ES2245790T3

ES2245790T3 - Uso de proteina inhibidora de la apoptosis neuronal (naip).

Info

Publication number: ES2245790T3
Application number: ES97902522T
Authority: ES
Inventors: Robert G. Korneluk; Alexander E. Mackenzie; Natalie Roy; George Robertson
Original assignee: University of Ottawa
Current assignee: University of Ottawa
Priority date: 1996-01-19
Filing date: 1997-01-17
Publication date: 2006-01-16
Anticipated expiration: 2017-01-17
Also published as: WO1997026331A3; DE69733861D1; ATE301192T1; US7235372B2; EP1609864A3; DK0815231T3; CA2215793A1; US20060172348A1; EP0815231B1; JPH11503620A; WO1997026331A2; US6994957B2; AU1614997A; EP1609864A2; EP0815231A2; DE69733861T2; JP4005135B2; GB9601108D0; CA2215793C; US20020137028A1

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA EL ACIDO NUCLEICO Y LAS SECUENCIAS DE LA NAIP. TAMBIEN SE PROPORCIONAN ANTICUERPOS ANTI-NAIP Y METODOS PARA LA MODULACION DE LA APOPTOSIS Y LA DETECCION DE COMPUESTOS QUE MODULAN LA APOPTOSIS.

Description

Uso de proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP).

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a la función de la proteína inhibidora NAIP en la apoptosis y más en particular al uso de proteínas NAIP y ácidos nucleicos para caracterizar NAIP, identificar compuestos que modulan NAIP y tratar dolencias afectadas por cambios en los niveles de NAIP.

Antecedentes de la invención

La apoptosis es una forma morfológicamente diferenciada de muerte celular programada que es importante en el desarrollo y mantenimiento normal de organismos multicelulares. La desregulación de la apoptosis puede tomar la forma de una supresión inapropiada de la muerte celular, como ocurre en el desarrollo de algunos cánceres, o en un fallo en el control de la extensión de la muerte celular, como se cree que ocurre en la inmunodeficiencia adquirida y ciertos trastornos neurodegenerativos, como la atrofia muscular espinal (AME).

Las atrofias musculares espinales infantiles son trastornos neurodegenerativos caracterizados por depleción progresiva de la neurona motora de la médula espinal y se encuentran entre los trastornos autosómicos recesivos más comunes (Dubowitz, V. 1978, Brooke, M.A. 1986). La AME de tipo I es la causa heredada de muerte más frecuente en la infancia. La pérdida de neuronas motoras en AME ha llevado a sugerir que la continuación o reactivación inapropiada de apoptosis de neuronas motoras que ocurre normalmente puede subyacer al trastorno (Sarnat, H.B. 1992). NAIP, un gen asociado con AME, se ha cartografiado en el cromosoma humano 5q13.1.

Algunos baculovirus codifican proteínas que se denominan proteínas inhibidoras de la apoptosis (PIA), ya que inhiben la apoptosis que en caso contrario se produciría cuando las células de insectos se infectan por el virus. Se cree que estas proteínas funcionan de manera que es independiente de otras proteínas virales. Los genes PIA de baculovirus incluyen secuencias que codifican un motivo similar a dedo de cinc (RZF), que puede participar en unión a ADN, y dos dominios N-terminales que consisten en un motivo de repetición de 70 aminoácidos denominado dominio BIR (Repetición PIA de Baculovirus).

Roy y col. (Cell, vol. 80, nº 1, 13 de enero de 1995, NA US páginas 167-178) desvela una secuencia que codifica NAIP de 5.502 nucleótidos de longitud. También se desvela la función de NAIP como inhibidora de la apoptosis y en el desarrollo de atrofias musculares espinales (AME).

El documento WO-9.612.016, publicado antes de la fecha de depósito internacional pero después de la fecha de prioridad de la presente invención, desvela el gen que codifica NAIP y la secuencia de aminoácidos correspondiente de 1.232 aminoácidos de longitud. También se desvela el uso de la información de secuencia para detección de secuencias de NAIP y para el diagnóstico y tratamiento de AME.

Liston y col. (Nature, vol. 379, nº 6563, 25 de enero de 1998, páginas 349-353), publicado antes de la fecha de depósito internacional pero después de la fecha de prioridad de la presente invención, está relacionado con las pruebas de secuencias homólogas a la secuencia que codifica NAIP para actividad antiapoptótica.

Resumen de la invención

La presente invención se refiere a una nueva secuencia de proteínas inhibidoras de la apoptosis neuronal (siglas en inglés, NAIP) y a un fragmento de NAIP con actividades antiapoptóticas, que comprende nucleótidos 3.734 a 3.886 (exón 14a) y 4.139 a 4.503 (exón 17) de ID SEC nº 21 o nucleótidos 3.838 a 3.990 (exón 14a) y nucleótidos 4.243 a 4.605 (exón 17) de ID SEC nº 23.

La presente invención proporciona un ácido nucleico sustancialmente puro que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico para la secuencia de ácidos nucleicos de proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP) de longitud completa de ID SEC nº 21 y que incluye nucleótidos 3.734 a 3.886 (exón 14a) y 4.139 a 4.503 (exón 17) de ID SEC nº 21 o que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico para la secuencia de ácidos nucleicos de NAIP de longitud completa de ID SEC nº 23 y que incluye nucleótidos 3.838 a 3.990 de ID SEC nº 23 y nucleótidos 4.243 a 4.605 de ID SEC 23, con dichos ácidos nucleicos codificando un polipéptido de NAIP que inhibe la apoptosis.

La presente invención proporciona también un ácido nucleico sustancialmente puro que tiene la secuencia de ID SEC nº 21 o variantes degeneradas de la misma y codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC nº 22, en las que dicho polipéptido es capaz de inhibir la apoptosis.

Preferentemente, el ácido nucleico está unido operativamente a una secuencia reguladora para la expresión de dicho polipéptido de NAIP y dicha secuencia reguladora comprende un promotor.

Preferentemente, el promotor es un promotor constitutivo y es inducible por uno o más agentes externos o es específico del tipo celular.

La presente invención proporciona un vector que comprende el ácido nucleico de la presente invención, en el que el vector es capaz de dirigir la expresión del polipéptido de NAIP que es capaz de inhibir la apoptosis.

La invención proporciona también una célula huésped que contiene el vector descrito anteriormente.

En una forma de realización alternativa, la presente invención proporciona un polipéptido de NAIP de mamífero sustancialmente puro codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de la presente invención.

La presente invención proporciona también una composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de polipéptido de NAIP de la invención en un vehículo fisiológicamente aceptable.

También se proporciona un animal transgénico no humano para una secuencia de ácidos nucleicos de NAIP de la invención.

La presente invención proporciona también un procedimiento in vitro de obtención de un polipéptido de NAIP. El procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) suministro de una célula con un ácido nucleico de la invención, estando colocado dicho ácido nucleico para expresión en dicha célula;

(b) cultivo de dicha linfocito Bajo las condiciones para la expresión de dicho ADN; y

(c) aislamiento de dicho polipéptido de NAIP.

La invención proporciona también un procedimiento in vitro de identificación de un ácido nucleico de NAIP en una célula de mamífero. El procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) suministro de un preparado de ADN celular de mamífero de dicha célula;

(b) suministro de una secuencia ADN marcada de manera detectable que se une específicamente con nucleótidos 3.734 a 3.886 (exón 14a) y 4138 a 4.503 (exón 17) de ID SEC nº 21 y nucleótidos 3.838 a 3.990 (exón 14a) o nucleótidos 4.243 a 4.605 (exón 17) de ID SEC nº 23;

(c) puesta en contacto de dicho preparado de ADN celular con dicha secuencia de ADN marcada de manera detectable bajo condiciones de hibridación para proporcionar detección de ácidos nucleicos que tienen al menos el 50% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos; e

(d) identificación de un ácido nucleico de NAIP por su asociación con dicha secuencia de ADN marcada de manera detectable.

En una forma de realización alternativa, la presente invención proporciona un procedimiento in vitro de aislamiento de un ácido nucleico de NAIP de la invención o una parte del mismo. El procedimiento comprende amplificación por PCR del ácido nucleico de NAIP, o parte del mismo, usando cebadores de oligonucleótidos en los que dichos cebadores:

(a) son todos mayores de 13 nucleótidos de longitud;

(b) cada uno tiene regiones de complementariedad a cadenas de ADN opuestas que comprenden nucleótidos 3.838 a 3.990 (exón 14a) o nucleótidos 4.243 a 4.605 (exón 17) de ID SEC nº 23; y

(c) opcionalmente contienen secuencias capaces de producir sitios de corte de enzimas de restricción en el producto amplificado; y aislamiento de dicho ácido nucleico de NAIP o parte del mismo.

En la presente invención se proporciona también un procedimiento in vitro de identificación de un compuesto que modula la apoptosis. El procedimiento comprende puesta en contacto in vitro de una célula que expresa polipéptido de NAIP con un compuesto candidato y monitorización de la expresión de un ácido nucleico de NAIP de la invención por detección de una secuencia de ácidos nucleicos que comprende nucleótidos 3.838 a 3.990 de ID SEC nº 23 o nucleótidos 4.243 a 4.605 de ID SEC nº 23. Una alteración en el nivel de dicha expresión de dicho ácido nucleico indica la presencia de un compuesto que modula la apoptosis.

La presente invención proporciona también un ácido nucleico de proteínas inhibidoras de la apoptosis neuronal (NAIP) de la invención o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos, para su uso como un medicamento.

También se proporciona el uso de un ácido nucleico de NAIP de la invención o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de atrofia muscular espinal, ELA, SIDA, una enfermedad neurodegenerativa, un síndrome mielodisplásico o una lesión isquémica.

La invención proporciona también una molécula antisentido de NAIP que comprende ácido nucleico que es complementario a nucleótidos 3.734 a 3.886 (exón 14a) o a nucleótidos 4.139 a 4.503 (exón 17) de ID SEC nº 21 o a nucleótidos 3.838 a 3.990 de ID SEC nº 23 o nucleótidos 4.243 a 4.605 de ID SEC 23 y el uso de esta molécula antisentido como un medicamento.

En general, la invención presenta una molécula de ácido nucleico sustancialmente pura, como una molécula genómica, de ADNc, de ADN antisentido, de ARN o de ácido nucleico sintético, que codifica o se corresponde con un polipéptido de NAIP de mamífero de la invención. Este ácido nucleico puede incorporarse en un vector. Dicho vector puede estar en una célula, como, por ejemplo, una célula de mamífero, de levadura, de nematodo o bacteriana. El ácido nucleico puede incorporarse también en un animal transgénico no humano o un embrión del mismo. En formas de realización preferidas, la molécula de ácido nucleico es un ácido nucleico de NAIP humano. En formas de realización más preferidas, el gen de NAIP es un gen de NAIP humano. En otras formas de realización preferidas diversas, la célula es una linfocito Transformada.

La secuencia de ácidos nucleicos incluye secuencias de ADNc que codifican exones 14a y 17. En una forma de realización más preferida, la secuencia incluye exones 1-14, 14a y 15-17. En las formas de realización más preferidas, la secuencia incluye también las regiones no traducidas 5' y 3' completas del gen de NAIP y se representa como ID SEC nº 2, 21 ó 23, con la máxima preferencia, como ID SEC nº 21. En otras formas de realización preferidas, el ácido nucleico es una secuencia de nucleótidos purificada que comprende ADN genómico, ADNc, ARNm, ADN antisentido u otros ADN sustancialmente idénticos a las secuencias de ADNc de la ID SEC nº 2, 21 ó 23 correspondientes a las secuencias de ADNc de la invención. Con la máxima preferencia, los exones 1 a 14 y 14a a 17 son como se ha descrito en ID SEC nº 21.

En formas de realización específicas, la invención presenta secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente idénticas a las secuencias mostradas en la Fig. 21, o fragmentos de las mismas, en las que los fragmentos comprenden nucleótidos 3.734 a 3.886 (exón 14a) y 4.139 a 4.503 (exón 17) de ID SEC nº 21 o nucleótidos 3.838 a 3.990 (exón 14a) y nucleótidos 4.243 a 4805 (exón 17) de ID SEC nº 23 y codifican un polipéptido que inhibe la apoptosis.

En otro aspecto, la invención presenta también un ARN que está codificado por el ADN descrito en la presente memoria descriptiva. Preferentemente, el ARN es ARNm. En otra forma de realización el ARN es ARN antisentido que es complementario a la cadena de codificación de NAIP.

El ácido nucleico que codifica NAIP comprende al menos los 3 dominios BIR de una secuencia de NAIP proporcionada en la presente memoria descriptiva (por ejemplo, nucleótidos 1-1.360 de la secuencia de NAIP proporcionada en la Fig. 6), pero carece de al menos algunas de las secuencias que codifican el término carboxi del polipéptido de NAIP. Preferentemente, al menos 30 ácidos nucleicos se suprimen de la región del gen de NAIP entre los ácidos nucleicos 1.360 (es decir, el final de los dominios BIR) y 4.607 (es decir, el final de la secuencia de codificación) de la secuencia de NAIP mostrada en la Fig. 6, ID SEC nº 21. Más preferentemente, se suprimen al menos 100 nucleótidos, y todavía más preferentemente se suprimen al menos 1.000 nucleótidos. En la forma de realización más preferida se suprimen hasta 3.247 nucleótidos. Preferentemente, la deleción produce un aumento estadísticamente significativo de la actividad antiapoptótica de la proteína codificada en uno de los ensayos proporcionados en la presente memoria descriptiva.

La invención presenta un ADN sustancialmente puro que incluye un promotor capaz de expresar o activar la expresión del gen de NAIP o fragmentos según la invención en una célula susceptible de apoptosis. En formas de realización preferidas de este aspecto, el gen de NAIP es NAIP humano o fragmentos según la invención, tal como se describe anteriormente. En otras formas de realización preferidas de este aspecto de la invención, el promotor es el promotor nativo del gen de NAIP. Adicionalmente, las regiones reguladoras transcripcional y traslacional son, preferentemente, las nativas de un gen de NAIP.

La invención proporciona líneas celulares transgénicas que incluyen ácidos nucleicos de NAIP de la invención. Las linfocitos Transgénicas de la invención son preferentemente células que están alteradas en su respuesta apoptótica. En formas de realización preferidas, la célula de mamífero transgénico es un fibroblasto, célula neuronal, célula pulmonar, célula renal, célula de linfocito, célula glial, célula miocárdica, célula madre embrionaria o célula de insecto. Con la máxima preferencia, la neurona es una neurona motora y el linfocito es una célula CD4+ T.

También se describe un procedimiento in vitro para alterar el nivel de apoptosis que implica la producción de una linfocito Transgénica que tiene un transgén que codifica un polipéptido de NAIP o un ácido nucleico antisentido de la invención. El transgén está integrado en el genoma de la célula de una forma que permite la expresión. Además, el nivel de expresión en la célula es suficiente para alterar el nivel de apoptosis. Preferentemente, el transgén está en una neurona motora o una célula miocárdica.

En otro aspecto más relacionado, la invención presenta un animal transgénico no humano, preferentemente un mamífero, más preferentemente un roedor, y con la máxima preferencia un ratón, que tiene un gen de NAIP según se describe anteriormente insertado en el genoma (mutante o silvestre), o un noqueado del gen de NAIP en el genoma, o ambos. También se incluye un animal transgénico no humano que expresa ácido nucleico antisentido de NAIP. Los animales transgénicos no humanos pueden expresar una cantidad aumentada o disminuida de polipéptido de NAIP, dependiendo de la construcción usada y de la naturaleza de la alteración genómica. Por ejemplo, la utilización de una molécula de ácido nucleico que codifica una NAIP de la invención para diseñar por ingeniería una mutación de noqueado en un gen de NAIP generaría un animal no humano con expresión reducida de la totalidad o parte del polipéptido de NAIP correspondiente. En contraste, la inserción de copias exógenas de un gen de NAIP de la invención en el genoma, preferentemente bajo el control de elementos promotores y reguladores activos, conduciría a una expresión aumentada o al polipéptido de NAIP correspondiente.

