BRPI0707126A2

BRPI0707126A2 - anticorpos para ox-2/cd200 e uso destes

Info

Publication number: BRPI0707126A2
Application number: BRPI0707126-4A
Authority: BR
Inventors: Katherine S Bowdish; Anke Kretz-Rommel; Mcknight Sysan Faas; Jeremy P Springhorn; Dayang Wu
Original assignee: Alexion Pharma Inc
Priority date: 2006-01-12
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2011-04-19
Also published as: ES2586825T3; AU2007207764A1; US8709415B2; RU2008133032A; JP2012193215A; NZ569903A; CA2636577A1; NZ599035A; TW200804422A; HUE028179T2; IL192668A0; JP5911391B2; PT2463305T; EP2463305B1; KR20080099262A; US20100285030A1; EP3101033B1; EP1984403A2; CN103690947A; US9000133B2

Abstract

ANTICORPOS PARA OX-2/CD200 E USO DESTES. Este pedido fornece métodos e composições para modular e/ou esvaziar células positivas CD200.

Description

"ANTICORPOS PARA OX-2/CD200 E USO DESTES"

Pedidos relacionados

O presente pedido reivindica os benefícios dos pedidos U.S. provisórios de Nos.60/758,426, depositado em 12 de Janeiro de 2006, 60/759,085, depositado em 12 deJaneiro de 2006, e 60/801,991, depositado em 18 de Maio de 2006, cujos pedidos seencontram aqui incorporados por referência em suas totalidades.

Campo Técnico

A descrição se refere a antagonistas OX-2/CD200 (aqui referido como CD200) emétodos de esvaziar ou eliminar as células que super expressam CD200 em um indivíduocom câncer ou doença auto-imune. Os métodos de terapia para o tratamento de câncerproporcionam uma combinação de dois mecanismos. Mais especificamente, a presentedescrição se refere ao tratamento de câncer usando uma terapia que: (1) interfere com ainteração entre CD200 e o seu receptor para bloquear a supressão imune deste modopromovendo a erradicação das células cancerosas; e/ou (2) exterminar diretamente ascélulas cancerosas seja por (a) citotoxicidade celular dependente de anticorpo oucitotoxicidade mediada a complemento ou por (b) direcionar as células usando umamolécula de fusão que inclui uma porção de direcionamento CD200. A descrição se refereainda a um método de tratar desordens auto-imunes por uma terapia que aumenta acitotoxicidade celular dependente de anticorpo e/ou a citotoxicidade mediada acomplemento de células imunes positivas CD200.

Antecedentes

Diversos mecanismos desempenham um papel na resposta do corpo a um estadomórbido, incluindo câncer. Por exemplo, células T auxiliadoras CD4+ desempenham umpapel crucial em uma resposta imune efetiva contra diversas malignidades ao proporcionarfatores estimulatórios para as células efetoras. Acredita-se que as células T citotóxicassejam as células mais eficientes para eliminar células cancerosas, e que as células Tauxiliadoras inicializam as células T citotóxicas ao secretar citocinas Th1 tais como IL-2 eIFN-γ. Em diversas malignidades, as células T auxiliadoras mostraram apresentar umfenótipo alterado em comparação às células encontradas em indivíduos saudáveis. Uma dascaracterísticas alteradas proeminentes é descrita pela produção de citocina Th1 e um desviopara a produção de citocinas Th2. (Ver, por exemplo, Kiani, et al., Haematologica 88:754 -761 (2003); Maggio, et al., Ann Oncol 13 Suppl 1:52 -5 6 (2002); Ito, et al., Câncer 85:2359- 2367 (1999); Podhorecka, et al., Leuk Res 26:657 - 660 (2002); -Tatsumi, et al., J ExpMed 196:619 - 628 (2002); Agarwal, et al., Immunol Invest 32:17 - 30 (2003); Smyth, etal., Ann Surg Oncol 10:455 - 462 (2003); Contasta, et al., Câncer Biother Radiopharm18:549 - 557 (2003); Lauerova, et al., Neoplasma 49:159 - 166(2002)). A reversão doreferido desvio de citocina a um perfil de Th1 foi demontrado aumentar Oe efeitos dascélulas Τ. (Ver, Winter1 et at., Immunology 108:409 - 419 (2003); Inagawa, et al.,Anticancer Res 18:3957 - 3964 (1998)).

Os mecanismos subjacentes à capacidade da célula tumoral de direcionar aexpressão de citocina das células auxiliadoras T a partir de Th1 para Th2 incluem asecreção de citocinas tais como IL-10 ou TGF-/? assim como a expressão de moléculas desuperfície que interagem com as células do sistema imune. CD200, uma molécula expressana superfície das células dendríticas que possui um alto de grau de homologia paramoléculas da família do gene da imunoglobulina, esteve implicada na supressão imune(Gorczynski et al., Transplantation 65:1106 - 1114 (1998)). Foi mostrado, por exemplo,que as células que expressam Cd200 podem inibir a estimulação da produção decitocina Th 1.

Embora as células imunes possam ajudar no ataque e na eliminação de célulascancerosas, em déterminados casos, tais como em desordens auto-imunes, alergias e a*rejeição de tecido ou transplante de órgãos, o sistema imune pode ser a causa dadoença. De modo a inibir as reações imunes prejudiciais nos referidos casos, agentesimunossupressores tais como corticosteróides e antagonistas de citocina podem seradministrados a pacientes. Entretanto, os referidos imunossupressores gerais podemsuscitar efeitos colaterais indesejáveis incluindo toxicidade e resistência reduzida àinfecção. Assim, métodos alternativos e talvez mais específicos de tratamento de auto-imunidade são necessários.

Diversas terapias imunomodulatórias, incluindo terapias de anticorpo, provaramser bem sucedidas no tratamento de determinados cânceres e desordens auto-imunes.

Entretanto, há uma necessidade clínica para terapias de anticorpo adicionais para otratamento tanto do câncer como das desordena auto-imunes. Ademais, há umanecessidade relacionada para anticorpos monoclonais humanizados ou outros humanoquiméricos/rato. Em estudos bem publicados, os pacientes administrados comanticorpos monoclonais anti-TNF de murino (fator de necrose de tumor) desenvolveramrespostas de anticorpo anti-murino para o anticorpo administrado. (Exley A. R., et al.,Lancet 335:1275 - 1277 (1990)). Este tipo de resposta imune ao regime de tratamento,comumente referido como resposta de anticorpo anti-rato humana (HAMA) (Mirick et al.Q J Nucl Med Mol Imaging 2004; 48: 251 - 7), reduz a eficácia do tratamento e podemesmo tornar o tratamento completamente ineficaz. Os anticorpos monoclonaishumanizados ou humano quimérico/rato foram mostrados significativamente reduzir aresposta de HAMA e de aumentar a eficácia terapêutica dos tratamentos de anticorpo.

Ver, por exemplo, LoBugIio et al., P.N.A.S 86: 4220 - 4224 (Junho de 1989). Ademais,os anticorpos nos quais as funcionalidades particulares são ou aumentadas oureduzidas podem encontrar aplicação útil na clínica.Sumário

A presente descrição se refere a agentes e métodos para a modulação dafunção de CD200. Os agentes que modulam a função de CD200 incluem os agentesque modulam a atividade e/ou a expressão de CD200 e/ou de seu receptor (CD200R).

Em algumas modalidades, os agentes inibem a função ou a atividade de CD200. Assim,em determinados aspectos, os referidos agentes atual como antagonistas ao CD200.Determinados antagonistas podem se ligar a CD200 e inibir ou interromper a interaçãode CD200 com o seu receptor. Outros antagonistas podem se ligar ao CD200 maspodem não bloquear a interação de CD200:CD200R. Assim os antagonistas CD200incluem quaisquer agentes que sejam capazes de modulação dos efeitos de CD200 pormecanismos que possam ou não incluir o bloqueio da interação de CD200:CD200R. Osantagonistas de CD200 incluem, mas não são limitados a, polipeptídeos, moléculaspequenas, compostos organometálicos, construtores de oligonucleotídeo, construtoresde RNAi, aptâmeros, spiegelmers, ácidos nucléicos anti-sentido, inibidores de ácidonucléico travado (LNA), inibidores de ácido peptídeo nucléico (PNA), agentesimunomodulatórios, anticorpos, fragmentos de ligação de antígeno, pró-fármacos, e/oucompostos peptidomiméticos.

Em determinadas modalidades, o referido antagonista é um anticorpo anti-CD200.Anticorpos, como referidos aqui, incluem fragmentos de ligação de antígeno, Fab, Fv1 scFv,Fab' e F(ab')2, anticorpos monoclonais e policlonais, anticorpos trabalhados por engenharia(incluindo quiméricos, de cadeia simples, CDR enxertado, humanizado, anticorposcompletamente humanos, e anticorpos aartificialmetne selecionados), e anticorpos sintéticosou semi-sintéticos.

Em determinados aspectos, a presente descrição se refere a anticorpos anti-CD200quiméricos, humanizados, humanos e de-imunizados e fragmentos de ligação a antígenodos mesmos. Em modalidades adicionais, um anticorpo da descrição compreende umacadeia pesada que compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos 90%idêntica a uma seqüência de amino ácido selecionada entre SEQ ID NOS: 7, 9, 11 e 20 oufragmentos dos mesmos. Incluído está um anticorpo que compreende uma seqüência deamino ácido que é cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou100% idêntica ou similar a uma seqüência de amino ácido proporcionada nas SEQ IDNOS: 7, 9, 11 e 20 ou fragmentos dos mesmos (incluindo mas não são limitados aosfragmentos que correspondem às seqüências sem as seqüências líderes). O referidoanticorpo pode adicionalmente pode adicionalmente compreender uma cadeia leve quecompreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos 90% idêntica ou similar auma seqüência de amino ácido selecionada entre as SEQ ID NOS: 24, 26, 28 e 32, oufragmentos dos mesmos. Da mesma forma, a seqüência de amino ácido acima mencionadapode ser de cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou100% idêntica ou similar a uma seqüência de amino ácido proporcionada nas SEQ IDNOS: 24, 26, 28 e 32, ou fragmentos dos mesmos (incluindo mas não são limitados aosfragmentos que correspondem às seqüências sem as seqüências líderes).

Em uma modalidade, a descrição se refere à um anticorpo anti-CD200 quecompreende uma cadeia pesada que compreende uma seqüência de amino ácido que épelo menos cerca de 90% idêntica à seqüência de amino ácido da SEQ ID NO: 7 e aindacompreende uma cadeia leve que compreende uma seqüência de amino ácido que é pelomenos cerca de 90% idêntica à SEQ ID NO: 24. Também incluídos estão os anticorpos anti-CD200 que compreende as seqüências de amino ácido que são cerca de 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica ou similares a uma ou maisseqüência de amino ácido proporcionada nas SEQ ID NOS: 7 e 24 ou fragmentos dosmesmos. Os fragmentos incluem, mas não são limitados a, seqüências quecorrespondem às seqüências determinadas em SEQ ID NOS: 7 e 24 sem asseqüências líderes. Assim, a descrição se refere a um anticorpo anti-CD200 quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada pela seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições rigorosas à seqüência de amino ácido da SEQ IDNO: 6 (incluindo os fragmentos da mesma e complementa a mesma) e tambémcompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições rigorosas a uma seqüência de ácido nucléico daSEQ ID NO: 23 (incluindo os fragmentos da mesma e complementa a mesma). Aindaincluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de80% homóloga ou similar à seqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ IDNO: 6, incluindo os fragmentos do mesmo e complementa o mesmo, e aindacompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que é pelo menos 80% homóloga ou similar à seqüência de ácido nucléicoproporcionada pela SEQ ID NO: 23, incluindo os fragmentos da mesma e oscomplementos da mesma. A presente invenção ainda se refere a anticorpo anti-CD200 que compreendem uma seqüência de amino ácido codificada pela seqüênciade ácido nucléico que é de cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% homólogo ou similar a uma seqüência de ácidonucléico proporcionada na SEQ ID NO: 6 ou 23, incluindo os fragmentos da mesma eos complementos da mesma.

Em uma outra modalidade, a descrição se refere a um anticorpo anti-CD200que compreende uma cadeia pesada que compreende uma seqüência de amino ácidoque é pelo menos cerca de 90% idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO:9 e também compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos 90%idêntica à SEQ ID NO: 26. Ainda incluídos estão os anticorpo anti-CD200 quecompreendem seqüências de amino ácidos que são cerca de 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idênticas ou similares a uma ou maisseqüências de amino ácidos proporcionadas em SEQ ID NOS: 9 ou 26 ou fragmentosdas mesmas. Os fragmentos incluem, mas não são limitados a, seqüências quecorrespondem às seqüências determinadas nas SEQ ID NOS: 9 e 26 sem asseqüências líderes. Assim, a descrição se refere a um anticorpo anti-CD200 quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas na seqüência de ácido nucléico de SEQID NO: 8 (incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma) e aindacompreendendo uma seqüência de amino ácido codificada pela seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico deSEQ ID NO: 25 (incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma).

Ainda incluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 80% homólogaou similar a uma seqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NO: 8,incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma, e aindacompreendendo uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que é pelo menos cerca de 80% homóloga ou similar à seqüência de ácidonucléico proporcionada na SEQ ID NO: 25, incluindo os fragmentos da mesma e oscomplementos da mesma. A presente invenção ainda se refere a anticorpos anti-CD200que compreendem uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência deácido nucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99%, ou 100% homólogo ou similar a uma seqüência de ácido nucléicoproporcionada na SEQ ID NO: 8 ou 25, incluindo os fragmentos da mesma e oscomplementos da mesma.

Em uma outra modalidade, a descrição se refere a um anticorpo anti-CD200que compreende uma cadeia pesada que compreende uma seqüência de amino ácidoque é pelo menos cerca de 90% idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO:11 e também compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos 90%idêntica à SEQ ID NO: 26. Ainda incluídos estão os anticorpo anti-CD200 quecompreendem seqüências de amino ácidos que são cerca de 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idênticas ou similares a uma ou maisseqüências de amino ácidos proporcionadas em SEQ ID NOS: 11 ou 26 ou fragmentosdas mesmas. Os fragmentos incluem, mas não são limitados a, seqüências quecorrespondem às seqüências determinadas nas SEQ ID NOS: 11 e 26 sem asseqüências líderes. Assim, a descrição se refere a um anticorpo anti-CD200 quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas na seqüência de ácido nucléico de SEQID NO: 8 (incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma) e aindacompreendendo uma seqüência de amino ácido codificada pela seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico deSEQ ID NO: 25 (incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma).

Ainda incluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de aminoácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 80% homólogaou similar a uma seqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NO: 10,incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma, e aindacompreendendo uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que é pelo menos cerca de 80% homóloga ou similar à seqüência de ácidonucléico proporcionada na SEQ ID NO: 25, incluindo os fragmentos da mesma e oscomplementos da mesma. A presente invenção ainda se refere a anticorpos anti-CD200que compreendem uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência deácido nucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99%, ou 100% homólogo ou similar a uma seqüência de ácido nucléicoproporcionada na SEQ ID NO: 10 ou 25, incluindo os fragmentos da mesma e oscomplementos da mesma.

Em uma modalidade adicional, a descrição se refere a um anticorpo anti-GD200 que compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de90% idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO: 11 e ainda compreendendouma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de 90% idêntica à SEQ IDNO: 28. Ainda incluídos são os anticorpos anti-CD200 que compreendem asseqüências de amino ácidos que são cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98%, 99%, ou 100% idênticos ou similares a uma ou mais seqüências de aminoácidos proporcionadas em SEQ ID NOS: 11 e 28 ou fragmentos dos mesmos. Osfragmentos incluem, mas não são limitados a, seqüências que correspondem àsseqüências determinadas nas SEQ ID NOS: 11 e 28 sem as seqüências líderes. Assim,a descrição se refere a um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência deamino ácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que hibridiza sobcondições severas em uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 10 (incluindoos fragmentos da mesma e os complementos da mesma) e ainda compreendendo umaseqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que hibridizasob condições severas em uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 27(incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma). Ainda incluída estáuma anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido codificadapor uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 80% homóloga ousimilar a uma seqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NO: 10, incluindoos fragmentos da mesma e os complementos da mesma, e ainda compreendendo umaseqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelomenos cerca de 80% homóloga ou similar a uma seqüência de ácido nucléicoproporcionada na SEQ ID NO: 27, incluindo os fragmentos da mesma e oscomplementos da mesma. A presente invenção ainda se refere a anticorpos anti-CD200compreendendo uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,99%, ou 100% homólogo ou similar a uma seqüência de ácido nucléico proporcionadana SEQ ID NOS: 10 ou 27, incluindo os fragmentos da mesma e os complementos damesma.

Ainda em outra modalidade, a descrição se refere a um anticorpo anti-CD200compreendendo uma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de 90% idêntica àseqüência de amino ácido de SEQ ID NO: 20 e ainda compreende uma seqüência de aminoácido que é pelo menos cerca de 90% idêntica à SEQ ID NO: 32. Também incluídos estãoos anticorpos anti-CD200 que compreendem seqüências de amino ácidos que são cerca de90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% idêntica ou similar auma ou mais seqüências de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NO: 20 e 32, ouos fragmentos da mesma. Os fragmentos incluem, mas não são limitados a,seqüências que correspondem às seqüências determinadas em SEQ ID NOS: 20 e 32sem as seqüências líderes. Assim, a descrição se refere a um anticorpo anti-CD200que compreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência deácido nucléico que hibridiza sob condições severas na seqüência de ácido nucléico deSEQ ID NO: 19 (incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma) eainda compreendendo uma seqüência de amino ácido codificada pela seqüência deseqüência de ácido nucléico que hibridiza sob condições severas em uma seqüênciade ácido nucléico de SEQ ID NO: 31 (incluindo os fragmentos da mesma e oscomplementos da mesma). Ainda incluído está um anticorpo anti-CD200 quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que é pelo menos 80% homóloga ou similar a uma seqüência de ácidonucléico proporcionada na SEQ ID NO: 19, incluindo os fragmentos da mesma e oscomplementos da mesma, e ainda compreendendo uma seqüência de amino ácidocodificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 80%homóloga ou similar à seqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NO: 31,incluindo os fragmentos da mesma e os complementos da mesma. Incluídos, portanto,estão anticorpos anti-CD200 que compreendem uma seqüência de amino ácidocodificada por uma seqüência de ácido nucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% homóloga ou similar a umaseqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NOS: 19 ou 31, incluindo osfragmentos da mesma e os complementos da mesma.

Os anticorpos anti-CD200 proporcionados na presente descrição incluemanticorpos e fragmentos de ligação de antígeno com função alterada ou sem função efetora.

Incluídos são os anticorpos que compreendem uma constante alterada ou região Fc comfunções efetoras ou aumentadas ou reduzidas. A descrição também se refere a anticorposcom funções efetoras alteradas ou sem funções em virtude de afinidade de ligaçãoaumentada ou reduzida, que podem ser decorrentes de mudanças nas regiões variáveis.

Funções efetoras alteradas incluem, por exemplo, uma habilidade aumentada ou reduzidapara ligar um ou mais receptor Fc (FcR) ou célula efetora, maior ou menor citotoxicidadedependente de antígeno (ADCC), e/ou maior ou menor citotoxicidade dependente decomplemento (CDC). Anticorpos variantes incluem mas não são limitados a anticorpos nosquais a região constante ou região Fc contém uma ou mais inserções, deleções, e/ousubstituições de amino ácido. Em modalidades adicionais, os referidos anticorpos variantescompreendem uma região constante onde o CHI e a região de articulação são derivadas apartir do lgG2 humano e as regiões CH2 e CH3 são derivadas a partir de lgG4 humano.

Também incluídos são os anticorpos nos quais a constante ou região Fc exibe glicosilaçãoalterada. Os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno acima mencionados (incluindoanticorpos de cadeia simples) podem ser murino, quimérico, humanizado, completamentehumano, ou desimunizado; incluídos são os anticorpos que compreende as estruturas IgGI,lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgAI1 lgA2, IgA1 IgD, ou IgE. Ademais, os referidos anticorpos,incluindo fragmentos e variantes dos mesmos, podem ser anticorpos de bloqueio ou de nãobloqueio ou fragmentos dos mesmos.

Em determinados aspectos, a descrição proporciona anticorpos anti-CD200 queexibem função efetora diminuída ou sem função efetora. Anticorpos com função efetoradiminuída ou sem função efetora podem compreender uma região variante ou Fc alteradaou constante, tal como, por exemplo, uma região constante com uma ou mais substituições,inserções, e/ou deleções de amino ácidos, ou uma região constante com uma ou maismudanças em glicosilação. Uma região constante variante inclui, por exemplo, uma regiãoonde um ou mais amino ácidos são substituídos com alanina, tal como na mutação Ala-Aladescrita aqui, ou onde um ou mais grupos carboidrato é mudado, adicionado, ou removido.

Uma alteração no número e/ou localização dos grupos carboidrato pode ser alcançada aose produzir o referido anticorpo em tipos de células particulares para as quais modificaçõespós-translacionais seriam reduzidas, ausentes ou aumentadas. Em uma modalidade, afunção efetora dos anticorpos anti-CD200 é eliminada por troca do domínio constante deIgGI por um Domínio de fusão lgG2/4. Outras formas de eliminar uma função efetorapodem ser previstas tais como, por exemplo, mutação dos campos conhecidos por interagircom uma FcR ou inserção de um peptídeo na região de articulação, deste modo eliminandocampo críticos necessários para uma interação de FcR.

Em determinados aspectos e métodos da presente descrição, anticorpos anti-CD200 com funções efetoras alteradas ou sem funções compreendem anticorpos anti-CD200 com uma ou mais substituições, inserções, e/ou deleções de amino ácidos. Emdeterminadas modalidades, a referida variante de anticorpo anti-CD200 exibe reduzida ounenhuma função efetora. Em determinadas modalidades, a região constante variante (doreferido anticorpo variante) possui pelo menos cerca de 70% de homologia com a constantede seqüência nativa ou região Fc e/ou com a constante ou região Fc do anticorpo parenteou fragmento dos mesmos; em outras modalidades a constante variante ou região Fc possuipelo menos cerca de 80% de homologia ou similaridade com a mesma; em outrasmodalidades pelo menos cerca de 90% de homologia ou similaridade com a mesma e emmodalidades adicionais pelo menos cerca de 95% de homologia ou similaridade com amesma. Em modalidades particulares, uma variante de anticorpo compreende um construtorG2/G4. Deste modo, a presente descrição se refere a constante ou região Fc de umanticorpo anti-CD200 com reduzida ou nenhuma função efetora, onde a referida regiãoconstante compreende uma cadeia pesada que compreende uma seqüência de amino ácidoselecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 13, 15, 18, 22, e fragmentosdos mesmos. A presente descrição também se refere a uma região constante variante deum anticorpo anti-CD200 onde um anticorpo compreende uma seqüência de amino ácidoque é pelo menos cerca de 90% idêntica ou similar a uma seqüência de amino ácidoselecionada a partir de SEQ ID NOS: 13, 15, 18, 22, e fragmentos dos mesmos. Tambémincluídos na descrição são os anticorpos que compreendem uma seqüência de amino ácidoque é cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ousimilar a uma seqüência de amino ácido proporcionada nas SEQ ID NOS: 13, 15, 18, 22, efragmentos dos mesmos. Fragmentos incluem, mas não são limitados a, seqüências sem asseqüências líderes. Adicionalmente, em algumas modalidades uma região constante de umanticorpo anti-CD200 com reduzida ou nenhuma função efetora e que compreende oconstrutor G2/G4 é codificada por um ácido nucléico selecionado a partir do grupo queconsiste em SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 17, e 21, ou fragmentos dos mesmos e complementosaos mesmos. Em determinadas modalidades, um anticorpo anti-CD200 com reduzida ounenhuma função efetora é codificado por um ácido nucléico que compreende Umaseqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 80% homóloga ou similar a umaseqüência selecionada a partir de SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 17, e 21, incluindo fragmentosdos mesmos e complementos aos mesmos. Em outras modalidades, uma variante deanticorpo anti-CD200 é codificada por uma seqüência de ácido nucléico que compreendeuma seqüência que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 91%,98%, 99%, ou 100% homóloga ou similar a uma seqüência de ácido nucléico selecionada apartir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 17, e 21, incluindo fragmentos Sosmesmos e complementos aos mesmos. Ainda em outras modalidades, o ácido nucléico quecodifica uma variante de anticorpo anti-CD200 compreende uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléicoselecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 17, e 21, incluindofragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos. Incluídos são os fragmentos deligação de antígeno e ambos os anticorpos de bloqueio e de não bloqueio ou fragmentosdos mesmos.

Em uma modalidade, a presente descrição se refere a uma variante de anticorpoanti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de90% idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO: 13 e também que compreendeuma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de 90% idêntica a SEQ ID NO: 28.

Também incluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma ou mais seqüênciade amino ácidos que é cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou100% idêntica a uma seqüência de amino ácido proporcionada nas SEQ ID NOS: 13 e 28 oufragmentos dos mesmos. Fragmentos incluem, mas não são limitados a, seqüências quecorrespondem às seqüências determinadas em SEQ ID NOS: 13 e 28 sem as seqüênciaslíderes. Deste modo, a descrição se refere a uma variante de anticorpo anti-CD200 quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico de SEQ IDNO: 12 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos) e também quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico de SEQ IDNO: 27 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos). Também incluídoestá um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido codificadapor uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 80% homóloga a umaseqüência de ácido nucléico proporcionada nas SEQ ID NO: 12, incluindo fragmentos dosmesmos e complementos aos mesmos, e também que compreende uma seqüência deamino ácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de80% homóloga a uma seqüência de ácido nucléico proporcionada nas SEQ ID NO: 27,incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos. Incluídos, portanto, sãoanticorpos anti-CD200 que compreendem uma seqüência de amino ácido codificada poruma seqüência de ácido nucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% homóloga a uma seqüência de ácido nucléicoproporcionada nas SEQ ID NOS: 12 ou 27, incluindo fragmentos dos mesmos ecomplementos aos mesmos.

Em uma outra modalidade, a descrição se refere a uma variante de anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de 90%idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO: 15 e também que compreende umaseqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de 90% idêntica a SEQ ID NO: 24.

Também incluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de aminoácido que é cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%idêntica a uma ou mais seqüência de amino ácidos proporcionada nas SEQ ID NOS: 15 e24 ou fragmentos dos mesmos. Fragmentos incluem, mas não são limitados a, seqüênciasque correspondem às seqüências determinadas em SEQ ID NOS: 15 e 24 sem asseqüências líderes (por exemplo, o fragmento da SEQ ID NO: 15 iniciando no amino ácidoou 21). Deste modo, a descrição se refere a uma variante de anticorpo anti-CD200 que15 compreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico de SEQ IDNO: 14 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos) e também quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico de SEQ IDNO: 23 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos). Também incluídoestá um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido codificadapor uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 80% homóloga a umaseqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NO: 14, incluindo fragmentos dosmesmos e complementos aos mesmos, e também que compreende uma seqüência deamino ácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de80% homóloga a uma seqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NO: 23,incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos. Incluídos, portanto, sãoanticorpos anti-CD200 que compreendem uma seqüência de amino ácido codificada poruma seqüência de ácido nucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% homóloga a uma seqüência de ácido nucléicoproporcionada nas SEQ ID NOS: 14 ou 23, incluindo fragmentos dos mesmos ecomplementos aos mesmos.

Em uma modalidade adicional, a descrição se refere a uma variante de anticorpoanti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de90% idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO: 13 e também que compreendeuma seqüência de amino ácido que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 28. Tambémincluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma ou mais seqüências de aminoácidos que é cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%idêntica a uma seqüência de amino ácido proporcionada nas SEQ ID NOS: 13 e 28 oufragmentos dos mesmos. Os fragmentos incluem, mas não são limitados a, seqüências quecorrespondem às seqüências determinadas em SEQ ID NOS: 13 e 28 sem as seqüênciaslíderes. Deste modo, a descrição se refere a uma variante de anticorpo anti-CD200 quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico de SEQ IDNO: 16 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos) e também quecompreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência de ácidonucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico de SEQ IDNO: 27 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos). Também incluídoestá um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido codificadapor uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 80% homóloga a umaseqüência de ácido nucléico proporcionada nas SEQ ID NO: 16, incluindo fragmentos dosmesmos e complementos aos mesmos, e também que compreende uma seqüência deamino ácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de80% homóloga a uma seqüência de ácido nucléico proporcionada na SEQ ID NO: 27,incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos. Incluídos, portanto, sãoanticorpos anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido codificada por umaseqüência de ácido nucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% homóloga a uma seqüência de ácido nucléicoproporcionada nas SEQ ID NOS: 16 ou 27, incluindo fragmentos dos mesmos ecomplementos aos mesmos.

Em ainda uma outra modalidade, a descrição se refere a uma variante de anticorpoanti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de90% idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO: 18 e também que compreendeuma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de 90% idêntica a SEQ ID NO: 30.

