap, 1995).
발명의 요약
본 발명은 p16을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 작제물을 제공함으로써 폐 및 기타 p-16-연관된 암에 대한 향상된 치료요법에 대한 요구도에 촛점을 맞추고 있다. 또한, 본 발명의 목적은 이러한 조성물의 사용 방법, 특히 암의 치료에 있어서 이러한 조성물의 사용 방법을 제공하는 것이다. 다른 양태로서, 본 발명은 발현 작제물내 p16 핵산을 사용하여 세포를 형질전환시키는 방법을 포함한다.
본 발명은 또한 진핵 세포내에서 작용성인 프로모터 및 프로모터의 전사 조절하에 존재하는, p16을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 작제물을 포함한다.
바람직한 양태에서, 발현 작제물은 폴리아데닐화 시그날을 추가로 포함한다. 다른 양태에서, 작제물은 선별성 마커를 추가로 포함한다. 또 다른 양태에서, 발현 작제물은 아데노바이러스이다. 바람직한 양태에서, 발현 작제물은 적어도 E1 영역의 부위가 없는 아데노바이러스이다.
특정 양태에서, 핵산은 cDNA이다. 다른 양태에서 핵산은 게놈성 DNA이다. 또 다른 양태는 cDNA 및 예를 들면, 소-유전자 작제물내 게놈성 DNA의 조합을 포함한다. 예시적 양태에서, 핵산은 상기 프로모터에 대하여 센스 배향으로 위치한다. 다른 양태에서, 핵산은 안티센스 배향으로 위치한다.
본 발명은 또한 진핵 세포내에서 작용성인 프로모터 및 p16을 암호화하는 핵산을 갖는 발현 작제물과 약제학적으로 허용되는 완충액, 용매 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 특정 양태에서, 발현 작제물 및 약제학적으로 허용되는 완충액, 용매 또는 희석제가 키트중에 제공된다.
본 발명은 또한 p16 작용을 결여하고 있거나 부적절하게 위치화된 작용성 p16을 발현하는 세포내에서 적절한 p16 작용을 회복시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 세포를 상술한 바와 같은 발현 작제물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 핵산은 센스 배향으로 위치한다. 본 발명의 예시적 양태에서, 세포는 형질전환된 세포이고, 접촉은 형질전환된 발현형을 전환시킨다. 추가의 양태에서, 세포는 폐, 방광, 백혈병 또는 악성 암 세포이고, 추가의 양태에서, 발현 작제물은 아데노바이러스이다.
본 발명은 추가로 세포내에서 p16 작용을 억제하는 방법을 포함한다. 이 방법은 이러한 세포를 상술한 바와 같은 발현 작제물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서, 핵산은 안티센스 배향으로 위치한다. 추가의 양태에서, 발현 작제물은 아데노바이러스이다.
본 발명의 추가의 양태는 암을 지닌 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 약제학적으로 허용되는 완충액, 용매 또는 희석액중에 센스 배향으로 위치하고, 진핵세포내에서 작용성인 프로모터와 p16을 암호화하는 핵산을 갖는 발현 작제물을 포함하는 약제학적 조성물을 동물에게 투여함을 포함한다. 본 발명의 특정 양태에서, 포유동물은 사람이다. 추가의 양태에서, 투여는 정맥 주사를 통한다. 추가의 양태에서, 암은 폐암이다.
본 발명의 추가의 양태는 p16을 암호화하는 핵산 또는 p16을 검출함에 의해 샘플내에서 암 세포를 검출하는 방법을 포함한다.
본 발명은 일반적으로 종양 생물학에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 서프레서(suppressor)를 암호화하는 핵산 및 종양 성장을 억제하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다. 한 양태로써, 본 발명은 p16을 암호화하는 발현 작제물 및 암을 억제하는데 있어서의 이의 용도에 관한 것이다.
도1A은 p16의 뉴클레오타이드 서열을 도시한 것이다(서열 1).
도1B는 p16의 아미노산 서열을 도시한 것이다(서열 2).
도2는 Ad-p16 감염된 세포주의 세포 성장 곡선을 도시한 것이다. 세포는 감염시키기전에 24시간 동안 60mm 배양 디쉬내에서 5 X 104의 밀도로 접종시키고 50PFU/세포에서 Ad-p16 또는 Ad5CMV-lacZ로 감염시킨다. 모의 감염을 위해서는 배양 배지만을 사용한다. 각 처리에 대하여 각각의 세포주의 배양물 3개를 감염시킨지 1 내지 6일후로부터 매일 계수한다. 곡선은 3회의 실험의 대표적인 검정으로부터 플롯팅한 것이다(평균 ± SD).
도3A 내지 도3D는 Ad-p16, 대조군 바이러스 AD5CMV-lacZ 또는 PBS의 종양내 주입에 따른 마우스내 종양 성장을 도시한 것이다(그룹당 마우스의 수는 5마리이다). 누드 마우스의 등쪽 옆구리내로 PBS 0.1ml중에 현탁된 5 X 106H460 세포를 주입함에 의해 피하 종양 노듈(nodule)을 생성시킨다. 종양 노듈(180 내지 220mm3)을 세포 이식후 16일째에 처리한다. Ad-p16, AD5CMV-lacZ 또는 PBS의 종양내 직접적인 주입을 수행한다. 각각의 종양 노듈에 대해, 3개의 용량으로 일하게 분리된 1010PFU의 Ad-p16 또는 AD5CMV-lacZ를 6일 동안 다른날에 주입한다. 종양 크기를 주입한후 다른날에 2개의 정사형 방향에서 선형 측경기로 측정하고 종양 부피를 계산한다(평균 ± SD). (A) H322 세포; (B) HBL100 세포; (C) H460 세포; (D) H226Br 세포.
본 발명에 이르러 세포 주기의 조절에 관여하는 특정의 유전자의 조절이상이 세포의 악성 진행에 관여한다는 확증이 축적되어졌다. 예를 들어, 세포 주기의 다음 상태로의 세포의 성숙전 도입은 DNA 손상의 불완전한 보수 및 연속적으로 게놈성 불안전성을 초래할 수 있다. 상술한 바와 같이, 사이클린-의존성 키나제는 세포 주기 조절에 있어 중요한 역활을 한다. p16INK4단백질이 사이클린 D1-CDK4와 복합되어 Rb와의 이의 상호작용을 억제함으로써 세포주기에 따른 이동을 지연시킴은 공지되어 있다. 암 세포주에서 점 돌연변이 및 동형접합성 결실의 존재에 있어 높은 퍼센트는 또한 p16INK4가 종양 서프레서 유전자로서 작용할 수 있음을 제시한다.
주요 사람 식도암 및 췌장암, 방광암, 악성 및 NSCLC 전이에 있어서의 돌연변이가 보고되어 있으나, 1차 종양에 있어서의 돌연변이율은 세포주의 경우보다 더욱 낮다(참조: Mori et al., 1994; Okamoto et al., 1994; Okamoto et al., 1995; Zhou et al., 1994; Cairns et al., 1994; Hussussian et al., 1994; Kamb et al., 1994; Gruis et al., 1995). 그러나, 전사적 사일런스(transcriptional silencing)와 연관된 p16INK4의 과메틸화는 폐암, 뇌 및 목암, 교종 세포주 및 결실 또는 돌연변이되지 않은 새로운 종양에 있어 흔히 발견되므로 결실 및 돌연변이는 p16INK4불활성화의 주요 모델일 수는 없다(참조: Herman et al., 1995).
본원에 제시된 데이타는 무엇보다도 p16이 생체내에서 종양 서프레서 유전자로서 작용한다는 것을 나타내기 위한 것이다. 따라서, 본 발명은 폐암 및 기타 p16-관련된 질환용의 개선된 치료법에 대한 요구를 해결한다. 특히, 작용성 p16 생성물을 발현시킬 수 있는 발현 작제물을 사용하여 종양 세포의 증식을 억제시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 세포주를 형질전환시키거나 세포의 성장 속도 또는 성장 범위를 증가시키기 위해 p16에서 유도된 안티센스 방법의 사용에 관한 것이다. 하기 설명은 본 발명의 양태 및 기타 양태를 보다 상세히 설명한 것이다.
또한, p16-표적화된 치료가 항-맥관형성 방법에서 치료학적으로 관련되어 있음을 입증한다. 맥관 구조의 감소가 바람직한 다수의 질환이 있다. 또한, p16-치료는 재발협착증과 같은 과다증식성 질환에 유리함을 입증할 것이다.
A. p16 및 p16-관련된 핵산
본 발명에 따른 핵산은 완전한 p16 유전자, 작용성 p16 단백질 도메인, 또는 임의의 p16 폴리펩타이드, CDK4를 억제시키기에 충분한 펩타이드 또는 단편을 암호화한다. p16 핵산은 특정한 생물체의 게놈으로부터 직접 클론된 게놈 DNA로부터 유도될 수 있다. 그러나, 바람직한 양태에 있어서, p16을 암호화하는 핵산은 상보성 DNA(cDNA) 또는 cDNA + 인트론, 즉 미니-유전자를 포함할 것이다.
용어 "cDNA"는 주형으로서 메신저 RNA(mRNA)를 사용하여 제조된 DNA를 의미한다. 게놈 DNA 또는 게놈성, 비- 또는 부분적으로 처리된 RNA 주형으로부터 합성된 DNA와는 대조적으로, cDNA를 사용하는 잇점은 cDNA가 임의의 비-암호화 서열을 함유하지 않으나, 상응하는 단백질의 암호화 영역만을 함유한다는 것이다. 비-암호화 영역이 최적 발현에 요구되거나 인트론과 같은 비-암호화 영역이 안티센스 방법으로 표적화되는 경우, 완전한 또는 부분적인 게놈 서열이 바람직한 경우가 있다.
명세서 전반에 걸쳐서, 용어 "p16"은 이의 기타 표시-MTS1, CDK4I 및 CDKN2와 동의어로 사용된다. 또한, 용어 "p16"의 사용은 명시된 종류 이외에 다른 종류로부터의 모든 p16 동족체를 의미한다.
또한, 제공된 p16은 약간 상이한 1차 서열을 가지나 서로 생물학적 기능이 동일한 천연 변이체(하기 참조)에 의해 나타날 수도 있다. 본 발명에 따라 기능하기 위해서는 p16이 CDK4에 결합해야만 한다는 것이다. 이러한 효과를 시험하기 위해, 시험관내에서 p16 핵산에 의해 암호화된 단백질의 결합을 검정하거나, 본원에 참조로서 인용된 문헌[참조: Serano et al., 1993]에 기술된 바와 같은 형질감염 기술을 사용하는 것은 단순한 문제이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "p16을 암호화하는 핵산"은 총 세포 핵산중에서 분리된 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 양태에 있어서, 본 발명은 필수적으로 도 1A에 기술된 핵산 서열(서열 1)에 관한 것이다. 용어 "도 1에 기술된"은 핵산 서열이 실질적으로 도 1A의 부분에 상응하고, 도 1A의 코돈과 동일하지 않은 코돈이 코돈이 거의 없거나 기능적으로 동등하다는 것을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "기능적으로 동등한 코돈"은 아르기닌 또는 세린에 대한 6개 코돈과 같이 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈을 의미하고, 또한 생물학적으로 동등한 아미노산을 암호화하는 코돈(하기 표 1에서와 같이)을 의미한다.
아미노산 코돈
알라닌 Ala A시스테인 Cys C아스파르트산 Asp D글루탐산 Glu E페닐알라닌 Phe F글리신 Gly G히스티딘 His H이소류신 Ile I리신 Lys K류신 Leu L메티오닌 Met M아스파라긴 Asn N프롤린 Pro P글루타민 Gln Q아르기닌 Arg R세린 Ser S트레오닌 Thr T발린 Val V트립토판 Trp W티로신 Tyr Y GCA GCC GCG GCUUGC UGUGAC GAUGAA GAGUUC UUUGGA GGC GGG GGUCAC CAUAUA AUC AUUAAA AAGUUA UUG CUA CUC CUG CUUAUGAAC AAUCCA CCC CCG CCUCAA CAGAGA AGG CGA CGC CGG CGUAGC AGU UCA UCC UCG UCUACA ACC ACG ACUGUA GUC GUG GUUUGGUAC UAU
유전자 암호의 축퇴성을 위해, 도 1A의 뉴클레오타이드와 동일한 뉴클레오타이드가 약 50% 내지 약 75%, 또는 더욱 바람직하게는 약 76% 내지 약 99%인 서열이 "도 1A에 기술된" 서열일 수 있다. 도 1A에 기술된 서열과 필수적으로 동일한 서열은 표준 조건하에 도 1A의 보체를 함유하는 핵산 단편과 하이브리드화할 수 있는 서열로서 기능상 정의한다.
적합한 하이브리드화 조건은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 공지되어 있다. 특정한 적용, 예를 들어 부위-지시된 돌연변이 유발에 의한 아미노산의 치환에 있어서는 보다 낮은 스트링전트 조건(stringent control)이 요구된다는 것이 인정된다. 이들 조건하에서, 하이브리드화는 프로브 및 표적 쇄의 서열이 완전히 상보성이지는 않지만 하나 이상의 위치에서 부적합(mismatch)되어 있어도 발생할 수 있다. 상기 조건은 염 농도를 증가시키거나 온도를 낮춤으로써 보다 덜 스트링전트될 수 있다. 예를 들어, 중간의 스트링전트 조건은 약 37℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.1 내지 0.25M NaCl에 의해 입증될 수 있으며, 한편 보다 낮은 스트링전트 조건은 약 20℃ 내지 약 55℃ 범위의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M 염에 의해 입증될 수 있다. 따라서, 하이브리드 조건은 용이하게 조작될 수 있고, 일반적으로 목적하는 결과에 따라 선택된 방법일 수 있다.
다른 양태에 있어서, 하이브리드화는 예를 들어 약 20℃ 내지 약 37℃의 온도에서 50mM 트리스-HCl(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM 디티오트레이톨의 조건하에 달성될 수 있다. 사용된 다른 하이브리드화 조건은 약 40℃ 내지 약 72℃ 범위의 온도에서 약 10mM 트리스-HCl(pH 8.3), 50mM KCl, 1.5μM MgCl2를 포함한다. 또한, 포름아미드 및 SDS를 사용하여 하이브리드화 조건을 변형시킬 수 있다.
