ES2336433T3 - Moldes modififcados mediante ingenieria genetica y su uso en amplificacion de cebador unico. - Google Patents

Moldes modififcados mediante ingenieria genetica y su uso en amplificacion de cebador unico. Download PDF

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Abstract

Método para amplificar ácido nucleico, que comprende: a) hibridar un cebador a un molde, presentando el cebador una primera porción que se hibrida al molde y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde; b) sintetizar un polinucleótido que es complementario a la porción del molde entre la localización a la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y el extremo del molde, presentando el polinucleótido el cebador en un primer extremo del mismo y un segundo extremo; c) separar el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) del molde; d) hibridar un oligonucleótido molde al segundo extremo del polinucleótido sintetizado en la etapa (b), presentando el oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo del polinucleótido y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador; e) extender el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en el que dicho oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3''; y f) amplificar el polinucleótido extendido usando un cebador único que tiene la secuencia predeterminada.

Description

Moldes modificados mediante ingeniería genética y su uso en amplificación de cebador único.
Campo técnico
La presente descripción se refiere a moldes modificados mediante ingeniería genética útiles para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana. Más específicamente, los moldes que se modifican mediante ingeniería genética para contener secuencias complementarias en sus extremos opuestos se proporcionan mediante una reacción de extensión con oligonucleótidos anidados (NOER). El molde modificado mediante ingeniería genética permite la Amplificación con Cebador Único (SPA) para amplificar una secuencia diana dentro del molde modificado mediante ingeniería genética. En formas de realización particularmente útiles, las secuencias diana de los moldes modificados mediante ingeniería genética se clonan en vehículos de expresión para proporcionar una librería de polipéptidos o proteínas, tal como, por ejemplo, una librería de anticuerpos.
Antecedentes de la técnica relacionada
Los métodos para la amplificación de ácidos nucleicos y la detección de productos de la amplificación ayudan en la detección, identificación, cuantificación y análisis de secuencias de las secuencias de ácidos nucleicos. La amplificación de ácidos nucleicos es una etapa importante en la construcción de librerías a partir de genes relacionados, tales como, por ejemplo, anticuerpos. Estas librerías se pueden identificar en busca de anticuerpos que tienen actividades específicas, deseables. El análisis de ácidos nucleicos es importante para la detección e identificación de patógenos, la detección de una alteración génica que conduce a fenotipos definidos, el diagnóstico de enfermedades genéticas o la susceptibilidad a una enfermedad, la evaluación de la expresión génica en desarrollo, enfermedad y en respuesta a estímulos definidos, así como los diversos proyectos genómicos. Otras aplicaciones del método de amplificación de ácidos nucleicos comprenden la detección de células raras, la detección de patógenos, y la detección de la expresión génica alterada en tumores, y similares. La amplificación de ácidos nucleicos también es útil para el análisis cualitativo (tal como, por ejemplo, la detección de la presencia de secuencias de ácido nucleico definidas) y la cuantificación de secuencias génicas definidas (útil, por ejemplo, en la evaluación de la cantidad de secuencias patógenas, así como la determinación de la multiplicación o supresión génica, y la transformación celular desde un tipo celular normal a neoplásico, etc.). La detección de alteraciones de secuencias en una secuencia de ácido nucleico es importante para la detección de genotipos mutantes, tan importante para el análisis genético, la detección de mutaciones que conducen a resistencia a fármacos, farmacogenómica, etc.
Hay muchas variaciones de la amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo la amplificación exponencial, la amplificación lineal enlazada, la amplificación a base de ligación, y la amplificación a base de transcripción. Un ejemplo de método de amplificación exponencial de ácidos nucleicos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que se ha descrito en numerosas publicaciones. Véase, por ejemplo, Mullis et al. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986); Mullis K., documento EP 201.184; Mullis et al., patente US nº 4.582.788; Erlich et al., documentos EP 50.424, EP 84.796, EP 258.017, EP 237.362; y Saiki R. et al., patente US nº 4.683.194. De hecho, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es el método de amplificación diana más usado habitualmente. La PCR se basa en múltiples ciclos de desnaturalización, hibridación de dos cebadores oligonucleotídicos diferentes, cada uno a una hebra opuesta de las hebras diana, y la extensión de los cebadores mediante una polimerasa nucleotídica para producir múltiples copias bicatenarias de la secuencia diana.