Também incluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de aminoácido que é cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%idêntica a uma seqüência de amino ácido proporcionada nas SEQ ID NOS: 18 e 30 oufragmentos dos mesmos. Deste modo, a descrição se refere a uma variante de anticorpoanti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüênciade ácido nucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléicode SEQ ID NO: 17 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos) etambém que compreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência deácido nucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico deSEQ ID NO: 29 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos). Tambémincluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácidocodificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 80% homólogaa uma seqüência de ácido nucléico proporcionada nas SEQ ID NO: 17, incluindo fragmentosdos mesmos e complementos aos mesmos, e também que compreende uma seqüência deamino ácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos 80%homóloga a uma seqüência de ácido nucléico proporcionada nas SEQ ID NO: 29, incluindofragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos. Incluídos, portanto, são anticorposanti-CD200 que compreendem uma seqüência de amino ácido codificada por umaseqüência de ácido nucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% homóloga a uma seqüência de ácido nucléicoproporcionada nas SEQ ID NOS: 17 ou 29, incluindo fragmentos dos mesmos ecomplementos aos mesmos.

Em uma outra modalidade, a descrição se refere a uma variante de anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de 90%idêntica à seqüência de amino ácido de SEQ ID NO: 22 e também que compreende umaseqüência de amino ácido que é pelo menos cerca de 90% idêntica a SEQ ID NO. 34.

Também incluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de aminoácido que é cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100%idêntica a uma seqüência de amino ácidos proporcionada nas SEQ ID NOS: 22 e 34 oufragmentos dos mesmos. Deste modo, a descrição se refere a uma variante de anticorpoanti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüênciade ácido nucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléicode SEQ ID NO: 21 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos) etambém que compreende uma seqüência de amino ácido codificada por uma seqüência deácido nucléico que hibridiza sob condições severas a uma seqüência de ácido nucléico deSEQ ID NO: 33 (incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos). Tambémincluído está um anticorpo anti-CD200 que compreende uma seqüência de amino ácidocodificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de 80% homólogaa uma seqüência de ácido nucléico proporcionada nas SEQ ID NO: 21, incluindo fragmentosdos mesmos e complementos aos mesmos, e também que compreende uma seqüência deamino ácido codificada por uma seqüência de ácido nucléico que é pelo menos cerca de80% homóloga a uma seqüência de ácido nucléico proporcionada nas SEQ ID NO: 33,incluindo fragmentos dos mesmos e complementos aos mesmos. Incluídos, portanto, sãoanticorpos anti-CD200 que compreendem uma seqüência de amino ácido codificada poruma seqüência de ácido nucléico que é cerca de 80%, 85%, 90%5 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% homóloga a uma seqüência de ácido nucléicoproporcionada nas SEQ ID NOS: 21 e 33, incluindo fragmentos dos mesmos ecomplementos aos mesmos.

Anticorpos anti-CD200 com função efetora alterada podem também exibir funçãoefetora aumentada. Funções efetoras aumentadas incluem mas não são limitadas a maiorligação a um ou mais receptores de Fcs1 maior habilidade para suscitar ADCC, e/ou maiorhabilidade para suscitar CDC. Os anticorpos anti-CD200 com função efetora aumentadapodem também compreender uma variante de Fc ou região constante como descrito aqui.

Os anticorpos anti-CD200 acima mencionados com funções efetoras alteradas podemadicionalmente ser anticorpos de bloqueio ou de não bloqueio. Por exemplo, um anticorpoanti-CD200 com função efetora aumentada pode se ligar a CD200 mas pode não bloquear ainteração CD200:CD200R. O referido anticorpo pode ser útil quando se direciona umafunção efetora (por exemplo, ADCC ou CDC) a uma Célula que expressa CD200. Comomencionado anteriormente, os anticorpos descritos aqui, incluindo os anticorpos anti-CD200acima mencionados com função efetora alterada(s), incluem anticorpos murino, quimérico,humanizado, completamente humano e desimunizado, todos em suas formas de bloqueio ede não bloqueio, e fragmentos dos mesmos.

Em determinados aspectos, a presente descrição proporciona métodos ecomposições para modular ou esvaziar Células positivas CD200. As células positivasCD200 podem ser moduladas ou esvaziadas ao se administrar um antagonista CD200 a umindivíduo. O referido antagonista pode estar direcionado a células positivas CD200 para umafunção efetora e/ou pode romper a interação CD200:CD200R. Em determinadasmodalidades, o referido antagonista é um anticorpo anti-CD200. O referido anticorpo anti-CD200 pode ser um anticorpo descrito aqui, incluindo quaisquer fragmentos e variantes dosmesmos. Incluídos estão os anticorpos e fragmentos de ligação de antígeno com funçãoefetora alterada(s), tal como, por exemplo, anticorpos anti-CD200 com função efetoradiminuída ou sem função efetora. Também incluídos estão os anticorpos murino, quimérico,humanizado, completamente humano e desimunizado e fragmentos de ligação de antígeno,incluindo anticorpos de cadeia simples. Os anticorpos acima mencionados podem seranticorpos de não bloqueio ou de bloqueio e incluem anticorpos que compreende asestruturas IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM1 IgAI, lgA2, IgA, IgD1 ou IgE.

As células positivas CD200 estão implicadas em determinados tipos de câncer edeterminadas doenças auto-imunes. Deste modo, células positivas CD200 incluem mas nãosão limitadas à células imunes (tais como, por exemplo, Células B e Células T) e célulascancerosas (tais como, por exemplo, células cancerosas de ovário, pele, pulmão, rins,mama, próstata, neuroblastoma, linfoma, mieloma, leucemia, tireóide, e cânceres de célulaplasmática). Também incluídas são células cancerosas provenientes de qualquer tecido ouórgão derivado a partir de células da crista neural. Assim, o indivíduo em necessidade deum método de modular ou esvaziar células positivas CD200 pode ser um paciente comcâncer ou doença auto-imune, ou um paciente que tenha recebido ou que se espera receberum órgão de transplante.

Em um aspecto a presente descrição proporciona métodos e composições paratratar doença auto-imune. Doenças auto-imunes que podem ser tratadas pelos métodos ecomposições aqui proporcionadas incluem, mas não são limitadas a artrite reumatóide,doença inflamatória do intestino(incluindo colite ulcerativa e Doença de Crohn), lúpuseritematoso sistêmico, esclerose múltipla, Tireoidite de Hashimoto1 anemia perniciosa,

Doença de Addison, diabetes do tipo I, dermatomiosite, Síndrome de Sjogren, lúpuseritematoso, miastenia gravis, Síndrome de Reiter, Doença de Grave, psoríase, e doençashemolíticas auto-imunes. Em algumas modalidades, um paciente com doença auto-imune édado um antagonista para CD200, e em determinadas modalidades, o antagonista é umanticorpo anti-CD200. O anticorpo anti-CD200 pode compreender uma região constantevariante como descrito aqui. Deste modo, o anticorpo anti-CD200 pode exibir função efetoraalterada(s), tal como, por exemplo, função efetora aumentada(s). O referido anticorpo podeexibir, por exemplo, maior ligação a um ou mais receptores de Fcs. Adicionalmente, oreferido anticorpo pode suscitar maior ADCC e/ou CDC. O referido anticorpo podeadicionalmente ser ou um anticorpo de bloqueio ou de não bloqueio ou fragmento dosmesmos e pode ser um anticorpo ou murino, quimérico, humanizado, completamentehumano ou desimunizado ou fragmento dos mesmos.

Cânceres para os quais os métodos descritos podem ser usados incluem, mas nãosão limitados a melanoma, câncer de ovário, câncer dos rins, neuroblastoma, câncer depulmão, câncer de mama, câncer de próstata, linfoma, mieloma, leucemia, e cânceres decélula plasmática. Também incluídos estão os cânceres derivados a partir de células dacrista neural e quaisquer cânceres que expressam CD200. Em determinadas modalidades,a presente descrição proporciona um método para tratar malignidades hematológicas, taiscomo, por exemplo, Ieucemias incluindo leucemia linfocítica crônica.

Em uma modalidade particularmente útil, uma terapia de câncer de acordo com apresente descrição compreende (1) administrar um anticorpo anti-CD200 ou antagonista queinterfere com a interação entre CD200 e seus receptores para bloquear a supressão imune,deste modo promovendo a erradicação das células cancerosas; e/ou (2) administrar umamolécula de fusão que inclui uma porção de direcionamento a CD-200 para diretamenteexterminar as células cancerosas. Alternativamente, o anticorpo diretamente extermina ascélulas cancerosas através de citotoxicidade mediada a complemento e/ou celulardependente de anticorpo. Em diversas modalidades, a função efetora do anticorpo anti-CD200 é alterada. Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-CD200 contém umaregião constante alterada ou variante para a qual a função efetora é reduzida ou eliminada;o referido anticorpo pode ser útil para os métodos descritos acima em (1) e (2), por exemplo.Em determinadas modalidades, a descrição se refere a uma molécula de fusãoonde um anticorpo anti-CD200 ou fragmento de ligação de antígeno é ligado a uma segundamolécula. A referida molécula de fusão pode compreender, por exemplo, uma pequenamolécula, polipeptídeo, peptidomimético, peptídeo heterocíclico, um agentequimioterapêutico, um agente imunomodulador, uma fração de direcionamento, ou umconstrutor de ácido nucléico (por exemplo, anti-sentido, RNAi1 ou construtor dedirecionamento de gene). A descrição também inclui fragmentos de ligação de antígenopara CD200 onde o fragmento é fundido ou de outro modo ligado a um polipeptídeo,domínio protéico, proteína do soro, albumina, PEG (polietileno glicol), ou qualquer outramolécula que irá aumentar a meia vida do referido fragmento in vivo. Os referidosfragmentos de ligação de antígeno incluem Fab, Fv, fragmentos de cadeia simples ou scFv,Fab1, e F(ab')2, por exemplo.

A presente descrição também se refere a métodos que empregam anticorpos anti-CD200 para determinar o status de expressão de CD200 de uma amostra de célula outecido obtida de um paciente. Os referidos métodos incluem mas não são limitados acoloração imunohistoquímica de amostras de tecido e análise de citometria de fluxo dascélulas CD200 coradas de um paciente. O paciente pode ser um paciente com câncer, porexemplo.

De acordo com os métodos e composições descritos aqui, a descrição também serefere a métodos de tratar um paciente de transplante ou aloenxerto. Um anticorpo anti-CD200 ou outro antagonista CD200 da presente descrição pode ser administrado a umpaciente antes de um procedimento de transplante ou de aloenxerto ou após oprocedimento de modo a reduzir ou eliminar Células imunes positivas CD200 que poderiamreduzir a aceitação do paciente do órgão ou tecido transplantado. Em uma modalidadeparticular, um anticorpo anti-CD200 com função efetora aumentada é dado a um paciente detransplante.

Em modalidades adicionais, métodos são proporcionados para terapias decombinação que compreendem terapia anti-CD200. Por exemplo, um paciente que recebeuma primeira terapia que compreende um antagonista CD200 (por exemplo, um anticorpoanti-CD200 descrito aqui) pode também ser dado uma segunda terapia. O antagonistaCD200 pode ser dado simultaneamente com a segunda terapia. Alternativamente, oantagonista CD200 pode ser dado antes ou em seguida da segunda terapia. Segundasterapias incluem mas não são limitadas um agente quimioterapêutico, terapia de radiação,vacinas, antibióticos e agentes anti-virais, e terapias imunomodulatórias.

Em uma outra modalidade da presente descrição, métodos são proporcionadospara monitorar o progresso do tratamento terapêutico. O método envolve administrar umaterapia (por exemplo, uma terapia imunomodulatória, uma terapia quimioterapêutica, etc.) edeterminar Os níveis de CD200 em um indivíduo pelo menos duas vezes para determinar aeficácia da terapia. Outros métodos para determinar a eficácia de uma terapia incluem masnão são limitados a detecção de células cancerosas, contagem de linfócitos totais, tamanhodo nodo de baço, fígado e/ou linfa, número de células T regulatórias, perfis intracelulares oude citocina do soro, ou secreção de citocinas por células T ou B como medido pelo sistemade teste ELISPOT—an que permite a detecção de citocinas ou outras moléculas secretadasem base de por célula.

De acordo com as composições e métodos determinados nas presentesmodalidades, a descrição também se refere a qualquer composição farmacêutica quecompreenda um anticorpo anti-CD200. Incluídos são anticorpos anti-CD200 quimérico,humanizado, humano e desimunizado e fragmentos de ligação de antígeno, incluindoanticorpos de cadeia simples. Também incluídos são murino, quimérico, humanizado,humano e anticorpos desimunizados variantes anti-CD200 e fragmentos de ligação deantígeno com função efetora alterada(s) como descrito aqui. Os anticorpos acimamencionados e anticorpos variantes podem ou ser anticorpos de bloqueio ou de nãobloqueio ou fragmentos de ligação de antígeno.

Em determinadas modalidades, pacientes para os quais a terapia anti-CD200 é útilou pacientes que esperam receber uma terapia que compreende uma terapia comantagonista CD200 (incluindo, por exemplo, um anticorpo anti-CD200) podem serpesquisados para determinados tratamentos e procedimentos anteriormente recebidos oupara o status médico atual. Em uma modalidade, por exemplo, pacientes femininas podemser pré-pesquisadas quanto a freqüência de gestação e concordância para contracepção,uma vez que CD200 desempenha um importante papel na proteção contra aborto. Destemodo, pacientes que recebem a referida terapia podem concordar em praticar um ou maismétodos de contracepção. O referido paciente pode concordar em usar um ou maismétodos de contracepção por um período de tempo designado antes de iniciar a referidaterapia e/ou para a duração da referida terapia. Em determinadas modalidades, pacientesfemininas recebem aconselhamento relativo aos riscos com relação à exposição fetal àreferida terapia anti-CD200. Em modalidades adicionais, os referidos pacientes podem seresperados assinar um formulário de consentimena umates do referido tratamento. Emoutros aspectos, pacientes de aconselhamento físico relativo à terapia anti-CD200 poderequerer que os referidos pacientes usem dispositivos contraceptivos ou formulações antesde administrar a terapia anti-CD200 (ver, por exemplo, US 6,908,432 e patentesrelacionadas, os conteúdos das quais se encontram aqui incorporados por referência).

Similarmente, em outras modalidades, os pacientes podem ser pesquisados de modo aidentificara os pacientes que já tenham recebido anteriormente cirurgia cerebral e/ou terapiade radiação no cérebro; a terapia anti-CD200 não seria prescrita para os referidos pacientes.Breve descrição das figuras

A Figura 1 proporciona a seqüência de ácido nucléico para o primer C7mhHF (SEQID NO: 1) usado na geração do construtor G2/G4.

A Figura 2 proporciona a seqüência de ácido nucléico para o Primer Rev Age Pri(SEQ ID NO: 2) usado na geração o construtor G2/G4.

A Figura 3 proporciona a seqüência de ácido nucléico para o primer C2aB7 rev(SEQ ID NO: 3) usado na geração o construtor G2/G4.

A Figura 4 proporciona a seqüência de ácido nucléico para o Iacpri (SEQ ID NO: 4)usado na geração o construtor G2/G4.

A Figura 5 proporciona a seqüência de ácido nucléico para LeadVHpAX (SEQ IDNO:5).

As Figuras 6A - F ilustram as seqüências de amino ácidos e seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo chC2aB7-hGI (SEQ ID NOS: 6,7, 23, 24, 37, e 38). A Figura 6C mostra a SEQ ID NO: 37 (seqüência de ácido nucléico) e aSEQ ID NO: 7 (seqüência de amino ácido). SEQ ID NO: 7 como mostrado no esquemático écontígua mas é ilustrada com uma seqüência de nucleotídeo correspondente que incluiíntrons. A Figura 6F mostra a SEQ ID NO: 38 (seqüência de ácido nucléico) e a SEQ ID NO:24 (seqüência de amino ácido).

As Figuras 7A-F ilustram a seqüência de amino ácidos e as seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo hB7V4VI-hGI(SEQ ID NOS: 8, 9,25, 26, 39, e 40). A Figura 10 mostra a SEQ ID NO: 39 (seqüência de ácido nucléico) e aSEQ ID NO: 9 (seqüência de amino ácido). A Figura 7F mostra a SEQ ID NO: 40 (seqüênciade ácido nucléico) e a SEQ ID NO: 26 (seqüência de amino ácido).

As Figuras 8A-F ilustram a seqüência de amino ácidos e as seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo hB7V3VI-hGI (SEQ ID NOS: 10,11,25, 26, 40, e 41). A Figura 8C mostra a SEQ ID NO: 41 (seqüência de ácido nucléico) e aSEQ ID NO: 11 (seqüência de amino ácido). A Figura 8F mostra a SEQ ID NO: 41(seqüência de ácido nucléico) e a SEQ ID NO: 26 (seqüência de amino ácido).

As Figuras 9A-F ilustram a seqüência de amino ácidos e as seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo hB7V3V2-hGI (SEQ ID NOS: 10,11, 27, 28, 41, e 42). A Figura 9C mostra SEQ ID NO: 41 (seqüência de ácido nucléico) eSEQ ID NO: 11 (seqüência de amino ácido). A Figura 9F mostra SEQ ID NO: 42 (seqüênciade ácido nucléico) e a SEQ ID NO: 28 (seqüência de amino ácido).

As Figuras 10A-F ilustram a seqüência de amino ácidos e as seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo hB7V3V2-hG2G4 (SEQ ID NOS:12, 13, 27, 28, 42, e 43). A Figura 10C mostra SEQ ID NO: 43 (seqüência de ácido nucléico)e a SEQ ID NO: 13 (seqüência de amino ácido). A SEQ ID NO: 13 como mostrado noesquemático é contígua mas é ilustrada com uma seqüência de nucleotídeo correspondenteque inclui íntrons. A Figura 10F mostra a SEQ ID NO: 42 (seqüência de ácido nucléico) e aSEQ ID NO: 28 (seqüência de amino ácido).

As Figuras 11A-F ilustram a seqüência de amino ácidos e as seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo chC2aB7-hG2G4 (SEQ ID NOS:14, 15, 23, 24, 44, 45, 46, e 47). A Figura 11C mostra a SEQ ID NO: 44 (seqüência de ácidonucléico) e a SEQ ID NO: 45 (seqüência de amino ácido). SEQ ID NO: 45 corresponds toamino ácidos 1-337 da SEQ ID NO: 15. Como mostrado no esquemático, SEQ ID NO: 45 écontígua mas é ilustrada com uma seqüência de nucleotídeo correspondente que incluiíntrons. A Figura 1 IF mostra a SEQ ID NO: 46 (seqüência de ácido nucléico) e a SEQ IDNO: 47 (seqüência de amino ácido).

As Figuras 12A-F ilustram a seqüência de amino ácidos e as seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo hB7V3V2-cG2G4 (SEQ ID NOS:13, 16, 27, 28, 48, e 49). A Figura 120 mostra a SEQ ID NO: 48 (seqüência de ácidonucléico) e a SEQ ID NO: 13 (seqüência de amino ácido). A Figura 12F mostra a SEQ IDNO: 49 (seqüência de ácido nucléico) e a SEQ ID NO: 28 (seqüência de amino ácido).

As Figuras 13A-D ilustram a seqüência de amino ácidos e seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo chC7-hG2G4 (SEQ ID NOS: 17,18, 29, e 30).

As Figuras 14A-F ilustram a seqüência de amino ácidos e seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo DIB5-hGI (SEQ ID NOS: 19, 20,31, 32, 50, e 51). A Figura 14C mostra a SEQ ID NO: 50 (seqüência de ácido nucléico) e aSEQ ID NO: 20 (seqüência de amino ácido). A SEQ ID NO: 20 como mostrado noesquemático é contígua mas é ilustrada com uma seqüência de nucleotídeo correspondenteque inclui íntrons. A Figura 14F mostra a SEQ ID NO: 51 (seqüência de ácido nucléico) e aSEQ ID NO: 32 (seqüência de amino ácido).

As Figuras 15A-D ilustram a seqüência de amino ácidos e as seqüências denucleotídeos para as cadeias pesadas e leves do anticorpo G2G4 63L1D (SEQ ID NOS: 21,22, 33, e 34).

A Figura 16 proporciona a seqüência de ácido nucléico para o primer dianteiro paraclonar cDNA CD200 (SEQ ID NO: 35).

A Figura 17 proporciona a seqüência de ácido nucléico para o primer reverso paraclonar cDNA CD200 (SEQ ID NO: 36).

A Figura 18 mostra os efeitos de administrar anticorpos CD200 humanizados nomodelo RAJI-CD200/PBL. Os anticorpos anti-CD200 humanizados resultaram em umainibição do crescimento tumoral.

A Figura 19 demonstra os efeitos de administrar anticorpos CD200 humanizadoscom e sem a função efetora no modelo iNamalwa_CD200 animal. Os anticorpos sem afunção efetora exibiram eficácia em inibição do crescimento tumoral.

A Figura 20 é uma tabela que mostra o nível de expressão de CD200 em amostrasde pacientes com leucemia linfocítica crônica (CLL) em comparação com amostras normais.

A Figura 21 ilustra os níveis relativos da expressão de CD200 detectados emlinhagens de células cancerosas.

A Figura 22 mostra o nível de expressão de antígeno CD200 em amostras decâncer de ovário humano com relação ao nível de expressão detectado em linfócitos dosangue periférico humano (PBL).

A Figura 23 mostra o nível de expressão de antígeno CD200 em amostras depaciente com melanoma humano com relação ao nível de expressão detectados em PBL.

A Figura 24 mostra a coloração imunohistoquímica de CD200 de amostras depaciente com melanoma.

A Figura 25 demonstra os efeitos do anticorpo anti-CD200 na produção de citocina.

Os níveis de Produção de IL-2 em testes com população de células misturadas forammedidos na ausência e na presença de Anticorpo CD200. O anticorpo usado é um anticorpoanti-CD200 quimérico sem função efetora.

A Figura 26 mostra os efeitos de administrar anticorpos anti-CD200, com ou sem afunção efetora, no modelo de Namalwa/PBL no qual os tumores não expressam CD200.

A Figura 27 mostra a análise de citometria de flüxo da Expressão de CD200 emcélulas T ativadas. Células CD3+ foram ativadas com mOKT3, coletadas, lavadas esubmetidas a coloração com os anticorpos conjugados indicados específicos para CD25,CD200, CDS, CD4 e CD8 humano. As células foram lavadas e analisadas porimunofluorescência em um Citômetro de fluxo FacsCaIiber usando o programa CeIIQuest.

A Figura 28 demonstra os efeitos dos anticorpos anti-CD200 em ADCC das célulasT ativadas. Células t humanas CD3+ foram estimuladas com 10 pg/mL mOKT3 imobilizado(com placa revestida) por 72 hrs. As células T ativadas foram então cromadas para usocomo alvos e incubadas com células (NK) CD56+ autólogas purificadas como célulaefetoras. As células foram coincubadas por 4 horas a 37°C em proporções de 25:1 (A) ou10:1 (B) efetora: célula alvo na presença ou ausência do anticorpo anti-CD200 humanizadocapaz de mediar a função efetora (V3V2-G1) ou trabalhadas por engenharia para impedir afunção efetora (V3V2-G2G4). Os dados são representados como o percentual específico delise. Os anticorpos anti-CD200 aumentaram a ADCC das células T ativadas, enquanto que oanticorpo anti-CD200 sem função efetora falhou na indução de ADCC.

A Figura 29 é uma tabela que mostra o nível de expressão de CD200 em célulasplasmáticas.

Descrição detalhada das modalidades preferidasI. Antaqonistas cd200

CD200 é uma glicoproteína de transmembrana do tipo I altamente conservadaexpressa em diversos tipos de células incluindo células do sistema imune (por exemplo,Células T1 Células B1 e células dendríticas (Barclay et al., TRENDS Immunol. 2002: 23))assim como determinadas células cancerosas como mostrado aqui. A proteína interage comseus receptores CD200R nas células mielóides e sub-populações de Células T (Wright et al.J. Immunol. 2003 (171): 3034 - 3046 e Wright et al., Immunity 2000 (13):233 - 242); ainteração de CD200:CD200R envia um sinal imunomodulatório para as células e induz aimunossupressão incluindo tolerância imune associada a apoptose (Rosenblum et al. 2004Sangue (103): 2691 - 2698). Assim os agentes que interferem com a função ou atividade deCD200 e/ou seus receptores podem inibir ou reverter os efeitos imunossupressivos dainteração CD200:CD200R. Ademais, agentes que ligam especificamente CD200 (mas quepossam ou não inibir a interação CD200:CD200R) podem engatilhar eventos a jusante querevertam ou eliminem os efeitos de CD200.

Em determinados aspectos, a presente descrição se refere um antagonistas deCD200. Como usado aqui, o termo antagonista inclui qualquer agente que seja capaz deinibir a atividade, função e/ou a expressão de CD200 ou de seus receptores. Exemplosincluem, mas não são limitados a polipeptídeos, anticorpos, pequenas moléculas,aptâmeros, spiegelmers, inibidores de ácido nucléico travado (LNA), inibidores de ácidonucléico peptídeo (PNA), construtores de ácido nucléico (por exemplo, construtor dedirecionamento de genes, construtores de anti-sentido, Construtores de RNA interferência(RNAi), etc.) e peptidomiméticos. Em determinadas modalidades, o antagonista rompe ainteração de CD200 e CD200R. Em outras modalidades, os antagonistas de CD200 sãocapazes de reduzir os efeitos imunossupressivos de CD200 ou são capazes de direcionar acélula que expressa CD200s para esvaziamento ou eliminação.

Em determinados aspectos, os antagonistas de CD200 são polipeptídeos. Ospolipeptídeos utilizados na presente descrição podem ser construídos usando diferentestécnicas as quais são conhecidas daqueles versados na técnica. Em uma modalidade, ospolipeptídeos são obtidos por síntese química. Em outras modalidades, os polipeptídeos sãoanticorpos construídos a partir de um fragmento ou diversos fragmentos de um ou maisanticorpos. Em modalidades adicionais, o polipeptídèo é um anticorpo anti-CD200 comodescrito aqui.

Assim, em determinadas modalidades, os antagonistas de CD200 são anticorposanti-CD200. Como usado aqui, o termo "anticorpos" se refere a anticorpos completos oufragmentos de anticorpo capaz de se ligar a CD200 ou CD200R. Incluídos são Fab1 Fv,scFv, Fab1 e F(ab')2, anticorpos monoclonais e policlonais, anticorpos trabalhadas porengenharia (incluindo anticorpos quimérico, cadeia simples, CDR-enxertado, humanizado,anticorpos completamente humanos, e anticorpos artificialmente selecionados), e anticorpossintéticos ou semi-sintéticos produzidos usando exibição de fago ou técnicas alternativas.

Também incluídos estão os anticorpos trabalhados por engenharia ou produzidos de modo aconter uma constante alterada ou variante ou região Fcs seja com capacidade maior oureduzida para ligar uma ou mais células efetoras; os referidos anticorpos variantes incluemmas não são limitados a anticorpos nos quais a constante ou região Fc contém padrões deglicosilação alterados. Pequenos fragmentos, tais como Fv e scFv, são dotados depropriedades vantajosas para aplicações diagnosticas e terapêuticas por conta do pequenotamanho dos mesmos e a conseqüente superior distribuição no tecido. Anticorpos comregiões Fc ou constante variante ou trabalhadas por engenharia podem ser úteis emmodular as funções efetoras, talis como, por exemplo, ADCC e CDC. Os referidosanticorpos com regiões Fc ou constante variante ou trabalhadas por engenharia podem serúteis em casos onde CD200 é expressa em tecido normal, por exemplo; anticorposvariantes anti-CD200 sem a função efetora nos referidos casos podem suscitar a respostaterapêutica desejada e ainda não danificar tecido normal. Ademais, anticorpos, anticorposvariantes, e fragmentos dos mesmos podem ser de bloqueio (isto é, os referidos anticorposou fragmentos inibem a interação de CD200 e CD200R) ou de não bloqueio (isto é, osreferidos anticorpos ou fragmentos se ligam a CD200 mas não bloqueiam a sua interaçãocom CD200R).

A descrição também se refere a anticorpos anti-CD200 que compreende cadeiaspesadas e leves como aqui proporcionadas, incluindo as cadeias pesadas e leves que sãohomólogas ou similares às cadeias pesadas e/ou leves aqui proporcionadas. "Homologia"ou "identidade" ou "similaridade" se refere à similaridade de seqüência entre dois peptídeosou entre duas moléculas de ácido nucléico. Homologia e identidade podem cada uma dasquais ser determinada ao se comparar a posição em cada seqüência que podem seralinhadas por questão de comparação. Quando uma posição equivalente nas seqüênciascomparadas é ocupada pela mesma base ou amino ácido, então as moléculas são idênticasna referida posição; quando o campo equivalente ocupado pelo mesmo resíduo de aminoácido ou similar (por exemplo, similar de natureza estérica e/ou eletrônica), então asmoléculas podem ser referidas como homólogas (similares) na referida posição. Aexpressão como um percentual de homologia/similaridade ou identidade se refere à funçãodo número de amino ácidos idênticos ou similares em posições compartilhadas pelasseqüências comparadas. O termo "homologia" descreve uma comparação com basematemática de similaridades de seqüência as quais são usadas para identificar genes ouproteínas com funções ou motivos similares. Como usado aqui, "identidade" significa opercentual de nucleotídeo idêntico ou de resíduos de amino ácidos em posiçõescorrespondentes em duas ou mais seqüências quando as seqüências são alinhadas paramaximizar a correspondência da seqüência, isto é, levando em consideração espaços einserções. Assim, métodos para determinar identidade são projetados para oferecer a maiorcorrespondência entre as seqüências testadas (ver, Computational Molecular Biology1 Lesk,A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics e GenomeProjects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis ofSequence Data, Part I, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey,1994; Sequence Analysis em Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; eSequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York,1991; e Carillo, H., e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 1988, Devereux, J., etal.,Ácidos nucléicos Research 12(1): 387 (1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S. F. etal., J. Molec. Biol. 215: 403 - 410 (1990) e Altschul et al. Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402(1997)) e BLAST X (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403 - 410 (1990). Uma seqüência a qual é "nãorelacionada" ou "não-homóloga" compartilha menos do que 40% de identidade, emborapreferivelmente menos do que 25% de identidade com uma seqüência da presentedescrição. Ao se comparar as duas seqüências, a ausência de resíduos (amino ácidos ouácidos nucléicos) ou presença de resíduos extras também reduz a identidade ehomologia/similaridade.

