PT1889065E

PT1889065E - Métodos para o diagnóstico e tratamento de doenças tendo uma componente autoimune e/ou inflamatória

Info

Publication number: PT1889065E
Application number: PT67706051T
Authority: PT
Inventors: Mohammad Luqman; Sharon Lea Aukerman; Bahija Jallal
Original assignee: Novartis Ag; Xoma Technology Ltd
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2006-05-18
Publication date: 2013-09-27
Also published as: DK1889065T3; PL1889065T3; EP2312315A1; HK1110942A1; US8333970B2; EP1889065A2; HRP20130852T1; JP5421590B2; EP1889065B1; WO2006125117A3; JP2008539791A; AU2006247134B2; CA2608750A1; WO2006125117A2; ES2429564T3; AU2006247134A1; US20080274118A1

Description

DESCRIÇÃO

MÉTODOS PARA O DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE DOENÇAS TENDO UMA COMPONENTE AUTOIMUNE E/OU INFLAMATÓRIA

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se ao campo da medicina de diagnóstico e prognóstico, mais particularmente, a métodos para a determinação da eficácia de agentes terapêuticos no tratamento de doenças que têm uma componente autoimune e/ou inflamatória, que está associado com a sinalização de CD40 aberrante.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Muitos membros da familia de ligandos do factor de necrose tumoral (TNF) e os seus receptores correspondentes regulam o crescimento de células normais por indução de apoptose, ou por aumento da sobrevivência e proliferação das células. É esse equilíbrio entre os sinais de apoptose e a sobrevivência e os sinais de proliferação que mantém a homeostase celular normal. Pelo menos 26 receptores da familia TNF e 18 ligandos da familia TNF foram identificados até à data. As formas biologicamente ativas de ambos os receptores e ligandos são trímeros de proteínas auto reunidas. Foram identificadas transmembranas e formas solúveis de ambos os receptores e ligandos. Embora os domínios intracelulares dos receptores não partilhem nenhuma homologia de sequência, os seus domínios extracelulares compreendem de 40 repetições de aminoácidos ricos em cisteína. A sua cauda citoplasmática assinala por interação com dois grandes grupos de proteínas intracelulares: os factores associados do receptor de TNF (TRAF3) e o domínio de morte (DD) contendo proteínas. A interação entre, pelo menos, seis TRAFs humanos e sítios de 1 ligação de TRAF na cauda citoplasmática de alguns destes receptores inicia várias vias de sinalização, incluindo AKT (a serina/treonina quinase, designada por proteína quinase B ou PKB), factor nuclear KB (NF-kB) e proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK). Ver, por exemplo, a revisão por Younes e Kadin (2003) J. Clin. Oncol. 18:3526-3534. O membro da família do receptor de TNF CD40 é um antigénio de superfície celular 50-55 kDa, presente na superfície de ambas as células B normais e neoplásicas humanas, células dendríticas, monócitos, macrófagos, células T CD8+, células endoteliais, e células monocíticas e epiteliais. O antigénio CD40 também é expresso em células T ativadas, plaquetas ativadas, células do músculo liso vascular inflamado, eosinófilos, membranas sinoviais na artrite reumatoide, fibroblastos dérmicos, e outros tipos de células não linfóides. Dependendo do tipo de células que expressam CD40, a ligação pode induzir a adesão intercelular, a diferenciação, ativação e proliferação. Por exemplo, a ligação de CD40 ao seu ligando cognato, CD40L (também designado por CD154), estimula a proliferação de células B e a diferenciação em células do plasma, a produção de anticorpos, comutação de isótipo, e geração de células B de memória. Durante a diferenciação de células B, o CD40 é expresso em células pré-B, mas perde-se na diferenciação em células plasmáticas. 0 ligando CD40 (CD40L), também conhecido como CD154, é uma proteína de transmembrana 32-33 kDa, que também existe em duas formas solúveis biologicamente ativas menores, 18 kDa e 31 kDa, respectivamente (Graf et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:1749-1754; Mazzei et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:7025-7028; Pietravalle et al. (1996) J. Biol. 2

Chem. 271:5965-5967). 0 CD40L é expresso em células CD4+ T auxiliares ativadas, mas não permanece (Lane, et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2573-2578; Spriggs et al. (1992) J. Exp. Med. Chem. 17 6:1543-1550; e Roy et al.

(1993) J. Immunol. 151:1-14). Tanto o CD40 como o CD40L foram clonados e caracterizados (Stamenkovi et al. (1989) EMBO J. 8:1403-1410; Armitage et al. (1992) Nature 357:80- 82; Lederman et al. (1992) J. Exp. Med. Chem. 175:1091- 1101; e Hollenbaugh et al. (1992) EMBO J. 11:4313-4321). Ver também Patente US 5945513, descrevendo CD40L humano. As células transfectadas com o gene CD40L e expressando a proteina CD40L na sua superfície podem desencadear a proliferação de células B e, juntamente com outros sinais estimuladores, podem induzir a produção de anticorpos (Armitage et al. (1992) supra; e Patente US 5945513).

Pacientes com doenças autoimunes têm niveis séricos elevados de CD40L solúvel (sCD40L) que não são vistos em indivíduos saudáveis. A sobre expressão de CD40L provoca doenças autoimunes semelhantes a lúpus sistémico eritomatoso em modelos de roedores (Higuchi et al. (2002) J. Immunol. 168:9-12). Em contraste, a ausência de CD40L funcional nas células T ativadas provoca a sindrome de hiper-IgM ligado ao X (Allen et al. (1993) Science 259:990; e Korthauer et al. (1993) Nature 361:539).Além disso, o bloqueio da interação CD40/CD40L pode evitar a rejeição do transplante em modelos de primatas não humanos. Ver, por exemplo, Wee et al. (1992) Transplantation 53:501-7. A expressão de CD40 nas APCs desempenha um importante papel co-estimulador na ativação destas células. Por exemplo, os anticorpos monoclonais anti-CD40 agonistas (mAbs) foram mostrados para imitar os efeitos das células T auxiliares na ativação de células B. Quando apresentadas em células 3 aderentes que expressam FcyRII, estes anticorpos induzem a proliferação de células B (Banchereau et al. (1989) Science 251:70). Além disso, os agonistas anti-CD40 mAbs podem substituir o sinal de células T auxiliares para a secreção de IgM, IgG e IgE na presença de IL-4 (Gascan et al. (1991) J. Immunol. 147:8). Além disso, os agonistas anti-CD40 mAbs podem prevenir a morte celular programada (apoptose) de células B isoladas de nódulos linfáticos.

Estas e outras observações suportam a teoria atual que a interação entre CD40 e CD40L desempenha um papel central na regulação das respostas imunitárias tanto humorais como mediadas por células. Estudos mais recentes têm revelado um papel muito mais amplo da interação CD40/CD40L em diversos processos fisiológicos e patológicos. A via de transdução de sinal de CD40 depende da regulação coordenada de muitos factores intracelulares. Como outros membros da familia de receptores de TNF, o CD40 ativa TRAFs, incluindo TRAF-1, TRAF-2, -3, -5 e -6, o que sobre regula diversas vias de sinalização da sequência de acoplamento de CD40 com CD40L (tanto CD40L ligado à membrana ou CD40L solúvel), incluindo quinase extracelular regulada por sinal (ERK), quinase c-jun amino terminal (JNK), p38 MAPK e NF-kB (ver, por exemplo, Younes e Carbone (1999) Int. J. Biol. Markers 14:135-143; van Kooten e Banchereau (2000) J. Leukoc. Biol. 67:2-17). A sinalização através de CD40 demonstrou impedir a morte celular de apoptose (Makus et al. (2002) J. Immunol. 14:973-982). Sinais apoptóticos são necessários para induzir a morte celular programada de uma maneira 4 coordenada. Sinais de morte celular podem incluir estímulos intrínsecos a partir de dentro da célula, tais como a tensão do retículo endoplasmático ou estímulos extrínsecos, tais como a ligação ao receptor de FasL ou TNFa. A via de sinalização é complexa, envolvendo a ativação de caspases, tais como Caspase-3 e Caspase-9 e de poli (ADP ribose) polimerase (PARP). Durante a cascata, as proteínas de sinalização anti-apoptóticas, tais como Mcl-1 e Bcl-x, e os membros da família de proteínas IAP, tais como o inibidor de ligação X de apoptose (XIAP), são sub-reguladas (Budihardjo et al. (1999) Annu. Ver. Cell Dev. Biol. 15:269-290). Por exemplo, em células dendríticas, as células de sinalização CD40 podem bloquear os sinais de apoptose transduzidos por FasL (Bjõrck et al. (1997) Intl. Immunol. 9:365-372).

Assim, o acoplamento de CD40 por CD40L e subsequente ativação de sinalização de CD40 são medidas necessárias para respostas imunes normais, no entanto, a desregulação da sinalização de CD40 pode levar à doença. A via de sinalização de CD40 tem sido mostrada ser envolvida na doença autoimune (Ichikawa et al. (2002) J. Immunol. 169:2781-2787 e Moore et al. (2002) J. Autoimmun. 19:139-145) . Além disso, a interação CD40/CD40L desempenha um papel importante nos processos inflamatórios. Por exemplo, tanto CD40 e CD40L são superexpressos nas lesões ateroscleróticas humanas e experimentais. A estimulação de CD40 induz a expressão de enzimas que degradam a matriz e a expressão do factor tecidual em tipos de células de associadas a ateromas, tais como células endoteliais, células musculares lisas e macrófagos. Além disso, a estimulação de CD40 induz a produção de citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de crescimento endotelial 5 vascular (VEGF) , IL-1, IL-6 e IL-8, e as moléculas de adesão tais como ICAM-1, E-selectina e VCAM. A inibição da interação CD40/CD40L previne a aterogénese em modelos animais. Em modelos de transplante, bloqueando a interação CD40/CD40L previne-se a inflamação. Tem sido demonstrado que os atos de ligação CD40/CD40L sinergicamente com o peptídeo beta-amilóide de Alzheimer promovem a ativação da microglia, levando assim à neurotoxicidade.

Em pacientes com artrite reumatoide (AR), a expressão de CD40 é aumentada em condrócitos articulares, assim, a sinalização de CD40 provavelmente contribui para a produção de citoquinas prejudiciais e metaloproteinases da matriz. Ver, Gotoh et al. (2004) J. Rheumatol. 31:1506-1512. Além disso, demonstrou-se que a amplificação da resposta inflamatória sinovial ocorre através da ativação de MAPKs e NF-kB por meio de ligação de CD40 em células sinoviais CD14+ de pacientes com AR (Harigai et al. (2004) Arthritis. Rheum. 50:2167-2177). Num modelo experimental de AR, o tratamento com anticorpo anti-CD40L impediu a indução da doença, a inflamação das articulações, e a produção de anticorpos anti-colagénio (Durie et al. (1993) Science 261:1328-1330). Finalmente, em ensaios clinicos, tem sido mostrado que o esgotamento de células B CD20+ positivas de pacientes com artrite reumatoide por administração de Rituxan® (geralmente indicado para o linfoma de células B) melhora os sintomas (Shaw et al. (2003) Ann. Rheum. Dis. 62 (Suppl 2): ii55-ii59). O bloqueio de interações CD40/CD40L durante a apresentação antigénio às células T, também tem sido demonstrado que induz a tolerância da célula T. Portanto, o bloqueio da interação CD40/CD40L impede a ativação inicial das células 6 T, bem como induz a tolerância a longo prazo à reexposição ao antigénio.

Dado o importante papel de CD40L mediada por sinalização de CD40 na manutenção de uma imunidade normal, são necessários métodos para identificar indivíduos com uma doença autoimune e/ou inflamatória, que seriam sensíveis a regimes de tratamento tendo como alvo a sinalização de CD40.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção proporciona um método para identificar um sujeito que tem uma doença inflamatória ou doença autoimune que é sensível ao tratamento com um agente terapêutico anti-CD40, o referido método compreendendo: a) proporcionar uma amostra biológica de teste e uma amostra de controlo biológico obtida a partir do referido sujeito, em que a referida amostra de teste a referida amostra de controlo biológico compreende células que expressam CD40, que foram estimuladas com um ligando de CD4 0; b) contactar a referida amostra biológica de teste com uma quantidade eficaz do referido agente terapêutico anti-CD40; c) detecção do nível de pelo menos um bio marcador na referida amostra biológica de teste, em que o referido bio marcador é selecionado de entre o grupo constituído por: (i) um bio marcador da apoptose celular, em que o referido bio marcador da apoptose é selecionado a partir do grupo constituído por uma proteína Caspase clivada, poli ADP-ribose-polimerase clivada (PARP), expressão de superfície 7 celular de fosfotidilserina (PS), fragmentação de ADN genómico, e quaisquer combinações dos mesmos; (ii) um bio marcador de CD40L mediado por via de sinalização de CD40, em que o referido CD40L mediado por via de sinalização de CD40 é selecionado a partir do grupo consistindo por a via de sinalização de AKT, a via de sinalização de NF-kB, e via de sinalização de uma proteina quinase ativada por mitogénio (MAPK), e o dito bio marcador do referido CD40L mediado por via de sinalização de CD40 é selecionado a partir do grupo consistindo em fosfo-PI3K, fosfo-PDKl, fosfo-Akt, fosfo-MEK, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-ΙΚΚα/β, proteina fosfo-IkB e NF-kB ativada; e (iii) um bio marcador da sobrevivência das células, em que o referido bio marcador da sobrevivência celular é selecionado a partir do grupo consistindo numa proteina anti-apoptótica que é um membro da familia Bcl-2, uma proteina inibidora da apoptose IAP e receptor de TNF associado ao factor-1 (TRAF-1); e d) comparação do nivel do referido pelo menos um bio marcador na referida amostra biológica de teste para o nivel do referido pelo menos um bio marcador detectado na referida amostra de controlo biológico, em que a referida amostra de controlo biológico não foi posta em contacto com o referido agente terapêutico anti-CD40, caracterizado por (i) um aumento do nivel de pelo menos um dos referidos bio marcadores de apoptose; e/ou (ii) a redução do nivel de pelo menos um dos referidos bio marcadores de pelo menos um dos referidos CD40L mediado por via de sinalização CD40; e/ou 8 (iii) redução do nível de pelo menos um dos referidos bio marcadores de sobrevivência das células; na referida amostra biológica de teste em relação à referida amostra de controlo biológico é indicativa de um sujeito que beneficiaria do tratamento com o referido agente terapêutico anti-CD40, e em que o referido agente terapêutico anti-CD40 é um anticorpo monoclonal antagonista anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio deste que é capaz de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula B humana, e que é isenta de atividade agonista significativa quando ligada ao antigénio CD40 expresso na superfície da referida célula B.

BREVE SUMÁRIO São fornecidos métodos para a identificação de indivíduos que possuem uma doença inflamatória e/ou doença autoimune que irão beneficiar de agentes terapêuticos anti-CD40 incluindo os que modulam a sinalização mediada por CD40L e/ou modulam a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Tais agentes terapêuticos anti-CD40 incluem, mas não estão limitados a, anticorpos antagonistas anti-CD40, anticorpos antagonistas anti-CD40L, e os agentes farmacológicos que bloqueiam ou interferem com a interação CD40/CD40L, particularmente de CD40L mediada por sinalização CD40, bem como anticorpos antagonistas anti-CD40 que, adicionalmente, ou em alternativa, têm atividade ADCC como modo de ação. Em alguns exemplos, os métodos compreendem a utilização de bio marcadores de apoptose celular, proliferação e sobrevivência celular, e vias de sinalização de CD40 para monitorizar, ex vivo, a resposta celular a um ou mais agentes terapêuticos anti-CD40 de interesse. Estes ensaios prognósticos ex vivo compreendem 9 proporcionar uma amostra biológica de teste e uma amostra biológica de controlo a partir de um sujeito candidato, em que estas amostras biológicas compreendem células que expressam CD40 que foram estimuladas com um ligando CD40, ou in vivo ou ex vivo; contactar a amostra biológica de teste com o agente terapêutico anti-CD40 de interesse; detecção do nível de expressão de pelo menos um bio marcador dentro da amostra biológica de teste; e comparar o nível de expressão do bio marcador (es) com um nível de expressão correspondente detectado na amostra biológica de teste que não tenha sido posta em contacto com o agente terapêutico anti-CD40 de interesse. Bio marcadores para uso nesses ensaios de prognóstico ex vivo incluem proteínas e/ou genes cujos níveis de expressão são indicadores de prognóstico da resposta ao tratamento de intervenção, incluindo os bio marcadores da apoptose celular, bio marcadores de CD40L mediados por vias de sinalização CD40, e bio marcadores de proliferação celular ou de sobrevivência, dependendo do modo de ação do agente terapêutico anti-CD40. Onde o agente terapêutico anti-CD40 tem o seu modo de ação através do rompimento de CD40L mediado por sinalização de CD40, os bio marcadores da apoptose celular, CD40L mediado por vias de sinalização de CD40, e a proliferação celular e sobrevivência podem ser usadas nestes ensaios prognósticos ex vivo. Em alguns exemplos, os marcadores adicionais de CD40L mediados por sinalização de CD40 podem ser ensaiados, incluindo, mas não limitado a, citoquinas que são sobre reguladas através da interação CD40L-CD40, por exemplo, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), interleucina (IL)-6, IL-8, IL- 10, factor de necrose tumoral-α (TNF-a), proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1), e proteína-ΐβ inflamatória de macrófagos (MIP-Ιβ). Onde o agente terapêutico anti-CD40 tem o seu modo de ação através de 10 ADCC, por exemplo, um anticorpo anti-CD40, os bio marcadores da apoptose celular podem ser usados nesses ensaios prognósticos ex vivo.

Em outros exemplos, os indivíduos candidatos são rastreados para o nível de expressão de um ou mais factores de CD40-relacionados que são preditivos de um indivíduo, ou uma subpopulação de indivíduos, que irão beneficiar da intervenção com agentes terapêuticos anti-CD40. Assim, as amostras biológicas recolhidas a partir de sujeitos candidatos, por exemplo, os indivíduos com uma doença compreendendo um componente autoimune e/ou inflamatório, são rastreados para um ou mais factores relacionados com o CD40 selecionados a partir do grupo consistindo no nível de expressão da superfície celular do antigénio CD40 em células de uma amostra biológica, nível de expressão de superfície celular de CD40L nas células de uma amostra biológica, nível circulante de CD40 solúvel (sCD40), e nível circulante de CD40L solúvel (sCD40L). Estes factores relacionados com CD40 podem ser indicadores de prognóstico da doença, e podem ainda ser utilizados para identificar indivíduos que irão ou não responder à intervenção terapêutica com agentes terapêuticos anti-CD40, independentemente do modo de ação do agente terapêutico anti-CD40. Um nível elevado de expressão de um ou mais destes factores CD40 relacionados dentro de uma amostra biológica quando comparado com um controlo ou padrão de referência seria indicativo de um indivíduo que beneficiaria da intervenção terapêutica com um agente terapêutico anti-CD40 que modula CD40L mediado por sinalização de CD40, modula ADCC, ou ambos. Sujeitos candidatos identificados com este processo de rastreio podem ser tratados com um agente terapêutico anti-CD40 de 11 interesse, ou podem ainda ser rastreados para a capacidade de resposta a agentes terapêuticos anti-CD40 utilizando os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos.

Ainda noutros exemplos, os sujeitos candidatos são rastreados quanto à presença ou ausência de um ou mais marcadores de prognóstico clinicamente úteis para a definição de subpopulações de indivíduos candidatos que têm um prognóstico pobre com outras classes de terapêuticas, mas que irão beneficiar da intervenção com agentes terapêuticos anti-CD40. Deste modo, as amostras biológicas recolhidas a partir de sujeitos candidatos são rastreadas para um ou mais marcadores de prognóstico clinicamente úteis que se sabe ser indicadores de mau prognóstico com as terapias atuais, cujo modo de ação não é a via CD40 ou CD40L mediado por sinalização de CD40. Qualquer marcador de prognóstico clinicamente útil para uma dada doença autoimune ou inflamatória pode ser incluído no processo de rastreio. Indivíduos candidatos dentro de uma subpopulação identificados com este processo de rastreio podem ser adicionalmente rastreados para a capacidade de resposta a agentes terapêuticos anti-CD40 utilizando os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos.

Também são aqui divulgados métodos para a monitorização da eficácia de um agente terapêutico anti-CD40 no tratamento de um sujeito que tenha uma doença inflamatória ou doença autoimune. Desta forma, um sujeito sob terapia com um agente terapêutico anti-CD40, que pode ou não ter sido previamente rastreado utilizando um ensaio de prognóstico ex vivo aqui revelado, é monitorizado para alterações na expressão in vivo de pelo menos um bio marcador de apoptose celular, proliferação e sobrevivência celular, e/ou um ou 12 mais CD40L mediado por vias de sinalização de CD40 a seguir ao tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. Os bio marcadores particulares a serem ensaiados podem ser escolhidos com base no modo de ação do agente terapêutico tal como referido acima. Alternativamente, ou adicionalmente, o sujeito pode ser monitorizado para as mudanças in vivo no nivel de expressão de um ou mais factores relacionados com o CD40 selecionados a partir do grupo consistindo em superfície celular do antigénio CD40 em células, superfície celular CD40L em células, nível circulante de sCD40, e nível circulante de sCD40L seguinte ao tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. Deste modo, uma primeira amostra biológica é obtida a partir do sujeito e analisada para o nível de expressão de um ou mais destes bio marcadores e/ou factores relacionados com o CD40 para obter um nível de expressão da linha de base para cada um dos factores testados e, em seguida, uma ou mais amostras biológicas subsequentes é obtida a partir do sujeito e analisada para o mesmo bio marcador (es) e/ou factor (es) relacionado de CD40, onde a amostra biológica subsequente é obtida após a administração de pelo menos uma dose do agente terapêutico anti-CD40 de interesse. 0 controlo pode ocorrer num único ponto no tempo, ou em vários pontos no tempo, para determinar a eficácia de um determinado protocolo de tratamento em que o agente terapêutico anti-CD40 é administrado ao sujeito. Dependendo do bio marcador a ser ensaiado, uma diminuição ou aumento do nível de expressão do bio marcador entre quaisquer dois pontos de tempo pode ser indicativo de eficácia do agente terapêutico anti-CD40 no tratamento da doença inflamatória ou doença autoimune. Sempre que um controlo revela uma diminuição no nível de expressão de um ou mais dos factores relacionados com o CD40, tal resultado pode ser um 13 indicativo da eficácia do agente terapêutico anti-CD40 no tratamento da doença inflamatória ou doença autoimune. 0 nivel de expressão destes diversos bio marcadores e factores relacionados com o CD40, e quaisquer marcadores de prognóstico clinicamente úteis numa amostra biológica pode ser detectado ao nivel da proteina ou do ácido nucleico, utilizando-se, por exemplo, técnicas de imuno-histoquimica ou técnicas à base de ácidos nucleicos tal como hibridação in situ e RT-PCR. Em algumas concretizações, um nivel elevado ou um aumento da expressão de pelo menos um bio marcador é indicativa de uma resposta positiva ao tratamento terapêutico, com um agente terapêutico anti-CD40. Em outras formas de realização, um nível diminuído ou uma diminuição na expressão de pelo menos um bio marcador é indicativa de uma resposta positiva ao tratamento terapêutico com o agente terapêutico anti-CD40.

Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para identificar indivíduos para os quais a intervenção terapêutica anti-CD40 seria benéfica na prevenção, melhoria ou tratamento de doenças que compreendem uma componente autoimune e/ou inflamatória, incluindo mas não se limitando a, doenças autoimunes e inflamatórias, tais como lúpus eritematoso sistémico (LES), lúpus discóide, nefrite lúpica, sarcoidose, artrite inflamatória, incluindo, mas não limitado a, artrite juvenil, artrite reumatoide, artrite psoriática, síndrome de Reiter, espondilite anquilosante e artrite gotosa, rejeição de um órgão ou tecido transplantado, rejeição hiperaguda, aguda ou crónica e/ou doença do enxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, síndrome hiper IgE, poliarterite nodosa, cirrose biliar primária, doença inflamatória do intestino, doença 14 de Crohn, doença de celíaca (enteropatia sensível ao glúten), hepatite autoimune, anemia perniciosa, anemia hemolítica autoimune, psoríase, esclerodermia, miastenia gravis, púrpura trombocitopênica autoimune, tireoidite autoimune, doença de Graves, tireoidite de Hasimoto, doença do complexo imune, síndrome de disfunção imunológica da fadiga crónica (CFIDS), polimiosite e dermatomiosite, crioglobulinemia, trombólise, cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose intersticial pulmonar, sarcoidose, diabetes mellitus tipo I e tipo II, hipersensibilidade tardia tipo 1, 2, 3 e 4, alergia ou doenças alérgicas, respostas imunes proteínas terapêuticas indesejadas/não intencionais, asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatose alérgica), dermatite atópica, dermatite de contacto alérgica e irritante, urticária, alergia mediada por IgE, aterosclerose, vasculite, miopatias inflamatórias idiopáticas, doença hemolítica, doença de Alzheimer, polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, e afins.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra que a sinalização e sobrevivência das células B humanas normais são induzidas por CD40L e bloqueadas por CHIR-12.12.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente divulgação é dirigida a métodos para a identificação de indivíduos que possuem uma doença inflamatória ou doença autoimune que beneficiariam do tratamento com agentes terapêuticos anti-CD40 que alvejam o receptor CD40 e que modulam o ADCC, interferem com a sinalização de CD40, CD40, particularmente com as vias de 15 sinalização que são mediadas pela interação de CD40 com o ligando CD40 (CD40L), ou ambos. Num exemplo, os métodos compreendem a utilização de ensaios de prognóstico ex vivo, para monitorizar os efeitos de agentes terapêuticos antagonistas anti-CD40, que bloqueiam ou interferem com o CD40L mediado por sinalização de CD40 sobre o nivel de expressão de três classes de bio marcadores que estão associados com CD40L mediado por sinalização de CD40, particularmente bio marcadores de proliferação celular ou sobrevivência e vias apoptóticas celulares e bio marcadores de chave CD40L mediados por vias de sinalização de CD40, incluindo AKT, NF-kB e vias de sinalização da proteina quinase ativada por mitógeno (MAPK). Outros marcadores que podem servir para controlar os efeitos de agentes

terapêuticos antagonistas anti-CD40 que bloqueiam ou interferem com CD40 mediado por sinalização de CD40L incluem citocinas que são sobre reguladas através de CD40L mediado por sinalização de CD40, tal como referido abaixo. Os bio marcadores e vias apoptóticas celulares, também podem servir para controlar os efeitos dos agentes terapêuticos anti-CD40 que modulam ADCC, por exemplo, os anticorpos anti-CD40 que têm ADCC como modo de ação. Os agentes terapêuticos que atuam como antagonistas de sinalização de CD40, aqui referidos como "antagonistas CD40", podem interferir com um ou mais dos sinais de sinalização normalmente desencadeados pela ligação do CD40L ao receptor CD40. Os ensaios de prognóstico ex vivo podem ser usados para discriminar entre os sujeitos que beneficiariam com a intervenção com antagonistas CD40 e agentes terapêuticos que têm como alvo CD40 e modulam ADCC e aqueles para os quais a intervenção com estes tipos de agentes terapêuticos não seria benéfica. Sujeitos candidatos podem adicionalmente, ou alternativamente, ser pesquisados quanto à presença ou ausência de, ou niveis 16 elevados ou diminuídos, de um ou mais factores relacionados com o CD40 e/ou um ou mais marcadores de prognóstico clinicamente úteis para definir indivíduos candidatos ou subpopulações de indivíduos que beneficiariam da intervenção terapêutica com agentes terapêuticos anti-CD40 que modulam CD40L mediado por sinalização de CD40 e/ou ADCC. Os sujeitos identificadas nestes métodos de rastreio podem ser adicionalmente rastreados utilizando os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos. Os bio marcadores e os factores relacionados com o CD40 aqui descritos também encontram utilização na monitorização da eficácia do tratamento com os agentes terapêuticos anti-CD40 que modulam a sinalização de CD40 e/ou ADCC, e em determinar a base para a capacidade de resposta de fármacos em pacientes individuais ou subpopulações de pacientes com uma doença inflamatória ou doença autoimune.

Por "antigénio CD40", "superfície celular do antigénio CD40", "receptor CD40", ou "CD40" entende-se uma glicoproteína transmembranar que pertence à família do receptor do factor de necrose tumoral (TNF), (ver, por exemplo, Patentes US 5674492 e 4708871; Stamenkovic et al. (1989) EMBO 8:1403; Clark (1990) Tissue Antigens 36:33; Barclay et al. (1997) The Leucocyte Antigen Facts Book (2d ed; . Academic Press, San Diego)) . Têm sido identificadas duas isoformas de CD40 humano, codificadas por variantes de transcritos de splicing alternativos deste gene. A primeira isoforma (também conhecida como "isoforma longa" ou "isoforma 1") é expressa como polipeptídeo precursor de aminoácidos 277 (SEQ ID n°: 12 (reportada pela primeira vez como número de acesso GenBank CAA43045, e identificada como isoforma 1 com o número de acesso GenBank NP_001241), codificado pela SEQ ID n°: 11 (ver números de acesso 17

GenBank X60592 e NM_001250)), que tem uma sequência de sinal representada pelos primeiros 19 resíduos. A sequnda isoforma (também conhecido como "isoforma curta" ou "isoforma 2") é expressa como o polipeptídeo precursor de aminoácidos 203 (SEQ ID n°: 10 (número de acesso GenBank

NP 690593), codificado pela SEQ ID n°: 9 (número de acesso GenBank NM_152854)), que tem também uma sequência de sinal representada pelos primeiros 19 resíduos. Os polipeptideos precursores destas duas isoformas do CD40 humano partilham em comum os seus primeiros 165 resíduos (isto é, os resíduos 1-165 da SEQ ID n° 10 e SEQ ID n° : 12) . O polipeptídeo precursor da isoforma curta (mostrada na SEQ ID n°: 10) é codificado por uma variante de transcrito (SEQ ID n°: 9) que não possui um segmento codificante, o que leva a uma mudança de estrutura de tradução; a isoforma resultante de CD40 contém um menor e distinto terminal C (resíduos 166-203 da SEQ ID n°: 10), a partir da contida na isoforma longa de CD40 (terminal C mostrado nos resíduos 166-277 da SEQ ID n° 12) . Para os fins da presente invenção, o termo "antigénio CD40", " superfície da célula do antigénio CD40", "receptor CD40", ou "CD40" engloba tanto as isoformas curta e longa de CD40. O antigénio CD40 é exibido na superfície de uma variedade de tipos de células, tal como aqui descrito. Por "exibido na superfície" e "expresso na superfície" entende-se que a totalidade ou uma porção do antigénio CD40 é exposto no exterior da célula. O antigénio CD40 apresentado ou expresso pode ser total ou parcialmente glicosilado.

Por "atividade agonista" entende-se as funções da substância como um agonista. Um agonista combina-se com um receptor numa célula e inicia uma reação ou atividade que é 18 similar ou idêntica à iniciada pelo ligando natural do receptor. Por exemplo, um agonista de CD40 induz qualquer uma, ou todas, mas não se limitando a, as seguintes reações: proliferação de células e/ou diferenciação; sobre regulação ou adesão intercelular por via de tais moléculas como ICAM-1, E-selectina, VCAM, e análogos; secreção de citocinas pró-inflamatórias, tais como VEGF, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF, e semelhantes; transdução de sinal através do receptor CD40 por essas vias como TRAF (por exemplo, TRAF-1, TRAF2, TRAF3), quinases MAP como NIK (quinase induzida por NF-kB) , quinases I-kappa B (IKK α/β) , fator de transcrição NF-kB, Ras e a via MEK/ERK, via PI3K/AKT, via de P38 MAPK, e semelhantes; transdução de um sinal anti-apoptótico de tais moléculas como XIAP, Mcl-1, Bcl-x, e semelhantes; geração de células memória B e/ou T; produção de anticorpos de células B; comutação de célula B do isótipo, sobre regulação da expressão da superfície celular de MHC da Classe II e CD80/86, e semelhantes.

Por "atividade antagonista" entende-se as funções da substância como um antagonista. Por exemplo, um antagonista de CD40 evita ou reduz a indução de qualquer das respostas induzidas pela ligação do receptor CD40 a um ligando agonista, particularmente CD40L. 0 antagonista pode reduzir a indução de qualquer uma ou mais das seguintes respostas à ligação por agonista de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, de preferência 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, mais preferencialmente 70%, 80%, 85%, e mais preferencialmente 90%, 95%, 99%, ou 100%. Métodos para medir a especificidade de ligação ao ligando de CD40 e a atividade antagonista de um agente terapêutico anti-CD40, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 são conhecidos dos peritos na técnica e incluem, mas não estão limitados a, ensaios 19 padrão de ligação competitiva, ensaios de controlo da secreção de imunoglobulina pelas células B, ensaios de proliferação de células B, ensaios de proliferação de células Banchereau-Like-B, ensaios de células T auxiliares para a produção de anticorpos, ensaios de co-estimulação de proliferação de células B, e ensaios para a sobre regulação da ativação de marcadores de células B. Ver, por exemplo, tais ensaios divulgados nas WO 00/75348 e Patente US 6087329. Ver também, Pedido de Patente Internacional PCT/US2004/037152 (Processo n° P20107.004 (035784/282916)), também intitulado "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use", apresentado em 4 de Novembro de 2004, e publicado como WO 2005/044854.

Por atividade agonista "significativa" entende-se uma atividade agonista de pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% maior do que a atividade agonista induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo, como medido num ensaio de uma resposta das células B. Preferencialmente, a atividade agonista "significativa" é uma atividade agonista que é pelo menos 2 vezes maior, ou pelo menos 3 vezes maior do que a atividade agonista induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo, como medido num ensaio de uma resposta das células B. Assim, por exemplo, em que a resposta de células B de interesse é a proliferação de células B, a atividade agonista "significativa" seria a indução de um nivel de proliferação de células B que é pelo menos 2 vezes superior ou pelo menos 3 vezes maior do que o nivel de proliferação de células B induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo. Num exemplo, uma imunoglobulina não especifica, por exemplo IgGl, que não se liga ao CD40 serve como controlo negativo. Uma substância 20 exibiria uma "isenta de atividade agonista significativa" atividade agonista de não mais do que cerca de 25% maior do que a atividade agonista induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo, preferencialmente não mais do que cerca de 20% maior, 15% maior, 10% maior, 5% maior, 1% maior, 0,5% maior, ou até mesmo não mais do que cerca de 0,1% maior do que a atividade agonista induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo, como medido num bio ensaio tal como um ensaio de resposta das células B.

Em algumas formas de realização da invenção, o agente terapêutico anti-CD40 é um anticorpo antagonista anti-CD40. Tais anticorpos são livres de atividade agonista significativa, como mencionado acima, quando ligados a um antigénio CD40 numa célula humana. Numa forma de realização da invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40 é isento de atividade agonista significativa numa resposta celular. Numa outra forma de realização da invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40 é isento de atividade agonista significativa em ensaios de mais do que uma resposta celular (por exemplo, proliferação e diferenciação, ou proliferação, diferenciação, e, para as células B, produção de anticorpos). Em alguns exemplos da invenção, o agente terapêutico anti-CD40 de interesse é o anticorpo monoclonal totalmente humano CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, ou um fragmento de ligação ao antigénio dos mesmos, como aqui referido abaixo.

Qualquer um dos ensaios conhecidos na técnica podem ser utilizados para determinar se um agente terapêutico anti-CD40 funciona como um antagonista de um ou mais respostas das células B. Em alguns exemplos, o agente terapêutico é um anticorpo anti-CD40, que atua como um antagonista de 21 pelo menos uma resposta de células B selecionada de entre o grupo constituído por proliferação de células B, diferenciação de células B, produção de anticorpos, adesão intercelular, geração de células B de memória, comutação de isótipo, sobre regulação da expressão na superfície celular de MHC de Classe II e CD80/86, e secreção de citoquinas pró-inflamatórias, tais como VEGF, IL-8, IL-12 e TNF. De particular interesse são os antagonistas de anticorpos anti-CD40, isentos de atividade agonista significativa em relação à proliferação de células B, quando ligados ao antigénio CD40 humano à superfície de uma célula B humana.