También se han descrito métodos de amplificación que emplean un único cebador. Véanse, por ejemplo, las patentes US n^{os} 5.508.178; 5.595.891; 5.683.879; 5.130.238; y 5.679.512. El cebador puede ser un cebador quimérico de ADN/ARN, como se describe en la patente US nº 5.744.308.
Algunos métodos de amplificación usan oligonucleótidos de cambio de molde (TSO) y oligonucleótidos bloqueantes. Por ejemplo, en las patentes US nº 5.679.512; nº 5.962.272; nº 6.251.639 y en Patel et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:2969-2974 (1996) se describe una amplificación de cambio de molde en la que se utiliza un cebador de ADN quimérico.
Sin embargo, los métodos de amplificación diana descritos previamente adolecen de varios inconvenientes. Por ejemplo, los métodos de amplificación a base de transcripción, tales como la Amplificación a Base de Secuencias de Ácidos Nucleicos (NASBA) y la amplificación mediada por transcripción (TMA), están limitados por la necesidad de incorporar la secuencia del promotor de la polimerasa en el producto de amplificación mediante un cebador, un proceso que tiene tendencia a dar como resultado una amplificación no específica. Otro ejemplo de un inconveniente de los métodos actuales de amplificación es el requisito de dos sucesos de unión que pueden tener una unión óptima a diferentes temperaturas, así como el uso de cebadores que contienen secuencias de origen natural. Esta combinación de factores da como resultado el aumento de la probabilidad de un cebado erróneo y la amplificación resultante de secuencias distintas de la secuencia diana.
Por lo tanto, existe la necesidad de métodos mejorados de amplificación de ácidos nucleicos que superen estos inconvenientes. La invención proporcionada en la presente memoria satisface esta necesidad y proporciona beneficios adicionales.
Sumario
Ahora se han descubierto nuevos métodos para amplificar ácido nucleico, que comprenden las etapas de: a) hibridar un cebador a una secuencia de ácido nucleico molde, presentando el cebador una primera porción que se hibrida al molde, y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde; b) sintetizar un polinucleótido que es complementario a la porción del molde entre la localización en la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y el extremo del molde, presentando el polinucleótido un primer extremo y un segundo extremo, en el que el primer extremo incorpora el cebador; c) separar del molde el polinucleótido sintetizado en la etapa (b); d) hibridar un oligonucleótido molde al segundo extremo del polinucleótido sintetizado en la etapa (b), presentando el oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo del polinucleótido, y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador; e) extender el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en la que dicho oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3'; y f) amplificar el polinucleótido extendido usando un único cebador que tiene la secuencia predeterminada.
En una forma de realización alternativa, el método comprende las etapas de a) hibridar un cebador y un oligonucleótido frontera a una secuencia de ácido nucleico molde, presentando el cebador una primera porción que se hibrida al molde, y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde; b) sintetizar un polinucleótido que es complementario a la porción del molde entre la localización en la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y la porción del molde a la que se hibrida el oligonucleótido frontera, presentando el polinucleótido un primer extremo y un segundo extremo, en el que el primer extremo incorpora el cebador; c) separar del molde el polinucleótido sintetizado en la etapa (b); d) hibridar un oligonucleótido molde al segundo extremo del polinucleótido sintetizado en la etapa (b), presentando el oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo del polinucleótido, y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador; e) extender el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en la que dicho oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3'; y f) amplificar el polinucleótido extendido usando un único cebador que tiene la secuencia predeterminada.
También se contempla que una hebra de ácido nucleico modificada mediante ingeniería genética, que tiene una secuencia predeterminada en un primer extremo de la misma, y una secuencia complementaria a la secuencia predeterminada en el otro extremo de la misma, sea en sí misma un aspecto de esta descripción.
En otro aspecto, esta descripción proporciona un método para amplificar una hebra de ácido nucleico que comprende las etapas de proporcionar una hebra de ácido nucleico modificada mediante ingeniería genética que tiene una secuencia predeterminada en un primer extremo de la misma y una secuencia complementaria a la secuencia predeterminada en el otro extremo de la misma; y poner en contacto la hebra de ácido nucleico modificada mediante ingeniería genética con un cebador que tiene la secuencia predeterminada, en presencia de una polimerasa y nucleótidos en condiciones adecuadas para la polimerización de los nucleótidos.