Deste modo, a descrição se refere a anticorpos como descrito aqui sem asseqüências líderes. Assim os anticorpos da descrição podem compreender cadeiaspesadas e leves (como descrito aqui) nas quais a seqüência líder está ou ausente ousubstituída por uma seqüência líder diferente. Se as células T hospedeiras são usadas paraproduzir os anticorpos da presente descrição, seqüências líderes apropriadas podemportanto ser selecionadas de acordo com a célula hospedeira particular usada.

Os anticorpos podem ser produzidos por métodos bem conhecidos na técnica. Porexemplo, anticorpos anti-CD200 monoclonais podem ser gerados usando Células positivasCD200, Polipeptídeo CD200, ou um fragmento do polipeptídeo CD200, como umimunogênio, assim surgindo uma resposta imune em animais a partir dos quais as célulasque produzem anticorpo e por sua vez os anticorpos monoclonais podem ser isolados. Umaseqüência dos referidos anticorpos pode ser determinada e os anticorpos ou variantes dosmesmos produzidos por técnicas recombinantes. As técnicas recombinantes podem serusadas para produzir anticorpos quiméricos, CDR-enxertados, humanizados ecompletamente humanos com base em uma seqüência dos anticorpos monoclonais assimcomo polipeptídeos capazes de se ligarem a CD200.

Adicionalmente, os anticorpos derivados a partir de bibliotecas recombinantes("anticorpos de fago") podem ser selecionados usando células positivas CD200, oupolipeptídeos derivados a partir das mesmas, como iscas para isolar os anticorpos oupolipeptídeos com base em especificidade de alvo. A produção e o isolamento de anticorposanti-CD200 não-humanos e quiméricos está bem dentro do alcance daqueles versados natécnica.

A tecnologia de DNA recombinante é usada para aprimorar os anticorposproduzidos em células não humanas. Assim, anticorpos quiméricos podem ser construídosde modo a reduzir a imunogenicidade dos mesmos em aplicações diagnosticas outerapêuticas. Adicionalmente, a imunogenicidade pode ser minimizada ao se humanizar osanticorpos por enxerto CDR e, opcionalmente, modificação de estrutura. Ver, Patente U.S.No. 5,225,539, os conteúdos da qual são aqui incorporados por referência.

Os anticorpos podem ser obtidos a partir de soro de animal ou, no caso deanticorpos monoclonais ou fragmentos dos mesmos, produzidos em cultura celular. Atecnologia de DNA recombinante pode ser usada para produzir os anticorpos de acordo comprocedimentos estabelecidos, incluindo procedimentos em cultura celular bacteriana oupreferivelmente de mamífero. O sistema de cultura celular selecionado preferivelmentesecreta o produto de anticorpo.

Em uma outra modalidade, um processo para a produção de um anticorpo aquidescrito inclui o cultivo de um hospedeiro, por exemplo E. coli ou uma célula de mamífero,que foi transformada com um vetor híbrido. O vetor inclui um ou mais cassetes de expressãocontendo um promotor operacionalmente ligado a uma primeira seqüência de DNA quecodifica um sina! de peptídeo ligado em uma estrutura de leitura adequada a uma segundaseqüência de DNA que codifica a proteína de anticorpo. A proteína de anticorpo é entãocoletada e isolada. Opcionalmente, o cassete de expressão pode incluir um promotoroperacionalmente ligado a seqüências de DNA policistrônica, por exemplo, bicistrônica, quecodifica proteínas de anticorpo, cada uma das quais individual e operacionalmente ligadas aum sinal de peptídeo na estrutura de leitura adequada.

A multiplicação das células de hibridoma ou células T hospedeiras de mamífero invitro é realizada em meio de cultura adequado, o qual inclui o meio de cultura padrãohabitual (tal como, por exemplo meio Eagle modificado a Dulbecco (DMEM) ou meio RPMI1640), opcionalmente reabastecido com soro de mamífero (por exemplo, soro de feto debezerro), ou elementos de traços e suplementos de sustentação de desenvolvimento (porexemplo células alimentadoras tai como células de exudato peritoneal normais de rato,células do baço, macrófagos da medula óssea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina,lipoproteína de baixa densidade, ácido oléico, ou semelhante). A multiplicação de célulashospedeiras que são células bacterianas ou células de levedura é da mesma formarealizada em meio de cultura adequado conhecido na técnica. Por exemplo, os meios deculturas bacterianos adequados incluem meios LE, NZCYM, NZYM, NZM, Terrific Broth,SOB, SOC, 2 χ YT, ou meio mínimo M9. Para levedura, meios de culturas adequadosincluem meio YPD, YEPD1 meio Mínimo, ou Meio de Pausa Mínimo completo.

A produção in vitro proporciona preparações de anticorpos relativamente puras epermite a ampliação da produção para proporcionar grandes quantidades de anticorposdesejados. As técnicas para o cultivo de células bacterianas, levedura, vegetal, ou demamífero são conhecidas na técnica e incluem cultura de suspensão homogênea (porexemplo, em um reator aéreo ou em um reator de agitação contínua), e cultura celularimobilizada ou aprisionada (por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em microcontas deagarose ou cartuchos cerâmicos).

Grandes quantidades dos anticorpos desejados podem também ser obtidas ao semultiplicar células de mamífero in vivo. Para este fim, as células de hibridoma produzindo osanticorpos desejados são injetadas em mamíferos histocompatíveis para causar odesenvolvimento de tumores produzindo anticorpos. Opcionalmente, os animais são primedcom um hidrocarbono, em especial - óleos minerais tais como pristano (tetrametil-pentadecano), antes da injeção. Apos uma a três semanas, os anticorpos são isolados apartir dos fluidos corporais dos referidos mamíferos. Por exemplo, as células de hibridomaobtidas por fusão de células de mieloma adequadas com células de baço que estãoproduzindo anticorpos a partir de ratos Balb/c, ou células transfectadas derivadas a partir delinhagem celular de hibridoma Sp2/0 que produz os anticorpos desejados são injetadas porvia intraperitoneal em Ratos Balb/c opcionalmente pré-tratados com pristano. Após uma aduas semanas, fluido ascítico é obtido dos animais.

As técnicas anteriores e outras são discutidas, por exemplo, em Kohler e Milstein,(1975) Nature 256:495 -497; Patente U.S. No. 4,376,110; Harlow e Lane, Antibodies: aLaboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor1 as descrições dos quais estão todas aquiincorporadas por referência. Técnicas para a preparação de moléculas de anticorporecombinante são descritas nas referências acima e também, por exemplo, emW097/08320; Patente U.S. No. 5,427,908; Patente U.S. No. 5,508,717; Smith, 1985,Science, Vol. 225, pp 1315 - 1317; Parmley e Smith, 1988, Gene 73, pp 305 - 318; De LaCruz et al., 1988, Journal of Biological Chemistry, 263 pp 4318 - 4322; Patente U.S. No.5,403,484; Patente U.S. No. 5223409; W088/06630; W092/15679; Patente U.S. No.5780279; Patente U.S. No. 5571698; Patente U.S. No. 6040136; Davis et al., 1999, CâncerMetastasis Rev., 18(4):421 - 5; Taylor, et al., Nucleic Acids Research 20 (1992): 6287 -6295; Tomizuka et al., Proc. Natl. Academy of Sciences USA 97(2) (2000): 722 - 727. Osconteúdos de todas as referidas referências são aqui incorporados por referência.

Os sobrenadantes de cultura celular são pesquisados para os anticorposdesejados, preferencialmente por coloração imunofluorescente de células positivas CD200,por teste de imuno-blot, por um imuno teste de enzima, por exemplo, um teste de sanduícheou um teste de ponto, ou um radioimunoteste.Para o isolamento dos anticorpos, as imunoglobulinas nos sobrenadantes dasculturas ou no fluido ascítico podem ser concentradas, por exemplo, por precipitação comsulfato de amônia, diálise contra material higroscópico tal como polietileno glicol, filtragematravés de membranas seletivas, ou semelhante. Se necessário e/ou desejado, osanticorpos são purificados por métodos de cromatografia habituais, por exemplo, gel defiltragem, cromatografia de troca de íon, cromatografia sobre DEAE-celulose e/oucromatografia de (imuno-) afinidade, por exemplo, cromatografia de afinidade com uma oumais polipeptídeos de superfície derivados a partir de uma linhagem de células positivasCD200, ou com Proteína-A ou -G.

Outra modalidade proporciona um processo para a preparação da linhagem decélula bacteriana que secreta anticorpos direcionados contra CD200 em um mamíferoadequado. Por exemplo, um coelho é imunizado com amostras agrupadas a partir de tecidopositivo para CD200 ou células ou Polipeptídeo CD200 ou fragmentos dos mesmos. Aexibição da biblioteca de fagos produzida a partir do coelho imunizado é construída epanoramizada para os anticorpos desejados de acordo com os métodos bem conhecidos natécnica (tais como, por exemplo, os métodos descritos nas diversas referências aquiincorporadas por referência).

As células de hibridoma que secretam os anticorpos monoclonais são tambémdescritas. As células de hibridoma preferidas são geneticamente estáveis, secretamanticorpos monoclonais descritos aqui da especificidade desejada, e podem ser ativadas apartir de culturas de congelamento profundo por rápido resfriamento e reclonagem.

Em uma outra modalidade, um processo é proporcionado para a preparação dalinhagem celular de hibridoma que secreta anticorpos monoclonais contra CD200. Noreferido processo, um mamífero adequado, por exemplo, um rato Balb/c, é imunizado comum ou mais polipeptídeos ou fragmentos antigênicos de CD200 ou com um ou maispolipeptídeos ou fragmentos antigênicos derivados a partir de uma célula positiva CD200, acélula positiva CD200 em si, ou um veículo antigênico contendo um polipeptídeo purificadocomo descrito. As células que produzem anticorpos do mamífero imunizado sãodesenvolvidas brevemente em cultura ou fundidas com células da linhagem celular demieloma adequada. As células híbridas obtidas na fusão são clonadas, e clones de célulasque secretam os anticorpos desejados são selecionados. Por exemplo, células de baço deratos Balb/c imunizados com uma linhagem celular crônica linfocítica (CLL) de leucemiapositiva CD200 são fundidas com células da linhagem celular de mieloma PAI ou dalinhagem celular de mieloma Sp2/0-Ag 14. As células híbridas obtidas são entãopesquisadas para a secreção dos anticorpos desejados e células positivas de hibridoma sãoclonadas.

Preferido é um processo para a preparação da linhagem celular de hibridoma,caracterizado pelo fato de que ratos Balb/c são imunizados ao se injetar por via subcutâneae/ou por via intraperitoneal entre 106 e 107 células da linhagem celular positiva CD200diversas vezes, por exemplo, quatro a seis vezes, por diversos meses, por exemplo, entredois e quatro meses. As células de baço dos ratos imunizados são obtidas de dois a quatrodias após a última injeção e fundidas com as células da linhagem celular de mieloma PAI napresença do promotor de fusão, preferivelmente polietileno glicol. Preferivelmente, ascélulas de mieloma são fundidas com a três- a vinte- vezes de células de baço dos ratosimunizados em uma solução contendo de cerca de 30% a cerca de 50% de polietileno glicolde peso molecular em torno de 4000. Após a fusão, as células são expandidas em meio decultura adequado como descrito aqui anteriormente, suplementadas com um meio deseleção, por exemplo, Meio HAT, em intervalos regulares de modo a evitar que as célulasnormais de mieloma desenvolvam excessivamente as células desejadas de hibridoma.

Os anticorpos e fragmentos dos mesmos podem ser "quimérico". Anticorposquiméricos e fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos compreendem porções deduas ou mais espécies diferentes (por exemplo, rato e humano). Os anticorpos quiméricospodem ser produzidos com regiões de rato variáveis de especificidade desejada associadasem segmentos de gene de domínio constante humano (por exemplo, Patente U.S. No.4,816,567). Deste modo, anticorpos não humanos podem ser modificados para torná-losmais adequados para aplicação clínica humana.

Os anticorpos monoclonais da presente descrição incluem as formas"humanizadas" dos anticorpos não humanos (isto é, de rato). mAbs CDR-enxertado ouhumanizado são particularmente úteis como agentes terapêuticos para humanos pelo fatode que os mesmos não são depurados a partir da circulação tão rapidamente quanto osanticorpos de rato e não provocam tipicamente uma reação imune adversa. Em geral, umanticorpo humanizado apresenta um ou mais resíduos de amino ácidos introduzidos nomesmo a partir de uma fonte não humana. Os referidos resíduos de amino ácidos nãohumanos são com freqüência referidos como resíduos "de importação", os quais sãotipicamente obtidos a partir de um domínio variável "de importação". Métodos de preparaçãode anticorpos humanizados são em geral bem conhecidos na técnica. Por exemplo, ahumanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter ecolaboradores (Jones et al., Nature 321:522 - 525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323- 327 (1988); Verheoeyen et al.,. Science, 239: 1534 - 1536 (1988)), ao substituir CDRs ouseqüências de CDr de roedores para as seqüências humanas do anticorpo humano.

Também ver, Staelens et al. 2006 Mol Immunol 43: 1243 - 1257. Em modalidadesparticulares, formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, de rato) sãoanticorpos humanos (anticorpo receptor) nos quais os resíduos da região hipervariávèl(CDR) do anticorpo receptor são substituídos por resíduos da região hipervariável a partir deespécies não humanas (anticorpo doador) tal como de um rato, camundongo, coelho, ouprimata não humano dotado da especificidade, afinidade, e capacidade de ligaçãodesejadas. Em alguns casos, os resíduos da região de estrutura da imunoglobulina humanasão também substituídos por resíduos não humanos correspondentes (assim chamados de"mutações retrógradas"). Ademais, exibição de biblioteca de fagos pode ser usada paravariar os amino ácidos em posições escolhidas dentro da seqüência de anticorpos. Aspropriedades de um anticorpo humanizado são também afetadas pela escolha da estruturado humano. Ademais, anticorpos humanizados e quimerizados podem ser modificados paracompreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpodoador de modo a adicionalmente aprimorar as propriedades de anticorpo, tais como, porexemplo, afinidade ou função efetora.

Os anticorpos completamente humanos são também proporcionados na descrição.O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos dotados de regiões constantes e variáveis (sepresentes) derivadas a partir de seqüências de imunoglobulina da linha germinativahumana. Os anticorpos humanos podem incluir resíduos de amino ácidos não codificadospor seqüências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutaçõesintroduzidas por mutagênese aleatória ou específica de campo in vitro ou mutação somáticain vivo). Entretanto, o termo "anticorpo humano" não inclui anticorpos nos quais asseqüências CDR derivadas a partir da linha germinativa de outras espécies de mamíferos,tais como um rato, foram enxertadas nas seqüências de estrutura humana (isto é, anticorposhumanizados). Anticorpos humanos ou completamente humanos podem ser derivados apartir de ratos transgênicos portando genes de anticorpo humano (portando exons devariável (V), diversidade (D), união (J)1 e constante (C)) ou a partir de células humanas. Porexemplo, é agora possível se produzir animais transgênicos (por exemplo, ratos) que sãocapazes, com imunização, de produzir um amplo repertorio de anticorpos humanos naausência de produção de imunoglobulina endógena (ver, por exemplo, Jakobovits et al.,PNAS, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255 - 258 (1993); Bruggermann et al.,Year em Immuno., 7:33 (1993); e Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Cepas de ratostransgênicos podem ser trabalhadas por engenharia para conter seqüências de gene a partirde genes de imunoglobulina humana não rearrumados. As seqüências humanas podemcodificar Tanto as cadeias pesadas como as leves de anticorpos humanos e funcionarãocorretamente em ratos, sofrendo rearrumação para proporcionar um grande repertorio deanticorpos similares àqueles em humanos. Os ratos transgênicos podem ser imunizadoscom a proteína alvo (por exemplo, CD200, fragmentos dos mesmos, ou células queexpressam CD200) para criar a uma estrutura diversa de anticorpos específicos e seusRNAs codificados. Os ácidos nucléicos que codificam os componentes de cadeia deanticorpos dos referidos anticorpos podem então ser clonados a partir do animal em umvetor de exibição. Tipicamente, populações separadas de ácidos nucléicos que codificamseqüências de cadeia pesada e leve são clonadas, e as populações separadas entãorecombinadas com inserção no vetor, de modo que qualquer cópia do vetor recebe umacombinação aleatória da cadeia pesada e leve. O vetor é projetado para expressar cadeiasde anticorpos de modo que os mesmos podem ser montados e exibidos na superfícieexterna do pacote de exibição que contém o vetor. Por exemplo, cadeias de anticorpospodem ser expressas como proteínas de fusão com uma proteína de revestimento de fago apartir da superfície externa do fago. Após, pacotes de exibição podem ser pesquisados paraa exibição dos anticorpos que se ligam a um alvo.

Ademais, anticorpos humanos podem ser derivados a partir de bibliotecas deexibição de fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. BioL,222:581 - 597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)). Bibliotecas de fagosintético podem ser criadas as quais usam combinações aleatórias de regiões V deanticorpo humano sintético. A seleção de antígenos anticorpos completamente humanos sepode ser realizada na qual as regiões V são muito similares às humanas em sua natureza.Ver, patentes US Nos. 6,794,132; 6,680,209; 4,634,666, e Ostberg et al. (1983), Hibridoma2:361 - 367, os conteúdos das quais se encontram aqui incorporados por referência.

Para a geração de anticorpos humanos, também ver, Mendez et al., NatureGenetics 15:146 - 156 (1997), Green e Jakobovits J. Exp. Med. 188:483 - 495 (1998), asdescrições dos quais se encontram aqui incorporados por referência. Os anticorposhumanos são adicionalmente discutidos e delineados nas patentes U.S. Nos. 5,939,598 e6,673,986. Também ver, patentes U.S. Nos. 6,114,598, 6,075,181, e 6,162,963, todasdepositadas em 5 de Junho de 1995. Também ver, a patente U.S. No. 6,150,584,depositada em 2 de Outubro de 1996 e patentes U.S. Nos. 6,713,610 e 6,657,103 assimcomo os Pedidos de patentes U.S. Nos. 10/421,011 (US 2003-0229905 Al), 10/455,013 (US2004-0010810 Al), 10/627,250 (US 2004-0093622 Al), 10/656,623 (US 2006-0040363 Al),10/658,521 (US 2005-0054055 Al), 10/917,703 (US 2005-0076395 Al) e 10/978,297 (US2005-0287630 Al). Ver, também PCT/US93/06926 depositado em 23 de Julho de 1993,Patente Européia No., EP 0 463 151 BI, concessão publicada em 12 de Junho de 1996,Pedido de patente internacional No., WO 94/02602, publicado em 3 de Fevereiro de 1994,Pedido de patente internacional No., WO 96/34096, publicado em 31 de Outubro de 1996, eWO 98/24893, publicado em 11 de Junho de 1998. As descrições de cada um de patentes,pedidos, e referências acima mencionados se encontram aqui incorporada por referência emsua totalidade.

Em uma abordagem alternativa, outros, incluindo GenFarm International, Inc.,utilizaram um abordagem de "minilocus". Na abordagem de minilocus, um Iocus Ig exógenoé mimetizado através da inclusão de peças (genes individuais) a partir do lócus Ig. Assim,um ou mais genes Vh1 um ou mais genes Dh, um ou mais genes Jh, uma região muconstante, e uma segunda região constante (preferivelmente uma região gama constante)são formadas em um construtor para inserção em um animal. A referida abordagem édescrita na Patente U.S. No. 5,545,807 para Surani et al. e patentes U.S. Nos. 5,545,806;5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; 5,770,429; 5,789,650, e 5,814,318 cada umadas quais para Lonberg e Kay, Patente U.S. No. 5,591,669 para Krimpenfort e Bems,Patentes U.S. Nos. 5,612,205; 5,721,367; 5,789,215 para Berns et al., e Patente U.S. No.5,643,763 para Choi e Dunn, e GenFarm International. Também ver, Patentes U.S. Nos.5,569,825; 5,877,397; 6,300,129; 5,874,299; 6,255,458; e 7,041,871, as descrições dasquais se encontram aqui incorporados por referência. Ver, também Patente Européia No. 0546 073 BI, Pedidos de patente internacional Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO97/13852, e WO 98/24884, as descrições dos quais se encontram aqui incorporadas porreferência em sua totalidade. Ver, ainda Taylor et al., (1992 Nuc. Acids. Res., 20: 6287),Chen et al. (1993 Int. Immunol. 5: 647), Tuaillon et al. (1993 PNAS USA. 90: 3720 - 4), Choiet al., (1993 Nature Genetics 4: 117), Lonberg et al. (1994 Nature 368: 856 - 859), Taylor etal. (1994 International Immunology 6: 579 - 591), e Tuaillon et al., (1995 J Immunol. 154:6453 - 65), Fishwild et al. (1996 Nature Biotechnology 14: 845), e Tuaillon et al. (2000 Eur JImmunol. 10: 2998 - 3005), as descrições dos quais se encontram aqui incorporadas porreferência em sua totalidade.

Em determinadas modalidades, anticorpos anti-CD200 desimunizados oufragmentos de ligação de antígeno dos mesmos são proporcionados. Anticorposdesimunizados ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos podem ser modificadosde modo a tornar o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos nãoimunogênico, ou menos imunogênico, a uma determinada espécie. A De-imunização podeser alcançada por modificação do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dosmesmos utilizando qualquer uma da variedade de técnicas conhecidas daqueles versadosna técnica (ver, por exemplo, Publicações PCT Nos. WO 04/108158 e WO 00/34317). Porexemplo, um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos pode serdesimunizado ao identificar epítopos de célula T potenciais e/ou epítopos de célula B dentrode uma seqüência de amino ácidos do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dosmesmos e remover um ou mais dos epítopos de célula T potenciais e/ou epítopos de célulaB a partir do anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos, por exemplo,usando técnicas recombinantes. Os anticorpos modificados ou fragmento de ligação deantígeno dos mesmos podem então ser opcionalmente produzidos e testados paraidentificar anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos que retiveram umaou mais atividades biológicas desejadas, tais como, por exemplo, afinidade de ligação, masque apresentam imunogenicidade reduzida. Métodos para identificar epítopos de célula Tpotenciais e/ou Epítopos de célula B podem ser realizados usando técnicas conhecidas natécnica, tais como, por exemplo, métodos computacionais (ver, por exemplo, PublicaçãoPCT No. WO 02/069232), in vitro ou técnicas em silico, e testes biológicos ou métodosfísicos (tais como, por exemplo, determinação da ligação de peptídeos a moléculas MHC,determinação da ligação de peptídeo:Complexos MHC aos Receptores de célula T a partirdas espécies para receber o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos,testar a proteína ou partes de peptídeo dos mesmos usando animais transgênicos com asmoléculas MHC das espécies para receber o anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodos mesmos, ou testar com animais transgênicos reconstituídos com células do sistemaimune a partir das espécies para receber o anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodos mesmos, etc.). Em diversas modalidades, os anticorpos anti-CD200 desimunizadosdescritos aqui incluem fragmentos de ligação de antígeno desimunizados, Fab, Fv scFv,Fab' e F(ab')2, anticorpos monoclonais, anticorpos de murino, anticorpos trabalhadas porengenharia (tais como, por exemplo, quimérico, de cadeia simples, CDR-enxertado,humanizado, anticorpos completamente humanos, e anticorpos artificialmenteselecionados), anticorpos sintéticos e anticorpos semi-sintéticos.

Em uma modalidade adicional, DNA recombinante que compreende umacodificação de inserção para um domínio variável de cadeia pesada e/ou para um domíniovariável de cadeia leve dos anticorpos direcionados a CD200 ou uma linhagem de célulaspositivas CD200- são produzidas. O termo DNA inclui codificação de DNAs de fita simples,de DNAs de fita dupla consistindo da referida codificação de DNAs e de DNAscomplementares ao mesmo, ou dos próprios DNAs complementares (de fita simples).

Ademais, o DNA que codifica um domínio variável de cadeia pesada e/ou umdomínio variável de cadeia leve dos anticorpos direcionados a CD200 ou a linhagem celularpositiva CD200 podem ser DNA sintetizado enzimática ou quimicamente dotado decodificação de DNA de seqüência autêntica para um domínio variável de cadeia pesadae/ou para o domínio variável de cadeia leve, ou um mutante dos mesmos. Um mutante doDNA autêntico é um DNA que codifica um domínio variável de cadeia pesada e/ou umdomínio variável de cadeia leve dos anticorpos acima mencionados no qual um ou maisamino ácidos são esvaziados, inseridos, ou trocados com um ou mais outros amino ácidos.

Preferivelmente a referida modificação(s) são externas ao CDRs do domínio variável decadeia pesada e/ou do domínio variável de cadeia leve do anticorpo em aplicações dehumanização e otimização de expressão. O termo DNA mutante também engloba mutantessilenciosos onde um ou mais nucleotídeos são substituídos por outros nucleotídeos com asnovas codificações de códons para o(s) mesmo(s) amino ácido(s). O termo seqüênciamutante também inclui uma seqüência degenerada. Seqüência degeneradas sãodegeneradas dentro da significação do código genético em que um número ilimitado denucleotídeos é substituído por outros nucleotídeos sem resultar em uma mudança de umaseqüência de amino ácido originalmente codificado. As referidas seqüências degeneradaspodem ser úteis em virtude de seus diferentes campos de restrição e/ou freqüência decódons particulares que são preferidos pelo hospedeiro específico, particularmente E. coli,para obter uma ótima expressão do domínio variável de murino de cadeia pesada e/ou odomínio variável de murino de cadeia leve.

O termo mutante é pretendido incluir um DNA mutante obtido por mutagênese invitro do DNA autêntico de acordo com os métodos conhecido na técnica.

Para a montagem das moléculas de imunoglobulina tetraméricas completas e aexpressão de anticorpos quiméricos, a codificação de inserções de DNA recombinante paraos domínios variáveis de cadeia pesada e leve são fundidos com a codificação de DNAcorrespondente para domínios constantes de cadeia pesada e leve, então transferidos emcélulas hospedeiras apropriadas, por exemplo, após a incorporação em vetor híbridos.

DNAs recombinantes incluindo uma codificação de inserção para um domíniovariável de murino de cadeia pesada de um anticorpo direcionado a CD200 ou umalinhagem de células positivas CD200 fundidas a um domínio constante de IgG IgG humano,por exemplo yl, y2, y3 ou y4; em modalidades particulares y1 ou y4 podem ser usados.DNAs recombinantes incluindo uma codificação de inserção para domínio variável de murinode cadeia leve de um anticorpo direcionado à linhagem celular aqui descrita fundida a umdomínio constante de IgG humano Kou X, preferivelmente κ, são também proporcionados.

Outra modalidade pertence a DNA recombinantes que codificam para umpolipeptídeo recombinante onde o domínio variável de cadeia pesada e o domínio variávelde cadeia leve são ligados por meio de um grupo espaçador, opcionalmentecompreendendo uma seqüência de sinal facilitando o processamento do anticorpo na célulahospedeira e/ou a seqüência de DNA que codifica um peptídeo facilitando a purificação doanticorpo e/ou de um campo de clivagem e/ou a espaçador de peptídeo e/ou um agente. Acodificação de DNA para um agente é pretendida ser uma codificação de DNA para oagente útil em aplicações diagnosticas ou terapêuticas. Assim, moléculas agentes que sãotoxinas ou enzimas, em especial enzimas capazes de catalisar a ativação de pró-fármacos,são particularmente indicados. O DNA que codifica o referido agente é dotado de umaseqüência de enzima ou toxina de ocorrência natural que codifica DNA, ou um mutante dosmesmos, e podem ser preparadas por métodos bem conhecidos na técnica.

Deste modo, os anticorpos monoclonais ou fragmentos de ligação de antígeno dadescrição podem ser anticorpos nus ou fragmentos de ligação de antígeno que não sãoconjugados para outros agentes, por exemplo, um agente terapêutico ou marcaçãodetectável. Alternativamente, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de antígenopodem ser conjugados a um agente tal como, por exemplo, um agente citotóxico, umapequena molécula, um hormônio, uma enzima, um fator de crescimento, uma citocina, umaribozima, um peptidomimético, um produto químico, um pró-fármaco, uma molécula de ácidonucléico incluindo seqüências de codificação (tais como anti-sentido, RNAi, construtor dedirecionamento de genes, etc.), ou uma marcação detectável (por exemplo, um NMR ouagente de contraste de raio-X, molécula fluorescente, etc.). Em determinadas modalidades,um Polipeptídeo anti-CD200 ou fragmento de ligação de antígeno (por exemplo, Fab, Fv,scFv de cadeia simples, Fab' e F(ab')2) é ligado a uma molécula que aumenta a meia vidado referido polipeptídeo ou fragmento de ligação de antígeno. Moléculas que podem serligadas ao referido polipeptídeo anti-CD200 ou fragmento de ligação de antígeno incluemmas não são limitados a proteínas do soro incluindo albumina, polipeptídeos, outrasproteínas ou domínios protéicos, e PEG.