Num exemplo, o anticorpo anti-CD40 é um antagonista da proliferação de células B, tal como medido num ensaio de proliferação de células B, tal como o descrito no Exemplo 4 abaixo, e o anticorpo antagonista anti-CD40 estimula a proliferação de células B a num nível que não é mais do que cerca de 25% maior do que a proliferação de células B induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo, preferencialmente não mais do que cerca de 20% maior, 15% maior, 10% maior, 5% maior , 1% maior, 0 ; J o maior, ou até mesmo não mais do que cerca de 0, 1 2 _L t) maior que a proliferação de células B induzida por uma substância neutra ou um controlo negativo.

Em outro exemplo, o anticorpo anti-CD40 é um antagonista da proliferação de células B que é induzida por um outro anticorpo anti-CD40, por exemplo, o anticorpo S2C6 anti-CD40, tal como medido num ensaio de proliferação de células B, tal como o descrito no Exemplo 4 abaixo, e o nível de proliferação de células B estimuladas por outro anticorpo anti-CD40, na presença do anticorpo antagonista anti-CD40, não é mais do que cerca de 25% da proliferação de células B 22 induzida pelo outro anticorpo anti-CD40 na ausência do anticorpo antagonista anti-CD40 (isto é, pelo menos 75% de inibição) , de preferência não mais do que cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou até mesmo não mais do que cerca de 0,1% da proliferação de células B induzida pelo outro anticorpo anti-CD40, na ausência do anticorpo antagonista anti-CD40.

Em ainda outro exemplo, o anticorpo anti-CD40 é um antagonista da proliferação de células B, que é induzido pela linha de células EL4B5 tal como medido no ensaio de ativação da célula B descrito no Exemplo 4 abaixo, e o nivel de proliferação de células B estimulado pela linha de células EL4B5 na presença do anticorpo antagonista anti-CD40 não é mais do que cerca de 25% da proliferação de células B induzida por esta linha celular na ausência do antagonista de anticorpo anti-CD40 (isto é, pelo menos 75% de inibição) , preferencialmente não mais do que cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou até mesmo não mais do que cerca de 0,1% da proliferação de células B induzida por esta linha celular na ausência do anticorpo antagonista anti-CD40.

Em ainda outros exemplos, o anticorpo anti-CD40 é um antagonista da produção de anticorpos de célula T humana induzida por células B humanas, tal como medido no ensaio de células T auxiliares humanas para a produção de anticorpos pelas células B descrita no Exemplo 4 abaixo. Desta maneira, o nivel de produção de anticorpos IgG, a produção de anticorpos IgM ou a produção de ambos os anticorpos IgM e IgG pelas células B estimuladas por células T na presença do anticorpo antagonista anti-CD40, não é mais do que cerca de 50% da respectiva produção de 23 anticorpo por células B estimuladas por células T na ausência do anticorpo antagonista anti-CD40 (isto é, pelo menos 75% de inibição) , de preferência não mais do que cerca de 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou até mesmo não mais do que cerca de 0,1% da respectiva produção de anticorpos por células B estimuladas por células T na ausência do anticorpo antagonista anti-CD40.

Por "CD40" entende-se qualquer péptido, polipeptideo ou proteina que pode ligar-se e ativar uma ou mais vias de sinalização CD40. Assim, "ligandos de CD40" incluem, mas não estão limitados a, todo o comprimento do ligando de proteínas CD40 e variantes e seus fragmentos que retêm uma atividade suficiente para realizar a função de ligação e estimulam a sinalização de CD40 em células que expressam CD40. As modificações de um ligando CD40 nativo, por exemplo, um ligando CD40 humano (CD40L, também conhecido como CD154), incluem, mas não estão limitadas a, substituições, deleções, truncagens, extensões, proteínas de fusão, fragmentos, peptidomiméticos, e semelhantes. Em algumas formas de realização da invenção, os ensaios de prognósticos ex vivo incluem a utilização de CD40L solúvel, por exemplo, CD40L solúvel humano recombinante (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, Reino Unido) para estimular a sinalização de CD40 nas células que expressam o CD40 de uma amostra biológica.

Por " CD40L mediado por sinalização de CD40" entende-se qualquer das atividades biológicas que resultam da interação do receptor de superfície celular CD40, com um ligando CD40. Exemplos de sinalização de CD40 são sinais que conduzem à proliferação e sobrevivência de células que expressam CD40, e estimulam uma ou mais vias de sinalização 24 de CD40 dentro de células que expressam CD40. Uma "via de sinalização de" CD40 ou "via de transdução de sinal" pretende significar, pelo menos, uma reação bioquímica, ou um grupo de reações bioquímicas, que resultam da interação do receptor de CD40, com um ligando de CD40, por exemplo, CD40L, e que gera um sinal de que, quando transmitido através da via de sinal, conduz à ativação de uma ou mais moléculas a jusante na cascata de sinalização. Vias de transdução de sinal envolvem uma série de moléculas de transdução de sinal que levam à transmissão de um sinal a partir da superfície da célula do receptor CD40 através da membrana plasmática de uma célula, e através de uma ou mais de uma série de moléculas de transdução de sinal, através do citoplasma da celular e, em alguns casos, para o núcleo da célula. De particular interesse para a presente invenção são as vias de transdução de sinal de CD40, incluindo a via de sinalização AKT, que leva à ativação de AKT, e, finalmente, à ativação de NF-KB através da via de sinalização de NF-kB; e as vias de sinalização da proteína quinase ativada por mitogénio (MAPK), incluindo a via de sinalização de MEK/ERK e a via de sinalização de MEK/p38, que levam à ativação da ERK e p38, respectivamente. 0 equilíbrio entre a ativação e bloqueio destas vias de sinalização favorece ou a sobrevivência celular ou a apoptose como descrito a seguir.

Os métodos da presente invenção são dirigidos para os ensaios de prognóstico ex vivo, e ensaios de prognóstico que utilizam anticorpos, quer num passo de detecção, ou como agentes terapêuticos candidatos anti-CD40, que estão a ser testados nestes ensaios de prognóstico ex vivo. Os seguintes termos e definições aplicam-se a esses anticorpos. 25 "Anticorpos" e "imunoglobulinas" (Ig) são glicoproteínas possuindo as mesmas caracteristicas estruturais. Os termos são usados como sinónimos. Em alguns casos, a especificidade para o antigénio da imunoglobulina pode ser conhecida. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais lato e abrange anticorpos completamente unidos, fragmentos de anticorpos que se podem ligar a um antigénio (por exemplo, Fab, F(ab')2/ Fv, anticorpos de cadeia simples, diacorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos hibridos, anticorpos biespecificos, anticorpos humanizados, e afins), e os péptidos recombinantes compreendendo o exposto acima.

Os termos "anticorpos monoclonais" e "mAb", tal como aqui utilizados referem-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possiveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. "Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas" são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150,000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfureto covalente, enquanto o número de ligações dissulfureto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isótipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes intracadeias de dissulfureto regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem numa extremidade um 26 domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (VL) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve está alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Resíduos de aminoácido particulares são acreditados formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada. 0 termo "variável" refere-se ao facto de certas porções dos domínios variáveis diferirem extensivamente em sequência entre os anticorpos. As regiões variáveis conferem especificidade de ligação de antígeno. No entanto, a variabilidade não está uniformemente distribuída ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrada em três segmentos chamados regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são unicelulares nas regiões de estrutura (FR) . Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativas compreendem cada um quatro regiões FR, que adoptam largamente uma configuração de folha β-plissada, ligadas por três CDR, que forma laços conectando e, em alguns casos, fazendo parte, da estrutura de folhas β-plissadas. As CDR em cada cadeia são mantidas juntas em estreita proximidade pelas regiões FR e, com as CDR da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação ao antigénio dos anticorpos (ver, Kabat et al. (1991) NIH Publ. N° 91-3 242, vol. I, páginas 647-669). Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antigénio, mas exibem várias funções efectoras, tais 27 como a ligação do receptor Fc, a participação do anticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpos, a iniciação da citotoxicidade dependente do complemento, e a desgranulação dos mastócitos. 0 termo "região hipervariável", quando aqui utilizado, refere-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação ao antigénio. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade" ou "CDR" (isto é, resíduos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (Hl), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada; Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD) e/ou aqueles resíduos de um "laço hipervariável" (isto é, resíduos 26-32 (Ll), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável de cadeia leve e (Hl), 53 -55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Clothia e Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196:901-917). "Estrutura" ou "Resíduos FR" são aqueles resíduos do domínio variável que não os resíduos da região hipervariável, tal como é aqui considerado. "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente a ligação ao antigénio ou a região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab, F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares (Zapata et al. (1995) Protein Eng. 10:1057-1062; moléculas de anticorpo de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. A digestão de anticorpos com papaína produz dois fragmentos idênticos 28 de ligação ao antigénio, denominados fragmentos "Fab", cada um com um único sitio de ligação ao antigénio, e um fragmento residual "Fc", cujo nome reflete a sua capacidade para cristalizar facilmente. 0 tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de combinação com o antigénio e é ainda capaz de ligação cruzada ao antigénio. "Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um reconhecimento completo do antigénio e sítio de ligação. Esta região consiste num dímero de um domínio variável de cadeia pesada e um de cadeia leve em firme associação não-covalente. É nesta configuração que as três CDR de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antigénio sobre a superfície do dímero VH-VL. Colectivamente, as seis CDR conferem especificidade de ligação do antigénio ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDR específicas para um antigénio) tem a capacidade de reconhecer e ligar o antigénio, embora com uma menor afinidade do que sítio de ligação completo. 0 fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduos no terminal carboxi do domínio da cadeia pesada CH1, incluindo um ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo. Fab'-SH é a designação aqui para o Fab' no qual o resíduo de cisteína (s) dos domínios constantes suportam um grupo tiol livre. Fragmentos Fab' são produzidos por redução dos fragmentos F (ab')2 de ponte de dissulfureto da cadeia pesada. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos. 29

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de quaisquer espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa (k) e lambda (λ), com base nas sequências de aminoácidos dos seus dominios constantes.

Dependendo da sequência de aminoácidos do dominio constante das suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser atribuídas a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados alfa, delta, épsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Isótipos diferentes têm diferentes funções efetoras. Por exemplo, os isótipos IgGl e IgG3 humanos têm atividade ADCC (anticorpo dependente da citotoxicidade mediada pela célula). A palavra "marcador" quando aqui utilizada refere-se a um composto ou composição que é conjugada direta ou indiretamente com o anticorpo de modo a gerar um anticorpo "marcado" detectável. 0 marcador pode ser detectável por si próprio (por exemplo, etiquetas de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto de substrato ou composição que é detectável. 30

Uma "célula hospedeira", tal como é aqui utilizado, refere-se a um microrganismo ou uma célula eucariótica ou linha de células cultivadas como uma entidade unicelular que pode ser ou ter sido, usada como um receptor para um vector recombinante ou outros polinucleótideos de transferência e incluem a descendência da célula original que foi transfectada. Entende-se que a descendência de uma célula única pode não ser necessariamente completamente idêntica em morfologia ou em ADN genómico ou de complemento total de ADN, como o progenitor original devido à mutação natural, acidental, ou deliberada. "Células efectoras Humanos" são os leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efectoras. Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam a função efectora da citoxicidade mediada por células (ADCC), dependente de antigénio. Exemplos de leucócitos humanos que medeiam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, macrófagos, eosinófilos e neutrófilos, com células PBMC e NK sendo preferidas. Anticorpos que possuem atividade ADCC são tipicamente do isótipo IgGl ou IgG3. Note-se que para além de isolar anticorpos IgGl e IgG3, tais anticorpos que medeiam ADCC podem ser feitos através de manipulação de uma região variável de um anticorpo não-ADCC, ou fragmento da região variável de uma região constante do isótipo IgGl ou IgG3 .

Os termos "receptor de Fc" ou "FcR" são utilizados para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. 0 FcR preferido é um FcR humano de sequência nativa. Além disso, um FcR preferido é um que se liga a um 31 anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e formas de splicing alternativo destes receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor ativador") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácidos semelhantes que diferem primariamente nos dominios citoplasmáticos dos mesmos. 0 receptor ativador FcyRIIA contém um motivo de ativação imunorreceptor à base de tirosina (ITAM) no seu dominio citoplasmático. 0 receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição imunorreceptor baseado em tirosina (ITIM) no seu dominio citoplasmático (ver Daeron (1997) Annu. Rev. Immunol. 15:203-234). FcRs são revistos em Ravetch e Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492; Capei et al. (1994) Immunomethods 4:25-34; e de Haas et al. (1995) J. Lab. Clin. Med. Chem. 126:330-341. Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR". O termo inclui também o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgG materna para o feto (Guyer et al. (1976) J. Immunol. 117:587 e Kim et al. (1994) J.

Immunol. 24:249). Há um certo número de maneiras de fazer anticorpos humanos. Por exemplo, as células secretoras podem ser imortalizadas por infecção com o virus de Epstein-Barr (EBV). Contudo, as células infectadas com EBV são dificeis de clonar e produzem habitualmente apenas rendimentos relativamente baixos de imunoglobulina (James e Bell (1987) J. Immunol. Methods 100:5-40). No futuro, a imortalização de células B humanas pode ser obtido através da introdução de uma combinação definida de genes de transformação. Tal possibilidade é realçada por uma recente demonstração de 32 que a expressão da subunidade catalítica da telomerase, juntamente com a grande oncoproteína SV40 e um alelo oncogénico de H-ras resultou na conversão tumorigénico de células epiteliais humanas normais e de fibroblastos (Hahn et al. (1999) Nature 400:464-468). É agora possível produzir animais transgénicos (por exemplo, ratinhos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena (Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258; Lonberg e Huszar (1995) Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Fishwild et al. (1996) Nat. Biotechnol. 14:845-851; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15:146-156; Green (1999) J. Immunol. Methods 231:11-23; Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:722-727; revisto em Little et al. (2000) Immunol. Today 21:364-370). Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica da região de união de cadeia pesada do anticorpo (gene JH) em ratinhos mutantes quiméricos e de linha germinal resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos (Jakobovits et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:2551-2555). A transferência da matriz da linha germinal do gene da imunoglobulina germinal humana em tais ratinhos mutantes resulta na produção de anticorpos humanos após desafio com antigénio (Jakobovits et al. (1993) Nature 362:255-258). Mendez et al. (1997) (Nature Genetics 15:146-156) geraram uma linha de ratinhos transgénicos que, quando estimulada com um antigénio, gera anticorpos totalmente humanos de elevada afinidade. Isto foi conseguido através da integração da linha germinal de megabase humana de cadeia pesada e de cadeia leve loci em ratos com supressão no segmento JH endógeno, tal como descrito acima. Estes ratos (tecnologia XenoMouse® II (Abgenix; Fremont, Califórnia)) abrigam 1020 kb de lócus da cadeia pesada humana contendo aproximadamente 66 genes VH, regiões 33 completas DH e JH, e três regiões constantes diferentes, e também abriga 800 kb de lócus humano κ contendo 32 genes VK, segmentos JK e genes Ck. Os anticorpos produzidos nesses ratos assemelham-se aos observados em seres humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo de gene, montagem e repertório. Os anticorpos humanos são expressos preferencialmente sobre anticorpos endógenos devido à deleção no segmento endógeno que evita o rearranjo de genes no locus murino. Tais ratinhos podem ser imunizados com um antigénio de interesse particular.

Os soros de tais animais imunizados podem ser rastreados quanto à reatividade de anticorpos contra o antigénio inicial. Os linfócitos podem ser isolados a partir de células de nódulos linfáticos ou do baço e podem ainda ser selecionados para as células B por seleção de células CD138 negativas e CD19 positivas. Num aspecto, tais culturas de células B (CBCs) podem ser fundidas com células de mieloma para gerar hibridomas, como detalhado acima.

Num outro aspecto, tais culturas de células B podem ser rastreadas para mais reatividade contra o antigénio inicial, de preferência. Tal rastreio inclui um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), com a proteina/antigénio alvo, num ensaio de competição com anticorpos conhecidos que se ligam ao antigénio de

interesse, e a ligação in vitro a células CHO transitoriamente transfectadas ou outras que expressam o antigénio alvo. 34 fatores

Bio marcadores, marcadores de citocinas, relacionadas com CD40 e marcadores de prognóstico clinicamente úteis para uso nos ensaios de prognóstico da

Em algumas formas de realização, os métodos da presente invenção compreendem a utilização de ensaios de prognóstico ex vivo, para monitorizar as alterações no nivel de expressão de um ou mais bio marcadores da sobrevivência celular, proliferação, apoptose e vias de sinalização CD40. Os ensaios de prognóstico ex vivo podem ser utilizados sozinhos, ou em combinação com outros ensaios de prognóstico, por exemplo, ensaios de prognósticos que identificam indivíduos candidatos que têm uma doença inflamatória ou doença autoimune que seria sensível ao tratamento com agentes terapêuticos anti-CD40, com base na expressão de outros factores relacionados com o CD40 e/ou com base na presença ou ausência de, ou uma expressão elevada ou reduzida de, outros marcadores de prognóstico clinicamente úteis que são indicativos de prognóstico pobre com o tratamento de intervenção com agentes terapêuticos padrão que têm um modo de ação diferente da exercida por agentes terapêuticos anti-CD40. Por "sensível ao tratamento com um agente terapêutico anti-CD40" entende-se o sujeito candidato (isto é, um indivíduo com uma doença inflamatória ou doença autoimune tal como referido abaixo), quando tratado com o agente terapêutico anti-CD40, podendo ter uma resposta terapêutica positiva relativamente à doença autoimune e/ou doença inflamatória para o qual o tratamento é requerido.

Bio marcadores para utilização em ensaios de prognóstico ex vivo

As vias de sinalização são caracterizadas por famílias de proteínas que facilitam a transdução de sinal. 0 termo 35 "família" quando se refere a proteína e moléculas de ácido nucleico pretende significar duas ou mais proteínas ou moléculas de ácido nucleico possuindo um domínio estrutural comum ou motivo e possuindo aminoácido suficiente ou homologia da sequência de nucleótideos, tal como aqui definido. Os membros da família podem ser de ocorrência natural ou não natural e pode ser de qualquer uma das mesmas ou de diferentes espécies. Por exemplo, uma família pode conter uma primeira proteína de origem humana, assim como outras, proteínas distintas de origem humana ou alternativamente, podem conter os homólogos de origem não humana. Os membros de uma família também podem ter características funcionais comuns. A família AKT (por vezes referido como PKB, para a proteína quinase B) da quinase serina/treonina, está integralmente envolvida no crescimento celular, sobrevivência, e metabolismo. A PKB foi originalmente identificada como um oncogene retroviral. Atualmente, têm sido caracterizados três variantes da família AKT, o resíduo 480 AKT-1, o resíduo 481 AKT-2, e o resíduo 479 AKT-3. Para fins da presente invenção, os membros da família de proteínas AKT serão referidos genericamente como proteínas AKT, embora seja reconhecido que os métodos aplicam-se a todas as três formas de AKT, ou seja, de AKT-1, AKT-2 e AKT 3, e as suas variantes. A AKT é um factor de crescimento regulado por quinase de serina/treonina que contém um domínio PH (homologia pleckstrin). Este domínio PH interage com os produtos lipídicos de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), fosfatidilinositol-3,4-bifosfato, e fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato, o que resulta na translocação da AKT do 36 citossol da célula para a sua membrana plasmática. Esta translocação é necessária a fim de apresentar a AKT a uma ativação de quinase a montante, PDK1 (quinase 1 dependente de fosfatidilinositol). Uma variedade de factores de sobrevivência e de crescimento, tais como PDGF, EGF, insulina, trombina, e NGF são conhecidos por ativar a translocação da AKT. A forma ativada (isto é, fosforilada) da proteina AKT/PKB fosforila numerosos substratos, incluindo GSK-3 (quinase 3 de sintase do glicogénio), e NOS (sintase endotelial de óxido nítrico), FKHR 1 (factor de transcrição de um membro da família de forquilha 1), Bad (membro pro-apoptótico da família Bcl-2), e p21 CIP (inibidor da progressão do ciclo celular). Estas ações podem resultar em efeitos biológicos diversos, tais como a supressão da apoptose, controlo do metabolismo da glucose, proliferação celular, transcrição, tradução, migração celular e angiogénese. A AKT ativada (isto é, p-AKT) promove a sobrevivência de células por meio de várias vias distintas, que envolvem a fosforilação de moléculas efectoras a jusante. Primeiro, a p-AKT inibe a apoptose por fosforilação do componente Bad do complexo Bad/Bcl-xl. Bad fosforilado liga-se a 14-3-3, causando a dissociação do complexo Bad/Bcl-xl e libertando assim o Bcl-XL para permitir a sobrevivência celular. Em segundo lugar, o NF-kB, que é mantido inativo no citoplasma por meio de associação com proteínas inibidoras da família I-kappa B (Ik-B), pode ser ativado por interação com a quinase induzinda por NF-kB (NIK) ou pode ser ativado pela via de sinalização AKT. Desta maneira, a AKT ativada (isto é, p-AKT) ativa uma molécula inibidora de NF-kB da família Ik-B (por exemplo, Ik-Boí) , via fosforilação intermediária do complexo multiproteico quinase Ik-B (IKK-α/β); a activação de um Ik-B leva à sua degradação e libertação de NF-kB previamente ligado, que conduz à ativação deste factor de 37 transcrição. A forma ativa de NF-kB pode translocar para o núcleo, e regula a expressão de centenas de genes para se oporem à apoptose. Um outro meio pelo qual a AKT promove a sobrevivência de células e se opõe à apoptose é através da fosforilação da protease Caspase 9 ou factores de transcrição de forquilha, tais como FKHRL1.

Os métodos da presente invenção para identificar indivíduos com uma doença inflamatória ou doença autoimune que possam beneficiar de um tratamento com um agente terapêutico anti-CD40, que bloqueia ou interfere com CD40L mediado por sinalização de CD40 compreendem o uso de um ensaio de prognóstico ex vivo para monitorizar a efeitos dos agentes terapêuticos anti-CD40 sobre a sinalização de CD40 através vias de sinalização AKT e NF-kB. Deste modo, uma amostra biológica de teste recolhida de um sujeito candidato é contactada com o agente terapêutico anti-CD40 de interesse durante o tempo suficiente para permitir a modulação de CD40L mediado por sinalização de CD40 como referido abaixo, e essa amostra é então testada para modificações do nível de expressão de, pelo menos, um bio marcador de sinalização CD40 selecionado a partir do grupo consistindo em AKT fosforilada (ρ-ΑΚΤ), PI3K fosforilado (p-PI3K), PDK1 fosforilado (p-PDKl), ΙΚΚ-α/β fosforilado (ρ-ΙΚΚ-α/β), Ικ-Β fosforilado (ρΙκ-Β, por exemplo, ρ-Ικ-Βα), e NF-kB ativado. A detecção da diminuição dos níveis de expressão destes bio marcadores fosforilados numa amostra biológica de teste compreendendo CD40L estimulado por células que expressam CD40 em resposta à incubação com um agente terapêutico anti-CD40, em relação ao observado para uma amostra biológica de controlo é indicativo da subregulação de CD40L mediada por sinalização de CD40 e, portanto, indicativo de um resultado positivo do tratamento com o agente 38 terapêutico anti-CD40. Em algumas formas de realização, o nivel de expressão de um determinado bio marcador de sinalização de CD40 através de vias de sinalização AKT e NF-kB é reduzido em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% em relação ao detectado na amostra de controlo biológico. A interação CD40/CD40L também leva à ativação das cascatas de sinalização MAPK, incluindo a via de sinalização MEK/ERK, a via de sinalização MEK/p38, e a via de sinalização MEKK/JNKK/JNK. Todas as vias MAPK operaram através de eventos de fosforilação sequencial para fosforilar fatores de transcrição e regulam a expressão do gene. Elas também podem fosforilar alvos citosólicos para regular eventos intracelulares. Estas cascatas estão implicadas na regulação da proliferação celular, diferenciação, desenvolvimento, ciclo celular e a transmissão de sinais oncogénicos. De particular interesse para os métodos são a ativação das vias de sinalização MEK/ERK e MEK/p38.

As quinases MAP (também referida como proteína quinase extracelulares regulada por sinal, ou ERKs) são as enzimas terminais três quinases em cascata, em que cada enzima fosforila e, consequentemente, ativa o membro seguinte na sequência. Cada módulo de MAPK consiste em três proteínas quinases: uma quinase de MAPK (ou MEKK), que ativa uma quinase de MAPK (ou MEK), que por sua vez, ativa uma enzima de MAPK/ERK. As MEKKs são proteínas quinases específicas de serina/treonina que fosforilam dualmente, e assim, ativam, uma ou mais das enzimas MEK em resíduos Ser ou Thr (Ser-X-X-X-Ser/Thr) dentro do núcleo catalítico. As Meks são 39 proteínas quinases específicas de serina/treonina/tirosina que ativam MAPKs por fosforilação tanto de Thr como de Tyr na sequência consenso TXY das MAPKs. Esta dupla fosforilação é necessária para a ativação. ERK1 (p44), ERK2 (p42), p38/HOG e JNK/SAPK representam ainda MAPKs terminais distintas relacionadas em vias paralelas.

Os métodos da invenção para identificar indivíduos com uma doença inflamatória ou doença autoimune que beneficiariam do tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 incluem a utilização de um ensaio de prognóstico ex vivo para monitorizar os efeitos de agentes terapêuticos anti-CD40 sobre a sinalização de CD40 através das vias MEK/ERK e MEK/p38. Deste modo, numa amostra biológica de teste recolhida de um sujeito candidato é contactada com o agente terapêutico de interesse durante o tempo suficiente para permitir a modulação de CD40L mediada por sinalização de CD40 como referido abaixo, e a amostra é então testada para alterações no nível de expressão de pelo menos um bio marcador de sinalização CD40 selecionado a partir do grupo consistindo em MEK fosforilado (p-MEK), por exemplo, p-MEK1, MEK2-p, p-MEK3, e p-MEK6, ERK fosforilado (p-ERK), por exemplo, p-ERKlou p- ERK2, e p38fosforilado (p-p38). A detecção da diminuição dos níveis de expressão destes bio marcadores fosforilados numa amostra biológica de teste compreendendo CD40L estimulado por células expressando CD40 em resposta à incubação com um agente terapêutico anti-CD40, em relação ao observado para uma amostra biológica de controlo é indicativo da subregulação de CD40L mediada por sinalização de CD40 e, portanto, indicativo de um resultado positivo do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. Em algumas formas de realização, o nível de expressão de um determinado bio marcador de CD40 através das vias de 40 sinalização de MEK/ERK e MEK/p38 é reduzida em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35 %, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% em relação ao detectado na amostra de controlo biológico. A resposta de um sujeito candidato à terapia com um agente terapêutico anti-CD40, que bloqueia ou interfere com CD40L mediado por sinalização de CD40 pode igualmente ser avaliada através da monitorização ex vivo, dos efeitos do agente terapêutico no nivel de expressão de qualquer um dos marcadores de citoquina de CD40L mediados por sinalização de CD40. O engajamento do CD40 pelo seu ligante natural, in vivo resulta em sobre regulação de uma série de citoquinas pró-inflamatórias, dependendo do tipo de células que expressam CD40. A estimulação ex vivo DE CD40L das células B normais resulta em sobre regulação da produção de várias citoquinas, incluindo, mas não limitado a, factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), interleucina (IL-6), IL-8, IL-10, factor de necrose tumoral-α (TNF-a), proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1), e proteína-ΐβ inflamatória de macrófagos (MIP-Ιβ), enquanto a estimulação de monócitos CD40L ex vivo resulta na sobre regulação da produção de VEGF, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α, MCP-1 e ΜΙΡ-1β como observado a seguir.

Em conformidade com os métodos de rastreio uma amostra biológica de teste recolhida a partir de um sujeito candidato é contactada com o agente terapêutico anti-CD40 de interesse durante o tempo suficiente para permitir a modulação de CD40L mediada por sinalização de CD40 como referido abaixo, e a amostra é então testada para as alterações no nível de expressão de pelo menos um marcador de citoquina selecionado do grupo que consiste em VEGF, IL- 41 6, IL-8, IL-10, TNF-α, MCP-1 e MIP-Ιβ. 0 nível de expressão de citoquinas pode ser realizado usando qualquer método de detecção conhecidos na técnica, como referido abaixo. A detecção da diminuição dos níveis de expressão destes marcadores de citocinas numa amostra biológica de teste compreendendo CD40L estimulado por células que expressam CD40 em resposta à incubação com um agente terapêutico anti-CD40, em relação ao observado para uma amostra biológica de controlo é indicativo da subregulação de CD40L mediada por sinalização de CD40 e, portanto, indicativo de um resultado positivo do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. Em alguns exemplos, o nível de expressão de qualquer citoquina é reduzido em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% em relação ao detectado na amostra de controlo biológico.

As vias de sinalização AKT, NF-d3 e MAPK estão todas envolvidas na proliferação celular e na sobrevivência. No sistema imunitário, a apoptose desempenha um papel importante na seleção do repertório de células T, na deleção de linfócitos T e B auto-reativos, na remoção de células T periféricas efectoras após a cessação de uma resposta imunitária, na regulação da memória imunológica, e na citotoxicidade de células alvo pelas células CTL e NK. Os agentes terapêuticos que podem bloquear a sobrevivência de CD40 por sinalização em células que expressam CD40 e promover os processos de apoptose celular que podem beneficiar do tratamento de doenças que têm uma componente autoimune e/ou inflamatória, que está associada com CD40L-mediada por sinalização de CD40. 42

Assim, em adição ao controlo de CD40 por sinalização em células que expressam CD40, os métodos para identificar indivíduos com uma doença inflamatória ou doença autoimune que beneficiariam do tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 incluem a utilização de ensaios de prognóstico ex vivo, que monitorizam os efeitos de agentes terapêuticos anti-CD40 sobre a expressão de um ou mais bio marcadores da apoptose, especialmente as proteínas pró-apoptóticas celulares, incluindo, mas não limitados a, proteínas de caspase clivadas e poli ADP-ribose polimerase clivada (PARP). Os bio marcadores adicionais de apoptose que podem ser ensaiados incluem, mas não estão limitados a, alterações na membrana plasmática na superfície da célula, por exemplo, a presença de fosfotidilserina na superfície da célula (PS) , e a clivagem ou a fragmentação do ADN genómico. A PS normalmente está localizada exclusivamente no lado interior da membrana de plasma, mas é translocada para a superfície externa da célula durante as fases iniciais de morte celular apoptótica, durante as quais a membrana celular permanece intacta. A presença de PS na superfície celular e a fragmentação de ADN genómico pode ser detectada, por exemplo, por coloração de anexina V e coloração TUNEL, respectivamente, como referido abaixo. A detecção de níveis elevados de expressão de um ou mais destes bio marcadores de apoptose numa amostra biológica de teste compreendendo CD40L estimulado por células que expressam CD40, em resposta à incubação com um agente terapêutico anti-CD40, em relação aos observados numa amostra biológica de controlo é indicativo de um resultado positivo do tratamento com esse agente terapêutico anti-CD40. Em algumas formas de realização, o nível de expressão de um determinado bio marcador da apoptose é aumentado em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 43 100%, 125%, relativamente controlo. 150%, 200%, ao detectado 250%, 300%, na amostra ou superior biológica de

Em alternativa, ou em combinação com os ensaios ex vivo descritos acima, os métodos compreendem a utilização de ensaios de prognóstico ex vivo que monitorizam os efeitos dos agentes terapêuticos anti-CD40 sobre a expressão de uma ou mais proteínas que são bio marcadores da proliferação celular e/ou sobrevivência celular, incluindo, mas não limitado a, uma proteina anti-apoptótica que é um membro da familia Bcl-2, um inibidor de apoptose de proteínas IAP e receptor de TNF associado ao factor-1 (TRAF-1). A detecção da diminuição dos níveis de expressão destes bio marcadores de proliferação celular e/ou sobrevivência celular de uma amostra biológica compreendendo CD40L estimulado por células que expressam CD40 em resposta à incubação com um agente terapêutico anti-CD40, em relação à observada numa amostra biológica de controlo é indicativo de um resultado positivo do tratamento com esse agente terapêutico anti-CD40. Em alguns exemplos, o nível de expressão de um determinado bio marcador da proliferação celular e/ou sobrevivência celular é reduzido em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% em relação ao detectado na amostra de biológica controlo.

Os membros da família caspase de proteínas são os principais efetores da apoptose celular. As caspases são proteases de cisteína que existem dentro da célula, como pro-formas inativas ou os chamados "zimogénios". Os zimogénios são clivados para formar enzimas ativas após a indução da apoptose, quer através da via de morte mediada 44 por receptor ou por via da apoptose mitocondrial. Ver, por exemplo, Gupta et al. (2003) Intl. J. Oncol. 22:15-20. Dependendo da via apoptótica, diferentes caspases dão inicio ao processo de apoptose, com a caspase-8 e -10 a iniciar a via do receptor de morte, e a caspase-9 iniciando a via mitocondrial. Caspases iniciadoras ativas então ativam (ou seja, clivam) caspases efectoras, por exemplo, caspase-3, -6 e -7, para induzir a apoptose. Estas caspases clivam proteinas celulares efectoras chave que levam às alterações morfológicas tipicas observadas em células em apoptose.

Assim, os métodos da presente invenção para identificar indivíduos com uma doença inflamatória ou uma doença autoimune que beneficiariam do tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 incluem a utilização de ensaios de prognóstico ex vivo, para monitorizar a proteólise de proteínas celulares específicas associadas com a apoptose. Por exemplo, a poli (ADP-ribose) polimerase (PARP-1) é especificamente clivada durante a apoptose. PARP-1 é uma proteína de ligação de ADN que catalisa a adição de cadeias de poli (ADP-ribose) a algumas proteínas nucleares e pensa-se que desempenham um papel crucial na reparação de danos no ADN. PARP-1 é ativada rapidamente durante a tensão celular, tal como choque térmico, radiação ionizante, exposição a genes cancerígenos, e tratamento com agentes quimioterapêuticos (Scovassi e Poirier (1999) Mol. Cell Biochem. 199:125-137; Wyllie (1997) Eur. J. Cell Biol. 73:189-197). Durante a apoptose, a caspase-3 ativada (isto é, clivada), por sua vez cliva PARP-1; de facto, a resolução de 89 kDa e 24 kDa de fragmentos proteolíticos é aceite como marcas de apoptose (Scovassi e Poirier (1999) supra; Wyllie et al. (1997) supra. Os ensaios de 45 prognóstico ex vivo aqui descritos monitorizam as alterações no nivel de uma ou mais proteínas de caspase clivadas, por exemplo, caspase-3 clivada, caspase-7 clivada, e caspase-9 clivada e, opcionalmente, o nivel de clivagem de PARP-1, superfície da célula PS, e/ou fragmentação do ADN genómico, numa amostra biológica de teste obtida de um sujeito candidato em resposta a agentes terapêuticos anti-CD40 que modulam CD40L mediado por sinalização de CD40 e/ou modulam ADCC. Niveis elevados de bio marcadores apoptóticos dentro de uma amostra biológica podem ser detectados através de qualquer método conhecido dos peritos na técnica, incluindo aqueles descritos abaixo.