성질상, 본 발명은 또한 도 1A에 기술된 서열과 상보성이거나 본질적으로 상보성인 DNA 분절(segment)을 포함한다. "상보성"인 핵산 서열은 왓슨-크릭 표준 법칙에 따라 염기쌍(base-pairing)할 수 있는 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상보성 서열"은, 상술된 동일한 뉴클레오타이드 비교에 의해 평가할 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 조건과 같은 비교적 계축 제어하에 도 1A의 핵산 서열과 하이브리드화될 수 있는 것으로 정의된 서열과 실질적으로 상보성인 핵산 서열을 의미한다. 이와 같은 서열은 완전한 p16 분자 또는 이의 기능성 단편을 암호화할 수 있다.
다른 한편으로, 하이브리드화 분절은 보다 짧은 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 17개 염기 길이의 서열은 사람 게놈중에 단지 1번만 존재하여 유일한 표적 서열을 구체화하기에 충분해야 한다. 보다 짧은 올리고머가 생체내 접근성을 보다 용이하게 하고 증가시킬지라도, 다수의 다른 인자도 하이브리드화의 특이성 측정에 관련된다. 이의 상보성 표적에 대한 올리고뉴클레오타이드의 결합 친화성 및 서열 특이성 모두는 길이를 증가시킴에 따라 증가한다. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 염기쌍을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있음을 고려해야 한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 예를 들어 프로브 및 증폭 반응에서의 프라이머로서 사용할 수 있을 것이다.
본 발명의 DNA 분절에는 생물학적으로 기능상 동등한 p16 단백질 및 펩타이드를 암호화하는 단편도 포함된다. 이렇게 암호화된 핵산 서열 및 단백질내에 천연적으로 존재하는 것으로 공지된 이와 같은 서열은 코돈 풍부성 및 기능상 동일성에 기인하여 발생할 수 있다. 다른 한편으로, 기능상 동일한 단백질 또는 펩타이드는 재조합 DNA 기술의 적용에 의해 작제할 수 있는데, 이는 교환되는 아미노산의 특성을 기준으로 하여 단백질 구조의 변화를 유전자 조작할 수 있다. 사람에 의해 작제된 변화는 부위-지시된 돌연변이 유발 기술에 의해 도입되거나 무작위로 도입할 수 있으며, 나중에 목적하는 기능을 위해 스크리닝한다.
경우에 따라, 또한 p16 암호화 영역이 예를 들어 정제, 면역 검출, 안정화 또는 표적화 목적과 같이 다른 단백질 또는 펩타이드에 대한 암호화 영역과 융합되어 목적하는 기능을 갖는 융합 단백질 및 펩타이드를 제조할 수 있다. 추가로, 이들 융합 단백질 또는 융합 펩타이드는 선택된 분자 구역, 특히 핵으로 이들의 수송을 유도하는 세포내 표적화 서열을 함유할 수 있다. 이들 융합 단배질 또는 융합 펩타이드는 동물 세포로 전달된 DNA 작제물로부터 발현될 수 있다.
또한, 아미노산 및 핵산 서열이 추가의 잔기, 예를 들어 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열, 및 단백질 발현과 관련되어 있는 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하여 상술된 기준에 서열이 부합되는 한 본원에 기술된 서열중의 하나와 본질적으로 동일한 서열을 포함할 수 있다. 말단 서열의 부가는 특히 예를 들어 프로모터와 같이 암호화 영역의 5' 또는 3' 부분중 어느 하나에 플랭킹된 각종 비-암호화 서열을 포함할 수 있는 암호화 핵산 서열에 적용된다. 추가로, 디그옥시게닌 또는 아비딘과 같이 친화성 또는 검출 잔기를 핵산 서열에 부가할 수도 있다.
상술된 바와 같이, 변형 및 변화가 p16의 1차 구조(도 1B에 예시됨)에서 발생할 수 있고, 또한 유사하거나 다른 목적하는 특성을 갖는 분자를 수득할 수도 있다. 예를 들어, 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자상의 결합 부위, 수용체와 같은 구조와의 상호 결합 능력 또는 시그날 형질도입 능력을 상실하지 않은 단백질 구조중의 다른 아미노산으로 특정한 아미노산을 치환할 수 있다. 단백질의 반응 능력 및 성질이 정의되기 때문에, 단백질의 생물학적 기능 활성, 특정 아미노산 서열 치환이 단백질 서열(또는, 물론, 이의 중요한 DNA 암호화 서열)에서 발생하여, 유사한(효능적) 특성을 갖는 단백질이 수득된다. 동일하게, 동일한 이유를 이용하여 상쇄성(예: 길항적) 특성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 작제할 수 있다.따라서, 본 발명자들은 각종 변화가 이들의 생물학적 유용성 또는 활성을 상당히 손상시키지 않으면서 p16 단백질 또는 펩타이드(또는 중요한 DNA)의 서열에서 발생할 수 있을 것으로 생각한다.
또한, 생물학적으로 동등한 단백질 또는 펩타이드의 정의에는 본래 분자의 정의된 부분에서 발생할 수 있는 다수의 변화를 한정하면서 동일한 생물학적 활성의 허용되는 수준으로 분자내에서 발생한다는 개념이 있다는 것은 본 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. 따라서, 생물학적으로 기능상 동등한 펩타이드는 아미노산의 일부(대부분 또는 전부가 아님)가 치환될 수 있는 펩타이드로서 본원에 정의되어 있다. 특히, p16 단백질의 N-말단이 관련되는 경우, 약 16개 또는 더욱 바람직하게는 약 5개의 아미노산이 주어진 펩타이드내에서 변화될 수 있는 것으로 생각된다. 물론, 상이한 치환체를 갖는 다수의 독특한 단백질/펩타이드를 용이하게 제조하여 본 발명에 따라 사용할 수 있을 것이다.
아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄의 상대적 유사성, 예를 들면 이의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 토대로 한다. 아미노산 측쇄 치환의 크기, 형태 및 유형의 분석은 아르기닌, 리신 및 히스티딘이 모두 양전하 잔기이고; 알라닌, 글리신 및 세린이 모두 크기가 유사하고; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신이 모두 일반적으로 유사한 형태를 갖는다는 것을 밝혀주었다. 따라서, 이러한 사항을 근거로 아르기닌, 리신 및 히스티딘; 알라닌, 글리신 및 세린; 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 본원에서 생물학적 기능 동등물로서 정의된다.
변화를 주는 경우, 아미노산의 수치료 지수가 고려될 수 있다. 각 아미노산에는 이들의 소수성 및 전하 특성을 토대로 하여 수치료 지수가 부여되며, 이는 이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르트에이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5) 이다.
단백질상에 상호활성 생물학적 기능을 부여하는 수치료 아미노산 지수의 중요성이 당업계에 일반적으로 이해되고 있다[Kyte & Doolite, 1982; 참조로서 본원에 기입]. 특정 아미노산이 유사한 수치료 지수 또는 스코어를 갖는 다른 아미노산으로 치환되어도 여전히 유사한 생물학적 활성을 갖을 수 있다는 것이 공지되었다. 수치료 지수를 기초로 한 변화를 주는 경우, 수치료 지수가 ±2 내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 수치료 지수가 ±0.5 내인 아미노산의 치환이 더욱 특히 바람직하다.
아미노산이 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되어도 여전히 생물학적으로 동등한 단백질이 수득될 수 있다는 것이 이해된다. 미국 특허 제4,554,101호에 상세히 기술된 바와 같이, 하기의 친수성 값은 아미노산에 부여된다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르트에이트(+1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 이소루이신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
유사한 친수성 값을 토대로 하여 변화를 주는 경우, 친수성 값이 ±2 내인 아미노산으로의 치환이 바람직하며, ±1 내인 아미노산으로의 치환이 특히 바람직하며, ±0.5 내인 아미노산으로의 치환이 더 더욱 바람직하다.
전술한 논점은 아미노산 변화에 기인한 기능적으로 동등한 폴리펩타이드에 초점을 맞추고 있으므로, 유전 암호가 축퇴적이고 2 이상의 코돈이 동일한 아미노산을 암호화할 수 있다는 점을 고려하여 암호화 DNA를 변경시킴으로써 상기 변화를 줄 수 있으리라는 것이 기대된다.
본원에 기술된 펩티딜 화합물 외에, 본 발명자들은 다른 입체적으로 유사한 화합물을 제형화화하여 펩타이드 구조의 주요 부분을 모사할 수 있다고 생각하였다. 펩타이드 모사물이라 정의된 이러한 화합물은 본 발명의 펩타이드와 동일한 방법으로 사용될 수 있으므로 이들도 또한 기능적 동등물이다. 구조적 기능 동등물의 제조는 당업자에게 공지된 모델링 및 화학적 디자인의 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 입체적으로 유사한 작제물은 모두 본 발명의 범위내라는 것이 이해될 것이다.
B. 안티센스 작제물
또 다른 양태에서, p16 핵산은 완전한 길이 또는 단편적인 상기 핵산중의 하나의 안트센스 버젼을 암호화할 것이다. 일반적으로, 센스 또는 암호화 작제물은 p16 기능의 결함이 문제라서 p16 기능의 교체가 고려되는 종양 증식의 억제 방법에 사용될 것이다. 그러나, p16의 과발현이 문제라서 p16 발현의 억제 또는 억제가 고려되는 경우, 안트센스 분자가 사용될 것이다.
용어 "안티센스 핵산"은 p16-암호화 DNA 또는 RNA의 염기 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 표적 세포에 도입된 경우, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 특이적으로 이의 표적 핵산에 결합하여 전사, RNA 프로세싱, 수송, 해독 및/또는 안정성을 억제할 것이다. 올리고 또는 올리고뉴클레오타이드에 의한 이본쇄(ds) DNA의 표적화는 삼중 나선형을 유발할 것이고; RNA 표적화는 이중-나선형을 유발할 것이다.
안티센스 작제물은 유전자의 프로모터와 다른 조절 영역, 엑손, 인트론 또는 엑손-인트론의 경계부에 결합되도록 고안될 것이다. 안티센스 RNA 작제물, 또는 이러한 안티센스 RNA 작제물을 암호화하는 DNA가, 시험관내 또는 생체내 방식으로 사람 피검체를 포함한 숙주 동물과 같은 숙주 세포내에서 유전자 전사 또는 해독, 또는 전사와 해독 모두를 억제하는데 사용될 수 있다. "상보적 뉴클레오타이드"를 포함하는 핵산 서열은 표준적인 왓슨-크릭 상보성 법칙에 따라 염기-쌍을 형성할 수 있는 것이다. 즉, 더 큰 퓨린은 더 작은 피리미딘과 염기쌍을 형성하여 시토신과 구아닌의 염기쌍(G:C) 및 티민과 아데닌의 염기쌍(A:T)(DNA의 경우) 또는 우라실과 아데닌의 염기쌍(A:U)(RNA의 경우)의 조합을 형성할 것이다. 이노신, 5-메틸시토신, 6-메틸시토신, 히포크산틴 등과 같은 덜 일반적인 염기를 하이브리드화 서열중에 포함하여도 이것이 염기쌍 형성을 방해하지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "상보적" 또는 "안티센스 서열"은 전체 길이를 통해 실질적으로 상보적이고 염기 부정합을 거의 갖지 않는 핵산 서열을 의미한다. 예를 들면, 15 개 염기의 핵산 서열은, 이들이 13 또는 14 위치에서 상보적 뉴클레오타이드을 갖고 단지 하나의 불일치를 갖는 경우, 상보적이라고 정의될 수 있다. 본래, "완전히 상보적"인 핵산 서열은 전체 길이를 통해 전적으로 상보적이고 염기 부정합이 전혀 없는 핵산 서열일 것이다.
상동성의 정도가 낮은 다른 서열도 또한 고려된다. 예를 들면, 한정된 영역에서는 높은 상동성을 갖지만 비-상동성 영역도 포함하는 안티센스 작제물(예: 리보자임)을 고안할 수 있다. 50% 미만의 상동성을 갖는 이들 분자는 적당한 조건하에서 표적 서열에 결합할 것이다.
상기 유전자 서열의 전부 또는 일부가 안티센스 작제에 사용되는 경우, 통계적으로, 17개 염기의 특정 서열이 사람 게놈중에 단지 하나 존재하므로, 유일한 표적 서열을 특정하기에 충분하다. 비록 더 작은 올리고머가 생체 내에서의 접근가능성을 더 용이하게 하고 증가시키지만, 수 많은 다른 요인이 하이브리드화의 특이성을 결정하는데 관련된다. 상보적인 표적에의 올리고뉴클레오타이드의 결합 친화성 및 서열 특이성 모두 길이가 증가됨에 따라 증가한다. 8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상의 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 고려된다. 내생 유전자의 기능이 영향을 받는지 또는 상보적 서열을 갖는 관련 유전자의 발현이 영향을 받는지를 결정하기 위하여 시험관내에서 작제물을 시험함으로써, 주어진 안티센스 핵산이 상응하는 숙주 세포 유전자에의 표적화에 효과적인지를 쉽게 결정할 수 있다.
특정 태양에서, 다른 인자를 포함하는 안티센스 작제물, 예를 들면 C-5 프로핀 피리미딘을 포함하는 것을 사용할 수 있다. 우리딘 및 시티딘의 C-5 프로핀 동족체을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 고 친화성으로 RNA에 결합하므로, 유전자 발현의 효과적인 안티센스 억제제이라는 것을 알 수 있다[참조:Wagner et al., 1993].