Diversos sistemas vetores possíveis são oferecidos para a expressão de genesclonados de cadeia pesada e de cadeia leve em células de mamífero. Uma classe devetores se baseia na integração das seqüências desejadas de gene no genoma das célulashospedeiras. Células que integraram DNQA de modo estável podem ser selecionadas aosimultaneamente introduzir genes de resistência de droga tais como E. coli gpt (Mulligan, R.C. e Berg, P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 2072 (1981)) ou Tn5 neo (Southern, P. J. eBerg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)). O gene marcador selecionável pode ser ouligado às seqüências de DNA de gene a ser expresso, ou introduzido na mesma célula porco-transfecção (Wigler, M. et al., Cell1 16: 77 (1979)). Uma segunda classe de vetores utilizaElementos de DNA que conferem capacidades de replicação autônoma a um plasmídeoextracromossomal. Os referidos vetores podem ser derivados a partir de vírus animais, taiscomo papilomavirus bovino (Sarver, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 7147 (1982)),polioma vírus (Deans, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 1292 (1984)), ou SV40vírus (Lusky, M. e Botchan, M., Nature, 293: 79 (1981)).

Uma vez que um cDNA de imunoglobulina é compreendido apenas de seqüênciasque representam mRNA maduro que codifica uma proteína de anticorpo, elementosadicionais de expressão de gene que regulam a transcrição do gene e o processamento doRNA são necessários para a síntese do mRNA de imunoglobulina. Os referidos elementospodem incluir sinais de união, promotores de transcrição, incluindo intensificadorespromotores induzíveis, e sinais de terminação. Vetores de expressão de cDNA queincorporam os referidos elementos incluem aqueles descritos por Okayama, H. e Berg, P.,Mol. Cell Biol., 3: 280 (1983); Cepko, C. L. et al., Cell1 37: 1053 (1984); e Kaufman, R. J.,Proc. NatL Acad. Sci., USA, 82: 689 (1985).

Em determinadas modalidades, um anticorpo anti-CD200 pode ser um anticorpo debloqueio ou de não bloqueio. Como usado aqui, um anticorpo de bloqueio é um quebloqueia a interação entre CD200 e CD200R. O anticorpo de não bloqueio se liga e/ouinterage com CD200 mas não bloqueia a sua interação com CD200R. Assim emdeterminadas modalidades, um anticorpo anti-CD200 é um anticorpo de bloqueio ou de nãobloqueio de murino, quimérico, humanizado humano ou desimunizado.

li. Antaqonistas de cd200 com funções efetoras alteradas

Os antagonistas de CD200 podem ser alterados para suscitar efeitos maiores oureduzidos com relação ao antagonista original ou parente. Por exemplo, um antagonista queliga CD200 pode suscitar funções secundárias em seguida de se ligar a CD200 e, em algunscasos, inibindo a interação CD200:GD200R. Por exemplo, um antagonista pode contercampos de ligação adicionais para outros ligantes, incluindo receptores ou proteínasextracelulares. A ligação aos referidos outros ligantes pode engatilhar outros eventos, taiscomo a atração ou o recrutamento de outras células e a ativação de diversos eventosincluindo morte celular. Assim, em determinados aspectos, a presente descrição se refereum antagonistas de CD200 que suscitam funções secundárias alteradas (ou as funçõesefetoras como referido aqui abaixo). Em determinadas modalidades, o antagonista CD200com função(s) efetora(s) ou secundárias alteradas exibe maior, reduzida, ou nenhumafunção efetora(s) ou secundária alterada, e adicionalmente pode ou não bloquear ainteração CD200:CD200R. Em modalidades particulares, o antagonista CD200 com funçãoefetora(s) ou secundária alterada é um anticorpo anti-CD200.

A) As funções efetoras

A interação dos anticorpos e complexos de anticorpo-antígeno com células dosistema imune afeta uma variedade de respostas, referidas aqui como as funções efetoras.Funções efetoras exemplificativas incluem ligação de receptor Fc, fagocitose, regulação àmenor dos receptores de superfície celular (por exemplo, Receptor de célula B; BCR), etc.

Outras funções efetoras incluem ADCC, onde os anticorpos ligam receptores de Fcs emcélulas exterminadoras naturais (NK) ou macrófagos conduzindo a morte celular, e CDC,que é morte celular induzida por meio de ativação da cascata de complemento (revista emDaeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203 - 234 (1997); Ward e Ghetie, Therapeutic Immunol.2:77 - 94 (1995); e Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457 - 492 (1991)). As referidasfunções efetoras em geral necessitam da região Fc para serem combinadas com umdomínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadasusando diversos testes como aqui descritos, por exemplo.

Diversas funções efetoras de anticorpo, incluindo ADCC, são mediadas porreceptores de Fcs (FcRs), que ligam a região Fc de um anticorpo. Em ADCC, Células NK oumacrófagos se ligam à região Fc do complexo de anticorpo e promovem a Iise da célulaalvo. A reticulação de FcRs nas células NK engatilha citotoxicidade mediada aperforin/granzima, enquanto que em macrófagos a referida reticulação promove a liberaçãode mediadores tais como óxido nítrico(NO), TNF-oc, e espécies de oxigênio reativo. Forcélulas alvo positivas CD200, um anticorpo anti-CD200 se liga à célula alvo e a região Fcdireciona a função efetora à célula alvo. A afinidade de um anticorpo para um FcR particular,e conseqüentemente a atividade efetora mediada pelo anticorpo, podem ser moduladas aose alterar a seqüência de amino ácido e/ou as modificações pós-translacionais do Fc e/ouregião constante do anticorpo.

FcRs são definidos por sua especificidade para isótipos de imunoglobulina;receptores de Fcs para Anticorpos de IgG são referidos como FcyR1 para IgE como FceR1para IgA como FcaR e assim por diante. Três subclasses de FcyR foram identificadas:FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16). Em virtude de cada subclasse FcyR sercodificada por dois ou três genes, e a união de RNA alternativa levar a múltiplastranscrições, existe uma ampla diversidade em isoformas de FcyR. Os três genes quecodificam a subclasse FcyRI (FcyRIA, FcyRIB e FcyRIC) são agrupados na região 1 q21.1do braço longo do cromossoma 1; os genes que codificam as isoformas FcyRII (FcyRIIA,FcyRIIB e FcyRIIC) e os dois genes que codificam FcyRIII (FcyRIIIA e FcyRIIIB) são todosagrupados na região Iq22. Os referidos subtipos diferentes de FcR são expressos emdiferentes tipos de células (revista em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457 - 492(1991)). Por exemplo, em humanos, FcyRIIIB é encontrado apenas em neutrófilos, enquantoque FcyRIIIA é encontrado em macrófagos, monócitos, células (NK) exterminadorasnaturais, e a subpopulação de Células T. De forma notável, FcyRIIIA é o único FeR presenteem células NK, um dos tipos de células implicadas em ADCC.

FcyRI, FcyRII e FcyRIII são receptores (IgSF) da superfamília das imunoglobulinas;FcyRI é dotado de três domínios IgSF em seu domínio extracelular, enquanto que FcyRII eFcyRIII é dotado apenas de dois domínios IgSF em seus domínios extracelulares. Outro tipode receptor Fc é o receptor Fc neonatal (FcRn). FcRn é estruturalmente similar ao complexomaior de histocompatibilidade (MHC) e consiste de uma cadeia-a não covalentemente ligadaa p2-microglobulina.

O campo de ligação em humano e anticorpos de murino para FcyR forampreviamente mapeados a uma assim chamada "região de articulação inferior" consistindoem resíduos 233 - 239 (numeração de índice EU como em Kabat et al., Sequences ofProteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, Md. (1991)). Woof et al., Molec. Immunol. 23:319 - 330 (1986); Duncan etal. Nature 332:563 (1988); Canfield e Morrison, J. Exp. Med. 173:1483 - 1491 (1991);Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:9036 - 9040 (1991). Dos residues 233 - 239,P238 e S239 foram citados como possivelmente estando envolvidos na ligação.

Outras áreas anteriormente citadas possivelmente envolvidas na ligação a FcyRsão: G316-K338 (IgG humano) para FcyRJ humano (apenas por comparação de seqüência;nenhum mutantes de substituição foram avaliados) (Woof et al. Molec Immunol. 23:319 -330 (1986)); K274-R301 (lgG1 humano) para humano FcyRIII (com base em peptídeos)(Sarmay et al. Molec. Immunol. 21:43 - 51 (1984)); Y407-R416 (IgG humano) para humanoFcyRIII (com base em peptídeos) (Gergely et al. Biochem. Soe. Trans. 12:739 - 743 (1984));assim como N297 e E318 (lgG2b de murino) for murino FcyRII (Lund et al., Molec.Immunol., 29:53-59(1992)).

Células efetoras humanas são leucócitos que expressam um ou mais FcRs erealizam as funções efetoras. Em determinadas modalidades, as células expressam pelomenos FcyRIII e realizam a função efetora ADCC. Exemplos de leucócitos humanos quemediam ADCC incluem células mononuclear de sangue periférico (PBMC), células (NK)exterminadoras naturais, monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoraspodem ser isoladas a partir de uma fonte nativa das mesmas, por exemplo, a partir dosangue ou PBMCs.

Em CDC, o complexo antígeno-anticorpo se liga a complemento, resultando naativação da cascata de complemento e geração do complexo de ataque de membrana. Aativação do trajeto clássico de complemento é iniciada pela ligação do primeiro componentedo sistema complemento (CIq) a anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados aoseu antígeno cognato; assim a ativação da cascata de complemento é regulada em partepela afinidade de ligação da imunoglobulina a proteína Clq. Clq e duas serina proteases, Clre Cls1 formam o complexo Cl1 o primeiro componente do trajeto CDC. Clq é uma moléculahexavalente com um peso molecular de aproximadamente 460,000 e uma estrutura no qualseis "talos" colagenosos são conectados a seis regiões de cabeças globulares. Burton eWoof, Advances em Immunol. 51:1 - 84 (1992). Para ativar a cascata de complemento, énecessário para Clq se ligar a pelo menos duas moléculas de IgGI, lgG2, ou lgG3, masapenas uma molécula de IgM, fixada a um alvo antigênico (Ward e Ghetie, TherapeuticImmunology 2:77 - 94 (1995) p. 80). Para avaliar a ativação do complemento, um teste deCDC, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Métodos 202:163(1996), pode ser realizado.

Foi proposto que diversos resíduos da molécula de IgG estão envolvidos em seligar a Clq incluindo os resíduos Glu318, Lys320 e Lys322 no domínio CH2, resíduo deamino ácido 331 localizado em uma volta em proximidade com o mesmo filamento beta, osresíduos Lys235 e Gly237 localizados na região de articulação inferior, e resíduos 231 to238 localizados na região N-terminal do domínio CH2 (ver, por exemplo, Xu et al., J.Immunol. 150:152A (Abstract) (1993),W094/29351; Tao et al, J. Exp. Med., 178:661 - 667(1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol, 24:2542 - 47 (1994); Burton et al; Nature, 288:338 -344 (1980); Duncan e Winter, Nature 332:738 - 40 (1988); U.S. Pat No. 5,648,260, e PatenteU.S. No. 5,624,821). Foi adicionalmente proposto que a habilidade do IgG de se ligar a Clq eativar a cascata de complemento também depende da presença, ausência ou modificaçãoda fração carboidrato posicionada entre os dois domínios CH2s (que é normalmenteancorado em Asn297) (Ward e Ghetie, Therapeutic Immunology 2:77 - 94 (1995). Emdeterminadas modalidades, um ou mais dos referidos resíduos podem ser modificados,substituídos, ou removidos ou um ou mais resíduos de amino ácidos podem ser inseridos demodo a aumentar ou reduzir a atividade CDC dos anticorpos anti-CD200 aquiproporcionadas.

B) Anticorpos anti-cd200 com função efetora(s) modulada(s)

As funções efetoras envolvendo a região constante do anticorpo alvo-específicopodem ser moduladas ao se alterar as propriedades da constante ou região Fe. As funçõesefetoras alteradas incluem, por exemplo, uma modulação em um ou mais atividades aseguir: ADCC, CDC, apoptose, ligação a um ou mais Fc-receptores, e respostas pró-inflamatórias. Modulação se refere a um aumento, redução, ou eliminação de uma atividadecomparada a uma atividade do segundo anticorpo. Em determinadas modalidades, osegundo anticorpo é um anticorpo com uma função efetora. O segundo anticorpo pode serum anticorpo trabalhado por engenharia ou um anticorpo de ocorrência natural e pode serreferido como um anticorpo parente, não variante, ou nativo. Em modalidades particulares, amodulação inclui situações nas quais uma atividade é abolida ou completamente ausente.

Ademais, em alguns casos, um anticorpo não variante pode exibir uma atividade de funçãoefetora similar ou equivalente à atividade dos anticorpos chC2aB7-hGI ou dos hB7V3V2-hGIaqui descritos. Da mesma forma, uma constante não variante ou funcional ou região Fcpode ser dotada de uma função efetora da constante nativa ou Domínio Fc; em algunscasos, a constante ou região Fc de chC2aB7-hGI ou hB7V3V2-hGI pode representar osdomínios não variantes. Para os objetivos presentes, chC2aB7-hGI e hB7V3V2-hGI são ospadrões contra os quais a atividades dos outros anticorpos são comparadas, com hB7V3V2-hGI sendo o padrão preferido.

Uma variante polipeptídeo com com afinidade de ligação para FcR alterada e/ouatividade ADCC e/ou atividade CDC alterada é um polipeptídeo que é dotado ou deatividade de ligação a FcR aumentada ou diminuída e/ou atividade Atividade ADCC e/ouCDC comparada ao polipeptídeo nativo ou parente ou a um polipeptídeo que compreendeuma seqüência nativa Fc ou região constante. Uma variante polipeptídeo que exibe maiorligação a um FcR liga pelo menos um FcR com maior afinidade do que o polipeptídeoparente. Uma variante polipeptídeo que exibe reduzida ligação a um FcR liga pelo menosum FcR com menor afinidade do que um polipeptídeo parente. As referidas variantes queexibem reduzida ligação a um FcR podem ser dotadas de pouca ou não apreciável ligação aum FcR, por exemplo, 0% - 20% de ligação ao FcR em comparação ao nível de ligação deuma constante de imunoglobulina de seqüência nativa ou região Fc para a FcR. De modosimilar uma variante polipeptídeo que exibe ADCC alterada e/ou atividade CDC pode exibirADCC maior ou reduzida e/ou atividade CDC comparada ao polipeptídeo nativo ou parente.

Uma variante polipeptídeo que exibe ADCC reduzida e/ou CDC pode exibir reduzida ounenhuma ADCC e/ou atividade CDC como mostrado aqui por exemplo. Em determinadasmodalidades, o polipeptídeo nativo ou parente e sua variante são anticorpos ou fragmentosde ligação de antígeno. Em modalidades particulares, o referido anticorpo ou fragmento deligação de antígeno se liga a CD200 e pode ou não bloquear a interação CD200:CD200R.

Uma seqüência nativa Fc ou região constante compreende uma seqüência deamino ácido idêntica à seqüência de amino ácido de uma Fc ou região de cadeia constanteencontrada na natureza. Uma região variante ou de Fc alterada ou constante compreendeuma seqüência de amino ácido que difere daquela de uma região de cadeia pesada deseqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação, inserção, ou deleção deamino ácido, por exemplo. Em determinadas modalidades, a região constante alterada ouvariante é dotada pelo menos de uma substituição, inserção, e/ou deleção de amino ácido,em comparação a uma região constante de seqüência nativa ou a uma região constante dopolipeptídeo parente, por exemplo, a partir de cerca de um a cerca de cem substituições,inserções, e/ou deleções de amino ácidos em uma região constante de seqüência nativa ouna região constante do polipeptídeo parente. Em algumas modalidades, a região constantealterada ou variante aqui serão dotadas de pelo menos cerca de 70% de homologia(similaridade) ou identidade com uma região constante de seqüência nativa e/ou com umaregião constante da polipeptídeo parente, e em alguns casos pelo menos cerca de 75% eem outros casos pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade com a mesma, e emoutras modalidades pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% de homologia ou identidadecom a mesma. A região constante alterada ou variante pode também conter uma ou maisdeleções ou inserções de amino ácido. Adicionalmente, a região constante variante podeconter uma ou mais substituições, deleções, ou inserções de amino ácido que resulte emmodificações pós-translacionais alteradas, incluindo, por exemplo, um padrão deglicosilação alterado.

Anticorpos variantes anti-CD200 como atualmente descritos podem ser codificadospor uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo com uma ou maisinserções, deleções, ou substituições de amino ácido com relação ao polipeptídeo nativo ouseqüência parente. Ademais, anticorpos variantes podem ser codificados por seqüência deácidos nucléicos que hibridiza sob condições severas em uma seqüência de ácido nucléicoque codifica uma variante de anticorpo anti-CD200. Uma variedade de condições pode serusada para detectar híbridização, e o rigor é determinado principalmente pelo estágio delavagem do teste de hibridização. Em geral, altas temperaturas e baixa concentração de salproporciona alto rigor, enquanto que baixas temperaturas e altas concentrações de salproporcionam baixo rigor. Uma hibridização de baixo rigor é alcançada por lavagem em, porexemplo, cerca de 2.0 χ SSC a 50 °C, e de alto rigor é alcançada com cerca de 0.2 χ SSC a50 °C.

Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmos com funçõesefetoras alteradas ou sem funções podem ser gerados por trabalho de engenharia ouproduzindo anticorpos com constante variante, Fc1 ou regiões de cadeia pesada; atecnologia de DNA recombinante e/ou cultura celular e condições de expressão podem serusados para produzir anticorpos com função e/ou atividade alterada. Por exemplo, atecnologia de DNA recombinante pode ser usada para trabalhar por engenharia uma oumais substituições, deleções, ou inserções de amino ácido em regiões (tais como, porexemplo, Fc ou região constante) que afetam a função de anticorpo incluindo as funçõesefetoras. Alternativamente, alterações em modificações pós-translacionais, tais como, porexemplo, padrões de glicosilação, podem ser alcançadas por manipulação da cultura celulare das condições de expressão pelas quais o anticorpo é produzido.

Deste modo, determinados aspectos e métodos da presente descrição se referem aanticorpos anti-CD200 com funções efetoras alteradas que compreendem uma ou maissubstituições, inserções, e/ou deleções de amino ácidos. Em determinadas modalidades, areferida uma variante de anticorpo anti-CD200 exibe reduzida ou nenhuma função efetora.

Em modalidades particulares, uma variante de anticorpo compreende um construtor G2/G4em Iugardo domínio G1 (ver, Figuras 10, 11, 12, 13, e 15, por exemplo).

Ademais para trocar o Domínio G1 com um construtor G2/G4 como aquiapresentado, os anticorpos anti-CD200 com função efetora reduzida podem ser produzidosao introduzir outros tipos de mudanças em uma seqüência de amino ácido de determinadasregiões do anticorpo. As referidas mudanças de seqüência de amino ácido incluem mas nãosão limitadas à mutação Ala-Ala descrita por Bluestone et al. (ver, WO 94/28027 e WO98/47531; ver também, Xu et al. 2000 Cell Immunol 200; 16 - 26). Assim em determinadasmodalidades, os anticorpos anti-CD200 com mutações dentro da região constante incluindoa mutação Ala-Ala podem ser usados para reduzir ou abolir a função efetora. De acordocom as referidas modalidades, a região constante de um anticorpo anti-CD200 compreendea mutação a uma alanina na posição 234 ou a mutação a uma alanina na posição 235.

dicionalmente, a região constante pode conter uma dupla mutação: a mutação a umaalanina na posição 234 e uma segunda mutação a uma alanina na posição 235. Em umamodalidade, o anticorpo anti-CD200 compreende uma estrutura lgG4, onde a mutação Ala-

Ala descreve a mutação(s) a partir de fenilalanina para alanina na posição 234 e/ou amutação a partir de Ieucina para alanina na posição 235. Em uma outra modalidade, oanticorpo anti-CD200 compreende uma estrutura IgGI, onde a mutação Ala-Ala descreve amutação(s) a partir de Ieucina para alanina na posição 234 e/ou a mutação a partir deIeucina para alanina na posição 235. Um anticorpo anti-CD200 pode alternativa ouadicionalmente portar outras mutações, incluindo a mutação de ponto K322A no DomínioCH2 (Hezareh et al. 2001 J Virol. 75: 12161 - 8). Um anticorpo com a referida mutação(s) naregião constante pode adicionalmente ser um anticorpo de bloqueio ou de não bloqueio.

Mudanças dentro da região de articulação também afetam as funções efetoras. Porexemplo, a deleção da região de articulação pode reduzir a afinidade para os receptores deFcs e pode reduzir ativação do complemento (Klein et al., 1981 PNAS USA 78: 524 - 528). Apresente descrição, portanto, também se refere a anticorpos com alterações na região dearticulação.

Em modalidades particulares, os anticorpos anti-CD200 podem ser modificadospara ou aumentar ou inibir citotoxicidade dependente de complemento (CDC). AtividadesCDC moduladas podem ser alcançadas ao introduzir uma ou mais substituições, inserções,ou deleções de amino ácido em uma região Fc do anticorpo (ver, por exemplo, Patente U.S.No. 6,194,551). Alternativa ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína podem ser introduzidosem uma região Fc, deste modo permitindo a formação de ligação disulfeto intercadeias nareferida região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ser dotado de capacidade deinternalização aprimorada ou reduzida e/ou maior ou menor extermínio de célula mediado acomplemento. Ver, Caron et al., J. Exp Med. 176:1191 - 1195 (1992) e Shopes, B. J.Immunol. 148:2918 - 2922 (1992), W099/51642, Duncan & Winter Nature 322: 738 - 40(1988); Patente U.S. No. 5,648,260; Patente U.S. No. 5,624,821; e W094/29351. Anticorposhomodiméricos com maior atividade anti-tumor podem também ser preparadas usandoreticuladores heterobifuncionais como descrito em Wolff et al. Câncer Research 53:2560 -2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo pode ser trabalhado por engenharia que édotado de dupla região Fcs e pode deste modo ser dotado de maior capacidade de Iise decomplemento e ADCC. Ver, Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219 - 230 (1989).

Outro meio potencial de modular a função efetora dos anticorpos inclui mudançasem glicosilação. Este tópico foi recentemente revisto por Raju que resumiu a importânciaproposta dos oligossacarídeos encontrados em IgG humanos com seus graus da funçãoefetora (Raju, TS. BioProcess International April 2003. 44 - 53). De acordo com Wright eMorrison, a microeterogeneidade dos oligossacarídeos de IgG humano pode afetar asfunções biológicas tais como CDC e ADCC, se ligando a vários receptores de Fcs, e seligando a proteína Clq(Wright A. & Morrison SL. TIBTECH 1997, 15 26 -32). É bemdocumentado que os padrões de glicosilação dos anticorpos podem diferir dependendo dacélula produtora e das condições de cultura celular (Raju, TS. BioProcess International Abrilde 2003. 44 - 53). As referidas diferenças podem conduzir à mudanças tanto na funçãoefetora como nas farmacocinéticas (Israel et al. Immunology. 1996; 89(4):573 - 578; Newkirketal. P. Clin. Exp. 1996; 106(2):259 - 64). Diferenças na função efetora podem serrelacionadas à habilidade de IgGs se ligar aos receptores Fey (FcyRs) nas células efetoras.Shields, et al., mostrou que IgG1 com variantes em seqüência de amino ácido queaprimoraram a ligação a FcyR1 podem exibir cerca de ADCC 100% aumentado usandocélulas efetoras humanas (Shields et al. J Biol Chem. 2001 276(9):6591 - 604). Embora asreferidas variantes incluam mudanças em amino ácidos não encontrados na ligação deinterface, tanto a natureza do componente de açúcar assim como o seu padrão estruturalpodem também contribuir para as diferenças observadas. Ademais, a presença ou ausênciade fucose no componente oligossacarídeo de um IgG pode aprimorar a ligação e ADCC(Shields et al. J Biol Chem. 2002; 277(30):26733 - 40). Um IgG que faltou de um carboidratofucosilado ligado a Asn297 exibiu receptor normal se ligando ao receptor Fey. De mododiferente, a ligação ao receptor FcyRIIA foi aprimorada em 50% e acompanhada de umamaior ADCC1 em especial concentrações de anticorpo mais baixas.

Trabalho por Shinkawa, et al., demonstrou que um anticorpo para o receptor IL-5humano produzidos em hibridoma de rato mostrou mais de 50% ADCC superior quandocomparado ao anticorpo produzido em células de ovário de hamster chinês (CHO)(Shinkawa et al., J Biol Chem. 2003 278(5):3466 - 73). Composição de monossacarídeo e operfilamento de oligossacarídeo mostrou que o IgG produzido por hibridoma de ratoapresentou um teor mais baixo de fucose do que a proteína produzida a CHO. Os autoresconcluíram que a falta de fucosilação de um IgGI desempenha um papel fundamental noaumento da atividade de ADCC.

Uma diferente abordagem foi obtida por Umana, et al., que mudou o padrão deglicosilação de chCE7, um anticorpo anti-neuroblastoma de IgGI quimérico (Umana et al.Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17(2): 176 - 80). Usando tetraciclina, eles regularam a atividadeda enzima glicosiltransferase (GnnII) que bisecta os oligossacarídeos que estiveramimplicados na atividade de ADCC. A atividade de ADCC do anticorpo parente esteveembora por pouco acima do nível de amplitude. A medição da atividade de ADCC de chCE7produzido em diferentes níveis de tetraciclina mostrou uma ótima faixa de expressão deGnTIH para chCE7 atividade máximo in vitro de ADCC. As referidas atividadescorrelacionadas com o nível de região constante-associada, bisectou o complexo deoligossacarídeo. Variantes recentemente otimizadas exibiram atividade ADCC substancial.

De modo similar, Wright e Morrison produziram anticorpos na Linhagem de célula CHOdeficiente em glicosilação (1994 J Exp Med 180: 1087 - 1096) e mostrou que os anticorposproduzidos na referida linhagem celular foram incapazes de citólise mediada acomplemento. Assim as alterações conhecidas que afetam a função efetora incluemmodificações no padrão de glicosilação ou uma mudança no número de resíduosglicosilados, a presente descrição se refere a anticorpo CD200 onde a glicosilação éalterada seja para aumentar ou reduzir a função efetora(s) incluindo ADCC e CDC. Aglicosilação alterada inclui uma redução ou aumento no número de resíduos glicosiladosassim como uma mudança no padrão ou local dos resíduos glicosilados.

Ainda outras abordagens existem para a alteração da função efetora dosanticorpos. Por exemplo, células que produzem anticorpos podem ser hipermutagênicas,deste modo gerando anticorpos com nucleotídeo aleatoriamente alterado e resíduos depolipeptídeo através de toda a molécula de anticorpo (ver, WO 2005/011735). Célulashipermutagênicas hospedeiras incluem células deficientes em reparo divergente de DNA. Osanticorpos produzidos desta maneira podem ser menos antigênicos e/ou apresentarpropriedades farmacocinéticas benéficas. Adicionalmente, os referidos anticorpos podemser selecionados para propriedades tais como função efetora(s) aumentada ou reduzida.

É adicionalmente entendido que a função efetora pode variar de acordo com aafinidade de ligação do anticorpo. Por exemplo, anticorpos com alta afinidade podem sermais eficientes em ativação do sistema de complemento comparado a anticorpos comafinidade relativamente mais baixa (Marzocchi-Machado et al., 1999 Immunol Invest 28: 89 -101). Deste modo, um anticorpo pode ser alterado de modo que a afinidade de ligação parao seu antígeno é reduzida (por exemplo, ao mudar as regiões variáveis do anticorpo pormétodos tais como substituição, adição, ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos). Um anticorpo anti-CD200 com reduzida afinidade de ligação pode exibir reduzidasfunções efetoras, incluindo, por exemplo, ADCC e/ou CDC reduzidos.

III. Métodos de esvaziar ou eliminar células que super expressam cd20Q

De acordo com a presente descrição, métodos são proporcionados para esvaziarcélulas que expressam CD200 em um indivíduo ao se administrar ao indivíduo uma terapiaque compreende um antagonista CD200. Como mencionado acima, CD200 é expressa emdeterminadas células imunes; e como demonstrado na presente descrição, CD200 étambém expressa em determinadas células malignas. A expressão díspar de CD200proporciona uma via pela qual direcionar as células cancerosas (isto é, Células positivasCD200) para terapia. Da mesma forma, as células imunes positivas CD200 podem serdirecionadas para esvaziamento em métodos de tratar desordens auto-ímunes.