Bio marcadores de sobrevivência e proliferação celular incluem, mas não estão limitados a, proteínas anti-apoptóticas que são membros da família de proteínas Bcl-2. A família de proteínas Bcl-2, a qual compreende, pelo menos, 16 membros, participa na regulação da apoptose celular. Alguns dos membros da família são anti- apoptóticos, por exemplo, Bcl-2, Bcl-xl, Mcl-1, Bcl-w, e AI e, assim, os bio marcadores da sobrevivência celular, e outros, são pró-apoptóticos (por exemplo, Bid, Bim, Bik, Bmf, Bad, Hrk, BNIP3, Bax, Bak e Bok) e, assim, bio marcadores de atividade apoptótica. Os membros da família Bcl-2 têm sido sugeridos para atuar através de diversos mecanismos, incluindo a formação de poros na membrana mitocondrial externa, através da qual o citocromo c (Cyt c), e outras proteínas intermembrana podem escapar, e a heterodimerização entre os membros da família pro e anti-apoptótica.

Os efeitos de agentes terapêuticos anti-CD40 CD40 sobre a sinalização e modulação da apoptose podem ser avaliados com 46 os ensaios de prognóstico ex vi vo aqui descritos para monitorizar um ou mais destes bio marcadores de sobrevivência celular/apoptose. Os bio marcadores de sobrevivência celular que são de particular interesse incluem, mas não estão limitadas a, proteínas anti- apoptóticas Bcl-XL e Mcl-1. 0 gene Bcl-2, que codifica a proteína da membrana mitocondrial de Bcl-2, foi identificado pela primeira vez nos linfomas de células B (Tsujimoto et al. (1984) Science 226:1097) onde a lesão genética causal tem sido caracterizada como uma translocação cromossómica (t (14:18)), que coloca o gene bcl-2 sob o controlo do promotor de imunoglobulina. A sobre-expressão de Bcl-2 resultante retarda o curso normal da morte celular por apoptose que de outra forma mantém a homeostase de células B, resultando na acumulação de células B e linfoma folicular (Adams e Cory, 1998; Cory (1994) Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sei. 345:289). O Bcl-2 pode existir como um homodímero ou pode formar um heterodímero com bax. Tal como um homodímero, o bax funciona para induzir a apoptose. No entanto, a formação de um complexo Bax-Bcl-2 bloqueia a apoptose. A expressão de Bcl-2 pode também desempenhar um papel no desenvolvimento da resistência ao fármaco. Vários genes com homologia ao gene bcl-2 foram seguidamente caracterizados, incluindo o seguinte: al, que codifica a proteína Al do aminoácido 80 que é rapidamente induzida em macrófagos em resposta a GM-CSF ou LPS (Lin et al. (1993) J. Immunol. 151: 1979-1988); mcl-1, um gene de resposta precoce em linhas de células mielóides que sofrem diferenciação de macrófagos (Kozopas et al. (1993) Proc. 47

Natl. Acad. Sei. USA 90:3516-3520) e bak, um homólogo de bcl-2 que pode aumentar a apoptose (Chittenden et al. (1995) Nature 374:733; Kiefer et al. (1995) Nature 374:736). Outras proteínas que interagem com e/ou estão estruturalmente relacionadas com a produção do gene bcl- 2 também foram identificadas, tal como, por exemplo, Bcl-xl e Bcl-xs (Boise et al. (1993) Cell 74:597); Ced-9 (Vaux, et al. (1992) Science 258:1955). O produto do gene Bcl-x, Bcl-x, que está estreitamente relacionado com a proteína Bcl-2 também protege as células da apoptose. 0 splicing alternativo de Bcl-x humano pode resultar em pelo menos duas espécies distintas de mARN de Bcl-x, a Bcl-xl e a Bcl-xs. O produto de proteínas predominantes (233 aminoácidos) da maior bcl-x mARN, Bcl-XL, inibe a morte celular após a retirada do factor de crescimento (Boise et al. (1993) Cell 74:597-608) e a sua expressão transgénica altera a maturação de timócitos que conduz ao aumento do número de timócitos maduros (Chao et al. (1995) J. Exp. Med. Chem. 182:821-828; Grillot et al. (1995) J. Exp. Med. Chem. 182:1973-1983). A célula da leucemia mielóide associada ao gene mcl-1 codifica uma proteína, Mcl-1, que é expressa precocemente durante a programação de diferenciação em células de leucemia mielóide aguda (ver, por exemplo, a publicação do Pedido de Patente US 20020086321). A porção carboxilo de Mcl-1 partilha a homologia com a Bcl-2. Como outros membros da família Bcl-2, Mcl-1, é caracterizada por uma associação com a programação de transições no destino da célula, tal como a viabilidade ou a morte e da proliferação à diferenciação. 48

Em adição aos membros da família Bcl-2, os bio marcadores de sobrevivência celular incluem membros da família de genes de inibidores de apoptose relacionados com o gene de IAP de baculovírus (Birnbaum et al. (1994) J. Virol. 68:2521-2528; Ciem et al. (1994) Mol. Cell Biol. 14:5212- 5222; Duckett et al. (1996) EMBO J. (1996) 15:2685-2694;

Hay et al. (1995) Cell 83:1253-1262; Liston et al. (1996) Nature 379:349-353; Rothe et al. (1995) Cell 83:1243-1252;

Roy et al. (1995) Cell 80:167-178). Pelo menos oito IAPs humanos foram identificados (Salvesen e Duckett (2002) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3:401-410).

As IAPs são altamente conservadas evolutivamente; compartilhando uma arquitetura semelhante organizada em aproximadamente de um a três de aminoácido 70 do aminoácido terminal Cys/His do baculovírus de repetição IAP (BIR) e por um terminal carboxi de domínio de ligação de zinco, designado dedo RING. As proteínas da família IAP são reconhecidas como tendo potencialmente papéis importantes na regulação da apoptose e tumorigénese (Deveraux e Reed (1999) Genes Dev. 13:239-252; Tamm et al. (2000) Clin. Câncer Res. 6:1796-1803).

As IAPs suprimem a morte celular por meio da inibição das caspases terminal a montante (ver, por exemplo, Thompson (1995) Science 267:1456). As formas ativas (isto é, clivadas) da caspase-3 e -7 são diretamente inibidas por XIAP, C-IAP1 e C-IAP2 (ver, por exemplo, de Roy et al. (1997), supra), que também pode impedir o processamento proteolítico da pró-caspase-3, -6 e -7, bloqueando o citocromo c induzido por ativação da pró-caspase-9 (Deveraux et al. (1998) EMBO J. 17:2215-2223). As utilizações terapêuticas e de diagnóstico de ácidos 49 nucleicos que codificam para vários inibidores da apoptose, relativamente a um membro da familia IAP têm sido descritas na literatura de patentes. Ver, por exemplo, os Pedidos de Patente Internacional WO 97/06255, WO 97/26331 e WO 97/32601. Exemplos de proteínas IAP que podem ser utilizadas como bio marcadores da sobrevivência celular incluem, mas não estão limitadas a, XIAP, cIAPl, IAP2 e survivina. XIAP é o inibidor mais amplamente expresso e mais potente de caspases (ver, por exemplo, Takahasi et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:7787; Reed (1994), J. Cell Biol. 124:1). Survivina é aproximadamente 16,5 kDa de proteina citoplasmática (ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US 20030100525) contendo uma única BIR e uma região de espiral enrolada altamente carregada do terminal carboxilo em vez de um anel de RING, o que inibe a apoptose induzida pela retirada do factor de crescimento (IL-3) quando transferida em precursores de células B (Ambrosini et al. (1997) Nature Med. 3:917-921). A sobre expressão da proteina survivina exógena salva as células da apoptose induzida pela p53, de uma forma dependente da dose, sugerindo que a perda de survivina medeia, pelo menos, em parte, o circuito apoptótico dependente da p53 (Mirza et al. (2002) Oncogene 21:2613-2622).

Outro bio marcador representativo da sobrevivência celular para utilização nos métodos é TRAF-1. Os membros da família TRAF ligam-se ao domínio citoplasmático de CD40 e medeiam a ativação de múltiplas vias de sinalização que regulam a sobrevivência de células B, proliferação, diferenciação, comutação de isótipo, desenvolvimento do centro germinativo, e resposta humoral de memória (ver, por 50 exemplo, Pullen et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:14246-14254) . Tem sido relatado que a ativação do receptor CD40 pode resultar na transcrição do gene TRAF-1 (Schwenzer et al. (1999) J. Biol. Chem. 274 (27):19368-19374) e uma forte sobre regulação da expressão de TRAF-1 em monócitos humanos (Pearson et al. (2001) Internat. Immunol. 13 (3):273-283). Alterações na expressão do gene TRAF-1 em resposta à ativação do receptor CD40 pode ser capaz de predizer a eficácia do fármaco, proporcionando assim um bio marcador adequado para avaliar e/ou monitorizar os efeitos da terapêutica anti-CD40 em CD40L mediado por sinalização de CD40 e modulação da sobrevivência celular/apoptose. Alterações na expressão de TRAF-1 podem ser facilmente detectadas, quer ao nivel do mARN por meio de técnicas tais como Northern blot ou RT-PCR quantitativo, ou ao nivel da proteina, por exemplo, por Western blot, como descrito a seguir.

Os bio marcadores precedentes da sobrevivência celular podem ser monitorizados nos ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos em qualquer combinação, incluindo um ou todos estes bio marcadores, bem como em combinação com outros bio marcadores de proliferação celular. Deste modo, numa forma de realização, os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos são também usados para monitorizar, numa amostra biológica de teste a partir de um sujeito candidato a expressão do bio marcador de proliferação celular Ki67.

Ki67 é uma proteina nuclear relacionada com o ciclo celular que está presente no núcleo das células do grupo Gl, S, Me fases G2 de divisão de células, mas não na fase GO de células quiescentes (Gerdes et al. (1984) J. Immunol. 133, 51 1710-1715). Por estas razões, é utilizado como um marcador de proliferação celular.

Assim, os bio marcadores que estão a ser monitorizados nos ensaios de prognóstico ex vivo, incluem a sobrevivência celular e proteínas apoptóticas descritas acima, e as proteínas envolvidas nas vias de sinalização do CD40 como referido acima. A monitorização pode ser ao nivel da proteína ou ácido nucleico. Assim, os bio marcadores incluem estas proteínas e os genes que codificam estas proteínas. Quando a detecção é ao nível da proteína, o bio marcador da proteína compreende o polipeptídeo de comprimento completo ou qualquer seu fragmento detectável, e pode incluir variantes destas sequências proteicas. Da mesma forma, quando a detecção é ao nível dos nucleótideos, o bio marcador de ácido nucleico inclui ADN compreendendo a sequência de codificação de comprimento completo, um fragmento da sequência de codificação de comprimento completo, variantes destas sequências, por exemplo, variantes ou que ocorrem naturalmente ou variantes splice, ou o complemento de uma tal sequência. Os bio marcadores de ácidos nucleicos também incluem ARNA, por exemplo, mARN, compreendendo a sequência de comprimento completo que codifica o bio marcador da proteína de interesse, um fragmento da sequência de ARN de comprimento completo de interesse, ou variantes destas sequências. Bio marcadores de proteínas e bio marcadores de ácidos nucleicos incluem variantes destas sequências. Por "fragmento" entende-se uma porção do polinucleótideo ou uma porção da sequência de aminoácidos e consequentemente a proteína por ele codificada. Os polinucleótideos que são fragmentos de uma sequência de bio marcador de nucleótideos compreendem geralmente pelo menos 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 52 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, ou 1400 nucleótideos contíguos, ou até ao número de nucleótidos presentes num bio marcador de polinucleótideo de comprimento completo aqui descrito. Um fragmento de um bio marcador de polinucleótideo geralmente codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 100, 200 ou 250 aminoácidos contíguos, ou até ao número total de aminoácidos presentes num bio marcador de proteína de comprimento completo. Por "variante" pretende-se significar as sequências substancialmente semelhantes. Geralmente, as variantes de um bio marcador particular da invenção terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com este bio marcador como determinado por programas de alinhamento de sequências conhecidos na técnica. A proteína e a correspondente sequência de codificação para cada um destes marcadores são conhecidas na técnica. Ver o Quadro 6 no Exemplo 3 abaixo.

Factores relacionados com o CD40 e os marcadores de prognóstico clinicamente úteis para utilização em outros ensaios de prognóstico

Indivíduos ou subpopulações de pacientes que têm uma doença inflamatória ou doença autoimune que beneficiariam do tratamento com agentes terapêuticos anti-CD40 também podem ser identificados utilizando ensaios de prognóstico que procurar a presença ou ausência de, ou níveis elevados ou diminuídos, de uma ou mais de factores relacionados com CD40. Os sujeitos identificados como sendo responsivos ao tratamento com um agente terapêutico anti-CD40, com base nestes factores relacionados com CD40 podem ser tratados com o agente terapêutico anti-CD40. Alternativamente, podem ser rastreados para potenciais benefícios com o tratamento com agentes terapêuticos anti-CD40 utilizando os ensaios de 53 prognóstico ex vivo aqui descritos, por exemplo, para identificar se a doença inflamatória ou doença autoimune poderia ser mais sensivel ao tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 que bloqueia CD40L mediado por sinalização de CD40 ou que modula a atividade ADCC, ou que tem esses dois modos de ação.

Factores relacionados com o CD40 de interesse incluem, mas não estão limitados a, nivel de expressão do antigénio CD40 da superfície da célula, o nivel de expressão de CD40L na superfície celular, os niveis circulantes de CD40 solúvel (sCD40) e os niveis circulantes de CD40L solúvel (sCD40L). Deste modo, uma amostra biológica recolhida a partir de um sujeito candidato é analisada para o nivel de expressão de pelo menos um destes factores relacionados com CD40. 0 nivel de expressão destes factores relacionados com CD40 pode ser utilizado como marcadores de prognóstico para doenças autoimunes e/ou doenças inflamatórias. Eles podem ser úteis como diagnóstico de indivíduos que iriam ou não responder aos agentes terapêuticos anti-CD40.

Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para a análise destes marcadores. Os niveis circulantes de sCD40 ou sCD40L, por exemplo, numa amostra de sangue obtida de um sujeito candidato, podem ser medidos, por exemplo, através de ELISA, radioimunoensaio (RIA), electroquimioluminescência (ECL), Western blot, tecnologias de multiplexagem, ou outros métodos semelhantes. A xxpressão na superfície celular de CD40 ou CD40L pode ser medida, por exemplo, por citometria de fluxo, imuno-histoquímica, Western blot, imunoprecipitação, seleção de esfera magnética, e quantificação de células que expressam qualquer destes marcadores da superfície celular. Os niveis 54 de expressão de CD40 e CD40L ARN podem ser medidos por RT-PCR, Qt-PCR, microensaio, Northern blot, ou outras tecnologias semelhantes. As sequências para o antigénio CD40, CD40L, e CD40L solúvel são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a Tabela 7 no Exemplo 3 abaixo. Em algumas concretizações, o sCD40 é isolado e sequenciado para determinar uma distinção entre sCD40 que é segregado pelas células que expressam CD40 contra o sCD40 que é clivado proteoliticamente na superfície destas células. 0 nivel de expressão de sCD40 segregado e/ou sCD40clivado proteoliticamente pode ser correlacionado com um estado de doença e/ou a capacidade de resposta da doença para o tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 de interesse.

As subpopulações de pacientes que têm uma doença inflamatória ou doença autoimune que beneficiariam do tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 são identificadas por rastreio de indivíduos candidatos para um ou mais marcadores de prognóstico clinicamente úteis conhecidos na técnica. Exemplos de marcadores clinicamente úteis incluem, mas não estão limitados a, soro de interleucina (IL)-18, os níveis que se relacionam com a gravidade da cirrose biliar primária (Yamano et al. (2000) Clin. Exp. Immunol. 122:227-231); molécula-1 de adesão intercelular solúvel (ICAM-1), a expressão de que é maior em cirrose biliar primária tardia do que no início da doença, e que se correlaciona com a progressão histológica (Lim et al. (1994) Hepatology 20:882-888); a expressão de moléculas de adesão celular de células, como a ICAM-1 e CD40, que servem para prever o resultado da nefrite lúpica (Daniel et al. (2001) Kidney Int. 60:2215-2221); os níveis de receptor de soro de IL-2 solúvel (sIL-2R) , o que parece 55 ser um excelente do monitor da atividade clínica da doença em artrite reumatoide (AR) (Wood et ai. (1988) J. Autoimmun. 1:353-361); proteína intestinal da resistência a múltiplos fármacos (MDRl), o nível do qual é um poderoso indicador do prognóstico para o resultado do transplante de fígado de doador vivo (Hashida et al. (2001) Clin. Pharmacol. Ther. 69:308-316); níveis aumentados de leucina aminopeptidase de soro, que pode ser um indicador de atividade para o lúpus eritematoso sistémico (Inokuma et al. (1999) Rheumatology (Oxford) 38:705-708), proteína C-reativa, que é um indicador geral de inflamação, e alfa-1-antitripsina, o que é um indicador da atividade da doença na doença de Crohn, ileíte e colite (Meyers et al. (1985) Gastroenterology 89:13-18).

Assim, as subpopulações de pacientes com doenças autoimunes e/ou inflamatórias, que são menos sensíveis às terapias existentes podem ser prontamente identificadas através de métodos de ensaio correntemente utilizados, incluindo os ensaios de prognóstico aqui descritos que utilizam um ou mais destes marcadores de prognóstico clinicamente úteis. Tendo identificado um sujeito que cai dentro de uma destas subpopulações com base nestes marcadores de prognóstico clinicamente úteis, o sujeito pode ainda ser rastreado utilizando um ou mais dos ensaios de prognóstico ex vivo identificados acima, para avaliar o benefício de tratar o sujeito com um anti-CD40 terapêutico que modula CD40L mediada por sinalização de CD40 e/ou atividade ADCC.

Ensaios de prognóstico O potencial benefício terapêutico com um agente terapêutico anti-CD4 0, que modula CD40L mediado por sinalização de 56 CD40, e modula ADCC, ou ambos, é avaliado utilizando ensaios de prognóstico ex vivo que monitorizam alterações no nível de expressão de um ou mais dos bio marcadores da proliferação e sobrevivência celular mencionados, apoptose celular, e as vias de sinalização de CD40 numa amostra biológica, que são recolhidas de um sujeito candidato que esteja em necessidade de intervenção terapêutica para uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, que é mediada pela estimulação de CD40 sinalizada em células que expressam CD40. Por "células que expressam CD40" entende-se as células que expressam o antigénio CD40. Os métodos para detectar a expressão de CD40 em células são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, técnicas de PCR, imuno-histoquímica, citometria de fluxo, Western blot, ELISA e semelhantes. Onde os ensaios ex vivo geram uma alteração favorável do nível de expressão de um ou mais bio marcadores de interesse na amostra biológica, o tratamento de intervenção com o agente terapêutico anti-CD40 está justificado. Além disso, os bio marcadores, marcadores de citoquinas, e factores relacionados com o CD40 aqui discutidos podem ser usados para monitorizar a eficácia do tratamento de um agente terapêutico anti-CD40 num indivíduo, que pode ou não ter sido testados usando os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos, e, assim, determinar se o tratamento adicional com o mesmo agente terapêutico anti-CD40 é garantido, ou se são necessárias ou desejáveis protocolos de tratamento alternativo. Quando o tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 é garantido tal como determinado pelos métodos da presente invenção, o agente terapêutico pode ser administrado por qualquer via de administração adequada. 57 0 sujeito candidato que está a ser considerado para a intervenção terapêutica com um agente terapêutico anti-CD40, que modula CD40L mediado por sinalização de CD40, e modula ADCC, ou ambos, pode ser atingido com, ou em risco de desenvolver ou reincidir com, qualquer doença autoimune ou inflamatória que é mediada por CD40 sinalizado em células que expressam CD40. As doenças inflamatórias são caracterizadas pela inflamação e destruição de tecidos, ou uma combinação destes. "Doença inflamatória" inclui qualquer processo inflamatório imune mediado em que o evento inicial ou o alvo da resposta imune envolve antigénio (s) não próprios, incluindo, por exemplo, aloantigénios, xenoantigénios, antigénios virais, antigénios bacterianos, antigénios desconhecidos, ou alérgenos. 0 termo "doença inflamatória (s) " compreende "doença autoimune (s) Tal como aqui utilizado, o termo "autoimunidade" é geralmente entendido para abranger processos imunomediados inflamatórias envolvendo antigénios "próprios". Em doenças autoimunes, os antigénio (s) próprios desencadeiam respostas imunitárias do hospedeiro.

Além disso, os métodos aqui descritos podem ser utilizados para avaliar a eficácia de um agente terapêutico anti-CD40 para o tratamento da inflamação associada com a rejeição do transplante de tecido. "Rejeição de transplante" ou "rejeição de enxerto" refere-se a qualquer resposta imune do hospedeiro contra o enxerto, incluindo mas não se limitando aos antigénios HLA, antigénios do grupo sanguineo, e semelhantes. 58 A divulgação também pode ser utilizada para avaliar a eficácia de um agente terapêutico anti-CD40 para o tratamento da doença do enxerto versus hospedeiro, tal como a associada com o transplante de medula óssea, por exemplo. Em tal doença do enxerto versus hospedeiro, a medula óssea do dador inclui linfócitos e células que maturam em linfócitos. Os linfócitos do doador reconhecem os antigenos do destinatário como não próprios e desencadeiam uma resposta imune inflamatória. Assim, tal como é aqui utilizado, a "doença do enxerto versus hospedeiro" ou "reação do enxerto contra o hospedeiro" refere-se a qualquer célula T de resposta imune mediada por linfócitos do doador na qual reagem os antigénios do hospedeiro.

Exemplos de doenças autoimunes e/ou inflamatórias incluem, mas não estão limitadas a, lúpus eritematoso sistémico (LES), lúpus discóide, nefrite lúpica, sarcoidose, artrite inflamatória, incluindo artrite juvenil, artrite reumatoide, artrite psoriática, sindrome de Reiter, espondilite anquilosante, e artrite gotosa, rejeição de um transplante de órgão ou tecido, rejeição e/ou doença do enxerto versus hospedeiro hiperaguda, aguda ou crónica, esclerose múltipla, sindrome de hiper IgE, poliarterite nodosa, cirrose biliar primária, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, doença celiaca (enteropatia sensível ao glúten), hepatite autoimune, anemia perniciosa, anemia hemolitica autoimune, psoríase, esclerodermia, miastenia gravis, auto-imune, púrpura trombocitopénica, autoimune, tireoidite autoimune, doença de Graves, tireoidite de Hasimoto, doença do complexo imune, sindrome de disfunção imunológica da fadiga crónica (CFIDS) polimiosite e dermatomiosite, crioglobulinemia, trombólise, cardiomiopatia, pênfigo vulgar, fibrose intersticial 59 pulmonar, diabetes mellitus tipo I e tipo II, hipersensibilidade tardia tipo 1, 2, 3 e 4, alergia ou doenças alérgicas, respostas imunes indesejadas/não pretendidas a proteínas terapêuticas (ver por exemplo, Pedido de Patente US 2002/0119151 e Koren et al. (2002) Curr. Pharm.Biotechnol. 3:349-60), asma, sindrome de Churg-Strauss (granulomatose alérgica), dermatite atópica, dermatite de contacto alérgica e irritante, urticária, alergia mediada por IgE, aterosclerose, vasculite, miopatias inflamatórias idiopáticas, doença hemolitica, doença de Alzheimer, polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, e semelhantes. Os métodos da presente invenção são utilizadas para identificar indivíduos que beneficiariam do tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 para a inflamação pulmonar, incluindo, mas não se limitando a, rejeição de enxerto pulmonar, asma, sarcoidose, enfisema, fibrose cística, fibrose pulmonar idiopática, bronquite crónica, rinite alérgica e doenças alérgicas do pulmão, como pneumonite de hipersensibilidade, pneumonia eosinofílica, bronquiolite obliterante, devido a transplante de medula óssea e/ou pulmão ou outras causas, aterosclerose do enxerto/fleboesclerose do enxerto, assim como fibrose pulmonar resultante de colágeno, doenças vasculares, e autoimunes, tais como artrite reumatoide e lúpus eritematoso.

Os métodos da invenção são úteis para a identificação e tratamento de doenças autoimunes e doenças inflamatórias que são inicialmente resistentes a, ou que desenvolvem resistência a outros tratamentos terapêuticos conhecidos, cujo modo de ação é diferente do meio da modulação de CD40L mediado por sinalização de CD40, e modulação de ADCC, ou ambos. Os ensaios de prognóstico ex vivo podem ser usados 60 para identificar subpopulações de pacientes para os quais o tratamento com a intervenção de um ou mais agentes terapêuticos anti-CD40, que modulam CD40L, mediado por sinalização de CD40, e modulam ADCC, ou ambos, é desejável. 0 termo "prognóstico" é reconhecido na especialidade e engloba as previsões sobre a probabilidade de curso da resposta à intervenção terapêutica, e o curso susceptivel da doença ou da progressão da doença, em particular no que diz respeito à possibilidade de remissão da doença, recidiva da doença e morte. Os ensaios de prognóstico ex vivo da presente invenção podem ser utilizados para prever a resposta de um sujeito candidato a um determinado agente terapêutico anti-CD40, ou classe de agentes terapêuticos anti-CD40, que modulam CD40L, mediado por sinalização de CD40, modulam ADCC, ou ambos. Por "prever a resposta de um sujeito candidato" entende-se a avaliação da probabilidade de um indivíduo em questão ir experimentar um resultado positivo ou negativo, com um agente terapêutico anti-CD40 particular. Para as finalidades da presente invenção "indicativo de um resultado positivo do tratamento", no contexto dos ensaios de prognóstico ex vivo da presente invenção entende-se significar um aumento da probabilidade de que o candidato sujeito experimentará resultados benéficos em resposta ao tratamento com o agente terapêutico anti-CD40 em consideração e, portanto, o tratamento de intervenção com esse agente terapêutico anti-CD40 seria justificado. Em contraste, "indicativo de um desfecho negativo do tratamento" pretende-se significar um aumento da probabilidade de que o paciente não beneficiará do tratamento de intervenção com o agente terapêutico anti-CD40 sob consideração, e, portanto, a intervenção 61 terapêutica com este agente terapêutico anti-CD40 não seria justificada.

Resultados benéficos que podem ser alcançados com o tratamento de intervenção com agentes terapêuticos anti-CD40 que modulam CD40L mediado por sinalização de CD40 incluem qualquer resposta terapêutica positiva. Por "resposta terapêutica positiva" no que diz respeito a uma doença autoimune e/ou doença inflamatória pretende-se uma melhoria da doença em associação com a atividade anti-inflamatória destes anticorpos ou fragmentos de ligação ao antigénio dos mesmos, e/ou uma melhoria dos sintomas associada com a doença. Isto é, pode ser observado um efeito anti-proliferativo, a prevenção da proliferação da célula que expressa CD40, uma redução na resposta inflamatória, incluindo, mas não limitado à redução da secreção de citoquinas inflamatórias, moléculas de adesão, proteases, imunoglobulinas (nos casos em que a célula de carga de CD40 é uma célula B), suas combinações, e semelhantes, o aumento da produção de proteínas anti-inflamatórias, uma redução no número de células auto-reativas, um aumento na tolerância imunológica, inibição da sobrevivência de células auto-reativas, e/ou a uma diminuição um ou mais sintomas mediados pela estimulação de células que expressam CD40. Tais respostas terapêuticas positivas não estão limitadas à via de administração e podem compreender a administração ao dador, o tecido do dador (tal como, por exemplo, a perfusão do órgão), o hospedeiro, ou uma combinação destes, e semelhantes. A resposta clínica pode ser avaliada através de técnicas de triagem, como ressonância magnética (RM), imagem x-radiográfica, tomografia computadorizada (TC), citometria 62 de fluxo ou classificador de análise de células de fluorescência ativada (FACS), histologia, patologia grave, e análise química do sangue, incluindo, mas não se limitando a alterações detectáveis por ELISA, RIA, cromatografia e semelhantes. Além destas respostas terapêuticas positivas, o sujeito sob tratamento com o agente terapêutico anti-CD40 pode experimentar o efeito benéfico de uma melhoria dos sintomas associados com a doença.

Os ensaios de prognóstico ex vivo compreendem proporcionar uma amostra biológica de teste e uma amostra biológica de controlo a partir de um sujeito candidato com necessidade de prognóstico para o tratamento de intervenção com o agente terapêutico anti-CD40 como aqui referido, em que as amostras biológicas de teste e de controlo compreendem células que expressam CD40 que tenham sido estimuladas com um ligando de CD40, quer in vivo ou ex vivo; o contacto da amostra biológica de teste com uma quantidade eficaz do agente terapêutico anti-CD40 de interesse; detecção do nível de pelo menos um bio marcador nessa amostra biológica de teste, onde o bio marcador é selecionado a partir do grupo consistindo num bio marcador da apoptose celular, um bio marcador de CD40L mediado por via de sinalização de CD40, e um bio marcador da sobrevivência celular, dependendo do modo de ação do agente terapêutico anti-CD40 de interesse; e comparação do nível do bio marcador (s) na amostra de biológica de teste para o nível do bio marcador (s) na amostra de controlo biológico, que não foi contactada com o agente terapêutico anti-CD40. Onde o agente terapêutico anti-CD40 é um antagonista que bloqueia ou interfere com CD40 mediado por sinalização de CD40L, ou bloqueia ou interfere com essa sinalização e também modula 63 ADCC, os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos para qualquer um ou todos estes bio marcadores de proliferação celular e sobrevivência, a apoptose, e CD40L mediado por sinalização de CD40, podem ser utilizados para avaliar o potencial efeito benéfico do agente terapêutico, isoladamente ou em combinação com os ensaios para os marcadores de citoquinas que são sobre reguladas por CD40 mediado por sinalização de CD40L, e/ou ensaios para um ou mais dos factores relacionados com o CD40 aqui descritos, a fim de identificar um sujeito que tem uma doença inflamatória ou doença autoimune que seria sensivel ao tratamento com esse agente terapêutico anti-CD40. Onde o agente terapêutico anti-CD40 tem o seu modo de ação através de atividade de modulação de ADCC, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 pode ser utilizado um ensaio de prognóstico ex vivo para um ou mais marcadores da apoptose para avaliar o potencial efeito benéfico do agente terapêutico, isoladamente ou em combinação com os ensaios para um ou mais dos factores relacionados com o CD40 aqui descritos, a fim de identificar um sujeito que tem uma doença inflamatória ou doença autoimune que seria sensivel ao tratamento com esse agente terapêutico anti-CD40. 0 nível de expressão de um ou mais bio marcadores e, opcionalmente, um ou mais marcadores de citoquinas, numa amostra biológica de teste que está em contacto com o agente terapêutico anti-CD40 de interesse é comparado ao nível de expressão para o bio marcador (es) , e, opcionalmente, o marcador de citoquinas numa amostra biológica de controlo. Por "amostra biológica de teste" entende-se uma amostra biológica que compreende células que expressam CD40 obtidas a partir do sujeito candidato, e que irão ser postas em contacto com o agente terapêutico anti- 64 CD40 sob consideração para tratamento do sujeito candidato. Por "amostra biológica de controlo" entende-se uma amostra biológica que é comparável à amostra biológica de teste na medida em que também compreende aproximadamente o mesmo número e tipo de células que expressam CD40, e foi obtida a partir do sujeito candidato no mesmo periodo de tempo e numa modo equivalente ao utilizado para se obter a amostra biológica de teste, e que irá ser submetida às mesmas condições experimentais, como a amostra de teste, mas que não será posta em contacto com o agente terapêutico anti-CD40 de interesse. A amostra biológica de teste e amostra biológica de controlo podem ser fornecidas a partir de uma amostra biológica única que tenha sido obtida a partir do sujeito e dividida em subamostras, uma das quais é designada a amostra biológica de teste e a outra é designado a amostra biológica de controlo.

Alternativamente, a amostra biológica de teste e amostra de biológica de controlo podem ser fornecidas a partir de duas ou mais amostras biológicas, que podem ser combinadas e, em seguida, subdividida em subamostras tal como acima, ou que podem representar individualmente as amostras biológicas de teste e de controlo.

Embora seja reconhecido que as células que expressam CD40 obtidas a partir do sujeito candidato podem ter sido constitutivamente estimuladas por CD40L in vivo, antes da colheita de uma amostra biológica, é preferível estimular as células que expressam CD40 das amostras biológicas de teste e de controlo ex vivo, de modo que os efeitos antagonistas de um agente terapêutico anti-CD40 sobre as atividades relacionadas com CD40, por exemplo, a estimulação da proliferação das células e sinalização de CD40, possam ser avaliados de forma eficaz. 65

Deste modo, antes de fazer contactar a amostra biológica de teste de células que expressam CD40 com o agente terapêutico anti-CD40 de interesse, as células que expressam CD40 em relação a qualquer amostra biológica recolhida do sujeito candidato podem ser estimuladas, por exemplo, com CD40L, para assegurar a sobre regulação de CD40 na sinalização das células que expressam CD40 das amostras biológicas de teste e de controlo a serem usadas no ensaio de prognóstico ex vivo. Qualquer fonte de CD40L pode ser utilizada, incluindo, mas não limitado a, CD40L solúvel. Outras moléculas estimuladoras de CD40 adequadas podem incluir, por exemplo, anticorpos agonistas que se ligam especificamente ao domínio extracelular de CD40. Assim, as moléculas estimuladores de CD40 adequadas incluem, mas não estão limitados a, CD40L ligado à membrana (por exemplo, CD40L ligado à membrana plasmática de uma célula, por exemplo, células CHO fixadas por formaldeído transfectantes que expressam CD40L, ou CD40L incorporado num substrato sintético à base de lípidos, tal como, um lipossoma ou micelas, CD40L solúvel, um agonista do anticorpo anti-CD40, por exemplo, o anticorpo anti-CD40 humano G28-5 (Bristol-Myers Squibb, Seattle, Washington), e suas misturas. Uma quantidade eficaz de uma molécula estimuladora para ser posta em contacto com células de uma amostra biológica ou subamostra da mesma recolhida, a fim de estimular uma ou mais vias de sinalização CD40 dependerá de factores tais como o tipo de ligante utilizado (por exemplo, monomérico ou multimérico; solubilidade e permeabilidade, e semelhantes) e a abundância do receptor CD40 sobre as células que expressam CD40. De preferência, entre cerca de 1,0 nM e cerca de 1 mM de CD40L ou CD40L solúvel é utilizado para estimular a sinalização de CD40. 66

As células que expressam CD40 na amostra biológica ou uma sua subamostra são estimuladas com CD40L solúvel humano recombinante (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK) , antes da etapa de contacto através da incubação da amostra biológica ou a mesma subamostra com CD40L solúvel durante um tempo suficiente para estimular a sinalização de CD40. 0 tempo de incubação é de cerca de 10 minutos a cerca de 4 horas. A quantidade de CD40L solúvel presente durante o período de incubação é facilmente determinada por meio de titulação. A quantidade de CD40L solúvel é de cerca de 1 pg/ml. Qualquer protocolo aceitável de contacto da amostra biológica de teste com um agente terapêutico anti-CD40 de interesse pode ser usado nos ensaios de prognóstico ex vivo. Factores a ser considerados incluem, mas não estão limitados a, o número de células a ser contactado dentro de um recipiente que compreende a amostra biológica ou subamostra da mesma; concentração do agente terapêutico anti-CD40, a ser posto em contacto com a amostra biológica de teste; tempo de incubação do agente terapêutico anti-CD40 com as células na amostra biológica de teste; e onde aplicável, a concentração de uma molécula estimuladora, por exemplo, CD40L, CD40L solúvel, ou um seu fragmento ou variante estimuladora, a ser posto em contacto com a amostra biológica de teste; e, se for caso disso, o tempo de incubação da molécula estimuladora das células na amostra de biológica de teste. A determinação destes factores pode ser realizada pelos peritos na técnica com base em variáveis tais como o tipo de amostra biológica a ser testada, o tamanho do recipiente de armazenagem, o volume de liquido no recipiente, e a composição química do agente terapêutico anti-CD40 (isto é, tamanho, carga, e semelhantes) a ser testado. 67

Num exemplo, uma amostra biológica de teste ou subamostra, compreendendo um número adequado de células que expressam CD40, é adicionada a uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. 0 número adequado de células é um número de células que permita detectar uma alteração numa ou mais das atividades mediadas por CD40 (isto é, a proliferação celular e sobrevivência celular, o nivel de apoptose, as vias de sinalização CD40) utilizando um ou mais dos métodos de detecção aqui descritos. 0 número adequado de células situa-se entre cerca de 1 e cerca de lxlO6 células por poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços. Após a adição das células à placa de cultura de tecidos, as células podem ser pré-incubadas entre cerca de 0 a cerca de 96 horas antes de pôr as células em contacto com o agente terapêutico anti-CD40. As células são pré-incubadas com uma molécula estimuladora de CD40 como notado acima.