표적화된 안티센스 전달에 대한 대안으로서, 표적화된 리보자임을 사용할 수 있다. 용어 "리보자임"은 p16 DNA 및 RNA중의 특정 염기 서열을 표적하고 절단할 수 있는 RNA-기제된 효소을 의미한다. 리보자임은 리보자임 서열을 혼입한 RNA 올리고뉴클레오타이드의 형태로 세포에 직접적으로 표적될 수 있거나 목적하는 리보자임 RNA을 암호화하는 발현 작제물로서 세포에 도입될 수 있다. 리보자임은 안티센스 핵산에 대해 기술된 바와 매우 동일하게 사용되고 적용될 수 있다. 또한, 리보자임 서열은 안티센스 핵산에 대해 기술된 바와 매우 동일하게 개질될 수 있다. 예를 들면, 비-왓슨-크릭 염기을 혼입시키거나, 혼합된 RNA/DNA 올리고뉴클레오타이드을 제조하거나, 포스포디에스테르 골격을 변형시킬 수 있다.
C. 발현 작제물
본 출원을 전반에서, 용어 "발현 작제물"은 유전자 산물의 서열을 암호화하는 핵산의 일부 또는 전부가 전사될 수 있는 유전자 산물을 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 작제물의 모든 유형을 포함하는 것을 의미한다. 전사체는 단백질로 해독될 있지만, 이는 필요치 않다. 따라서, 특정 태양에서, 발현은 p16 유전자의 전사 및 p16 mRNA의 p16 단백질로의 해독을 모두 포함한다. 다른 태양에서, 발현은 p16을 암호화하는 핵산의 전사만을 포함한다.
바람직한 태양에서, p16-유도된 산물을 암호화하는 핵산은 프로모터의 전사적 조절하에 있다. "프로모터"는 세포의 합성 기구, 또는 유전자의 특이적 전사를 개시시키기 위하여 도입된 합성 기구에 의해 인식되는 DNA 서열을 의미한다. "전사적 조절"란 문구는 프로모터가 핵산에 대한 정확한 위치 및 방향하에서 RNA 폴리머라제 개시 및 유전자의 발현을 조절하는 것을 의미한다.
본원에서 용어 프로모터는 RNA 폴리머라제의 개시 부위 주변에 집합된 전사적 조절 모듈의 그룹을 지시하는데 사용될 것이다.
Ⅱ. 프로모터의 배향에 대한 많은 생각들이, HSV 티미딘 키나제(tk) 및 SV40 초기 전사 단위의 프로모터를 포함하는 몇몇 바이러스 프로모터의 분석으로부터 추론되었다. 보다 최근의 조사에서 논의된 이러한 연구결과, 프로모터는 약 7내지 20개염기쌍의 DNA로 구성되고 전사 활성 및 억제 단백질에 대한 하나 이상의 인식 부위를 포함하는 분리된 기능적 모듈로 구성되어 있는 것으로 나타났다.
각각의 프로모터에 있는 하나이상의 모듈은 RNA 합성을 위한 개시 부위를 배치하는 기능을 수행한다. 이에 대한 가장 잘 알려진 예는 TATA 박스이며, 포유류의 말단 데옥시뉴클레오타이드 트랜스퍼라제 유전자 및 SV40 후기 유전자의 프로모터의 경우, TATA 박스가 없는 프로모터,예를 들어 개시 부위 자체를 가지는 분리된 요소가 개시 위치를 고정시키는 것을 돕는다.
추가적인 프로모터 요소들은 전사 개시의 빈도를 조절한다. 최근들어 많은 프로모터가 개시 부위의 아래에 작용 원소들을 포함한다는 것이 밝혀졌으나, 전형적으로는 추가적인 프로모터 요소들은 개시 부위의 상부 30내지 110개염기쌍의 영역에 위치한다. 프로모터 원소들 사이의 간격은 종종 유연적이어서 요소들이 서로 역전되거나 이동되는 경우에도 프로모터의 기능은 보존된다. 티미딘 키나제 프로모터에서, 프로모터 원소들 사이의 간격은 활성이 감소되기까지 약 50개염기쌍이 떨어질 수 있다. 프로모터에 따라 개개의 요소들이 전사를 활성화하는데있어 협력적으로 또는 독립적으로 작용할 수 있는 것으로 보인다.
p16를 암호화하는 핵산의 발현을 조절하는데 사용되는 특정 프로모터는 표적 세포에서 핵산을 발현할 수 있는 한 중요하지는 않다. 따라서, 사람 세포가 표적화되는 경우,핵산의 암호화 영역을 사람세포에서 발현될 수 있는 프로모터의 조절하에 이에 인접하게 위치를 잡는 것이 바람직하다. 일반적으로, 이러한 프로모터는 사람 또는 바이러스 프로모터를 포함할 수 있다.
여러 가지의 양태에서, 사람의 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus,CMV)의 즉각적인 초기 유전자 프로모터, SV40 초기 프로모터 및 로우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복물은 p16의 고발현에 사용할 수 있다. 발현 수준이 지정 목적에 충분하다면, 당 분야에서 잘 알려진 p16을 발현시키는데 다른 바이러스 또는 포유류 세포 또는 박테리아 파지 프로모터의 사용도 고려한다.
특성이 잘 알려진 프로모터를 사용해서, 형질감염 후 p16의 발현 수준 및 양상을 최대화 할 수 있다. 예를 들어, 특히 폐 세포에서 티로시나제(흑색종),알파-페토단백질 및 알부민(간종양), CC10(폐종양) 및 전립선-특이적 항원(전립선 종양)에서 활성인 프로모터의 선택은 p16의 조직-특이적 발현을 허용한다. 또한, 특정한 생리적인 신호에 반응하여 의해 조절되는 프로모터의 선택은 p16의 유도적 발현을 허용한다. 예를 들어, p16 암호화 핵산일 경우, 사람의 PAI-1프로모터로부터 발현되는 종양 괴사 인자에 의해 유도될 수 있다. 표2 및 3은 사용할 수 있는 몇몇 요소들/프로모터들을 p16의 발현을 조절하기 위해 본 발명에 따라 열거한 것이다. 이 목록은 p16의 발현 촉진에 수반되는 모든 가능한 요소들을 제한하려는 의도가 아니고 단지 예를 든 것이다.
인핸서는 처음에는 동일한 DNA 분자상에서 떨어진 거리에 위치한 프로모터로부터 전사를 증가시키는 유전적 요소로 검출되었다. 원거리에서 작용할 수 있는 이러한 능력은 원핵세포의 전사 조절에 관한 전통적인 연구에서는 거의 선례가 없었다. 차후의 연구에서 인핸서 활성을 가지는 DNA 영역이 프로모터와 많이 유사하게 배치된다는 것을 보였다. 즉, 인핸서는 각 요소들이 하나 이상의 전사 단백질에 결합하는 많은 각각의 요소들로 구성된다.
인핸서와 프로모터 사이의 기본적인 차이는 조작에 있다. 대체적으로 인핸서 영역은 떨어진 위치에서 전사를 자극할 수 있어야 한다 ; 프로모터 영역 또는 이의 구성 요소들의 경우에 그렇지 않다. 반면, 프로모터는 특정한 부위 특별한 방향으로 RNA 합성을 개시하는 하나 이상의 요소들을 가져야 하나, 인핸서는 이러한 특이성을 갖지 않는다. 프로모터와 인핸서는 종종 겹쳐지고 인접하게 위치하여, 종종 매우 유사한 모듈의 배향을 갖는 것으로 보인다.
발현 작제물에서 p16을 암호화하는 핵산과 조합하여 사용할 수 있는 바이러스 프로모터, 세포 프로모터/인핸서 및 유도성 프로모터/인핸서가 표2 및 3에 열거되어 있다. 진핵세포 프로모터 데이터 베이스, EPDB에 따라 특정한 프로모터/인핸서 조합물은 p16의 발현을 유도하는데 사용할 수 있다. T3,T7 혹은 SP6 세포질 발현 시스템의 사용이 또다른 양태이다. 진핵 세포는, 적절한 박테리아 폴리머라제가 전달 복합체의 일부 또는 추가의 유전적 발현 작제물로서 제공되는 경우 특정 박테리아 프로모터의 세포질성 전사를 지지할 수 있다.
인핸서
면역 글로블린 중쇄
면역 글로블린 경쇄
T-세포 수용체
HLA DQα및 DQβ
β-인터페론
인터루킨-2
인터루킨-2 수용체
MHC 제Ⅱ형 5k α
MHC 제Ⅱ형 HLA-DRα
β-액틴
근육 크레아틴 키나제
전알부민(트랜스티레틴)
엘라스타제 Ⅰ
메탈로티오나인
콜라겐아제
알부민 유전자
α-페토단백질
γ-글로빈
β-글로빈
c-포스
c-HA-라스
인슐린
신경 세포 접착 분자 (NCAM)
인핸서
α1-안티트립신
H2B (TH2B) 히스톤
마우스 또는 타입Ⅰ 콜라겐
포도당-조절 단백질(GRP94 및 GRP78)
랫 성장 호르몬
인간 혈청 아밀로이드 A (SAA)
트로포닌 Ⅰ(TNⅠ)
혈소판-유도 성장 인자
듀켄 근육 위축(Duchenne Muscular Dystrophy)
SV40
폴리오마
레트로바이러스
파필로마 바이러스
B형 간염 바이러스
사람 면역 결핍 바이러스
시토메갈로바이러스
기본 아페 백혈병 바이러스(Gibbon Ape Leukemia virus)
원소 유도체
MT Ⅱ 포볼 에스터 (TFA), 중금속
MMTV(마우스 유방 종양바이러스) 글루코코티코이드
β-인터페론 폴리(rI)X, 폴리(rc)
아데노바이러스 5E2 엘라
C-준 포볼 에스터 (TPA), 과산화수소
콜라겐아제 포볼 에스터 (TPA)
스트로멜리신 포볼 에스터 (TPA), IL-1
SV40 포볼 에스터 (TFA)
뮤린 MX 유전자 인터페론, 뉴캐슬 질병 바이러스
GRP78 유전자 A23187
α-2-마크로글로블린 IL-6
비멘틴 혈청
MHC 제Ⅰ형유전자 H-2kB 인터페론
HSP70 엘라, SV40 거대 T 항원
프로리페린 포볼 에스터-TPA
종양 괴사 인자 FMA
갑상선 자극 호르몬α유전자 갑상선 호르몬
본 발명의 특정한 양태에서, 세포내로의 핵산의 전달은 시험관내 및 생체내에서 발현 작제물에 마커를 포함시켜 확인할 수 있다. 마커는 발현의 용이한 확인이 가능하도록 형질감염된 세포에 확인가능한 변화를 나타낸다. 일반적으로 약물 선택 마커를 포함시키면 클로닝 및 형질전환체의 선별을 도와준다. 달리는, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제(tk)(진핵세포) 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)(원핵세포)같은 효소들을 사용할 수 있다. 면역학적인 마커도 또한 사용할 수 있다. 사용가능한 선별적인 마커는 p16을 암호화하는 핵산과 함께 동시에 발현될 수 있는 한 중요하지 않다. 선별적 마커에 대한 추가예는 당 분야의 전문가들에게 널리 공지되어 있다.
cDNA 삽입물을 사용하는 경우, 통상적으로 p16 전사체의 적절한 폴리아데닐화를 위해 폴리아데닐화 시그날을 포함시키는 것이 바람직하다. 폴리아데닐화 시그날의 특성이 본 발명의 성공적인 실시에 중요하다고 믿어지지 않으므로, 어떠한 다른 염기 서열도 사용될 수 있다. 본 발명자은 사용된 표적 세포에서 잘 작용하는 것으로 알려진 편리한 SV40 폴리아데닐화 시그날을 사용했다. 또한 터미네이터가 발현 카세트의 요소로서 고려된다. 이들 요소들은 메시지 수준강화향상시키고 카세트에서 다른 서열로의 해독을 최소화한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 발현 작제물은 바이러스 또는 바이러스 게놈으로부터 유도된 유전자 조작된 작제물을 포함한다. 바이러스는 수용체-매개된 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis)를 통해 세포내로 들어와 숙주 세포의 게놈에 통합되고 효과적이고 안정적으로 바이러스의 유전자를 발현시키는 능력이 있으므로 인성 유전자를 포유류 세포로 전이하는데 있어 매력적인 후보자이다(Ridgeway,1988; Nicolas와 Rubenstein,1988; Baichwal과 Sugden, 1986 : Temin,1986). 유전자 벡터로서 최초로 사용된 바이러스는 파포바바이러스(원숭이 바이러스 40, 소의 파필로마 바이러스, 및 폴리오마)(Ridgeway,1988; Baichwal과 Sugden,1986) 및 아데노바이러스(Ridgeway,1988; Baichwal과 Sugden,1986)를 포함한 DNA 바이러스였다. 이는 인성 DNA 서열에 대해 상대적으로 낮은 용량을 가지고 제한된 숙주 범위를 가진다. 게다가, 수용 세포의 온코진 잠재력과 세포변성 효과가 안전성의 문제를 일으킨다. 이들은 단지 8kb 이하의 인성 유전 물질을 수용할 수 있지만 많은 세포주와 실험 동물에 용이하게 도입될 수 있다 (Nicolas와 Rubenstein, 1988, Temin, 1986).
(ⅰ) 레트로바이러스
레트로바이러스는 역-전사(Coffin,1990)과정에 의해서 감염된 세포내에서 그들의 RNA를 이쇄 DNA로 전환하는 능력이 특성이 특징적인 단쇄 RNA 바이러스군이다. 생성된 DNA를 프로바이러스로서 세포의 염색체에 안정하게 통합시켜 바이러스 단백질의 합성을 지시한다. 통합되면 수송 세포 및 이의 후손들에 바이러스 유전자 서열이 보유되게 된다. 레트로바이러스의 게놈은 캡시드 단백질,폴리머라제, 그리고 외피 구성성분을 암호화하는 세 개의 유전자,gag, pol 및 env를 포함한다. Ψ라고 명명된 gag 유전자의 상부에서 발견되는 서열은 게놈을 바이론으로 패킹하기 위한 시그날로서 작용한다. 두 개의 긴 말단 반복(LTR) 서열은 바이러스 게놈의 5'및 3'말단에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터와 인핸서 서열을 포함하고, 또한 숙주 세포의 게놈에 통합되는데 필요하다(Coffin, 1990).