CD200, através da sua interação com CD200R nas células mielóides, modula aimunossupressão ao enviar um sinal inibitório para atividade mielóide e/ou migração.Nocaute de CD200 em ratos, por exemplo, demonstra uma resposta imune mais ativa emseguida de estímulo de imunogênico (Hoek et al. Science 2000), e célula que expressaCD200s suscita imunossupressão ao induzir um desvio no perfil de citocina das célulasimunes estimuladas (ver, dados mostrados aqui). Especificamente, as células positivasCD200 são capazes de induzir um desvio de produção de citocina a partir de Thl para Th2em testes com população de células misturadas. Embora as células positivas CD200 sejamcapazes de suprimir a resposta imune, Células CD200 positivas cancerosas, deste modo,podem ser capazes de escapar do ataque de célula imune. Entretanto, a expressão deCD200 na membrana das células cancerosas assim como das células imunes pode serexplorada para direcionar as referidas células em terapia. Por exemplo, um anti-antagonistaCD200 pode especificamente direcionar as células positivas CD200 e romper a interaçãoCD200:CD200R deste modo inibindo a supressão imune, assim como direcionar célulaspositivas CD200 às células efetoras imunes. As modalidades da presente descrição,portanto, se referem métodos de direcionar células positivas CD200 para esvaziamento quecompreende um antagonista que se liga a CD200 e, em alguns casos, rompe a interaçãoCD200:CD200R.

Em determinadas modalidades, a presente descrição se refere a métodos deaumentar a resposta imune. Os referidos métodos incluem administrar uma terapia quecompreende um antagonista CD200, e em modalidades particulares o antagonista é umanticorpo anti-CD200 ou fragmento de ligação de antígeno como determinado aqui. Emboranão se pretenda ater a um mecanismo particular, um anticorpo de bloqueio anti-CD200,fragmento de ligação de antígeno, polipeptídeo, ou outro antagonista pode eliminar célulaspositivas CD200 ao bloquear a supressão imune, deste modo permitindo que as célulasimunes ataquem e eliminem as células positivas CD200. Alternativamente ou emcombinação com o mecanismo acima mencionado, um anticorpo anti-CD200 (seja debloqueio ou de não bloqueio) ou outro antagonista pode recrutar células efetoras ou outrosIigantes (por exemplo, componente complemento) a uma célula positiva CD200 à qual oanticorpo ou antagonista é ligado e direcionar a célula positiva CD200 for morte celularmediada a efetora.

Em um aspecto, a presente descrição se refere a métodos de modular ADCC e/ouCDC de células alvo positivas CD200 ao se administrar a anticorpo anti-CD200 murino,quimérico, humanizado, ou humano a um indivíduo em necessidade dos mesmos. Adescrição se refere a anticorpos variantes anti-CD200 que suscitam maior ADCC e/ou CDCe a anticorpos variantes anti-CD200 que exibem reduzida ou nenhuma Atividade ADCC e/ouCDC.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-DC200 variante compreende uma regiãovariante ou Fc alterada ou constante, onde a variante Fc ou região constante exibe funçãoefetora aumentada. A referida região variante pode conter uma ou mais substituições,inserções, ou deleções de amino ácido. Alternativa ou adicionalmente, a região constante ouFc variante ou alterada podem compreender modificações alteradas pós-translacionais,incluindo, por exemplo, um padrão de glicosilação alterada. Um padrão de glicosilaçãoalterada inclui um aumento ou redução no número de ligações glicosídicas e/ou umamodificação no local (isto é, número de resíduos de amino ácido) de uma ou mais ligaçõesglicosídicas.Em uma outra modalidade, a descrição se refere a métodos de esvaziar ou eliminarcélulas positivas CD200 que compreendem anticorpos variantes anti-CD200 que exibemreduzida ou nenhuma atividade ADCC e/ou CDC. Em uma modalidade, a variante anti-anticorpo CD200 compreende uma região variante ou Fc alterada ou constante, onde a Fcvariante ou região constante exibe função efetora diminuída ou sem função efetora. Areferida variante ou alterada Fc ou região constante pode conter uma ou mais substituições,inserções, ou deleções de amino ácido. Alternativa ou adicionalmente, a variante Fc ouregião constante podem compreender modificações pós-translacionais alteradas, incluindomas não limitada a um padrão de glicosilação alterada. Exemplos de padrões deglicosilação alterados são descritos acima.

Em uma modalidade adicional, um anticorpo anti-CD200 de murino, quimérico,humanizado, humano ou desimunizado administrado a um paciente é um anticorpo de nãobloqueio. O anticorpo de não bloqueio anti-CD200 pode ser uma variante de anticorpo comodescrito acima e pode conseqüentemente exibir função efetora modulada(s). Por exemplo,uma variante de anticorpo anti-CD200 pode não bloquear a interação CD200:CD200R epode também compreendr uma região constante variante que suscita função efetoraaumentada, tal como, por exemplo, maior ADCC.

A) Métodos de tratar pacientes com desordens auto-imunes

Em determinados aspectos, a descrição se refere a tratamento de pacientes comdesordens auto-imunes com uma terapia que compreende um antagonista CD200. Emdeterminadas modalidades, o antagonista é um anticorpo anti-CD200 ou fragmento deligação de antígeno dos mesmos. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD200 oufragmento dos mesmos é uma variante de anticorpo anti-CD200 que exibe atividade efetoramodulada. Por exemplo, o anticorpo variante pode compreender uma região constantealterada ou variante capaz de suscitar maior ou um aumento da função efetora, tal como,por exemplo, ADCC. Adicionalmente, o referido anticorpo pode ser um anticorpo de nãobloqueio e pode ser um anticorpo anti-CD200 de murino, quimérico, humanizado, humanoou desimunizado. Assim, métodos de tratar pacientes com desordens auto-imunes podemcompreender quaisquer um dos antagonistas de CD200 e anticorpos como determinado napresente descrição.

Em determinadas modalidades, anticorpos anti-CD200 ou antagonistas de CD200podem ser usados para esvaziar qualquer tipo de célula que expresse CD200 em suasuperfície, incluindo, por exemplo, células imunes tais como Células T, Células B, e célulasdendríticas. Em uma modalidade, os anticorpos aríti-CD200 podem ser úteis para destruiçãodirecionada de células imunes envolvidos em uma resposta imune indesejada, tal como, porexemplo, respostas imunes associadas com uma desordem auto-imune, transplantes,alergias, ou desordens inflamatórias. Doenças auto-imunes e desordens exemplificativasque podem ser tratadas com os anticorpos anti-CD200 aqui proporcionadas incluem, porexemplo, respostas inflamatórias tais como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríasee dermatite (por exemplo, dermatite atópica); dermatomiosite; escleroderma sistêmico eesclerose; respostas associadas com doença inflamatória do intestino (tais como Doença deCrohn e colite ulcerativa); síndrome de angústia respiratória (incluindo síndrome de angústiarespiratória de adulto; ARDS); dermatite; meningite; encefalite; uveite; colite;glomerulonefrite; condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições queenvolvem a infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas; ateroesclerose;deficiência de adesão de leucócitos; artrite reumatóide; lúpus eritematoso sistêmico (SLE);diabetes melito (por exemplo, Diabetes do tipo I melito ou diabetes melito dependente deinsulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud's; tireoidite auto-imune; encefalomielitealérgica; Síndrome de Sjogren; início de diabetes juvenil; e respostas imunes associadas àhipersensibilidade aguda ou retardada mediada por citocinas e Linfócitos T tipicamenteencontrados em tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; anemiaperniciosa (Doença de Addison); doenças que envolvem diapedese de leucócito; desordensinflamatórias do sistema nervoso central sistema nervoso central (SNC); síndrome de danosa múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas não limitado a crioglobinemia oupositive anemia de Coombs); miastenia gravis; doenças mediadas a complexo antígeno-anticorpo; doença da membrana basal anti-glomerular; síndrome antifosfolipídeo; neuritealérgica; doença de Graves; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; pemfigóide bullous;pênfigo; poliendocrinopatias auto-imunes; doença de Reiter; síndrome de "pessoa rígida";doença de Bechet; arterite de célula gigante; nefrite complexa imune; nefropatia de IgA;polinefropatias de IgM; púrpura trombocitopênica imune (ITP) trombocitopenia auto-imune edoenças hemolíticas auto-imunes, tireoidite de Hashimoto, etc.

De acordo com os métodos e composições descritos aqui, a descrição também serefere a métodos de tratar um paciente de transplante ou aloenxerto. Um anticorpo anti-CD200 ou outro antagonista CD200 da presente descrição pode ser administrado a umpaciente antes de um procedimento de transplante ou de aloenxerto ou após oprocedimento de modo a reduzir ou eliminar células imunes positivas CD200 que poderiamreduzir a aceitação do paciente do órgão ou tecido transplantado. Em uma modalidadeparticular, um anticorpo anti-CD200 com função efetora aumentada é dado a um paciente detransplante. Ademais, um anticorpo anti-CD200 é a um anticorpo de não bloqueio.

Terapias que compreendem antagonistas de CD200 ou anticorpos podem seradministradas a pacientes em terapias de combinação. Deste modo, o extermíniodirecionado de determinadas populações de células imunes para tratar ou evitar desordensauto-imunes, aumentar ou estender sobrevivência de transplante, tratar ou evitar alergias,ou tratar ou evitar desordens inflamatórias, pode ser administrado como parte da terapia decombinação. Por exemplo, um paciente que recebe uma primeira terapia que compreendeum antagonista CD200 (por exemplo, um anticorpo anti-CD200 descrito aqui) pode tambémser dado uma segunda terapia. O antagonista CD200 pode ser dado simultaneamente coma segunda terapia. Alternativamente, o antagonista CD200 pode ser dado antes ou emseguida da segunda terapia. Segundas terapias incluem, mas não são limitados a agentesantiinflamatórios, agentes imunossupressivos, e/ou agentes antiinfecciosos.

As terapias de combinação da presente descrição incluem, por exemplo, umantagonista CD200 como descrito aqui, administrado em conjunto ou em seqüência emsérie com esteróides, anti-malária, aspirina, drogas antiinflamatórias não esteróides,imunossupressores, ou drogas citotóxicas. Incluídos são os corticoesteróides (por exemplo,prednisona, dexametasona, e predisolona), metotrexato, metilprednisolona,imunossupressores macrolídeos (por exemplo, sirolimus e tacrolimus), inibidores mitóticos(por exemplo, azatioprina, ciclofosfamida, e metotrexato), metabólitos fúngicos que inibem aatividade de Linfócitos T (por exemplo, ciclosporina), micofenolato mofetil, acetato deglatiramer, e agentes citotóxicos e de danos de DNA (por exemplo, clorambucil). Para asdesordens auto-imunes e aloenxerto ou pacientes de transplante, a terapia anti-CD200 podeser combinada com tratamentos de anticorpo incluindo daclizumab, um anticorpomonoclonal de IgG humano trabalhado por engenharia genética que se liga especificamenteà cadeia-a do receptor interleucina-2, assim como vários outros anticorpos direcionados acélulas imunes ou outras células. As referidas terapias de combinação podem ser úteis notratamento de diabetes do tipo 1, artrite reumatóide, lúpus, e púrpura trombocitopênicaidiopática, e outras indicações auto-imunes. A descrição também se refere a terapias paradesordens auto-imunes e para pacientes de transplante a qual compreende um antagonistaCD200 (tal como, por exemplo, os anticorpos e variantes dos mesmos descritos na presentedescrição) conjugado a um ou mais agentes.

B) Métodos de tratar pacientes com câncer

Em um aspecto, a descrição proporciona método de tratar câncer no qual umagente que rompe ou inibe a interação de CD200 com seus receptores é administrado a umindivíduo. O rompimento da interação CD200:CD200R subseqüentemente reverte ou inibe asupressão imune, e assim aumenta a resposta imune. Possíveis agentes para o rompimentoda interação CD200:CD200R incluem, por exemplo, pequenas moléculas, produtosquímicos, polipeptídeos, moléculas inorgânicas, e compostos organometálicos. A interaçãoCD200.CD200R pode também ser inibida ao se reduzir a expressão seja da membranaprotéica ou de seus receptores via anti-sentido, RNAi, ou gene terapia. Adicionalmente, apolipeptídeo específico para CD200 ou CD200R, tal como um anticorpo anti-CD200- ou anti-CD200R-específico ou fragmentos dos mesmos, podem inibir os efeitos imunossupressivosda interação CD200:CD200R.As células cancerosas que podem ser tratadas por um antagonista CD200 incluemquaisquer células cancerosas que exibam expressão de CD200 ou regulação à maior deCD200. Cânceres para os quais a terapia anti-CD200 pode ser usada incluem, por exemplo,cânceres de ovário, melanoma, mieloma, neuroblastoma, rins, mama, próstata,malignidades hematológicas (por exemplo, Iinfomas e leucemias), e câncer de célulaplasmática. Também incluídos estão quaisquer células cancerosas derivadas a partir decélulas da crista neural. Em algumas modalidades, o antagonista CD200 é um anticorpoanti-CD200. Os referidos anticorpos usados como terapêuticos anti-câncer são capazes deinterferir com a interação de CD200 e seus receptores. A referida interferência podebloquear o efeito imune-supressor de CD200. Ao se aprimorar a resposta imune destamaneira, os referidos anticorpos podem promover a erradicação de células cancerosas.Anticorpos anti-CD200 podem também direcionar as células cancerosas para morte celularmediada a efetora.

Em uma modalidade, uma variante de anticorpo anti-CD200 que exibe atividadesmoduladas de ADCC e/ou CDC pode ser administrado a um indivíduo com células CD200positivas cancerosas. Por exemplo, uma variante de anticorpo anti-CD200 usado em terapiade câncer pode exibir atividade efetora aumentada comparada ao anticorpo parente ounativo. Em uma outra modalidade, o anticorpo anti-DC200 variante exibe função efetorareduzida, incluindo ADCC reduzida, com relação ao anticorpo nativo. O referido anticorpopode ser um murino, quimérico, humanizado, humano ou desimunizado anticorpo. Câncerespara os quais o anticorpo anti-DC200 variante pode ser usado no tratamento incluem masnão são limitados a cânceres de células da crista neural. Também incluídos estão câncer decélula plasmática, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer dos rins,câncer de mama, câncer de próstata, neuroblastoma, linfoma, mieloma, e leucemia.

Os presentes anticorpos podem ser administrados como um terapêutico aospacientes com câncer, em especial, mas não limitado a, pacientes com CLL, câncer decélula plasmática, câncer de ovário, câncer de pele, câncer de pulmão, câncer dos rins,câncer de mama, câncer de próstata, neuroblastoma, linfoma, mieloma, leucemia, equalquer câncer derivado a partir de células da crista neural. Em uma modalidadeparticularmente útil, uma terapia de câncer de acordo com a presente descriçãocompreende (1) administrar um anticorpo anti-CD200 ou antagonista que interfere com ainteração entre CD200 e seus receptores para bloquear a supressão imune, deste modopromovendo a erradicação das células cancerosas; e/ou (2) administrar uma molécula defusão que inclui uma porção de direcionamento a CD-200 para diretamente exterminarcélulas cancerosas. Alternativamente, o anticorpo diretamente extermina as célulascancerosas através citotoxicidade mediada a complemento ou citotoxicidade celulardependente de anticorpo. Uma vez que CD200 é também expresso em células normais taiscomo células endoteliais, embora em níveis mais baixos células cancerosas, poderia sertambém vantajoso se administrar um anticorpo anti-CD200 com uma região constantemodificada para reduzir ou eliminar ADCC ou CDC para limitar danos às células normais.

Por exemplo, se a expressão de CD200 é regulada a maior em algumas células ativadasnormais (por exemplo, células ativadas T), tornando as referidas células vulneráveis aextermínio por um anticorpo anti-CD200 com a função efetora, pode portanto também servantajoso se usar um anticorpo anti-CD200 desprovido de uma função efetora para evitar oesvaziamento das referidas células que ajudam na destruição das células cancerosas.

Em uma modalidade particular, a função efetora dos anticorpos anti-CD200 éeliminada por mudança do domínio constante de IgGI por um domínio de fusão lgG2/4.

Outras formas de eliminar uma função efetora podem ser previstas tais como, por exemplo,mutação dos campos conhecidos por interagir com FcR ou inserção de um peptídeo naregião de articulação, deste modo eliminando campo críticos necessários para a interaçãode FcR. Anticorpos variantes anti-CD200 com reduzida ou nenhuma função efetora tambémincluem variantes como descrito anteriormente aqui.

Os agentes acima mencionados para a inibição ou prevenção da interaçãoCD200:CD200R podem ser usados em combinação com outras terapias ou com outrosagentes. Outros agentes incluem mas não são limitados a polipeptídeos, pequenasmoléculas, produtos químicos, metais, compostos organometálicos, compostos inorgânicos,moléculas de ácido nucléico, oligonucleotídeos, aptâmeros, spiegelmers, ácidos nucléicosde anti-sentido, inibidores de ácido nucléico travado (LNA), inibidores de ácido nucléicopeptídeo (PNA), agentes imunomodulatórios, fragmentos de ligação de antígeno, pró-fármacos, e compostos peptidomimético.

Em determinados aspectos, a presente descrição se refere a tratamentos decombinação que compreendem um antagonista CD200 incluindo os anticorpos descritosaqui e compostos imunomodulatórios, vacinas ou quimioterapia. Exemplos ilustrativos dosagentes imunomodulatórios que podem ser usados nas referidas terapias de combinaçãoincluem agentes que bloqueiam a regulação negativa de células T ou de células queapresentam antígeno (por exemplo, anticorpos anti-CTLA4, anticorpos anti-PD-LI, anticorposanti-PDL-2, anticorpos anti-PD-1 e semelhante) ou agentes que aumentam a co-estimulaçãopositiva de células T (por exemplo, anticorpos anti-CD40 ou anticorpos anti 4-1 BB) ouagentes que aumentam o número de células NK ou a atividade da célula T (por exemplo,anticorpos anti-CD200 isoladamente ou em combinação com inibidores tais como IMiDs1talidomida, ou análogos de talidomida). Ademais, a terapia imunomodulatória pode incluirvacinas de câncer tais como células dendríticas carregadas com células tumorais, proteínas,peptídeos, RNA, ou DNA derivadas a partir das referidas células, proteínas de choque decalor derivadas de paciente (hsp's) ou adjuvantes gerais que estimulam o sistema imune emvários níveis tais como CpG1 Luivac, Biostim1 Ribominil1 Imudon1 Bronchovaxom ou qualqueroutro composto ou outro adjuvante que ativa os receptores do sistema imune inato (porexemplo, agonista receptor similar a "toll", anticorpos anti-CTLA-4, etc.). Também, terapiaimunomodulatória pode incluir o tratamento com citocinas tais como IL-2, GM-CSF e IFN-gama.

Em modalidades adicionais, a eliminação de células T regulatórias existentes comreagentes tais como anti-CD25, fludarabina, ou ciclofosfamida é alcançada antes de iniciar otratamento anti-CD200 tratamento. Também, a eficácia terapêutica das terapiasmieloablativas seguido de transplante de medula óssea ou transferência adotiva de célulasT reativas com células CLL é aumentada pela terapia anti-CD200. Em ainda outrasmodalidades, a eficácia do tratamento anti-CD200 é aprimorada ao bloquear mecanismosimunossupressivos com agentes tais como anticorpos anti-PDLI e/ou 2, anticorpos anti-IL-10, anticorpos anti-IL-6, e semelhante. Ademais, poderia ser vantajoso se eliminar célulasdendríticas plasmacitóides, mostradas ser imunossupressivas em ambiente de câncer. Nasreferidas modalidades nas quais o envio de um anticorpo anti-CD200 é pretendido paraaumentar uma resposta imune ao bloquear a supressão imune, por exemplo, uma variantede anticorpo anti-CD200 desprovida de função efetora pode também ser usada.

Em modalidades particularmente úteis, a terapia que aumenta a resposta imune é aadministração de polipeptídeo que se liga a CD200, isoladamente ou em combinação comuma das terapias imunomodulatórias anteriormente mencionadas. Deste modo, umantagonista CD200 (incluindo um anticorpo anti-CD200 como descrito aqui) pode ser usadoem combinação com um anticorpo monoclonal (por exemplo, rituximab, trastuzumab,alemtuzumab, cetuximab, ou bevacizumab), incluindo um anticorpo monoclonal conjugado(por exemplo, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetan, ou tositumomab).

Ademais, a combinação de terapia anti-CD200 com quimioterapêuticos pode serparticularmente útil para reduzir a carga tumoral total, para limitar a angiogênese, paraaumentar a acessibilidade do tumor, para aumentar a susceptibilidade a ADCC1 pararesultar em maior função imune ao proporcionar mais antígeno de tumor, ou para aumentara expressão do LIGHT atrator de célula T. Quando a terapia anti-CD200 é administrada aum indivíduo em combinação com outro agente anti-neoplástico convencional, sejaconcomitantemente ou em seqüência, a terapia anti-CD200 pode ser mostrada de modo aaumentar o efeito terapêutico de cada agente isoladamente. Os compostos farmacêuticosque podem ser usados para terapia combinatória anti-tumor terapia incluem, meramentepara ilustrar: aminoglutetimida, ansacrina, anastrozol, asparaginase, beg, bicalutamida,bleomicina, busserrelina, bussulfano, camptotecina, capecitabina, carboplatina, carmustina,clorambucila, cisplatina, cladribina, clodronato, colchicina, ciclofosfamida, ciproterona,citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dienestrol, dietilestilbestrol,docetaxel, doxorrubicina, epirrubicina, estradiol, estramustina, etoposídeo, exemestano,filgrastim, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracila, fluoximesterona, flutamida, gencitabina,genisteína, gosserrelina, hidroxiuréia, idarrubicina, ifosfamida, imatinibe, interferon,irinotecana, letrozol, leucovorina, leuprolida, levamisol, lomustina, mecloretamina,medroxiprogesterona, megestrol, melfalana, mercaptopurina, mesna, metotrexato,mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazol, octreotídeo, oxaliplatina,paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfimer, procarbazina, raltitrexede,rituximabe, estreptozocina, suramina, tamoxifeno, temozolomida, teniposídeo, testosterona,tioguanina, tiotepa, cloridrato de titanoceno, topotecana, trastuzumabe, tretinoína,vimblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina.

Os referidos compostos anti-tumor quimioterapêuticos podem ser categorizados porseus mecanismos de ação em grupos, incluindo, por exemplo, as classes de agentes aseguir: anti-metabólitos/agentes anti-câncer, tais como análogos de pirimidina (5-fluorouracila, floxuridina, capecitabina, gemcitabina e citarabina) e análogos de purina,antagonists fdlato e inibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodeoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitóticos incluindo produtosnaturais tais como alcalóides de vinca (vinblastina, vincristina, e vinorelbina), rompedores demicrotúbulo tais como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazola,epotilonas e navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposida, teniposida), Agentes danificadoresde DNA (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfan, camptotecina,carboplatina, clorambucil, cisplatina, ciclofosfamida, cytoxan, dactinomicina, daunorubicina,doxorubicina, epirubicina, hexametilmelamineoxaliplatina, ifosfamida, melfalan,mecloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicina, procarbazina, taxol,taxotere, teniposida, trietilenetiofosforamida e etoposida (VP16)); antibióticos tais comodactinomicina (actinomicina D), daunorubicina, doxorubicina (adriamicina), idarubicina,antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) e mitomicina; enzimas (L-asparaginase que sistematicamente metaboliza L-asparagina e priva células que nãoapresentam a capacidade de sintetizar sua própria asparagina); agentes antiplaquetários;agentes alquilantes antiproliferativos/antimitóticos tais como mostardas de nitrogênio(mecloretamina, ciclofosfamida e análogos, melfalan, clorambucil), etileniminas emetilmelaminas (hexametilmelamina e tiotepa), sulfonatos-busulfan de alquila, nitrosouréias(carmustina (BCNU) e análogos, streptozocina), trazenos - dacarbazinina (DTIC);antimetabólitos antiproliferativos/antimitóticos tais como análogos de ácido fólico(metotrexato);complexos de coordenação de platina (cisplatina, carboplatina), procarbazina,hidroxiuréia, mitotano, aminoglutetimida; hormônios, análogos de hormônios (estrogênio,tamoxifen, goserelina, bicalutamida, nilutamida) e ininidores de aromatase (letrozola,anastrozola); anticoagulantes (heparina, sais de heparina sintética e outros inibidores detrombina); agentes fibrinolíticos (tais como ativador de plasminogênio de tecido,streptoquinase e uroquinase), aspirina, dipiridamole, ticlopidina, clopidogrel, abciximab;agentes antimigratórios; agentes antisecretolíticos (breveldina); imunossupressivos(ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina, micofenolatomofetila); agentes imunomodulatórios (talidomida e análogos dos mesmos tais comoIenalidomida (Revlimid, CC-5013) e CC-4047 (Actimid)), ciclofosfamida; compostos anti-angiogênicos (TNP-470, genistein) e inibidores de fator de crescimento (fator de crescimentoendotelial vascular (VEGF), inibidores de fator de crescimento de fibroblasto (FGF));bloqueador de receptor de angiotensina; doadores de óxido nítrico; oligonucleotídeos anti-sentido; anticorpos (trastuzumab); inibidores de ciclo celular e indutores de diferenciação(tretinoina); inibidores de mTOR, inibidores de topoisomerase (doxorubicina (adriamicina),amsacrina, camptotecina, daunorubicina, dactinomicina, eniposida, epirubicina, etoposida,idarubicina e mitoxantrona, topotecan, irinotecan), corticoesteróides (cortisona,dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona, e prenisolona); inibidores dequinase transdução de sinal de fator de crescimento; indutores de disfunção mitocondrial eativadores de caspase; e rompedores de cromatina.

Em determinadas modalidades, compostos farmacêuticos que podem ser usadospara terapia combinatória anti-angiogênese incluem: (1) inibidores de liberação de"moléculas angiogênicas," tais como bFGF (fator de crescimento de fibroblasto básico); (2)neutralizadores de moléculas angiogênicas, tais como anticorpos anti-3bFGF; e (3)inibidores de resposta de célula endotelial a um estímulo angiogênico, incluindo inibidor decolagenase, inibidores de movimento de base de membrana, esteróides angiostáticos,inibidores de angiogênese derivada de fungos, fator 4 plaquetário, trombospondina, drogasde artrite tais como D-penicilamina e tiomalato de ouro, análogos de vitamin D3, alfa-interferon, e semelhante. Para inibidores de angiogênese adicionais propostos, ver, Blood etal., Biochim. Biophys. Acta, 1032:89 - 118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408 - 1410(1990), Ingber et al., Lab. Invest, 59:44 - 51 (1988), e Patentes U.S. Nos. 5,092,885;5,112,946; 5,192,744; 5,202,352; e 6,573,256. Ademais, há uma grande variedade decompostos que podem ser usados para inibirem a angiogênese, por exemplo, peptídeos ouagentes que bloqueiam o trajeto de angiogênese mediado a VEGF, proteína ou derivadosde endostatina, fragmentos de angiostatina de ligação de lisina, melanina ou compostos quepromovem melanina, fragmentos de plasminogênio (por exemplo, Kringles 1-3 deplasminogênio), subunidades de troponina, antagonistas de vitronectina avp3, peptídeosderivadas a partir de Saposin B, antibióticos ou análogos (por exemplo, tetraciclina, ouneomicina), composições contendo dienogest, compostos que compreende um núcleoinibitório MetAP-2 acoplado a um peptídeo, o composto EM-138, chalcone e seus análogos,e inibidores de naaladase. Ver, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6,395,718; 6,462,075;6,465,431; 6,475,784; 6,482,802; 6,482,810; 6,500,431; 6,500,924; 6,518,298; 6,521,439;6,525,019; 6,538,103; 6,544,758; 6,544,947; 6,548,477; 6,559,126, e 6,569,845.

Dependendo da natureza da terapia combinatória, a administração do anticorpoanti-CD200 pode ser continuada enquanto a outra terapia está sendo administrada e/ouapós. A administração do anticorpo pode ser implementada em uma única dose, ou emmúltiplas doses. Em alguns casos, a administração do anticorpo anti-CD200 é iniciada pelomenos diversas dias antes da terapia convencional, enquanto em outros casos,administração é iniciada ou imediatamente antes ou no momento da administração daterapia convencional. Em alguns cases, o anticorpo anti-CD200 será administrado apósoutras terapias, ou o mesmo pode ser administrado alternando com outras terapias.

Os presentes anticorpos podem ser utilizados para diretamente exterminar oueliminar células cancerosas in vivo. O extermínio direto envolve administrar os anticorpos(que são opcionalmente fundidos a uma droga citotóxica) a um indivíduo que necessite doreferido tratamento. Uma vez que os anticorpos reconhecem CD200 nas célulascancerosas, quaisquer das referidas células às quais os anticorpos se ligam são destruídas.

Onde os anticorpos são usados isoladamente para exterminar ou eliminar as célulascancerosas, o referido extermínio ou eliminação pode ser efetuado ao se iniciar funçõesimunes hospedeiras endógenas, tais como CDC e/ou ADCC. Testes para determinar se umanticorpo extermina células desta maneira estão dentro do âmbito daqueles versados natécnica.