Uma quantidade eficaz de um agente terapêutico anti-CD40, é adicionada às células da amostra biológica de teste para fornecer a regulação de uma atividade mediada por CD40 de interesse (ou seja, CD40L mediado por sinalização de CD40, a atividade ADCC de um agente que se liga a CD40, ou ambos) de tal forma que a regulação seja detectável utilizando um ou mais métodos de detecção descritos noutras partes deste documento. A quantidade eficaz estará, evidentemente, dependente do agente terapêutico anti-CD40, a ser testado. Geralmente, uma quantidade eficaz de um agente terapêutico anti-CD40 está entre cerca de 1 nM a cerca de 10 mM do agente por poço de uma placa de 96 poços. O agente terapêutico anti-CD40 é um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 monoclonal totalmente humano, ou um fragmento de ligação ao antigénio dos mesmos, e a quantidade eficaz é de cerca de 0,01 pg/ml 68 a cerca de 30 yg/ml, incluindo cerca de 0,01 yg/ml, 0,1 yg/ml, 0,5 pg/ml, 1 yg/ml, 5 yg/ml, 10 μg/ml, 20 yg/ml, e 30 yg/ml, e outros tais valores entre cerca de 0,01 yg/ml e cerca de 30 yg/ml. As células no seio da amostra biológica teste ou uma sua subamostra são deixadas a incubar por um período de tempo adequado para permitir que o agente terapêutico anti-CD40 interaja com as células e gere uma ou mais respostas biológicas. O tempo de incubação preferido entre o agente terapêutico anti-CD40 e as células da amostra biológica de teste ou uma subamostra da mesma é entre cerca de 1 minuto até cerca de 48 horas. Em outras formas de realização, o tempo de incubação é de cerca de 20 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 4 horas, cerca de 12 horas, cerca de 22 horas, ou cerca de 24 horas. A amostra biológica (s) que serve (s) como o teste e as amostras biológicas de controlo podem ser qualquer conjunto de células, tecido ou fluido corporal que compreende células que expressam o antigénio CD40. Exemplos de tais amostras biológicas incluem, mas não estão limitadas a, sangue, linfa, amostras de tecido, manchas e semelhantes. As amostras biológicas podem ser recolhidas a partir de um sujeito candidato utilizando qualquer procedimento aceitável na técnica, por exemplo, através de uma agulha de aspiração de fluidos corporais, remoção de uma amostra de tecido, e semelhantes. Quando uma amostra biológica deve ser armazenada antes do teste, a amostra biológica pode ser transferida para uma lâmina de vidro ou pode ser congelada para posterior preparação ou imediatamente colocada numa solução fixadora. 69

Como observado anteriormente, a detecção do bio marcador de interesse ao nível da proteína ou de nucleótideos pode ser realizada utilizando qualquer método de detecção conhecido pelos peritos na técnica. Por " expressão de detecção" ou "detecção do nível de" entende-se a determinação da quantidade ou da presença de um bio marcador de proteína ou gene na amostra biológica. Assim, "a expressão de detecção" abrange situações em que um bio marcador é determinado para não ser expresso, para não ser expresso de forma detectável, expresso a um nível baixo, expresso a um nível normal, ou sobre expresso. A fim de determinar o efeito de um agente terapêutico anti-CD40 em CD40L mediado por sinalização de CD40, uma amostra biológica de teste compreendendo células que expressam CD40 que foram estimuladas com um ligando de CD40 (quer in vivo ou ex vivo) é posta em contacto com o agente terapêutico anti-CD40 durante um tempo suficiente para permitir que o agente terapêutico exerça uma resposta celular, e então o nível de expressão de um ou mais bio marcadores de interesse em que a amostra biológica de teste é comparada com o nível de expressão na amostra biológica de controle que não foi posta em contacto com o agente terapêutico anti-CD40. Em alguns exemplos, a amostra biológica de controlo de células é posta em contacto com uma substância neutra ou um controlo negativo, que não interfere com CD40L mediado por sinalização de CD40. Por exemplo, uma imunoglobulina não específica, por exemplo IgGl, que não se liga ao CD40 serve como controlo negativo. A detecção pode ocorrer ao longo de um curso de tempo para permitir a monitorização das alterações em bio marcadores ao longo do tempo. A detecção também pode ocorrer com a exposição a diferentes concentrações de agente terapêutico anti-CD40, para gerar uma curva de "dose-resposta" para qualquer bio marcador de interesse. 70

Os métodos para a detecção da expressão dos bio marcadores e, opcionalmente, marcadores de citoquinas, em amostras de teste e de controlo biológico incluem quaisquer métodos que determinam a quantidade ou a presença dos marcadores, quer a nivel do ácido nucleico ou da proteina. Tais métodos são bem conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limitados a western blots, Northern blots, ELISA, imunoprecipitação, imunofluorescência, citometria de fluxo, imuno-histoquimica, técnicas de hibridação de ácidos nucleicos, métodos de transcrição reversa de ácidos nucleicos e métodos de amplificação de ácidos nucleicos. Em exemplos particulares, a expressão de um bio marcador é detectada num nivel de proteina utilizando, por exemplo, os anticorpos que são dirigidos contra as proteinas de bio marcadores especificos. Estes anticorpos podem ser usados em vários métodos, tais como Western blot, ELISA, tecnologias de multiplexagem, imunoprecipitação, ou técnicas de imuno-histoquimica. Em alguns exemplos, a detecção de marcadores de citocinas é realizado por electroquimioluminescência (ECL). Qualquer um destes métodos de detecção de bio marcadores e, opcionalmente, marcadores de citocinas podem ser combinados com a avaliação de informações clinicas, métodos convencionais de prognóstico, expressão de outros factores relacionados com o CD40, particularmente a expressão de superfície celular de CD40 e/ou CD40L e niveis circulantes de CD40 solúvel e/ou CD40L, e a expressão de, ou na presença de, marcadores de prognóstico clinicamente úteis conhecidos na técnica, incluindo, mas não limitado a, aqueles aqui referidos acima. Deste modo, os métodos descritos podem permitir a determinação mais precisa dos sujeitos candidatos cuja doença autoimune ou doença inflamatória beneficiariam da intervenção terapêutica com um agente terapêutico anti-CD40 aqui descrito. 71

Assim, um sujeito candidato com uma doença inflamatória ou doença autoimune ou que está associada com células que expressam CD40, é testado quanto à capacidade de resposta a um agente terapêutico anti-CD40 de interesse utilizando os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos, em que os efeitos do agente terapêutico, numa ou mais atividades mediadas por CD40 são avaliados. Onde um refinamento adicional do ensaio de prognóstico ex vivo é desejável, o sujeito candidato pode ser examinado para o nivel de expressão de, ou ausência de expressão de um ou mais factores relacionados com o CD40 identificados aqui acima, de um ou mais marcadores de prognóstico clinicamente úteis, incluindo os aqui identificados acima, ou ambos. Deste modo, uma amostra biológica que compreende células que expressam CD40 pode ser recolhida a partir de um sujeito candidato e avaliada para o nivel de expressão de, ou ausência de expressão do, factor relacionado com o CD40 (s) e/ou marcador de prognóstico clinicamente úteis de interesse. Qualquer amostra biológica que compreende células que expressam CD40, como aqui referido acima pode ser recolhida para estes ensaios de prognóstico. Além disso, qualquer método de detecção conhecidos pelos peritos na técnica pode ser usado para detectar o nivel de expressão ou ausência de expressão do factor relacionado com o CD40 e/ou marcador de prognóstico clinicamente útil de interesse, como mencionado neste documento.

Sempre que o nivel de expressão de um ou mais factores relacionados com CD40 é avaliado, a fim de identificar um sujeito que tem uma doença inflamatória ou doença autoimune que irá ser responsivo ao tratamento com um agente terapêutico anti-CD40, uma amostra biológica é recolhida a partir do sujeito, e o nivel de expressão em que a amostra 72 é comparada ao nível de expressão desse factor (ou factores), num controle de padrão ou referência. Para o nível de expressão da superfície celular CD40 e/ou superfície celular de CD40L, qualquer amostra biológica que compreende células que expressam CD40 e/ou células que expressam CD40L podem ser usadas como descrito aqui acima. Para níveis circulantes de sCD40 e/ou SCD40L, uma amostra de sangue ou uma amostra que compreende um componente do sangue, tais como plasma ou soro pode ser obtida a partir do sujeito candidato. Por "controlo" ou "padrão de referência" entende-se um padrão que é da mesma fonte biológica (isto é, tecido ou fluido corporal) e que a distingue indivíduos com a doença inflamatória ou doença autoimune de indivíduos saudáveis que não são afectados com a doença. Um perito na técnica pode proporcionar um padrão de referência por uma medição dos níveis de expressão destes factores relacionados com o CD40 (isto é, superfície celular CD40, superfície celular de CD40L, sCD40, SCD40L) em indivíduos saudáveis que não possuem a doença e os sujeitos que têm a doença, controlados para a idade, sexo, raça, e semelhantes, e comparando os níveis de expressão para determinar o nível padrão de expressão que se espera num indivíduo saudável. Em alguns exemplos, o nível de expressão em que o candidato sujeito com a doença autoimune ou inflamatória é, pelo menos, de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% maior do que o nível de expressão no padrão de referência. Reconhece-se que a aplicação do tratamento com um agente terapêutico anti-CD40 pode ser avaliada através da detecção do nível de expressão de um ou mais destes factores relacionados com o CD40, em que um aumento do nível de expressão, numa amostra biológica em relação ao padrão de referência é suficiente para demonstrar que o sujeito tem uma doença inflamatória ou autoimune que vai ser responsivo ao tratamento com o 73 agente terapêutico anti-CD40 de interesse, sem ter de fazer o rastreio adicional para os efeitos ex vivo do agente terapêutico anti-CD40 sobre as atividades de CD40 mediadas, tais como a sobrevivência e proliferação celular e/ou atividade ADCC.

Também são aqui revelados kits para realizar os ensaios de prognóstico ex vivo da presente invenção. Por exemplo, o kit pode compreender um composto marcado ou agente capaz de detectar um bio marcador aqui descrito, por exemplo, um bio marcador da apoptose, proliferação ou sobrevivência celular, ou CD40L mediado por vias de sinalização de CD40, quer ao nivel da proteína ou do ácido nucleico, numa amostra biológica, e meios para determinar a quantidade do bio marcador na amostra (por exemplo, um anticorpo ou uma sonda oligonucleotídica que se liga ao ARN que codifica para um bio marcador de interesse) a seguir à incubação da amostra com um agente terapêutico anti-CD40 de interesse. Os kits podem ser embalados para permitir a detecção simultânea de vários bio marcadores de interesse, incluindo os compostos ou agentes individuais marcados capazes de detectar cada bio marcador particular de interesse e meios para determinar a quantidade de cada bio marcador na amostra. Os kits podem também incluir instruções para o tratamento de um sujeito quando o ensaio de prognóstico ex vivo gera um resultado que é indicativo de um resultado positivo do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40.

Para os kits baseados em anticorpos, o kit pode compreender, por exemplo: (1) um primeiro anticorpo (por exemplo, ligado a um suporte sólido) que se liga a um bio marcador de interesse; e, opcionalmente, (2) um segundo anticorpo diferente que se liga ao bio marcador ou ao 74 primeiro anticorpo e é conjugado a um agente detectável. Para os kits baseados em oligonucleótideo, o kit pode compreender, por exemplo: (1) um oligonucleótideo, por exemplo, um oligonucleótideo marcado de forma detectável, que hibridiza com uma sequência de ácido nucleico que codifica o bio marcador ou (2) um par de iniciadores úteis para a amplificação de uma molécula de ácido nucleico que codifica o bio marcador de interesse. 0 kit também pode compreender, por exemplo, um agente de tampão, um conservante ou um agente estabilizador de proteina. 0 kit pode também incluir os componentes necessários para a detecção do agente detectável (por exemplo, uma enzima ou um substrato) . 0 kit também pode conter uma amostra de controlo ou uma série de amostras de controlo que podem ser ensaiadas e comparadas com a amostra de teste contida. Cada componente do kit é geralmente fechado dentro de um recipiente individual e todos os diversos recipientes estão dentro de um único pacote, juntamente com instruções para observar se o sujeito testado é um candidato para o tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. Métodos de Detecção

Qualquer meio para identificar e quantificar especificamente um bio marcador, marcador de citocina, ou proteina com factor relacionado com CD40 de interesse (por exemplo, um bio marcador da sobrevivência celular ou proliferação, um bio marcador da apoptose, um bio marcador de CD40L mediado por via de sinalização de CD40, CD40 ou CD40L solúvel circulante, superfície celular CD40 ou CD40L, ou um marcador de prognóstico clinicamente útil) na amostra biológica de um sujeito candidato está contemplado. Assim, o nível de expressão de um bio marcador de proteína de interesse numa amostra biológica é detectado por meio de uma proteína de ligação capaz de interagir especificamente 75 com esse bio marcador de proteína ou um seu variante biologicamente ativo. De preferência, podem ser utilizados os anticorpos marcados, porções de ligação dos mesmos, ou outros parceiros de ligação. A palavra "marcador" quando aqui utilizado refere-se a um composto ou composição que é conjugada direta ou indiretamente com o anticorpo de modo a gerar um anticorpo "marcado" detectável. 0 marcador pode ser detectável por si próprio (por exemplo, etiquetas de radioisótopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto de substrato ou composição que é detectável. Os anticorpos para a detecção de um bio marcador de proteína podem ser monoclonais ou policlonais na origem, ou podem ser produzidos sinteticamente ou de forma recombinante. A quantidade de proteína complexada, por exemplo, a quantidade de bio marcador de proteína associado com a proteína de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente ao bio marcador de proteína, é determinada utilizando metodologias de detecção de proteínas padrão conhecidas dos peritos na técnica. Uma revisão detalhada da concepção do ensaio imunológico, teoria e protocolos pode ser encontrada em numerosos textos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel et al. Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology) (Greene Publishing e Wiley-Interscience, NY)); Coligan et al., Eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., New York, NY).

Uma variedade de ensaios está disponível para a detecção de proteínas com anticorpos marcados. Num ensaio de uma etapa, a proteína alvo de interesse a ser detectada, se estiver presente, é imobilizada e incubada com um anticorpo marcado. 0 anticorpo marcado liga-se à molécula da proteína 76 alvo imobilizada. Após lavagem para remover as moléculas não ligadas, a amostra é ensaiada para a presença da marcação. Num formato padrão, uma única proteína é testada por amostra. Usando novas tecnologias de multiplex, proteínas múltiplas podem ser analisadas numa amostra única, utilizando marcações diferentes para cada anticorpo de detecção.

Num ensaio de duas etapas, a molécula imobilizada de proteína alvo de interesse é incubada com um anticorpo não marcado. 0 complexo anticorpo-proteína alvo não marcado, se presente, é, então, ligado a um segundo anticorpo marcado que seja específico para o anticorpo não marcado. A amostra é lavada e ensaiada para a presença da marcação. A escolha do marcador usado para marcar os anticorpos irá variar dependendo da aplicação. No entanto, a escolha do marcador é facilmente determinável para um perito na técnica. Estes anticorpos marcados podem ser utilizados em imunoensaios, bem como em aplicações histológicas para detectar a presença de qualquer bio marcador ou proteína de interesse. Os anticorpos marcados podem ser policlonais ou monoclonais. Além disso, os anticorpos para utilização na detecção de uma proteína de interesse podem ser marcados com um átomo radioativo, uma enzima, uma porção cromófora ou fluorescente, ou uma marcação colorimétrica como aqui descrito. A escolha de uma etiqueta de marcação também dependerá das limitações na detecção desejadas. Os ensaios enzimáticos (ELISA) tipicamente permitem a detecção de um produto de cor formado pela interação do complexo de enzima marcada com um substrato de enzima. Os radionuclídeos que podem servir como marcadores detectáveis incluem, por exemplo, 1-131, 1-123, 1-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, 77

Cu-67, Bi-212 e Pd-109. Exemplos de enzimas que podem servir como marcadores detectáveis incluem, mas não estão limitados a, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase e glucose-6-fosfato desidrogenase. Radicais cromóforos incluem, mas não estão limitados a, fluoresceina e rodamina. Os anticorpos podem ser conjugados com estas marcações, por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as enzimas e moléculas cromóforas podem ser conjugadas com os anticorpos, por meio de agentes de acoplamento, tais como dialdeidos, carbodiimidas, dimaleimidas, e semelhantes. Em alternativa, a conjugação pode ocorrer através de um par ligando-receptor. Exemplos de pares ligando-receptor adequados são a biotina-avidina ou biotina-estreptavidina, e o anticorpo-antigénio.

Em alguns exemplos, a presente descrição contempla a utilização de uma técnica de sanduíche para a detecção de um ou mais bio marcadores, ou outras proteínas de interesse, como notado aqui acima, em soro e outros fluidos biológicos. Como descrito na Publicação Internacional WO 93/09437, uma tal técnica utiliza dois anticorpos capazes de se ligarem à proteína de interesse: por exemplo, um dos quais está livre em solução mas marcado com um composto químico detectável, e o outro das quais é imobilizado num suporte sólido. Exemplos de marcadores químicos que podem ser utilizados para o segundo anticorpo incluem, mas não estão limitados a, radioisótopos, compostos fluorescentes e enzimas ou outras moléculas que produzem produtos coloridos ou electroquimicamente ativos quando expostos a um reagente ou substrato enzimático. Quando as amostras contendo o bio marcador ou outra proteína de interesse são colocadas neste sistema, o bio marcador ou outra proteína de interesse liga-se tanto ao anticorpo imobilizado como ao anticorpo 78 marcado. 0 resultado é um complexo imune em "sanduíche" na superfície do suporte. A proteína complexada é detectada através da remoção de componentes de amostra não ligados e excesso de anticorpo marcado e medindo a quantidade de anticorpo marcado complexado com a proteína na superfície do suporte. 0 imunoensaio em sanduíche é altamente específico e sensível, desde que sejam utilizadas marcações com bons limites de detecção.

As amostras biológicas podem ser pesquisadas individualmente; em alternativa, numerosas amostras de fluidos biológicos, podem ser rastreadas, ao mesmo tempo, por exemplo, usando o formato convencional de microtitulação de 96 poços, o que é amplamente utilizado e facilmente automatizável. Existem também vários espectrómetros comercialmente disponíveis ("leitores de placas") para a análise calorimétrica de placas de 96 poços. Além disso, as amostras biológicas podem ser rastreadas para um bio marcador ou marcadores múltiplos, por exemplo, um painel de bio marcadores, utilizando métodos bem conhecidos na técnica.

Em exemplos preferidos, a expressão de um ou mais bio marcadores ou outras proteínas de interesse dentro de uma amostra biológica, por exemplo, uma amostra de fluido corporal, é detectada por radioimunoensaio ou imunoensaios ligados a enzima (ELISA), imunoensaios ligados a enzima de ligação competitiva, ponto blot (ver, por exemplo, Promega Protocols and Applications Guide (2a ed; Promega Corporation (1991), Western Blot (ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, vol. 3, Capítulo 18 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY), cromatografia, preferencialmente 79 cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), ou outros ensaios conhecidos na técnica. Assim, os ensaios de detecção podem envolver etapas, tais como, mas não limitados a, imunotransferência, imunodifusão, imunoelectroforese, ou imunoprecipitação.

Para qualquer dado ensaio de proteína de detecção, a amostra biológica, ou uma sua subamostra, compreendendo as células que expressam o CD40, é contactada com o parceiro de ligação, por exemplo, o anticorpo, ou anticorpo marcado de forma detectável, para o bio marcador ou outra proteína de interesse, por um tempo suficiente para permitir a formação de complexos antígeno-anticorpo, e, em seguida, a ligação do anticorpo é detectada, por exemplo, por qualquer meio, aqui mencionado acima. Os anticorpos e os anticorpos marcados de forma detectável para os bio marcadores, factores relacionados com o CD40, e marcadores de prognóstico clinicamente úteis aqui descritos são bem conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis. Ver, por exemplo, anticorpos específicos para marcadores da apoptose, sobrevivência celular, e vias de sinalização de CD40, bem como marcadores de prognóstico clinicamente úteis, disponíveis, por exemplo, a partir de Cell Signalinh Technology, Beverly, Massachusetts; Dako, Copenhaga, Dinamarca, e semelhantes. Alternativamente, anticorpos, ou formas marcadas de forma detectável destes anticorpos, podem ser gerado utilizando os métodos de produção de anticorpos bem conhecidas na técnica, e ainda descritos aqui a seguir.

Um certo número de kits de ensaio para bio marcadores de caspases estão comercialmente disponíveis. Por exemplo, o Homogeneous Caspases Assay (Roche Applied Sciences, 80

Indianapolis, Indiana), é um ensaio fluorimétrico para a determinação quantitativa in vitro da atividade da caspase em microplacas. 0 ensaio é particularmente útil para rastreio de alto rendimento, permitindo, por exemplo, 100 testes em placas de 96 poços, e 400 testes em placas de 384 poços (Cat. n° 3 005 372) . Este ensaio permite a detecção de várias caspases, incluindo caspase-2, caspase-3, caspase-7, e, em menor medida, caspase-6, caspase-8, caspase-9 e caspase-10, em amostras biológicas, incluindo, por exemplo, soro ou plasma. 0 ensaio de detecção de morte celular ELISAplus (Cat.n° 1 774 425, Roche Applied Sciences, Indianapolis, Indiana) baseia-se num principio de imunoensaio sanduíche de enzima quantitativo, utilizando anticorpos monoclonais de ratinho dirigidos contra o ADN e histonas, respectivamente. Este ensaio permite a detecção especifica e quantificação de mono e oligonucleosomes que são libertados no citoplasma das células que morrem por apoptose. Pode ser usado para uma variedade de amostras, incluindo lisados celulares, soro, sobrenadante de cultura e semelhantes. A PS da superfície celular pode ser detectada usando qualquer um dos reagentes de coloração de Anexina V comercialmente disponíveis, que se baseiam na afinidade elevada da anexina V para a PS. Ver, por exemplo, os reagentes de coloração de anexina V comercialmente disponíveis a partir de Roche Applied Science. Ao conjugar a FITC à anexina V, é possível identificar e quantificar as células apoptóticas numa base de célula única por citometria de fluxo. A coloração de células em simultâneo com anexina V-FITC (fluorescência verde) e o iodeto de propídio corante não vital (fluorescência vermelha) pode fornecer a discriminação de células intactas (FITC-PI), 81 apoptose precoce (FITC + PI-) e tardia e células apoptóticas ou necróticas (FITC + PI +).

Além disso, a apoptose elevada dentro de uma amostra biológica pode ser confirmada com os métodos baseados em ácidos nucleicos que detectam a fragmentação do ADN, que é caracteristico da apoptose. Quando resolvido usando eletroforese em gel de agarose, o ADN apoptótico inicialmente tem um padrão caracteristico em "escada", em oposição a uma mancha de ácidos nucleicos que é observada, por exemplo, em necrose ou outra degradação não especifica de ADN. Uma técnica histoquimica comum para a detecção fragmentação de ADN utiliza o ADN marcado na extremidade. Kits para tal estão disponíveis comercialmente, tal como o kit de fragmentação de ADN APOLERT (Clontech Laboratories, Inc., Paio Alto, Califórnia). Este ensaio baseia-se no terminal deoxinucleotidiltransferase (Tdt) mediado por dUTP de rotulagem de extremidade (TUNEL), onde Tdt catalisa a incorporação de fluoresceina-dUTP nas extremidades livres 3'-hidroxilo de ADN fragmentado em células em apoptose.

Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para detectar a produção de marcadores de citoquinas. Os ensaios padrão compreendem um formato de ELISA, em que uma citoquina é medida por amostra. Alternativamente, uma tecnologia mais sensivel é a electroquimioluminescência (ECL). Numa forma de realização, a produção de citoquinas é ensaiada utilizando ECL, por exemplo, utilizando um sistema de multi-matriz, tais como o sistema de Meso Scale Discovery® disponível comercialmente para ensaios de citoquina de alto desempenho (Meso Scale Discovery Gaithersburg, Maryland). Outros formatos que permitem a medição de citoquinas múltiplas (ou outros analitos) de uma 82 vez dentro de uma amostra incluem as tecnologias de multiplex. Um desses produtos é a tecnologia Luminex ® (Luminex Corporation, Austin, Texas), em que até 100 microesferas de código de cores revestidas com reagentes específicos para um bio ensaio em particular (tal como um anticorpo para uma citoquina) podem ser misturadas e analisadas usando tecnologia Lasar. A presença de um ou mais dos bio marcadores, citoquinas, factores relacionados com o CD40, e marcadores de prognóstico clinicamente úteis aqui descritos dentro de uma amostra biológica obtida a partir de um sujeito candidato também pode ser determinada ao nivel do ácido nucleico. Técnicas à base de ácidos nucleicos para avaliar a expressão são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, a determinação do nivel de bio marcadores mARNs numa amostra biológica. Muitos métodos de detecção de expressão utilizam ARN isoladamente. Qualquer técnica de isolamento de ARN que não selecione contra o isolamento de mARN pode ser utilizada para a purificação de ARN (ver, por exemplo, Ausubel et al., Ed. (1987-1999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, New York). Além disso, um grande número de amostras de tecido pode ser facilmente processado utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica, tal como, por exemplo, o processo para isolar ARN de um só passo divulgado na Patente US 4843155.

Assim, em alguns exemplos, a detecção de um bio marcador ou outra proteína de interesse é testada ao nível do ácido nucleico utilizando sondas de ácidos nucleicos. O termo "sonda de ácido nucleico" refere-se a qualquer molécula que é capaz de se ligar seletivamente a uma molécula específica 83 de ácido nucleico alvo, destinada, por exemplo, à transcrição de nucleótideos. As sondas podem ser sintetizadas por um perito na técnica, ou derivadas a partir de preparações biológicas adequadas. As sondas podem ser especificamente concebidas para ser marcadas, por exemplo, com um marcador radioativo, um marcador fluorescente, uma enzima, uma marca quimioluminescente, uma marca de colorimetria, ou outras marcas ou rótulos que são discutidas acima, ou que são conhecidos na técnica. Exemplos de moléculas que podem ser utilizadas como sondas incluem, mas não estão limitados a, ARN e ADN.

Por exemplo, o mARN isolado pode ser usado em ensaios de hibridação ou de amplificação, que incluem, mas não se limitam a, análises de Southern ou de Northern, análise de reação em cadeia da polimerase e matrizes de sondas. Um método para a detecção dos niveis de mARN envolve o contacto do mARN isolado com uma molécula de ácido nucleico (sonda) que pode hibridar com o ARNm codificado pelo gene a ser detectado. A sonda de ácido nucleico pode ser, por exemplo, um cADN de comprimento total, ou uma sua porção, tal como um oligonucleideo de pelo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleótideos de comprimento e suficiente para hibridar especificamente sob condições rigorosas com um mARN ou ADN genómico que codifica para um bio marcador, o factor relacionado com o CD40, ou marcador de prognóstico clinicamente útil aqui descrito acima. A hibridação de um mARN com a sonda indica que o bio marcador ou outra proteína alvo de interesse está a ser expressa.

Num exemplo, o mARN é imobilizado numa superfície sólida e em contacto com uma sonda, por exemplo, executando o mARN isolado num gel de agarose e transferindo o mARN do gel 84 para uma membrana, tal como nitrocelulose. Numa concretização alternativa, a sonda (s) são imobilizadas numa superfície sólida e o mARN é contactado com a sonda (s), por exemplo, numa matriz de chip de gene. Um perito na técnica pode prontamente adaptar métodos de detecção de mARN conhecidos para utilização na detecção do nível de mARN que codifica os bio marcadores ou outras proteínas de interesse.

Um método alternativo para a determinação do nível de um mARN de interesse numa amostra envolve o processo de amplificação de ácido nucleico, por exemplo, por RT-PCR (ver, por exemplo, Patente US 4683202), reação em cadeia da ligase (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:189-193), replicação de sequência autossustentada (Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874-1878), sistema de amplificação da transcrição (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173-1177), replicase Q-Beta (Lizardi et al. (1988) Bio/Technology 6:1197), círculo replicação de rolamento (Patente US 5854033) ou qualquer outro método de amplificação de ácidos nucleicos, seguido pela detecção das moléculas amplificadas utilizando técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção de moléculas de ácido nucleico se tais moléculas estiverem presentes em quantidades muito baixas. Em aspectos particulares da invenção, a expressão de bio marcadores, ou a expressão de um factor relacionado com o CD40, ou outro marcador de prognóstico clinicamente útil, é avaliada por RT-PCR fluorogénico quantitativo (ou seja, o sistema de TaqMan®). 85

Os níveis de expressão de um ARN de interesse podem ser controlados por meio de uma mancha de membrana (tal como utilizado na análise de hibridação de Northern, ponto, e assim por diante), ou micropoços, tubos de ensaio, geles, pérolas ou fibras (ou qualquer outro suporte sólido que compreende ácidos nucleicos ligados) . Ver as Patentes US 5770722, 5874219,5744305,5677195 e 5445934. A detecção de expressão pode também compreender a utilização de sondas de ácido nucleico em solução.

Num exemplo, são utilizadas micromatrizes para detectar a expressão de um ou mais bio marcadores, factores relacionados com o CD40, e/ou marcadores de prognóstico clinicamente úteis. As micromatrizes são particularmente bem adaptadas para este fim, por causa da reprodutibilidade entre as diferentes experiências. As micromatrizes de ADN fornecem um método para a medição simultânea dos níveis de expressão de um grande número de genes. Cada conjunto é constituído por um padrão reprodutível de sondas de captura ligadas a um suporte sólido. O ADN ou ARN marcado é hibridado com sondas complementares na matriz e, em seguida, detectados por varrimento de laser. As intensidades de hibridação para cada sonda da matriz são determinadas e convertidas para um valor quantitativo que representa os níveis de expressão génica relativos. Veja-se, as Patentes US 6040138, 5800992 e 6020135, 6033860 e 6344316. Matrizes de oligonucleótideos de alta densidade são particularmente úteis para a determinação do perfil de expressão de gene para um grande número de ARN numa amostra.

As técnicas para a síntese destas matrizes utilizando métodos de síntese mecânica são descritos em, por exemplo, 86 na Patente US 5384261. Apesar de uma superfície de disposição planar ser preferida, a matriz pode ser fabricada numa superfície de virtualmente qualquer forma, ou mesmo uma multiplicidade de superfícies. As matrizes podem ser péptidos ou ácidos nucleicos em contas, geles, superfícies poliméricas, fibras, tais como fibras ópticas, vidro ou de qualquer outro substrato adequado, ver as Patentes US 5770358,5789162, 5708153, 6040193 e 5800992.

As matrizes podem ser embaladas de modo a permitir o diagnóstico ou outra manipulação de um dispositivo de tudo incluído. Ver, por exemplo, as Patentes US 5856174 e 5922591.

Numa abordagem, o ARNm total isolado a partir da amostra é convertido em cARN marcado e depois hibridado com uma matriz de oligonucleótideos. Cada amostra é hibridada com uma matriz distinta. Os níveis de transcrição relativos podem ser calculados por referência aos controlos apropriados presentes na matriz e na amostra.

Agentes terapêuticos anti-CD40

Os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos podem ser utilizados para identificar indivíduos com uma doença inflamatória e/ou da doença autoimune associada com células que expressam CD40, que beneficiariam do tratamento com qualquer agente terapêutico anti-CD40 de interesse. De particular interesse são agentes terapêuticos anti-CD40 que modulam CD40L mediado por sinalização de CD40 e/ou modulam ADCC. Tais agentes terapêuticos anti-CD40 incluem, mas não estão limitados a, anticorpos antagonistas anti-CD40 que bloqueiam ou interferem com a sinalização mediada por CD40L e/ou modular a atividade de ADCC quando ligada a CD40, antagonistas de CD40L, incluindo anticorpos anti-CD40L, 87 formas mutadas de CD40L, que podem ligar-se a CD40, mas que não ativam a sinalização de CD40, CD40 solúvel, formas solúveis de proteínas de fusão compreendendo o CD40, e agentes farmacológicos que interrompem ou interferem com a interação CD40L-CD40 e/ou interferem com a sinalização de CD40, por exemplo, compostos de ligação de interrupção de CD40-CD40L divulgados na Publicação do Pedido de Patente US 20040067982. De particular interesse são os antagonistas de agentes terapêuticos anti-CD40, por exemplo, os anticorpos antagonistas anti-CD40 e anticorpos antagonistas anti-CD40L, ou os seus fragmentos de ligação ao antigénio deste, que servem para bloquear o CD40L mediado por sinalização de CD40, e agentes terapêuticos anti-CD40 que modulam ADCC, por exemplo, os anticorpos anti-CD40 e os fragmentos de ligação ao antigénio dos mesmos.

Anticorpos anti-CD40

Os anticorpos monoclonais para CD40 são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, as secções dedicadas a antigénio de células B em McMichael, ed. (1987 e 1989) Leukocyte Typing III e IV (Oxford University Press, Nova Iorque; Patentes US 5874082;5677165;6056959; WO 00/63395, Publicação Internacional WO 02/28905 e WO 02/28904; Gordon et al. (1988) J. Immunol. 140:1425; Valle et al. (1989)

Eur. J. Immunol. 19:1463; Clark et al. (1986) PNAS 83:4494;

Paulie et al. (1989) J. Immunol. 142:590; Gordon et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:1535; Jabara et al. (1990) J.

Exp. Med. Chem. 172:1861; Zhang et al. (1991) J. Immunol. 146:1836; Gascan et al. (1991) J. Immunol. 147:8;

Banchereau et al. (1991) Clin. Immuno. Spectrum 3:8; e Banchereau et al. (1991) Science 251:70. Outros anticorpos monoclonais anti-CD40 incluem, mas não estão limitados a, anticorpos anti-CD40 humanizados, tais como SGN-40 (Tai et al. (2004) Câncer Res. 64:2846-52; Patente US 6838261), que 88 é a forma humanizada do anticorpo anti-CD40 murino SGN-14 (Francisco et ai. (2000) Câncer Res. 60:3225-31) e os anticorpos agonistas e antagonistas descritos na Publicação do Pedido de Patente US 2004/0120948.

Num exemplo, os ensaios de prognóstico ex vivo são usados para examinar a adequação ou a eficácia do tratamento com anticorpos antagonistas anti-CD40. Anticorpos antagonistas anti-CD40 para utilização nos métodos incluem anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação ao antigénio dos mesmos que são capazes de se ligar especificamente ao antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana. Em algumas formas de realização, os anticorpos antagonistas anti-CD40 para uso nos métodos da presente invenção exibem uma forte afinidade de ligação de sítio único para o antigénio de superfície celular CD40. Tais anticorpos monoclonais exibem uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) para o CD40 de pelo menos 10“5 M, pelo menos 3 x 10“5 M, preferencialmente pelo menos 10“6 M a 10“7 M, mais preferencialmente pelo menos 10" 8 M a cerca de 10~12 M, medido usando um ensaio padronizado como o Biacore™. A análise Biacore é conhecida na técnica e são fornecidos pormenores no "BIAapplications Handbook". Métodos descritos em WO 01/27160 podem ser utilizados para modular a afinidade de ligação.