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, p16을 암호화하는 핵산을, 복제에 결점이 있는 바이러스를 생성하는 특정한 바이러스 서열대신 바이러스 게놈으로 삽입한다. 바이론을 생성하기 위해 LTR 및 Ψ성분이 없이 gag, pol 및 env유전자를 포함하는 패킹 세포주를 작제한다(Mann et al., 1983). 사람 cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드를 레트로바이러스 LTR 및 Ψ 서열과 함께 이러한 세포주에 (예로서 인산 칼슘침전에 의해)도입하면 Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체를 바이러스 입자로 패킹시키며 그 후 바이론 입자들은 배양 배지로 분비된다(Nicolas와 Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983). 그 후 재조합 레트로바이러스를 포함한 배지를 수집하고, 임의로 농축시킨 후, 유전자 전이에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 세포 유형를 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정적 발현에는 숙주세포의 분열이 필요하다(Paskind et al., 1975)
바이러스의 외피에 락토우즈 잔기를 화학적으로 첨가시켜 레트로바이러스를 화학적 개질시키는 것에 기초로 하여 레트로바이러스의 특이적 표적화를 위해 고안된 새로운 접근 방법이 최근에 개발되었다. 이러한 개질은 시알로당단백질 수용체를 경유한 간세포로의 특별한 감염을 허용한다.
레트로바이러스의 외피 단백질 및 특정한 세포의 수용체에 대한 바이오틴화된 항체를 사용하는 재조합 레트로바이러스의 표적화에 대한 다른 접근 방법이 고안되었다. 항체는 스트렙토아비딘을 사용해서 바이오틴 성분을 통해 커플링되었다(Roux et al, 1989). 주요 조직적합성 복합체 제 Ⅰ형 및 제 Ⅱ형 항원에 대한 항체를 사용하여, 시험관내에서 에코트로픽(ecotropic) 바이러스에 의한 표면 항원을 갖는 다양한 사람 세포들의 감염을 증명하였다(Roux et al, 1989).
본 발명의 모든 양상에서 레트로바이러스 벡터를 사용하는데에는 특정 제한이 있다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터는 종종 세포 게놈의 램덤 부위로 통합된다. 이는 숙주 유전자의 차단 또는 플랭킹 유전자의 작용을 방해할 수 있는 바이러스 조절 서열의 삽입을 통해서 삽입 돌연변이 유발을 이끌 수 있다(Varmus et al., 1981). 결점을 가진 레트로바이러스 벡터의 사용에 대한 또다른 우려는 패킹 세포에서 야생형의 복제-가능 바이러스의 등장 잠재성이다. 이는 숙주 세포의 게놈에 통합된 gag, pol, env 서열의 상부에 재조합 바이러스로부터의 온전한 Ψ 서열을 삽입시키는 재조합시 일어날 수 있다. 그러나, 현재 재조합의 가능성을 크게 감소시킨 새로운 세포주를 이용할 수 있다(Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990)
생체내에서 레트로바이러스 벡터를 사용하는데 있어서의 한가지 제한은 106개 감염물 U/ml초과의 레트로바이러스 벡터 역가를 생성하는 능력에 한계가 있다는 것이다. 많은 생체내의 적용에서는 10- 내지 1000-배 높은 역가가 필요하다.
레트로바이러스의 몇몇 특성은 폐암치료에서 이의 사용에 제한을 가진다(Stratford-Perricaudet와 Perricaudet, 1991) : (ⅰ) 레트로바이러스의 감염은 숙주 세포 분열에 의존적이다. 사람암에서는, 극히 적은 체분열 세포가 종양의 병변에서 발견될 수 있다. (ⅱ) 레트로바이러스의 숙주 세포로의 통합은, 악성 세포가 유전적인 불안정성의 크기 때문에, 표적 세포에 역 효과를 일으킬 수 있다. (ⅲ) 레트로바이러스 감염은 종종 특정한 숙주의 범위에 의해서 제한될 수 있다. (ⅳ) 레트로바이러스는 포유동물 및 척추동물 모두에서 많은 악성 종양과 관련이 있었다. (ⅴ) 레트로바이러스의 역가는 일반적으로 아데노바이러스의 역가보다 100-내지 1000-배가 낮다.
(ii) 아데노바이러스
36kB, 선형 및 이본쇄 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 유전 조합에 대한 지식에 따르면 아데노바이러스성 DNA의 거대부분을 7kB 이하의 외래 서열[참조: Grunhaus and Horwitz, 1992]로 대체할 수 있다. 레트로바이러스와는 대조적으로, 아데노바이러스성 DNA의 숙주 세포로의 감염은 아데노바이러스성 DNA가 잠재적 유전자독성없이 에피솜 방법으로 복제할 수 있기 때문에 염색체 통합이 일어나지 않는다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하고 게놈 재배열이 광대한 증폭 후에 검출되지 않는다. 아데노바이러스는 세포 사이클 단계와 관계없이 사실상 모든 상피세포를 감염시킬 수 있다. 지금까지 아데노바이러스 감염은 사람에서의 급성 호흡기 질환과 같은 심하지 않은 질환과만 관련있는 것으로 나타났다.
아데노바이러스는 특히 게놈 크기가 중간이고 조작이 쉬우며 역가가 높고 타겟 세포 범위가 넓으며 감염성이 높기 때문에 유전자 전사 벡터로서 사용하기에 적합하다. 바이러스성 게놈의 양 말단은 바이러스성 DNA 복제 및 패키지화에 필수적인 시스 원소인 100-200 염기쌍 전환된 말단 반복물(ITR)을 함유한다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스성 DNA 복제의 개시에 의해 분할되는 상이한 전사 단위를 함유한다. E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스성 게놈 및 소수개의 세포성 유전자의 전사 조절과 관련있는 단백질을 암호화한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현으로 바이러스성 DNA 복제용 단백질이 합성된다. 이러한 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 차단에 포함된다[참조: Renan, 1990]. 다수의 바이러스성 캡시드 단백질을 포함한 후기 유전자 생성물은 주요 후기 촉진제(MLP)에 의한 시그날 1차 전사의 뚜렷한 진행 후에만 발현된다. MLP(16.8m.u.에 위치)는 특히 후기 감염 동안 유효하고 이러한 촉진자에 의한 모든 mRNA는 번역시 바람직한 mRNA로 만드는 5' 3문자 리더(TL) 서열을 갖는다.
현 시스템에서, 재조합 아데노바이러스는 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터간의 동종 재조합으로부터 생성된다. 2개의 프로바이러스 벡터간의 재조합으로 인해, 이 과정으로부터 야생형 아데노바이러스가 생성될 수 있다. 그러므로, 바이러스의 단일 클론을 각각의 플라크로부터 분리하고 게놈 구조를 검정하는 것이 중요하다. YAC 시스템을 사용하여 재조합 아데노바이러스의 제조에 접근한다.
복제 결핍인 아데노바이러스 벡터의 제조 및 증식은 사람 태아 신장으로부터 Ad5 DNA 단편에 의해 변형되고 구조적으로 E1 단백질을 나타내는 특이한 헬퍼 세포주, 293에 좌우된다[참조: Graham, et al., 1977]. E3 영역은 아데노바이러스 게놈으로부터 제거되기 때문에[참조: Jones and Shenk, 1978], 헬퍼 293 세포를 갖는 아데노바이러스 벡터는 외래 DNA를 E1, E3 또는 양 영역으로 이동시킨다[참조: Graham and Prevec, 1991]. 원래 아데노바이러스는 야생형 게놈의 약 105%가 패키지되어 DNA의 약 2엑스트라 kB 용량이 제공될 수 있다. E1 및 E3 영역으로 대체되는 DNA의 약 5.5kB와 합하면 아데노바이러스 벡터의 최대 용량은 7.5kB 하이거나 벡터의 전체 길이의 약 15%이다. 아데노바이러스 바이러스성 게놈의 80% 이상이 벡터 주축에 잔류하고 벡터계 세포독성의 공급원이다. 또한, E1 삭제된 바이러스의 복제 결핍이 불완전하다. 예를 들면, 바이러스성 유전자 발현 누출은 고다중 감염에서 시판되는 아데노바이러스 벡터로 관찰된다[참조: Mulligan, 1993].
헬퍼 세포주는 사람 태아 신장 세포, 근육 세포, 혈액 세포 또는 기타 사람 태아 간엽이나 상피 세포와 같은 사람 세포로보터 유도할 수 있다. 또는 헬퍼 세포는 사람 아데노바이러스에 허용되는 기타 포유동물 종의 세포로부터 유도할 수 있다. 이러한 세포에는 베로 세포, 기타 원숭이 태아 간엽 또는 상피 세포가 포함된다. 상기한 바와 같이 바람직한 헬퍼 라인은 293이다.
아데노바이러스가 복제 결핍이거나 최소한 조건적으로 결함이 있는 필요조건 외에 아데노바이러스 벡터의 특성은 본 발명을 성공적으로 실행하는데 중요한 것이 아니다. 아데노바이러스는 42개의 공지된 상이한 세로타입이나 아그룹 A 내지 F 중의 어느것 일 수 있다. 아그룹 C의 아데노바이러스 타입 5는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 조건적 복제 결핍 아데노바이러스 벡터를 수득하는데 바람직한 출발물질이다. 이는 아데노바이러스 타입 5가 생화학적 및 유전적 정보가 다수 공지된 사람 아데노바이러스기 때문에 벡터로서 아데노바이러스를 사용하는 대부분의 구조에 사용되어 왔다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따르는 전형적인 벡터는 복제 결핍적이고 아데노바이러스 E1 영역을 갖지 않는다. 따라서, E1 암호화 서열이 제거되는 위치에서 p16을 암호화하는 핵산을 도입하는데 가장 편리하다. 그러나, p16 암호화 영역의 아데노바이러스 서열로의 삽입 위치는 본 발명에서는 중요하지 않다. p16을 암호화하는 핵산 전사 단위는 또한 문헌[참조: Karlsson et al., (1986)]에 기재된 E3 치환 벡터 중의 삭제된 E3 영역 또는 헬퍼 세포주이나 헬퍼 바이러스가 E4 결핍을 보충하는 E4 영역에 삽입할 수 있다.
아데노바이러스는 성장시키고 조작하기 쉽고 생체내 및 세포내에서 광범위한 숙주 범위를 나타낸다. 당해 바이러스 그룹은 높은 역가, 예를 들면, 109-1011플라크 형성 단위(PFU)/ml로 수득할 수 있고 매우 감염성이다. 아데노바이러스의 라이프 사이클은 숙주 세포 게놈으로의 통합을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 이동되는 외래 유전자는 에피솜이므로 숙주 세포에 대한 게놈독성이 낮다. 생체내 유전자 전이 벡터로서 치료 효능과 안정성을 나타내는 야생형 아데노바이러스를 사용한 벡신의 연구에 어떠한 부작용도 보고되어 있지 않다[참조: Couch et al., 1963; Top et al., 1971].
아데노바이러스 벡터는 진핵세포 유전자 발현[참조: Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992] 및 백신 개발[참조: Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1992]에 사용한다. 최근에 동물 연구로 재조합 아데노바이러스를 유전자 치료에 사용할 수 있음이 제안되었다[참조: Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993]. 재조합 아데노바이러스를 상이한 조직에 투여하는 실험에는 기관 적하[참조: Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992], 근육 주사[참조: Ragot et al., 1993] , 말초 정맥 주사[참조: Herz and Gerard, 1993] 및 뇌로의 주축성 접종[참조: Le Gal La Salle et al., 1993]이 포함된다.
(iii) 발현 작제물로서의 기타 바이러스성 벡터
본 발명에서는 기타 바이러스성 벡터를 발현 작제물로서 사용할 수 있다. 종두 바이러스[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988], 아데노 관련 바이러스(AAV)[참조: Ridgeway, 1988; Baichwal and Sugden, 1986; Hermonat and Muzycska, 1984] 및 헤르페스바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 벡터를 사용할 수 있다. 이들은 다양한 포유동물 세포에 대한 수개의 흥미있는 특징을 제공한다[Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Baihwal and Sugden, 1986; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990].
결핍성 B형 간염 바이러스의 최근 인식으로 새로운 식견을 상이한 바이러스성 서열의 구조-작용 관계로 수득하였다. 시험관내 연구로 바이러스는 게놈의 80% 이하가 삭제되어도 헬퍼 의존성 패키지와 역전사에 대한 능력이 유지됨이 밝혀졌다[참조: Horwich et al., 1990]. 이는 거대 부분의 게놈이 외래 유전자 물질에 의해 치환될 수 있음을 나타낸다. 간굴성과 내성(통합)이 간에 관한 유전자 전이에 특히 흥미있는 특성이다. 문헌[참조: Chang et al.]에 의하면 최근 클로람페니콜 아세틸트란스퍼라제(CAT) 유전자를 폴리머라제, 표면 및 예비 표면 암호화 서열 위치의 오리 B형 간염 바이러스 게놈 속으로 도입시킨다. 야생형 바이러스를 조류 간종양 세포주로 감염시킨. 역가가 높은 재조합 바이러스를 함유하는 배양 매질을 사용하여 1차 새끼 오리 간세포를 감염시킨다. 안정한 CAT 유전자 발현을 복제 후 24일 이상 동안 검출한다[참조: Chang et al., 1991].
D. 유전자 전달 방법
센스 또는 안티센스 p16 작제물을 발현시키기 위해, 발현 작제물을 세포속으로 이동시켜야 한다. 이러한 이동은 시험관내에서 변형 세포주에 대한 실험실 방법으로 또는 생체내 또는 생체외에서 특정 질환의 치료법에서와 같이 수행할 수 있다(이하 참조). 상기한 바와 같이, 이동에 바람직한 기전은 발현 작제물이 감염성 바이러스 입자 속에 단백질 막으로 싸여지는 바이러스 감염을 통한다.