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento in vitro de detección de un gen de NAIP en una célula detectando el gen de NAIP, o una parte del mismo (que es mayor que 9 nucleótidos, y preferentemente mayor que 18 nucleótidos de longitud), con un preparado de ADN genómico a partir de la célula. El gen de NAIP y el ADN genómico se ponen en contacto bajo condiciones que permiten la hibridación (y, por tanto, la detección) de secuencias de ácido nucleico en la célula que son al menos el 50% idénticas al ADN que codifica los polipéptidos de NAIP. El ácido nucleico usado comprende al menos una parte de exón 14a o exón 17, según se proporciona en las Fig. 6 y 7.

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para producir un polipéptido de NAIP in vitro. En una forma de realización, este procedimiento implica proporcionar una célula con ácido nucleico que codifica la totalidad o parte de un polipéptido de NAIP (que está colocado para expresión en la célula), cultivando la linfocito Bajo condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico, y aislamiento del polipéptido de NAIP. En formas de realización preferidas, el polipéptido de NAIP se expresa por ADN que está bajo el control de un promotor constitutivo o inducible. Según se describe en la presente memoria descriptiva, el promotor puede ser un promotor nativo o heterólogo. El ácido nucleico comprende exón 14a o exón 17. Con la máxima preferencia, el ácido nucleico es el ácido nucleico mostrado en las figuras 6 ó 7. Con la máxima preferencia, es la secuencia de la Fig. 6.

En otro aspecto, la invención presenta polipéptido de NAIP de mamífero sustancialmente puro. El polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una de las secuencias de aminoácidos mostradas en cualquiera de las Fig. 6 ó 7. Con la máxima preferencia, el polipéptido es el polipéptido de NAIP humano de la Fig. 6. Fragmentos que incluyen al menos dos dominios BIR, según se proporciona en la presente memoria descriptiva, son también parte de la invención. Preferentemente, el fragmento tiene al menos tres dominios BIR. Por ejemplo, los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos descritos anteriormente que tienen deleciones entre ácidos nucleicos 1.360 y el fin del gen son parte de la invención. En una forma de realización, los fragmentos de NAIP según la invención incluían aquellos fragmentos de NAIP que comprenden al menos 15 aminoácidos secuenciales de ID SEC nº 22 ó 24. El fragmento incluye al menos una parte de exón 14a o exón 17.

En otro aspecto, la invención presenta un polipéptido de mamífero recombinante obtenido de NAIP que es capaz de modular la apoptosis. El polipéptido puede incluir al menos dos dominios BIR según se define en la presente memoria descriptiva, preferentemente tres dominios BIR. En formas de realización preferidas, la secuencia de aminoácidos de NAIP difiere de las secuencias de NAIP de las Fig. 6 ó 7 únicamente en sustituciones conservadoras o difiere de las secuencias codificadas por los ácidos nucleicos de ID SEC nº 12, 21 ó 23 por deleciones de terminal carboxi de aminoácidos en los dominios BIR. En otras formas de realización preferidas, la proteína recombinante reduce la apoptosis con respecto a un control en al menos el 5%, más preferentemente en el 25%.

En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento in vitro de identificación de un compuesto que modula la apoptosis. El procedimiento incluye la puesta en contacto in vitro de una célula que expresa o es capaz de expresar un polipéptido de NAIP de la presente invención con un compuesto candidato, y la monitorización de la expresión del ácido nucleico de NAIP de la presente invención mediante detección de una secuencia de ácidos nucleicos que comprende nucleótidos 3.838 a 3.990 o nucleótidos 4.243 a 4.605 de la ID SEC 23. Una alteración en el nivel de expresión del ácido nucleico de NAIP indica la presencia de un compuesto que modula la apoptosis. El compuesto puede ser un inhibidor o un potenciador de apoptosis. En varias formas de realización preferidas, la célula de mamífero es una célula miocárdica, un fibroblasto, una célula neuronal, una célula glial, un linfocito (linfocito T o linfocito B) o una célula de insecto.

En un aspecto relacionado, la invención presenta procedimientos de detección de compuestos que modulan la apoptosis usando la tecnología de trampa de interacción y polipéptidos de NAIP de la presente invención, o fragmentos de la presente invención, como componente del cebo. En formas de realización preferidas, el compuesto sometido a prueba como modulador de apoptosis es también un polipéptido.

El ácido nucleico y los polipéptidos de NAIP de la invención pueden usarse en el diagnóstico de una enfermedad de proliferación celular, o puede usarse una probabilidad incrementada de dicha enfermedad, por ejemplo, una sonda de ácido nucleico de NAIP o un anticuerpo de NAIP. Preferentemente, la enfermedad es un cáncer del sistema nervioso central. Con la máxima preferencia, la enfermedad se selecciona entre el grupo constituido por neuroblastoma, meningioma, glialblastoma, astracistoma, neuroastrocitoma, leucemia promielocítica, un carcinoma de tipo HeLa, leucemia mielógena crónica (preferentemente usando sondas relacionadas con xiap o hiap-2), leucemia linfoblástica (preferentemente usando una sonda relacionada con xiap), linfoma de Burkitt, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma pulmonar y melanoma. Preferentemente, un diagnóstico se indica por un aumento doble en la expresión o actividad, más preferentemente, al menos un aumento de 10 veces en la expresión o actividad.

El ácido nucleico y polipéptidos de NAIP de la invención pueden usarse también para la preparación de un medicamento para el tratamiento de niveles nocivos de apoptosis. Cuando el paciente tiene más apoptosis de lo deseable o muestra deficiencia en NAIP normal, es apropiada una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína NAIP, ácido nucleico de NAIP o un compuesto que potencie los niveles de actividad de NAIP de una forma que permita el suministro a las células que están experimentando más apoptosis de la terapéuticamente deseable. En una forma de realización preferida, la célula que tiene niveles nocivos de apoptosis es una célula miocárdica en un paciente con diagnóstico de una dolencia cardíaca.

Cuando es probable que se produzcan niveles insuficientes de apoptosis, es apropiado usar ácido nucleico de NAIP antisentido de la invención, anticuerpo de NAIP o un compuesto que reduzca por otros medios los niveles de actividad de NAIP. El tratamiento de AME está excluido específicamente de esta forma de realización de la invención. Así, la apoptosis puede inducirse en una célula administrando a la célula un regulador negativo de la vía antiapoptótica dependiente de NAIP. El regulador negativo puede ser, pero sin limitarse a, un fragmento de polipéptido de NAIP de la invención o anticuerpo específico NAIP purificado. El regulador negativo puede ser una molécula de ARN antisentido de NAIP de la invención.

Los expertos en la materia reconocerán que una NAIP de mamífero de la presente invención puede servir como ingrediente activo en una composición terapéutica. Esta composición, dependiendo de la NAIP o del fragmento de la invención incluido, puede usarse para modular la apoptosis y, por tanto, tratar cualquier dolencia que esté causada por un trastorno en la apoptosis. Así, se entenderá que otro aspecto de la invención descrito en la presente memoria descriptiva incluye los compuestos de la invención en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se ha resumido anteriormente, un ácido nucleico o polipéptido de NAIP de la presente invención puede usarse para modular la apoptosis. Además, un ácido nucleico o polipéptido de NAIP puede usarse en el descubrimiento y/o fabricación de un medicamento para la modulación de la apoptosis.

Por "gen de NAIP" se entiende un gen que codifica un polipéptido que tiene al menos exón 14a o exón 17, Fig. 6 ó 7, o la secuencia de la Fig. 5, ID SEC nº 1, en el que se han suprimido al menos 10 ácidos nucleicos de terminal carboxi para potenciar la actividad, según se describe anteriormente. El gen de NAIP codifica un polipéptido que es capaz de inhibir la apoptosis. Un gen de NAIP es un ácido nucleico que tiene el 90% o más de identidad de secuencia de nucleótidos con las secuencias de codificación de aminoácidos NAIP de las Fig. 6 ó 7. El gen de NAIP codifica un polipéptido que inhibe la apoptosis. La región de secuencia sobre la que se mide la identidad es una región que incluye exón 14a o exón 17 de codificación de ácido nucleico. Los genes de NAIP de mamífero incluyen secuencias de nucleótidos aisladas de cualquier fuente de mamífero. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

Se entiende que el término "gen de NAIP" abarca cualquier gen de NAIP, que se caracteriza por su aptitud para modular la apoptosis y codifica un polipéptido que tiene el 90% de identidad de secuencia de aminoácidos con los polipéptidos de NAIP mostrados en las Fig. 6 y 7.

Se excluye específicamente la secuencia de longitud completa desvelada en el documento PCT/CA95/00581 y mostrada en la ID SEC nº 1.

Por "proteína NAIP" o "polipéptido de NAIP" se entiende un polipéptido, o fragmento según la invención, codificado por un gen de NAIP según se describe anteriormente.

Por "modulación de la apoptosis" o "alteración de la apoptosis" se entiende el aumento o la reducción del número de células que en caso contrario experimentarían apoptosis en una población celular dada. Preferentemente, la población celular se selecciona entre un grupo que incluye linfocitos T, células neuronales, fibroblastos, células miocárdicas o cualquier otra línea celular de la que se sepa que experimenta apoptosis en un conjunto de laboratorio (por ejemplo, las células de insecto infectadas por baculovirus). Se observará que el grado de modulación proporcionado por una NAIP o un compuesto de modulación en un ensayo dado variará, pero de forma que un experto en la materia pueda determinar el cambio estadísticamente significativo en el nivel de apoptosis que identifica un NAIP o un compuesto que modula un NAIP.

Por "inhibición de la apoptosis" se entiende cualquier descenso en el número de células que experimentan apoptosis con respecto a un control sin tratar. Preferentemente, el descenso es de al menos el 25%, más preferentemente el descenso es del 50%, y con la máxima preferencia el descenso es de al menos una vez.

Por "polipéptido" se entiende cualquier cadena de más de dos aminoácidos, independientemente de la modificación postraslacional como, por ejemplo, glicosilación o fosforilación.

Por "sustancialmente idéntico" se entiende un polipéptido o ácido nucleico que exhibe al menos el 90% de identidad con respecto a un aminoácido o una secuencia de ácidos nucleicos de referencia.

La identidad de secuencia se mide normalmente usando un software de análisis de secuencias con los parámetros por omisión especificados en el mismo (por ejemplo, Secuencia Análisis Software Package de Genetics Computer Group, Centro de Biotecnología de la Universidad de Wisconsin, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Este programa de software compara secuencias similares mediante la asignación de grados de homología a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservadoras incluyen normalmente sustituciones dentro de los grupos siguientes: glicina, alanina, valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

Por "polipéptido sustancialmente puro" se entiende un polipéptido que se ha separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. Normalmente, el polipéptido es sustancialmente puro cuando está en al menos el 80%, en peso, libre de las proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que se asocia naturalmente. Preferentemente, el polipéptido es un polipéptido de NAIP que es al menos el 75%, más preferentemente al menos el 90%, y con la máxima preferencia al menos el 99%, en peso, puro. Un polipéptido de NAIP sustancialmente puro puede obtenerse, por ejemplo, por extracción de una fuente natural (por ejemplo, un fibroblasto, célula neuronal o linfocito) por expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido de NAIP, o mediante síntesis química de la proteína. La pureza puede medirse mediante cualquier procedimiento apropiado como, por ejemplo, por cromatografía de columna, electroforesis de gel de poliacrilamida o análisis de HPLC.

Una proteína carece sustancialmente de componentes asociados naturalmente cuando se separa de estos contaminantes que la acompañan en su estado natural. Así, una proteína que se sintetiza químicamente o se produce en un sistema celular diferente de la célula de la que procede naturalmente estará sustancialmente libre de sus componentes asociados naturalmente. En consecuencia, los polipéptidos sustancialmente puros incluyen los obtenidos de organismos eucariotas pero sintetizados en E. coli u otros procariotas. Por "ADN sustancialmente puro" se entiende un ADN que está libre de los genes que, en el genoma de producción natural del organismo del que se obtiene el ADN de la invención, flanquean al gen. Por tanto, el término incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector; en un plásmido o virus replicante autónomamente; o en el ADN genómico de un procariota o eucariota; o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento genómico o de ADNc producido por PCR o por digestión de endonucleasa de restricción) independiente de otras secuencias. Incluye también un ADN recombinante que forma parte de un gen híbrido que codifica secuencia de polipéptidos adicional.

Por "linfocito Transformada" se entiende una célula en la que (o en un ancestro de la misma en el que) se ha introducido, por medio de técnicas de ADN recombinante, una molécula de ADN que codifica (según se usa en la presente memoria descriptiva) un polipéptido de NAIP.

Por "transgén" se entiende cualquier fragmento de ADN que se inserta por artificio en una célula, y que se convierte en parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de esta célula. Dicho transgén puede incluir un gen que sea parcial o totalmente heterólogo (es decir, extraño) al organismo transgénico, o puede representar un gen homólogo a un gen endógeno del organismo.

Por "transgénico" se entiende cualquier célula que incluye una secuencia de ADN que se inserta por artificio en una célula y se convierte en parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de esta célula. Según se usa en la presente memoria descriptiva, los organismos transgénicos son en general mamíferos transgénicos (por ejemplo, roedores como ratas o ratones) y el ADN (transgén) se inserta por artificio en el genoma nuclear.

Por "transformación" se entiende cualquier procedimiento para introducir moléculas extrañas en una célula. Lipofección, precipitación de fosfato de calcio, administración retroviral, electroporación y transformación biolística son sólo algunas de las enseñanzas que pueden usarse. Por ejemplo, la transformación biolística es un procedimiento para introducir moléculas extrañas en una célula usando nucleoproyectiles accionados por velocidad, como partículas de tungsteno o de oro. Dichos procedimientos accionados por velocidad se originan a partir de impulsos de presión que incluyen, pero no se limitan a, técnicas de accionamiento por helio, accionamiento por aire y accionamiento por pólvora. La transformación biolística puede aplicarse a la transformación o transfección de una amplia variedad de tipos celulares y tejidos intactos que incluyen, sin limitación, organelos intracelulares (por ejemplo, y mitocondrias y cloroplastos), bacterias, levadura, hongos, algas, tejido animal y células cultivadas.

Por "colocados para expresión" se entiende que la molécula de ADN está colocada adyacente a una secuencia de ADN que dirige la transcripción y traducción de la secuencia (es decir, facilita la producción de, por ejemplo, un polipéptido de NAIP, una proteína recombinante o una molécula de ARN).

Por "gen indicador" se entiende un gen cuya expresión puede someterse a ensayo; dichos genes incluyen, sin limitación, glucuronidasa (GUS), luciferasa, cloranfenicol transacetilasa (CAT) y p-galactosidasa, así como proteína fluorescente verde (GFP).

Por "promotor" se entiende la secuencia mínima suficiente para dirigir la transcripción. También se incluyen en la invención aquellos elementos promotores que son suficientes para reproducir la expresión génica dependiente de promotor controlable por especificidad celular, especificidad tisular o inducible por señales o agentes externos; dichos elementos pueden estar localizados en las regiones 5' ó 3' del gen nativo.

Por "enlazable operativamente" se entiende que un gen y una o más secuencias reguladoras están conectadas de tal manera que permiten la expresión génica cuando las moléculas son apropiadas (por ejemplo, las proteínas activadoras transcripcionales están unidas a las secuencias reguladoras).

Por "región conservada" se entiende cualquier extensión de seis o más aminoácidos contiguos que exhiben al menos el 30%, preferentemente el 50%, y con la máxima preferencia el 70% de identidad de secuencia de aminoácidos entre dos o más de los miembros de la familia NAIP (por ejemplo, entre NAIP humano y NAIP murino).

Por "aminoácidos de NAIP de terminal carboxi" se entiende los aminoácidos de terminal carboxi en los tres dominios BIR del gen de NAIP. Por ejemplo, los aminoácidos codificados por encima del ácido nucleico 1.360 de ID SEC nº 21 son de terminal carboxi.

Por "detectablemente marcado" se entiende cualquier medio para marcar e identificar la presencia de una molécula, por ejemplo, una sonda o cebador de oligonucleótido, un gen o fragmento del mismo, o una molécula de ADNc. Los procedimientos para marcar detectablemente una molécula son bien conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, marcaje radiactivo (por ejemplo, con un isótopo como ^{32}P o ^{35}S) y marcaje no radiactivo (por ejemplo, marcaje quimioluminiscente como, por ejemplo, marcaje con fluoresceína).