De particular interesse são os antagonistas de anticorpos anti-CD40, que são livres de atividade agonista significativa, tal como aqui acima definido, mas exibem atividade antagonista quando ligados ao antigénio CD40 em células humanas. Numa forma de realização da invenção, o anticorpo antagonista anti-CD40, é isento de atividade agonista significativa numa resposta das células B. Em 89 outro exemplo, o anticorpo antagonista anti-CD40, é isento de atividade agonista significativa em ensaios de mais do que uma resposta de células B (por exemplo, proliferação e diferenciação ou proliferação, diferenciação e produção de anticorpos). Os anticorpos anti-CD40 monoclonais adequados possuem regiões constantes humanas, de preferência também possuem regiões de estrutura parcialmente ou totalmente humanizadas; e mais preferencialmente são anticorpos totalmente humanos ou os fragmentos de ligação ao antigénio dos mesmos. Exemplos de tais anticorpos monoclonais são os anticorpos aqui designados como CHIR-5.9 e CHIR-12.12.

Os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 representam anticorpos antagonistas anti-CD40 para utilização nos métodos da presente revelação. Os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 são anticorpos monoclonais anti-CD40 inteiramente humanos do isótipo IgGi produzido a partir das linhas celulares de hibridoma 131.2F8.5.9 (aqui referida como a linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6. 12,12 (aqui referida como a linha celular 12.12). Estas linhas celulares foram criadas usando esplenócitos de ratinhos xenotipicos imunizados contendo a IgGi humana, um locus de cadeia pesada e o locus de cadeia κ humana (tecnologia XenoMouse®; Abgenix, Fremont, Califórnia). As células do baço foram fundidas com as células SP2/0 do mieloma do rato (Sierra BioSource). Os hibridomas resultantes foram sub-clonados por diversas vezes para criar as linhas celulares monoclonais estáveis 5.9 e 12.12. Outros anticorpos da invenção podem ser preparados de forma semelhante utilizando ratinhos transgénicos para loci de imunoglobulinas humanas ou por outros métodos conhecidos na técnica e/ou descritos aqui. 90 São divulgadas as sequências de nucleótideos e de aminoácidos das regiões variáveis do anticorpo CHIR-12.12, e as sequências de aminoácidos das regiões variáveis do anticorpo CHIR-5.9. Mais particularmente, as sequências de aminoácidos para as regiões lider, variáveis e constantes de cadeia leve e de cadeia pesada para o mAb CHIR-12.12 estão estabelecidas na SEQ ID n°: 2 (sequência completa da cadeia leve do mAb CHIR-12.12), SEQ ID n°: 4 (sequência completa para a cadeia pesada para o mAb CHIR-12.12), e SEQ ID n°: 5 (sequência completa de uma variante da cadeia pesada para o mAb CHIR-12.12 apresentada na SEQ ID n° : 4, em que a variante compreende uma substituição de serina para o residuo alanina na posição 153 da SEQ ID n°: 4). As sequências de nucleótideos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada para o mAb CHIR-12.12 estão estabelecidas na SEQ ID n°: 1 (sequência de codificação para a cadeia leve para o mAb CHIR-12.12), e SEQ ID n°: 3 (sequência de codificação para a cadeia pesada para o mAb CHIR-12.12). As sequências de aminoácidos para as regiões lider, variáveis e constantes de cadeia leve e de cadeia pesada do mAb CHIR-5.9 estão estabelecidas na SEQ ID n°: 6 (sequência completa da cadeia leve do mAb CHIR-5.9), SEQ ID n°: 7 (sequência completa para a cadeia pesada do mAb CHIR-5.9), e SEQ ID n°: 8 (sequência completa de uma variante da cadeia pesada do mAb CHIR-5.9 apresentada na SEQ ID n°: 7, em que a variante compreende uma substituição de serina para o residuo alanina na posição 158 da SEQ ID n°: 7) . Além disso, hibridomas expressando anticorpos CHIR 5,9 e CHIR 12,12 foram depositados na ATCC com a designação de depósito de patente PTA-5542 e PTA-5543, respectivamente.

Em adição à atividade antagonista, os anticorpos anti-CD40 para utilização nos métodos da presente divulgação podem 91 ter um outro mecanismo de ação contra uma célula de tumor. Por exemplo, os anticorpos nativos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 têm atividade ADCC. Alternativamente, as regiões variáveis dos anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 podem ser expressas em outro isótipo de anticorpo que tem uma atividade ADCC.

Também é possivel conjugar formas nativas, formas recombinantes ou fragmentos de ligação ao antigénio de CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 a uma citotoxina, um agente terapêutico, ou um ião de metal radioativo ou radioisótopos, como aqui referido abaixo.

Os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 ligam CD40 solúvel em ensaios do tipo ELISA, evitam a ligação de CD40 ao ligando da superfície celular de CD40 e deslocam o ligando pré-ligado de CD40, tal como determinado por ensaios de citometria de fluxo. Os anticorpos CHIR-5.9 e CHIR-12.12 competem um com o outro para a ligação a CD40, mas não com ο 15B8, o anticorpo monoclonal anti-CD40 descrito no Pedido Internacional PCT1US01/30857 publicado como WO 02/28904, intitulado "Human Anti-CD40 Antibodies", apresentado em 2 de Outubro de 2001 (Processo n° PP16092.003). Quando testados in vitro para efeitos sobre a proliferação de células B de seres humanos normais, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 agem como anticorpos antagonistas anti-CD40. Além disso, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 não induzem forte proliferação de linfócitos humanos em indivíduos normais. Estes anticorpos são capazes de matar as células alvo que expressam CD40 através de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). A afinidade de ligação de CHIR-5.9 para o CD40 humano é 1.2xl0“8 M e a afinidade de ligação de CHIR-12.12 é 5xlO"10 M, tal como determinado pelo ensaio Biacore™. 92

Outros antagonistas de anticorpos anti-CD40 que partilham as caracteristicas de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 acima descritos incluem, mas não estão limitados ao seguinte: (1) os anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas celulares de hibridoma designadas 131.2F8.5.9 (aqui referida como a linha celular 5.9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (aqui referida como a linha celular 12.12), depositadas na ATCC como o Depósito de Patente n° PTA-5542 e Depósito de Patente n° PTA-5543, respectivamente; (2) um anticorpo monoclonal que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo na sequência apresentada em SEQ ID n°: 2, a sequência mostrada em SEQ ID n°: 4, a sequência mostrada em SEQ ID n°: 5, ambas as sequências apresentadas na SEQ ID n°: 2 e SEQ ID n°: 4, e ambas as sequências apresentadas na SEQ ID n°: 2 e SEQ ID n°: 5; (3) um anticorpo monoclonal compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste da sequência mostrada em SEQ ID n°: 6, a sequência mostrada em SEQ ID n°: 7, a sequência apresentada na SEQ ID n°: 8, ambas as sequências apresentadas na SEQ ID n°: 6 e SEQ ID n°: 7, e ambas as sequências apresentadas na SEQ ID n° : 6 e SEQ ID n° : 8; (4) um anticorpo monoclonal tendo uma sequência de aminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleótideos selecionada a partir do grupo consistindo na sequência de nucleótideos apresentada na SEQ ID n°: 1, a sequência de nucleótideos apresentada em SEQ ID n°: 3, e ambas as sequências apresentadas na SEQ ID n°: 1 e SEQ ID n°: 3; (5) um anticorpo monoclonal que se liga a um epiopo capaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linha celular de hibridoma 5.9 ou pela linha celular de hibridoma 12.12; (6) um anticorpo monoclonal que liga a um epítopo compreendendo os residuos 82-87 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID n°: 10 ou SEQ ID n°: 12; (7) um 93 anticorpo monoclonal que compete com o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 num ensaio de ligação competitiva; e (8) um anticorpo monoclonal que é um fragmento de ligação ao antigénio do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou os anticorpos monoclonais que precedem nos itens anteriores (1)-(7), onde o fragmento conserva a capacidade de se ligar especificamente ao antigénio CD40 humano.

Os peritos na técnica reconhecem que os anticorpos e fragmentos de ligação ao antigénio destes anticorpos aqui descritos incluem anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antigénio que são produzidos de forma recombinante utilizando métodos bem conhecidos na técnica e aqui descritos a seguir, e incluem, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12, que foram produzidos de forma recombinante.

Anticorpos antagonistas anti-CD40 adicionais incluem os anticorpos monoclonais referidos como 5D12, 3A8 e 3C6, que são segregados por um hibridoma com o número de acesso ATCC HB 11339, HB 12024 e HB 11340, respectivamente. Ver, por exemplo, Patente US 6315998.

Outros antagonistas de anticorpos anti-CD40 são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, o anticorpo anti-CD40 humano produzido pelo hibridoma designado F4-465 divulgado na Publicação de Pedidos de Patente 20020142358 e 20030059427. F4-465 foi obtido a partir do rato HAC (Kuroiwa et al. (2000) Nature Biotech. 10:1086 (2000 )) e, por conseguinte, expressa a cadeia leve lambda humana. 94

Anticorpos antagonistas Anti-CD40L

Anticorpos que se ligam a CD40L e, assim, interferem com a interação de CD40/CD40L ou CD40L mediado por sinalização de CD40 são conhecidos na técnica. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos na Publicação Internacional WO 95/06666. Os exemplos específicos incluem, mas não estão limitados a antagonistas de anticorpos anti-CD40L designados 89-76 e 24-31, que são produzidos pelos hibridomas 89-76 e 24-31, respectivamente, depositados na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University

Blvd., Manassas, Va. 20110-2209, e atribuido o Número de Acesso ATCC HB 11713 e HB 11712, respectivamente.

Produção de Anticorpos

Os anticorpos, por exemplo, os anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui descritos e qualquer anticorpo que se liga especificamente a um bio marcador ou outro marcador de prognóstico clinicamente útil de interesse, podem ser produzidos utilizando qualquer método de produção de anticorpos conhecido dos peritos na técnica. Assim, os soros policlonais podem ser preparados por métodos convencionais. Em geral, uma solução contendo o antigénio de interesse, por exemplo, o antigénio CD40 ou antigénio CD40L, é utilizado em primeiro lugar para imunizar um animal adequado, preferencialmente um ratinho, rato, coelho ou cabra. Os coelhos ou as cabras são preferidos para a preparação de soros policlonais devido ao volume de soro obtido, e a disponibilidade de anticorpos anti-coelho e anti-cabra marcados.

Os soros policlonais podem ser preparados de um animal transgénico, de preferência um rato tendo loci de imunoglobulinas humanas. Numa concretização preferida, as 95 células Sf9 que expressam a proteína de interesse, por exemplo, CD40 ou CD40L, são usadas como o imunogénio. A imunização pode também ser realizada misturando ou emulsionando a solução contendo o antigénio em soro fisiológico, preferencialmente num adjuvante tal como o adjuvante completo de Freund, e injetando a mistura ou emulsão parentericamente (geralmente subcutânea ou intramuscular). Uma dose de 50-200 yg/injeção é tipicamente suficiente. A imunização é geralmente impulsionada 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injeções da proteína em soro fisiológico, de preferência usando o adjuvante incompleto de Freund. Pode-se alternativamente gerar anticorpos pela imunização in vitro utilizando métodos conhecidos na técnica, que para os fins da presente invenção é considerado equivalente à imunização in vivo. Anti-soros policlonais são obtidos por sangria do animal imunizado para um recipiente de vidro ou de plástico, incubando o sangue a 25°C durante uma hora, seguida por incubação a 4°C durante 2-18 horas. O soro é recuperado por centrifugação (p. ex., 1000 x g durante 10 minutos) . Cerca de 20-50 ml por sangramento podem ser obtidos a partir de coelhos. A produção de células Sf9 (Spodoptera frugíperda), é divulgado na Patente US 6004552. No caso de CD40, resumidamente, as sequências que codificam para o CD40 humano foram recombinadas num baculovírus usando vectores de transferência. Os plasmídeos foram co-transfectados com o tipo selvagem do ADN de baculovírus em células Sf9. Células Sf9 recombinantes infectadas com baculovírus foram identificadas e purificadas por clonagem. 96

De preferência, o anticorpo é monoclonal na natureza. Por "anticorpo monoclonal", entende-se um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, ou seja, os anticorpos individuais que constituem a população são idênticos excepto quanto a possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. 0 termo não é limitado em relação à espécie ou fonte do anticorpo. 0 termo abrange imunoglobulinas inteiras assim como fragmentos, tais como Fab, F(ab')2, Fv e outros, que retêm a função de ligação ao antigénio do anticorpo. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio do antigénico; por exemplo, no caso dos anticorpos anti-CD40 ou anticorpos anti-CD40L, o antigénio de superfície celular CD40 ou antigénio da superfície celular CD40L, respectivamente. Além disso, em contraste com preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que incluem tipicamente diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antigénio. 0 modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogénea de anticorpos, e não deve ser entendido como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a ser utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou podem ser produzidos por métodos de ADN recombinante (ver, por exemplo, a Patente US 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpos de fagos, utilizando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; 97

Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. Biol. 222:581-597; e

Patente US 5514548.

Por "epítopo" entende-se a parte de uma molécula antigénica à qual um anticorpo é produzido e à qual o anticorpo se ligará. Os epítopos podem compreender resíduos lineares de aminoácidos (isto é, resíduos dentro do epítopo que estão dispostos sequencialmente um após o outro de um modo linear), os resíduos de aminoácidos não-lineares (aqui referidos como "epítopos não lineares", estes epítopos não estão dispostos sequencialmente), ou ambos os resíduos de aminoácidos lineares e não lineares.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando o método de Kohler et al. (1975) Nature 256:495-496, ou uma sua modificação. Tipicamente, um ratinho é imunizado com uma solução contendo um antigénio. A imunização pode ser realizada misturando ou emulsionando a solução contendo o antigénio em soro fisiológico, preferencialmente num adjuvante tal como o adjuvante completo de Freund, e injetando a mistura ou emulsão parentericamente. Qualquer método de imunização conhecido na técnica pode ser usado para obter os anticorpos monoclonais da invenção. Após a imunização do animal, o baço (e opcionalmente, vários nódulos linfáticos grandes) é removido e dissociado em células individuais. As células do baço podem ser rastreadas aplicando uma suspensão celular numa placa ou poço revestido com o antigénio de interesse. As células B expressando a membrana ligam a imunoglobulina específica para o antigénio que se liga à placa e não são enxaguados. As células B resultantes, ou todas as células dissociadas do baço, são então induzidas a fundir-se com células do mieloma para formar hibridomas, e são cultivadas num meio 98 seletivo. As células resultantes são plaqueadas por diluição em série e são ensaiadas quanto à produção de anticorpos que se ligam especificamente ao antigénio de interesse (e que não se ligam a antigénios não relacionados). 0 anticorpo monoclonal selecionado (mAb) que segrega hibridomas é então cultivado, quer in vitro (por exemplo, em garrafas de cultura de tecidos ou reatores de fibras ocas) , ou in vivo (como ascites em ratinhos) .

Quando os anticorpos, por exemplo, os anticorpos antagonistas anti-CD40 ou anticorpos antagonistas anti-CD40L, estão a ser preparados utilizando métodos de ADN recombinante, o ADN que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, por utilização de sondas de oligonucleótideo que são capaz de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesada e leve de anticorpos murinos). As células de hibridoma aqui descritas servem como uma fonte preferida de tal ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser colocado em vectores de expressão, que são então transfectados para células hospedeiras, tais como E. coli, células COS de simio, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que não produzem de outro modo a proteina imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisão sobre a expressão recombinante em bactérias de ADN que codifica o anticorpo incluem Skerra et al. (1993) Curr. Opinion in Immunol. 5:256 e Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130:151. Alternativamente, o anticorpo pode ser produzido numa linha celular tal como uma linha celular CHO, tal como descrito nas Patentes US 5545403; 5545405; e 5998144. Resumidamente a linha celular for transfectada com vectores capazes de 99 expressar uma cadeia leve e uma cadeia pesada, respectivamente. Por transfecção das duas proteínas em vectores separados, podem ser produzidos os anticorpos quiméricos. Outra vantagem é a glicosilação correta do anticorpo. 0 anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou fragmento de ligação ao antigénio do mesmo é produzido em células CHO utilizando o sistema de expressão do gene GS (Lonza Biologics, Portsmouth, New Hampshire), que utiliza a sintetase de glutamina como marcador. Veja também as Patentes US 5122464; 5591639; 5658759; 5770359; 5827739; 5879936; 5891693; e 5981216.

Além disso, os anticorpos podem ser anticorpos quiméricos, que possuem as caracteristicas de ligação desejadas. Assim, por exemplo, os anticorpos quiméricos anti-CD40 podem ter as caracteristicas de ligação dos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui descritos. Por anticorpos "quiméricos" entende-se anticorpos que são mais preferencialmente derivados utilizando técnicas recombinantes de ácido desoxirribonucleico e que compreendem tanto componentes humanos (incluindo espécies imunologicamente "relacionadas", por exemplo, chimpanzé) e não-humanos. Assim, a região constante do anticorpo quimérico é muito preferivelmente substancialmente idêntica à região constante de um anticorpo humano natural; a região variável do anticorpo quimérico é mais preferencialmente derivada de uma fonte não humana e tem a especificidade antigénica desejada para o antigénio de interesse, por exemplo, o antigénio CD40 ou CD40L. A fonte não humana pode ser qualquer fonte de vertebrado que possa ser usada para gerar anticorpos contra um antigénio humano ou material 100 compreendendo um antigénio CD40 humano. Tais fontes não humanas incluem, mas não estão limitados a, roedores (e g, coelho, rato, ratinho, etc. ver, por exemplo, Patente US 4816567 e primatas não-humanos (por exemplo, Macaco Old World, macaco, etc., ver, por exemplo, Patentes US 5750105 e 5756096) . Tal como aqui utilizada, a frase "imunologicamente ativo" quando utilizada em referência, por exemplo, aos anticorpos quiméricos anti-CD40 ou anticorpos quiméricos anti-CD40L, significa um anticorpo quimérico que se liga a CD40 humano ou a CD40L humano, respectivamente.

Por "humanizado" entende-se formas de anticorpos que contêm uma sequência minima derivada de sequências de imunoglobulinas não-humanas. Para a maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que residuos de uma região hipervariável (também conhecida como região determinante de complementaridade ou CDR) do receptor são substituidos por residuos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo do dador) tal como ratinho, rato, coelho ou um primata não humano, possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejada. A expressão "região determinante de complementaridade" refere-se a sequências de aminoácidos que em conjunto definem a afinidade de ligação e especificidade da região natural Fv de um sitio de ligação de imunoglobulina nativa. Ver, por exemplo, Chothia et al (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Kabat et al (1991), U.S. Dept. of Health and Human Services, NIH Publication n° 91-3242) . A expressão "região constante" refere-se à porção da molécula de anticorpo que confere as funções efectoras. Em trabalhos anteriores dirigidos para a produção de anticorpos não-imunogénicos para utilização em 101 terapia de doenças humanas, as regiões constantes de ratinho foram substituídas por regiões constantes humanas. As regiões constantes dos anticorpos humanizados dos sujeitos foram derivadas de imunoglobulinas humanas. No entanto, estes anticorpos humanizados ainda provocavam uma resposta imune indesejável e potencialmente perigosa em seres humanos e houve uma perda de afinidade. Os anticorpos humanizados, por exemplo, os anticorpos humanizados anti-CD40 para uso nos métodos da presente invenção têm características de ligação semelhantes às exibidas pelo anticorpo progenitor de interesse, por exemplo, os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui descritos. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), por substituição de CDRs de roedores ou mutantes de roedores ou sequências de CDR para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Veja também as Patentes US 5225539; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205. Em alguns casos, os resíduos entre as regiões de estrutura de uma ou mais regiões variáveis da imunoglobulina humana são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos (ver, por exemplo, Patentes US 5585089; 5693761; 5693762; e 6180370). Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo dador. Estas modificações são feitas para refinar mais o desempenho do anticorpo (por exemplo, para obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em 102 que todas ou substancialmente todas as regiões hipervariáveis correspondem às de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões estruturais são as de uma sequência de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc) , tipicamente a de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes veja Jones et al. (1986) Nature 331:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Assim, estes anticorpos "humanizados" podem incluir anticorpos em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos estruturais foram substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. Ver, por exemplo, as Patentes US 5225539; 5585089; 5693761; 5693762; 5859205. Veja também a Patente US 6180370, e a Publicação Internacional WO 01/27160, em que são divulgados os anticorpos humanizados e técnicas para a produção de anticorpos humanizados possuindo uma afinidade melhorada para o antigénio pré-determinado.

Os presentes métodos podem também ser praticados utilizando anticorpos xenogénicos ou modificados produzidos num hospedeiro não-humano mamífero, mais particularmente um ratinho transgénico, caracterizado por locus endógenos de imunoglobulina (Ig) inativados. Em tais animais transgénicos, os genes endógenos competentes para a expressão de subunidades leves e pesadas das imunoglobulinas do hospedeiro são tornados não-funcionais e 103 substituídos com os análogos loci de imunoglobulinas humanas. Estes animais transgénicos produzem anticorpos humanos na ausência substancial de subunidades de imunoglobulina hospedeiras leves ou pesadas. Ver, por exemplo, Patentes US 5877397 e 5939598.

Os anticorpos inteiramente humanos para CD40, por exemplo, são obtidos por imunização de ratinhos transgénicos. Um tal ratinho é obtido utilizando a tecnologia XenoMouse® (Abgenix, Fremont, Califórnia), e é revelada na Patentes US 6075181, 6091001, e 6114598. Para produzir os anticorpos aqui divulgados, ratos transgénicos para o lócus da cadeia pesada de Ig Gi humana e locus de cadeia leve κ humana foram imunizados com células Sf9 que expressam CD40 humano. Os ratos podem também ser transgénicos de outros isótipos. Anticorpos anti-CD40 inteiramente humanos úteis nos métodos da presente invenção são caracterizados por propriedades de ligação semelhantes às exibidas pelos anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui descritos.

Os fragmentos de um anticorpo particular de interesse, por exemplo, o anticorpo anti-CD40 ou o anticorpo anti-CD40L, são adequados para utilização nos métodos da invenção, desde que os mesmos mantenham a desejada afinidade do anticorpo de comprimento completo. Assim, por exemplo, um fragmento de um anticorpo anti-CD40 que conserva a capacidade de se ligar à superfície celular B do antigénio de CD40. Tais fragmentos são caracterizados por propriedades semelhantes do anticorpo de comprimento completo correspondente. Assim, por exemplo, um fragmento de um anticorpo antagonista anti-CD40 de comprimento completo irá ligar especificamente um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana, e é isenta de 104 atividade agonista significativa, mas exibe atividade antagonista quando ligada a um antigénio CD40 numa célula que expressa CD40 humano. Tais fragmentos são aqui referidos como "fragmentos de ligação ao antigénio".

Fragmentos de ligação ao antigénio de um anticorpo adequados compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento completo, geralmente a região de ligação ao antigénio ou variável do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, F (ab')2 e Fv e as moléculas de anticorpo de cadeia simples. Por "Fab" entende-se um fragmento monovalente de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina que é composto por uma cadeia leve e parte da cadeia pesada. Por F (ab')2 entende-se um fragmento bivalente de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina que compreende duas cadeias leves e parte de ambas as cadeias pesadas. Por "Fv de cadeia simples" ou fragmentos de anticorpo "sFv" entende-se fragmentos compreendendo os dominios de um anticorpo VH e VL, em que estes dominios estão presentes numa única cadeia polipeptidica. Ver, por exemplo, as Patentes US 4946778, 5260203, 5455030, e 5856456. Geralmente, o polipeptídeo Fv compreende ainda um ligante polipeptídico entre os dominios VH e VL que permite que que o sFv forme a estrutura desejada para ligação ao antigénio. Para uma revisão de sFv ver Pluckthun (1994) em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, ed. Rosenburg e Moore (Springer-

Verlag, Nova Iorque), pp 269-315. Fragmentos de ligação ao antigénio dos anticorpos antagonistas anti-CD40 aqui descritos também podem ser conjugados com uma citotoxina para efetuar a morte das células alvo, tal como aqui descrito abaixo. 105

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em, por exemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554 (1990) e Patente US 5514548. Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. Biol. 222:581-597 descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respetivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (intervalo nM) por baralhação de cadeia (Marks et al. (1992) Bio/Technology 10:779-783), bem como infeção combinatória e recombinação in vivo como estratégia para a construção de bibliotecas de fagos muito grandes (Waterhouse et al. (1993) Nucleic. Acids Res. 21:2265-2266). Assim, estas técnicas são alternativas viáveis às técnicas de hibridoma de anticorpo monoclonal tradicionais para isolamento de anticorpos monoclonais.

Diversas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al. (1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al. (1985) Science 229:81). No entanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir das bibliotecas de fagos de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente a partir de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167). De acordo com outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isolados 106 diretamente a partir de cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para o perito na técnica.

Antagonistas de anticorpos anti-CD40 para utilização nos métodos incluem os anticorpos monoclonais CHIR-5.9 e CHIR-12.12 aqui descritos assim como anticorpos que diferem deste anticorpo, mas retendo as CDR; e anticorpos com uma ou mais de adição de aminoácido (s) , deleção (ões) , ou substituição (ões), em que a atividade antagonista é medida pela inibição da proliferação de células B e/ou diferenciação. Também são englobados os anticorpos de-imunizados, particularmente os anticorpos antagonistas anti-CD40 de-imunizados, que podem ser produzidos tal como descrito em, por exemplo, as Publicações Internacionais WO 98/52976 e WO 0034317. Desta maneira, os residuos dentro dos anticorpos antagonistas anti-CD40 da invenção são modificados de modo a tornar os anticorpos não ou menos imunogénicos para os seres humanos, mantendo a sua atividade antagonista em relação às células que expressam o CD40 humano, em que esta atividade é medida por ensaios observados neste documento. Também estão incluídas as proteínas de fusão compreendendo um anticorpo de interesse, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40 ou um anticorpo antagonista anti-CD40L, ou um seu fragmento, cujas proteínas de fusão podem ser sintetizadas ou expressas a partir de vectores polinucleotidicos correspondentes, como é conhecido na especialidade. Tais proteínas de fusão são descritas com referência a conjugação de anticorpos, tal como referido aqui. 107

Qualquer anticorpo conhecido possuindo a especificidade de ligação de interesse pode ter variações de sequência produzidas utilizando métodos descritos em, por exemplo, Publicações de Patente EP 0983303 Al, WO 00/34317, e WO 98/52976. Por exemplo, demonstrou-se que as sequências dentro do CDR podem causar que um anticorpo se ligue a MHC da Classe II e vá desencadear uma resposta de células T auxiliares indesejada. Uma substituição conservativa pode permitir que o anticorpo retenha a atividade de ligação e ainda perca a sua capacidade de desencadear uma resposta de células T indesejada. Tais substituições conservativas ou não conservativas podem ser feitas usando métodos reconhecidos na técnica, tais como os mencionados aqui, e os anticorpos resultantes podem também ser utilizados nos métodos. Os anticorpos variantes podem ser rotineiramente testados para a atividade especifica, por exemplo, a atividade antagonista, afinidade e especificidade usando os métodos aqui descritos.

Onde o agente terapêutico anti-CD40 é um anticorpo antagonista anti-CD40, o anticorpo antagonista anti-CD40, produzido por qualquer um dos métodos acima descrito, ou qualquer outro método não aqui descrito, pode ser usado de uma maneira semelhante ao anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9, onde possui pelo menos uma das seguintes atividades biológicas: in vitro e/ou in vivo: inibição da secreção de imunoglobulinas por células B periféricas humanas normais estimuladas por células T; inibição da sobrevivência e/ou proliferação de células B periféricas humanas normais estimuladas por células que expressam CD40L ou ligando de CD40 solúvel (sCD40L); inibição da sobrevivência e/ou proliferação de células B periféricas humanas normais estimuladas por células T de Jurkat; inibição de sinais 108 intracelulares anti-apoptóticos "sobrevivência" em qualquer célula estimulada por sCD40L ou em fase sólida de CD40L; inibição de transdução de sinal de CD40, em qualquer célula em ligação com sCD40L ou fase sólida de CD40L, deleção, anergia e/ou indução de tolerância de células alvo portadoras de CD40 ou de células portadoras de ligandos cognatos para CD40 incluindo, mas não se limitando a, células T e células B, indução de expansão ou ativação de células T reguladoras CD4+CD25+ (ver, por exemplo, a rejeição do tecido dador especifico do aloantigénio via interferência de CD40-CD40L, van Maurik et al. (2002) J. Immunol. 169:5401-5404), por meio de qualquer mecanismo de citotoxicidade (incluindo, mas não limitado a, o anticorpo dependente da citotoxicidade mediada por células (ADCC), citotoxicidade dependente do complemento (CDC), sub-regulação da proliferação e/ou apoptose em células alvo), a modulação da célula alvo na secreção de citoquinas e/ou expressão da molécula de superfície celular, e suas combinações. Os ensaios para tais atividades biológicas podem ser realizadas tal como aqui e no Pedido de Patente Internacional PCT/US2004/037152 publicado como W02005/044854 (Processo n° PP20107.004 (035784/282916)), intitulado "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use”, apresentado em 4 de Movembro de 2004. Ver igualmente os ensaios descritos em Schultze et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204; Denton et al. (1998) Pediatr: Transplant. 2:6-15; Evans et al. (2000) J. Immunol. 164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22; Lederman et al. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86; Coligan et al. (1991) Current Protocols in Immunology 13:12; Kwekkeboom et al. (1993) Immunology 79:439-444; e Patentes US 5674492 e 5847082. 109

Um ensaio representativo para deteção de antagonistas de anti-CD40, anticorpos especificos para os epitopos do antigénio CD40 aqui identificados é um "ensaio de ligação competitiva." Ensaios de ligação competitiva são ensaios serológicos onde incógnitas são detetadas e quantificadas pela sua capacidade de inibir a ligação de um ligando marcado conhecido ao seu anticorpo específico Isto é também referido como um ensaio de inibição competitiva. Num ensaio de ligação competitiva representativo, o polipeptídeo CD40 marcado é precipitado por anticorpos candidatos numa amostra, por exemplo, em combinação com os anticorpos monoclonais criados contra um ou mais epitopos dos anticorpos monoclonais da invenção. Os anticorpos anti-CD40 que reagem especificamente com um epítopo de interesse podem ser identificados por rastreio de uma série de anticorpos preparados contra uma proteína CD40 ou o fragmento de proteína que compreende o epítopo particular da proteína CD40de interesse. Por exemplo, para o CD40 humano, os epitopos de interesse incluem epitopos que compreendem resíduos de aminoácidos lineares e/ou não lineares da isoforma curta do CD40 humano (ver acesso GenBank n° NP_690593) apresentada na SEQ ID n°: 10, codificadas pela sequência mostrada em SEQ ID n°: 9, ver também acesso GenBank NM_152854), ou da isoforma longa do CD40 humano (ver Acesso GenBank CAA43045 e NP_001241, estabelecido na SEQ ID n°: 12, codificada pela sequência apresentada na SEQ ID n°: 11, ver Acesso GenBank X60592 e NM_001250). Em alternativa, os ensaios de ligação competitiva com anticorpos antagonistas anti-CD40 adequados previamente identificados podem ser utilizados para selecionar os anticorpos monoclonais comparáveis aos anticorpos previamente identificados. 110

Os anticorpos utilizados em tais imunoensaios podem ser marcados ou não marcados. Os anticorpos não marcados podem ser utilizados em aglutinação; os anticorpos marcados podem ser utilizados numa grande variedade de ensaios, utilizando uma larga variedade de marcas. A deteção da formação de um complexo antigénio-anticorpo entre um anticorpo anti-CD40 e um epítopo de interesse pode ser facilitada, anexando uma substância detetável ao anticorpo. Meios de deteção adequados incluem a utilização de etiquetas, tais como radionuclideos, enzimas, coenzimas, substâncias fluorescentes, quimioluminescentes, cromogénios, substratos enzimáticos ou cofactores, inibidores de enzimas, complexos de grupos prostéticos, radicais livres, partículas, corantes e semelhantes. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, β-galactosidase, ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato, rodamina, fluoresceina diclorotriazinilamina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente é o luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem a luciferase, a luciferina, e a aequorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H. Tais reagentes marcados podem ser usados numa variedade de ensaios bem conhecidos, tais como radioimunoensaios, imunoensaios enzimáticos, por exemplo, ELISA, imunoensaios fluorescentes e similares. Ver, por exemplo, as Patentes US 3766162; 3791932; 3817837; e 4233402.

Qualquer um dos anticorpos anteriormente descritos, por exemplo, os anticorpos antagonistas anti-CD40 ou fragmentos 111 de anticorpo do mesmo, podem ser conjugados antes de serem utilizados nos métodos. Os métodos para produzir anticorpos conjugados são conhecidos na técnica. Assim, o anticorpo pode ser marcado usando marcação indireta ou uma abordagem de marcação indireta. Por "marcação indireta" e "abordagem de marcação indireta" entende-se que um agente quelante é ligado covalentemente a um anticorpo e pelo menos um radionuclideo é inserido no agente quelante. Ver, por exemplo, os agentes quelantes e os radionuclideos descritos em Srivagtava e Mease (1991) Nucl. Med. Bio. 18:589-603. Os marcadores adequados incluem fluoróforos, cromóforos, átomos radioativos (particularmente P e I), reagentes densos em eletrões, enzimas e ligandos possuindo parceiros de ligação específicos. As enzimas são tipicamente detetadas pela sua atividade. Por exemplo, a peroxidase de rábano é geralmente detetada pela sua capacidade de converter 3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) num pigmento azul, quantificável com um espectrofotómetro. "Parceiro de ligação específico" refere-se a uma proteína capaz de se ligar a uma molécula de ligando com alta especificidade, tal como por exemplo no caso de um antigénio e um anticorpo monoclonal específico, portanto. Outros parceiros de ligação específica incluem biotina e avidina ou estreptavidina, Ig G e proteína A e os inúmeros pares recetor-ligando conhecidos na técnica. Deve ser entendido que a descrição acima não pretende categorizar os vários marcadores em classes distintas, uma vez que o mesmo marcador pode servir em diversas modalidades diferentes. Por exemplo, o 125I pode servir como marcador radioativo ou como um reagente denso em eletrões. HRP pode servir como enzima ou como antígeno para um mAb. Além disso, pode-se combinar vários marcadores para o efeito desejado. Por exemplo, os mAbs e a avidina também necessitam de narcadores na prática da presente invenção: assim, um pode 112 marcar um mAb com biotina e detetar a sua presença com avidina marcada com 125I, ou com um mAb anti-biotina marcado com HRP. Outras permutações e possibilidades serão facilmente evidentes para os peritos na técnica, e são consideradas como equivalentes dentro do âmbito da presente invenção.

Alternativamente, um anticorpo de interesse, por exemplo, um anticorpo anti-CD40 pode ser marcado usando "marcação direta" ou uma "abordagem de marcação direta", em que um radionuclideo está ligado de forma covalente diretamente a um anticorpo (tipicamente através de um resíduo de aminoácido). Radionuclídeos preferidos são fornecidos em Srivagtava e Mease (1991) supra. A abordagem de marcação indireta é particularmente preferida. Ver também, por exemplo, as Publicações Internacionais WO 00/52031 e WO 00/52473, em que um ligante é usado para ligar um marcador radioativo a anticorpos e as formas marcadas de anticorpos anti-CD40 descritas na Patente US 6015542.

Variantes de Anticorpos

Os métodos podem ser realizados utilizando as variantes de um anticorpo conhecidas na técnica. Tais variantes retêm as propriedades de ligação desejadas do anticorpo progenitor. Assim, por exemplo, onde o agente terapêutico anti-CD40 a ser testado é um anticorpo antagonista anti-CD40, o anticorpo variante irá manter as propriedades de ligação do anticorpo progenitor antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo CHIR-12.12 ou CHIR-5.9. Os métodos para produzir as variantes de anticorpos estão geralmente disponíveis na técnicas. Embora a discussão seguinte se refira a variantes de um anticorpo antagonista anti-CD40, os métodos são 113 geralmente aplicáveis a qualquer anticorpo de interesse, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a um bio marcador ou marcador de prognóstico clinicamente útil aqui revelado.