Deste modo em uma modalidade, os anticorpos da presente descrição podem serusados para enviar uma variedade de compostos citotóxicos. Quaisquer compostoscitotóxicos podem ser fundidos aos presentes anticorpos. A fusão pode ser alcançadaquímica ou geneticamente (por exemplo, via expressão como uma única molécula fundida).

Os compostos citotóxicos podem ser um biológico, tal como um polipeptídeo, ou umapequena molécula. Como aqueles versados na técnica podem observar, para pequenasmoléculas, fusão química é usada, enquanto que para compostos biológicos, ou fusãoquímica ou genética podem ser empregadas.

Exemplos não Iimitantes de compostos citotóxicos incluem drogas terapêuticas, umcomposto que emite radiação, moléculas de plantas, fungos, ou orgina bacteriana, proteínasbiológicas, e misturas dos mesmos. As drogas citotóxicas podem ser drogas citotóxicas queatuam intracelularmente, tais como emissores de radiação de curto alcance, incluindo, porexemplo, a-emissores de curto alcance e alta energia. Toxinas enzimaticamente ativas efragmentos das mesmas são exemplificados por fragmento A de toxina de difteria,fragmentos ativos de não ligação de toxina de difteria, exotoxina A (das Pseudomonasaeruginosa), cadeia de riçina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sacrina,determinadas proteínas Ajeurites fordii, determinadas proteínas Dianthina, proteínas dePhytolacca americana (PAP, PAPII e PAP-S), inibidor de Morodica charantia, curcina,crotina, inibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogillina, estrictocina, fenomicina, eenomicina, por exemplo.

Procedimentos para preparar polipeptídeos enzimaticamente ativos deimunotoxinas são descritos em W084/03508 e W085/03508, as quais se encontram aquiincorporadas por referência. Determinadas frações citotóxicas são derivadas a partir deadriamicina, clorambucil, daunomicina, metotrexato, neocarzinostatina, e platina, porexemplo.

Procedimentos para conjugar os anticorpos com os agentes citotóxicos já foramanteriormente descritos e são dentro do âmbito daqueles versados na técnica.

Alternativamente, o anticorpo pode ser acoplado a emissores de radiação de altaenergia, por exemplo, a radioisótopo, tal como |3|l, um y-emissor, o qual, quando localizadono campo do tumor, resulta no extermínio de diversos diâmetros de célula. Ver, porexemplo, S. E. Order, "Analyse, Results, e Future Prospective of the Therapeutic Use ofRadiolabeled Antibody in Câncer Therapy", Monoclonal Antibodies for Câncer Detecção andTherapy, R. W. Baldwin et al. (eds.), pp 303 - 316 (Academic Press 1985), os quais seencontram aqui incorporadas por referência. Outros radioisótopos adequados incluem a-emissores, tais como 2l2Bi, 213Bi, e 211At, e p"-emissores, tais como l86Re e 90Y.

Em algumas modalidades, os presentes anticorpos de ligação CD200 proporcionamo benefício de bloquear a supressão imune em CLL ao direcionar as células leucêmicasdiretamente através CD200. Especificamente, a estimulação do sistema imune pode permitira erradicação de células CLL a partir dos Baco e dos nodos linfáticos. Os requerentes nãoestão cientes de qualquer erradicação bem sucedida de células CLL a partir dos referidosmicroambientes tenha sido alcançada com agentes que simplificam as células B alvo. (talcomo alemtuzumab). De modo diferente, células T CLL reativas podem ser dotadas demelhor acesso aos referidos órgãos do que os anticorpos. Em outras modalidades, oextermínio celular direto é alcançado por marcação das células CLL com anti-CD200 Abs.

De acordo com as composições e métodos da presente descrição, em modalidadesparticularmente úteis, a combinação de extermínio celular direto e direcionamento daresposta imune em direção a um perfil Thl proporciona uma abordagem particularmentepotente para o tratamento do câncer. Assim, em uma modalidade, a tratamento do câncer éproporcionados onde um anticorpo ou fragmento de anticorpo, que se liga a CD200 e ambosa) bloqueiam a interação entre CD200 e seus receptores e b) diretamente exterminam ascélulas cancerosas que expressam CD200, são administrados a um paciente com câncer. Omecanismo pelo qual as células cancerosas são exterminadas pode incluir, mas não sãolimitados a ADCC e/ou CDC; fusão com a toxina; fusão com um radiomarcador; fusão comum agente biológico envolvido em extermínio celular, tal como granzime B ou performa;fusão com um vírus citotóxico; fusão com uma citocina tal como TNF-a ou IFN-a. Emmodalidade alternativa, o tratamento do câncer envolve administrar um anticorpo que tantoa) bloqueia a interação entre CD200 e seus receptores e b) aumenta a atividade de célulaNK ou células T citotóxicas contra o tumor. O referido aumento de atividade de célula NK oucélulas T citotóxicas pode, por exemplo, ser combinado por fusão do anticorpo com citocinastais como, por exemplo, IL-2, IL-12, IL-18, IL-13, e IL-5. Ademais, o referido aumento podeser alcançado por administração de um anticorpo anti-CD200 em combinação cominibidores tais como IMiDs, talidomida, ou análogos de talidomida.

Em ainda outra modalidade, o tratamento do câncer envolve administrar umanticorpo que tanto (1) bloqueia a interação entre CD200 e seus receptores e (2) atrai ascélulas T para as células de tumor. A atração de célula T pode ser alcançada por fusão deAb com quimiocinas tais como MIG, IP-10, l-TAC, CCL21, CCL5 ou LIGHT. Também, otratamento com quimioterapêuticos pode resultar na regulação a maior de LIGHT. As açõescombinadas de bloqueio de supressão imune e extermínio direto através do direcionamentode anticorpo das células de tumor é uma abordagem única que proporciona maior eficácia.

Os anticorpos anti-CD200 de acordo com a presente descrição podem também serusados como uma ferramenta de diagnóstico. Biópsias ou amostras de tecido de célula decâncer podem ser testados quanto a expressão de CD200 antes do tratamento de modo aprever a eficácia da terapia anti-CD200, isoladamente ou em combinação com outrosagentes ou métodos (tais como quimioagentes terapêuticos, terapia de radiação, terapiaimunomodulatória, etc.). Por exemplo, usando sangue obtido a partir de pacientes comcânceres hematopoiéticos, a expressão de CD200 pode ser avaliada em células cancerosaspor análise de FACS usando anticorpos anti-CD200 em combinação com os marcadores decélula de câncer apropriados tais como, por exemplo, CD38 e GDI9 em Células CLL.

Pacientes com os níveis de CD200 pelo menos 1.4-vezes acima dos níveis encontrados emcélulas B normais podem ser selecionadas para tratamento com anticorpos anti-CD200. Umoutro exemplo, amostras de tecido a partir de um paciente podem ser coradas comanticorpo anti-CD200 para determinar a expressão de CD200 nas células malignas enormais do paciente.

Em outro exemplo de uso dos presentes anticorpos anti-CD200 como umaferramenta de diagnóstico ou de prognóstico, biópsias de pacientes com malignidades sãoobtidas e a expressão de CD200 é determinada por Análise FACS usando anticorpos anti-CD200 ou por imunohistoquímica usando anti-CD200. Se as células de tumor expressamCD200 em níveis que são pelo menos 1.4-vezes superior comparada ao tecido normalcorrespondente, pacientes com câncer são selecionados para terapia imunomodulatória(incluindo mas não limitado a uma terapia que compreende terapia anti-CD200). Paracâncer derivado a partir de células que normalmente não expressam CD200, qualquerCD200 detectável nas biópsias de câncer indica utilidade potencial da terapia anti-CD200. Aterapia imunomodulatória pode ser a terapia anti-CD200, mas pode também ser qualqueroutra terapia que afeta o sistema imune do paciente. Exemplos de terapiasimunomodulatórias adequadas incluem a administração de agentes que bloqueiam aregulação negativa de células T ou de células que apresentam antígeno (por exemplo, anti-CTLA4, anti-PD-LI, anti-PDL-2, anti-PD-1) ou a administração de agentes que aumentam apositiva co-estimulação das células T (por exemplo, anti-CD40 ou anti 4-1 BB). Ademais, aterapia imunomodulatória pode ser vacinas de câncer tais como peptídeos heteroclíticos oupeptídeos de célula de tumor que geram Células T citotóxicas ou células dendríticascarregadas com células de tumor, ou a administração de agentes que aumentam o númerode células NK ou a atividade de célula T (por exemplo, anticorpos anti-CD200 isoladamenteou em combinação com inibidores tais como IMiDs, talidomida, ou análogos de talidomida),ou a administração de agentes que esvaziam as Células T regulatórias (por exemploanticorpos anti-CD200 isoladamente ou em combinação com ONTAK), ou célulasdendríticas plasmacitóides. A combinação com agentes que aumentam a migração de célulaT ou de célula dendrítica é também vantajosa tal como, por exemplo, qualquer agente debloqueio de SPARC. Ademais, a terapia imunomodulatória pode ser vacinas de câncer taiscomo células dendríticas carregadas com células de tumor, DNA de tumor ou RNA de tumorde exosomas derivados de paciente, proteína de tumor ou peptídeos de tumor, proteínas dechoque de calor derivadas de paciente (hsp's), hsp's carregados com antígenos de tumor ouadjuvantes gerais que estimulam o sistema imune em vários níveis tais como CpG1 Luivac,Biostim, Ribominil, lmudon, Broncovaxom ou qualquer outro composto que ative osreceptores do sistema imune inato (por exemplo, receptores como toll). Também, a terapiapode incluir o tratamento com citocinas tais como IL-2, GM-CSF e IFN-gamma. Acombinação com agentes de restauração comprometeram a atividade de células dendríticasno ambiente do tumor tal como, por exemplo, inibidores de MAP quinase são tambémcontemplados.

Em uma modalidade, os presentes anticorpos também podem ser utilizados paradetectar células cancerosas in vivo. A detecção in vivo é alcançada por marcação doanticorpo, administrar o anticorpo marcado a um indivíduo, e então imagear o indivíduo.

Exemplos de marcações úteis para imageamento diagnóstico de acordo com a presentedescrição são radiomarcações tais como biI1 niIna, 123I, 99mTc1 32P, l2sI, 3H1 14C1 e 188Rhlmarcações fluorescentes tais como fluoresceina e rodamina, marcações ativas deressonância nuclear magnética, isótopos emissores de pósitron detectáveis por leitor detomografia de emissão de pósitrons ("PET"), quimioluminescentes tais como Iuciferina1 emarcadores enzimáticos tais como peroxidase ou fosfatase. Emissores de radiação de curtoalcance, tais como isótopos detectáveis por sondas detectoras de curto alcance, tal como asonda transretal, podem também ser empregados. O anticorpo pode ser marcado com osreferidos reagentes usando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, ver, Wensel eMeares, Radioimmunoimaging e Radioimmunoterapia, Elsevier, N.Y. (1983), que seencontram aqui incorporadas por referência, para técnicas relativas à radiomarcação de5 anticorpos. Ver, também, D. Colcher et ai., "Use of monoclonal antibodies asRadiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma Xenografts em AthymicMice", Meth. Enzymol. 121: 802 - 816 (1986), o qual se encontra aqui incorporada porreferência.

Um anticorpo radiomarcado de acordo com a presente descrição pode ser usadopara testes diagnósticos in vitro. A atividade específica de um anticorpo, porção de ligaçãodos mesmos, sonda, ou ligante, depende da meia vida, da pureza do isotópico da marcaçãoradioativa, e de como a marcação é incorporada no agente biológico. Em testes deimunoensaio, quanto maior a atividade específica, em general, melhor a sensibilidade.Procedimentos para a marcação de anticorpos com os isótopos radioativos são em geralconhecido na técnica.

O anticorpo radiomarcado pode ser administrado a um paciente onde o mesmo élocalizado em células cancerosas portadoras de antígeno com os quais o anticorpo reage, eé detectado ou "imageado" in vivo usando técnicas conhecidas tais como scannerradionuclear usando, por exemplo, uma câmera gama ou tomografia de emissão. Ver, porexemplo, A. R. Bradwell et al., "Developments em Antibody Imaging", monoclonal antibodiesfor Câncer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), pp. 65 - 85 (Academic Press1985), os quais se encontram aqui incorporadas por referência. Alternativamente, umscanner de tomografia transaxial de emissão de pósitrons, tal como o designado Pet Vllocalizado em Brookhaven National Laboratory, podem ser usados onde a radiomarcaçãoemite pósitrons (por exemplo, C, F, O, e 13N).

Agentes biológicos marcados com fluoróforo e cromóforo podem ser preparados apartir de frações padrão conhecidas na técnica. Uma vez que os anticorpos e outrasproteínas absorvem luz dotada de comprimentos de onda de cerca de 310 nm, as fraçõesfluorescentes devem ser selecionadas de modo a ter absorção substancial emcomprimentos de onda acima de 310 nm e preferivelmente acima de 400 nm. Umavariedade de fluorescentes e cromóforos adequada são descritas por Stryer, Science,162:526 (1968) e Brand, L. et al., Annual Review of Biochemistry, 41:843 - 868 (1972), osquais se encontram aqui incorporadas por referência. Os anticorpos podem ser marcadoscom grupos cromóforos fluorescentes por procedimentos convencionais tais como aquelesdescritos em Patentes U.S. Nos. 3,940,475; 4,289,747, e 4,376,110, as quais se encontramaqui incorporadas por referência.

Em uma outra modalidade de acordo com a presente descrição, métodos sãoproporcionados para monitorar o progresso e/ou eficácia do tratamento terapêutico. Ométodo envolve administrar uma terapia imunomodulatória e determinar os níveis de CD200em um indivíduo pelo menos duas vezes para determinar a eficácia da terapia. Por exemplo,níveis de pré-tratamento de CD200 podem ser determinados e, após pelo menos umaadministração da terapia, níveis de CD200 podem mais uma vez ser determinados. Umaredução nos níveis de CD200 é indicativa de um tratamento eficaz. A medição dos níveis deCD200 pode ser usada pelo técnico como um guia para aumentar a quantidade de dosagemou a freqüência de uma terapia. Evidentemente, deve ser entendido que os níveis de CD200podem ser diretamente monitorados ou, alternativamente, qualquer marcador que secorrelacione com CD200 podem ser monitorados. Outros métodos para determinar aeficácia da referida terapia incluem, mas não são limitados à detecção de célulascancerosas, contagem de linfócitos totais, tamanho de linfonodo, número de células Treguatórias, perfil de citocinas no soro ou intracellular, ou secreção de citocinas por célulasT ou B como medido por ELISPOT.

C. Outros antaqonistas de cd200

Os antagonistas de CD200 e polipeptídeos e/ou anticorpos utilizados na presentedescrição são em especial indicados para aplicações diagnosticas e terapêuticas comodescrito aqui. Deste modo, os antagonistas de CD200 e anticorpos anti-CD200 e variantesdos mesmos podem ser usados em terapias, incluindo terapias de combinação, emdiagnóstico e prognóstico de doença, assim como no monitoramento do progresso dadoença.

Nas modalidades terapêuticas da presente descrição, anticorpos biespecíficos sãocontemplados. Anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferivelmentehumanos ou humanizados, anticorpos que apresentam especificidades de Iigacap para pelomenos dois diferentes antígenos. No presente caso, uma das especificidades de ligação épara o antígeno CD200 em uma célula (tal como, por exemplo, uma célula de câncer oucélula imune), a outra referida é para qualquer outro antígeno, e preferivelmente for umaproteína ou receptor de superfície celular ou subunidade receptora.

Métodos para a produção de anticorpos biespecíficos estão dentro do âmbitodaqueles versados na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorposbiespecíficos é com base na co-expressão de dois pares de imunoglobulina cadeiapesada/cadeia leve, onde as duas cadeias pesadas apresentam diferentes especificidades(Milstein e Cuello, Nature, 305:537 - 539 (1983)). Um domínio variável de anticorpos com asespecificidades de ligação desejadas (campos que combinam anticorpo-antígeno) pode serfundido às seqüências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão preferivelmente écom an domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo pelo menos partedas regiões de articulação, CH2, e CH3. DNAs que codificam as fusões de cadeia pesadade imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos intovetores de expressão separados, e são co-transfectados em um organismo hospedeiroadequado. Para detalhes adicionais dos métodos atualmente conhecidos ilustrativos paragerar anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology,121:210(1986); WO 96/27011; Brennanetal., Science 229:81 (1985); Shalabyetal., J. Exp.Med. 175:217 - 225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol. 148(5): 1547 -1553 (1992); Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444 - 6448 (1993); e Gruber et al., J. Immunol.152:5368 (1994); e Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). Anticorpos biespecíficos tambémincluem anticorpos reticulados ou heteroconjugados. Anticoprpos heteroconjugados podemser produzidos usando quaisquer métodos de reticulação convenientes. Agentes dereticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são descritos em Patente U.S. No.4,676,980, junto com uma série de técnicas de reticulação.

Várias técnicas para produção e isolamento de fragmentos de anticorpobiespecífico diretamente a partir cultura celular recombinante foram também descritas. Porexemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos usando zippers de leucina. Kostelny etal., J. Immunol., 148(5): 1547 - 1553 (1992). Os peptídeos zipper de leucina a partir dasproteínas Fos e Jun podem ser ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes porfusão de gene. Os homodímeros de anticorpo podem ser reduzidos em uma região dearticulação para formar monômeros e então re-oxidados para formar os heterodímeros deanticorpo. O referido método pode também ser utilizado para a produção de homodímerosde anticorpo. A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 90:6444 - 6448 (1993) proporcionou um mecanismo alternativo para a produção defragmentos de anticorpo biespecífico. os fragmentos compreendem a domínio variável decadeia pesada (Vh) conectado ao domínio variável de cadeia leve (Vl) por um agente deligação que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios mesma cadeia.

Deste modo, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a parear com os domíniosVl e Vh complementares de outro fragmento, deste modo formando dois campos de ligaçãode antígeno. Outra estratégia de produção de fragmentos de anticorpo biespecífico pelo usode dímeros de cadeia simpleís Fv (scFv) foi também reportada. Ver, Gruber et al., J.Immunol., 152:5368 (1994). Alternativamente, os anticorpos podem ser "anticorpos lineares"como descrito em Zapata et al. Protein Eng. 8(10): 1057 - 1062 (1995). Em suma, osreferidos anticorpos compreendem um par de segmentos Fd tandem (Vh -ChI-Vh -ChI) queformam um par de regiões de ligação de antígeno. Os anticorpos lineares podem serbiespecíficos ou monoespecíficos.

D. Modos de administração e formulações

A via de administração de anticorpo dos anticorpos da presente descrição (seja umanticorpo puro, um anticorpo marcado, um anticorpo fundido a uma toxina, etc.) é de acordocom métodos conhecidos, por exemplo, por meio de injeção ou infusão por via intravenosa,intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, subcutânea, intraocular, intraarterial, intratecal,inalação ou intralesional, ou por sistemas de liberação sustentada. O anticorpo épreferivelmente administrado continuamente por infusão ou por injeção de bolus. É possívelse administrar os anticorpos de modo sistêmico ou local.

Os presentes anticorpos podem ser preparados em mistura com um veículofarmaceuticamente aceitável. Técnicas para a formulação e administração dos compostosdo presente pedido podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences,"Mack Publishing Co., Easton, PA, última edição. A referida composição farmacêutica podeser administrada por via intravenosa ou através do nariz ou pulmão, preferivelmente comoum líquido ou pó aerossol (liofilizado). A composição pode também be administrada por viaparenteral ou por via subcutânea como desejado. Quando administrada por via sistêmica, acomposição farmacêutica deve ser estéril, substancialmente livre de pirógeno e na soluçãoparenteralmente aceitável dotada do devido cuidado com relação a pH, isotonicidade, eestabilidade. Por exemplo, uma preparação farmacêutica é substancialmente livre demateriais pirogênicos de modo a ser adequada para administração como um terapêuticohumano. As referidas condições são conhecidas daqueles versados na técnica.

Composições farmacêuticas adequadas para uso incluem as composições onde umou mais dos presentes anticorpos são contidos em uma quantidade eficaz para alcançar o20 seu objetivo pretendido. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficazsignifica uma quantidade do anticorpo eficaz para evitar, aliviar ou melhorar os sintomas dadoença ou prolongar a sobrevivência do indivíduo sendo tratado. A determinação de umaquantidade terapeuticamente eficaz é bem conhecida da capacidade daqueles versados natécnica, em especial na luz da descrição detalhada aqui proporcionada. Dosesterapeuticamente eficazes podem ser determinadas pelo uso de métodos in vitro e in vivo.

Embroa a descrição acima tenha sido direcionada a anticorpos, em algumasmodalidades os polipeptídeos derivados a partir dos referidos anticorpos podem serutilizados de acordo com a presente descrição.

Exemplificacão

Construção de modelo de rato e célula cd200+Modelo raii/pbl

Ratos NOD.CB17-Prkdc<scid> (Jackson Laboratory) foram injetados com 200 μΙ_de RPM1 contendo 4x106 células RAJI (ATCC) s.c. junto com 0, 1, 5 ou 10 milhões PBLs.

Nove ou dez ratos foram incluídos por grupo. PBLs foram isolados a partir de 250 ml_ desangue total em um gradiente histopaco seguido de Iise de célula sangüínea vermelhausando 0.9% de cloreto de amônia. O crescimento tumoral foi monitorado três vezes porsemana ao medir o comprimento e a largura com um calibre. O volume do tumor foicalculado com base em comprimento χ largura χ largura/2.

Diferenças entre os grupos que foram injetados com PBLs comparadas ao grupoque receberam células de tumor apenas foram analisadas por t-teste de Student de 2-prolongamentos não pareados. Diferenças significantes foram observadas nos grupos quereceberam 5 ou 10 milhões de PBLs1 mas não no grupo que recebeu 1 milhão de PBLs apartir do trigésimo segundo dia em diante.

Modelo Namalwa PBL

Ratos NOD.CB17-Prkdc<scid> (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) foraminjetados com 200 pL de RPMI contendo 4 χ 106 células Namalwa (ATCC) s.c. junto com 0,2 ou 10 milhões de PBLs. 9-10 ratos foram incluídos por grupo. PBLs foram isolados apartir de 250 mL de sangue total em um gradiente histopaco seguido de Iise de célulasangüínea vermelha usando 0.9% de cloreto de amônia. O crescimento tumoral foimonitorado três vezes por semana ao medir o comprimento e a largura com um calibre. Ovolume do tumor foi calculado com base em comprimento χ largura χ largura/2.

Criação de Célula estável que expressa linhagens CD200CD200- estáveis que expressam linhagens celulares de Raji e Namalwa foramgeradas usando o Virapower Lentiviral Expression System (Invitrogen, Carlsbad1 CA). UmcDNA de CD200 foi isolado a partir de células primárias CLL por RT-PCR usando o primerdianteiro 5'-GACAAGCTTGCAAGGATGGAGAGGCTGGTGA-3' (SEQ ID NO: 34) e o primerreverso 5'-GACGGATCCGCCCCTTTTCCTCCTGCTTTTCTC-3· (SEQ ID NO: 35). O produtoPCR foi clonado no vetor de entrada Gateway pCR8/GW/TOPO-TA e clones individuaisforam sequenciados. Os clones com a seqüência correta foram recombinados em ambas asorientações de sentido e e anti-sentido nos vetores Ientivirais pLenti6/V5/DEST epLenti6/UbC/V5/DEST usando tecnologia Gateway (Invitrogen, Carlsbad1 CA). A principaldiferença entre os referidos dois vetores é que o promotor usado para direcionar aexpressão de CD200: pLenti6/V5/DEST contém o promotor precoce imediato de CMVhumano, enquanto que pLenti6/UbC/V5/DEST contém o promotor C de ubiquitina humana.

Estoques de VSV-G Ientivirais pseudotipados de alta titulação foram produzidos porcotransfecção transitória de células 293-FT como recomendado pelo fabricante. As célulasRaji ou Namalwa foram convertidas por resuspensão de 106 células em 1 mL de meio decrescimento contendo 12 pg/mL de Polibreno e a adição de 1 mL de estoque lentiviral. Apósincubar as células durante a noite a 37°C, o meio contendo vírus foi removido e substituídocom 4 mL de meio fresco. Dois dias depois, as células infectadas foram analisadas para aexpressão de CD200 por citometria de fluxo. Em todos os experimentos, >70% das célulasforam CD200+, enquanto que CD200 não foi detectável nas linhas celulares parentes e emcélulas convertidas com os vírus de controle negativo (anti-sentido CD200).

Para isolar uma linhagem celular de clones que super expressam CD200, ascélulas infectadas foram selecionadas com blasticidina por 13 dias. As concentrações deblasticidina usadas foram 6 pg/mL para células Raji ou 2 pg/mL para células Namalwa. Osclones estáveis foram então isolados por limitar a diluição das ceullas ressitentes ablasticidina em em placas de 96 cavidades. Os clones foram pesquisados em formato de 96cavidades por citometria de fluxo usando CD200 anti-Humano de rato PE conjugado (cloneMRC 0X104, Serotec) e um BD FACSCaIibur equipado com a amostrador de altaprodutividade. Após a leitura de um total de 2000 Raji e 2000 Namalwa clones, os referidosclones com a maior expressão de CD200 foram expandidos para caracterização adicionalusando convencional técnicas.

Exemplo 1

Eficácia de versões humanizadas de C2aB7 no modelo de RAJI_CD200/PBLA) para se avaliar se as versões humanizadas de C2aB7 retêm a sua eficácia emmodelos de tumores in vivo, quimérico C2aB7 (ver, Publicação de pedido de patente U.S.No. 2005/0129690) e 3 versões humanizadas (C2aB7V4VI, C2aB7V3VI e C2aB7V3V2)assim como o anticorpo de controle negativo alxn4100 foram testados no modelo RAJI-CD200/PBL. Células RAJI convertidas com CD200 foram injetadas s.c. em ratosNOD.CB17-Prkdc<scid>, e a habilidade de PBLs para reduzir o crescimento tumoral napresença ou ausência de anticorpos quimérico ou humanizado C2aB7 ou anticorpo decontrole alxn4100 (que não se liga a células de tumor) foi avaliada. Os anticorpos emconcentrações indicadas abaixo foram administrados inicialmente com as células de tumor,e então duas vezes/por semana i.v. Os grupos a seguir foram ajustados com 10 ratos cada:

Grupo 1: 4 χ 106 RAJI_CD200 s.c.Grupo 2: 4 χ 106 RAJI_CD200 s.c. + 6x10® PBLGrupo 3: 4 χ 106 RAJI_CD200 s.c. + 6 χ 106 PBL +5 mg/kg C2aB7Grupo 4: 4 χ 106 RAJI_CD200 s.c. + 6 χ 106 PBL +20 mg/kg C2aB7V4VIGrupo 5: 4 χ 106 RAJT_CD200 s.c. + 6 χ 106 PBL +5 mg/kg C2aB7V4VIGrupo 6: 4 χ 106 RAJI_CD200 s.c. + 6 χ 106 PBL +20 mg/kg C2aB7V3VIGrupo 7: 4 χ 106 RAJI_CD200 s.c. + 6 χ 106 PBL +5 mg/kg C2aB7V3VIGrupo 8: 4 χ 106 RAJI_CD200 s.c. + 6 χ 106 PBL +5 mg/kg C2aB7V3V2Grupo 9: 4 χ 106 RAJI_CD200 s.c. + 6 χ 106 PBL +20 mg/kg alxn4100

O comprimento e a largura do tumor foram medidos 3 vezes por semana, e ovolume do tumor foi calculado por tumor comprimento* largura*largura/2. A Figura 18 mostraque, como esperado, a expressão de CD200 nas células de tumor evitou que as célulasimunes reduzicem o crescimento tumoral. Todas as versões humanizadas de C2aB7bloquearam o crescimento tumoral em cerca de 97% em doses de 20 mg/kg. O anticorpo decontrole alxn4100 não afetou o crescimento tumoral. Os referidos dados demonstram quetodos os anticorpos humanizados são altamente eficazes em bloquear o crescimentotumoral.

Β) Evasão imune por CD200

Embora o sistema imune humano seja capaz de suscitar uma resposta imunecontra diversos tipos de câncer, esta resposta é insuficiente para erradicar o câncer namaior parte dos pacientes, possivelmente em virtude da evasão imune através da regulaçãonegativa do sistema imune para o tumor. Foi identificado que a molécula imune-supressivaCD200 foi regulada a maior de 1.5 - 5.4-vezes em células (CLL) de leucemia linfocíticacrônica em todos os pacientes examinados (n = 80). A interação de CD200 com seusreceptores é conhecida por alterar o perfil de citocinas a partir de Thl para Th2 em reaçõesde linfócitos misturadas, e de resultar na indução de células T regulatórias, as quais sãoconhecidas por aumentar a imunidade da célula T efetora específica de tumor. No estudopresente nos concentramos em se a expressão de CD200 nas células de tumordesempenha um papel na evasão imune, deste modo evitando a eliminação de células detumor pelo sistema imune no xenoenxerto de modelo de hu/SCID rato, e se o tratamentocom um anticorpo anti-CD200 antagonístico afeta o crescimento tumoral neste modelo.