Por "antisentido" según se usa en la presente memoria descriptiva en referencia a ácidos nucleicos se entiende una secuencia de ácidos nucleicos, independientemente de la longitud, que es complementaria con la cadena de codificación de un gen.

Por "anticuerpo purificado" se entiende un anticuerpo que está en al menos el 60%, en peso, libre de proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que se asocia naturalmente. Preferentemente, la preparación es de al menos el 75%, más preferentemente el 90%, y con la máxima preferencia al menos el 99%, en peso, de anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo específico de NAIP. Un anticuerpo purificado puede obtenerse, por ejemplo, por cromatografía de afinidad usando proteína producida por medios recombinantes o péptidos de motivos conservados y técnicas estándar.

Por "se une específicamente a" se entiende un anticuerpo que reconoce y se une a una proteína pero que no reconoce sustancialmente y se une a otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica, que incluye naturalmente la proteína. El anticuerpo preferido se une a secuencia de péptidos NAIP de ID de secuencia nº 2 pero no se une a la secuencia de NAIP desvelada en el documento PCT/CA95/00581.

Otras características y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción de las formas de realización preferidas de la misma, y a partir de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Diversos aspectos de la invención se describen con respecto a los dibujos, en los que:

Fig. 1 muestra la expresión de NAIP en líneas estables de HeLa, CHO y Rat-1 combinados y células infectadas por adenovirus analizadas por inmunotransferencia (A-D) e inmunofluorescencia. A-B son células infectadas con adenovirus que codifican NAIP-myc detectados mediante anticuerpo policlonal anti-myc de ratón o anticuerpo policlonal antihumano de conejo. Las células C infectadas con adenovirus que codifican NAIP se detectaron mediante el anticuerpo policlonal NAIP. La expresión D de myc-NAIP en líneas celulares combinadas representativas por inmunofluorescencia se detectó con anticuerpos contra myc. Los transfectantes NAIP rat-1 E-F se detectaron por anticuerpos E anti-myc y F anti-NAIP.

Fig. 2 muestra el efecto de NAIP en la muerte celular inducida por privación sérica, menadiona y TNF-\alpha. Viabilidad de células CHO privadas de suero en A, células infectadas por adenovirus y B, transformantes combinados. C-H, muerte celular inducida por menadiona en células CHO infectadas por adenovirus (C, D) y Rat-1 (E, F y G, H) infectadas por adenovirus y transformantes combinados, respectivamente. I, transformantes infectados por adenovirus y J, combinados de células HeLa tratadas con TNF-\alpha/ciclohexamida.

Fig. 3 muestra análisis de inmunofluorescencia de tejido de médula espinal humana. A, Células del asta anterior. B, Neuronas intermedio-laterales. C, Raíces dorsales. D, Raíces ventrales.

Fig. 4 representa la estructura genómica de PAC 125D9 de cromosoma humano 5q13.1. Se han secuenciado ambas cadenas de la región de 131.708 pb mostrada en la figura y pueden encontrarse como GenBank acceso nº U80017. Se indican los sitios NotI (N), EcoRI (E), HindIII (H) y BamHI (B). Los exones de BTF2p44 (verde), NAIP (rojo) y SMN (gris) se representan encima mediante recuadros numerados y coloreados. La secuencia CCA transcrita (pero no traducida) se indica en un recuadro verde claro. El número de nucleótidos en los que se extiende una región específica son como se indica, por ejemplo, el intervalo entre NAIP y SMN es de 15.471 pb. Más adelante se muestra el patrón de embaldosado mínimo de clones de plásmidos que cubre la PAC. Las letras al principio de cada clon indican las enzimas de restricción usadas para preparar las bibliotecas de plásmidos, excepto para 1C6, 2A8 y 2E2, que son clones de las bibliotecas parciales Sau3AI. (SstI-S). La posición y orientación de ocho clases de secuencias de repetición encontradas usando el programa NIH Sequin se representan mediante triángulos de color. Los nombres de las repeticiones representadas por diferentes colores se muestran arriba a la derecha de la figura. Las secuencias de promotores detectadas mediante programas GRAIL (flecha roja) o Prestridge (Prestridge, D.S. J. Mol. Biol. 249, 923-932 (1995) (flecha verde) e islas CpG se muestran como flechas o bloques azules, respectivamente, encima de la barra.

Fig. 5 muestra las secuencias obtenidas en 2 secuenciaciones separadas del gen de NAIP.

Fig. 6 muestra una secuencia de ADNc de NAIP preferida y la secuencia de polipéptidos de NAIP predicha.

Fig. 7 muestra una secuencia de NAIP que incluye los límites intrón-exón. (ID SEC nº 23).

Descripción detallada

Aunque el sitio y el mecanismo precisos del efecto antiapoptótico de NAIP se desconocen, se demuestra ahora que NAIP está implicada claramente en las vías apoptóticas en células de mamíferos. Además, la localización por inmunofluorescencia indica que NAIP se expresa en neuronas motoras, pero no sensoriales. Estos hallazgos están en consonancia con la acción de la proteína como regulador negativo de apoptosis, más en particular apoptosis neuronal y, cuando es deficiente o está ausente, contribuye a fenotipos neurodegenerativos como AME y ELA.

1. El gen de NAIP

Existen dos copias casi idénticas de NAIP en 5q13.1. El gen de NAIP completo, mostrado en la Fig. 6, contiene 18 exones (1 a 14 y 14a a 17) y se extiende a una estimación de 90 kb de ADN genómico. (En las Fig. 5 y 7 se muestran otras secuencias intermedias obtenidas). La región de codificación de NAIP se extiende a 4.212 nucleótidos, lo que da como resultado un producto génico predicho de 1.404 aminoácidos (ID SEC nº 22). La longitud total del gen de NAIP se extiende a 6.228 nucleótidos (ID SEC nº 21) con una UTR 5' de 395 nucleótidos y una UTR 3' de 1.621 nucleótidos. La secuencia completa, ID SEC nº 2, permite al experto en la materia desarrollar sondas y cebadores para la identificación de secuencias homólogas y para la identificación de mutaciones dentro del ADN. Las regiones 5' y 3' pueden demostrarse útiles como sitios de unión de codificación para agentes que pueden regular por incremento o por reducción el gen, delineando además la vía y la función de NAIP. Las secuencias identificadas como ID SEC nº 2 y 23 son también útiles para la expresión de proteínas en vectores y huéspedes apropiados para producir NAIP y estudiar su función, así como desarrollar anticuerpos. La secuenciación del PAC 125D9 154 kb, que se identificó como un lugar probable del gen AME, dio como resultado la identificación de la secuencia de NAIP mostrada en la Fig. 5, ID SEC nº 1. Desde entonces se ha identificado una secuencia de codificación adicional, exón 14a, y se adjunta. La secuencia de ADN de NAIP que contiene el exón 14a parece ser una isoforma génica predominante que no se suprime ni muta en pacientes de AME. Las técnicas y cebadores usados para el aislamiento y aplicación del exón 14a de las bibliotecas de ADNc de médula espinal fetal humana fueron según se describe para la identificación de los otros exones y se detalla en el Ejemplo 4. La detección selectiva adicional de bibliotecas de ADNc combinada con análisis de secuencia de ADN genómico PAC 125D9 ha producido la identificación de un nuevo extremo 3' de NAIP que incluye una secuencia adicional de exón 17.

II. Síntesis de NAIP

Las características de la secuencia de NAIP de genes clonados pueden analizarse introduciendo la secuencia en varios tipos celulares o usando sistemas extracelulares in vitro. La función de la NAIP puede examinarse así bajo diferentes condiciones fisiológicas. La secuencia de ADN de NAIP puede manipularse en estudios para comprender la expresión del gen y el producto génico. Alternativamente, pueden producirse líneas celulares que sobreexpresan el producto génico permitiendo la purificación de NAIP para caracterización bioquímica, producción a gran escala, producción de anticuerpos y terapia de pacientes.

Para expresión de proteínas, pueden generarse sistemas de expresión eucarióticos y procarióticos en los que la secuencia de gen de NAIP se introduce en un plásmido u otro vector que a continuación se introduce en células vivas. Pueden usarse construcciones en las que la secuencia de ADNc de NAIP que contiene el marco de lectura abierta completo insertado en la orientación correcta en un plásmido de expresión para expresión de la proteína. Alternativamente, pueden insertarse partes de la secuencia, incluyendo secuencias de NAIP silvestres o mutantes. Los sistemas de expresión procarióticos y eucarióticos permiten recuperar varios dominios funcionales importantes de la proteína como proteínas de fusión y usarlos luego para unión, estudios estructurales y funcionales y también para la generación de anticuerpos apropiados. Si una NAIP aumenta la apoptosis, puede ser deseable expresar dicha proteína bajo el control de un promotor inducible.

Los vectores de expresión típicos contienen promotores que dirigen la síntesis de grandes cantidades de ARNm correspondiente al gen. También pueden incluir secuencias que permiten su replicación autónoma dentro del organismo huésped, secuencias que codifican rasgos genéticos que permiten seleccionar células que contienen los vectores y secuencias que aumentan la eficacia con que se traduce el ARNm. Algunos vectores contienen marcadores seleccionables como de resistencia a neomicina que permiten el aislamiento de células por cultivo bajo condiciones selectivas. Los vectores estables a largo plazo pueden mantenerse como entidades replicadoras libremente usando elementos reguladores de virus. También pueden producirse líneas celulares que tienen el vector integrado en el ADN genómico y, de esta manera, el producto génico se produce en una base continua.

La expresión de secuencias extrañas en bacterias como E. coli requiere la inserción de la secuencia de NAIP en un vector de expresión, normalmente un plásmido bacteriano. Este vector plásmido contiene varios elementos como secuencias que codifican un marcador seleccionable que asegura el mantenimiento del vector en la célula, un promotor transcripcional controlable (es decir, Iac) que bajo inducción puede producir grandes cantidades de ARNm a partir del gen clonado, secuencias de control de traducción y un poliligador para simplificar la inserción del gen en la orientación correcta dentro del vector. En un simple vector de expresión de E. coli que utiliza el promotor Iac, el plásmido del vector de expresión contiene un fragmento del cromosoma de E. coli que contiene el promotor Iac y el gen IacZ vecino. En presencia del análogo de lactosa IPTG, la ARN polimerasa transcribe normalmente el gen IacZ que produce ARNm IacZ que se traduce en la proteína codificada, \beta-galactosidasa. El gen IacZ puede cortarse del vector de expresión con enzimas de restricción y sustituirse por una secuencia de gen de NAIP. Cuando este plásmido resultante se transfecta en E. coli, la adición de IPTG y posterior transcripción a partir del promotor Iac produce ARNm NAIP, que se traduce en NAIP.

Una vez que se construye el vector de expresión apropiado que contiene el gen de NAIP, se introduce en una cepa de E. coli apropiada por técnicas de transformación que incluyen transfección de fosfato de calcio, transfección DEAE-dextrano, electroporación, microinyección, fusión de protoplastos y transfección mediada por liposomas.

La célula huésped que puede transfectarse con el vector de la presente invención puede seleccionarse del grupo constituido por E. coli, Pseudomonas, bacillus subtillus, u otros bacilos, otras bacterias, levadura, hongos, células de insecto (usando vectores baculovirales para expresión), ratón u otro animal o tejido humano. Pueden usarse también células de mamífero para expresar la proteína NAIP usando un sistema de expresión de virus de vacuna.

La expresión in vitro de proteínas codificadas por ADN clonado es también posible usando el sistema de expresión de promotor tardío T7. Este sistema depende de la expresión regulada de T7 ARN polimerasa que es una enzima codificada en el ADN de bacteriófago T7. La T7 ARN polimerasa transcribe ADN que empieza dentro de una secuencia específica de promotor de 23 pb denominada promotor tardío T7. Copias del promotor tardío T7 se encuentran en varios sitios del genoma T7, pero ninguna está presente en el ADN cromosómico de E. coli. En consecuencia, en células infectadas T7, la T7 ARN polimerasa cataliza la transcripción de genes virales pero no de genes de E. coli. En este sistema de expresión, primero se diseñan células de E. coli recombinantes para transportar el gen que codifica T7 ARN polimerasa junto al promotor Iac. En presencia de IPTG, estas linfocitos Transcriben el gen T7 polimerasa a alta velocidad y sintetizan cantidades abundantes de T7 ARN polimerasa. Estas células se transforman entonces con vectores de plásmidos que transportan una copia de proteína de promotor tardío T7. Cuando se añade IPTG al medio de cultivo que contiene estas linfocitos Transformadas de E. coli, se producen grandes cantidades de T7 ARN polimerasa. Entonces la polimerasa se une al promotor tardío T7 en los vectores de expresión de plásmidos, catalizando la transcripción del ADNc insertado a una alta velocidad. Como cada célula de E. coli contiene muchas copias del vector de expresión, pueden producirse grandes cantidades de ARNm correspondientes al ADN clonado en este sistema y la proteína resultante puede marcarse radiactivamente. Los vectores de plásmidos que contienen promotores tardíos y las correspondientes ARN polimerasas de los bacteriófagos relacionados, como T3, T5 y SP6, pueden usarse también para producción in vitro de proteínas a partir de ADN clonado. E. coli puede usarse también para expresión por infección con fago M13 mGPI-2. Pueden usarse vectores de E. coli con secuencias reguladoras de fagos lambda, mediante vectores de proteínas de fusión, fusiones de proteínas unidas a maltosa y proteínas de fusión glutationa-S-transferasa.

Un sistema de expresión preferido es el sistema de baculovirus que usa, por ejemplo, el vector pBacPAK9, disponible en Clontech (Palo Alto, CA). Si se desea, este sistema puede usarse conjuntamente con otras técnicas de expresión de proteínas como, por ejemplo, el enfoque myc tag descrito por Evan y col. (Mol. Cell. Biol. 5:3610-3616, 1985).

Los sistemas de expresión eucarióticos permiten modificaciones postraduccionales apropiadas para proteínas expresadas. Esto permite estudios del gen de NAIP y productos génicos que incluyen determinación de expresión apropiada y modificaciones postraduccionales modificaciones para actividad biológica. La identificación de elementos reguladores situados en la región 5' del gen de NAIP y su rol en la regulación tisular de la expresión de proteínas. También permite la producción de grandes cantidades de proteínas normales y mutantes para aislamiento y purificación, usar células que expresan NAIP como un sistema de ensayo funcional para anticuerpos generados contra la proteína, probar la eficacia de agentes farmacológicos o como un componente de un sistema de transducción de señales, para estudiar la función de la proteína completa normal, partes específicas de la proteína o polimorfismos naturales y proteínas mutadas producidas. La secuencia de ADN de NAIP puede alterarse usando procedimientos como digestión de enzimas de restricción, relleno de ADN polimerasa, deleción de exonucleasa, extensión de desoxinucleotidotransferasa terminal, ligado de secuencias de ADN sintéticas o clonadas y alteración de secuencias dirigidas al sitio mediante el uso de oligonucleótidos específicos junto con PCR.

Una NAIP puede producirse mediante una línea celular de mamífero transfectado de manera estable. Existe una serie de vectores adecuados para transfección estable de células de mamífero disponible para el público; véase, por ejemplo, Pouwels y col. (supra), así como procedimientos para construir dichas líneas celulares (véase, por ejemplo, Ausubel y col. (supra)). En un ejemplo, se clona ADNc que codifica una NAIP en un vector de expresión que incluye el gen de dihidrofolatorreductasa (DHFR). La integración del plásmido y, por tanto, la integración del gen que codifica NAIP en el cromosoma de célula huésped se selecciona por inclusión de metotrexato 0,01-300 \muM en el medio de cultivo celular (según se ha descrito, Ausubel y col., supra). Esta selección dominante puede lograrse en la mayoría de los tipos celulares. La expresión de proteína recombinante puede aumentarse por amplificación mediada por DHFR del gen transfectado.