Por exemplo, variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 aqui descrito, podem ser preparadas por mutações na sequência de ADN clonado que codifica para o anticorpo de interesse. Métodos de mutagénese e de alterações de sequências nucleotidicas são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nova Iorque); Patente US 4873192, e as referências ai citadas. Uma orientação quanto a substituições de aminoácidos adequados que não afetam a atividade biológica do polipeptideo de interesse pode ser encontrada no modelo de Dayhoff et al. (1978) no Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl Biomed. Res. Found., Washington, DC.). As substituições conservativas, tais como a troca de um aminoácido por outro com propriedades semelhantes, podem ser preferidas. Exemplos de substituições conservadoras incluem, mas não estão limitados a, Gly <=> Ala, Vai <=> Ile <=> Leu, Asp <=> Glu, Lys <=> Arg, Asn <=> Gin, e Phe <=> Trp<=> Tyr.

Na construção de variantes de um anticorpo de interesse, por exemplo, um anticorpo de polipéptideo antagonista anti-CD40 de interesse, as modificações são feitas de tal modo 114 que as variantes continuem a possuir a atividade desejada, isto é, a afinidade de ligação semelhante e, no caso de anticorpos antagonistas anti-CD40 são capazes de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula humana, e ser isenta de atividade agonista significativa, mas exibindo atividade antagonista quando ligados a um antigénio CD40 numa célula que expressa CD40 humano. Obviamente, todas as mutações efetuadas no ADN que codifica o polipeptídeo variante não devem colocar a sequência fora do quadro de leitura e preferivelmente não criarão regiões complementares que possam produzir estrutura de mARN secundária. Ver Pedido de Patente EP 75444. por ser de e que Fc

Além disso, a região constante de um anticorpo, exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40, pode mutada para alterar a função efectora de uma série maneiras. Por exemplo, veja a Patente US 6737056 BI Publicação do Pedido de Patente US 2004/0132101A1, descrevem mutações Fc que otimizam a ligação a recetores do anticorpo.

De preferência, as variantes de um anticorpo de referência, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40, têm sequências de aminoácidos que possuem pelo menos 70% ou 75% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 80% ou 85% de identidade de sequência, mais preferivelmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos para o anticorpo de referência, por exemplo, uma molécula de anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpo monoclonal CHIR-5.9 ou CHIR-12.12 aqui descrito, ou a uma porção inferior da molécula de anticorpo de referência. Mais 115 preferencialmente, as moléculas partilham pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência. A percentagem de identidade de sequência é determinada utilizando o algoritmo de pesquisa de homologia Smith-Waterman, utilizando uma pesquisa de lacuna afim com uma lacuna aberta de grande penalidade de 12 e uma penalidade de extensão de lacuna de 2, matriz BLOSUM de 62. 0 algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é ensinado em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482-489. Uma variante pode, por exemplo, diferir do anticorpo de referência, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40, por tão pouco como 1 a 15 resíduos de aminoácidos, tão pouco como 1 a 10 resíduos de aminoácidos, tais como 6-10, tão pouco como 5, tão pouco como 4, 3, 2, ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.

No que diz respeito ao alinhamento ótimo das duas sequências de aminoácidos, o segmento contíguo da sequência de aminoácidos variante pode ter resíduos de aminoácidos adicionais ou eliminr os resíduos de aminoácidos em relação à sequência de aminoácidos de referência. O segmento contíguo utilizado para comparação com a sequência de aminoácidos de referência irá incluir pelo menos 20 resíduos de aminoácidos contíguos e pode ser de 30, 40, 50 ou mais resíduos de aminoácidos. Correções para a identidade de sequência associada com substituições de resíduos conservadores ou lacunas podem ser feitas (ver algoritmo de busca de homologia Smith-Waterman). Métodos de terapia

Os ensaios de prognóstico ex vivo aqui descritos podem também ser usados em métodos de tratamento para um indivíduo com necessidade de tratamento para uma doença 116 inflamatória e/ou doença autoimune que está associada com células que expressam o CD40. Assim, o ensaio de prognóstico ex vivo é realizado num sujeito candidato e, se os resultados do ensaio preveem uma resposta favorável ao tratamento com o agente terapêutico anti-CD40, o sujeito é então tratado com o agente terapêutico anti-CD40. Como observado anteriormente neste documento, as informações obtidas a partir do ensaio de prognóstico ex vivo podem ser usadas isoladamente para proferir uma decisão em relação ao beneficio do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. Em alternativa, o ensaio de prognóstico ex vivo pode ser utilizado em combinação com ensaios de prognóstico que rastreiam para o nivel de expressão, ou a presença ou ausência de expressão de um ou mais dos factores relacionados com o CD40 aqui identificados; ensaios de prognósticos que rastreiam para o nivel de expressão, ou a presença ou ausência de expressão de um ou mais marcadores de prognóstico clinicamente úteis para a doença inflamatória ou autoimune particular, por exemplo, um marcador de prognóstico clinicamente útil, como aqui identificado, ou ambos.

Deste modo, um sujeito identificado utilizando os ensaios de prognóstico ex vivo da presente divulgação, isoladamente ou em combinação com outros ensaios de prognóstico aqui descritos, pode ainda ser tratado com um ou mais doses terapeuticamente eficazes do agente terapêutico anti-CD40 que tem sido identificado no processo de rastreio como sendo benéfico para o tratamento da doença no sujeito candidato. "Tratamento" é aqui definido como a aplicação ou administração de um agente terapêutico anti-CD40, a um sujeito, ou a aplicação ou administração de um agente terapêutico anti-CD40, a um tecido isolado ou linha celular 117 de um sujeito, em que o sujeito tem uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, um sintoma associado com uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou uma predisposição para o desenvolvimento de uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, onde o objectivo é o de curar, sarar, atenuar, aliviar, alterar, remediar, melhorar, melhorar ou afectar a doença autoimune e/ou doença inflamatória, quaisquer sintomas associados da doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou a predisposição para o desenvolvimento da doença autoimune e/ou doença inflamatória. Por "tratamento" entende-se também a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo um agente terapêutico anti-CD40, a um sujeito, a aplicação ou administração de uma composição farmacêutica compreendendo um antagonista do agente terapêutico anti-CD40, a um tecido isolado ou linha celular de um sujeito, em que o sujeito tem uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, um sintoma associado com uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou uma predisposição para o desenvolvimento de uma doença autoimune e/ou doença inflamatória, onde o objectivo é o de curar, tratar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, melhorar, melhorar ou afectar a doença autoimune e/ou doença inflamatória, quaisquer sintomas associados da doença autoimune e/ou doença inflamatória, ou a predisposição para o desenvolvimento da doença autoimune e/ou doença inflamatória.

Por "atividade anti-inflamatória" entende-se a redução ou a prevenção da inflamação. A terapia com pelo menos um agente terapêutico anti-CD40, tal como definido aqui que provoca uma resposta fisiológica, que é benéfica no que diz respeito ao tratamento de uma doença autoimune e/ou doença 118 inflamatória, onde a doença envolve as células que expressam o antigénio CD40. É reconhecido que os métodos podem ser úteis na prevenção da alteração fenotipica em células, tais como a proliferação, a ativação, e semelhantes.

Por "dose ou quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" entende-se uma quantidade do agente terapêutico anti-CD40, que, quando administrado provoca uma resposta terapêutica positiva com respeito ao tratamento de um paciente com uma doença autoimune e/ou doença inflamatória. 0 agente terapêutico anti-CD40 é um anticorpo antagonista anti-CD40, um anticorpo antagonista anti-CD40L, ou seu fragmento de ligação ao antigénio, e a dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40, anticorpo anti-CD40L, ou seu fragmento, é na gama desde cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 40 mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, desde cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, desde cerca de 1 mg/kg a cerca 30 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg a cerca de 25 mg/kg, entre cerca de 3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, desde cerca de 5 mg/kg até cerca de 15 mg/kg, ou desde cerca de 7 mg/kg a cerca de 12 mg/kg. É reconhecido que o método de tratamento pode compreender uma única administração de uma dose terapeuticamente eficaz ou administrações múltiplas de uma dose terapeuticamente eficaz do agente terapêutico anti-CD40, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40, um anticorpo antagonista anti-CD40L ou fragmento de ligação ao antigénio dos mesmos.

Os ensaios de prognóstico ex vivo podem ser usados para determinar a base fisiológica para a capacidade de resposta, ou falta de capacidade de resposta ao tratamento 119 com um agente terapêutico anti-CD40 particular. Assim, quando uma doença inflamatória ou autoimune num sujeito é inicialmente responsiva à terapia com um agente terapêutico anti-CD40 e as células que expressam CD40 da doença desenvolvem resistência a essa linha de terapia, os ensaios de prognóstico ex vivo podem ser utilizados para definir que interação CD40L-CD40 contribui para a natureza resistente destas células que expressam CD40.

Os bio marcadores de CD40L mediados por sinalização de CD40, ou seja, os bio marcadores da apoptose, proliferação e sobrevivência celular, marcadores de citoquinas de CD40L mediados por sinalização de CD40, e de factores relacionados com o CD40 aqui descritos também podem ser usados, isoladamente ou em qualquer combinação dos mesmos, para monitorizar a eficácia do tratamento com um agente terapêutico anti-CD40. Neste modo, um sujeito que está em tratamento com um agente terapêutico anti-CD40, que pode ou não ter sido previamente rastreado para a adequação do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40 utilizando um ensaio de prognóstico descrito acima, é controlado para as alterações na expressão in vivo de pelo menos um bio marcador da apoptose celular, proliferação celular e na sobrevivência e/ou uma ou mais vias de sinalização de CD40, em que a produção de citoquinas é opcionalmente monitorizada (dependendo do modo de ação do agente terapêutico anti-CD40), seguindo o tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. Alternativamente, ou adicionalmente, o sujeito pode ser monitorizado para mudanças no nivel de expressão in vivo de um ou mais factores relacionados com o CD40 selecionados a partir do grupo consistindo emantigénio CD40 da superfície celular em células, superfície celular de CD40L em células, nivel de circulação sCD40, e nivel de 120 circulação de sCD40L seguinte ao tratamento com o agente terapêutico anti-CD40.

Deste modo, uma primeira amostra biológica é obtida a partir do sujeito antes do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40 de interesse e ensaiada para o nível de expressão de um ou mais destes bio marcadores e/ou factores relacionados com a expressão de CD40 para obter um nível basal de expressão para cada fator testado. Esta primeira amostra biológica é referida como a "amostra biológica de referência." Um ou mais amostras biológicas seguintes, do mesmo tipo de tecido ou fluido corporal, é obtida a partir do sujeito e analisada para o mesmo bio marcador e/ou factor de CD40 relacionado, onde a amostra biológica subsequente é obtida a seguir à administração de pelo menos uma dose do agente terapêutico anti-CD40 de interesse. 0 controlo pode ocorrer num único ponto no tempo, ou em vários pontos de tempo para determinar a eficácia de um determinado protocolo de tratamento em que o agente terapêutico anti-CD40 é administrado ao sujeito. Dependendo do bio marcador a ser ensaiado, uma diminuição ou aumento do nível do bio marcador entre quaisquer dois pontos de tempo pode ser um indicativo de eficácia do agente anti-CD40 no tratamento terapêutico de doenças inflamatórias ou autoimunes. Sempre que um controlo revela uma diminuição no nível de um ou mais dos factores relacionados com a expressão de CD40, tal resultado pode ser um indicativo de eficácia do agente terapêutico anti-CD40 no tratamento de doenças inflamatórias ou autoimunes.

Assim, a eficácia do tratamento de um sujeito com um agente terapêutico anti-CD40, que bloqueia ou interfere com CD40L mediado por sinalização de CD40 é monitorizada através da 121 obtenção de uma amostra biológica de linha de base a partir do sujeito e a detecção do nivel de expressão de um ou mais bio marcadores da sobrevivência celular e/ou CD40L mediado por via de sinalização de CD40 aqui descrito acima; administrar pelo menos uma dose do agente terapêutico, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40 tal como CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um fragmento de ligação ao antigénio do mesmo, ao sujeito, a obtenção de uma amostra biológica subsequente a partir do sujeito, por exemplo, dentro de cerca de 30 minutos a cerca de 24 horas, incluindo cerca de 30 minutos a cerca de 12 horas, cerca de 30 minutos a cerca de 6 horas, cerca de 30 minutos a cerca de 4 horas, e cerca de 1 hora até cerca de 4 horas; e detectar o nivel de expressão do bio marcador da sobrevivência celular e/ou CD40L mediado por via de sinalização de CD40 na amostra biológica subsequente; em que uma redução no nivel de expressão na amostra biológica subsequente em comparação com o nivel de expressão na amostra biológica basal é indicativo da eficácia do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. A detecção pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido na técnica incluindo os métodos descritos neste documento. Em alguns exemplos, o nivel de expressão é reduzida em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% em relação ao detectado na amostra biológica de referência. A percentagem de alteração a partir da linha de base de pelo menos 25% (isto é, pelo menos, uma redução de 25% em relação à amostra biológica de referência) é indicativa de eficácia do agente terapêutico anti-CD40, com capacidade de resposta intermédia indicada por uma alteração percentual de pelo menos 30% ou pelo menos 40%. Preferivelmente, a alteração percentual da linha de base é pelo menos 50% (isto é, pelo 122 menos, uma redução de 50% em relação à amostra biológica de base) ou superior. A eficácia do tratamento de um sujeito com um agente terapêutico anti-CD40, que bloqueia ou interfere com CD40L mediado por sinalização de CD40 é monitorizada através da obtenção de uma amostra biológica de linha de base a partir do sujeito e a detecção do nivel de expressão de marcadores de citoquinas de CD40L mediados por sinalização de CD40 descrito aqui acima; administrar pelo menos uma dose do agente terapêutico, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40 tal como CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um fragmento de ligação ao antigénio dos mesmos, ao sujeito; a obtenção de uma amostra biológica subsequente a partir do sujeito, por exemplo, dentro de cerca de 24 horas a cerca de 3 semanas, incluindo cerca de 48 horas, cerca de 72 horas, cerca de 1 semana, ou cerca de 2 semanas, após a dosagem; e a detecção do nivel de expressão do bio marcador da sobrevivência celular e/ou CD40L mediado por vias de sinalização de CD40 na amostra biológica subsequente; em que uma redução no nivel de expressão na amostra biológica subsequente em comparação com o nivel de expressão na amostra biológica basal é indicativo da eficácia do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. A detecção pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido na técnica incluindo os métodos descritos neste documento. Além disso, as citoquinas que não são afectadas por CD40L mediadas por de sinalização de CD40 (por exemplo, IL-lb, GM-CSF, e IL-12M; ver a secção Experimental aqui a seguir) podem ser usadas como um controlo para normalizar os dados. Em algumas formas de realização, o nivel de expressão é reduzido em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 123 90%, 95%, ou 100% em relação ao detectado na amostra biológica de referência. A percentagem de alteração a partir da linha de base de pelo menos 20% (isto é, pelo menos, uma redução de 20% em relação à amostra biológica de base) ou superior é indicadora da eficácia do agente terapêutico anti-CD40. Amostras biológicas de linha de base que compreendem extracto de soro ou de soro são congeladas para análise subsequente dos marcadores de citoquinas. A eficácia do tratamento de um sujeito com um agente terapêutico anti-CD40, que bloqueia ou interfere com CD40 mediado por sinalização de CD40L ou que tenha uma ADCC como o seu modo de ação, é monitorizada através da obtenção de uma amostra biológica de linha de base a partir do sujeito e a detecção do nível de expressão de um ou mais bio marcadores da apoptose acima descrito; administrar pelo menos uma dose do agente terapêutico, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40 tal como CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um fragmento de ligação ao antigénio dos mesmos, ao sujeito; a obtenção de uma amostra biológica subsequente a partir do sujeito, por exemplo, dentro de cerca de 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, ou 72 horas após a dosagem; e, opcionalmente, novamente cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, ou cerca de 3 semanas após a dosagem; e detectar o nível de expressão do bio marcador de apoptose na amostra biológica subsequente, em que um aumento no nível de expressão na amostra biológica subsequente em relação ao nível de expressão em a amostra biológica basal é indicativo da eficácia do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. A detecção pode ser realizada utilizando qualquer método conhecido na técnica incluindo os métodos descritos neste documento. Em alguns exemplos, o nível de expressão é aumentado em pelo 124 menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 125%, 150%, 200%, 250%, 300% ou superior em relação ao detectado na amostra biológica basal. A percentagem de alteração a partir da linha de base de pelo menos 20% (isto é, pelo menos, um aumento de 20% relativamente à amostra biológica de base) ou superior é indicadora da eficácia do agente anti-terapêutico.

Em ainda outros exemplos, a eficácia do tratamento de um sujeito com um agente terapêutico anti-CD40, que bloqueia ou interfere com CD40L mediado por sinalização de CD40, modula ADCC, ou ambos, é monitorizada através da obtenção de uma amostra biológica de linha de base a partir do sujeito e a detecção do nível de expressão de um ou mais factores relacionados com o CD40 aqui descrito acima (isto é, superfície celular CD40 e/ou de CD40L em células, e/ou os níveis circulantes de sCD40 e/ou sCD40L); administrar pelo menos uma dose do agente terapêutico, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40 tal como CHIR-12.12 ou CHIR-5.9 ou um fragmento de ligação ao antigénio dos mesmos, ao sujeito; a obtenção de uma amostra biológica subsequente a partir do sujeito, por exemplo, dentro de cerca de 1 dia (isto é, 24 horas ), 2 dias, 3 dias, 4 dias ou uma semana; e detectar o nível de expressão do factor relacionado com o CD40, em que uma redução no nível de expressão na amostra biológica subsequente em comparação com o nível de expressão na amostra biológica de linha de base é indicativa da eficácia do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40. Em alguns exemplos, o nível de expressão é reduzida em pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 125 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% em relação ao detectado na amostra biológica de referência.

Reconhece-se que qualquer um ou uma combinação destes ensaios podem ser efectuadas para monitorizar a eficácia do tratamento de um sujeito com uma doença inflamatória ou autoimune com um agente terapêutico anti-CD40 de interesse, dependendo do seu modo de ação. Sempre que a eficácia é demonstrada, as doses subsequentes do agente terapêutico anti-CD40 podem ser administradas de acordo com o regime de dosagem recomendado, por exemplo, diariamente, em dias alternados, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana, duas vezes por semana, mensalmente e semelhantes. Alternativamente, o nivel de expressão in vivo do marcador de interesse (ou seja, bio marcador (es) da proliferação celular e sobrevivência, bio marcador (es) de CD40L mediado por vias de sinalização de CD40, marcador de citoquina (s) , fatores relacionados com CD4 0, e qualquer combinação dos mesmos podem servir como um guia para a frequência da dosagem, e podem também servir como uma indicação da dose terapeuticamente eficaz a ser administrada. Deste modo, onde as amostras biológicas subsequentes continuam a mostrar uma redução ou um aumento aceitável no nivel de expressão do respectivo marcador de interesse, mais dosagem com o agente terapêutico anti-CD40 pode ser atrasada até ao momento em que o nivel de expressão do respectivo marcador se aproxime dos observados na amostra biológica basal. Como alguns bio marcadores podem flutuar de forma independente dos efeitos do agente terapêutico, o qual também irá variar nos tempos de meia-vida, e de residência, de preferência, pelo menos, duas medições consecutivas (por exemplo, dentro de um período de 24-48 horas), são tomados em consideração quando se utiliza 126 o nível de expressão do marcador (ou seja, o bio marcador da apoptose, sobrevivência celular, via de sinalização do CD40, marcador de citoquina, e/ou o factor relacionado com o CD40) como um guia para a frequência de dosagem.

Sempre que os resultados destes ensaios, continuam a mostrar a subregulação desejada de CD40L mediado por sinalização de CD40 no que diz respeito a uma diminuição da expressão de um ou mais dos bio marcadores da sobrevivência celular, um ou mais dos bio marcadores de uma via de sinalização de CD40 e/ou um ou mais dos factores relacionados com o CD40, e um aumento na expressão de um ou mais dos marcadores de apoptose celular, na sequência do tratamento com o agente terapêutico anti-CD40 está justificada. As amostras biológicas podem ser recolhidas em vários intervalos de tempo ao longo de um período de tratamento, como aqui referido acima, para permitir a monitorização da eficácia do tratamento ao longo do tempo e para determinar se o tratamento deve ser continuado ou retirado.

Os exemplos que se seguem são oferecidos como forma de ilustração e não como forma de limitação.

EXPERIMENTAL

Introdução

Os anticorpos antagonistas anti-CD40 usados nos exemplos abaixo são CHIR-5.9 e CHIR-12.12. Os anticorpos anti-CD40 CHIR-5.9 e CHIR-12,12 são um subtipo de anticorpos monoclonais anti-CD40 humanos IgGi humana (mAb) gerados pela imunização de ratos transgênicos que carregam o lócus da cadeia pesada de IgGi humana e o locus de cadeia leve κ 127 humano (tecnologia XenoMouse® (Abgenix; Fremont, Califórnia)). Células de insecto SF9 expressando o dominio extracelular de CD40 foram usadas como imunogénio.

Resumidamente, os esplenócitos de ratinhos imunizados foram fundidos com células de mieloma murino SP 2/0 ou P 3 x 63Ag8.653 numa proporção de 10:1 1 utilizando 50% de polietilenoglicol como descrito anteriormente por de Boer et al. (1988) J. Immunol. Meth. 113:143. As células fundidas foram ressuspensas em meio IMDM completo suplementado com hipoxantina (0,1 mM) , aminopterina (0,01 mM) , timidina (0,016 mM) e 0,5 ng/ml de hIL-6 (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). As células fundidas foram então distribuídas entre os poços de placas de cultura de tecidos de 96 poços, de modo que cada poço continha, em média, um hibridoma em crescimento.

Após 10-14 dias, os sobrenadantes das populações de hibridoma foram rastreados para a produção do anticorpo especifico. Para o rastreio da produção de anticorpos específicos pelos clones de hibridoma, os sobrenadantes de cada cavidade foram reunidos e testados quanto à especificidade da atividade anti-CD40, por meio de ELISA em primeiro lugar. Os positivos foram então utilizados para a coloração fluorescente de células B transformadas por EBV usando um ensaio padrão de FACS. As células positivas do hibridoma foram clonadas duas vezes por diluição limitante em IMDM/FBS contendo 0,5 ng/ml de hIL-6.

Um total de 31 baços de ratos foi fundido com as células de mieloma do rato SP2/0 para gerar 895 anticorpos que reconhecem o CD40 recombinante em ELISA. Em média, cerca de 128 10% dos hibridomas produzidos usando a tecnologia Abgenix XenoMouse® (Abgenix, Fremont, Califórnia) podem conter a cadeia leve lambda do ratinho em vez de cadeia kappa humana. Os anticorpos contendo cadeia leve lambda do rato foram selecionados. Um subconjunto de 260 anticorpos que também mostraram uma ligação de CD40 na superfície celular foi selecionado para posterior análise. Hibridomas estáveis selecionados durante uma série de procedimentos de subclonagem foram usados para posterior caracterização, em ensaios de ligação e funcionais. Para mais detalhes sobre o processo de seleção, consulte a PCT/US2004/037152 publicada como W02005/044854 (Processo n° PP20107.004 (035784/282916)), intitulada "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies for Their Use", apresentada em 4 de Novembro de 2004, e publicada como WO 2005/04485.

Clones de 7 outros hibridomas foram identificados como tendo atividade antagónica. Com base na sua potência antagonista relativa e atividades ADCC, foram selecionados dois clones de hibridoma para avaliação posterior (Tabela 1, abaixo). Eles são nomeados 131.2F8.5.9 (5,9) e 153.8E2.D10.D6.12.12 (12.12). 129

Tabela 1. Resumo do conjunto inicial de dados com anticorpos anti-CD40 IgGl CHIR-5,9 E CHIR-12-12

Hibridoma mãe Clones de hibridoma Ligação de superfície celular Antagonista ADCC CDC CMCC# Região V da sequência de ADN 131.2F5 131.2F5.8.5.9 +++ +++ ++ " 12047 Sim 153.8E2 153.8E2D10D6.12.12 +++ +++ ++++ 12056 Sim A linha do hibridoma do rato 131.2F8.5.9 (CMCC#12047) e linha de hibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC#12056) foram depositados na American Type Culture Collection (ATCC; 10801 University Blvd, Manassas, Virgínia 20110-2209 (EUA)) sob a patente com o Número de Depósito PTA-5542 e PTA-5543, respectivamente.

Os cADNs que codificam as regiões variáveis dos anticorpos candidatos foram amplificados por PCR, clonados e sequenciados. As sequências de aminoácidos para a cadeia leve e para a cadeia pesada do anticorpo CHIR-12.12 estão estabelecidas na SEQ ID n°: 2 (cadeia leve para o mAb CHIR- 12.12) , e SEQ ID n°: 4 (cadeia pesada para o mAb CHIR- 12.12) . Uma variante da cadeia pesada para o mAb CHIR-12.12 está apresentada em SEQ ID n°: 5, que difere da SEQ ID n°: 4, em que tem um resíduo de serina substituída pelo resíduo de alanina na posição 153 da SEQ ID n°: 4. As sequências de nucleótidos que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo CHIR-12.12 estão estabelecidas na SEQ ID n°: 1 (sequência de codificação para a cadeia leve para o mAb CHIR-12.12), e SEQ ID n°: 3 (sequência de codificação para a cadeia pesada mAb CHIR-12.12). As sequências de aminoácidos para a cadeia leve e a cadeia pesada do 130 anticorpo CHIR-5.9 estão estabelecidas na SEQ ID n°: 6 (cadeia leve para o mAb CHIR-5.9), e SEQ ID n°: 7 (cadeia pesada para o mAb CHIR-5.9). Uma variante da cadeia pesada para o mAb CHIR-5.9 é apresentada na SEQ ID n°: 8, que difere da SEQ ID n°: 7 em que tem um residuo de serina substituida pelo residuo de alanina na posição 158 da SEQ ID n°: 7.

Tal como esperado para os anticorpos derivados de hibridomas independentes, existe uma variação considerável nas sequências de nucleótidos de reqiões determinantes de complementaridade (CDRs). A diversidade na reqião CDR3 de VH acredita-se que mais siqnificativamente determina a especificidade do anticorpo.

Como mostrado por meio de análise FACS, CHIR-5.9 e CHIR-12.12 ligam especificamente ao CD40 humano e podem evitar a ligação do ligando CD40. Ambos os mAbs podem competir fora com ligante pré-ligado CD40 de superficie celular CD40. A afinidade de ligação do CHIR-5.9 ao CD40 humano é l,2xl0~8 M e a afinidade de ligação de CHIR-12.12 ao CD40 humano é 5x10-10 M.

Os anticorpos monoclonais CHIR-12.12 e CHIR-5.9 são antagonistas fortes e inibem in vitro a proliferação de ligando de CD40 mediada por células B normais, assim como a inibição in vitro da proliferação do ligando CD40 mediada por células cancerosas de pacientes com NHL e LLC. 0 anticorpo monoclonal CHIR-12.12 inibe diretamente a sobrevivência e vias de sinalização mediadas por ligando de CD40 (CD40L) em linfócitos B humanos normais. In vitro, ambos os anticorpos primários matam as células cancerosas 131 de pacientes com LNH por ADCC. A atividade anti-tumor dependente da dose foi observada num modelo de xenoenxerto de linfoma humano. Para uma descrição mais detalhada destes resultados, e os ensaios usados para obtê-los, ver Pedido de Patente Internacional PCT/US2004/037152 publicado como W02005/044854 (Processo n° PP20107.004 (035784/282916)), também intitulado "Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use", apresentado em 4 de Novembro de 2004.

Exemplo 1: CHIR-12,12 bloqueia CD40L mediado por sinalização celular

Solúvel CD40 ligante (CD40L) ativa as células B e induz vários aspectos de respostas funcionais, incluindo o aumento da sobrevivência e proliferação e ativação de vias de sinalização NF-kB, ERK/MAPK, PI3K/AKT e p38. Além disso, a estimulação de CD40 mediada por CD40L proporciona sinais de sobrevivência mediante redução de PARP clivada e indução das proteínas anti-apoptóticas, XIAP e Mcl-1, em células B normais. Estimulação de CD40 mediada por CD40L recruta igualmente TRAF2 e TRAF3 para se ligar ao dominio citoplasmático CD40.

Os estudos seguintes demonstram que CHIR-12.12 inibiu diretamente todos estes efeitos de estimulação com células B humanas normais. Por exemplo, o tratamento com CHIR-12.12 resultou num aumento de clivagem de caspase-9, caspase-3 e PARP, assim como redução de XIAP e de Mcl-1 num tempo e forma dependente da dose, restabelecendo a apoptose das células B. O tratamento com CHIR-12.12 inibiu a fosforilação da quinase IkB (IKK) α e β (via de NF-kB), ERK, AKT e p38 em resposta à estimulação de CD40 mediada por CD40L. Além disso, verificou-se que CHIR-12.12 não 132 provoca estes efeitos apoptóticos sem CD40L inicial mediado por estimulação de CD40.

CHIR-12.12 inibiu a sobrevivência mediada pelo ligando de CD40 através da indução da clivagem de PARP

Nestas experiências, 0,6 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 yg/ml de sCD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). CHIR-12.12 (10 yg/ml) e IgG de controlo foram então adicionados. As células foram coletadas em 0,20 minutos, 2 horas, 6 horas, 18 horas e 26 horas. Caspase-9 clivada, caspase-3 clivada, PARP clivada e controlos β-actina foram detectadas em lisados celulares por Western blot.

Resumidamente, verificou-se que a estimulação de CD40L mediada por CD40 fornecia sinais de sobrevivência, uma vez que não resulta em aumentos de caspase-9 clivada, caspase-3 clivada ou PARP clivada ao longo do tempo, indicando que as células não foram submetidas a apoptose. No entanto, o tratamento com CHIR-12.12 resultou num aumento destes produtos de clivagem, indicando que o tratamento com CHIR-12.12 revoga os efeitos da ligação de CD40L na sobrevivência de sinalização em células B normais estimuladas em sCD40L, restabelecendo a apoptose das células B (dados não mostrados). CHIR-12.12 inibiu a expressão de "sobrevivência" de proteínas anti-apoptóticas

Nestas experiências, 0,6 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 yg/ml de SCD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). CHIR-12.12 (10 133 yg/ml) e IgG de controlo foram então adicionados. As células foram coletadas em 0, 20 minutos, 2 horas, 6 horas, 18 horas e 26 horas. Os controlos de ação Mcl-1, XIAP, CD40 e β foram detectados em lisados celulares por Western blot. Resumidamente, a estimulação sCD40L resultou na expressão sustentada de Mcl-1 e de XIAP ao longo do tempo. No entanto, o tratamento das células sCD40L estimuladas com CHIR 12.12 resultou num decréscimo na expressão destas proteínas ao longo do tempo (dados não mostrados). Uma vez que Mcl-1 e XIAP são sinais de "sobrevivência", capazes de bloquear a via de apoptose, estes resultados demonstram que o tratamento com CHIR-12.12 remove o bloqueio contra a apoptose em células B normais estimuladas com sCD40L. O tratamento com CHIR-12.12 inibiu a fosforilação do IKKa (Serl80) e ΙΚΚβ (Ser 181) em células B normais

Nestas experiências, 1,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). CHIR-12.12 (10 yg/ml) e IgG de controlo foram então adicionados. As células foram coletadas em 0 e 20 minutos. Foram detectadas IKKa (Serl80) fosforilada e ΙΚΚβ (Ser 181) e os controlos totais ΙΚΚβ em lisados celulares por Western blot.

Resumidamente, a estimulação por sCD40L resultou na fosforilação de IKKa (Serl80) e ΙΚΚβ (Ser 181) ao longo do tempo, no entanto, o tratamento com CHIR-12.12 revoga esta resposta à estimulação sCD40L em células B normais (dados não mostrados). 134 O tratamento com CHIR-12.12 inibiu sobrevivência mediada pelo ligando de CD40 num modo dependente da dose

Nestas experiências, 0,6 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 yg/ml de sCD40L (Alexis

Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). CHIR-12.12 (0,01, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 pg/ml) e IgG de controlo foram então adicionados. As células foram coletadas em 24 horas. Foram detectados controlos de ação de PARP clivadas, e β em lisados celulares por Western blot.

Resumidamente, o tratamento com CHIR-12.12 resultou em aumento da clivagem de PARP em células estimuladas por sCD40L de um modo dependente da dose e, portanto, anulada a via de sinalização de sobrevivência em células B normais estimuladas com sCD40L (dados não mostrados). CHIR-12.12 inibiu a expressão de "sobrevivência" de proteínas anti-apoptóticas numa maneira dependente da dose.

Nestas experiências, 0,6 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram estimuladas com 1 yg/ml de sCD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, UK). CHIR-12.12 (0,5, 2, e 10 yg/ml) e IgG de controlo foram então adicionados. As células foram coletadas em 22 horas. Foram detectados controlos de ação Mcl-1, XIAP, PARP clivada e β em lisados celulares por Western blot.

Resumidamente, o tratamento com CHIR-12.12 reduziu expressão de Mcl-1 e XIAP e aumentou a expressão de PARP clivada em células sCD40L estimuladas de uma forma dependente da dose, e, portanto, anula a estes bloqueios à 135 via apoptótica em células B normais estimuladas com sCD40L (dados não mostrados). CHIR-12.12 não afectou a expressão de proteínas anti-apoptóticas, PARP clivada e XIAP, na ausência de sinalização de CD40L solúvel.

Nestas experiências, 1,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram tratadas com CHIR-12.12 (10 yg/ml) e IgG de controlo isoladamente (ou seja, as células não foram pré-estimuladas com sCD40L antes da adição de anticorpo). As células foram coletadas em 0, 4, 14 e 16 horas. Foram detectados controlos de XIAP, PARP clivada e β-actina em lisados celulares por Western blot.

Em resumo, os resultados mostram que, sem estimulação sCD40L, as células expressavam concentrações aumentadas de PARP clivada, enquanto a expressão de XIAP permaneceu constante, tanto em células IgG de controlo tratadas e células CHIR-12.12 (dados não mostrados). Estes dados indicam que CHIR-12.12 não desencadeia a apoptose em células B humanas normais sem estimulação CD40L. CHIR-12.12 inibe a fosforilação da IKKct (Serl80) e ΙΚΚβ (Serl81) , AKT, ERK e p38 em células B normais.

Nestas experiências, 1,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram carenciadas em soro por quatro horas num meio contendo 1% de FBS, e estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, Reino Unido). As culturas foram tratadas com CHIR-12.12 (1 e 10 yg/ml) e IgG de controlo. As células foram coletadas em 0 e 20 minutos. Foram detectados gosfo-IKKa, fosfo-ΙΚΚβ, ΙΚΚβ 136 total, fosfo-ERK, ERK total, fosfo-AKT, AKT total, fosfo-p38 e p38 total em Usados celulares por Western blot.

Resumidamente, a estimulação sCD40L resultou em aumentos da fosforilação ΙΚΚα/β, da fosforilação de ERK, da fosforilação de AKT e da fosforilação de p38, levando assim à sobrevivência e proliferação celular. 0 tratamento das células com CHIR-12.12 revoga os efeitos da estimulação SCD40L sobre estas vias de sinalização em células B normais (dados não mostrados). CHIR 12.12 inibe as vias de sinalização de multiplex, tais como PI3K e MEK/ERK na cascata de sinalização de CD40.

Nestas experiências, 1,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram carenciadas em soro num meio contendo 1% de FBS, e estimuladas com 1 pg/ml de sCD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, Reino Unido). As culturas foram também tratadas com CHIR-12.12 (1 e 10 yg/ml) , Wortmanin (um inibidor de PI3K/AKT, 1 e 10 μΜ) , LY 294002 (um inibidor de PI3K/AKT, 10 e 30 μΜ) , e PD98095 (um inibidor de MEK, 10 e 30 pg/ml) . As células foram coletadas em 0 e 20 minutos. Fosfo-ERK, fosfo-Akt, AKT total, f osf ο-ΙΚΚοί/β e total foi detectada em lisados celulares por Western blot.