As linhagens celulares de Iinfoma de Hodgkin1S não humano RAJI e Namalwa foramconvertidas com CD200 humano e foram injetadas por via subcutânea junto com linfócitosdo sangue periférico humano (PBMC) em ratos NOD/SCID. O crescimento tumoral em ratosque receberam CD200 que expressam células de tumor foi comparado ao crescimentotumoral em ratos que receberam células de tumor que não expressaram CD200 com otempo. Em experimentos subsequentes, os ratos foram tratados com anticorpo quimérico oucom os anticorpos anti-CD200 humanizados (dose na faixa de 1 mg/kg a 20 mg/kg) porinjeção intravenosa. O tratamento foi ou iniciado imediatamente ou 7 dias após a injeção decélula no tumor.

PBMCs reduziu crescimento tumoral de RAJI ou Namalwa em cerca de 75% naausência de Expressão de CD200. De modo diferente, o desenvolvimento de tumores deRAJI ou Namalwa que expressaram CD200 em níveis comparáveis a CLL não foi reduzidopor PBMCs. A administração dos anticorpos anti-CD200 a 5 mg/kg resultou em inibição docrescimento tumoral quase completa (1/10 ratos desenvolveu um pequeno tumor) nodecurso do estudo mesmo quando o tratamento foi iniciado 7 dias após a injeção de célulatumoral.

A presença de CD200 humano em células de tumor inibe a habilidade de linfócitoshumanos para erradicar as células de tumor. O tratamento de CD200 que expressamtumores com anticorpos anti-CD200 antagonísticos inibe o crescimento tumoral, indicando opotencial para terapia anti-CD200 cmo uma abordagem promissora para CLL.

C) Eficácia dos construtores C2aB7GI versus C2aB7G2/G4

Para avaliar se os anticorpos anti-CD200 sem a função efetora (construtores defusão G2/G4 de C2aB7 como descrito abaixo) são igualmente ou mais eficazes do que osconstrutores G1, versões G1 e G2/G4 assim como a versão humanizada de C2aB7(alxn5200) foram testados no modelo de Raji_CD200/PBL. Células RAJI convertidas comCD200 como descrito acima foram injetadas s.c. em ratos NOD.CB17-Prkdc<scid>, e ahabilidade de PBLs para reduzir o crescimento tumoral na presença ou ausência deanticorpos quiméricos anti-CD200 c2aB7GI (c2aB7), c2aB7G2/G4 ou as versõeshumanizadas hC2aB7V3VIGI (V3V1), ou hC2aB7V3V2GI (V3V2) ou anticorpo de controlealxn4100 foi avaliada. Os anticorpos em concentrações indicados abaixo foramadministrados inicialmente com as células de tumor e então duas vezes/por semana i.v. Osgrupos a seguir foram ajustados com 10 ratos cada:

Grupo 1:4 χ 106 RAJI_CD200 s.c.Grupo 2: 4 χ 106 RAJI _CD200 s.c. + 6x10® PBLGrupo 3: 4 χ 106 RAJIJ3D200 s.c. + 6 χ 106 PBL +20 mg/kg hV3V2-GIGrupo 4: 4 χ 106 RAJI _CD200 s.c. + 6x10® PBL +5 mg/kg alxn 5200Grupo 5:4x10* RAJI _CD200 s.c. + 6 χ 106 PBL +2.5 mg/kg alxn 5200Grupo 6: 4 χ 105 RAJI_CD200 s.c. + 6x10® PBL +1 mg/kg alxn 5200Grupo 7: 4 χ 106 RAJI _CD200 s.c. + 6 χ 105 PBL +20 mg/kg chC2aB7G2/G4Grupo 8: 4 χ 106 RAJI _CD200 s.c. + 6x10® PBL +5 mg/kg chC2aB7G2/G4Grupo 9: 4 χ 106 RAJI _CD200 s.c. + 6x10® PBL +2.5 mg/kg chC2aB7G2/G4Grupo 10: 4 χ 10® RAJI _CD200 s.c. + 6 χ 10® PBL +1 mg/kg chC2aB7G2/G4Grupo 11:4x10® RAJI _CD200 s.c. + 6x10® PBL +20 mg/kg alxn4100

O comprimento e a largura do tumor foram medidos três vezes por semana, e ovolume do tumor foi calculado por tumor comprimento*largura*largura/2. A Figura 19 mostraque, como esperado, a expressão de CD200 nas células de tumor evitou que as célulasimunes reduzicem o crescimento tumoral. Entretanto, a adição dos anticorpos anti-CD200reduziu o volume do tumor em cerca de 100%. Embora 20 mg/kg C2aB7GI tenha resultadoem desenvolvimento de pequenos tumores em 6/10 ratos, apenas 1 rato desenvolveutumores no grupo tratado com 20 mg/kg C2aB7G2/G4, sugerindo que a versão a versãoG2/G4 deve resultar em uma eficácia melhor ou pelo menos igual à da versão Versão G1.

Todos os anticorpos anti-CD200, incluindo as versões humanizadas, bloquearamcompletamente o crescimento tumoral a 5 mg/kg. O tratamento com o anticorpo de controlenão reduziu o crescimento tumoral. Os refridos dados provam que a versão G2/G4 deC2aB7 é altamente eficaz em bloquear o crescimento tumoral de CD200 que expressamtumores. Os referidos dados adicionalmente confirmam que as versões humanizadas deC2aB7 são altamente eficazes em bloquear o crescimento tumoral neste modelo.

D) Geração de construtor G2/G4

Plasmídeos foram alterados em duas etapas, primeiro ao substituir a A região deIgGI a partir de um campo Age I na região CHI humana através do códon de parada a umcampo BamH I localizado após o sinal poli A SV40. C2aB7-6 e cC7 G2G4 (anticorpo L-SIGN) foram digeridos com Age I e BamH I, e C2aB7-6 foi tratado com CIP. Um fragmentode 10,315 bp a partir de C2AB7-6 e um fragmento de 1752 bp fragmento a partir de cC7G2G4 foram purificados por eletroforese e extração de gel. Os referidos fragmentos foramligados, eletroporados em XL1 Blue E. coli, e laminados em placas LB/carb/gluc. Colôniasforam desenvolvidas em solução e o DNA foi isolado usando colunas miniprep Qiagen. Apresença do fragmento lgG2G4 Age Ι/BamH I, em oposição ao fragmento IgGI, foideterminada por digestão de Pvu Il que resulta na presença de duas faixas de 267 e 1152bp em oposição a uma faixa de 1419 bp. O clone 21 foi selecionado para uso posterior.

O restante da região CHI a partir do final de uma região variável para o campo AgeI foi gerada em um formato lgG2/G4 ao usar sobreposições PCR. O fragmento PCRcontendo o início da região CHI através do campo Age I foi anteriormente gerado naprodução de plasmídeo cC7 G2G4. Primers C7mhHF (TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCC,SEQ ID NO:1) e Rev Age Pri (GGGCGCCTGAGTTCCACGAC, SEQ ID NO: 2) foram usadosna reação PCR com G2G4 63L1D como modelos para gerar um fragmento 142 bp. PrimersC2aB7 rev (GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAAACTGTGAGAGTGGTGC, SEQ ID NO: 3) eIacpri (GCTCCCGGCTCGTATGTTGTGT, SEQ ID NO: 4) foram usados com Fab C2aB7como modelos para gerar a região variável de cadeia pesada de murino (e material amontante) em um fragmento de cerca de 1250 bp. Os referidos fragmentos forampurificados por eletroforese e extração de gel e foram usados em PCR de sobreposição comos primers Rev Age Pri (GGGCGCCTGAGTTCCACGAC, SEQ ID NO: 2) e LeadVHpAX(ATATGAAATATCTGCTGCCGACCG, SEQ ID NO: 5) para gerar um fragmento 558 bp quefoi purificado em uma coluna de purificação PCR. Este fragmento 558 bp e o clone 21 foramdigeridos com Xho I e Age I para gerar um fragmento 458 bp that foi purificado poreletroforese e extração de gel. O clone 21 foi também digerido com Xho I e Age I, tratadocom CIP1 e um fragmento 11.6 kb foi purificado por eletroforese e extração de gel. Osreferidos fragmentos foram ligados e eletroporados em XL1 Blue E. coli e laminados emplacas LB/carb/gluc. C2aB7G2G4.11 clonado foi observado ter os fragmentos de restriçãoesperados quando digeridos com Pvu II.

O constructor final C2AB7G2G4.11 foi sequenciado. Foi descoberto que o códon deparada TAA da cadeia leve foi mutado em uma seqüência TCA de modo que 6 amino ácidosadicionais seriam adicionados à terminacoa carboxi da cadeia leve. Foi observado estarpresente na versão IgGI de clone C2AB7-6 que foi o parente para C2AB7G2G4.11. Osanticorpos contendo o construtor G2G4 são ilustrados nas Figurass 10, 11, 12, 13, e 15.

Exemplo 2

Expressão de CD200 em células cancerosasA. Determinação de regulação a maior de CD200 em paciente CLL

Linfócitos de 15 pacientes CLL foram corados com FITC-conjugados anti-CD5 (e-bioscience), APC-conjugados anti-CD 19 (e-bioscience) e PE-conjugados anti-CD200(Serotec). Linfócitos de doadores saudáveis foram corados deste modo. A expressão deCD200 em células CD5+CD19+ foi determinada. Como mostrado na Figura 20, embora onível de expressão de CD200 tenha variado entre as amostras de pacientes CLL1 todas asamostras CLL mostraram elevados níveis (uma faixa de 1.6-4 vezes) de maior expressãode CD200 comparado com a expressão de CD200 células b normais. Os pacientes CLL quemostraram elevados níveis de expressão de CD200 são selecionados para tratamento anti-CD200 de acordo com os métodos descritos aqui.

B. Análise FACS nas linhagens de células cancerosas

A expressão de CD200 foi avaliada por análise FACS usando um painel delinhagens celulares NCI60 a partir de melanoma de pacientes com câncer, pacientes comcâncer de próstata, pacientes com glioblastoma, pacientes com astrocitoma, pacientes comneuroblastoma, pacientes com câncer de ovário, pacientes com câncer de pulmão epacientes com câncer dos rins. C2aB7 foi marcado com Zenon-Alexa488 de acordo com asinstruções do fabricante (Invitrogen). De meio milhão a 1 milhão de células foram coradoscom 1 pg do anticorpo marcado por 20 mins, seguido de uma lavagem com PBS wash. Acoloração das células foi avaliada usando um FACSCaIibur (Becton Dickinson). A coloraçãodas células marcadas a anticorpo foi comparada com as amostras que permaneceram nãomarcadas e a proporção de corados/não corados foi determinada. Na figura 21, umaproporção maior que 1 mas menor do que 2 é indicada como +/-, uma proporção entre 2 e 3é +, entre 3 e 10 é ++, >10 é +++. Nenhuma das linhagens celulares testadas paraglioblastoma, astrocitoma, câncer de pulmão ou próstata expressa CD200, e não sãolistadas abaixo. Quatro em 5 linhagens celulares de melanoma testados, 2/2 linhagenscelulares de câncer de ovário, 2/3 linhagens celulares de rins, 2/2 linhagens celulares deneuroblastoma e 1/3 linhagens celulares de câncer de mama expressam CD200 em níveisdetectáveis na superfície celular, sugerindo que tumores sólidos devem usar CD200também como o mecanismo de escape imune.

C. RT-QPCR em amostras de paciente

Para verificar se CD200 é regulado a maior não só em linhagens celulares, mastambém em amostras de pacientes primários, RT-QPCR e imunohistoquímica (IHC) foramrealizados em amostras de pacientes primários. Amostras de RNA de pacientes commelanoma e ovarianos foram obtidas a partir de Cytomix. cDNA foi preparado e amostrasforam diluídas 1:100 e 1:1000 em 10 ng/mL de levedura de RNA. Amostras foram rodadaspara QPCR com teste CD200 Hs00245978_mL como proporcionado por ABL paranormalização 18S, teste 18S (ABI) foi rodado com amostras diluídas 1:10,000. Cada diluiçãofoi rodada em duplicata. Amostras de paciente ovarianos e com melanoma, junto comamostras de paciente CLL foram normalizadas a 18S, então a expressão de vezes comrelação ao PBL normal foi determinado. A Figura 22 mostra a expressão de CD200 emamostras de câncer de ovário. Seroso / seroso metastático / seroso papilar pareceram ter amais elevada expressão de CD200 em aproximadamente 10- a 20- vezes mais do que aPBL normal. A Expressão de CD200 foi relativamente baixa em amostras endometróide,mucinosas, e de célula clara, todas em ou abaixo dos níveis normais de expressão (1 — 5vezes maior do que o PBL normal). A Figura 23 mostra a expressão de níveis de CD200 dediversas amostras de metástases de melanoma: jejuno, intestino delgado, linfonodo,pulmão, pele, e cérebro). Diversas das referidas amostras são correspondidas normal/tumor,indicados pelo número (-1 par ou -2 pares). Outras amostras adicionais sem normaiscorrespondidas foram também rodadas para comparação. Amostras de jejuno mostraramuma expressão significativamente mais alta de níveis de CD200 do que o órgão normal, comas amostras metastáticas de cerca de 4 -7- vezes mais alta do que o jejuno normal.

D. Imunohistoquímica em amostras de pacientes primários

THC foi realizada em 2 amostras congeladas de paciente com melanoma(LifeSpan). Fragmentos de D1B5 e C2aB7 Fab foram usados para coloração. Um anticorpoIgGI foi usado como o isótipo de controle. A ligação dos anticorpos primários foi detectadacom um anticorpo anti-rato secudário e DAB chromagen.

Como mostrado na Figura 24, ambas as amostras de melanoma testadasmostraram uma forte coloração de membrana com os anticorpos anti-CD200, mas nenhumacoloração com o isótipo de controle. Tecidos de pele normal não mostraraam coloração deCD200. Os referidos dados demonstram que CD200 não é apenas regulado a maior emlinhagens celulares de melanoma e câncer de ovário, mas também em amostras depacientes primários.

E. Evasão imune de melanoma e células de tumor de ovário através daregulação a maior de molécula imunossupressiva CD200

O escape imune é uma característica fundamental de progressão de câncer.Tumores podem evadir o sistema imune por múltiplos mecanismos, cada um dos quais umabarreira significante para imunoterapia. A implementação de novas formas e mais eficazesde imunoterapia requer o entendimento dos referidos processos assim como de suassimilaridades e diferenças entre os cânceres. Foi identificado anteriormente a moléculaCD200 imunossupressiva como sendo regulado a maior em células de leucemia linfocíticacrônica. A presença de CD200 reguladas a menor produção de citocina Thl necessária parauma resposta de célula T citotóxica eficaz. Foi demonstrado em modelos animais que aexpressão de CD200 por células de tumor humano evitam que os linfócitos humanosrejeitem o tumor, e tratamento com um anticorpo anti-CD200 antagonístico inibiu ocrescimento tumoral. Neste estudo, foi avaliado se a regulação à maior de CD200 éencontrada em outros cânceres, e se a expressão de CD200 nas referidas célulascancerosas afeta a resposta imune.

Os níveis de mensagem relativas a CD200 foram quantificadas por RT-QPCR emadenocarcinoma de ovário (seroso/seroso metastático/seroso papilar, endometróide,mucinoso, célula clara) e amostras de pacientes metastático de melanoma maligno.

A expressão de superfície celular de CD200 foi avaliada por IHC em doismelanomas e três amostras congeladas de tecido de paciente ovariano e carcinoma(seroso) em comparação com pele normal e ovários normais. A expressão de CD200 nasuperfície celular de linhagens de células de câncer melanoma SK-MEL-5, SK-MEL-24 eSK-MEL-28 e a linhagem celular de câncer de ovário OV-CAR-3 foram avaliadas por análiseFACS usando a anticorpo anti-CD200PE-marcado. O efeito de linhagens de célulascancerosas CD200-que expressam no perfil de citocina misturadas em reações de linfócitosforam avaliadas pela adição das células a uma cultura de células dendríticas derivads demonócitos humanos com células T humanas alogeneicas. A produção de citocina (IL-2 eIFN-y para Thl, IL4 e IL10 para Th2) foi detectada no sobrenadante por ELISA.

PCR quantitative mostrou os níveis de expressão de CD200 em amostras deadenocarcinoma de ovário serosoat em cerca de 20 vezes maior do que o PBL normal, eigual ou cerca de 4- vezes maior do que o ovário normal. A expressão de CD200 foi em ouabaixo dos níveis de ovário normal em amostras de adenocarcinoma endometróide,mucinoso, e de célula clara de ovário. Em metástases de melanoma maligno para o jejuno,os níveis de expressão de CD200 pareceram ser significativamente mais alto do que asamostras normais. Em metástases de melanoma maligno de pulmão, 2/6 mostraram umamaior expressão de CD200 do que as amostras normais.

IHC mostrou coloração asociada a membrana de CD200 forte, específica, emcélulas malignas de ambos os pacientes com melanoma. A amostra de pele normal mostroufraca coloração das células endoteliais. Dentre os três pacientes com câncer de ovário, ummostrou forte coloração de CD200, um foi moderadamente positivo, e um mostrousubconjuntos de células de tumor pobremente corados. Em todos os três casos, o estromamostrou forte coloração.

CD200 foi altamente expressa na superfície celular de linhagens de células demelanoma cancerosas SK-MEL-24 e SK-MEL-28 assim como na linhagem celular de câncerde ovário OV-CAR.-3, e moderadamente expressa na linhagem celular de melanoma SK-MEL-5. A adição de qualquer uma das referidas linhagens celulares a uma reação delinfócitos mista regulou à menor a produção de Thl citocinas, enquanto as linhagenscelulares que não expressam CD200 não, demonstraram uma correlação direta. A inclusionde um anticorpo anti-CD200 antagonístico during a cultura anulou o efeito.Células de tumor ovariano e melanoma podem regular à maior CD200, deste modopotencialmente suprimindo uma resposta imune eficaz. A terapia com um anti-CD200antagonístico deve permitir que o sistema imune monte uma resposta citotóxica eficazcontra as células de tumor.

F. Efeito de CD200-que expressa linhagens de células cancerosas on perfis decitocina em reações mistas de linfócitos

A capacidade de células que super expressam CD200 de desviar a resposta decitocina a partir de uma resposta TH1 (IL-2, IFN-y) para uma resposta Th2 (1L-4, IL-10) foiavaliadas na reação de linfócitos mista. Como uma fonte de célula que expressa CD200s,ou células CD200 transfectadas ou células a partir da linhagens de células CD200 positivecancerosas foram usadas.

Reações misturadas de linfócitos foram ajustadas em placas de 24 cavidadesusando 250,000 células dendríticas maturadas a partir de monócitos periféricos humanosusando IL-4, GM-CSF e IFN-y e ixIO6 células reagentes. As células reagentes foram oslinfócitos enriquecidos com célula T purificados a partir do sangue periférico usando Ficoll.

As células T foram enriquecidas por incubação das células for 1 hora em frascos de culturade tecido e obtendo a fração de célula não aderente. 500,000 células a partir das linhagensde células de câncer melanoma SK-MEL-1, SK-MEL-24, SK-MEL-28, a linhagem celular decâncer de ovário OVCAR3 e a linhagem celular de Iinfoma não Hodgkin1S Namalwa ouCélulas CLL primárias como o controle positivo foram adicionado às células dendríticas napresença ou ausência de 30 pg/mL de anticorpo anti-CD200. Sobrenadantes foramcoletados após 48 e 68 horas e analisados para a presença de citocinas

Citocinas tais como IL-2, IFN-y, e IL-10 encontradas no sobrenadante de cultura detecido foram quantificadas usando ELISA. A captura e a detecção combinads de pares deanticorpos para cada citocina foi obtida a partir da R+D Systems (Mínneapolis, MN), e umacurva padrão para cada citocina foi produzida usando citocina humana recombinante. Oanticorpo de captura anti-citocina foi revesstido na placa em PBS na concentração ótima.

Após incubação durante a noite, as plates foram lavadas e bloqueadas por 1 hora com PBScontendo 1% de BSA e 5% de sucrose. Após 3 lavagens com PBS contendo 0.05% deTween, os sobrenadantes foram adicionados em diluiçãos de dois- vezes ou dez vezes emPBS contendo 1 % de BSA. As citocinas capturadas foram detectadas com o anticorpo anti-citocina biotinilada apropriado seguido da adição de conjugados de fosfatase alcalinastreptavidina e substrato SigmaS. O desenvolvimento da cor foi avaliado com uma leitora deplaca de ELISA (Molecular Devices).

Como mostrado na Figura 25A, a presença de linhagens celulares com altaExpressão de CD200 (MEL-24, MEL-28, OVCAR-3) resultaram na regulação à menor decitocinas Thl citocinas tais como IL-2 e IFN-y. De modo diferente, a adição de MEL-1 (baixaexpressão de CD200) ou Namalwa (sem Expressão de CD200) não afeta o perfil decitocina. A adição do anticorpo anti-CD200 hB7VH3VL2 a 50 pg/mL restabeleceucompletamente a resposta Thl (Figura 25B), indicando que o tratamento com anticorpo anti-CD200 de pacientes com melanoma ou com câncer de ovário pode ser terapeuticamentebenéfico.

Exemplo 3 Eliminação de células T ativadas por C2aB7-GI e seus derivadosPara avaliar se o tratamento anti-CD200 apresenta um efeito no modelo de câncerusando células de tumor que não expressam CD200, células Namalwa e PBLs humanoforam injetadas em ratos NOD/SCID, e os ratos foram tratados como delineado abaixo. Noreferido modelo, CD200 está apenas presente nas células naturalmente imunes queexpressam CD200 tal como células B e células T auxiliadoras foliculares.

Configuração do Grupo:

animais/grupoGrupo 1: 4 χ 10 Namalwa s.c.Grupo 2: 4 χ 106 Namalwa s.c. + 8 χ 106 PBLGrupo 3: 4 χ 105 Namalwa s.c. + 8 χ 106 PBL + 20 mg/kg hV3V2-GIGrupo 4: 4 χ 106 Namalwa s.c. + 8 χ 106 PBL + 5 mg/kg hV3V2-GIGrupo 5: 4 χ 106 Namalwa s.c. + 8 χ 106 PBL + 2.5 mg/kg hV3V2-GIGrupo 6: 4 χ 106 Namalwa s.c. + 4 χ 1Ό6 PBLGrupo 7: 4 χ 106 Namalwa s.c. + 8 χ 106 PBL + 20 mg/kg chC2aB7-G2G4Grupo 8: 4 χ 106 Namalwa s.c. + 8x10® PBL + 5 mg/kg chC2aB7-G2G4Grupo 9: 4 χ 106 Namalwa s.c. + 8x10® PBL + 2.5 mg/kg chC2aB7-G2G4Grupo 10: 4 χ 106 Namalwa s.c. + 4 χ 106 PBL + 20 mg/kg chC2aB7-G2G4Grupo 11: 4 χ 106 Namalwa s.c + 8 χ 106 PBL + 20 mg/kg alxn41001/10 de dose foi incluído na mistura de injeção. A dosagem subsequente foi 2 χ /por semana i.v. por 3 semanas.

O comprimento (L) e largura (W) do tumor foram medidos 3 vezes/por semana e osvolumes do tumor foram calculados por L*W*W72. A Figura 26 mostra que a injeçãosimultânea previamente estabelecida, de PBLs humano com células Namalwa inibe ocrescimento tumoral. Nenhum efeito de chC2aB7-G2G4 em inibição de crescimento tumoralmediado a PBL foi observado. De modo diferente, a administração de ALXN5200(hB7VH3VL2-GI) bloqueou a inibição do crescimento tumoral mediado a PBL. Na ausênciade CD200 em células de tumor, parece que o tratamento do anticorpo anti-CD200 com umanticorpo que media a função efetora tal como construtores Gl, células efetoras críticas napopulação PBL são eliminadas. Os referidos dados sugerem que a terapia de câncer anti-CD200 é menos eficaz quando um anticorpo com a função efetora está sendo usado emcomparação do uso do anticorpo sem a função efetora. Entretanto, o tratamento anti-CD200usando um construtor com a função efetora pode ser terapeuticamente benéfica emsituações onde a eliminação de células imunes é desejável tais como em transplantes oudoenças auto-imunes.

Exemplo 4

Extermínio de célula T por hB7VH3VTL2

Para avaliar se a incubação de células T ativadas com anticorpos anti-CD200contendo uma região constante mediando a função efetora (por exemplo Gl) resulta noextermínio das células T1 Células T foram ativadas e os testes de extermínio foramajustados como descrito abaixo.

A). Isolamento de célula T CD3+

Linfócitos do sangue periférico humano (PBLs) foram obtidos a partir de voluntáriossaudáveis normais por centrifugação de gradiente densidade de sangue total heparinizadousando o sistema Accuspin™. Quinze ml_ de Histopaque-1077 (Sigma, St. Louis1 MO; cat#H8889) foi adicionado a cada tubo Accuspin (Sigma, St. Louis1 MO; cat# A2055) que foientão centrifugado a 1500 rpm por 2 minutos de modo que o histopaque foi permitido passaratravés da frita. Trinta mL de sangue total foram acamados sobre a frita e os tubos foramcentrifugados por 15 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente sem interrupção. Ainterface de PBL foi coletada e as células mononucleares foram lavadas duas vezes emPBS com 2% de soro bovino fetal inativado a calor (FBS) (Atlas Biologicals, Ft. Collins1 CO;cat# F-0500-D) com 1200 rpm de centrifugação por 10 minutos. Células T CD3+ foramisoladas por passagem sobre uma coluna HTCC-5 (R&D Systems) de acordo com asinstruções do fabricante. As células eluídas foram lavadas, contadas e resuspensas emRPMI1640 contendo 5% de soro de doador único inativado a calor, 2 mM L-glutamina, 10mM de Hepes e penicilina/estreptomicina.

B. Ativação com mOKT3 ligado a placa

Cavidades de placas de 12 cavidades (FaIcon) foram revestidas por incubaçãodurante a noite a 4°C com 10 pg/mL de mOKT3 (OrthocIone) diluídas em PBS. O anticorporesidual foi removido e as placas gentilmente enxaguadas com PBS. As células T CD3+purificadas, isoladas como descrito acima, foram adicionadas às placas a uma concentraçãofinal de 2 χ 106/cavidade em RPMI 1640 contendo 5% de soro de doador único inativado acalor, 2 mM L-glutamina, 10 mM Hepes e penicilina/estreptomicina. As células forammantidas por 72 horas a 37°C na incubadora umidificada contendo 5% de CO2.

C. Marcação de Cromo51 de células alvo CD3+ mOKT3-ativadas

No final do período de cultura, células CD3+ mOKT3-ativadas foram coletadas,lavadas e resuspensas a 107 células/mL em RPMI 1640 sem soro. As células foramcromadas pela adição de 125 pCi de 51 cromo (Perkin Elmer, Billerica, MA)/106 células por 2horas a 37°C. As células marcadas foram coletadas, lavadas em RPMI contendo 5% de sorode doador único inativado a calor e resuspensas a uma concentração final de 2 χ 105células/mL no mesmo meio.

D. Preparação de célula efetoras NK autóloqas

Linfócitos do sangue periférico humano (PBLs) provenientes do mesmo indivíduoforam obtidos como descrito acima por centrifugação de gradiente de densidade. A interfacede PBL foi coletada e as células mononucleares foram lavadas duas vezes em PBS com 2%de soro bovino fetal inativado a calor (FBS) (Atlas Biologicals, Ft. Collins, CO; cat# F-0500-D) com 1200 rpm de centrifugação por 10 minutos. As células CD56+ foram isoladas porseleção positiva sobre contas magnéticas conjugadas a anti-CD56 (Miltenyi Biotec1 Auburn1CA1 Cat # 120-000-307) de acordo com as instruções do fabricante. As células eluídas foramlavadas, contadas e resuspensas a 1.3 χ IO6 células/mL em RPMI 1640 contendo 5% desoro de doador único inativado a calor, 2 mM de L-glutamina, 10 mM de Hepes epenicilina/estreptomicina. As células foram incubadas durante a noite a 37°C na incubadoraumidificada contendo 5% de CCb a uma concentração final de 4 χ 106 células/cavidade em 3mL do mesmo meio. No final do período de cultura, as células foram coletadas, lavadas,contadas e resuspensas em RPMI livre de soro contendo 2 mM de L-glutamina, 10 mM deHepes1 2 χ 10"5 M de 2-mercaptoetanol e penicilina/estreptomicina.