En Ausubel y col. (supra) se describen procedimientos para seleccionar líneas celulares que portan amplificaciones génicas. Estos procedimientos implican en general cultivo extendido en medio que contiene niveles gradualmente crecientes de metotrexato. Los vectores de expresión que contienen DHFR usados más comúnmente son pCVSEII-DHFR y pAdD26SV(A) (descritos en Ausubel y col., supra). Las células huésped descritas anteriormente o, preferentemente, una línea celular CHO deficiente en DHFR (por ejemplo, células CHO DHFR, ATCC acceso nº CRL 9096) están entre las más preferidas para la selección de DHFR de una línea celular transfectada por medios estables o una ampliación génica mediada por DHFR.

Una vez que se expresa la proteína recombinante, se aísla, por ejemplo, por cromatografía de afinidad. En un ejemplo, un anticuerpo anti-NAIP, que puede producirse por los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva, puede unirse a una columna y usarse para aislar la proteína NAIP. Pueden realizarse lisis y fraccionamiento de células que contienen NAIP antes de cromatografía de afinidad mediante procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Ausubel y col., supra). Una vez aislada, la proteína recombinante puede, si se desea, purificarse más mediante, por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC; por ejemplo, véase Fisher, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Work and Burdon, ed., Elsevier, 1980).

También pueden producirse polipéptidos de la invención, en particular fragmentos de NAIP cortos, mediante síntesis química (por ejemplo, por los procedimientos descritos en Solid Phase Peptide Synthesis, 2ª ed., 1984, The Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Estas técnicas generales de expresión y purificación de polipéptidos pueden usarse también para producir y aislar fragmentos de NAIP o análogos útiles, según se describe en la presente memoria descriptiva.

Los expertos en la materia de biología molecular comprenderán que puede usarse una amplia variedad de sistemas de expresión para producir la proteína recombinante. La célula huésped precisa usada no es esencial para la invención. La proteína NAIP puede producirse en un huésped procariótico (por ejemplo, E. coli) o en un huésped eucariótico (por ejemplo, S. cerevisiae, células de insecto como células Sf21, o células de mamífero como COS-1, NIH 3T3 o células HeLa). Estas células están disponibles públicamente, por ejemplo, de la American Type Culture Collection, Rockville, MD; véase también Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, 1994). El procedimiento de transducción y la elección de un vehículo de expresión dependerán del sistema huésped seleccionado. Los procedimientos de transformación y transfección se describen, por ejemplo, en Ausubel y col. (supra), y los vehículos de expresión puede escogerse entre los suministrados, por ejemplo, en Cloning Vectors: A Laboratory Manual (P.H. Pouwels y col., 1985, Supl. 1987).

III. Prueba de la presencia de actividad biológica de NAIP

Para analizar el efecto de NAIP en la apoptosis en un primer enfoque, se transfectaron plásmidos de expresión solos o que codifican NAIP de longitud casi completa o BcI-2 (una proteína que funciona bajo condiciones normales para proteger las células contra la apoptosis) en células CHO, Rat-1 y HeLa seguido de selección G418. Inicialmente, se aisló ADNc de NAIP mediante sondeo de una biblioteca de ADNc de encéfalo fetal humano con un inserto de ADN genómico de un cósmido de la biblioteca de cósmidos construidos, y se aisló un fragmento de ADNc que codifica la mayoría de los tres dominios BIR correspondientes a la secuencia de gen de NAIP.

IV. Distribución celular de NAIP

Los autores de la invención han revisado la distribución de NAIP usando inmunofluorescencia de anticuerpos marcados y han encontrado que NAIP se expresa al menos en los siguientes tejidos: neuronas motoras, células miocárdicas, hígado, placenta y SNC.

V. Fragmentos de NAIP

Los dominios BIR de NAIP parecen ser necesarios y suficientes para la actividad biológica de NAIP. Sorprendentemente, los autores de la invención tienen razones para creer que las deleciones de terminales carboxi de aminoácidos NAIP potencian en realidad la inhibición de apoptosis por NAIP. Las deleciones pueden darse hasta el último dominio BIR de NAIP (es decir, el tercero), pero no necesitan suprimir el terminal carboxi completo de la región hasta el tercer dominio BIR.

VI. Anticuerpos NAIP

Para preparar anticuerpos policlonales, pueden sintetizarse en bacterias NAIP, fragmentos de NAIP o proteínas de fusión que contienen partes definidas o la totalidad de la proteína NAIP mediante la expresión de secuencias de ADN correspondientes en un vehículo de clonación adecuado. Las proteínas de fusión se usan comúnmente como fuente de antígeno para producir anticuerpos. Dos sistemas de expresión ampliamente usados para E. coli son fusiones de IacZ usando la serie pUR de vectores y fusiones trpE mediante vectores pATH. La proteína puede entonces purificarse, acoplarse a una proteína portadora y mezclarse con adyuvante de Freund (para ayudar a estimular la respuesta antigénica por los conejos) e inyectarse en conejos u otros animales de laboratorio. Alternativamente, la proteína puede aislarse a partir de células cultivadas que expresan NAIP. Después de inyecciones de refuerzo en intervalos bisemanales, se sangra a los conejos u otros animales de laboratorio y se aíslan los sueros. Los sueros pueden usarse directamente o purificarse antes de usar, mediante varios procedimientos que incluyen cromatografía de afinidad empleando proteína A-Sefarosa, Antígeno Sefarosa, Anti-ratón-Ig-Sefarosa. A continuación pueden usarse los sueros para sondear extractos de proteínas a partir de tejidos dispuestos en gel de poliacrilamida para identificar la proteína NAIP. Alternativamente, pueden formarse péptidos sintéticos para las partes antigénicas de la proteína y usarse para inocular a los animales.

Para generar péptido para su uso en formación de anticuerpos específicos de NAIP, puede expresarse una secuencia de codificación de NAIP (es decir, fragmentos de aminoácidos mostrados en ID SEC nº 22 y 24) como fusión C-terminal con glutationa-S-transferasa (GST; Smith y col., Gene 67:31-40, 1988). La proteína de fusión puede purificarse en perlas de glutationa-Sefarosa, eluirse con glutationa y escindirse con trombina (en el sitio de escisión diseñado por ingeniería), y purificarse en el grado requerido para inmunizar con éxito a los conejos. Las inmunizaciones primarias pueden realizarse con adyuvante completo de Freund y las inmunizaciones posteriores se realizan con adyuvante incompleto de Freund. Se monitorizan los títulos de anticuerpo mediante inmunotransferencia y análisis de inmunoprecipitación usando el fragmento NAIP escindido con trombina de la proteína de fusión GST-NAIP. Se purifican por afinidad los sueros inmunológicos usando proteína NAIP acoplada con CNBr-Sefarosa. Se determina la especificidad antisérica usando un panel de proteínas GST no relacionadas (incluyendo GSTp53, Rb, HPV-16 E6 y E6-AP) y GST tripsina (que se generó mediante PCR usando secuencias conocidas).

Los expertos en la materia entienden también que los anticuerpos NAIP monoclonales pueden producirse cultivando células que expresan activamente la proteína o aisladas de los tejidos. Los extractos celulares, o extractos de proteína recombinante, que contienen la proteína NAIP, pueden, por ejemplo, ser inyectados en adyuvante de Freund en ratones. Después de ser inyectados, pueden extraerse los bazos de los ratones y resuspenderse en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las células de bazo actúan como fuente de linfocitos, algunos de los cuales son productores de anticuerpos de la especificidad apropiada. A continuación, éstos se fusionan con unas células compañeras de mieloma en crecimiento permanente, y los productos de la fusión se analizan en placa en una serie de pocillos de cultivo tisular en presencia de un agente selectivo, como HAT. A continuación se detectan selectivamente los pocillos mediante ELISA para identificar los que contienen células que forman anticuerpo de unión. Éstos se analizan en placa y, después de un período de crecimiento, estos pocillos se detectan selectivamente de nuevo para identificar células productoras de anticuerpos. Se realizan varios procedimientos de clonación hasta que más del 90% de los pocillos contengan clones únicos que sean positivos para la producción de anticuerpos. A partir de este procedimiento se establece una línea estable de clones que producen el anticuerpo. A continuación puede purificarse el anticuerpo monoclonal por cromatografía de afinidad usando proteína A Sefarosa, cromatografía de intercambio iónico, así como variantes y combinaciones de estas técnicas. También pueden producirse versiones truncadas de anticuerpos monoclonales mediante procedimientos recombinantes en los que se generan plásmidos que expresan el o los fragmentos deseados de anticuerpo monoclonal en un huésped adecuado.

Como inmunógeno alternativo o adjunto a proteínas de fusión GST, pueden generarse péptidos correspondientes a regiones hidrófilas relativamente únicas de NAIP y acoplarse una hemocianina de lapa (KLH) a través de una lisina C-terminal introducida. El antisuero de cada uno de estos péptidos se purifica por afinidad de manera análoga en péptidos conjugados con BSA, y se evalúa la especificidad mediante ELISA y inmunotransferencia usando conjugados peptídicos, y mediante inmunotransferencia e inmunoprecipitación usando NAIP expresada como una proteína de fusión GST.

Alternativamente, pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando la proteína NAIP según se describe anteriormente y tecnología de hibridoma estándar (véase, por ejemplo, Kohler y col., Nature 256:495, 1975; Kohler y col., Eur. J. Inmunol. 6:292, 1976; Kohler y col., Eur. J. Immunol. 6:292, 1976; Hammerling y col., en Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, Nueva York, NY, 1981; Ausubel et al., supra). Una vez producidos, los anticuerpos monoclonales se prueban también en cuanto a reconocimiento NAIP específico por inmunotransferencia o análisis de inmunoprecipitación (por los procedimientos descritos en Ausubel y col., supra).

Los anticuerpos que reconocen específicamente NAIP (o fragmentos de NAIP), como los descritos en la presente memoria descriptiva que contienen uno o más dominios BIR, se consideran útiles en la invención. Pueden usarse, por ejemplo, en un inmunoensayo para monitorizar los niveles de expresión de NAIP o para determinar la posición subcelular de una NAIP o fragmento de NAIP producidos por un mamífero. Los anticuerpos que inhiben NAIP descritos en la presente memoria descriptiva pueden ser especialmente útiles en la inducción de apoptosis en células que experimentan una proliferación indeseable.

Preferentemente, los anticuerpos se producen usando secuencia de NAIP que no reside dentro de regiones altamente conservadas, y que parecen ser probablemente antigénicos, analizados por criterios como los proporcionados por el programa de estructura de péptidos (Genetics Computer Group Sequence Analysis Package, Manual de Programa para el Paquete GCG, Versión 7, 1991) usando el algoritmo de Jameson y Wolf (CABIOS 4:181, 1988). Estos fragmentos pueden generarse mediante técnicas estándar, por ejemplo por la PCR, y clonarse en el vector de expresión pGEX (Ausubel y col., supra). Las proteínas de fusión se expresan en E. coli y se purifican usando matriz de afinidad de glutationa agarosa según se describe en Ausubel y col. (supra). Para minimizar el potencial de obtención de antisueros que es no específico, o exhibe unión a NAIP de baja afinidad, se generan dos o tres fusiones para cada proteína, y cada fusión se inyecta en al menos dos conejos. Los antisueros se preparan por inyecciones en serie, incluyendo preferentemente al menos tres inyecciones de refuerzo.

VII. Uso de anticuerpos frente a NAIP

Los anticuerpos frente a NAIP pueden usarse, como se ha observado anteriormente, para detectar NAIP o inhibir la proteína. Además, los anticuerpos se acoplaron a compuestos para diagnóstico y/o usos terapéuticos, como radionucleótidos para procedimientos de imagen y terapia y liposomas para etiquetado de compuestos en posiciones tisulares específicas.

VIII. Detección de expresión génica de NAIP

Como se ha observado, los anticuerpos descritos pueden usarse para monitorizar expresión de proteína NAIP. Además, la hibridación in situ es un procedimiento que puede usarse para detectar la expresión del gen de NAIP. La hibridación in situ se basa en la hibridación de una sonda de ácido nucleico marcada específicamente para el ARN celular en células o tejidos individuales. Por tanto, permite la identificación de ARNm dentro de tejidos intactos, como el encéfalo. En este procedimiento, se usan oligonucleótidos o fragmentos clonados de nucleótido (ARN o ADN) correspondientes a partes únicas del NAIP para detectar especies de ARNm específicas, por ejemplo, en el encéfalo. En este procedimiento se anestesia una rata y se perfunde por vía transcardial con PBS frío, seguido por perfusión con una solución de formaldehído. A continuación se extrae el encéfalo u otros tejidos, se congela en nitrógeno líquido y se corta en finas secciones micrométricas. Las secciones se colocan en portaobjetos y se incuban en proteinasa K. Después de enjuagado en DEP, agua y etanol, se colocan los portaobjetos en tampón de prehibridación. Se forma una sonda radioactiva correspondiente al cebador por traslado de mellas y se incuba con el tejido encefálico seccionado. Después de incubación y secado al aire, las zonas marcadas se visualizan por autorradiografía. Las manchas oscuras en la muestra de tejido indican hibridación de la sonda con ARNm de NAIP, lo que demuestra la expresión de la proteína.

IX. Identificación de moléculas que modulan la expresión de proteína NAIP

Los ADNc de NAIP pueden usarse para facilitar la identificación de moléculas que aumentan o reducen la expresión de NAIP. En un enfoque, se añaden las moléculas candidatas, en concentración variable, al medio de cultivo de células que expresan ARNm de NAIP. A continuación se mide la expresión de NAIP, por ejemplo, mediante análisis de transferencia Northern (Ausubel y col., supra) usando un ADNc de NAIP, o un fragmento de ADNc o ARN, como sonda de hibridación. Se compara el nivel de expresión de NAIP en presencia de la molécula candidata con el nivel de expresión de NAIP en ausencia de la molécula candidata, dejando iguales todos los otros factores (por ejemplo, tipo celular y condiciones de cultivo).

En su lugar, puede medirse el efecto de las moléculas candidatas en la apoptosis mediada por NAIP al nivel de traducción usando el enfoque general descrito anteriormente con técnicas estándar de detección de proteínas, como inmunotransferencia o inmunoprecipitación con un anticuerpo específico de NAIP (por ejemplo, el anticuerpo de NAIP descrito en la presente memoria descriptiva).

Pueden purificarse, o purificarse sustancialmente, compuestos que modulan el nivel de NAIP o puede ser un componente de una mezcla de compuestos como un extracto o sobrenadante obtenido de células (Ausubel y col., supra). En un ensayo de una mezcla de compuestos, la expresión de NAIP se prueba frente a subconjuntos progresivamente menores de la reserva de compuestos (por ejemplo, producida por técnicas de purificación estándar como HPLC o FPLC) hasta que se demuestre que un único compuesto o un número mínimo de compuestos efectivos modula la expresión de NAIP.

Pueden detectarse selectivamente también compuestos para medir su aptitud para modular la actividad de inhibición de apoptosis de NAIP. En este enfoque, se compara el grado de apoptosis en presencia de un compuesto candidato con el grado de apoptosis en su ausencia, en condiciones equivalentes. De nuevo, la detección selectiva puede empezarse con una reserva de compuestos candidatos, de los que se aíslan uno o más compuestos moduladores útiles en un tratamiento por etapas. La actividad de apoptosis puede medirse mediante cualquier ensayo estándar, por ejemplo, los descritos en la presente memoria descriptiva.

Otro procedimiento para detectar compuestos que modulan la actividad de proteínas NAIP consiste en detectar selectivamente compuestos que interaccionan físicamente con un polipéptido de NAIP dado. Estos compuestos pueden detectarse por sistemas de captura de interacción adaptativa conocidos en la técnica. Estos sistemas detectan interacciones de proteínas usando un ensayo de activación transcripcional y se describen en general en Gyuris y col. (Cell 75:791-803, 1993) y Field y col., Nature 340:245-246, 1989), y están disponibles comercialmente en Clontech (Palo Alto, GA). Además, la publicación PCT WO-95/28497 describe un ensayo de captura de interacción en el que se detectan las proteínas implicadas en la apoptosis, en virtud de su interacción con BcI-2. Puede usarse un procedimiento similar para identificar proteínas y otros compuestos que interaccionan con NAIP.

Los compuestos o moléculas que actúan como moduladores de muerte celular mediada por NAIP pueden incluir moléculas peptídicas y no peptídicas, como las que están presentes en extractos celulares, suero de mamífero o medio de crecimiento en el que se han cultivado células de mamífero.