Resumidamente, os resultados demonstram que CHIR-12.12 anulou a fosforilação de todas estas moléculas de transdução de sinal, enquanto que os inibidores de transdução de sinal mostraram apenas revogação especifica de sinalização, o que indica que CHIR-12.12 inibe provavelmente a montante destas moléculas de transdução de 137 sinal mediada pela estimulação de CD40L (dados não mostrados). CHIR-12.12 inibe a ligação de moléculas de sinalização TRAF2 e TRAF3 ao domínio citoplásmico de CD40 em células B normais.

Nestas experiências, 4,0 x 106 células B humanas normais de dadores saudáveis (percentagem de pureza entre 85-95%) foram carenciadas em soro durante quatro horas em meio contendo 1% de FBS e estimuladas com 1 yg/ml de sCD40L (Alexis Corporation, Bingham, Nottinghamshire, Reino Unido) durante 20 minutos. As células foram coletadas em 0 e 20 minutos. CD40 foi imunoprecipitado usando anti-CD40 policlonal (Santa Cruz Biotechnology, CA), e foram sondadas num Western Blot com anti-TRAF2 mAb (Santa Cruz Biotechnology, CA), anti-TRAF3 mAb (Santa Cruz Biotechnology, CA) , e anti-CD40 mAb (Santa Cruz Biotechnology, CA).

Resumidamente, os resultados mostram que TRAF2 e TRAF3 co-precipitaram com CD40 após estimulação sCD40L. Em contraste, o tratamento com CHIR-12.12 revogou a formação dos complexos de sinalização CD40-TRAF2/3 em células B normais estimuladas com sCD40L. Não houve alteração na expressão de CD40 (dados não mostrados).

Sem ser limitado pela teoria, os resultados destas experiências, e os resultados nos exemplos acima referidos, indicam que o anticorpo CHIR-12.12, é um antagonista de ação dual do anticorpo monoclonal anti-CD40 tendo uma combinação única de propriedades. Estes anticorpos monoclonais totalmente humanos bloqueiam CD40L mediados por 138 de vias de sinalização CD40 para a sobrevivência e proliferação das células B; este antagonismo conduz à morte celular final. CHIR-12.12 também medeia o reconhecimento e a ligação por células efetoras, iniciando citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) . Uma vez que CHIR-12.12 é ligado a células efetoras, as enzimas citoliticas são libertadas, levando à apoptose de células B e lise. CHIR-12.12 é um anticorpo anti-tumoral mais potente do que o rituximab, quando comparados em modelos pré-clinicos de tumores.

Exemplo 2: Avaliação de CD40 induzida pelo ligando de secreção de citocinas em células CD40+ A estimulação de CD40 pelo seu ligando fornece sinais de sobrevivência e proliferativos para células B normais. 0 anticorpo antagonista anti-CD40 CHIR-12.12 não induz a proliferação de linfócitos do sangue periférico humano, mas inibe a proliferação de linfócitos induzida por CD40L. A sinalização de CD40 também induz células para produzir uma variedade de citoquinas. Neste exemplo, foi investigada a capacidade de CHIR-12.12 de modular a produção de citoquinas pelas células B e monócitos normais.

As células (lxlO5 células por poço) foram cultivadas numa placa de 96 poços na presença ou ausência de CD40L (CD40 transfectado, células CHO fixadas por formaldeido, 2xl05 por poço). As células foram incubadas com huIgGl (controlo) ou CHIR-12.12 a 10 pg/ml a 37°C durante 24 horas, e os sobrenadantes foram colhidos. A produção de hIL-6, hIL-8, hIL-10, hTNF-oí, hGM-CSF, hIL-lb, hIL-12p70, MCP-1 e ΜΙΡ-1β beta foi medida pelo sistema de multi-matriz Meso Scale Discovery® (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland). 139

As células cultivadas com CHIR-12.12 isoladamente na ausência de CD40L não produziram qualquer das citoquinas acima dos níveis de fundo, sugerindo que CHIR-12.12 não tem uma atividade agonista para a produção de citoquinas. Em contraste com a produção induzida por CD40L de hIL-10, hTNF-cx, hIL-8, hIL-6, MCP-1 e MIP-Ιβ em células B normais (n = 3) (Tabela 2). A adição de CHIR-12.12 a essas culturas inibiu a produção de todas as citoquinas (ver Tabela 3).

Tabela 2: secreção de citoquinas induzida por CD40L de células B normais (os valores são vezes de indução sobre o fundo)

Citoquina Dador 1 Dador 2 Dador 3 hIL-lb não indução não indução não indução hIL-12p7 0 não indução NA não indução hIL-10 3, 6 NA 3, 6 hGM-CSF não indução NA não indução hTNF-a 3,7 4,8 22,8 hIL-8 7,7 14,7 49, 3 hIL-6 5,7 3, 8 20,5 MCP-1 5,5 não testado 1,7 MIP-1β 2,2 2, 6 17,8 140

Tabela 3: CHIR-12.12 inibe a secreção de células B normais de todas as citoquinas induzida por CD40L (os valores são % de inibição)

Citoquina Dador 1 Dador 2 Dador 3 hIL-lb não indução não indução não indução hIL-12p70 não indução NA não indução hIL-10 90,5 NA 94,4 hGM-CSF não indução NA não indução hTNF-a 92,8 97,4 98,5 hIL-8 98,2 64,7 99, 5 hIL-6 92,2 99, 9 99, 3 MCP-1 55,3 não testado 25,7 MIP-1β 54,4 92 92,5 Tabela 4: CHIR-12.12 inibe a produção de monócitos induzida por CD40L de hIL-10, hTNF-α, hIL-8, hIL-6, MCP-1 e ΜΙΡ-1β (n=l) (Tabela 4 versus Tabela 5)

Citoquina Dador 1 hIL-lb não indução hIL-12p7 0 não indução hIL-10 4,2 hGM-CSF não indução hTNF-a 13, 8 hIL-8 123, 5 hIL-6 77, 9 MCP-1 289, 9 ΜΙΡ-1β 161, 9 141

Tabela 5: CHIR-12.12 Inibe a secreção de todas as cltoqulnas a partir de monócltos induzidos por CD40L (os valores são % de inibição)

Citoquina Dador 1 hIL-lb não indução hIL-12p7 0 não indução hIL-10 58,5 hGM-CSF não indução hTNF-a 60,1 hIL-8 43,7 hIL-6 64, 9 MCP-1 92, 6 C^_ \—1 1 P-i 1—1 32,4

Juntos, estes dados mostram que CHIR-12.12 é um antagonista potente de sobrevivência mediada por ligando de CD40, proliferação e produção de citoquinas. A ligação CD40 também pode induzir a expressão do VEGF em células endoteliais normais e monócitos (Melter et al. (2000) Blood 96 (12) :3801-3808; Flaxenburg et al. (2004) J. Immunol. 172:7503-7509), bem como os fibroblastos sinoviais reumatoides (Cho et al. (2000) J. Immuno. 164:5055-5061. Acredita-se que CD40L mediado por sinalização de CD40 em locais inflamatórios estimula os fibroblastos e monócitos/produção de tecidos de macrófagos de VEGF, conduzindo à angiogénese, que promove e mantém o processo inflamatório crónico (veja, por exemplo, Monaco et al. (2004) Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy 3 (1):35-42). Como tal, as alterações nos niveis de VEGF pode fornecer um marcador útil da citoquina de CD40L mediada por sinalização 142 de CD40. Porque o VEGF é uma proteína segregada, as alterações na expressão da proteína VEGF podem ser facilmente detectadas em sobrenadantes de cultura de células ou no plasma obtido a partir de amostras de sangue de pacientes, utilizando técnicas, tais como ELISA ou Western Blot. Em alternativa, pode ser detectada a partir do mARN obtido a partir de amostras de células/tecidos, usando qualquer um de uma série de técnicas tais como Northern blot ou RT-PCR quantitativa.

Numa outra experiência, a produção induzida por CD40L de VEGF em monócitos é examinada de uma maneira semelhante ao descrito acima. A adição de CHIR-12.12 a estas culturas de células é encontrada para inibir a produção induzida por CD40L de VEGF.

Exemplo 3: Bio marcadores e marcadores de prognóstico

Os ensaios de prognóstico ex vivo e ensaios de prognósticos adicionais para serem utilizados nos métodos requerem a triagem de amostras biológicas para o nível de expressão de bio marcadores cujas sequências de proteínas e as sequências de nucleótideos maduros são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, a informação mostrada na Tabela 2 e 3 abaixo. Reconhece-se que as sondas para a detecção destes bio marcadores, quer a proteína (por exemplo, sondas de anticorpo) ou o nível do ácido nucleico (por exemplo, sondas de PCR) , podem ser concebidas com base nesta informação de sequência, e que as sondas podem ser concebidas para detectar variantes das sequências aqui divulgadas. 143

Tabela 6. Aminoácidos e sequências de nucleotideos de bio marcadores

Nome do Bio marcador N° de acesso N° de acesso AKT-1 NM 005163 NP 005154 AKT-2 NM 001626 NP 001617 AKT-3 AF1357 94 AAD24196 PI3K Y13892 CAA74194 PDK1 BC006339 AAH06339 IKKa AFO12 8 90 AAC51662 ΙΚΚβ AF0 31416 AAC64675 Kb Bt006743 Q15653 NF-Kb Nm 003998 NP 003989 MEK1 LI12 84 NM 002755 NP 002746 MEK2 LI12 85 NM 030662 NP 109587 MEK3 NM 002746 NP 002737 MEK6 U49732 AABH05035 ERK1 NM 002746 NP 002737 ERK2 NM 02745 NP 002736 P38 L35253 AAA74301 Caspase 3 NM 004346 NP 004337 Caspase 7 BT006683 AAP3532 9 Caspase 9 BT006911 AAP35557 PARP NM 001618 NP 001609 Bcl-2 M14745 AAA80661 Bcl-xl Z23115 CAA80661 Mcl-1 AF118124 AAD13299 XIAP U45880 AAC50373 C1AP1 U45879 AAC50372 Survivina U75285 AAC51660 TRAF-1 NM 005658 NP 005649 Ki 67 X65550 CAA6519 144

Tabela T. Aminoácidos e sequências de nucleotideos para

CD40 e CD40L

Sequência de Núcleotideo Sequência de aminoácido Nome N° de acesso Identificação da sequência N° de acesso Identificação da sequência Isoforma curta CD40 NM 152854 SEQ ID N° 9 NP 690593 SEQ ID N° 10 Isoforma longa CD4 0 X60592 SEQ ID N° 11 CAA43045 SEQ ID N° 12 CD40L NM 000074 SEQ ID N° 13 NP 000065 SEQ ID N° 14 CD40L solúvel NM 000074 SEQ ID N° 15 (nucleotideos 139-786 de SEQ ID N° 13) NP 000065 SEQ ID N° 16 (nucleotideos 47-261 de SEQ ID N° 14)

Exemplo 4: Ensaios para a atividade antagonista de agentes terapêuticos anti-CD40

Os seguintes ensaios podem ser utilizados para avaliar a atividade antagonista de um anticorpo anti-CD40. As células B humanas para estes ensaios podem ser obtidas, por exemplo, por isolamento a partir de amígdalas obtidas de indivíduos submetidos a amigdalectomias, essencialmente como descrito em De Groot et al. (1990) Lymphokine Research (1990) 9:321. Resumidamente, o tecido é disperso com lâminas de bisturi, as células fagocitárias e NK são esgotadas por tratamento com 5 mM de éster de metilo L-leucina e as células T são removidas por um ciclo de formação de rosetas com eritrócitos de carneiro (SRBC) tratados com brometo de 2-aminoetil isotiourónio. A pureza das preparações de linfócitos B resultantes pode ser controlada por meio de etiquetagem por imunofluorescência 145 indireta com o anticorpo anti-(CD20) mAb B 1 (Coulter Clone, Hialeah, FA) ou anti-(CD3) mAb 0KT3 (Ortho, Raritan, NJ) e um fragmentos de FITC conjugado de F(ab')2 de coelho anti-(Ig de ratinho) (Zymed, San Francisco, CA) e análise por FACS.

Ensaio de proliferação de células B

As células B (4 x 104 por poço) foram cultivadas em 200 μΐ de IMDM suplementado com soro fetal de vitela a 10% em placas de microtitulação de fundo plano de 96 poços. As células B são estimuladas pela adição de anticorpos imobilizados anti-(IgM) (Immunobeads; 5pg/ml; BioRad, Richmond, Califórnia). Quando desejado, é adicionado 100 U/ ml de IL-2 recombinante. Várias concentrações de anticorpos monoclonais de teste (mAbs) são adicionados no inicio da microcultura e a proliferação é avaliada ao dia 3 por medição da incorporação de (3H)-timidina após 18 horas de pulsação.

Um anticorpo antagonista anti-CD40 não co-estimula significativamente a proliferação de células B humanas na presença de anti-IgM imobilizada ou na presença de anti-IgM imobilizado e de IL-2.

Ensaio de proliferação de células B semelhante a Banchereau

Para testar a capacidade de anticorpos monoclonais anti-CD40 para estimular a proliferação de células B num sistema de cultura semelhante ao descrito por Banchereau et al. (1991) Science (1991) 251:70, são usadas células transfectadas de rato 3T6 que expressam a forma alélica HR de FeYRII humano. As células B (2 x 104 por pço) foram cultivadas em micropoços de fundo plano na presença de 1 x 104 células transfectantes (irradiadas com 5000 Rad), em 200 μΐ de IMDM suplementado com soro fetal de vitela a 10% 146 e 100 U/ml de IL-4 recombinante. Antes da adição das células B, as células 3T6 são deixadas aderir ao plástico da cultura durante pelo menos 5 horas. São adicionados MAbs anti-CD40 em concentrações variando de 15 ng/ml a 2000 ng/mL e a proliferação de células B é avaliada pela medição da incorporação de timidina no dia 7, após 18 horas de pulsação com [3H] timidina.

Inibição da proliferação de células B estimulada por S2C6 usando antagonista anti-CD40 mAb

Antagonista de anticorpos monoclonais anti-CD40 (mAb), também pode ser caracterizado pela sua capacidade para inibir a estimulação da proliferação de células B por um anticorpo anti-CD40, tais como S2C6 (também conhecido como SGN-14, que é alegadamente um agonista de estimulação de CD40 da proliferação de células B normais; Francisco et al. (2000) Câncer Res. 60:3225-3231) utilizando o ensaio de proliferação de células B acima descrito. As células B tonsilares humanas (4 x 104 por poço) foram cultivadas em 200 μΐ em micropoços, na presença de anti-IgM acoplado a esferas de Sefarose (5 pg/ml) e anti-CD40 mAb S2C6 (1,25 pg/ml). São adicionadas várias concentrações de um anti-CD40 mAb de interesse e a incorporação de [3H]-timidina é avaliada após 3 dias. Como um controlo de anti-(glucocerebrosidase) 8E4 mAb podem ser adicionados em concentrações semelhantes. Bameveld et al. (1983) Eur. J. Biochem. 134:585. Um anticorpo antagonista anti-CD40 pode inibir a co-estimulação da proliferação de células B humanas induzida por anti-IgM pelo mAb S2C6, por exemplo, pelo menos 75% ou mais (isto é, proliferação estimulada por S2C6 na presença de um antagonista anticorpo anti-CD40 não é mais do que 25% do que a observada na ausência do antagonista de anticorpo anti-CD40). Em contraste, nenhuma inibição significativa seria vista com quantidades 147 equivalentes do mAb 8E4 não relevante, dirigido para β-glucocerebrosidase. Barneveld et al. supra. Tal resultado indica que os mAbs anti-CD40 não entregam sinais estimuladores da proliferação de células B humanas, mas, por outro lado, podem inibir os sinais estimuladores exercidos pelo desencadeamento de CD40 com outro mAb.

Ativação de células B com células EL4B5

Zubler et al. (1985) J. Immunol. (1985) 134:3662 observou que um subclone mutante de timoma de rato da linha EL-4, conhecido como EL4B5, poderia estimular fortemente as tanto as células B de origem humana como de murino para proliferar e diferenciar em células do plasma que segregam imunoglobulina in vitro. Esta ativação foi encontrada para ser de antigénio independente do CPH e não restringida. Para a estimulação óptima das células B humanas, foi necessária a presença de sobrenadante de células T humanas ativadas, mas uma resposta de células B, também ocorreu quando as células EL4B5 foram pré-ativadas com forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) ou IL-1. Zubler et al. (1987) Immunological Reviews 99:281; e Zhang et al. (1990) J. Immunol. 144:2955. A ativação das células B neste sistema de cultura é eficiente - as experiências de diluição limitantes têm mostrado que a maioria das células B humanas pode ser ativada para proliferar e de se diferenciar em células secretoras de anticorpos. Wen et al. (1987) Eur. J. Immunol. 17:887.

As células B (1000 por poço) foram cultivadas em conjunto com células EL4B5 irradiadas (5000 Rad) (5 x 104 por poço) em placas de microtitulação de fundo plano de 200 pL de IMDM suplementado com soro fetal de vitelo inativado pelo calor a 10%, 5 ng/mL de forbol-12-miristato-13-acetato 148 (Sigma) e 5% de sobrenadante de células T humanas. mAbs são adicionados em concentrações variáveis no inicio da cultura e a incorporação de timidina é avaliada ao dia 6 após 18 horas de pulsação com [3H]-timidina. Para a preparação do sobrenadante de células T, as células T purificadas são cultivadas a uma densidade de 106/ml, durante 36 horas, na presença de 1 pg/ml de PHA e de 10 ng/ml de PMA. Wen et al. (1987) Eur. J. Immunol. (1987) 17:887. O sobrenadante de células T é obtido por centrifugação das células e armazenamento a -20°C. A eficácia dos sobrenadantes de células T no aumento da proliferação de células B humanas em culturas de células EL4B5 B é testada e os sobrenadantes mais eficazes foram reunidos para uso em experiências. Ao avaliar o efeito de um anticorpo anti-CD40 sobre a proliferação de células B humanas induzida por EL4B5, um anticorpo monoclonal, tal como MOPC-141 (IgG2b) pode ser adicionado como um controlo.

Um anticorpo antagonista anti-CD40 pode inibir a proliferação das células B estimuladas pela linha celular EL4BS, por exemplo, pelo menos 75% ou mais (isto é, a proliferação de células B induzida por EL4B5 na presença de um anticorpo antagonista anti-CD40 não é mais de 25% da observada na ausência do antagonista de anticorpo anti-CD40) . Em contraste, um anticorpo de controlo, tal como MOPC-141 não teria nenhum efeito significativo na proliferação de células B induzida por EL4B5.

Célula T auxiliar humana para a produção de anticorpos por células B

Um anticorpo antagonista anti-CD40, pode funcionar como um antagonista da produção de imunoglobulina pelas células B. Um anticorpo anti-CD40, pode ser testado para este tipo de 149 atividade antagonista, avaliando a capacidade do anticorpo para inibir a produção de imunoglobulina pelas células B que tenham sido estimuladas de um modo dependente do contacto por células T ativadas, num ensaio de células T auxiliares. Desta maneira, as placas de cultura de tecidos de 96 poços são revestidas com uma diluição de 1:500 de fluido de ascite do anti-CD3 mAb CLB-T3/3 (CLB, Amsterdão, Holanda). Como indicado são adicionados mAbs co-estimuladores: os anti CD2 mAbs CLB-Tll.1/1 e CLB-T11.2/1 (CLB, Amsterdão, Holanda), ambos de ascite 1:1000 e anti-CD28 mAb CLB-28/1 (CLB, Amsterdam, The Netherlands). Subsequentemente são adicionadas as células T das amigdalas (irradiadas, 3000 Rad, 105 por poço), células B das amigdalas (104 por poço) e rIL-2 (20 U/ ml). 0 volume final de cada cultura de células é 200 μΐ. Após 8 dias, as células são centrifugadas, e o sobrenadante livre de células é colhido. As concentrações de IgM e IgG humana nas amostras (diluídas) são estimadas por ELISA, como descrito abaixo.

As células B tonsilares humanas (loVpoço) foram cultivadas em conjunto com células T purificadas irradiadas (3000 rad, 105/poço) em placas de 96 poços, revestidas com anti-CD3mAb e com ou sem mAbs diferentes para as células T co-estimuladas. Após 8 dias de cultura, os sobrenadantes são colhidos para determinação da produção de imunoglobulinas pelas células B. A produção de imunoglobulina pelas células B é avaliada pelo ensaio de ELISA descrito abaixo. O anticorpo anti-CD40 de interesse é adicionado em concentrações variáveis desde o início das culturas. Como controlo, pode ser adicionado o mAb MOPC-141. 150

Um anticorpo antagonista anti-CD40 pode inibir a produção de anticorpos IgG e IgM de células B estimuladas por células T humanas em pelo menos 50% ou mais (isto é, a produção de anticorpos de células T induzida pelas células B na presença de um anticorpo antagonista anti-CD40 não é mais do que 50% do que a observada na ausência do antagonista de anticorpo anti-CD40). Em contraste, um anticorpo de controlo, tais como MOPC-141 não teria nenhum efeito significativo sobre a produção de anticorpos de células T induzida pelas células B.

Ensaio de ELISA para a quantificação de imunoglobulinas

As concentrações de IgM e IgG humanas foram estimadas por ELISA. Placas de 96 poços de ELISA são revestidas com 4 yg/ml de IgG anti-humana de ratinho mAb MH 16-01 (CLB, Amsterdão, Holanda) ou com 1,2 yg/ml de IgM anti-humana de ratinho mAb 4102 (Tago, Burlingame, CA) em tampão de carbonato 0,05 M (pH = 9,6), por incubação durante 16 h a 4°C. As placas são lavadas três vezes com PBS, 0,05% de Tween-20 (PBS-Tween) e saturadas com BSA durante 1 hora. Após 2 lavagens, as placas são incubadas durante lha 37°C com diferentes diluições das amostras de teste. Após 3 lavagens, a ligação de Ig é detectada por incubação durante lha 37°C com 1 yg/ml, com peroxidase marcada de IgG anti-humana de ratinho mAb MH 16-01 (CLB) ou IgM anti-humana de ratinho mAb MH 15-01 (CLB). As placas são lavadas 4 vezes e a ligação da atividade da peroxidase foi revelada pela adição de O-fenilenodiamina como substrato. Soro humano padrão (H00, CLB) é usado para estabelecer uma curva padrão para cada ensaio. 151

Exemplo 5: 0 tratamento com CHIR-12.12 blocrueia o ligando CD40 mediado por sobrevivência de CD40 e vias de sinalização em células B humanas normais A ativação de CD40 pelo ligando de CD40 (CD40L) , pode regular a sobrevivência, proliferação e diferenciação dos linfócitos B normais. Em células B, a ligação de CD40 leva a sua ligação com o fator de necrose tumoral e fatores de receptor associados (TRAFs) e a ativação subsequente de várias vias de sinalização a jusante envolvidas na proliferação celular e sobrevivência. A ativação desta via pode ser demonstrada ex vivo, em que a adição de CD4 0L em células B normais cultivadas promove a sua sobrevivência e proliferação. 0 estudo adicional descrito abaixo foi realizado para caracterizar ainda mais os efeitos do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 sobre a sobrevivência de CD40L mediada por CD40 e as vias de sinalização nas células B humanas normais.

As células B humanas normais foram purificadas a partir de sangue periférico por seleção negativa utilizando kit II de isolamento de células B MACS (INC Miltenyi Biotech, Auburn, CA) e cultivadas durante 24 horas com ou sem 2 yg/ml de CD40L solúvel recombinante humano (rhsCD40L) na presença de 10 yg/ml de CHIR-12.12 ou isótipo de controlo hlgGl. As células foram lisadas e todos os lisados de células foram resolvidas por SDS-PAGE e Western blotting utilizando anticorpos específicos para cPARP humano, Mcl-1, Bcl-xl, p-Akt, e p-MAPK p38. Todas as membranas foram retiradas e re-sondadas tanto para β-actina ou Akt total ou proteína p38 MAPK, quando apropriado. Os resultados são mostrados na Figura 1. 152 A estimulação por CD40L de células B humanas normais reduziu os niveis do marcador de apoptose (cPARP) e aumentou a expressão dos marcadorese anti-apoptóticos (Mcl-1, Bcl-XL), induzindo, assim, a proliferação/sobrevivência destas células. Além disso, a sobrevivência de células B induzida por CD40L foi associada com a fosforilação da Akt e p38 MAPK. Em contraste, o tratamento com CHIR-12.12 de CD40L estimulou as células B normais ex vivo, inibindo a expressão das proteínas anti-apoptóticas Mcl-1 e Bcl-xL, bem como inibindo a fosforilação das proteínas de sinalização a jusante, conduzindo finalmente a apoptose das células B.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS 110> Aukerman, Lea Jallal, Bahija Luqman, Mohammad <12 0> MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DE DOENÇAS COM UMa COMPONENTE AUTOIMUNE E/OU INFLAMATÓRIa <130> PP028062.0003 (311608) <150> 60/749, 336 <151> 2005-12-09 <150> 60/682, 575 <151> 2005-05-18 <160> 16 <170> FastSEQ para Windows versão 4.0

<210>1 <211>720 <212>ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de codificação para a cadeia leve de anticorpo anti-CD40 humano 12,12 153 (720)

<221>CDS <222> (1) ... <4 0 0> 1 atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg 399 ctg cta atg ctc tgg gtc tct 48 Mat Ala Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 IS gga tCC agt 333 gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctg acc 96 Gly Ser Ser Gly Asp Ile vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr 20 25 30 gtc acc cct gga gag ccg gee tcc ate tcc tgc agg tcc agt cag age 144 Vai Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser as 40 45 ctc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tac ctg cag aag 192 Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp •rrp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60 cca 333 cag tct cca cag gtc ctg ate tct ttg ggt tct aat cgg gee 240 Pro Gly Gin Ser Pro Gin vai Leu ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala €5 70 75 80 tcc 333 gtc cct gac »33 ttc agt ggc agt gga tea ggc aca gat ttt 288 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 aca ctg aaa ate age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tat tac 336 Thr Leu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 tgc atg caa gct cga caa acfc cca ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa 384 Cys Mat Gin Ala Arg Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly pro Gly Thr Lys 115 120 125 gtg gat ate aga cga act gtg gct gea cca tct gtc ttc ate ttc ccg 432 Val Asp 130 Ile Arg Arg Thr Val 135 Ala Ala Pro Ser Val 140 Phe Ile Phe Pro cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gee tct gtt gtg tgc ctg 430 Pro 145 Ser Asp Glu Gin Leu 150 Lys Ser Gly Thr Ala 155 Ser val val Cys Leu 160 ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gee aaa gta cag tgg aag gtg gat 528 Leu Asn Asn Phe Tyr 165 Pro Arg Glu Ala Lys 170 Val Gin Trp Lys Val 175 Asp aac gee ctc caa teg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac 576 Asn Ala Leu Gin 180 Ser Giy Asn Ser Gin 185 Glu Ser Val Thr Glu 190 Gin Asp age aag gac age acc tac age ctc age age acc ctg acg ctg age aaa 624 Ser Lys ASp 195 Ser Thr Tyr Ser Leu 200 ser Ser Thr Leu Thr 205 Leu Ser Lys gea gac tac gag aaa cac aaa gte tac gee tgc gaa gtc acc cat cag 672 Ala Asp 210 Tyr Glu Lys HiS Lys 215 Val Tyr Ala Cys Glu 220 Val Thr His Gin ggt ctg age teg ccc gtc aca aag age ttc aac agg gga gag tgt tag 720 Gly 225 Leu Ser Ser Pro Val 230 Thr Lys Ser Phe Asn 23 5 Arg Gly Glu Cys ★ 154

<210>2 <211>239 <212>PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> sequência de codificação para a cadeia leve de anticorpo anti-CD40 humano 12,12 <400> 2

Met Ala Leu Pro Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp Val Ser 1 5 10 15 Qly Ser Ser Gly Asp Ile Vai Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Thr 20 25 30 Vai Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Xle Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45 L@U Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Ttp Tyr Leu Gin Lys 50 55 60 Pro Gly Gin Ser Pro Gin Vai Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn Arg Ala 65 70 75 80 Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys 11 e Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gin Ala Arg Gin Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 115 120 125 Val Asp ile Arg Arg Thr val Ala Ala Pro Ser Val Phe ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser Val val cys Leu 145 150 155 160 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp 165 170 175 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Glu Asp 180 185 190

Ser Lys Asp 195 Ser Thr Tyr Ser Leu 200 Ser Ser Thr Leu Thr 205 Leu Ser Lys Ala Asp 210 Tyr Glu Lys His Lys 215 val Tyr Ala Cys Glu 220 Val Thr His Gin Gly 225 Leu Ser Ser Pro Val 230 Thr Lys Ser Phe Asn Arg 235 Gly Glu Cys

<210> 3 <211> 2016 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de codificação para a cadeia pesada de anticorpo anti-CD40 humano 12,12 (com introns) <400> 3 155 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctt gtgcagttgg tggagtctgg gggaggcgfcg tgtgcagcct etggattcac cttcagtagc ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata gactccgtga agggccgatt caccatctcc caaatgaaca gcctcagaac tgaggacacg atagcagcac ctgggcctga ctactggggc agtaccaagg gcccatccgt cttccccctg acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac aacfccaggeg ccçtgaccag cggcgtgcac ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac ccagcacagg gagggagggt gtetgctgga tcccggctat gcagtcccag tecagggcag gaggcctctg cecgccccac tcatgctcag tctgggcagg cacaggctag gtgcccctaa tgggctcaga cctgccaaga gccatatccg ccaaaggcca aactctccac tccctcagct aactcccaat cttctcfcctg cagagcccaa gtgcocaggt aagccagccc aggccfccgcc agtagcctgc atccagggac aggccccagc cctcagcacc tgaactcctg gggggaccgt acaccctcat gatctcccgg acccctgagg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg caaagccgcg ggaggagcag tacaacagca tgcaccagga ctggcfcgaat ggcaaggagt cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag cacatggaca gaggccggct cggcccaccc tctgtcccfca cagggcagcc ccgagaacca gagatgacca agaaccaggt cagçctgacc atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag gtgctggact ccgacggctc cttcttccfcc tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgcfccc acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt gttgctattt taagaggtgt ccagcgtcag 60 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 tcatatgagg aaagtaatag ataccatgca 240 agagacaatt ccaagatcac gcfcgtatctg 300 gctgtgtatt aecgtgcgag agatgggggt 360 cagggaacce tggtcaccgt ctccteagca 420 gcgcccgcta gcaagagcac ctctgggggc 480 tactfcccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 accttcccgg ctgtcctaca gtectcagga 600 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660 accaaggtgg acaagagagt tggtgagagg 720 agccaggctc agcgctcctg ectggacgca 780 caaggcaggc cccgtctgcc tcttcacccg 840 ggagagggtc ttctggottt ttccccaggc 900 cccaggccct gcacacaaag gggcaggtgc 960 ggaggaccct gcccctgacc taagcccacc 1020 cggacacctt ctctcctccc agattccagt 1080 atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc 1140 ctccagctca aggcgggaca ggtgccctag 1200 çgggtgctga cacgtccaee tccatctctt 1260 cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg 1320 tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg 1380 tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga 1440 cgtaocgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc 1500 acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc 1560 ccaaaggtgg gacccgtggg gtgcgagggc 1620 tctgccctga gagtgaccgc tgtaccaacc 1680 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag 1740 tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1800 ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1860 tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1920 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1980 aaatga 2016 <210> 4 <211> 469 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> cadeia pesada de ant <400> 4 corpo anti-CD40 humano 12,12

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp vai Phe Leu Vai Ala Ile Leu Arg Gly 15 10 15

Vai Gin Cys Gin Vai Gin Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gin 20 25 30 156

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Vai Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr His Ala 65 70 75 80 Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Xle Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ile 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gin Ket Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly lie Ala Ala Pro Gly Pro Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 ISO 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Vai Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 teu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu ftet lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val 290 295 300 Glu Vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Xle Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin 370 375 380 val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Xle Ala 385 390 395 400 Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465

210> 5 <211> 469 <212> PRT <213> Sequência Artificial 157 <22 0> <223> Cadeia pesada da variante do anticorpo anti-CD40 humano 12.12 <400> 5 158

Met 1 Glu Phe Gly vai Gin Cys Gin 20 Pro Gly Arg 35 Ser Ser Ser 50 Tyr Gly Glu 65 Trp Vai Ala Asp Ser Vai Lys Thr Leu Tyr Leu 100 Tyr Tyr Cys 115 Ala Trp Gly 130 Gin Gly Pro 145 Ser Val Phe Thr Ala Ala Leu Thr Vai Ser Trp 180 Pro Ala val 195 Leu Thr Vai 210 Pro Ser Asn 225 His Lys Pro Ser Cys Asp Lys Leu Gly Gly Pro 260 Leu Met Ile 275 Ser Ser His 290 Glu Asp Glu 305 Vai His Asn Thr Tyr Arg Val Asn Gly Lys Glu 340 Pro Ile Glu 355 Lys Gin Vai 370 Tyr Thr Vai 385 Ser Leu Thr Vai Glu Trp Glu Pro Pro Val Leu 420 Thr Vai Asp 435 Lys vai Met 450 His Glu Leu 465 Ser Pro Gly

Leu S Ser Trp Val Val Gin Leu Val Leu Arg Leu Ser 40 Met His Trp 55 Val val Ile 70 Ser Tyr Gly 85 Arg Phe Thr Gin Met Asn Ser Arg Asp Gly Gly 120 Thr Leu Val 135 Thr Pro Leu 150 Ala Pro Gly 165 Cys Leu val Asn Ser Gly Ala Gin Ser Ser Gly 200 Ser Ser Leu 215 Gly Ser Asn 230 Thr Lys Thr 245 His Thr Cys Ser Val Phe Leu Arg Thr Pro Glu 280 Pro Glu Val 295 Lys Ala Lys 310 Thr Lys Val 325 Ser Val Leu Tyr Lys Cys Lys Thr Ile Ser Lys 360 Leu Pro Pro 375 Ser Cys Leu 390 Val Lys Ser 405 Asn Gly Gin Asp Ser Asp Gly Ser Arg Trp Gin 440 Ala Lys Leu His 455 Asn

Phe Leu 10 Val Ala Glu 25 Ser Gly Gly Cys Ala Ala Ser Arg Gin Ala Pro 60 Glu Glu Ser 75 Asn lie Ser 90 Arg Asp Leu 105 Arg Thr Glu Ile Ala Ala Pro Val Ser Ser Ala 140 Ser Ser Lys 155 Ser Lys Asp 170 Tyr Phe Leu 185 Thr Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Thr Gin Thr Tyr 220 Val Asp Lys 235 Arg Pro Pro 250 Cys Pro Phe 265 Pro Pro Lys Val Thr Cys Val Phe Asn Trp Tyr 300 Pro Arg Glu 315 Glu Thr Val 330 Leu His Val 345 Ser Asn Lys Ala Lys Gly Gin Arg Glu Glu Met 380 Gly Phe Tyr 395 Pro Pro Glu 410 Asn Asn Ser 425 Phe Phe Leu Gin Gly Asn Val His Tyr Thr Gin 460

Ile Leu Arg Gly Gly Val 15 Val Gin Gly 30 Phe Thr Phe 45 Gly Lys Gly Leu Arg Tyr His Ala Asn Ser Lys 80 lie Asp Thr 95 Ala Val Gly 110 Pro Asp Tyr 125 Ser Thr Lys Gly Thr Ser Gly Gly Pro Glu Pro 160 Val val His 175 Thr Phe Ser 190 Ser val Val 205 Ile Cys Asn Val Val Glu Pro Lys Ala Pro Glu 240 Leu Pro Lys 255 Asp Thr Val 270 Val Asp Val 285 Val Asp Gly Val Gin Tyr Asn Ser Gin Asp Trp 320 Leu Ala Leu 335 Pro Ala Pro 350 Arg Glu Pro 365 Thr Lys Asn Gin Ser Asp Ile Ala Tyr Lys Thr 400 Thr Tyr Ser 415 Lys Leu Phe 430 Ser Cys Ser 445 Lys Ser Leu Ser 159