E. Teste ADCC

Células alvo CD3+ mOKT3-ativadas 51Cr-marcadas preparadas como descritoacima foram distribuídas em cavidades da placa de 96 cavidades a 104 células/cavidade em50 μί. Células efetoras CD56+ foram coletadas, lavadas, contadas e resuspensas seja em2.5 χ 10 células/mL (para uma proporção de efetora:célula alvo de 25:1) ou 106 células/mL(para uma proporção de efetora:célula alvo de 10:1) e foram distribuídas (100 ^L/cavidade)a cavidades contendo as células alvo. Diluiçãos de dez vezes dos anticorpos anti-CD200(V3V2-G1 ou V3V2-G2/G4) foram adicionadas às efeteoras e alvos em concentrações finaisde 10, 1, 0.1 e 0.01 pg/mL. Testes de controle incluíram o a seguir: 1) efetoras e alvos naausência do anticorpo (0 Ab); 2) células alvo na ausência de efetoras (lise espontânea) e 3)efetoras e alvos incubadas com 0.2% de Tween-80 (liberação máxima). Todas as condiçõesde cultura celular foram realizadas em triplicata. As células foram incubadas a 37°C por 4horas na incubadora umidificada contendo 5% CO2. No final do período de cultura, as placasforam centrifugadas para granular as células e 150 pL de sobrenadante de células foramtransferidos a frascos de cintilação e contadas no contador de cintilação gama (Wallac). Osresultados são expressos como o percentual específico de Iise de acordo com a fórmula aseguir:

(contagem média de amostras por minuto (cpm) - média de Iise espontânea) X 100(média máxima de Iise - média espontânea de lise)

F. Citometria de FluxoCem μΙ_ de suspensões celulares (células CD3+ mOKT3-ativadas ou Células NKCD56+ purificadas) preparadas como descrito acima foram distribuídas nas cavidades daplaca de fundo arredondado com 96 cavidadee (Falcon, Franklin Lakes NJ; cat# 353077). Ascélulas foram incubadas por 30 minutos a 4°C com as combinaçãos indicadss do a seguir:isotiocianato de fluoresceina (FITC)-, ficoeritrina (PE)- , PerCP-Cy5.5-, ou anticorposaloficocianina (APC)-conjugados (todos oferecidos pela Becton-Dickinson, San Jose1 CA);CD25-FITC anti-humano (cat# 555431); CD3-APC anti-humano (cat# 555335); anti-humanoCD200-PE (cat # 552475); anti-humano CD8-PerCP-Cy5.5 (cat# 341051); anti-humanoCD4-APC (cat# 555349); anti-humano CD5-APC (cat# 555355) e anti-humano CD56-APC(cat# 341025). Isótipos de controle for cada anticorpo marcado foram também incluídos.

Após a lavagem das células duas vezes com tampão FACS (1800 rpm centrifugação por 3minutos), as células foram resuspensas em 300 μΙ_ de PBS (Mediatech, Herndon, VA; cat#21-031-CV) e analisadas por citometria de fluxo usando uma máquina FacsCaIiber e oprograma CeIIQuest Software (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Como mostrado na Figura 27, as células T ativadas mostram alta expressão deCD200 em sua superfície. As células T ativadas são eficientemente exterminadas napresença de VH3VL2-G1 mas não em VH3VL2-G2G4 quando células NK são usadas comocélula efetoras (Figura 28). Os referidos dados demonstram que os anticorpos anti-CD200com a função efetora podem eliminar células T ativadas. O referido anticorpo pode ser deuso terapêutico em transplante ou para o tratamento de doenças auto-imunes.

Além das células T regulatórias, as células dendríticas plasmacitóides forammostradas desempenhar um papel imunoregulatório negativo em câncer humano (Wei S,Kryczek I, Zou L, Daniel B, Cheng P, Mottram P, Curiel T, Lange A, Zou W Plasmacytoiddendritic cells induce CD8+ regulatory T cells in human ovarian carcinoma. Câncer Res. 15de Junho de 2005; 65(12):5020 - 6). A combinação de uma terapia que elimina célulasdendríticas plasmacitóides com terapia anti-CD2Ó0 pode, portanto, ser vantajosa.

Exemplo 5

CD200 em células plasmáticas

Células da medula óssea provenientes de 10 pacientes com mieloma múltiplo e 3doadores normais foram preparadas por primeiro Iisar as células sangüíneas vermelhasusando cloreto de amônia. As células foram resuspensas em tampão FACS e marcadascom o coquetel de anticorpos a seguir:

•Kappa-FITC/CD3 8-PE/CD13 8-PerCP-Cy5.5

•Lambda-FITC/CD38-PE/CD138-PerCP-Cy5.5

'Isotipo de Controle-FITC/CD38-PE

•CD200-FITC/CD38-PE

Os dados foram coletados usando a BD FACS Canto e analisados usando oprograma BD DiVA. A expressão de CD200 em células CD38 brilhantes (célulasplasmáticas) foi analisada. Como mostrados na Figura 29, uma porção de célulasplasmáticas expressa CD200 em alta intensidade em doadores normais. Em múltiplospacientes com mieloma, a maioria das células plasmáticas expressa CD200.

No mieloma múltiplo, similar a CLL ou outros cânceres que expressam CD200, aexpressão de CD200 pelas células de tumor deve evitar que o sistema imune erradique ascélulas de tumor. A terapia anti-CD200 antagonística deve subseqüentemente permitir que osistema imune elimine as células cancerosas. A terapia anti-CD200 ablativa direcionando ascélulas plasmáticas pode ser terapeuticamente benéfica no cenário auto-imune ou detransplante.

Exemplo 6

CD200 em virus

CD200 é também expressa em uma série de vírus tais como vírus mixoma M.141Rou herpesvirus 8 humano. Similar à expressarão de CD200 em células de tumor, CD200 emvírus deve evitar que o sistema imune limpe de modo eficaz o vírus. O tratamento com umanticorpo anti-CD200 antagonístico pode ser terapeuticamente benéfico em uma infecçãocom um vírus que expressa CD200, permitindo que o sistema imune erradique o vírus.

Alternativamente, um anticorpo anti-CD200 ablativo pode ser usado.

Será entendido que diversas modificações podem ser implementadas nasmodalidades aqui descritas. Por exemplo, como aqueles versados na técnica podemobservar as seqüências específicas descritas aqui podem ser alteradas relativamente semnecessariamente afetar adversamente a funcionalidade do polipeptídeo, o anticorpo oufragmento de anticorpo usado em ligação OX-2/CD200. Por exemplo, substituições de umou de múltiplos amino ácidos na seqüência de anticorpos pode freqüentemente serimplementada sem destruir a funcionalidade do anticorpo ou fragmento. Assim, deve serentendido que os polipeptídeos ou anticorpos dotados de um grau de identidade maior doque 70% aos anticorpos específicos descritos aqui estão dentro do âmbito da presentedescrição. Em modalidades particularmente úteis, anticorpos dotados de uma identidadesuperior a cerca de 80% aos anticorpos específicos descritos aqui são contemplados. Emoutras modalidades úteis, os ánticorpos dotados de uma identidade superior a cerca de 90%aos anticorpos específicos descritos aqui são contemplados. Portanto, a descrição acimanão deve ser construída como limitante, mas meramente como exemplificações demodalidades preferidas. Aqueles versados na técnica poderão prever outras modificaçõesinseridas no âmbito e espírito da presente descrição.

Referências

As referências a seguir estão aqui incorporadas por referência para maisamplamente descrever o estado da técnica ao qual pertence a presente invenção. Qualqueriiicosistência entre as referidas publicações abaixo ou aquelas incorporadas por referênciaacima e a presente descrição devem ser resolvidas a favor da presente descrição.

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Claims

1. Anticorpo anti-CD200 ou fragmento de ligação deantigeno deste que compreende uma região constante alterada,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou frag-mento de ligação de antigeno exibe função efetora diminuídarelativa a um anticorpo anti-CD200 não variante.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque a função efetora diminuída compreende um ou mais dentreos seguintes:a. citotoxicidade mediada por célula dependente deanticorpo diminuída (ADCC);b. citotoxicidade dependente de complemento dimi-nuída (CDC) comparada a um anticorpo anti-CD200 não variante.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque o anticorpo é um anticorpo de murino, um anticorpo qui-mérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia sim-pies, ou um anticorpo humano.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque o anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno deste éselecionado a partir do grupo que consiste em IgGl, IgG2,IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgA, IgD, e IgE.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque a região constante foi construída para compreender umapelo menos uma substituição, inserção, ou deleção de aminoá-cido.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato decompreender uma seqüência de aminoácido que é codificada porum ácido nucléico que hibridiza sob condições estritas parauma seqüência de ácido nucléico selecionada a partir do gru-po que consiste em SEQ ID NOS; 12, 14, 16, 17, e 21, ou parafragmentos deste.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato decompreender uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90%idêntica a uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NOS: 13,-15, 18, ou 22, ou aos fragmentos deste.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque a referida região constante compreende uma ou mais dascaracterísticas seguintes:i) glicosilação alterada;ii) uma mutação de Ala-Ala;iii) uma construção de G2/G4 selecionada a partirdo grupo que consiste em SEQ ID NOS: 13, 15, 18, e 22.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 8,CARACTERIZADO pelo fato de que a glicosilação alterada com-preende uma ou mais das seguintes: (i) uma mudança em um oumais componentes de açúcar; (ii) presença de um ou mais com-ponentes de açúcar; e (iii) ausência de componentes de açúcar.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo é ex-presso em uma célula hospedeira selecionada a partir do gru-po que consiste em uma célula de mamífero, uma célula bacte-riana, e uma célula de planta.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é E. coli.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma cé-lula de hibridoma de rato.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma cé-lula de CHO.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato decompreender uma ou mais das características seguintes:a) ligação diminuída a um ou mais receptores de Fc;b) atividade de ADCC diminuída ; ec) atividade diminuída de CDCrelativa a um anticorpo anti-CD200 não variante.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno,de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato deque o anticorpo é um anticorpo anti-CD200 de bloqueio.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno,de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato deque o anticorpo é um anticorpo de murino, um anticorpo qui-mérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia sim-ples, ou um anticorpo humano.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência (s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 10 e 25 ou fragmentos desta.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) pelo menos 90% idênti-ca a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 26, o frag-mento de SEQ ID NO: 11 começando no aminoácido 20, o frag-mento de SEQ ID NO: 26 começando no aminoácido 23, e outrosfragmentos SEQ ID NOS: 11 e 26.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência (s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 10 e 27 ou fragmentos desta.

20. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) pelo menos 90% idênti-ca a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 28, o frag-mento de SEQ ID NO: 11 começando no aminoácido 20, o frag-mento de SEQ ID NO: 28 começando no aminoácido 23, e outrosfragmentos SEQ ID NOS: 11 e 28.

21. Anticorpo e fragmento de ligação de antígenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência (s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 8 e 25 ou fragmentos desta.

22. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) pelo menos 90% idênti-ca a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 26, o frag-mento de SEQ ID NO: 9 começando no aminoácido 20, o fragmen-to de SEQ ID NO: 26 começando no aminoácido 23, e outrosfragmentos SEQ ID NOS: 9 e 26.

23. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 12 e 27 ou fragmentos desta.

24. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência (s) de aminoácido que é(são) pelo menos 90% idênti-ca a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 28, o frag-mento de SEQ ID NO: 13 começando no aminoácido 20, o frag-mento de SEQ ID NO: 28 começando no aminoácido 23, e outrosfragmentos SEQ ID NOS: 13 e 28.

25. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência (s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NO: 14 e 23 ou fragmentos desta.

26. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste emSEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 24, o fragmento de SEQ ID NO: 15começando no aminoácido 21, o fragmento de SEQ ID NO: 24 co-meçando no aminoácido 21, e outros fragmentos SEQ ID NOS: 15e 24.

27. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por . umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 16 e 27 ou fragmentos desta.

28. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência (s) de aminoácido que é(são) pelo menos 90% idênti-ca a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 28, o frag-mento de SEQ ID NO: 13 começando no aminoácido 20, o frag-mento de SEQ ID NO: 28 começando no aminoácido 23, e outrosfragmentos SEQ ID NOS: 13 e 28.

29. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência (s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 17 e 29 ou fragmentos desta.

30. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) pelo menos 90% idênti-ca a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 30, o frag-mento de SEQ ID NO: 18 começando no aminoácido 21, o frag-mento de SEQ ID NO: 30 começando no aminoácido 21, e outrosfragmentos de SEQ ID NOS: 18 e 30.

31. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 19 e 31 ou fragmentos desta.

32. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) pelo menos 90% idênti-ca a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 32, o frag-mento de SEQ ID NO: 20 começando no aminoácido 21, o frag-mento de SEQ ID NO: 32 começando no aminoácido 21, e outrosfragmentos de SEQ ID NOS: 20 e 32.

33. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência (s) de aminoácido que é(são) codificada(s) por umácido nucléico que hibridiza sob condições estritas para umaseqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupoque consiste em SEQ ID NOS: 21 e 33 ou fragmentos desta.

34. Anticorpo e fragmento de ligação de antigenodeste, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma ou maisseqüência(s) de aminoácido que é(são) pelo menos 90% idênti-ca a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 34, o frag-mento de SEQ ID NO: 22 começando no aminoácido 20, o frag-mento de SEQ ID NO: 34 começando no aminoácido 20, e outrosfragmentos de SEQ ID NOS: 22 e 34.

35. Fragmento de ligação de antigeno, de acordocom quaisquer das reivindicações 17-34, CARACTERIZADO pelofato de que o fragmento de ligação de antigeno exibe funçãoefetora reduzida.

36. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com quaisquer das reivindicações 1 e 17-34,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou frag-mento de ligação de antigeno é conjugado a um agente.

37. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato deque o agente é selecionado a partir do grupo que consiste emuma toxina, enzima, agente terapêutico, agente diagnóstico,e agente de imageamento.

38. Fragmento de ligação de antigeno de um anti-corpo anti-CD200, CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmentode ligação de antigeno é modificado para exibir meia-vidaaumentada em um indivíduo.

39. Fragmento de ligação de antigeno, de acordocom a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que ofragmento de ligação de antigeno compreende uma ou mais dascaracterísticas seguintes:a) é PEGuilado;b) é fundido a um segundo polipeptídeo; ec) é ligado a uma molécula pequena.

40. Fragmento de ligação de antigeno de acordo coma reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundopolipeptídeo liga proteínas de soro.

41. Fragmento de ligação de antigeno, de acordocom a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que o se-gundo polipeptídeo é albumina.

42. Fragmento de ligação de antigeno, de acordocom a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que molé-cula pequena liga proteínas de soro.

43. Fragmento de ligação de antigeno, de acordocom quaisquer das reivindicações 38 e 39, CARACTERIZADO pelofato de que o fragmento de ligação de antigeno é um fragmen-to de cadeia simples.

44. Método de diminuir o número de células positi-vas CD200 em um paciente, CARACTERIZADO pelo fato de compre-ender administrar ao referido paciente um anticorpo anti-CD200 ou fragmento de ligação de antígeno deste.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou frag-mento de ligação de antigeno inibe a interação de CD200 comseu receptor.

46. Método de inibir a interação de CD200 com seureceptor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adminis-trar um antagonista de CD200.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antagonista deCD200 reduz a expressão de CD200.

48. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antagonista é se-lecionado a partir do grupo que consiste em polipeptideo,molécula pequena, substância química, metal, composto orga-nometálico, composto inorgânico, ácido nucléico, oligonucle-otídeo, aptâmero, spiegelmer, agente imunomodulador, frag-mento de ligação de antígeno, pró-fármaco, e composto pepti-domimético.

49. Método, de acordo com a reivindicação 47,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antagonista é se-lecionado a partir do grupo que consiste em DNA de filamentoduplo, DNA de filamento único, RNA filamento duplo, RNA defilamento único, RNAi e ácido nucléico anti-sentido.

50. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antagonista liga oreceptor de CD200.

51. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antagonista reduza expressão do receptor de CD200.

52. Método, de acordo com a reivindicação 50,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antagonista é se-lecionado a partir do grupo que consiste em polipeptideo,molécula pequena, substância química, metal, composto orga-nometálico, composto inorgânico, ácido nucléico, oligonucle-otídeo, aptâmero, agente imunomodulador, fragmento de liga-ção de antígeno, pró-fármaco, e composto peptidomimético.

53. Método, de acordo com a reivindicação 51,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antagonista é se-lecionado a partir do grupo que consiste em DNA de filamentoduplo, DNA de filamento único, RNA filamento duplo, RNA defilamento único.

54. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antagonista é umanticorpo anti-CD200 que exibe função efetora diminuída.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD200 exibe uma capacidade reduzida de matar células T.

56. Método, de acordo com a reivindicação 46,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD200 é um anticorpo de bloqueio.

57. Método de tratar um paciente com câncer, com-preendendo administrar ao referido paciente um antagonistade CD200, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido antago-nista é selecionado a partir do grupo que consiste em poli-peptideo, molécula pequena, substância química, metal, com-posto organometálico, composto inorgânico, ácido nucléico,oligonucleotideo, aptâmero, agente imunomodulador, fragmentode ligação de antigeno, pró-fármaco, e composto peptidomimé-tico.

58. Método para tratar um paciente com câncer, oreferido método, CARACTERIZADO pelo fato de compreender ad-ministrar um anticorpo ou fragmento de ligação de antigenode acordo com a reivindicação 1 ao referido paciente.

59. Método, de acordo com a reivindicação 58,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido câncer é derivadode um câncer de célula de crista neural.

60. Método, de acordo com a reivindicação 58,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido câncer é selecio-nado a partir do grupo que consiste em um câncer de célulaplasmática, câncer ovariano, câncer de pele, câncer do pul-mão, câncer renal, câncer de mama, câncer de próstata, neu-roblastoma, linfoma, mieloma, e leucemia.

61. Método de tratar um paciente com câncer,CARACTERIZADO pelo fato de compreender administrar ao refe-rido paciente um anticorpo ou fragmento de ligação de anti-geno de acordo com quaisquer das reivindicações 17-34.

62. Método de tratar câncer, CARACTERIZADO pelofato de compreender administrar um anticorpo anti-CD200 oufragmento deste em combinação com um segundo agente ou tera-pia.

63. Método, de acordo com a reivindicação 62,CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo agente compreendeuma ou mais das características seguintes:a) atividade quimioterapêutica;b) atividade reguladora em células T; ec) atividade imunomoduladora.

64. Método, de acordo com a reivindicação 62,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido segundo agente outerapia é selecionado a partir do grupo que consiste em ra-dioterapia, agente quimioterapêutico, agente imunomodulador,peptideo heterociclico, anticorpo, fragmento de ligação deantigeno, ácido nucléico, molécula pequena, composto organo-metálico, polipeptideo, aptâmero, spiegelmer, substânciaquímica, composto inorgânico, metal, pró-fármaco, e compostopeptidomimético.

65. Método de tratar câncer, CARACTERIZADO pelofato de compreender administrar um anticorpo anti-CD200 oufragmento deste de acordo com quaisquer das reivindicações-1-5.

66. Método, de acordo com a reivindicação 65,CARACTERIZADO pelo fato de também compreender administrar umagente que pode restabelecer a atividade de células dendrí-ticas comprometidas em um ambiente de tumor.

67. Método, de acordo com a reivindicação 66,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente é um inibi-dor de MAP cinase.

68. Método, de acordo com a reivindicação 65,CARACTERIZADO pelo fato de também compreender administrar umagente quimioterapêutico.

69. Método, de acordo com a reivindicação 68,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente quimiotera-pêutico é selecionado a partir do grupo que consiste em ami-noglutetimida, ansacrina, anastrozol, asparaginase, beg, bi-calutamida, bleomicina, busserrelina, bussulfano, camptote-cina, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucila,cisplatina, cladribina, clodronato, colchicina, ciclofosfa-mida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina,daunorrubicina, dienestrol, dietilestilbestrol, docetaxel,doxorrubicina, epirrubicina, estradiol, estramustina, etopo-sideo, exemestano, filgrastim, fludarabina, fludrocortisona,fluorouracila, fluoximesterona, flutamida, gencitabina, ge-nisteina, gosserrelina, hidroxiuréia, idarrubicina, ifosfa-mida, imatinibe, interferon, irinotecana, letrozol, leucovo-rina, leuprolida, levamisol, lomustina, mecloretamina, me-droxiprogesterona, megestrol, melfalana, mercaptopurina,mesna, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, ni-lutamida, nocodazol, octreotideo, oxaliplatina, paclitaxel,pamidronato, pentostatina, plicamicina, porfimer, procarba-zina, raltitrexede, rituximabe, estreptozocina, suramina,tamoxifeno, temozolomida, teniposideo, testosterona, tiogua-nina, tiotepa, cloridrato de titanoceno, topotecana, trastu-zumabe, tretinoina, vimblastina, vincristina, vindesina evinorelbina.

70. Método, de acordo com a reivindicação 68,CARACTERIZADO pelo fato de também compreender administrar umagente anti-angiogênico.

71. Método, de acordo com a reivindicação 68,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente quimiotera-pêutico é um antimetabólito.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anti-metabólito éum análogo de pirimidina.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido análogo de pirimi-dina é selecionado a partir do grupo que consiste em 5-fluorouracila, floxuridina, capecitabina, gencitabina e ci-tarabina.

74. Método, de acordo com a reivindicação 71,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anti-metabolite éum análogo de purina.

75. Método, de acordo com a reivindicação 74,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido análogo de purinaé selecionado a partir do grupo que consiste em mercaptopu-rina, tioguanina, pentostatina e 2-clorodesoxiadenosina.

76. Método, de acordo com a reivindicação 68,CARACTERIZADO pelo fato de também compreender administrar umagente antimitótico, agentes de dano ao DNA, de ruptura demicrotúbulo, antibióticos, agentes anti-plaquetários, agen-tes de alquilação de DNA, anticoagulantes, agentes fibrino-liticos, agentes antimigratórios, agentes anti-secretores,imunossupressores, agentes imunomoduladores, inibidores dofator de crescimento, inibidores de topoisomerase, corticos-teróides e de ruptura de cromatina.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente imunossu-pressor é selecionado a partir do grupo que consiste em ci-closporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), a-zatioprina, e mofetila de micofenolato.

78. Método, de acordo com a reivindicação 7 6,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente imunomodu-lador é selecionado a partir do grupo que consiste em tali-domida e análogos desta.

79. Método, de acordo com a reivindicação 7 6,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente imunomodu-lador é selecionado a partir do grupo que consiste em Iena-lidomida, Actimida, e ciclofosfamida.

80. Método, de acordo com a reivindicação 76,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente imunomodu-lador é selecionado a partir do grupo que consiste em peptí-deos heterocliticos e vacinas de câncer.

81. Método, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 68, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido se-gundo agente é administrado seqüencialmente ou simultanea-mente .

82. Método de tratar uma infecção viral em um pa-ciente, CARACTERIZADO pelo fato de compreender administrarum anticorpo anti-CD200 ou fragmento de ligação de antigenodeste ao referido paciente.

83. Método, de acordo com a reivindicação 82,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou frag-mento de ligação de antigeno deste é de bloqueio.

84. Método, de acordo com a reivindicação 82,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou frag-mento de ligação de antigeno deste é um anticorpo ou frag-mento de ligação de antigeno deste de acordo com quaisquerdas reivindicações 1-5.

85. Anticorpo anti-CD200 ou fragmento de li-gação de antigeno deste compreendem uma região constante va-riante, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpoexibe função efetora aumentada comparada a um anticorpo an-ti-CD200 não variante.

86. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADO pelo fato deque o referido anticorpo é um anticorpo de murino, um anti-corpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo decadeia simples, ou um anticorpo humano.

87. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADO pelo fato deque o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo queconsiste em IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgA,IgD e IgE.

88. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADO pelo fato deque o referido anticorpo compreende uma ou mais das caracte-risticas seguintes:a) ligação aumentada a um ou mais receptores de Fc;b) atividade de ADCC aumentada;c) atividade de CDC aumentada;comparada ao anticorpo não variante.

89. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADO pelo fato deque a referida região constante compreende glicosilação al-terada.

90. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADO pelo fato deque a referida região constante compreende uma inserção, de-leção ou substituição de aminoácido.

91. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 89,CARACTERIZADO pelo fato de que a glicosilação alterada com-preende uma ou mais das seguintes:(i) uma mudança em um ou mais componentes de açúcar;(ii) presença de um ou mais componentes de açúcar;e(iii) ausência de componentes de açúcar.

92. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 91,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo é ex-presso em uma célula hospedeira selecionada a partir do gru-po que consiste em uma célula de mamífero, uma célula bacte-riana, e uma célula de planta.

93. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 92,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é E. co-li.

94. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 92,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma cé-lula de hibridoma de rato.

95. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 92,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é uma cé-lula de CHO.

96. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno,de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADO pelo fato deque o referido anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodeste é um anticorpo anti-CD200 de bloqueio ou fragmento deligação de antigeno deste.

97. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodeste, de acordo com a reivindicação 96, CARACTERIZADO pelofato de que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico,um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano.

98. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodeste, de acordo com a reivindicação 85, CARACTERIZADO pelofato de que o referido anticorpo ou fragmento de ligação deantigeno deste é um anticorpo anti-CD200 de não bloqueio oufragmento de ligação de antigeno deste.

99. Anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodeste, de acordo com a reivindicação 98, CARACTERIZADO pelofato de que o referido anticorpo é um anticorpo quimérico,um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia simples, ouum anticorpo humano.

100. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que as células positivas CD-200são selecionadas a partir do grupo que consiste em células Be células T.

101. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de compreender administrar um anti-corpo ou fragmento de ligação de antigeno de acordo com areivindicação 85.

102. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido paciente tem umadoença auto-imune.

103. Método, de acordo com a reivindicação 102,CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença auto-imuneé selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reu-matóide, doença intestinal inflamatória, lúpus eritematososistêmico, esclerose múltipla, tireoidite de Hashimoto, ane-mia perniciosa, doença de Addison, diabetes tipo I, dermato-miosite, sindrome de Sjogren, lúpus eritematoso, miasteniagrave, sindrome de Reiter, e doença de Grave.

104. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido paciente recebeuou receberá um transplante.

105. Método, de acordo com a reivindicação 104,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido paciente recebeuou receberá um aloenxerto.

106. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido anticorpo ou frag-mento de ligação de antigeno é de não bloqueio.

107. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido paciente é uma mu-lher .

108. Método, de acordo com a reivindicação 107,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido paciente é avalia-do quanto ao estado de gravidez antes de administrar o refe-rido anticorpo ou fragmento deste.

109. Método, de acordo com a reivindicação 44,CARACTERIZADO pelo fato de que as amostras de célula ou te-cido do referido paciente são testados quanto ao nivel deexpressão de CD200 antes da administração de uma terapiacompreendendo o referido anticorpo ou fragmento de ligaçãode antigeno deste.

110. Agente que inibe a interação de CD200 com seureceptor, CARACTERIZADO pelo fato de o referido agente nãoelicia a função efetora.

111. Agente, de acordo com a reivindicação 110,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido agente é selecio-nado a partir do grupo que consiste em: aptâmero, polipeptí-deo, agente imunomodulador, fragmento de ligação de antige-no, molécula pequena, substância química, composto organome-tálico, composto inorgânico, metal, ácido nucléico, oligonu-cleotideo, pró-fármaco, e composto peptidomimético.

112. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelofato de compreender um agente que liga-se a CD200.

113. Composição farmacêutica de acordo com areivindicação 112, CARACTERIZADA pelo fato do agente ser umanticorpo anti-CD200 ou fragmento de ligação de antigenodeste.

114. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 113, CARACTERIZADA pelo fato de que o anticorpoou fragmento de ligação de antigeno deste é um anticorpo oufragmento de ligação de antigeno de acordo com quaisquer dasreivindicações 1-34, 38-43, 85-99.

115. Composição farmacêutica, de acordo com quais-quer das reivindicações 112 ou 113, CARACTERIZADA pelo fatode ser substancialmente livre de pirógeno.

116. Composição farmacêutica, de acordo com a rei-vindicação 114, CARACTERIZADA pelo fato de ser substancial-mente livre de pirógeno.

117. Método de monitorar o progresso de uma tera-pia, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a coleção de a-mostras de tecido ou células de uma paciente recebendo ouplanejando receber a referida terapia pelo menos duas vezese determinar a expressão de CD200 nas referidas amostras co-letadas.

118. Método, de acordo com a reivindicação 117,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido paciente tem cân-cer .

119. Método, de acordo com a reivindicação 117,CARACTERIZADO pelo fato de que expressão de CD200 é determi-nada antes de um ou mais dos métodos seguintes:(a) imunoistoquimica(b) análise citométrica de fluxo.

120. Método, de acordo com a reivindicação 117,CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos uma das referidasamostras é coletada antes de iniciar a referida terapia.

121. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 44, 58-60, 83, 103, 104, 106, 117, CARACTERIZADO pelofato de que o referido paciente não recebeu radioterapia aocérebro.

122. Método, de acordo com quaisquer das reivindi-cações 44, 58-60, 83, 103 104, 106, 117, CARACTERIZADO pelofato de que o referido paciente não recebeu previamente acirurgia cerebral.

123. Anticorpo anti-CD200 desimunizado ou fragmen-to de ligação de antigeno deste que compreende uma regiãoconstante alterada, CARACTERIZADO pelo fato de que o referi-do anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno exibe afunção efetora diminuída relativa a um anticorpo anti-CD200não variante.

124. Anticorpo anti-CD200 desimunizado ou fragmen-to de ligação de antigeno deste compreendendo uma regiãoconstante variante, CARACTERIZADO pelo fato de que o referi-do anticorpo desimunizado ou fragmento de ligação de antige-no deste exibe função efetora aumentada comparada a um anti-corpo anti-CD200 não variante.

125. Anticorpo desimunizado ou fragmento de liga-ção de antigeno, de acordo com a reivindicação 123 ou 124,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo desimunizado oufragmento de ligação de antigeno é um anticorpo de CD200 an-ti-bloqueio ou fragmento de ligação de antigeno deste.

126. Anticorpo desimunizado ou fragmento de liga-ção de antigeno, de acordo com a reivindicação 124,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo desimunizado oufragmento de ligação de antigeno é um anticorpo anti-CD200de não bloqueio ou fragmento de ligação de antigeno deste.