발현 작제물을 배양된 포유동물 세포 속으로 전사하는 몇가지 비바이러스성 방법도 또한 본 발명에 의해 예측된다. 이에는 인산칼슘 침강[찬조: Graham and Van Der Eb, 1973; Chen and Okayama, 1987; Rippe et al., 1990], DEAE-덱스트란[참조: Gopal, 1984], 직접 미세주입[참조: Harland and Weintraub, 1985], DNA 부하된 리포좀[참조: Nicol며 뭉 Sene, 1982; Fraley et al., 1979] 및 리포펙트아민-DNA 복합체, 세포 초음파분쇄[참조: Fechheimer et al., 1987], 고속 미세발사체를 사용한 유전자 충격[참조: Yang et al., 1990], 및 수용체 중재된 전사[참조: Wu and Wu, 1987; Wu and Wu, 1988]가 포함된다. 이러한 기술 중의 몇몇을 생체내 또는 생체외용으로 성공적으로 채택할 수 있다.
발현 작제물이 세포 속으로 이동되면 p16을 암호화하는 핵산은 상이한 위치에 위치하고 발현될 수 있다. 특정 양태에서, p16을 암호화하는 핵산은 안정하게 세포의 게놈 속으로 통합될 수 있다. 이러한 통합은 동종 재조합물을 통한 같은 계통의 위치 및 배향(유전자 치환)에서 있을 수 있거나 랜덤하게 비특이적 위치(유전자 첨가물에서 통합될 수 있다. 또 다른 양태에서 핵산은 DNA의 분리된 에피솜 단편으로서 세포에 안정하게 유지될 수 있다. 이러한 핵산 단편 또는 "에피솜"은 숙주 세포 사이클과 독립적으로 또는 이와 동시에 유지되고 복제되기에 충분한 서열을 암호화한다. 발현 작제물의 세포로의 이동방법 및 세포 속의 핵산의 잔류 장소는 사용되는 발현 작제물의 유형에 좌우된다.
본 발명의 한 양태에서, 발현 작제물은 단순히 재조합 DNA 자체 또는 플라스미드로 이루어질 수 있다. 작제물의 전사는 세포 막을 생리학적으로 또는 화학적으로 통과할 수 있는 상기한 방법 중의 어느 것으로도 수행할 수 있다. 이는 특히 시험관내 전사에 적합하지만, 생체내에서도 사용할 수 있다. 문헌[참조: Dubensky et al., 1984]에 의하면 CaPO4형태의 성공적으로 주입된 폴리오마바이러스가 활성 바이러스성 복제 및 급성 감염을 나타내는 성체 및 갓 태어난 마우스의 간 및 비장 속으로 침강된다. 문헌[참조: Benvenisty and Neshif, 1986]에는 또한 CaPO4침강된 플라스미드를 복막내로 직접 주사하면 감염된 유전자가 생성되는 것으로 나타나 있다. p16을 암호화하는 DNA는 또한 유사한 방법으로 생체내에서 전사되고 p16을 발현시키는 것으로 기대된다.
DNA 발현 작제물 자체를 세포 속으로 전사하는 본 발명의 다른 양태는 입자 충격을 포함한다. 이 방법은 DNA 피복된 미세발사체를 고속으로 추진하여 이들이 세포 막을 뚫고 폐사되지 않으면서 세포로 유입될 수 있는 능력에 좌우된다[참조: Klein et al., 1987]. 소립자 추진 장치가 개발되어 왔다. 이러한 장치는 동력을 제공하도록 전기 전류를 생성시키는 고전압 발전에 좌우된다[참조: Yang et al., 1990]. 사용되는 미세발사체는 텅스텐 또는 금 비드와 같은 생물학적 불활성 물질로 이루어진다.
래트 및 마우스의 간, 피부 및 근육 조직을 포함하는 선택된 기관을 생체내에서 충격을 준다[참조: Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991]. 건(gun)과 표적 기관 사이의 조직을 제거하는데 조직 또는 세포의 외과적 노출, 즉 생체외 처리가 필요하다. 또한, p16을 암호화하는 DNA를 당해 방법으로 이동시킬 수 있고 본 발명으로 혼입시킬 수 있다.
본 발명의 추가 양태에서, 발현 작제물을 리포좀에 포집할 수 있다. 리포좀은 인지질 이층 막과 내부 수성 매질이 특징인 소낭 구조이다. 다층 막 리포좀은 수성 매질에 이해 분리되는 액체 다층이다. 이는 인지질이 과량의 수용액에 현탁될 경우 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 밀폐 구조를 형성하기 전에 자기 재배열되고 지질 이층 사이에 물과 용해된 용질을 포집한다.[참조: Ghosh and Bachhawat, 1991]. 또한, 고려 대상은 리포펙트아민-DNA 복합체이다.
시험관내 리포좀 중재된 핵산 이동 및 외래 DNA 발현은 매우 성공적이다. 문헌[참조: Wong et al., 1980]에는 배양된 닭 태아, HeLa 및 간종양 세포에서의 리포좀 중재된 핵산 이동 및 외래 DNA 발현이 나타나 있다. 문헌[참조: Nicol며 et al., 1987]에 따르면 정맥내 주사 후 래트에서의 성공적인 리포좀 중재된 유전자 전사가 수행되었다.
본 발명의 특정 양태에서, 리포좀은 적혈구 응집 바이러스(HVJ)와 복합체화될 수 있다. 이는 세포 막과의 융합을 용이하게 해주고 리포좀 캡슐화된 DNA의 도입을 촉진시킨다[참조: Kaneda et al., 1989]. 다른 양태에서, 리포좀은 비히스톤 세포질 단백질과 복합체화되거나 이와 함께 결합되어 사용될 수 있다(HMG-1)[참조: Kato et al., 1991]. 또 다른 양태에서, 리포좀은 HVJ 및 HMG-1 둘 다와 복합체화되거나 이와 함께 결합되어 사용될 수 있다. 상기 발현 작제물을 핵산의 시험관내 및 생체내 전달 및 발현에 사용한 다음, 본 발명에 적용가능하다. 세균성 프로모터를 DNA 작제에 사용할 경우, 적합한 세균 폴리머라제를 리포좀내에 포함시키는 것이 바람직하다.
p16을 암호화하는 핵산을 세포내로 전달하는데 사용할 수 있는 이외의 발현 작제물은 수용체-매개 전달 비히클이다. 이들은 거의 모든 진핵 세포내에서 수용체-매개 엔도사이토시스에 의해 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 각종 수용체의 세포 유형-특이적 분배로 인해, 전달은 고도로 특이적이다[참조: Wu and Wu, 1993].
수용체를 표적화하는 수용체-매개 유전자는 두 개의 성분으로 이루어져 있다: 세포 수용체-특이적 리간 및 DNA-결합제. 여러 리간드를 수용체-매개 유전자 전달에 사용하여 왔다. 가장 광범위하게 특징적인 리간드는 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid: ASOR)[참조: Wu and Wu, 1987] 및 트랜스페린(transferrin)[참조: Wagner et al., 1990]이다. 최근, ASOR과 동일한 수용체로 인정되는 합성 네오당단백질을 유전자 전달 비히클로서 사용하여 왔고[참조: Ferkol et al., 1993; Perales et al., 1994] 상피 성장 인자(EGF)는 또한 판상 암종 세포에 유전자를 전달하는데 사용하여 왔다[참조: Myers, EPO 0273085].
다른 양태에서, 전달 비히클은 리간드 및 리포좀을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 니콜라우(Nicolau) 등(1987)은 리포좀내로 혼입된 락토실-세라마이드, 갈락토스-말단 아시알간글리코사이드를 사용하고 헤파토사이트에 의한 인슐린 유전자의 흡수에서의 증가를 관찰하였다. 이와 같이, p16을 암호화하는 핵산은 리포좀의 존재 또는 부재하에 다수의 수용체-리간드 시스템에 의해 폐, 상피 또는 종양 세포와 같은 세포 유형내로 특이적으로 전달할 수 있다. 예를 들어, 상피 성장 인자(EGF)를 EGF 수용체의 상승조절을 나타내는 다수의 종양 세포내에서 p16을 암호화하는 매개된 전달을 위해 수용체로서 사용할 수 있다. 만노스를 사용하여 간 세포상의 만노스 수용체를 표적화할 수 있다. 또한, CD5(CLL), CD22(림프종), CD25(T-세포 백혈병) 및 MAA(흑색종)을 유사하게 표적화 성분으로서 사용할 수 있다.
특정 양태에서, 유전자 전달은 생체외 조건하에 용이하게 수행할 수 있다. 생체외 유전자 치료는 동물로부터의 세포 분리, 생체내에서 핵산의 세포내로의 전달, 및 개질된 세포를 동물내로의 복귀를 의미한다. 이는 동물 또는 페로 및 조직의 제1 배양물로부터의 조직/기관의 외과적 제거를 포함할 수 있다. 본원에 인용된 문헌[참조: Anderson et al., U. S. Patent 5,399,346]에 생체외 치료학적 방법이 완전히 기술되어 있다.
제1차 포유동물 세포 배양물을 각종 방법으로 제조할 수 있다. 시험관내 및 발현 작제물과 접촉할 경우에도 세포를 생육가능한 상태로 두기 위해서는, 세포를 정확한 비의 산소와 이산화탄소 및 영양소와 접촉시키고 미생물 오염으로부터 방치하는 것이 필요하다. 세포 배양 기술은 문헌[참조: Freshner, 1992)에 익히 기술되어 있고 본원에 참조로 인용되어 있다.
시험관내 배양 조건 동안, 발현 작제물을 p16을 암호화하는 핵산을 세포내로 전달하여 발현시킬 수 있다. 최종적으로, 상기 세포를 약제학적으로 허용되는 형태로 하기 방법에 의해 기원 동물내로 재유입시키거나, 별개의 동물에 투여할 수 있다. 이와 같이, 동물을 병리학적 조건으로 처리하는 생체외 방법을 제공하는 것은 본 발명의 범주내에 있다.
E. 기타 치료제와 배합된 p16 발현 작제물
DNA 손상 제제에 대해 내성인 종양 세포는 임상적 종양학에서 중요한 문제점을 나타낸다. 현행 암 연구의 한 목적은 화학- 및 방사선치료를 유전자 치료와 조합함으로써 이의 효과를 개선시키는 방법을 발견하는 것이다. 예를 들어, 헤르페스 단순-티미딘 키나제(HS-tK) 유전자를 레트로바이러스 벡터 시스템에 의해 뇌 종양에 전달할 경우, 연속적으로 항균제 간시클로비르에 대한 감수성을 유도한다[참조: Culver et al., 1992]. 본 발명의 문맥에서, p16 대체 치료를 화학- 또는 방사선치료학적 개입과 연결하여 사용할 수 있다는 것을 고려한다.
악성 또는 정적 세포와 같은 세포를 사멸시키기 위해, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여, "표적" 세포를 p16 발현 작제물 및 하나 이상의 DNA 손상 제제와 일반적으로 접촉시킬 수 있다. 당해 조성물은 세포를 사멸시키거나 증식을 억제하기에 유효한 합한 양으로 제공할 수 있다. 당해 방법은 세포를 p16 발현 작제물 및 DNA 손상 제제 또는 인자와 동시에 접촉시킴을 포함할 수 있다. 상기 방법은 세포를 양쪽 제제를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형과 접촉시키거나, 세포를 두 개의 별개의 조성물 또는 제형과 동시에 접촉시킴으로써 달성할 수 있 으며, 여기서 하나의 조성물은 p16 발현 작제물을 포함하고 나머지는 DNA 손상 제제를 포함한다.
또한, p16 처리는 분 내지 주 간격으로 DNA 손상 제제를 우선하거나 따른다. DNA 손상 인자 및 p16 발현 작제물을 따로 세포에 적용할 경우의 양태에서, 일반적으로 DNA 손상 제제 및 p16 발현 작제물을 세포상에 유리하게 합해진 효과를 미칠 수 있을 정도로 각각의 전달 시간 사이에 상당은 기간을 두지 않도록 한다. 상기 예에서, 세포를 2개의 제제와 각각 약 12 내지 24시간, 보다 바람직하게는 약 6시간 내지 12시간 내에 접촉하도록 하고, 단지 약 12시간의 지체 시간이 가장 바람직하다. 특정 상황에서, 처리 치간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있으나, 며칠(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 몇주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)를 각 투여간에 경과시킨다.
p16 또는 DNA 손상 제제의 1회 이상의 투여가 바람직하다고 간주된다. p16이 "A"이고 DNA 손상 제제가 "B"인 여러 조합을 사용할 수 있다:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B B/B/B/A B/B/A/B
A/A/B/B/ A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B
A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A A/B/B/B B/A/B/B
세포 사멸을 성취하기 위해, 세포를 사멸시키기에 유효한 합해진 양으로 세포에 두 제제를 전달한다.
DNA 손상 제제 또는 인자는 본원에서 세포에 적용시킬 경우 DNA 손상을 포함하는 화학적 화학물 또는 처리 방법으로 정의된다. 상기 제제 및 인자는 γ-방사선, X-레이, UV-방사선, 마이크로웨이브, 전자 방출 등과 같이 DNA 손상을 유도하는 방사선 및 웨이브를 포함한다. 또한, 각종 화학적 화합물은 DNA 손상을 유도하는 작용을 하는 "화학적 치료제"로서 기술하여, 이들 모두는 본원에서 기술된 연합 치료 방법에 사용하고자 한다. 예를 들어, 아드리아마이신, 5-플루오로우라실(5FU), 에토포사이드(VP-16), 캠프토테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C, 시스플라틴(CDDP) 및 과산화수소를 포함하는 화학적 치료제가 유용한 것으로 간주된다. 또한, 본 발명은 방사물-기재 또는 실제 화합물 중, 하나 이상의 DNA 손상제의 배합물의 사용, 예를 들어 시스플라틴과 함께 X-레이의 사용 또는 에토포사이드와 함께 시스플라틴의 사용을 포함한다. 특정 양태에서, p16 발현 작제물과의 배합물로 시스플라틴을 상기 화합물로서 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따라 암을 치료할 경우, 종양 세포를 p16 발현 작제물과 함께 DNA 손상 제제와 접촉시킨다. 이는 국부적 종양 부위를 X-레이, UV-광선, γ-레이 또는 마이크로웨이브와 같은 DNA 손상 방사선으로 조사함으로써 달성할 수 있다. 또한, DNA 손상 화합물, 예를 들어 아드리아마이신, 5-플루오로우라실, 에토포사이드, 캠프토테신, 악티노마이신-D, 미토마이신 C 또는 보다 바람직하게는 시스플라틴을 포함하는 약제학적 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 피검자에게 투여함으로써 종양 세포를 DNA 손상 제제와 접촉시킬 수 있다. DNA 손상 제제는 상기한 바와 같이 p16 발현 작제물과 배합함으로써 배합 치료학적 조성물, 또는 키트로서 제조하고 사용한다.