Una molécula que promueve un aumento en la expresión de NAIP o la actividad de NAIP se considera particularmente útil en la invención; dicha molécula puede usarse, por ejemplo, como terapéutica para aumentar los niveles celulares de NAIP y aprovechar así la aptitud de los polipéptidos de NAIP para inhibir la apoptosis.

Una molécula que reduce la actividad de NAIP (por ejemplo, reduciendo la expresión génica de NAIP o la actividad polipeptídica) puede usarse para reducir la proliferación celular. Esto resultaría ventajoso en el tratamiento de neoplasias u otras enfermedades celulares proliferativas.

Las moléculas para las que se ha encontrado, por los procedimientos descritos anteriormente, que modulan eficazmente la expresión génica de NAIP o la actividad polipeptídica pueden someterse a más ensayos en modelos animales. Si siguen actuando con éxito en una configuración in vivo, pueden usarse como terapéutica para inhibir o potenciar la apoptosis, según resulte apropiado.

X. Terapias

Las terapias pueden diseñarse para sortear o superar un defecto génico de NAIP o una expresión de gen de NAIP inadecuada, y moderar así, y posiblemente prevenir, la apoptosis. El gen de NAIP se expresa en el hígado, el miocardio y la placenta, así como en el SNC. De ahí que al considerar las diversas terapias debe entenderse que dichas terapias pueden estar dirigidas a tejidos diferentes de los del encéfalo, como los del hígado, el miocardio y cualquier otro tejido para el que se demuestre posteriormente que expresa NAIP.

a) Terapia proteica

El tratamiento o prevención de la apoptosis puede lograrse mediante sustitución de proteína NAIP mutante o insuficiente con proteína normal, modulando la función de la proteína mutante o suministrando proteína NAIP normal a las células apropiadas. Una vez que se ha comprendido completamente la ruta biológica de la proteína NAIP, puede ser posible también modificar la ruta patofisiológica (por ejemplo, una ruta de transducción de señales) en la que participa la proteína para corregir el defecto fisiológico.

Para sustituir una proteína mutante por proteína normal, o añadir proteína a células que ya no expresan suficiente NAIP, es necesario obtener grandes cantidades de NAIP pura de sistemas celulares de cultivo que pueden expresar la proteína. El suministro de la proteína a los tejidos afectados puede lograrse así usando sistemas apropiados de empaquetado o administración. Alternativamente, pueden usarse análogos moleculares y administrarse para actuar como agonistas de NAIP y, de esta manera, producir un efecto fisiológico deseado. En la presente memoria descriptiva se proporcionan procedimientos para encontrar dichas moléculas.

b) Terapia génica

La terapia génica es otro posible enfoque terapéutico en el que se introducen copias normales del gen de NAIP en tejidos seleccionados para codificar con éxito proteína normal y abundante en tipos celulares afectados. El gen debe suministrarse a estas células en una forma que pueda asimilarse y codificarse para que una cantidad suficiente de proteína proporcione una función efectiva. Alternativamente, en algunos mutantes puede ser posible prevenir la apoptosis introduciendo otra copia del gen homólogo portador de una segunda mutación de ese gen o para alterar la mutación, o usar otro gen para bloquear cualquier efecto negativo.

Pueden usarse vectores retrovirales de transducción para terapia génica de células somáticas, especialmente por su alta eficacia de infección e integración y expresión estable. Las células diana, sin embargo, deben ser capaces de dividirse y la expresión de los niveles de proteína normal ha de ser alta. El gen de NAIP de longitud completa, o partes del mismo, puede clonarse en un vector retroviral y activarse a partir de su promotor endógeno o de la repetición retroviral de terminal largo o de un promotor específico del tipo celular diana de interés (como, por ejemplo, neuronas). Otros vectores virales que pueden usarse incluyen virus adenoasociados, virus de vacuna, papilomavirus bovinos o virus del herpes, como el virus de Epstein-Barr.

La transferencia génica puede lograrse asimismo usando medios no virales que requieren infección in vitro. Esto incluiría fosfato de calcio, DEAE dextrano, electroporación y fusión de protoplastos. Los liposomas pueden ser también potencialmente beneficiosos para suministro de ADN en una célula. Aunque estos procedimientos están disponibles, muchos de ellos son de baja eficacia.

Pueden emplearse estrategias basadas en oligonucleótidos antisentido para explorar la función del gen de NAIP y como base para el diseño de fármacos terapéuticos. El principio se basa en la hipótesis de que la supresión específica de secuencias de expresión génica puede conseguirse por hibridación intracelular entre ARNm y una especie antisentido complementaria. La formación de un ARN híbrido dúplex puede interferir entonces con el procesamiento/transporte/traducción y/o estabilidad del ARNm de NAIP diana. Las estrategias antisentido pueden usar una diversidad de enfoques, incluyendo el uso de oligonucleótidos antisentido, inyección de ARN antisentido y transfección de vectores de expresión de ARN antisentido. Los efectos antisentido pueden inducirse por secuencias de control (sentido); sin embargo, la magnitud de los cambios fenotípicos es altamente variable. Los efectos fenotípicos inducidos por efectos antisentido se basan en cambios en criterios como niveles de proteínas, medida de la actividad de proteínas y niveles de ARNm diana.

El trasplante de genes normales en las células afectadas de un paciente puede ser también una terapia útil. En este procedimiento, se transfiere NAIP normal a un tipo celular cultivable, ya sea de forma exógena o endógena al paciente. Estas células se inyectan a continuación serológicamente en el o los tejidos diana.

Como sistema de suministro de transferencia génica para una construcción de gen de NAIP terapéutico pueden usarse vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados u otros vectores virales con el tropismo apropiado para células implicadas probablemente en apoptosis (por ejemplo, células epiteliales). Se conocen en general numerosos vectores útiles para este propósito (Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis y Anderson, BioTechniques 6:808-814, 1988; Tolstoshev y Anderson, Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta y col., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller y col., Biotechniques 7:980-890, 1989; Le Gal La Salle y col., Science 259:988-990, 1993; y Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995). Los vectores retrovirales están particularmente bien desarrollados y se han usado en instalaciones clínicas (Rosenberg y col., N. Engl. J. Mod 323:370, 1990; Anderson y col., patente de EE.UU. nº 5.399.346). Los enfoques no virales pueden emplearse también para la introducción de ADN terapéutico en células para las que se ha predicho que experimentarán apoptosis. Por ejemplo, NAIP puede introducirse en una neurona o una linfocito T por lipofección (Feigner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987; Ono y col., Neurosci. Lett. 117:259, 1990; Brigham y col., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger y col., Meth. Enz. 101:512, 1983), conjugación de asialorosonucoid-polilisina (Wu y col., J. Biol. Chem. 263:14621, 1988; Wu y col., J. Biol. Chem. 264:16985, 1989); o, menos preferentemente, microinyección bajo condiciones quirúrgicas (Wolff y col., Science 247:1465, 1990).

Para cualquiera de los procedimientos de aplicación descritos anteriormente, la construcción de ADN de NAIP terapéutico se aplica preferentemente al sitio del suceso de apoptosis predicho (por ejemplo, por inyección). Sin embargo, puede aplicarse también a tejido en la vecindad del suceso de apoptosis predicho o a un vaso sanguíneo que irriga las células para las que se ha predicho que experimentarán apoptosis.

En las construcciones descritas, la expresión de ADNc de NAIP puede dirigirse desde cualquier promotor adecuado (por ejemplo, citomegalovirus (CMV) humano, virus de simio 40 (SV40) o promotores de metalotioneína), y regularse por cualquier elemento regulador de mamífero apropiado. Por ejemplo, si se desea, para dirigir la expresión de NAIP pueden usarse potenciadores de los que se conoce que dirigen preferentemente la expresión génica en células neuronales, linfocitos T o linfocitos B. Los potenciadores usados pueden incluir, sin limitación, los que se caracterizan como específicos de tejido o de célula en su expresión. Alternativamente, si se usa un clon genómico de NAIP como construcción terapéutica (por ejemplo, después de su aislamiento por hibridación con el ADNc de NAIP descrito anteriormente), la regulación puede mediarse por secuencias reguladoras cognadas o, si se desea, por secuencias reguladoras derivadas de una fuente heteróloga, incluyendo cualquiera de los promotores o elementos reguladores descritos anteriormente.

Menos preferentemente, se logra terapia génica NAIP mediante administración directa del ARNm de NAIP o ARNm de NAIP antisentido a una célula de la que se espera que experimente apoptosis. El ARNm puede producirse y aislarse por cualquier técnica estándar, pero se produce más fácilmente por transcripción in vitro usando un ADNc de NAIP bajo el control de un promotor de alta eficacia (por ejemplo, el promotor T7). La administración de NAIP antisentido o ARNm a ARNm de células puede realizarse por cualquiera de los procedimientos para administración directa de ácidos nucleicos descritos anteriormente. Idealmente, la producción de proteína NAIP por cualquier enfoque de terapia génica producirá niveles celulares de NAIP que son al menos equivalentes al nivel celular normal de NAIP en una célula no afectada. El tratamiento por cualquier enfoque de terapia génica mediada por NAIP puede combinarse con terapias más tradicionales.

Otro enfoque terapéutico dentro de la invención implica la administración de proteína NAIP recombinante, bien directamente al sitio de un suceso de apoptosis predicho (por ejemplo, por inyección) o bien sistemáticamente (por ejemplo, por cualquier técnica convencional de administración de proteína recombinante). La dosificación de NAIP depende de una serie de factores, que incluyen el tamaño y la salud del paciente individual, pero, en general, se administran entre [0,1 mg y 100 mg] inclusive al día a un adulto en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable.

XI. Administración de polipéptidos de NAIP, genes de NAIP o moduladores de síntesis o función NAIP

Una proteína, gen o modulador NAIP puede administrarse dentro de un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, en forma de dosificación unitaria. Puede emplearse la práctica farmacéutica convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas para administrar NAIP a pacientes que sufren una enfermedad que está causada por una apoptosis excesiva. La administración puede iniciarse antes de que el paciente sea sintomático. Puede emplearse cualquier ruta de administración apropiada; por ejemplo, la administración puede ser parenteral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular, intracraneal, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, intranasal, aerosol, por supositorios o por administración oral. Las formulaciones terapéuticas pueden estar en forma de soluciones o suspensiones líquidas; para administración oral, las formulaciones pueden estar en forma de comprimidos o cápsulas; y para formulaciones intranasales, en la forma de polvos, gotas nasales o aerosoles.

Se encuentran procedimientos bien conocidos en la técnica para formar formulaciones, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences". Las formulaciones para administración parenteral pueden contener, por ejemplo, excipientes, agua estéril o solución salina, polialquilenglicoles como polietilenglicol, aceites de origen vegetal o naftalenos hidrogenados. Para el control de la liberación del compuesto puede usarse polímero lactida, copolímero lactida/glicolida o copolímeros polioxietileno-polioxipropileno. Otros sistemas de suministro parenteral potencialmente útiles para compuestos de modulación de NAIP incluyen partículas de copolímero de etileno-acetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener excipientes como, por ejemplo, lactosa, o pueden ser soluciones acuosas que contienen, por ejemplo, éter polioxietilen-9-laurílico, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales, o como un gel.

Si se desea, puede combinarse el tratamiento con una proteína, gen o compuesto modulador de NAIP con terapias más tradicionales para la enfermedad como cirugía, terapia con esteroides o quimioterapia para enfermedad autoinmune; terapia antiviral para SIDA; y activador de plasminógeno tisular (TPA) para lesión isquémica.

XII. Detección de condiciones que implican apoptosis alterada

Los polipéptidos y secuencias de ácidos nucleicos de NAIP encuentran uso diagnóstico en la detección o monitorización de condiciones que implican niveles aberrantes de apoptosis. Por ejemplo, la expresión reducida de NAIP puede correlacionarse con apoptosis potenciada en seres humanos (véase XII, más adelante). En consecuencia, una reducción o aumento en el nivel de producción NAIP puede proporcionar un indicio de una dolencia nociva. Los niveles de expresión de NAIP pueden someterse a ensayo por cualquier técnica estándar. Por ejemplo, la expresión de NAIP en una muestra biológica (por ejemplo, una biopsia) puede monitorizarse mediante análisis de transferencia Northern estándar o puede ayudarse con PCR (véase, por ejemplo, Ausubel y col., supra; PCR Technology; Principles and Applications for ADN Amplification, H.A. Ehrlich, ed. Stockton Press, NY Yap y col. Nucl. Acids. Res. 19:4294, 1991).

Alternativamente, una muestra biológica obtenida de un paciente puede analizarse para una o más mutaciones en las secuencias de NAIP usando un enfoque de detección de apareamiento erróneo. En general, estas técnicas implican amplificación PCR de ácido nucleico a partir de la muestra de patente, seguido de identificación de la mutación (es decir, apareamiento erróneo) por hibridación alterada, migración de gen electroforético aberrante, unión o escisión mediada por apareamiento erróneo de proteínas de unión o secuenciación directa de ácidos nucleicos. Cualquiera de estas técnicas puede usarse para facilitar la detección de NAIP mutante, y todas son bien conocidas en la técnica; ejemplos de técnicas particulares se describen, sin limitación, en Orita y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770, 1989; Sheffield y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:232-236, 1989).

En un enfoque más, se usan inmunoensayos para detectar o monitorizar proteína NAIP en una muestra biológica. Pueden usarse anticuerpos policlonales o monoclonales específicos de NAIP (producidos según se describe anteriormente) en cualquier formato estándar de inmunoensayo (por ejemplo, ELISA, inmunotransferencia o RIA) para medir los niveles de polipéptidos de NAIP. Estos niveles se compararían con niveles de NAIP silvestre, de modo que una reducción en la producción de NAIP indica una dolencia que implica apoptosis aumentada. Se describen algunos ejemplos de inmunoensayos, por ejemplo, en Ausubel y col., supra. También pueden utilizarse técnicas inmunohistoquímicas para detección de NAIP. Por ejemplo, puede obtenerse una muestra de tejido de un paciente, seccionarse y teñirse para detectar la presencia de NAIP usando un anticuerpo anti-NAIP y cualquier sistema de detección estándar (por ejemplo, uno que incluya un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante). Puede encontrarse una guía general sobre dichas técnicas, por ejemplo, en Bancroft y Stevens (Theory and Practice of Histological Techniques, Churchill Livingstone, 1982) y Ausubel y col. (supra).

En un ejemplo preferido, puede emplearse un procedimiento de diagnóstico combinado que empieza con una evaluación de producción de proteína NAIP (por ejemplo, mediante técnicas inmunológicas o prueba de truncamiento de proteínas (Hogerrorst y col., Nature Genetics 10:208-212, 1995)) y también incluye una técnica de detección de ácidos nucleicos diseñada para identificar mutaciones de NAIP más sutiles (por ejemplo, mutaciones puntuales). Según se describe anteriormente, se dispone de una serie de ensayos de detección de apareamiento erróneo para los expertos en la técnica, y puede usarse cualquier técnica preferida. Pueden detectarse mutaciones en NAIP que produzcan pérdida de expresión de NAIP o pérdida de actividad biológica de NAIP. En una variante de este procedimiento de diagnóstico combinado, la actividad biológica de NAIP se mide como actividad anti-apoptótica usando cualquier sistema de ensayo de apoptosis apropiado (por ejemplo, los descritos en la presente memoria descriptiva).

Los ensayos de detección de apareamiento erróneo también proporcionan una oportunidad para diagnosticar una predisposición mediada por NAIP a enfermedades causadas por apoptosis inapropiada. Por ejemplo, un paciente heterocigoto para una mutación NAIP puede no mostrar síntomas clínicos y aun así posee una probabilidad mayor de la normal de desarrollar uno o más tipos de enfermedad neurodegenerativa, mielodisplásica o de tener secuelas de un suceso isquémico. Dado este diagnóstico, un paciente puede tomar precauciones para reducir al mínimo su exposición a factores ambientales adversos (por ejemplo, exposición UV o mutágenos químicos) y vigilar cuidadosamente su dolencia médica (por ejemplo, mediante exámenes físicos frecuentes). Este tipo de enfoque diagnóstico de NAIP puede usarse también para detectar mutaciones de NAIP en detecciones selectivas prenatales. Los ensayos diagnósticos de NAIP descritos anteriormente pueden realizarse usando cualquier muestra biológica (por ejemplo, cualquier muestra de biopsia u otro tejido) en la que NAIP se exprese normalmente. La identificación de un gen de NAIP mutante puede someterse también a ensayo usando estas fuentes como muestras de prueba.