<210>6 <211>239 <212>PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Cadeia leve do anticorpo anti-CD40 humano 5.9 <400> 6

Met Ala Leu Leu Ala Gin Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Ser Gly Ala Ile val Met Thr Gin Pro Pro Leu Ser Ser Pro 20 25 30 vai Thr Leu Gly Gin Pro Ala Ser Ile ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser 35 40 45 Leu Vai His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gin Gin Arg 50 55 60 Pro Gly Gin Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Phe Phe Arg Arg Leu 65 70 75 80 Ser Gly val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe 85 50 95 Thr teu Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Met Gin Val Thr Gin Phe Pro His Thr Phe Gly Gin Gly Thr Arg 115 120 125 teu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 130 135 140 Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser val Val Cys Leu 145 150 155 160 teu Asn Asn Phe Tyr pro Arg Glu Ala Lys val Gin Trp Lys Val ASp 165 170 175 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser val Thr Glu Gin Asp ISO 185 190 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu ser Lys 195 200 205 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin 210 215 220 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 233

<210> 7 <211> 474 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Cadeia pesada de anticorpo anti-CD40 humano 5.9 <400> 7 160

Met 1 Gly Ser Thr Ala 5 Ile Leu Ala Vai Cys Ala Glu 20 Val Gin Leu Val Pro Gly Glu 35 Ser Leu Lys Ile Ser 40 Thr Ser 50 Tyr Trp He Gly Trp 55 Val Glu 65 Trp Met Gly Ile Ile 70 Tyr Pro Pro Ser Phe Gin Gly 85 Gin Val Thr Thr Ala Tyr Leu 100 Gin Trp Ser Ser Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Gly Thr Ala 120 Tyr Gly 130 Met Asp Val Trp Gly 135 Gin Ala 145 Ser Thr Lys Gly Pro 150 Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly 165 Thr Ala Ala Phe Pro Glu Pro 180 Val Thr val Ser Gly Val His 195 Thr Phe Pro Ala Val 200 Leu Ser 210 Ser Val Val Thr Val 215 Pro Tyr 225 Xle Cys Asn val Asn 230 His Lys Arg Val Glu Pro Lys 245 Ser Cys Asp Pro Ala Pro Glu 260 Leu Leu Gly Gly Lys Pro Lys 275 Asp Thr Leu Met Ile 280 val 1 Val 290 val Asp Val Ser His 2 95 Glu Tyr Val 305 Asp Gly Val Glu 310 Val His Glu Gin Tyr Asn Ser 325 Thr Tyr Arg Hls Gin Asp Trp 340 Leu Asn Gly Lys Lys Ala Leu 355 Pro Ala Pro Ile Glu 360 Gin Pro 370 Arg Glu Pro Gin Val 375 Tyr Met 385 Thr Lys Asn Gin Val 390 Ser Leu Pro Ser Asp Ile Ala 405 Val Glu Trp Asn Tyr Lys Thr 420 Thr Pro Pro Val Leu Tyr Ser 435 Lys Leu Thr Val Asp 440 Val Phe 450 Ser Cys Ser val Met 455 His Gin Lys 465 Ser Leu Ser Leu 470 Ser Pro

Leu Leu Leu Ala Val Leu Gin Gly Gin 10 Ser Gly Ala Glu Val 15 Lys Lys 25 Cys Lys Gly Ser Gly 30 Tyr Ser Phe Arg Gin Met Pro 45 Gly Lys Gly Leu Gly Asp Ser 60 Asp Thr Arg Tyr Ser Ile Ser 75 Ala Asp Lys Ser Ile 80 Ser Leu 90 Lys Ala Ser Asp Thr 95 Ala Met 105 Ala Gly Arg Asp Tyr 110 Tyr Tyr Tyr Gly Thr Thr Val 125 Thr val Ser Ser Phe Pro Leu 140 Ala Pro Ala Ser Lys Leu Gly 155 Cys Leu Val Lys Asp 160 Tyr Trp 170 Asn Ser Gly Ala Leu 175 Thr Ser 185 Leu Gin Ser Ser Gly 190 Leu Tyr Ser Ser Ser Ser Leu 205 Gly Thr Gin Thr Pro Ser Asn 220 Thr Lys Val Asp Lys Lys Thr 235 His Thr Cys Pro Pro 240 Cys Pro 250 Ser Val Phe Leu Phe 255 Pro Pro 265 Ser Arg Thr Pro Glu 270 Val Thr Cys Asp Pro Glu Val 285 Lys Phe Asn Trp Asn Ala Lys 300 Thr Lys Pro Arg Glu Val Val 315 Ser Val Leu Thr Val 320 Leu Glu 330 Tyr Lys Cys Lys Val 335 Ser Asn 345 Lys Thr Ile Ser Lys 350 Ala Lys Gly Thr Leu Pro Pro 365 Ser Arg Glu Glu Thr Cys Leu 380 Val Lys Gly Phe Tyr Glu Ser 395 Asn Gly Gin Pro Glu 400 Asn Leu 410 Asp Ser Asp Gly Ser 415 Phe Phe 425 Lys Ser Arg Trp Gin 430 Gin Gly Asn Glu Ala Leu His 445 Asn His Tyr Thr

Gly Lys 460

<210> 8 <211> 474 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Cadeia pesada da variante do anticorpo anti-CD40 humano 5.9 <400> 8

Met Gly Ser Thr Ala Ile Leu Ala Leu Leu Leu Ala Vai Leu Gin Gly 15 10 15

Vai Cys Ala Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys 20 25 30

Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe 35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Vai Arg Gin Met Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60

Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser 65 70 75 80

Pro Ser Phe Gin Gly Gin Vai Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser ile Ser 85 90 95 162

Thr Ala Tyr Leu Gin Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 100 105 110 Tyr Tyr cys Ala Arg Gly Thr Ala Ala Gly Arg Asp Tyr Tyr Tyr Tyr 115 120 125 Tyr Gly Met Asp val Trp Gly Gin Gly Thr Thr val Thr Val Ser Ser 130 135 140 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 145 150 155 160 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 165 170 175 Phe Pro Glu Pro val Thr val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 180 185 190 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Val val Thr Val Pro Ser Ser ser Leu Gly Thr Gin Thr 210 215 220 Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 225 230 235 240 Arg Val Glu Pro Lys ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 245 250 255 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser val Phe Leu Phe Pro Pro 260 265 270 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Xle Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 275 280 285 Vai Val val Asp val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 290 295 300 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 305 310 315 320 Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr val Leu 325 330 335 His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 340 345 350 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 355 360 365 Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 370 375 380 Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 385 390 395 400 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 405 410 415 Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 420 425 430 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 435 440 44S Vai Phe ser cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 450 455 460 Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 465 470 <210> 9 <211> 612 <212> ADN <213> Homo sapi ens <22 0> <221> CDS <222> (D ... (612: ) 163 <221> caracter misto <222> (0) ... (0) isoforma curta de CD40 <223> Sequência de codificação para humano <400> 9 1 gct gtc cat cca Ala vai His Pro 20 ata aac agt cag Ile Asn Ser 35 Gin agt gac tgc aca Ser Asp 50 Cys Thr age gaa ttc cta Ser Glu Phe Leu 65 aaa tae tgc gac Lys Tyr Cys Asp tea gaa aca gac Ser Glu Thr Asp 100 agt gag gee tgt Ser Glu Ala 115 Cys ttt 399 gtc aag Phe Gly 130 Vai Lys ecç tgc cca gtc Pro Cys Pro Vai 145 tgt cac cct tgg Cys His Pro Trp gat ccc cat cat Asp Pro His His 180 ctt tat caa aaa Leu Tyr Gin 195 Lys atg gtt cgt ctg Met Vai Arg teu cct ctg cag tgc gtc Pro Leu Gin Cys Vai 5 CJ&3 cca ccc act gea Glu Pro pro Thr Ala 25 tgc tgt tet ttg tgc Cys Cys Ser Leu Cys 40 gag ttc aet gaa acg Glu Phe Thr 55 Glu Thr gac acc tgg aac aga Asp Thr 70 Trp Asn Arg ccc aac cta ggg ctt Pro Asn Leu Gly Leu 85 acc ate tgc acc tgt Thr lie Cys Thr Cys 105 gag age tgt gtc,ctg GlU Ser Cys Val Leu 120 cag att gct aca ggg Gin ile Ala 135 Thr Gly ggc ttc ttc tcc aat Gly Phe 150 Phe Ser Asn aca agg tcc cca gga Thr Arg Ser Pro Gly 16S ctt egg gat cct gtt Leu Arg Asp Pro val 185 ggt ggc caa gaa gee Gly Gly Gin Glu Ala 200 ctc tgg ggc tgc Leu Trp Gly Cys 10 tgc aga gaa aaa Cys Arg Glu Lys cag cca gga cag Gin Pro Gly Gin 45 gaa tgc ctt cct Glu Cys. Leu 60 Pro gag aca cac tgc Glu Thr 75 His Cys cgg gtc cag cag Arg val Gin Gin 90 gaa gaa ggc tgg Glu Glu Gly Trp cac ege tea tgc His Arg Ser cys 125 gtt tet gat acc Val Ser Asp 140 Thr gtg tea tet gct val Ser 155 Ser Ala teg gct gag age Ser Ala Glu Ser 170 tgc cat cct ctt Cys His Pro Leu aac caa taa Asn Gin * ttg ctg acc 48 Leu Leu Thr 15 cag tac Gin Tyr 30 cta Leu 96 aaa ctg Lys Leu gtg Val 144 tgc ggt Cys Gly gaa Glu 192 cac cag His Gin cac His 80 240 aag ggc Lys Gly 35 acc Thr 288 cac tgt His cys 110 acg Thr 336 teg ccc Ser pro ggc Gly 384 ate tgc Ile cys gag Glu 432 ttc gaa Phe Glu aaa Lys 160 480 cct ggt Pro Gly 175 ggt Gly 528 ggt gct Gly Ala 190 ggt Gly 576 164 612 <210> 10 <211> 203 <212> PRT <213> Homo <4 0 0> 10 sapiens

Met 1 Vai Arg Leu Pro 5 teu Gin Cys Vai Leu 10 Trp Gly Cys Leu Leu 15 Thr Ala Vai His pro 20 Glu Pro Pro Thr Ala 25 Cys Arg Glu Lys Gin 30 Tyr Leu lie Asn ser 35 Gin Cys Cys Ser Leu 40 Cys Gin Pro Gly Gin Lys 45 Leu Vai Ser Asp 50 cys Thr Glu Phe Thr 55 Glu Thr Glu Cys Leu 60 Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His cys His Gin His 65 Lys Tyr Cys Asp Pro 70 Asn Leu Gly Leu Arg 75 Val Gin Gin Lys 80 Gly Thr Ser Glu Thr ASp 85 Thr Ile Cys Thr Cys 90 Glu Glu Gly Trp His 95 Cys Thr Ser Glu Ala 100 Cys Glu Ser Cys Val 105 Leu HiB Arg Ser Cys 110 Ser Pro Gly 115 Phe Gly Vai Lys Gin Ile 120 Ala Thr Gly val Ser Asp 125 Thr Ile Cys Glu 130 Pro Cys Pro val Gly Phe 135 Phe Ser Asn Val ser 140 Ser Ala Phe Glu Lys 145 Cys His Pro Trp Thr 150 Arg Ser Pro Gly Ser 155 Ala Glu Ser Pro 160 Gly Gly Asp Pro His His 165 Leu Arg Asp Pro val 170 Cys His Pro Leu Gly 175 Ala Gly Leu Tyr Gin 180 Lys Gly Gly Gin Glu 185 Ala Asn Gin 190 195 200

<210> 11 <211> 834 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (1) ... (834) <221> carácter misto <222> (0) ... (0) <223> Sequência de codificação de isoforma longa para CD40 humano <400> 11 165 atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc etc tgg ggc tgc ttg ctg acc 48 Met vai Arg Leu Pro Leu Gin Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr 1 5 10 15 gct gtc cat cca gaa cca CCC act gea tgc aga gaa aaa cag tac cta 96 Ala Vai His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gin Tyr Leu 20 25 30 ata aac agt cag tgc tgt tet ttg tgc cag cca gga cag aaa ctg gtg 144 Ile Asn Ser Gin Cys Cys Ser Leu Cys Gin Pro Gly Gin Lys Leu Val 35 40 45 agt gac fcgc aca gag ttc act gaa acg gaa tgc ctt cct tgc ggt gaa 192 Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu 50 55 60 age gaa tte cta gac acc tgg aac aga gag aca cac tgc cac cag cac 240 Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gin His 65 70 75 80 aaa tac tgc gac CCC aac cta ggg ctt cgg gtc cag cag aag ggc acc 288 Lys Tyr Cys ASp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gin Gin Lys Gly Thr 85 90 95 tea gaa aca gac acc ate tgc acc tgt gaa gaa ggc tgg cac tgt acg 336 Ser Glu Thr Asp Thr Xle Cys Thr cys Glu Glu Gly Trp His cys Thr 100 105 110 agt gag gee tgt gag age tgt gtc ctg cac ege tea tgc teg CCC ggc 384 Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys vai Leu His Arg Ser Cys Ser pro Gly 115 120 125 ttt ggg gtc aag cag att gct aca ggg gtt tet gat acc ate tgc gag 432 166

Phe Gly Vai Lys Gin Ile Ala Thr Gly val Ser Asp Thr Ile Cys Glu 130 135 140 ccc tgc cca gtc ggc ttc ttc tcc aat gtg tea tet gct ttc gaa aaa 480 Pro Cys Pro Vai Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys 145 150 155 ISO tgt cac cct tgg aca age tgt gag acc aaa gac ctg gtt gtg caa cag 528 Cys Kis Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gin Gin 165 170 175 gca ggc aca aac aag act gat gtt gtc tgt ggs ccc cag gat cgg Ctg 37$ Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gin Asp Arg Leu ISO 185 190 aga gcc cfcg gtg gtg ate ccc ate ate ttc sgg ate ctg ttt gcc ate 624 Arg Ala Leu Vai Val Ile Pro lie Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile 195 200 205 ctc ttg gtg ctg gcc ttt ate aaa aag gtg gcc aag aag cca acc aat 672 I*eu Leu Vai Leu val Phe lie Lys Lys val Ala Lys 1>Y3 Pro Thr Asn 210 215 220 aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag ate aat ttt ccc gac 720 Lys Ala Pro His Pro Lys Gin Glu Pro Gin Glu lie Asn Phe Pro Asp 225 230 235 240 gat ctt ccc ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act fcta cat 76B Aap Leu Pro Gly ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gin Glu Thr Leu His 245 250 255 gga tgc cas ccg gtc aec cag gag gat ggc aaa g&g agt ege ate tea 816 Gly Cys Gin Pro val Thr Gin Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg ile Ser 260 265 270 gtg cag gag aga cag tga 834 vai Gin Glu Arg Gin * 275 <2 Λ o \—1 12 <2 11> 277 <2 12> PRT <2 13> Homo <4 Λ o o 12 167

Met 1 Vai Arg Leu Pro 5 Leu Gin Cys Vai Leu Trp Gly Cys Leu 10 Leu 15 Thr Ala Vai His Pro 20 Glu Pro Pro Thr Ala 25 Cys Arg Glu Lys Gin 30 Tyr Leu Ile Asn Ser 35 Gin Cys Cys Ser Leu Cys 40 Gin Pro Gly Gin Lys 45 Leu Vai Ser Asp Cys 50 Thr Glu Phe Thr Glu Thr 55 Glu Cys Leu Pro Cys 60 Gly Glu Ser 65 Glu Phe Leu Asp Thr 70 Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His 75 Gin His 80 Lys Tyr Cys Asp Pro 85 Asn Leu Gly Leu Arg Vai Gin Gin Lys 90 Gly 95 Thr Ser Glu Thr Asp 100 Thr Ile Cys Thr Cys 105 Glu Glu Gly Trp His 110 Cys Thr Ser Glu Ala 115 Cys Glu Ser Cys Vai Leu 120 His Arg Ser Cys Ser 125 Pro Gly Phe Gly Vai no Lys Gin Ile Ala Thr Gly 135 Vai Ser Asp Thr Ile 140 cys Glu Pro 145 Cys Pro Vai Gly Phe 150 Phe Ser Asn Vai Ser Ser Ala Phe 155 Glu Lys 160 Cys His Pro Trp Thr 16S Ser Cys Glu Thr Lys ASp Leu Vai Vai 170 Gin 175 Gin Ala Gly Thr Asn 180 Lys Thr Asp Vai Vai 185 Cys Gly Pro Gin Asp 190 Arg Leu Arg Ala Leu 195 Vai Vai Ile Pro Ile Ile 200 Phe Gly Ile Leu Phe 205 Ala Ile Leu Leu Vai 210 Leu Vai Phe Ile Lys Lys 215 Vai Ala Lys Lys Pro 220 Thr Asn Lys 225 Ala Pro His Pro Lys 230 Gin Glu Pro Gin Glu Ile Asn Phe 235 Pro Asp 240 Asp Leu Pro Gly Ser 245 Asn Thr Ala Ala Pro Vai Gin Glu Thr 250 Leu 255 His Gly Cys Gin Pro Vai Thr Gin Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser 260 265 270

Vai Gin Glu Arg Gin 27 S <210> 13 <211> 786 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) ... (786) <221> carácter misto <222> (0) ... (0) <223> CD40L <400> 13 168 48 atg ate gaa aca tac aac caa act tet ccc ega tet gcg gee act gga Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 IS ctg cce ate age atg aaa att ttt atg tat tta ctt act gtt ttt ctt Leu Pro Ile ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu 20 25 30 ate acc cag atg att 9SS tea gea ctt ttt gct gtg tat ctt cat aga Ile Thr Gin Met Ile Gly ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg 35 40 45 agg ttg gac aag ata gaa gat gaa agg aat ctt cat gaa gat ttt gta Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val 50 55 60 ttc atg aaa acg ata eag aga tgc aac aca gga gaa aga tcc tta tcc Phe Met kys Thr Ile Gin Arg cys Asn Thr Gly Glu Arg ser Leu Ser 65 70 75 80 tta ctg aac tgt gag gag att aaa age cag ttt gaa ggc ttt gtg aag Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Val Lys 85 90 35 gat ata atg tta aac aaa gag gag acg aag aaa gaa aac age ttt gaa ASp Xle Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 atg caa aaa ggt gat cag aat cct caa att gcg gea cat gtc ata agt Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin Ile Ala Ala His Val Ile ser 115 120 125 gag gee age agt aaa aca aca tet gtg tta cag tg g gct gaa aaa gga Glu Ala ser Ser Lys Thr Thr Ser Vai Leu Gin Trp Ala Glu Lys Gly 96 144 132 240 288 3 36 384 432 130 135 tac tac acc atg age aac aac ttg gta Tyr Tyr Thr Met ser Asn Asn Leu Val 145 ISO ctg acc gtt aaa aga caa gga ctc tat Leu Thr Val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr 165 ttc tgt tcc aat cgg gaa gct teg agt Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser 180 135 ctc tgc cta aag tcc ccc ggt aga ttc Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe 195 200 gea aat acc eac agt tcc gee aaa cct Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro 210 215 ttg gga gga gta ttt gaa ttg caa cca Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gin Pro 225 230 gtg act gat cca age caa gtg age cat Val Thr Asp Pro Ser Gin Val Ser His 245 ggc tta ctc aaa ctc tga Gly Leu Leu Lys Leu * 260 140 acc ctg gaa aat ggg aaa cag 480 Thr Leu 155 Glu Asn Gly Lys Gin 160 tat ate tat gee caa gtc acc 528 Tyr 170 He Tyr Ala Gin val 175 Thr caa gct cca ttt ata gee age 576 Gin Ala Pro Phe Ile Ala 190 Ser gag aga ate tta ctc aga gct 624 Glu Arg Ile Leu 205 Leu Arg Ala tgc ggg caa caa tcc att cac 672 Cys Gly Gin 220 Gin Ser Ile His ggt gct teg gtg ttt gtc aat 720 Gly Ala 235 Ser Val Phe val Asn 240 ggc act ggc ttc acg tcc ttt 768 Gly 250 Thr Gly Phe Thr Ser 255 Phe 169 786 <210> 14 <211> 261 <212> PRT <213> Homo <400> 14

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Vai Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gin Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Vai Tyr Leu His Arg 35 40 45 Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu HiB Glu Asp Phe Vai 50 55 60 Phe Met Lys Thr ile Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser 65 70 75 80 Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gin Phe Glu Gly Phe Vai Lys 85 90 95 Asp lie Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu 100 105 110 Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin Ile Ala Ala His vai ile Ser 115 120 • 125 Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Vai Leu Gin Trp Ala Glu Lys Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Vai Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin 145 150 155 160 Leu Thr Vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gin Vai Thr 165 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala 195 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser Ile His 210 215 220 Leu Gly Gly Vai Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Vai Phe Vai Asn 225 230 235 240 Vai Thr Asp Pro ser Gin Vai Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lys Leu 260 <210> 15 <211> 648 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (D ... (648) 170 <221> carácter misto <222> (0) ... (0) <223> CD40L solúvel <4 0 0> 15 cat aga agg ttg gac aag ata gaa gat gaa agg aat Gtt cat gaa gat 48 HÍS Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp 1 5 10 15 ttt gta tte atg aaa acg ata cag aga tgc aac aca gga gaa aga tcc 96 Phe Val Phe Hat hys Thr Ile Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser 20 25 30 tta tcc tta etg aac tgt gag gag att aaa age cag ttt gaa 990 ttt 144 Leu Ser Leu Leu Asn cys Glu Glu Ile Lys Ser Gin Phe GlU Gly Phe 35 40 45 gtg aag gat ata atg tta aac aaa gag gag acg aag aaa gaa aac age 192 vai Lys Asp ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser 50 55 60 ttt gaa atg caa aaa ggt gat cag aat cct caa att gcg gea cat. gtc 240 Phe Glu Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin Ile Ala Ala His val 65 70 75 80 ata agt gag gcc age agt aaa aca aca tet gtg tta cag tgg gct gaa 288 Ile Ser Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr ser Val Leu Gin Trp Ala Glu 85 90 95 aaa gga tac tac acc atg age aac aac ttg gta acc ctg gaa aat ggg 336 Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu val Thr Leu Glu Asn Gly 100 105 110 aaa cag ctg acc gtt aaa aga caa gga ctc tat tat ate tat gcc caa 384 Lys Gin Leu Thr Val Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gin 115 120 125 gtc acc ttc tgfc tcc aat cgg gaa gct teg agt caa gct cca ttt ata 432 val Thr Phe cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gin Ala Pro phe Ile 130 135 140 gcc age ctc tgc cta aag tcc ccc ggt aga ttc sag aga ate tta ctc 480 Ala Ser Leu cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu 145 150 155 160 aga gct gea aat acc cac agt tcc gcc aaa ect tgc 999 caa caa tcc 528

Arg Ala Ala Asn Thr HiS Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gin Gin Ser 165 170 175 att cac ttg gga gga gta ttt gaa ttg caa cca ggt gct teg gtg ttt 576 ile His Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser Val Phe 180 185 190 gtc aat gtg act gat cca age caa gtg age cat ggc act ggc ttc acg 624 Val Asn val Thr Asp Pro Ser Gin Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr 195 200 205 tcc ttt ggc tta ctc aaa ctc tga 648 ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu *

210 21S 171

<210> 16 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16

His Arg Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp 1 Phe Vai Phe Met 5 Lys Thr ile Gin Arg 10 Cys Asn Thr Gly Glu 15 Arg Ser Leu Ser Leu 20 Leu Asn Cys Glu 25 Glu Ile Lys Ser Gin Phe 30 GlU Gly Phe Vai 35 Lys Asp ile Met 40 Leu Asn Lys Glu Glu Thr 45 Lys Lys Glu Asn Ser Phe 50 Glu Met Gin Lys 55 Gly Asp Gin Asn Pro Gin 60 Ile Ala Ala His Vai 65 Ile Ser Glu Ala Ser 70 Ser Lys Thr Thr Ser 75 Vai Leu Gin Trp Ala 80 Glu Lys Gly Tyr Tyr 85 Thr Met Ser Asn Asn 90 Leu Vai Thr Leu Glu 95 Asn Gly Lys Gin Leu 100 Thr Vai Lys Arg 105 Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile 110 Tyr Ala Gin Vai 115 Thr Phe Cys Ser Asn Arg 120 Glu Ala Ser Ser 125 Gin Ala Pro Phe Ile Ala 130 Ser Leu Cys Leu 135 Lys Ser Pro Gly Arg Phe 140 Glu Arg Ile Leu Leu 145 Arg Ala Ala Asn Thr 150 His Ser Ser Ala Lys 155 Pro Cys Gly Gin Gin 160 Ser Ile His Leu 165 Gly Gly Vai Phe Glu Leu 170 Gin Pro Gly Ala Ser 175 Vai Phe Vai Asn Vai 180 Thr Asp Pro Ser 185 Gin Vai Ser His Gly Thr 190 Gly Phe Thr 195 200 205

Ser Phe Gly Leu Leu Lys Leu 210 215 172

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a identificação de um indivíduo com uma doença inflamatória ou doença autoimune que é sensível ao tratamento com um agente terapêutico anti-CD40, o referido método compreendendo: a) proporcionar uma amostra biológica de teste e uma amostra de controlo biológico obtida a partir do referido sujeito, em que a referida amostra de teste a referida amostra de controlo biológico compreende células que expressam CD40, que foram estimuladas com um ligando de CD40; b) contactar a referida amostra biológica de teste com uma quantidade eficaz do referido agente terapêutico anti-CD4 0; c) detecção do nível de pelo menos um bio marcador na referida amostra biológica de teste, em que o referido bio marcador é selecionado de entre o grupo constituído por: (i) um bio marcador da apoptose celular, em que o referido bio marcador da apoptose é selecionado a partir do grupo constituído por uma proteína Caspase clivada, poli ADP-ribose-polimerase clivada (PARP), expressão de superfície celular de fosfotidilserina (PS), fragmentação de ADN genómico, e quaisquer combinações dos mesmos; (ii) um bio marcador de CD40L mediado por via de sinalização de CD40, em que o referido CD40L mediado por via de sinalização de CD40 é selecionado a partir do grupo consistindo por a via de sinalização de AKT, a via de sinalização de NF-kB, e via de sinalização de uma proteína quinase ativada por mitogénio (MAPK), e o dito bio marcador do referido CD40L mediado por via de 1 sinalização de CD40 é selecionado a partir do grupo consistindo em fosfo-PI3K, fosfo-PDKl, fosfo-Akt, fosfo-MEK, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-ΙΚΚα/β, proteína fosfo-IkB e NF-kB ativada; e (iii) um bio marcador da sobrevivência das células, em que o referido bio marcador da sobrevivência celular é selecionado a partir do grupo consistindo numa proteína anti-apoptótica que é um membro da família Bcl-2, uma proteína inibidora da apoptose IAP e receptor de TNF associado ao factor-1 (TRAF-1); e d) comparação do nível do referido pelo menos um bio marcador na referida amostra biológica de teste para o nível do referido pelo menos um bio marcador detectado na referida amostra de controlo biológico, em que a referida amostra de controlo biológico não foi posta em contacto com o referido agente terapêutico anti-CD40, caracterizado por (i) um aumento do nível de pelo menos um dos referidos bio marcadores de apoptose; e/ou (ii) a redução do nível de pelo menos um dos referidos bio marcadores de pelo menos um dos referidos CD40L mediado por via de sinalização CD40; e/ou (iii) redução do nível de pelo menos um dos referidos bio marcadores de sobrevivência das células; na referida amostra biológica de teste em relação à referida amostra de controlo biológico é indicativa de um sujeito que beneficiaria do tratamento com o referido agente terapêutico anti-CD40, e em que o referido agente terapêutico anti-CD40 é um anticorpo monoclonal antagonista anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio deste que é capaz de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula B humana, e que é 2 isenta de atividade agonista significativa quando ligada ao antigénio CD40 expresso na superfície da referida célula B.
2. Método da reivindicação 1, em que as referidas células que expressam CD40 foram estimuladas ex vivo com um ligando de CD40, antes do referido passo de contacto.
3. Método da reivindicação 2, em que o referido ligando de CD40 é selecionado do grupo consistindo em CD40L solúvel e CD40L ligado à membrana.
4. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido antagonista de anticorpo monoclonal anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio do mesmo está isento de atividade agonista significativa numa resposta celular.
5. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o referido antagonista de anticorpo monoclonal anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio do mesmo está isento de atividade agonista significativa em ensaios de mais do que uma resposta celular.
6. Método da reivindicação 4 ou reivindicação 5, em que o referido antagonista de anticorpo monoclonal anti-CD40 ou o fragmento de ligação ao antigénio do mesmo atua como um antagonista de pelo menos uma resposta de células B selecionado de entre o grupo constituído por proliferação de células B, diferenciação de células B, produção de anticorpos, adesão intercelular, geração de células B de memória, comutação de isótipo, sobre regulação da expressão na superfície celular de MHC de Classe II e CD80/86, e da secreção de citoquinas pró-inflamatórias . 3
7. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado por a referida proteína caspase clivada ser selecionada a partir do grupo consistindo em caspase-3 clivada, caspase-7 clivada, e caspase-9 clivada.
8. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a superfície celular PS é detectada por coloração com anexina V, em que a fragmentação de ADN genómico, é detectada por coloração TUNEL.
9. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a referida via de sinalização MAPK é selecionada a partir do grupo consistindo na via de sinalização MEK/ERK e na via de sinalização MEK/p38.
10. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido membro da família Bcl-2 é selecionado a partir do grupo constituído por Bcl-XL e Mcl-1.
11. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, ou reivindicação 10, em que o referido inibidor da apoptose da proteína IAP é selecionado a partir do grupo consistindo em survivina, XIAP e cIAPl.
12. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, que compreende ainda detectar na referida amostra biológica de teste e na referida amostra biológica de controlo o nível de pelo menos um marcador de citoquinas de sinalização CD40.
13. Método da reivindicação 12, em que o referido marcador de citoquina é selecionado do grupo consistindo em fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), interleucina (IL-6), IL-8, IL-10, factor estimulante de 4 colónias de monócitos granulócitos (GM-CSF ), factor de necrose tumoral cx (TNF-cx), proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1), e proteína-ΐβ inflamatória de macrófagos (MIP-Ιβ).
14. Método da reivindicação 12 ou 13, em que a redução do nivel de pelo menos um dos referidos marcadores de citoquina na referida amostra biológica de teste em relação à referida amostra biológica de controlo é um indicativo de um sujeito que beneficiaria do tratamento com o referido agente terapêutico anti-CD40.
15. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido anticorpo monoclonal anti-CD40 é capaz de se ligar especificamente a um antigénio CD40 humano expresso à superfície de uma célula que expressa o CD40, modulando assim a atividade do anticorpo dependente da citotoxicidade mediada por células (ADCC) , e em que o referido bio marcador é um bio marcador da apoptose.
16. Método da reivindicação 15, em que um aumento do nivel de pelo menos um dos referidos bio marcadores de apoptose no interior da referida amostra biológica de teste em relação à referida amostra biológica de controlo é um indicativo de um sujeito que beneficiaria do tratamento com o referido anticorpo anti-CD40.
17. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, compreendendo ainda a detecção do nivel de expressão de superfície celular CD40 numa amostra biológica do referido indivíduo, o nível de expressão do CD40L da superfície celular, ou ambos, em células que expressam CD40 dentro da referida amostra biológica. 5
18. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, que compreende ainda detectar os niveis de circulação de CD40 solúvel circulante ou CD40L solúvel numa amostra biológica recolhida a partir sujeito.
19. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a detecção do nível do referido bio marcador compreende a utilização de um anticorpo para detectar a expressão do bio marcador da proteína.
20. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a detecção do nível do referido bio marcador compreende a hibridação de ácido nucleico.
21. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que a detecção do nível do referido bio marcador compreende realizar a RT-PCR quantitativa.
22. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o referido fragmento de anticorpo anti-CD40 ou de ligação ao antigénio deste é selecionado a partir do grupo que consiste em: a) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio deste que se liga a um epítopo compreendendo os resíduos 82-87 da sequência de CD40 humano mostrada na SEQ ID n°: 10 ou SEQ ID n°: 12; e b) um anticorpo ou fragmento de ligaçãoo ao antigénio deste que se liga a um epítopo compreendendo os resíduos 82-89 da sequência de CD40 humano apresentada na SEQ ID n°: 10 ou SEQ ID n°: 12.
23. Método de qualquer reivindicação anterior, em que o referido antagonista do anticorpo monoclonal anti-CD40 6 ou o fragmento de ligação ao antigénio deste é selecionado a partir do grupo que consiste em: (i) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, que compreende um domínio variável de cadeia leve contendo os resíduos da região determinante de complementaridade (CDR) da SEQ ID n°: 2 e um domínio variável de cadeia pesada contendo os resíduos da região determinante de complementaridade (CDR) da SEQ ID n°: 4; e (ii) um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigénio, compreendendo uma variável de cadeia leve domínio contendo os resíduos da região determinante de complementaridade (CDR) da SEQ ID n°: 6, e um domínio variável de cadeia pesada contendo os resíduos da região determinante de complementaridade (CDR) da SEQ ID n°: 7.
24. Método da reivindicação 23, em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigémio do mesmo, compreende uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo consistindo em: (i) SEQ ID n°2: 2; (ii) SEQ ID n° 4; (iii) SEQ ID n°5: 5; (iv) SEQ ID n°: 2 e SEQ ID n°: 4; (v) SEQ ID n°: 2 e SEQ ID n°: 5 (vi) SEQ ID n°: 6; (vii) SEQ ID n°: 7; 7 (viii) SEQ ID n°: 8; (ix) SEQ ID n°: 6 e SEQ ID n°: 7; e (x) SEQ ID n°: 6 e SEQ ID n°: 8, ou um fragmento de ligação ao antigénio dos mesmos, em gue o referido fragmento retém a capacidade de se ligar especificamente ao antigénio CD40 humano.
25. Método de qualquer reivindicação precedente, em que o referido fragmento de ligação ao antigénio de um anticorpo anti-CD40 é selecionado do grupo que consiste num fragmento Fab, um fragmento F (ab')2, um fragmento Fv e um fragmento Fv de cadeia única.
26. Método de qualquer reivindicação anterior, em que a dita doença inflamatória ou doença autoimune é selecionada de entre o grupo consistindo em lúpus eritematoso sistémico (LES), lúpus discóide, nefrite lúpica, sarcoidose, artrite juvenil, artrite reumatoide, artrite psoriática, sindrome de Reiter, espondilite anquilosante, artrite gotosa, rejeição de um órgão ou transplante de tecido, doença do enxerto versus hospedeiro, esclerose múltipla, sindrome hiper IgE, poliarterite nodosa, cirrose biliar primária, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, doença celiaca (enteropatia sensivel ao glúten), hepatite autoimune, anemia perniciosa, anemia hemolitica autoimune, psoriase, esclerodermia, miastenia gravis, púrpura trombocitopénica autoimune, tireoidite autoimune, doença de Graves, tireoidite de Hashimoto, doença do complexo imune, sindrome de disfunção imunológica da fadiga crónica (CFIDS), polimiosite e dermatomiosite, crioglobulinemia, 8 trombólise, cardiomiopatia pênfigo vulgar, fibrose intersticial pulmonar, sarcoidose, diabetes mellitus tipo I e tipo II, hipersensibilidade tardia tipo 1, 2, 3 e 4, alergia ou doenças alérgicas, asma, síndrome de Churg-Strauss (granulomatose alérgica), dermatite atópica, dermatite de contacto alérgica e irritante, urticária, alergia mediada por IgE, aterosclerose, vasculite, miopatias inflamatórias idiopáticas, doença hemolitica, doença de Alzheimer, e polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica. 9