본원에서 관찰되고 제시한, 핵산, 특히 DNA를 직접적으로 교차 결합시켜 DNA 손상을 유발하는 제제는 상승적인 항종양형성 화합물을 형성시킨다. 시스플라틴 및 이외의 DNA 알칼화제와 같은 제제를 사용할 수 있다. 시스플라틴의 유효량을 총 3회로 매 3주 5일 동안 20mg/m2의 임상적 적용으로 사용하여 시스플라틴을 암 치료에 광범위하게 사용하여 왔다. 시스플라틴은 경구적으로 흡수되지 않으므로, 정맥내, 피하, 종양내 또는 복막내 주사로 전달시켜야 한다.
또한, DNA를 손상시키는 제제는 DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 방해하는 화합물을 포함한다. 이러한 화학치료적 화합물은 독소루비신으로 공지되어 있는 아드리아마이신, 에토포사이드, 베라파밀, 포도필로톡신 등을 포함한다. 신조직형성의 치료용 임상적 세팅에 광범위하게 사용되는 상기 화합물을 아드리아마이신의 경우 21일 간격으로 25 내지 75mg/m2의 용량으로 정맥내 거환 주사를 통해, 에토포사이드의 경우 35 내지 50mg/m2의 용량으로 정맥내 또는 경구적으로 정맥내 주사 용량의 2배를 투여한다.
핵산 전구체 및 서브유니트의 합성 및 복제를 방해하는 제제는 또한 DNA 손상을 유도한다. 다수의 핵산 전구체가 개발되어 왔다. 광범위한 시험을 거치고 용이하게 입수가능한 제제가 특히 유용하다. 상기한 바와 같이, 5-플루오로우라실(5-FU)와 같은 제제가 종양 세포에 표적화하는데 특히 유용하게 하므로, 종양 조직직에 의해 특히 바람직하게 사용된다. 매우 독성인 5-FU를 국소를 포함하는 광범위한 캐리어에 적용가능하더라도, 3 내지 15mg/kg/day 용량 범위의 정맥내 투여가 통상적으로 사용된다.
DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되는 이외의 인자는 통상적으로 공지된 γ-선, X-선 및/또는 방사성 동위원소의 종양 세포로의 직접 전달을 포함한다. DNA 손상 인자의 이외의 형태는, 예를 들어 마이크로웨이브 및 UV-방사선으로 간주된다. 이들 인자 모두는 DNA, DNA 전구체, DNA의 복제 및 복귀 및 염색체의 회합 및 유지의 손상에 광범위한 영향을 미친다. X-선의 조사량 범위는 연장 기간(3 내지 4주) 동안 매일 50 내지 200 뢴트겐, 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 조사량이다. 방사성 동위원소에 대한 조사량 범위는 광범위하게 변화되고, 동위원소의 반감기, 방출된 방사선의 강도 및 유형, 종양 세포에 의한 흡수량에 따라 달라진다.
숙련가는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences' 15th Edition, chapter 33, 특히 p. 624-652]에 따른다. 조사량의 특정 변화는 피검자를 치료하는 조건에 따라 발생한다. 투여해야할 사람은 어떠한 경우에라도 개별적 피검자에 적합한 조사량을 측정한다. 또한, 사람 투여용 제제는 생물학의 FDA에 의해 요구되는 표준에 따른 멸균, 발열성, 일반적 안정성 및 순도 표준에 적합해야 한다.
본 발명자들은 p16 발현 작제물을 p16-결합된 암에 걸린 환자에게 국부적으로 전달하는 것은 임상적 질환을 억제하는 치료학적으로 유효한 유전자를 전달하는 유효한 방법일 것으로 제안한다. 유사하게는, 화학- 또는 방사선치료는 특히 피검자 신체의 감염 부위에 적용될 것이다. 또한, p16 발현 작제물 또는 DNA 손상 제제의 전신 전달은 특정 환경, 예를 들어 광범위한 유사 분열일 발생할 경우 적합할 것이다.
p16-표적 치료와 화학- 또는 방사선치료와의 연합에 덧붙여, 기타 유전자 치료와의 연합은 유리할 것으로 간주된다. 예를 들어, p16 및 p53 돌연변이의 동시 표적화는 개선된 항암 치료를 발생시킬 수 있다. 가능한 이외의 종양-관련 유전자는, 예를 들어 p21, Rb, APC, DCC, NF-1, NF-2, WT-1, MEN-I, MEN-II, BRCA1, VHL, FCC, ras, myc, neu, raf, erb, src, fms, jun, trk, ret, gsp,hst, bcl 및 abl은 상기 방법으로 표적화할 수 있다.
F. p16을 암호화하는 핵산 또는 마커로서의 p16
특정 양태에서, p16 또는 p16 펩타이드를 암호화하는 핵산을 진단 방법에 사용할 수 있다. p16을 암호화하는 p16 핵산의 부재 또는 감소/증가된 수준은 암과 같은 질환 상태의 지표일 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 p16을 암호화하는 핵산 또는 마커로서의 p16을 사용함을 포함한다. p16을 암호화하는 핵산 또는 p16을 검출하는데 사용할 수 있는 다수의 방법이 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있다. p16을 암호화하는 핵산을 검출하는 2가지의 통상적 방법은 써던 및 노던 분석 및 이의 번형이다. p16 메시지의 수준을 종양 형성을 지시하는 마커로서 사용할 수 있다.
또 다른 접근법은 실시예 1에 기술된 웨스턴 블롯팅 및 FACS 분석으로 p16에 결합하는 항체를 사용하여 면역검정법으로 p16을 검출하는 것이다. 2가지 기술을 사용하여 세포 표면상에서의 p16 발현을 검출한다. 검출 방법은 상기 기술에 제한되지 않으면, 본 발명에 포함될 수 있는 다수의 다른 방법이 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있다.
기타 바람직한 면역검정법은 당해 분야에 공지된 각종 유형의 효소-결합된 면역흡착 검정법(ELISA) 및 방사성면역검정법(RIA)이다.
조직 절편을 사용하여 면역 조직화학적 검출은 특히 유용하다.
ELISA's 에서 항-p16 항체(본원에서 기술한 Ab669)는 단백질 친화성을 나타내는, 예를 들면 폴리스티렌 미세적정 플레이트와 같은 선택된 표면위에 고정되있다. 그 후 세포 또는 세포 물질, 예를 들면 임상적 샘플을 함유하는 시험 조성물을 웰에 가한다. 결합하고, 세척하여 비-특이적으로 결합 면역복합체를 제거한 후 결합 p16을 검출할 수 있다. 검출은 일반적으로 검출할 수 있는 표지에 결합된 다른 항-p16 항체의 부가로 달성될 수 있다. ELISA의 이러한 유형은 단순한 "샌드위치 ELISA"이다. 검출은 또한 2차 항-p16 항체의 부가로 달성될 수 있고, 후속적으로 3차 항체의 부가는 2차 항-p16 항체에 대한 결합 친화성을 갖고, 3차 항체는 검출가능한 표지에 결합되있다.
다른 ELISA의 예에서, p16의 수준에 대해 시험된 세포 물질을 함유하는 샘플은 웰 표면위에 교정되 있고 그후 항-p16 항체와 접촉한다. 결합과 적당한 세척후 결합 면역복합체는 직접 검출될 수 있다. 다시 면역복합체는 1차 항-p16 항체에 대한 결합 친화성을 갖는 2차 항체를 사용하여 검출될 수 있고, 2차 항체는 검출가능한 표지에 결합되있다.
또한 시험 샘플이 공지된 양의 표지된 p16항원 또는 항체와 결합에 대해 경쟁하는 ELISA 경쟁은 가능하다. 공지된 샘플의 반응종의 양은 코팅된 웰과 배양하기 전 또는 동안 공지된 표지종과 샘플을 혼합하므로 측정된다. 샘플중에 존재하는 반응종은 웰에 결합하기 유용한 표지종의 양을 감소시키는 작용을 하고, 따라서 최종 신호를 감소시킨다.
사용된 포맷과 무관하게 ELISA는 일반적인 특정 특징, 예를 들면 코팅, 배양 또는 결합, 비특이적 결합 종을 제거하기 위한 세척, 및 결합 면역복합체의 검출을 갖는다. 상기는 하기와 같이 기술된다:
플레이트를 항원 또는 항체로 코팅하는데 있어, 하나는 일반적으로 항원 또는 항체의 용액으로 플레이트의 웰을 밤새 또는 특정 기간의 시간 동안 배양한다. 그 후 플레이트의 웰을 세척하여 불완전하게 흡수된 물질을 제저한다. 그 후 웰의 잔존 가능한 표면을 시험 항 혈청에 대해 항원적으로 중성인 비특이적 단백질로 "코팅"한다. 상기는 보바인 혈청 알부민(BSA), 카제인, 젤라틴 및 밀크 분말 용액을 포함한다. 브록킹 용액은 또한 비특이적 결합을 감소시키는데 큰 도움을 주는 세제 트윈 20을 일반즉으로 함유한다. 코팅은 고정화 표면상의 비특이적 흡착 부위를 브로킹하게 하고, 따라서 표면상의 항혈청의 비특이적 결합에 의해 발생된 백그라운드를 감소시킨다.
ELISA에서 직접적 방법 보다 2차 또는 3차 검출을 사용하는 것이 더일반적이다. 따라서 웰에 p16 또는 항-p16의 결합, 백그라운드를 감소시키기 위한 비활성 물질과의 코팅, 비결합 물지을 제거하기위한 세척 후, 고정화 표면은 면역복합체(항원/항체)이 형성되도록하는 효과적인 조건하에서 시험될 임상적 또는 생물학적 샘플과 접촉한다. 그후 면역복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체, 또는 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드롸 결합하는 2차 결합 리간드 또는 항체를 필요로한다.
"면역복합체(항원/항체)이 형성되도록하는 효과적인 조건하에서"는 조건이 바람직하게 항원 또는 항체를 용액, 예를 들면 BSA, 보바인 감마 글로블린(BGG) 및 인산 완충 식염수(PBS)/트윈 20으로 희석함을 포함한다. 상기 부가된 물질은 또한 비특이적 백그라운드의 감소를 돕는 경향이 있다.
또한 적합한 조건은 배양이 특정 효과적인 결합을 가능케하는 온도 및 충분한 시간 동안 수핸됨을 의미한다. 배양 단계는 전형적으로 약 1 내지 2 내지 4 시간, 온도는 바람직하게는 25℃내지 27℃ 이거나 약 4℃정도에서 밤새 수행할 수 있다.
ELISA의 하기의 모든 배양 단계에서 접촉된 표면은 비-복합 물질을 제거하기 위해 세척된다. 세척은 종종 PBS/트윈 20 또는 보레이트 완충용액으로의 세척을 포함한다. 후속적으로 시험 샘플과 원래의 결합 물질간의 특이적 면역복합체를 형성하고, 연속적 세척하여 면역복합체의 소량까지의 발생도 측정할 수 있다.
검출 수단을 제공하기 위해 2차 또는 3차 항체는 라벨과 결합하므로 검출할 수 있다. 바람직하게 이는 적당한 색소 기질과 배양하므로 색을 발생하는 효소이다. 따라서, 예를 들면 1차 또는 2차 면역복합체를 우레아제, 글루코즈, 옥시다제, 알칼린 포스파타제 또는 수소 퍼옥시다제-결합 항체와 추가의 멱역 복합체 형성의 진행이 바람직하게하는 시간 및 조건하에서 접촉시키고 배양하는 것이 바람직하다(예: PBS/트윈-20과 같은 PBS-함유 용액에서 실온에서 2시간 동안 배양).
표지된 항체와 배양하고, 연속적으로 비결합 물질을 제거하기 위해 세척한 후 표지의 양은, 예를 들면 색소성 기질[예: 우레아, 브로모크레졸 퍼플 또는 2,2'-아지노-디-(3-에틸-벤즈티아졸린-6-설폰산(ABTS) 및 H2O2]과, 배양함으로써, 퍼옥시다제의 경우에는 효소 표지로 정량된다. 그 후 양은 색 진행정도, 예를 들면 가시 스펙트럼 스펙트로포토미터를 사용하여 측정함으로써 달성된다.
F. 약제학적 조성물 및 투여 경로
p16을 암호화하는 핵신을 포함하는 발현 작제물의 임상적 적용이 구축된 경우, 의도된 적용을 위한 적합한 약제학적 조성물로서 복합체를 제조할 필요가 있다. 일반적으로 이는 사람 또는 동물에 유해할 수 있는 어떠한 기타 불순물이외에도 본질적으로 발열원을 제거한 약제학적 조성물을 제조함을 수반한다. 또한 복합체를 안저하게 하고, 목적 세포에 복합체가 흡수 되도록하는 적합한 염 및 완충용액을 일반적으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 수성 조성물은 약제학적으로 허영되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 핵산의 발현 작제물의 유효량을 포함한다. 상기 조성물은 또한 접종물이라 칭할 수 있다. "약제학적으로 또는 약리학적으로 하용되는"이란 문구는 작합물로 동물 또는 사람에게 투여된 경우 역, 알레르기성 도는 기타의 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자적 실체 및 조성물로 칭한다. 본 원에서 사용된 바대로 "약제학적으로 허용되는 담체"는 특정 및 모든 용매, 현탁액 배지, 코팅, 항세균성 및 항진균성 물질, 등장 및 흡수 지연 물질 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질에 대한 상기 배지 및 물질의 용도는 당래 기술분야에서 공지되어 있다. 어떠한 통상적인 배지 또는 물질이 활성 성분과 상용되는 경우를 제외하고 치료학적 조성물에서 이의 용도는 예측된다. 부수되는 활성 성분은 또한 조성물로 혼입될 수 있다.