Alternativamente, puede probarse una mutación de NAIP, en particular como parte de un diagnóstico de predisposición a enfermedades degenerativas asociadas a NAIP, usando una muestra de ADN obtenida de cualquier célula, por ejemplo, por técnicas de detección de apareamiento erróneo. Preferentemente, la muestra de ADN se somete a amplificación PCR antes de análisis.

XIII. Terapia preventiva antiapoptótica

En un paciente diagnosticado como heterocigoto con respecto a mutación de NAIP o como susceptible a mutaciones de NAIP (incluso si estas mutaciones no producen alteración o pérdida de actividad biológica de NAIP), o un paciente diagnosticado con una enfermedad degenerativa (por ejemplo, enfermedades degenerativas de la neurona motora como AME o enfermedades ELA), o diagnosticado como VIH-positivo, cualquier de las terapias anteriores puede administrarse antes de la aparición del fenotipo de la enfermedad. Por ejemplo, pueden proporcionarse terapias a un paciente que sea VIH-positivo pero que todavía no muestre un recuento de linfocitos T disminuido u otros signos de SIDA. En particular, los compuestos demostrados que aumentan la expresión de NAIP o la actividad biológica de NAIP pueden administrarse mediante cualquier dosificación y ruta de administración estándar (véase anteriormente). Alternativamente, puede emprenderse terapia génica usando una construcción de expresión de NAIP para invertir o prevenir el defecto celular antes del desarrollo de la enfermedad degenerativa.

Pueden usarse las composiciones y procedimientos descritos para reducir o diagnosticar los trastornos descritos en la presente memoria descriptiva en cualquier mamífero, por ejemplo, seres humanos, animales domésticos o ganado. Cuando se trata o diagnostica un mamífero no humano, se emplean preferentemente polipéptido, ácido nucleico o anticuerpo de NAIP específico para esa especie.

XV. Identificación de genes de NAIP adicionales

Pueden usarse técnicas estándar, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación de ADN, para clonar homólogos de NAIP adicionales en otras especies. Transferencias Southern de ADN genómico murino hibridado en bajas condiciones restrictivas con sondas específicas para NAIP humana revelan bandas que corresponden a NAIP y/o miembros relacionados de la familia. Así, pueden identificarse fácilmente secuencias de NAIP adicionales usando hibridación de bajas condiciones restrictivas. Ejemplos de cebadores específicos de ADN humano y murino, que pueden usarse para clonar genes adicionales por RT-PCR.

XVI. Caracterización de actividad NAIP y estudios de localización intracelular

La aptitud de NAIP para modular la apoptosis puede definirse en sistemas in vitro en los que puedan detectarse alteraciones de apoptosis. Pueden introducirse construcciones de expresión de mamíferos que transporten ADNc de NAIP, ya sean de longitud completa o truncados, en líneas celulares como CHO, NIH 3T3, HL60, Rat-1 o células de Jurkat. Además, pueden usarse células de insecto SF21, en cuyo caso el gen de NAIP se expresa preferencialmente usando un promotor de choque térmico de insecto. Después de transfección, puede inducirse apoptosis por procedimientos estándar, que incluyen privación sérica o aplicación de estaurosporina, menadiona (que induce apoptosis a través de formación de radicales libres) o anticuerpos anti-Fas. Como control, se cultivan células en las mismas condiciones que las inducidas para experimentar apoptosis, pero no transfectadas o transfectadas con un vector que carece de inserto de NAIP. La aptitud de cada construcción de NAIP para inhibir la apoptosis bajo expresión puede cuantificarse calculando el índice de supervivencia de las células, es decir, la proporción de linfocitos Transfectadas supervivientes con respecto a las células de control supervivientes. Estos experimentos pueden confirmar la presencia de apoptosis que inhibe la actividad y, como se expone más adelante, también pueden usarse para determinar la o las regiones funcionales de una NAIP. Estos ensayos pueden realizarse también en combinación con la aplicación de compuestos adicionales para identificar compuestos que modulan la apoptosis a través de expresión de NAIP.

XVII. Ejemplos de ensayos de apoptosis adicionales

En las referencias siguientes se proporcionan también ejemplos específicos de ensayos de apoptosis ensayos. Se desvelan ensayos de apoptosis en linfocitos en: Li y col., "Induction of apoptosis in uninfected lymphocites by HIV-1 Tat protein", Science 268:429-431, 1995; Gibellini y col., "Tat-expressing Jurkat cells show an increased resistance to different apoptotic stimuli, including acute human inmunodeficiency virus-type 1 (HIV-1) Infection", Br. J. Haematol. 89:24-33, 1995; Martin y col., "HIV-1 infection of human CD4+ T cells in vitro. Differential induction of apoptosis in these cells". J. Inmunol. 152:330-42, 1994; Terai y col., "Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T lymphoblasts acutely infected with HIV-1", J. Clin. Invest. 87:1710-5, 1991; Dhein y col., ``Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1/(Fas/CD95)11, Nature 373:438-441, 1995; Katsikis y col., "Fas antigen stimulation induces marked apoptosis of T lymphocites in human immunodeficiency virus-infected individuals", J. Exp. Med. 1815:2029-2036, 1995; Westendorp y col., Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gp120'', Nature 375:497, 1995; DeRossi y col., Virology 198:234-44, 1994.

Se desvelan ensayos de apoptosis en fibroblastos en: Vossbeck y col., "Direct transforming activity of TGF-beta on rat fibroblasts", Int. J. Cancer 61:92-97, 1995; Goruppi y col., "Dissection of c-myc domains involved in S phase induction of NIH3T3 fibroblasts", Oncogene 9:1537-44, 1994; Fernández y col., "Differential sensitivity of normal and Ha-ras transformed C3H mouse embryo fibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2, c-myc, and manganese superoxide dismutase in resistant cells", Oncogene 9:2009-17, 1994; Harrington y col., "c-Myc-induced apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines", EMBO J., 13:3286-3295, 1994; Itoh y col., "A novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen", J. Biol. Chem. 268:10932-7, 1993.

Se desvelan ensayos de apoptosis en células neuronales en: Melino y col., "Tissue transglutaminase and apoptosis: sense y antisense transfection studies with human neuroblastoma cells", Mol. Cell Biol. 14:6584-6595, 1994; Rosenbaum y col., "Evidence for hypoxia-induced, programmed cell death of cultured neurons", Ann. Neurol. 36:864-870, 1994; Sato y col., "Neuronal differentiation of PC12 cells as a result of prevention of cell death by bcl-2", J. Neurobiol. 25:1227-1234, 1984; Ferrari y col., "N-acetylcysteine D- and L-stereoisomers prevents apoptotic death of neuronal cells ", J. Neurosci. 1516:2857-2866, 1995; Talley y col., "Tumor necrosis factor alpha-induced apoptosis in human neuronal cells: protection by the antioxidant N-acetylcysteine and the genes bcl-2 and crma", Mol. Cell Biol. 1585:2359-2366, 1995; Talley y col., "Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Apoptosis in Human Neuronal Cells: Protection by the Antioxidant N-Acetylcysteine and the Genes bcl-2 and crma", Mol. Cell. Biol. 15:2359-2366, 1995; Walkinshaw y col., "Induction of apoptosis in catecholaminergic FC12 cells by L-DOPA. Implications for the treatment of Parkinson's disease", J. Clin. Invest. 95:2458-2464, 1995.

Se desvelan ensayos de apoptosis en células de insecto en: Clem y col., "Prevention of apoptosis by a baculovirus gene during infection of insect cells", Science 254:1388-90, 1991; Crook y col., "An apoptosis-inhibiting baculovirus gene with a zinc finger-like motif", J. Virol. 67:2168-74, 1893; Rabizadeh y col., "Expression of the baculovirus p35 gene inhibits mammalian neural cell death", J. Neurochem. 61:2318-21, 1993; Bimbaum y col., "An apoptosis inhibiting gene from a nuclear polyhedrosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs", J. Virol. 68:2521-8, 1994; Clem y col., Mol. Cell. Biol. 14:5212-5222, 1994.

XVIII. Construcción de un animal transgénico

La caracterización de genes de NAIP proporciona información que es necesaria para el desarrollo de un modelo animal de noqueado NAIP mediante recombinación homóloga. Preferentemente, el modelo es un animal mamífero, con la máxima preferencia un ratón. Análogamente, puede generarse un modelo animal de sobreproducción de NAIP por integración de una o más secuencias de NAIP en el genoma, según técnicas transgénicas estándar.

Puede construirse un vector dirigido de tipo sustitución, que se usaría para crear un modelo de noqueado, usando un clon genómico isogénico, por ejemplo, de una cepa de ratón como 129/Sv (Stratagene Inc., La Joya, CA). El vector dirigido se introducirá en una línea derivada adecuadamente de células madre embrionarias (ME) por electroporación para generar líneas celulares ME que transportan una forma profundamente truncada de NAIP. Para generar ratones fundadores quiméricos, las líneas celulares dirigidas se inyectarán en un embrión de ratón en fase de blástula. La descendencia heterocigota se entrecruzará para obtener homocigosidad. Los ratones noqueados proporcionarían el medio, in vivo, de detectar selectivamente compuestos terapéuticos que modulan la apoptosis a través de una vía dependiente de NAIP. Formar dichos ratones puede requerir el uso de sitios IoxP debido a las múltiples copias de NAIP en el cromosoma (véase Sauer y Henderson, Nucleic Aids Res. 17:147-61 (1989)).

Ejemplos

Los ejemplos pretenden ilustrar, no limitar la invención.

Ejemplo 1 Expresión de NAIP en líneas estables combinadas Rat-1, CHO y HeLa y células infectadas por adenovirus analizadas por inmunotransferencia e inmunofluorescencia

Para generar una construcción NAIP de aproximadamente 3,7 kb marcado con epítopo myc (I) MTG-SP3.7, se ligaron un fragmento Bsu36I/SaII de 2,5 kb de NAIP clonado en Bluescript y (II)Bsu36I/XhoI corte MTG-SE1.7, el vector de expresión pcADN3 que contenía un epítopo myc de 300 pb y un fragmento de 1,7 kb de NAIP. Se transfectaron células HeLa, CHO y Rat-1 por lipofección (Gibco BRL) con 8 \mug de ADN y se seleccionaron transformantes resistentes G418 manteniendo las células en 250 \mug/ml, 400 \mug/ml y 800 \mug/ml de G41B respectivamente. Todas las células se mantuvieron en medio de Eagle que contenía suero de ternera fetal al 10%. Para construcción del adenovirus, se clonó un fragmento BamHI de 3,7 kb de NAIP en el sitio SwaI del cósmido de expresión de adenovirus pAdex1CAwt. La producción de vectores, la purificación por doble gradiente de cloruro de cesio y la determinación volumétrica fueron según se describe en Rosenfeld, M.A. y col. 1992, y Graham, F.L. y Van Der Eb, A. 1973.

Se realizó análisis por inmunotransferencia usando anticuerpo monoclonal myc anti-humano de ratón (Ellison, M.J. y Hochstrasser, M.J. 1991) o anticuerpo policlonal NAIP anti-humano de conejo (E1.0). Para producción de anticuerpos NAIP, se inmunizaron conejos con proteína de fusión producida bacteriana purificada en adyuvante de Freunds completo. El suero se prelimpió con proteína GST e inmunoglobina anti-NAIP purificada con proteínas de fusión GST-NAIP inmovilizadas.

Para inmunofluorescencia, se cultivaron células en portaobjetos de vidrio, se fijaron con formaldehído durante 10 minutos, se incubaron con anti-NAIP (1:200) o anti-myc (1:20) en PBS, 0,3% Triton X-100^{TM} durante 1 hora seguido de incubación con antisueros secundarios, inmunoglobina anti-conejo de asno marcada con FITC (Amersham), inmunoglobina anti-ratón de cabra tinilada (Amersham) y estreptavidina Texas-Red^{TM} (Amersham).

Ejemplo 2 Efecto de NAIP en muerte celular inducida por privación de suero, menadiona y TNF-\alpha

Para cada ensayo se analizaron en placa células a 5 x 10^{4} ml en triplicado. Se trataron células de CHO o Rat-1 con menadiona durante 1,5 horas, se lavó 5 veces en PBS y se mantuvo en medio normal. Para ensayos de privación de suero, se lavaron células 5 veces en PBS y se mantuvo en medios con suero de ternera fetal al 0%. Se trataron células HeLa con 20 unidades/ml TNF-\alpha en combinación con 30 g/ml de ciclohexamida durante 17 horas. Se sometió a ensayo la apoptosis para cada activador mediante tinción con yoduro de propidio. Las células infectadas con adenovirus se sometieron a activaciones 36 horas post-infección. La expresión de IacZ se confirmó histoquímicamente mediante 5-bromo-4-cloro-3-indoíl-\beta-D-galactósido (X-gaI) según se describe en Ellison, M.J. y Hochstrasser, M.J. 1991. Se determinó la transcripción de PIAN mediante hibridación in situ usando el oligonucleótido de sentido etiquetado con DIG siguiendo el protocolo de los fabricantes (Boehringer Mannheim). Se digirió el clon BcI-2 humano pB4 (ATCC) con EcoRI y se ligó en el sitio EcoRI de pcDNA3.

Para ensayos de adenovirus se utilizaron como controles adenovirus que codifican LacZ, NAIP antisentido (NAIP) o vector en solitario sin inserto. Se utilizó BcI-2 como control positivo y pcDNA en solitario como control negativo en ensayos de líneas celulares. Se determinó la viabilidad celular por exclusión con azul de tripano. Los datos se presentan como promedios de tres infecciones o reservas transfectadas derivadas independientemente.

Ejemplo 3 Análisis de inmunofluorescencia de tejido de médula espinal humana

Se obtuvieron tejidos humanos en autopsia de un lactante de 2 meses de vida que murió por causas no neurológicas y se almacenó a -80ºC. Se fijaron secciones criostáticas 14 \muM en formaldehído durante 20 minutos, se enjuagó en PBS y se incubó en solución de bloqueo (suero de caballo al 2%, caseína al 2%, BSA al 2% en PBS) durante 15 minutos antes de incubación durante toda la noche con antisueros anti-NAIP diluidos en esta solución de bloqueo. Se utilizó inmunoglobina anti-conejo de asno etiquetada CY-3 (Sigma) como antisueros secundarios.

Ejemplo 4 Aislamiento y clonación del gen de NAIP Matriz contigua PAC

Los subloci 40GiCATT demostraron desequilibrio de unión y, por tanto, se construyó una matriz contigua PAC que contenía la región CATT. Esta matriz contigua PAC comprendía 9 clones y se extendía aproximadamente a 400 kb. Los análisis genéticos combinados con los datos de cartografía física indicaron que el marcador de subloci 40G1 CATT que mostraba el mayor desequilibrio con AME estaba duplicado y se localizaba en el extremo centromérico del intervalo AME crítico. En consecuencia, se eligió para mayor examen el clon PAC de 154 kb 125D9 que contenía dentro de 10 kb de su extremo centromérico el intervalo AME que define el alelo CMS 9 y se extendía telemétricamente para incorporar el sublocus 40G1 CATT.

Se construyeron dos bibliotecas genómicas mediante realización de Sau3A1 completo y parcial (tamaño de inserto 5 kb) en PAC 125D9 y clonación de productos restringidos en plásmidos Bluescript digeridos BamHI. Se realizó secuenciación genómica en ambos términos de 200 clones desde la biblioteca Sau3Aq parcial de inserto de 5 kb en la manera de (Chen y col., 1993) que permite la construcción de clones genómicos contiguos y solapados que cubren la mayoría del PAC. Esto se demostró útil en la elucidación de la estructura del gen de proteína inhibidora de la apoptosis neuronal.