유리 염 또는 약제학적으로 허용되는 염으로써 활성 화합물 용액은 계면 활성제, 예를 들면 하이드록시프로필셀룰로즈와 적다하게 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산물은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 저장 및 용도의 알반적인 조건하에 상기 제조는 미생물의 성장을 억제하는 방부제를 함유한다.
본 발명의 발현 작제물 및 전달 비히클은 약제학적 제조 부류를 포함한다. 본 발명에 따르는 치료학적 조성물의 투여는 목적 조직이 그 결로를 통해 유용하는 한 어떠한 일반 경로이다. 이는 경구, 비강, 구강, 직장, 질내, 국부를 포함한다. 국부적 투여는 피부암의 치료를 위해, 화학 치료로 유도된 탈모증 또는 기타의 피부의 과증식성 장애를 억제하기에 특히 유용하다. 또한 투여는 정위로, 피부내로, 피하로, 근육내로, 복막내로 도는 정맥내로의 주사이다. 상기 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체, 완충용액 도는 기타 부형제를 포함하는 약제학적으로 허용되는 조성물로 정상적으로 투여된다.
본 발명의 치료학적 조성물은 용액 또는 현탁액의 주사가능한 조성물 형태로 유용하게 투여될 수 있고, 주사 이전의 액체중에 용액 또는 형탁액에 적합한 고체 형태는 또한 제조될 수 있다. 상기 제조는 또한 유화될 수 있다. 상기 목적을 위한 전형적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 예를 들면 조성물은 인산 완충 식염수 ㎖당 사람 혈청 알부민 10㎎, 25㎎, 50㎎ 또는 100㎎이하를 함유할 수 있다. 기타 약제학적으로 허용되는 담체는 염, 보본제, 완충용액 등을 함유하는 수용액, 무독성 부형제를 포함한다. 비-수용성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 및 에틸로에이트와 같은 주사 가능한 유기산 에스테르이다. 수용성 담체는 물, 알콜/수용액, 식염수, 염화나트륨, 링거 덱스트로즈 등과 같은 비경구 비히클을 포함한다. 정맥용 비히클은 용액 액체 및 영양 재공급을 포함한다. 보존제는 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제 및 비활성 기체를 포함한다. 약제학적 조성물의 다양한 pH 및 추출 농도는 공지된 기준에 따라 조절된다.
추가의 제형은 경구 투여용으로 적합하다. 경구 투여용 제형은, 예를 들면 약제학적 등급의 만니톨, 락토오즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 탄산마그네슘등으로써의 상기 전형적 부형제를 포함한다. 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 지족적 유출 제형 또는 분말의 형태이다. 경로가 국부일 경우 형태는 크림, 연고, 고약 또는 분무제일 수 있다.
치료학적 제제의 유효량은 의도하는 목적을 기준으로, 예를 들면 (ⅰ)종양 세포증식의 억제, 또는 (ⅱ) 종양 세초의 제거를 위해 결정된다. 용어"단위 복용량"은 주제의 용도를 위해 적합한 물질적으로 분리된 단위를 지칭하고, 치료학적 조성물의 예측된 양을 함유하는 각 단위는 이의 투여, 예를 들면 적당한 경로 및 치료 양생법과 함께 상기 기술된 목적하는 반응을 생성하기 위해 계산된다. 치료 회수 및 단위 복용양 모두에 따라 투여되는 양은 치료되는 피검자, 피검자의 상태 및 목적하는 보호에 의존한다. 치료학적 조성물의 미세량은 또한 의사 결정에 의존하고, 각 개인에 따라 다르다.
G. 키트
종양 세포증식을 억제하고, 세포를 형질전환시키거나 종양 세포를 검출할 필요가 있는 모든 중요한 물질 및 시약은 키트내에서 함께 형성될 수 있다. 이는 일반적으로 선택된 발형 작제물을 포함한다. 또한 발현 작제물의 복제 및 상기 복제용 숙주 세포를 위한 다양한 배지를 포함할 수 있다. 상기 키트는 각 개체의 시약용 명백한 콘테이너를 포함한다.
키트의 성분이 하나 이상의 액체 용액을 제공할 경우, 액체 용액은 바람직하게는 수용액, 특히 바람직하게는 살균 수용액을 갖는 수용액이다. 생체내 용도에서 발현 작제물은 약제학적으로 허용되는 주사 가능한 조성물로 제형화될 수 있다. 이러한 경우에, 컨테이너 수단은 그 자체로 흡입, 주사, 피펫, 점안 또는 기구와 같은 기타일 수 있고, 이로 부터 제형은 동물의 체강, 예를 들면 폐의 감염된 부위에 주사하여 적용될 수 있거나 기타 키트의 성분과 혼합하여 적용되기까지 한다.
키트의 성분은 또한 건조되거나 동결건조 형태로 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조 형으로 제공될 경우, 재구성은 일반적으로 적당한 용매의 부가에 의한 것이다. 용매는 또한 다른 컨테이너 수단으로 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 또한 전형적으로 상업적으로 시판에 제한되는 바이알, 예를 들면 목적하는 바이알이 보유된 주입 또는 공기-주조된(blow-molded) 플라스틱 컨테이너를 포함한다.
컨테이너의 수 또는 유형에 관계없이 본 발명의 키트는 또한 동물의 체내에 주사/투여를 보조하거나 또는 궁극적 복합체 조성물을 넣는 기구를 포함하거나 기구와 함께 팩키지될 수 있다. 상기 기구는 흡입, 주사, 피펫, 핀셋, 계량 스푼, 점안 또는 상기 의학적으로 인정되는 어떠한 전달 비히클일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 양태의 예시를 포함한다. 실시예에서 후속적으로 설명하는 기술은 본 발명의 실행에서 잘 작용하기 위해 본 발명의 발명자들에 의해 발견된 기술로 제시된다고 공지되있고, 따라서 이의 실행을 의해 바람직한 모드로 구성되어 있다고 생각될 수 있다. 그러나 당해 기술 분야의 숙련인들은 현 발표에 비추어 보아 본 발명의 특성 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 공지되어지고 여전히 동일한 혹은 유사한 결과를 얻는 특정 양태로 많은 변화를 가할 수 있다는 점을 인지해야 한다.
A. 물질 및 방법
세포주.
세포주 293은 10% 열-불활성화된 말의 혈청으로 보완된 에글(Eagle)의 고형화된 기본 배지로 유지된다. 사람의 NSCLC 세포주 H226Br, H322를 5%의 태아인 소의 혈청을 포함하는 RPMI 배지에서 생육한다. 사람의 정상적인 가슴 세포주 HBL100을 10%의 태아인 소의 혈청으로 보완된 F12 배지에서 생육한다.
p16INK4 cDNA 서브클로닝(Subcloning).
원형 p16INK4cDNA를 시발체 5'-ATGGAGCCTTCGGC TGACTGG-3'(서열 3) 및 5'-CCTGTAGGACCTTCGGTGACT-3'(서열 4)를 사용하는 RT-PCRTM에 의해 정상적인 사람의 임파구의 총 RNA로부터 부연 설명한다. PCRTM생성물을 pCRTM벡터(인비트로겐, 샌디에고, 켈리포니아) 내에서 서브클론하며 이중 나선의 DNA 서열화로 입증한다. 젠뱅크(GenBank)의 p16INK4cDNA 서열의 수정 때문에 추가적인 42 염기쌍의 서열을 차후에 PCRTM두 단계로 클론된 p16INK4cDNA의 5'말단에 첨가한다. 일차의 PCRTM단계는 시발체 A(5'-GATCCGGCGG CGGGGAGCAGCATGGAGCCTTC GGCTGACTGG-3';서열 5) 및 시발체 C(5'-GCCTCTCTGGTTCTTTCA-3';서열 6)를 사용한다. 이차의 PCRTM단계는 시발체 B(5'-CGGGCGGGGAGCAGCATGGAGCCGG CGGCGGGGAGC-3';서열 7) 및 시발체 C를 사용한다. pCRTM벡터 pCR-p-16 내에서 최종 야생형 p16INK4cDNA서열을 다시 이중 나선의 DNA 서열화로 입증한다.
pAd-p16 작제.
셔틀 벡터 pEC53(쟝 Zhang 등,1994)을 제한효소 HinD Ⅲ AND Hpa Ⅰ로 침지한다. 1% 아가로스 겔을 통해 침지된 DNA을 작용시킴으로써 벡터 백본(backbone)을 p53 cDNA로부터 분리한 후 상기 겔로부터 정제시킨다. p16INK4cDNA을 pCR-p16으로부터 작용시킨 다음 정제된 셔틀 벡터 백본(backbone)으로 결찰시킨다. 최종 생성물,pAd-p16은 사람의 CMV 촉진제(보스하아트 Boshart 등,1985), 야생형 p16INK4cDNA, 및 SV40 초기 폴리아데닐화 신호를 포함하는 p16INK4발현 카세트를 운반한다.
재결합 p16INK4아데노바이러스의 생성.
재결합 Ad5CMV-lacZ 아데노바이러스 DNA를 제한효소 XbaⅠ 및 ClaⅠ로 침지시킨 다음 32 kb 부분 아데노바이러스 DNA 단편을 0.3% 아가로스 겔 내에서 정제시킨다. DNA 단편 및 pAd-p16 플라스미드 DNA를 CaPO4-매개된 형질도입에 의해 293 세포로 상호 형질도입한다. 형질도입된 세포를 배지 내에서 시토파틱 효과가 나타날 때까지 방치한다. 새롭게 형성된 p16INK4재결합 아데노바이러스(Ad-p16)을 세포 배양 상징액으로부터 준비한 DNA 샘플의 PCRTM분해로 확인한다. 대장균의 lacZ 유전자를 운반하는 재결합 아데노바이러스 Ad5CMV-lacZ는 Ad-p16의 구조와 유사한 구조를 지니며 본 연구에 있어서의 조절을 위한 수단으로 사용된다.
바이러스성 저장용액, 적정액 및 감염.
Ad-p16 및 Ad5CMV-lacZ 바이러스의 각각의 클론을 플라크 정제로 채취한 다음 그라함(Graham) 및 프레벡(Prevec)(1991)의 방법에 따라 293세포 내에서 번식시킨다. 바이러스성 적정액을 플라크 분석으로 결정한다. 바이러스성 용액을 세포 단일층에 첨가한 뒤 매 5분마다 간단히 휘저어주면서 30분동안 실온에서 배양시키면서 세포주을 감염시킨다. 뒤이어 배양 배지를 첨가시키고 감염된 세포를 37℃ 배양기로 돌려 보낸다.
종양발생 분석.
H460 세포를 50 PFU/세포의 MOI에서 Ad-p16 혹은 Ad5CMV-lacZ를 가지고 감염시킨다. 동수의 세포를 단지 감염 모형으로서의 배지를 가지고 처리한다. 감염 24시간 후에 처리된 세포를 거둬들이고 PBS 를 가지고 두 번 세척한다. 각각의 처리시, PBS 0.1ml 용적 내에서 5×106세포를 BALB/c nu/nu 쥐의 배측 옆구리로 피하조직을 통해 투입시킨다(할란 스프라그-듀레이 컴퍼니,휴스턴, 텍사스). 투입 후에 처리한 쥐를 매 주 검사한다. 3주 말기에 종양 형성을 검토한다. 직교 직경의 생성물 제곱근으로 계산된 평균 종양 직경으로 구형을 추정함으로써 종양의 부피를 측정한다.
B.결과
Ad-p16 재결합 바이러스 생성.
유전자 전이 벡터로서의 아데노바이러스의 이용 중 하나는 광범위한 숙주 세포 내에서 고도의 감염성을 지니는 것이다(버크너 Berkner,1988). 사람의 암 유전자 치료를 위한 아데노바이러스-유도 셔틀 벡터, pEC53을 사전에 형성시킨다(Zhang 등,1994). 이러한 벡터로부터 유도된 재결합 바이러스, Ad5CMV-p53은 H460, H322, 및 H226Br을 포함하는 일부 간암 세포주에서 97% 내지 100%의 감염율을 지닌다. 본 연구에 있어서, pEC53내의 p53 유전자를 완전한 길이의 p16INK4cDNA로 대치한다. 최종 생성물, pAd-p16는 사람의 CMV 촉진제(보스하아트 Boshart 등 1985), 야생형 p16INK4cDNA, 및 SV40 초기 폴리아데닐화 신호를 포함하는 p16INK4유전자 발현 카세트를 운반한다. 재결합 바이러스, Ad5CMV-lacZ 중의 DNA의 Xba Ⅰ 침지에 의해 생성된 아데노바이러스 DNA의 32kB 부분 단편을 pAd-p16 플라스미드를 가지고 상동 재결합을 위해 293 세포로 상호형질도입시킨다. 재결합 바이러스성 생성물, Ad-p16은 lacZ 유전자가 p16INK4유전자로 대치되었다는 점을 제외하고는 Ad5CMV-lacZ의 게놈 구조와 유사한 게놈 구조를 지닌다. 재결합 아데노바이러스의 E1 영역이 p16INK4유전자 혹은 lacZ 유전자로 치환되었기 때문에 이들은 E1 결실을 보완하는 293세포에서만 번식된다. Ad5CMV-lacZ을 Ad-p16을 위한 바이러스성 조절 수단으로 사용한다.
사람의 폐암 세포에서의 외인성 p16INK4 단백질의 발현.