Se escinde PAC 125D9 en fragmentos centroméricos de 30 kb y teloméricos de 125 kb mediante un sitio NotI (del que más tarde se demostró que bisecaba el exón 7 de PAC 125D9 al principio del dominio inhibidor de apoptosis). Los fragmentos PAC NotI se aislaron mediante PFGE preparatoria y se usaron por separado para sondear bibliotecas de ADNc de encéfalo fetal. También se sometió a ensayo la cartografía física y secuenciación de la región del sitio NotI para determinar la presencia de una isla CpG, un enfoque que detectó rápidamente secuencias de codificación. También se usó PAC 125D9 como plantilla en un sistema de captura de exones que produjo la identificación de los exones contenidos en el gen de proteína inhibidora de la apoptosis neuronal.

El enfoque multifacético, además de la presencia de transcriptos identificados previamente por hibridación mediante clones de la matriz de cósmidos (como GA1 y L7) produjo la rápida identificación de seis clones de ADNc contenidos en gen de proteína inhibidora de la apoptosis neuronal. El clon se dispuso, cuando fue posible, en matrices solapadas. Se excluyó el quimerismo en una serie de ocasiones mediante detección de colinealidad de los términos de clones de ADNc con secuencias de clones derivados de la biblioteca genómica Sau3A1 parcial PAC 125D9.

Clonación de gen de proteína inhibidora de la apoptosis neuronal

Se sondeó una biblioteca de ADNc de médula espinal fetal humana con el inserto genómico de ADN completo de cósmido 250B6 que contenía uno de los 5 subloci CATT. Esto produjo una detección de un transcripto de 2,2 kb referido como GA1. Se emprendieron posteriores sondeos de bibliotecas de encéfalo fetal con los insertos de cósmidos contiguos (cósmidos 40G1), así como subclones de copia única aislados de dichos cósmidos. Se obtuvo una serie de transcriptos, incluyendo uno denominado L7. No se detectó región de codificación para L7, debido probablemente al hecho de que una parte sustancial del clon contenía ARN heteronuclear sin procesar. Sin embargo, más tarde se descubrió que L7 demostró comprender parte de lo que se creía un gen de proteína inhibidora de la apoptosis neuronal. Análogamente, el transcripto GA1 demostró en último término ser un exón 13 de la proteína inhibidora de la apoptosis neuronal. Como se encontró que GA1 contenía exones que indicaban que era un gen expresado, fue de particular interés. El transcripto GA1 que estaba contenido dentro del clon PAC 125D9 se extendió posteriormente mediante sondeo de bibliotecas de ADNc.

Se completaron los huecos restantes en el ADNc y se consiguió la extensión 3' final mediante sondeo de una biblioteca de encéfalo fetal con dos exones atrapados. Se preparó un mapa físico del ADNc con clones solapados. La secuencia de ADNc completa se muestra en la Tabla 1 y contiene 18 exones (1 a 14a y 14 a 17). La secuencia de aminoácidos empieza con metionina que corresponde al triplete de nucleótidos ATG.

Manipulación y análisis de ADN

Se construyeron cuatro bibliotecas genómicas que contenían inserto PAC 125D9 mediante digestiones de BamHI, BamHI/NotI, Sau3aI total y parcial (seleccionada para tamaño de inserto de 5 kb) del inserto de ADN genómico PAC y se subclonó en vector Bluescript. Se emprendió la secuenciación de 400 pb aproximadamente de ambos términos de 200 clones de 5 kb mediante la biblioteca de digestión Sau3AI parcial en el modo de Chen y col. (1993).

Se aislaron las secuencias de codificación a partir de los PAC mediante el procedimiento de amplificación de exones, según describen Church y col. (1994). Se digirieron los PAC con BamHI o BamHI y BgIII y se subclonaron en pSPL3. Se transfectaron clones combinados de cada PAC en células COS. Al cabo de 24 h se extrajo ARN total de transfección. Se clonaron los exones en pAMP10 (Gibco, BRL) y se secuenció utilizando cebador SD2 (GTG AAC TGG ACT GTG ACA AGC TGC).

Se realizó la secuenciación de ADN en un secuenciador de ADN automatizado ABI 373A. Se usaron dos bibliotecas comerciales de ADNc de encéfalo fetal humano en lambda gt (Stratagene) y lambda ZAP (Clontech) para aislamiento de los transcriptos candidatos. Se adquirió comercialmente la transferencia Northern (Clontech) y se realizó el sondeo usando metodología estándar.

En general, los cebadores usados en el papel para PCR se seleccionaron para T_{m}s de 60ºC y pueden usarse con las siguientes condiciones: 30 ciclos de 94ºC, 60 s; 60ºC, 60 s; 72ºC, 90 s. Las cartografías de cebadores por PCR son según se refiere en las leyendas de figuras y el texto. Las secuencias de cebadores son las siguientes:

: 1258 ATg CTT ggA TCT CTA gAA Tgg - ID de secuencia nº 3

: 1285 AgC AAA gAC ATg Tgg Cgg AA - ID de secuencia nº 4

: 1343 CCA gCT CCT AgA gAA AgA Agg A - ID de secuencia nº 5

: 1844 gAA CTA Cgg CTg gAC TCT TTT - ID de secuencia nº 6

: 1863 CTC TCA gCC TgC TCT TCA gAT - ID de secuencia nº 7

: 1864 AAA gCC TCT gAC gAg Agg ATC - ID de secuencia nº 8

: 1884 CgA CTg CCT gTT CAT CTA CgA - ID de secuencia nº 9

: 1886 TTT gTT CTC CAg CCA CAT ACT - ID de secuencia nº 10

: 1887 CAT TTg gCA TgT TCC TTC CAA g - ID de secuencia nº 11

: 1893 gTA gAT gAA TAC TgA TgT TTC ATA ATT - ID de secuencia nº 12

: 1910 TgC CAC TgC CAg gCA ATC TAA - ID de secuencia nº 13

: 1919 TAA ACA ggA CAC ggT ACA gTg - ID de secuencia nº 14

: 1923 CAT gTT TTA AgT CTC ggT gCT CTg - ID de secuencia nº 15

: 1926 TTA gCC AgA TgT gTT ggC ACA Tg - ID de secuencia nº 16

: 1927 gAT TCT ATg TgA TAg gCA gCC A - ID de secuencia nº 17

: 1933 gCC ACT gCT CCC gAT ggA TTA - ID de secuencia nº 18

: 1974 gCT CTC AgC TgC TCA TTC AgA T - ID de secuencia nº 19

: 1979 ACA Aag TTC ACC ACg gCT CTg - ID de secuencia nº 20

El análisis genético y cartográfico de los autores de la invención de AME ha llevado a la identificación del inserto de 154 kb de PAC125D9 como sitio probable del gen AME. Los autores de la invención comunican aquí la secuencia de ADN completa de la parte de 131 kb del inserto PAC125D9 que contiene NAIP y SMN^{tel} así como el extremo 3' de una copia del gen de Factor de Transcripción Básico BTF2p44.^{9} El inserto PAC125D9 digerido con una diversidad de enzimas de restricción se usó para generar nueve bibliotecas. La secuenciación al azar de clones de la biblioteca Sau3A1 se obstaculizó por la naturaleza rica en Alu de la zona; por tanto, la secuenciación se realizó mediante un enfoque basado en trasposón modificado que produjo la configuración representada en la figura. Los genes de NAIP y SMN^{tel}, separados por 16,5 kb, están en una orientación de cola a cola (5'\rightarrow3':3'\rightarrow5'), extendiéndose a 56 kb y 28 kb de ADN genómico, respectivamente. El gen BTF2p44 existe en una serie de copias en 5q13.1^{10}; los exones 11-16 de una copia BTF2p44 ocupan la mayoría de 5' once kb del inserto PAC seguido por un intervalo de 11 kb antes del exón NAIP 2. El primer exón de NAIP según se comunicó originalmente^{3} no está presente en este PAC y puede haber sido un artefacto heteronuclear. Se transcribe una sección de aproximadamente 3 kb del intervalo de 15,5 kb entre NAIP y SMN (CGA, figura), pero no contiene secuencia de codificación de proteína. De hecho, no se identificó ninguna secuencia de codificación además de BTF2P44, NAIP y SMN en todo el intervalo.

Las islas CpG se identificaron en la región 5' de genes SMN y NAIP. Se identificaron 145 secuencias Alu en la secuencia de 131 kb, con cinco conglomerados de alta densidad (leyenda de figura). Dicha densidad Alu asociada con escasez L1 (cinco copias) está en consonancia con hallazgos previos para bandas cromosómicas de tinción Giamsa ligera (o inversa)^{11}. También se representan copias de otras repeticiones (por ejemplo, MIR2, MST y MER) según se detectan en el programa Sequin^{12}. Los loci microsatélites polimórficos previamente cartografiados en la región AME (CMSi1^{13},CATT^{14} o C16^{15}, G171^{15}, C272^{15} o AG-1^{16,17}), así como repeticiones simples o de dinucleótidos inusuales, según se muestra.

También se elucidó el ADNc de NAIP de longitud completa (6.228 pb con un ORF de 4.212 pb) por secuenciación y comparación de ADNc con secuencia PAC, que comprende 17 exones que codifican una proteína de 156 kDa predicha de 1.403 aminoácidos (datos no mostrados). Se identificó un nuevo exón 14 de NAIP entre los exones originales 14 y 15. El exón original 17 ha sido sustituido por un nuevo exón que contiene el codón de parada, una región UTR 3' de 1,6 kb y el sitio de consenso de poliadenilación (AATAAA) identificado por RACE 3'. No se encontraron nuevos dominios de proteína en el gen de NAIP.

En nuestra comprensión de la patogénesis de la enfermedad es crucial una definición rigurosa de cuánto se extienden las deleciones. Si el genotipo observado más frecuentemente en los cromosomas AME de tipo 1 (es decir, ausencia de exones NAIP 4 y 5 así como SMN^{tel} exones 7 y 8), son consecuencia de un único suceso, entonces nuestra secuenciación sugiere un tamaño de deleción mínimo de 60 kb. La alta frecuencia de deleción en cromosomas AME de tipo 1 de CATT-40G1^{14} (que se cartografía entre exones NAIP 7 y 8) es coherente con dicha deleción.

Las transferencias Southern que contienen ADN genómico sondeado con ADNc de NAIP revelan una diversidad de bandas, como consecuencia del número polimórfico de formas variantes de esta cartografía de locus a 5q13.1^{3\text{.}18}. En contraste, las mismas transferencias sondeadas ADNc de SMN revelan sólo las bandas asociadas con el locus de SMN intacto, tanto para individuos AME como no AME. Así, no existe evidencia de genes SMN truncados o suprimidos parcialmente, como se observa con el gen de NAIP. La ausencia de cualquier fragmento de unión SMN detectable en pacientes AME sugiere fuertemente que la deleción de exones 7 y 8 SMN^{tel} detectada en la mayoría significativa de casos AME incorpora el gen SMN^{tel} completo, extendiéndose así a la deleción AME de tipo 1 posible mínima en aproximadamente 100 kb (figura). Esto concuerda con la alta frecuencia de deleción de microsatélite C272^{15} (o AG-1^{16,17}) (que se corresponde con el exón 1 de SMN, figura) en cromosomas AME de tipo 1. Se observa una frecuencia de deleción de una copia de BTF2P44 en todos los casos de AME con independencia de su gravedad clínica^{9}, lo que sugiere que esta mutación puede no ser una extensión de la deleción de SMN-NAIP posible. La clarificación de este asunto debe esperar a detalles de qué copia de p44 está suprimida.

Nuestra secuenciación de PAC125D9 se corresponde con el locus de NAIP intacto y el SMN^{tel} clínicamente relevante en una región de 100 kb que contiene estos polimorfismos de microsatélites que se suprimen preferentemente en la mayoría significativa de cromosomas AME de tipo 1 (es decir, CATT-40G1^{14} C272^{15} o AG-1^{16,17}).La ausencia de cualquier secuencia que codifica proteína, distinta de NAIP y SMN en este intervalo, centra la atención en estos dos genes como moduladores clave de AME de tipo 1. Un modelo patógeno potencial es que la ausencia de SMN^{tel} actúa como agresión neurotóxica primaria^{19} con depleción/ausencia de NAIP que conduce a una resistencia apoptótica atenuada^{5,6}, agravando el desgaste de la neurona motora. La presencia de SMN^{cen} adicional puede actuar también para modular el curso de la enfermedad^{20}. Además de ayudar a nuestra comprensión de la patología molecular de la AME aguda, la secuencia aquí presentada debería ayudar en el estudio de los elementos de control transcripcional de ambos genes, facilitando posiblemente la formulación de terapias genéticas para esta devastadora enfermedad neuromuscular.

Secuenciación de ADN

Se formaron bibliotecas parciales de Sau3A1 (seleccionadas para 3 a 5kb), BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, SstI, XbaI y EcoRV a partir del inserto PAC126D9 y se secuenciaron usando una metodología basada en trasposones (TN1000 Gold Biotechnology^{10}). La subclonación de un gran número de insertos en el plásmido pMOB suministrado comercialmente se encontró problemática y, por tanto, se usaron pUC18 y pBluescript SK. En general, menos del 10% de los clones tenía trasposones en la región del vector. Se empleó lisado de E. coli como plantilla de secuenciación usando protocolo de difusión de calor de los autores de la invención^{21}. La secuenciación se hizo a partir del trasposón TN1000 insertado aleatoriamente en el ADN diana, usando cebadores de orientación opuesta (5'-ATA TAA ACA ACGAAT TAT CTC C-3'; 5'-GTA TTA TAA TCA ATA AGTTAT ACC-3'), generando 1 kb de secuencia con aproximadamente un solapamiento de 5 pb, extendiéndose fácilmente repeticiones Alu de 300 pb. El enfoque de los autores de la invención permitía secuenciación de insertos de hasta 14 kb.

Como se sabe que la región AME es inestable, se puso un cuidado especial para garantizar un inserto PAC intacto inalterado por comparación de inserto de PAC125D9 y patrones de hibridación de ADN genómico en transferencias Southern.

Se procesaron datos de secuencia de ADN generados por los secuenciadores automatizados de los autores de la invención (ABI 373 y ABI 373A) y se ensamblaron en paralelo por el programa Sequencher 3.0 (Gene Codes Inc.); y el programa GAP4 del paquete Staden^{27}. Los resultados editados se convirtieron automáticamente en formatos de archivo GCG^{22} y se colocaron en una base de datos independiente para búsquedas de usuarios externos mediante el servidor de correo electrónico de los autores de la invención en smafasta@mgcheo.med.uottawa.ca. Se emplearon búsquedas GRAIL y Blast^{29} para detectar selectivamente secuencia de codificación de proteínas y la base de datos PROSITE Protein^{24} según se usa para buscar dominios de proteínas.

Ejemplo 5 Vectores de expresión de NAIP

Usando la información de la secuencia de NAIP identificada, se ligaron una construcción NAIP de 3,7 kb de longitud completa marcado con el epítopo myc (I) MTG-SP3.7, un fragmento de Bsu36I/Sall de 2,5 kb de NAIP clonado en Bluescript y (ii) corte Bsu36I/Xhol MTG-SE1.7, conteniendo el vector de expresión pcDNA3 un epítopo myc de 300 pb y un fragmento de 1,7 kb de NAIP. Se transfectaron células de HeLa, CHO y Rat-1 por lipofección (Gibco BRL) con un ADN de 8 mg y se seleccionaron transformantes resistentes G418 manteniendo las células en G418 250 \mug/ml, 400 \mug/ml y 800 \mug/ml, respectivamente.