세 가지 사람 NSCLC 세포주;H460, H322, 및 H226Br;을 본 연구를 위해 선택했다. H460은 상동의 p16INK4유전자 결실을 운반하나(캠 Kamb 등,1994) p53 유전자(타까하시 Takahashi 등,1989) 및 Rb 유전자(하버 Harbour 등,1988)는 야생형이다. H322는 상동의 p16INK4유전자 결실(오카모토 Okamoto 등,1994), 야생형 Rb 유전자(하버 Harbour 등,1988), 및 코돈 248에서 상동의 p53 돌연변이( 미쓰도미 Mitsudomi 등,1992)를 운반한다. H226Br은 서열되지 않는 서던 블랏(southern blot) 및 PCRTM분석에 의해 결실된 p16INK4유전자를 운반하나 단백질 레벨에서 p16INK4을 발현하지는 않는다. 이는 코돈 254에서 상동의 p53 돌연변이를 운반하며(후지와라 Fujiwara 등,1994) 야생형 Rb 단백질을 발현한다(하버 Harbour 등,1988). 배양된 정상적인 사람의 가슴 상피 세포주, HBL100은 야생형 p16INK4, 야생형 p53 및 야생형 RB 유전자를 발현하며 본 연구에서 정상 세포주 조절에 사용된다. 세포주 HBL100만이 바이러스성 감염 전에 p16INK4단백질을 발현한다. 외인성 p16INK4단백질의 고수준의 발현을 얻기 위해서 사람의 CMV 촉진제(보스하트 Boshart 등,1985)를 사용해 p16INK4유전자 발현을 유도한다. Ad-p16으로 감염시킨 후에 고수준의 외인성 p16INK4단백질 발현을 H460, H322, 및 H226Br 세포 내에서 획득한다. HBL100 내에서의 p16INK4단백질의 레벨은 본 세포주에서 외인성 p16INK4단백질 발현을 나타내는 Ad-p16 감염 후에 보다 높다. 결과적으로 일어나는, 본 원에 소개된 종양 세포주상의 p16INK4단백질의 효과를 하기 분석을 통해 검사한다.
페암 세포 성장에 대한 p16INK4단백질의 효과.
NSCLC 세포 라인인 H460, H322 및 H226Br과 정상 유방세포 라인인 HBL100을 세포당 50 PFU로 Ad-p16또는 Ad5CMV-lacZ로 감염시킨다. 3 세트의 감염시킨 세포 및 위감염시킨 세포의 수를 6일간 매일 측정하고, 매일의 평균 세포수를 계측한다. 그림 2에서 보는 것처럼, Ad-p16을 감염시킨 H460, H322 및 H226Br 세포의 성장률은 Ad5CMV-lacZ를 감염시킨 세포와 비교해 볼 때, 각각, 94%, 85% 및 97%정도 억제되었다. 그러나, Ad-p16을 감염시킨 HBL100의 성장률은 Ad5CMV-lacZ를 감염시킨 HBL100 세포와 비교해 볼 때, 3% 미만으로 억제되었다. 이것은 p16INK4유전자를 이러한 세포 라인에 형질도입하는 것은 p16INK4유전자 발현을 회복함으로써 세포증식을 특이적으로 억제할 수 있음을 암시한다. 모든 세포 라인에 대해 위감염시킨 세포에 비해 Ad5CMV-lacZ를 감염시킨 세포의 성장률은 낮고 이는 발현된 바이러스 단백질과 lacZ 유전자에 의해 야기된 세포독성을 암시한다. 이런 바이러스성 세포독성은 보다 높은 감염중복도(MOI)가 사용될 때 증가한다. 세포 라인에 따라 이런 효과에 대해 다른 민감도를 가진다.
Ad-p16에 매개되는 세포주기 정지.
p16INK4단백질은 CDK4 및 CDK6의 활성을 억제할 수 있으며, 따라서 증식세포가 G1기에서 S기로 들어가는 것을 차단한다고 알려져 있다(Serrano et al., 1993; Serrano et al., 1995). Ad-p16에 의해 매개되는 성장률 억제 기작을 조사하기위해, H460, H322 및 H226Br 세포를 성장률 분석에서 기술된 것처럼 감염시키고 유속 세포측정기로 세포주기 분석을 위해 감염 24시간후 세포를 거두어 들였다. 표 4에서 보는 것과 같이, Ad-p16에 의해 매개된 p16INK4단백질의 발현은 p16INK4유전자가 제거된 종양세포 라인에서 G1기 세포의 수를 상당히 증가시키지만 S 및 (G2+M)기의 세포 수는 감소시키며, 이는 G1정지의 유도를 암시한다. 반대로, 어떠한 G1정지도 p16INK4단백질을 정상 발현하는 유방세포 라인인, HBL100에서는 관찰되지 않는다. 이런한 결과는 p16INK4단백질이 p16INK4단백질을 발현하지 않는 세포 라인에서 G1정지를 매개함으로써 종양세포의 성장을 억제한다는 것을 암시한다.
Ad-p16에 의해 매개되는 p16INK4의 세포 주기 효과에 대한 유속 세포측정 분석
세포의 %
세포 유형 및 감염 바이러스 G0/G1 S G 2 /M
HBL100/Ad-p16 36 42 22
HBL100/Ad5CMV-lacZ 31 44 25
HBL100/배지 31 42 27
H460/Ad-p16 88 9 3
H460/Ad5CMV-lacZ 41 32 27
H460/배지 39 35 26
H322/Ad-p16 80 6 14
H322/Ad5CMV-lacZ 30 36 34
H322/배지 30 36 34
H226Br/Ad-p16 80 11 9
H226Br/Ad5CMV-lacZ 20 53 27
H226Br/배지 26 44 30
수치는 대표적인 분석에 대해 나타낸다. 세포 성장률 결정 분석과 동일한 방법으로 세포를 감염시킨다. 감염 24시간 후, 세포를 1% 트윈-20으로 처리하고 프로피듐 요오드로 염색하고 유속 세포측정기를 사용해 DNA 합성과 세포 주기 상태를 분석한다. 유속 세포측정 분석은 공냉식 15mW 488nm 아르곤 레이저가 장착된 FACcan(Becton Dickison, San Jose, CA)을 사용해 수행한다. 650nm의 차단 파장을 가진 긴 패스 필터를 통해 적색 형광이 측정된다.
Ad-p16에 의해 매개되는 발종양성의 억제.
Ad-p16바이러스가 사람 NSCLC세포의 발종양성을 억제할 수 있는지를 결정하기 위해, BALB/c nu/nu 마우스에 H460 세포를 피하 주입하여 종양 형성을 유도시킨다. 각각의 마우스에는 1회 주사로 5 x 106개의 세포를 주입시키며, 이들 세포는 24시간 동안 세포당 50 PFU로 Ad-p16또는 Ad5CMV-lacZ로 감염시킨 세포이다. 배지만으로 감염시킨 H460 세포는 위감염시킨 대조군으로 사용된다. 각각의 처리는 4마리의 마우스에 대해 취한다. 마우스를 관찰하고 종양이 나타나면, 3주일 기간 동안 종양을 계측한다. 두 개의 독립적인 연구가 실험의 재현성을 확인하기 위해 수행되고 각각의 연구에서 나온 자료는 표 5에서 요약되어 있다. Ad-p16을 처리한 세포는 생체내에서 종양 성장이 상당히 억제된다. 배지가 처리된 세포를 받은 마우스의 10%와 Ad5CMV-lacZ처리된 세포를 받은 마우스의 87.5%에서 종양이 발생한다. 한편, 두 연구에서 Ad-p16이 처리된 세포를 받은 마우스의 50%만이 종양이 생기고 평균 부피는 Ad5CMV-lacZ바이러스가 처리된 세포를 받은 마우스의 부피의 11% 및 배지가 처리된 마우스의 부피의 6%에 불과하다(두명의 보조학생의 T 테스트에 의해P＜ 0.001 ). 따라서, 폐암 세포의 발종양성은 선행된 Ad-p16처리에 의해 억제되고, 이는 p16INK4단백질이 치료 효과를 갖을 수 있다는 것을 암시한다.
누드 마우스에서 H460 세포의 발종양성에 대한 p16INK4의 효과
처리 종양수/생쥐수(%) 평균부피(mm3±SD)
실험 1 배지 4/4 (100%) 1047.3 ± 104.7
Ad5/CMV-LacZ 4/4 (100%) 740.5 ± 205.5
Ad-p16 0/4 (0%) -
실험 2 배지 4/4 (100%) 1158.6 ± 200.2
Ad5/CMV-LacZ 3/4 (75%) 658.3 ± 144.3
Ad-p16 4/4 (100%) 71.2 ± 19.6
H460 세포에 24시간 동안 세포당 50 PFU의 감염중복도로 바이러스를 감염시키고 마우스당 5 x 106개의 세포를 피하 주입한다. 종양 크기는 3주일 기간의 마지막에 결정된다.
Ad-p16의 치료 잠재력은 BALB/c nu/nu 마우스 모델에서 실험된다. 피하의 종양혹은 5 x 106개의 H460 세포로 마우스에 피하 주사된 후 20시간 동안 자란다. 형성된 종양에 Ad-p16(1010PFU/종양), Ad5/CMV-LacZ(1010PFU/종양) 또는 PBS을 직접 주입한다. 그림 3에서 보이는 것처럼, 주입 18시간후 Ad-p16이 처리된 종양의 평균 부피는 대조군 바이러스가 처리된 종양 부피의 49% 및 PBS가 처리된 종양 부피의 34%에 지나지 않는다(두명의 보조학생의 T 테스트에 의해 p ＜ .001).
참조문헌
앞서 기술한 내용을 보충하는 실시예 과정 또는 다른 상세한 설명을 제공할 수 있는 하기의 참조문헌이 본원에 참조문헌으로서 인용된다.
[서열 목록]
(1) 일반 정보:
(i) 출원인:
(A) 성명: 보어드 오브 리전츠, 더 유니버서티 오브 텍사스 시스템
(B) 거리: 웨스트 7번 스트리트 201
(C) 도시: 오스틴
(D) 주: 텍사스주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호 (ZIP): 78701
(ii) 발명의 명칭 : p16 발현 작제물 및 암 치료에 있어서의 이의 용도
(iii) 서열수: 7
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 타입: 플로피 디스켓
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트 웨어: 패이턴트인 릴리즈 #1.0, 버젼 #1.30 (EPO)
(vi) 선행 출원 데이터:
(A) 출원 번호: US 08/502,881
(B) 출원일: 1995년 7월 17일
(C) 분류 : 미확인
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 987 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi)서열 기술
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 156 염기쌍
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 42 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술
(2) 서열 6에 대한 정보
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술:

Claims (27)

  1. 핵산이 프로모터의 전사 조절하에 있는, 진핵 세포에서 작용성인 프로모터 및 p16을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 작제물.
  2. 제1항에 있어서, 폴리아데닐화 시그날을 추가로 포함하는 발현 작제물.
  3. 제1항에 있어서, 선택성 마커를 추가로 포함하는 발현 작제물.
  4. 제1항에 있어서, 핵산이 cDNA인 발현 작제물.
  5. 제1항에 있어서, 핵산이 게놈성 DNA인 발현 작제물.
  6. 제1항에 있어서, 핵산이 cDNA/게놈성 DNA 하이브리드인 발현 작제물.
  7. 제1항에 있어서, 복제 결핍 아데노바이러스인 발현 작제물.
  8. 제7항에 있어서, 아데노바이러스가 E1 영역의 적어도 일부가 결여되어 있는 발현 작제물.
  9. 제1항에 있어서, 핵산이 프로모터에 대하여 센스(sense) 배향으로 위치하는 발현 작제물.
  10. 제1항에 있어서, 핵산이 프로모터에 대하여 안티센스(antisense) 배향으로 위치하는 발현 작제물.
  11. (i) 핵산이 프로모터의 전사 조절하에 있는, 진핵세포에서 작용성인 프로모터 및 p16을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 작제물 및
    (ii) 약제학적으로 허용되는 완충액, 용매 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  12. (i) 핵산이 프로모터의 조절하에 있고 프로모터에 대하여 센스 배향으로 위치하는, 진핵세포에서 작용성인 프로모터 및 p16을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 작제물을 제공하는 단계 및
    (ii) 발현 작제물을 p16 작용이 결여된 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여, p16 작용이 결여된 세포에서 p16 작용을 복구시키는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 세포가 형질전환된 세포이고, 접촉으로 인해 형질전환된 표현형이 역전되는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 세포가 종양 세포인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 종양 세포가 폐암, 방광암 또는 흑색종 세포인 방법.
  16. 제12항에 있어서, 발현 작제물이 복제 결핍 아데노바이러스인 방법.
  17. (i) 핵산이 프로모터의 조절하에 있고 프로모터에 대하여 안티센스 배향으로 위치하는, 진핵세포에서 작용성인 프로모터 및 p16을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 작제물을 제공하는 단계 및
    (ii) 발현 작제물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여, 세포에서 p16 작용을 억제하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 세포가 접촉에 의해 형질전환되는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 발현 작제물이 복제 결핍 아데노바이러스인 방법.
  20. (i) (a) 핵산이 프로모터의 조절하에 있고 프로모터에 대하여 센스 배향으로 위치하는, 진핵세포에서 작용성인 프로모터 및 p16을 암호화하는 핵산을 포함하는 아데노바이러스 및 (b) 약제학적으로 허용되는 완충액, 용매 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고,
    (ii) 약제학적 조성물을 포유 동물에게 투여함을 포함하여, 암에 걸린 포유 동물을 치료하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 포유 동물이 사람인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 정맥내 주사를 통해 투여하는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 정위(orthotopic) 주사를 통해 투여하는 방법.
  24. 제20항에 있어서, 암이 폐암, 방광암 또는 흑색종인 방법.
  25. 핵산이 프로모터의 전사 조절하에 있는, 진핵세포에서 작용성인 프로모터 및 p16을 암호화하는 핵산을 포함하는 발현 작제물 및 약제학적으로 허용되는 완충액, 용매 또는 희석제를 적합한 콘테이너 수단에 포함하는 키트.
  26. p16을 암호화하는 핵산을 검출하여 샘플에서 암 세포를 검출하는 방법.
  27. p16을 검출하여 샘플에서 암 세포를 검출하는 방법.
KR1019980700331A 1995-07-17 1996-07-17 p16 발현 작제물 및 암 치료에서의 이의 용도 KR19990029028A (ko)

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