En un segundo enfoque, se infectaron células con adenovirus en solitario o adenovirus que expresan NAIP, NAIP antisentido o LacZ. Para construcción del adenovirus, se clonó un fragmento BamHI de NAIP de 3,7 kb en el sitio SwaI del cósmido de expresión de adenovirus pAdexlCAwt. El ARN de NAIP antisentido contiene una secuencia complementaria a la región de un ARNm que contiene un codón iniciador. La expresión de NAIP se confirmó en ambos procedimientos por análisis de inmunotransferencia e inmunofluorescencia. Después de infección con los adenovirus recombinantes, se indujeron CHO para experimentar apoptosis por privación sérica con índices de supervivencia del 48% (sin inserto), el 51% (LacZ) y el 45% (NAIP antisentido) a 48 horas (Fig. 1a). En contraste, células CHO infectadas con adenovirus que expresan NAIP demuestran una supervivencia del 78 al 83%. NAIP indujo también supervivencia en CHO combinadas de transfección estable, aunque ligeramente inferior que la observada en células infectadas por adenovirus: el 44% de los transfectantes de vectores y el 65% de los transfectantes de NAIP sobrevivían a 48 horas (Fig. 1b). A continuación, la sobreexpresión de NAIP en células CHO tratada con menadiona 20 \muM (un inductor evidente de radicales libres) tuvo como resultado la mejora en la supervivencia del 20 al 30% en comparación con los controles después de 24 horas (Fig. 1c, 1d). La sobreexpresión de NAIP protegía también los fibroblastos Rat-1 tratados con menadiona protegida de la muerte celular (Fig. 1e, 1f, 1g, 1h). Sólo el 15% de las células infectadas con adenovirus que expresan LacZ eran visibles a las 12 horas, en contraste con el 80% de células infectadas con NAIP, un efecto detectado también con los transfectantes NAIP Rat-1 combinados. Se indujo todavía mayor supervivencia por sobreexpresión de NAIP en una concentración de menadiona inferior (5 \muM), con el 98% de transfectantes NAIP combinados y el 33% de transfectantes de control viables a 24 horas (Fig. 1g, 1h). También se evaluó el efecto protector de NAIP en células expuestas a la TNF-\alpha citoquina. Se protegieron las células HeLa tratadas con TNF-\alpha y ciclohexamida de la apoptosis cuando se infectaron con adenovirus que expresaban altos niveles de NAIP (139%) a las 48 horas, un efecto no observado con NAIP antisentido (52%) (Fig. 1i, 1j). Se observó un efecto similar en transformantes HeLa combinados.

Para confirmar que las células que sobreviven a agentes apoptóticos expresaban NAIP, se realizó inmunofluorescencia con antisueros anti-NAIP en una serie de ensayos de muerte celular. La inmunofluorescencia es una técnica que localiza proteínas en una célula por microscopía óptica mediante el uso de anticuerpos específicos para una proteína deseada y un microscopio de fluorescencia. Pueden acoplarse químicamente tinciones a anticuerpos dirigidos contra anticuerpos purificados específicos para una proteína deseada. Este complejo de tinción fluorescente-anticuerpo cuando se añade a células o secciones de tejido permeabilizadas se une al antígeno-anticuerpo deseado que se ilumina al ser iluminado por la longitud de onda excitadora. También pueden microinyectarse anticuerpos fluorescentes en células en cultivo para visualización. Usando inmunofluorescencia, se acopló CY-3, una tinción que emite luz roja, a un anticuerpo secundario usado para detectar anticuerpos anti-NAIP unidos. Se observó un enriquecimiento espectacular de células que expresan NAIP, sin que se observe alteración en la distribución citoplásmica de NAIP. Estos datos ofrecen un fuerte apoyo a la actividad de supresión apoptótica de NAIP.

Ejemplo 6 Distribución celular de NAIP usando anticuerpos NAIP

Previamente se demostró (Roy, N. y col. The gene for NAIP, una nueva proteína con homología para inhibidor baculoviral de apoptosis, está suprimido parcialmente en individuos con atrofia muscular espinal. Cell 80:167-178 (1995)) por análisis de PCR de transcriptasa inversa que el transcripto NAIP está presente en la médula espinal humana. Para definir con más precisión la distribución celular de NAIP, se preparó antisuero policlonal frente a NAIP. A continuación se usaron los anticuerpos NAIP en técnicas de inmunocitoquímica e inmunofluorescencia para visualizar la proteína directamente en células y tejidos para establecer la posición subcelular y la especificidad de tejido en la proteína.

La aptitud del anticuerpo policlonal de detectar NAIP se confirmó por inmunofluorescencia de linfocitos Transfectadas con NAIP marcado con myc empleado en anticuerpos anti-NAIP y anti-myc, así como análisis de inmunotransferencia en extractos de proteína de estas células (Fig. 1). En la técnica de inmunotransferencia, las proteínas se preparan en gel de poliacrilamida y a continuación se transfieren a membranas de nitrocelulosa. A continuación se incuban estas membranas en presencia del anticuerpo (primario), y después de lavado se incuban para obtener un anticuerpo secundario que se usa para detección del complejo de anticuerpos primarios de proteína. Después de lavado repetido, se visualiza todo el complejo usando procedimientos colorimétricos o quimioluminiscentes. Se detectó una proteína del peso molecular esperado para anticuerpos en inmunotransferencias y se demostró su colocalización celular por inmunofluorescencia. Las secciones de médula espinal humana teñidas con anti-NAIP mostraron fuerte inmunorreactividad en el citoplasma de células del asta anterior y neuronas intermediolaterales (Fig. 3a y 3b). En coherencia con la tinción de neuronas motoras, se observó reactividad NAIP en las raíces ventrales que contienen axones motores pero no en las raíces dorsales comprendidas en los axones sensoriales (Fig. 3c y 3d). La observación de tinción de las neuronas motoras se correlaciona bien con un rol de la proteína en la patogénesis de AME. Sin embargo, la presencia de NAIP en neuronas intermediolaterales para las que no se ha comunicado que estén afectadas en AME, implica heterogeneidad en las rutas apoptóticas entre las dos clases de neuronas.

Otras formas de realización

En otras formas de realización, la invención incluye cualquier proteína que sea sustancialmente idéntica a polipéptidos de NAIP de mamífero proporcionados en las Fig. 6 y 7, ID SEC nº 22 y 24; dichos homólogos incluyen otras proteínas NAIP de mamífero sustancialmente naturales, así como variantes alélicas; mutantes naturales; mutantes inducidos; secuencias de ADN que codifican proteínas y también híbridos de las secuencias de ADN de NAIP de las Fig. 6 y 7 (ID SEC nº 21 y 23) bajo condiciones de altas condiciones restrictivas (por ejemplo, lavado a SSC 2X a 40ºC con una longitud de sonda de al menos 40 nucleótidos); y proteínas específicamente unidas por antisueros dirigidas a polipéptido de NAIP. El término también incluye polipéptidos quiméricos que incluyen una parte NAIP. La secuencia de ID SEC nº 1 y las proteínas IAP están excluidas específicamente.

La invención incluye además análogos de cualquier polipéptido de NAIP natural. Los análogos pueden diferir de proteína NAIP natural por diferencias de secuencias de aminoácidos, por modificaciones postraduccionales o por ambas. Los análogos de la invención exhibirán en general al menos el 85%, más preferentemente el 90%, y con la máxima preferencia el 95% o incluso el 99% de identidad con la totalidad o parte de la secuencia de aminoácidos NAIP natural. La longitud de comparación de secuencia es de al menos 15 residuos de aminoácidos, preferentemente al menos 25 residuos de aminoácidos, y más preferentemente más de 35 residuos de aminoácidos. Las modificaciones incluyen derivaciones in vivo e in vitro de polipéptidos, por ejemplo, acetilación, carboxilación, fosforilación o glicosilación; dichas modificaciones pueden ocurrir durante síntesis o procesamiento de polipéptidos o después de tratamiento con enzimas modificadoras aisladas. Los análogos pueden diferir también del polipéptido de NAIP natural en la secuencia primaria. Éstos incluyen variantes genéticas, tanto naturales como inducidas (por ejemplo, resultantes de mutagénesis aleatoria por irradiación o exposición a sulfato de etanometilo o por mutagénesis específica del sitio, según se describe en Sambrook, Fritsch y Manlatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), CSH Press, 1989, o Ausubel y col., supra). También se incluyen péptidos, moléculas y análogos ciclados que contienen residuos distintos de L-aminoácidos como, por ejemplo, D-aminoácidos o aminoácidos sintéticos o de ocurrencia no natural como, por ejemplo, aminoácidos B o y. Además de polipéptidos de longitud completa, la invención incluye también fragmentos de polipéptidos de NAIP. Según se usa en la presente memoria descriptiva, el término "fragmento" significa al menos 20 aminoácidos contiguos, preferentemente al menos 30 aminoácidos contiguos, más preferentemente al menos 50 aminoácidos contiguos, y con la máxima preferencia al menos de 60 a 80 o más aminoácidos contiguos. Los fragmentos de polipéptidos de NAIP pueden generarse por procedimientos conocidos por los expertos en la técnica o pueden obtenerse del procesamiento normal de proteínas (por ejemplo, eliminación de aminoácidos del polipéptido naciente que no se requieren para actividad biológica o eliminación de aminoácidos por empalme de ARNm alternativo o sucesos de procesamiento de proteínas alternativos).

Son fragmentos o análogos preferibles según la invención aquéllos que facilitan la detección específica de un ácido nucleico o secuencia de aminoácidos NAIP en una muestra que ha de someterse a diagnóstico. Los fragmentos de NAIP particularmente útiles incluyen, sin limitación, los fragmentos de aminoácidos mostrados en la Tabla 2.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: UNIVERSIDAD DE OTTAWA

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 650 CUMBERLAND

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: OTTAWA

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: ONTARIO

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: CANADÁ

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): K1N 6N5

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO: (613) 562-5841

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX: (613) 562-5730

\vskip0.500000\baselineskip

(I): TÉLEX: 0533338

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: USO DE PROTEÍNA INHIBIDORA DE LA APOPTOSIS NEURONAL

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 27

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.30 (EPO)

\vskip0.800000\baselineskip

(v): DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 97902522.8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 5.502 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6.133 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 2:

\vskip1.000000\baselineskip

5

6

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGCTTGGAT CTCTAGAATG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCAAAGACA TGTGGCGGAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGCTCCTA GAGAAAGAAG GA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAACTACGGC TGGACTCTTT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTCAGCCT GCTCTTCAGA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGCCTCTG ACGAGAGGAT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGACTGCCTG TTCATCTACG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGTTCTCC AGCCACATAC T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTTGGCAT GTTCCTTCCA AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGATGAAT ACTGATGTTT CATAATT

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCACTGCC AGGCAATCTA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAACAGGAC ACGGTACAGT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGTTTTAA GTCTCGGTGC TCTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAGCCAGAT GTGTTGGCAC ATG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTCTATGT GATAGGCAGC CA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCACTGCTC CCGATGGATT A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCTCAGCT GCTCATTCAG AT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAAAGTTCA CCACGGCTCT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6.124 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 21:

10

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.403 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 22:

13

14

15

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6.228 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 23:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1.403 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 24:

24

25

26

27

28

\newpage

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGAACTGCA CTGTGACAAG CTGC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 22 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CADENA: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

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(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 26:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATAAACAA CGAATTATCT CC

\hfill

22

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(2) INFORMACIÓN PARA ID SEC Nº: 27:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESCRIPCIÓN: /desc = "CEBADOR"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID SEC Nº 27:

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTATAAT CAATAAGTTA TACC

\hfill

24

Claims

1. Un ácido nucleico sustancialmente puro que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico para la secuencia de ácido nucleico de la proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP) de longitud completa de ID SEC nº 21 y que incluye nucleótidos 3.734 a 3.886 (exón 14a) y 4.139 a 4.503 (exón 17) de ID SEC nº 21 o que tiene al menos el 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico para la secuencia de ácidos nucleicos de NAIP de longitud completa de ID SEC nº 23 y que incluye nucleótidos 3.838 a 3.990 de ID SEC nº 23 y nucleótidos 4.243 a 4.605 de ID SEC 23, codificando dichos ácidos nucleicos un polipéptido de NAIP que inhibe la apoptosis.

2. Un ácido nucleico sustancialmente puro según la reivindicación 1 que tiene la secuencia de ID SEC nº 21 o variantes degeneradas de la misma y codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de ID SEC nº 22, en las que dicho polipéptido es capaz de inhibir la apoptosis.

3. El ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en el que dicho ácido nucleico está unido operativamente a una secuencia reguladora para la expresión de dicho polipéptido de NAIP y en el que dicha secuencia reguladora comprende un promotor.

4. El ácido nucleico de la reivindicación 3, en el que dicho promotor es un promotor constitutivo, es inducible por uno o más agentes externos y es específico del tipo celular.

5. Un vector que comprende el ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y es capaz de dirigir la expresión de un polipéptido de NAIP que es capaz de inhibir la apoptosis.

6. Una célula huésped que contiene el vector de la reivindicación 5.

7. Un polipéptido de NAIP de mamífero sustancialmente puro codificado por la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

8. Una composición terapéutica que comprende una cantidad eficaz de un polipéptido de NAIP según la reivindicación 7 en un vehículo fisiológicamente aceptable.

9. Un animal no humano transgénico para una secuencia de ácidos nucleicos de NAIP de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Un procedimiento in vitro para obtener un polipéptido de NAIP, comprendiendo dicho procedimiento:

(a): suministro de una célula con un ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, estando dicho ácido nucleico colocado para la expresión en dicha célula;

(b): cultivo de dicha linfocito Bajo condiciones para expresar dicho ADN; y

(c): aislamiento de dicho polipéptido de NAIP.

11. Un procedimiento in vitro para identificar un ácido nucleico de NAIP en una célula de mamífero, comprendiendo dicho procedimiento:

(a): suministro de un preparado de ADN celular de mamífero de dicha célula;

(b): suministro de una secuencia de ADN marcada de manera detectable que se une específicamente a nucleótidos 3.734 a 3.886 (exón 14a) y 4.139 a 4.503 (exón 17) de ID SEC nº 21 y nucleótidos 3.838 a 3.990 (exón 14a) o nucleótidos 4.243 a 4.605 (exón 17) de ID SEC nº 23;

(c): puesta en contacto de dicho preparado de ADN celular con dicha secuencia de ADN marcada de manera detectable bajo condiciones de hibridación para proporcionar detección de ácidos nucleicos que tienen al menos el 50% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos; e

(d): identificación de un ácido nucleico de NAIP por su asociación con dicha secuencia de ADN marcada de manera detectable.

12. Un procedimiento in vitro de aislamiento de un ácido nucleico de NAIP según se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o parte del mismo, comprendiendo dicho procedimiento la amplificación por PCR de dicho ácido nucleico de NAIP, o parte del mismo, usando cebadores de oligonucleótido en los que dichos cebadores:

(a): son todos mayores de 13 nucleótidos de longitud;

(b): cada uno tiene regiones de complementariedad a cadenas de ADN opuestas que comprenden nucleótidos 3.838 a 3.990 (exón 14a) o nucleótidos 4.243 a 4.605 (exón 17) de ID SEC nº 23; y

(c): opcionalmente contienen secuencias capaces de producir sitios de corte de enzimas de restricción en el producto amplificado;

y aislamiento de dicho ácido nucleico de NAIP o parte del mismo.

13. Un procedimiento in vitro de identificación de un compuesto que modula la apoptosis, comprendiendo dicho procedimiento:

puesta en contacto in vitro de una célula que expresa un polipéptido de NAIP con un compuesto candidato y monitorización de la expresión de un ácido nucleico de NAIP según se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, por detección de una secuencia de ácidos nucleicos que comprende nucleótidos 3.838 a 3.990 de ID SEC nº 23 o nucleótidos 4.243 a 4.605 de ID SEC nº 23, indicando una alteración en el nivel de dicha expresión de dicho ácido nucleico la presencia de un compuesto que modula la apoptosis.

14. Un ácido nucleico de proteína inhibidora de la apoptosis neuronal (NAIP) según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos, para su uso como medicamento.

15. Uso de un ácido nucleico de NAIP según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o un polipéptido codificado por dicha secuencia de ácidos nucleicos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de atrofia muscular espinal, ELA, SIDA, una enfermedad degenerativa, un síndrome mielodisplásico o una lesión isquémica.

16. Una molécula antisentido de NAIP que comprende un ácido nucleico que es complementario a los nucleótidos 3.734 a 3.886 (exón 14a) o a los nucleótidos 4.139 a 4.503 (exón 17) de ID SEC nº 21 o a los nucleótidos 3.838 a 3.990 de ID SEC nº 23 o nucleótidos 4.243 a 4.605 de ID SEC 23.

17. Una molécula antisentido de NAIP según la reivindicación 16 para su uso como medicamento.