Los procesos de amplificación y los moldes modificados mediante ingeniería genética descritos en la presente memoria se pueden usar para preparar productos amplificados que se pueden ligar a un vector de expresión adecuado. El vector se puede usar entonces para transformar un organismo hospedante apropiado usando métodos estándar para producir el polipéptido o proteína codificado por la secuencia diana. En formas de realización particularmente útiles, las técnicas descritas en la presente memoria se usan para amplificar una familia de secuencias relacionadas para construir una librería compleja, tal como, por ejemplo, una librería de anticuerpos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es una ilustración esquemática de un cebador y un oligonucleótido frontera hibridado a un molde;
la figura 2A es una ilustración esquemática de un oligonucleótido de restricción hibridado a una hebra de ácido nucleico;
la figura 2B es una ilustración esquemática de un cebador hibridado a un molde que presenta un extremo 5' acortado;
la figura 3 es una ilustración esquemática de una forma de realización alternativa en la que se llevan a cabo múltiples rondas de polimerización, y se hibrida un oligonucleótido de restricción a las hebras recientemente sintetizadas, en lugar de al molde original;
la figura 4 es una ilustración esquemática de un oligonucleótido anidado hibridado a una hebra de ácido nucleico recientemente sintetizada;
la figura 5 es una ilustración esquemática de un molde modificado mediante ingeniería genética según esta descripción;
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la figura 6 es una ilustración esquemática de la amplificación con cebador único de un molde modificado mediante ingeniería genética;
la figura 7 muestra la secuencia del oligonucleótido anidado denominado TMX24CMnpt;
las figuras 8a-e muestran las secuencias de Fabs aislados producidos en el Ejemplo 3; y
las figuras 9a-d muestran las secuencias de Fabs aislados producidos en el Ejemplo 5.
Descripción detallada de las realizaciones preferidas
La presente descripción proporciona un método para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana. En formas de realización particularmente útiles, la secuencia de ácido nucleico diana es un gen que codifica un polipéptido o proteína. La descripción también describe cómo se pueden clonar y expresar los productos de la amplificación en sistemas de expresión adecuados. En formas de realización particularmente útiles, las técnicas descritas en la presente memoria se usan para amplificar una familia de secuencias relacionadas para construir una librería compleja, tal como, por ejemplo, una librería de anticuerpos.
La secuencia de ácido nucleico diana se amplifica exponencialmente a través de un proceso que implica solamente un único cebador. La capacidad para emplear un único cebador (es decir, sin la necesidad de ambos cebadores directo e inverso, que tienen cada uno diferentes secuencias) se logra modificando mediante ingeniería genética una hebra de ácido nucleico que contiene la secuencia diana a amplificar. La hebra de ácido nucleico modificada mediante ingeniería genética (algunas veces denominada en la presente memoria como el "molde modificado mediante ingeniería genética") se prepara a partir de dos moldes, a saber, 1) un material de partida que es un ácido nucleico natural o sintético (por ejemplo, ADN o ADNc) que contiene la secuencia a amplificar, y 2) un oligonucleótido anidado. El material de partida se puede considerar como el molde original. El oligonucleótido anidado se usa como un molde para extender la secuencia nucleotídica del molde original durante la creación de la hebra de ácido nucleico modificada mediante ingeniería genética. La hebra de ácido nucleico modificada mediante ingeniería genética se crea a partir del molde original mediante una serie de manipulaciones que dan como resultado la presencia de secuencias complementarias en sus extremos opuestos. Son estas secuencias complementarias las que permiten la amplificación usando solamente un único cebador.
Cualquier ácido nucleico, en forma pura o no pura, se puede utilizar como el material de partida para los procesos descritos en la presente memoria, con tal de que contenga o se sospeche que contiene la secuencia de ácido nucleico diana a amplificar. De este modo, el material de partida empleado en el proceso puede ser, por ejemplo, ADN o ARN, comprendiendo ARN mensajero, ADN o ARN el cual puede ser monocatenario o bicatenario. Además, se puede utilizar un híbrido de ADN/ARN que contiene una hebra de cada uno. También se puede emplear una mezcla de cualquiera de estos ácidos nucleicos, o se pueden utilizar los ácidos nucleicos producidos a partir de una reacción de amplificación previa en este caso usando los mismos o diferentes cebadores. La secuencia de ácido nucleico diana a amplificar puede ser una fracción de una molécula más grande, o puede estar presente inicialmente como una molécula discreta. El ácido nucleico de partida puede contener más de una secuencia de ácido nucleico diana deseada, que puede ser la misma o diferente. Por lo tanto, el presente proceso puede ser útil no sólo para producir grandes cantidades de una secuencia de ácido nucleico diana, sino también para amplificar simultáneamente más de una secuencia de ácido nucleico diana diferente situada en las mismas o diferentes moléculas de ácido nucleico.
Los ácidos nucleicos se pueden obtener a partir de cualquier fuente, por ejemplo: librerías genómicas o de ADNc, plásmidos, ADN o ARN clonados, o a partir de ADN o ARN natural de cualquier fuente, comprendiendo bacterias, levadura, virus, y organismos superiores tales como plantas o animales. Los ácidos nucleicos pueden ser de origen natural, o pueden ser sintéticos, totalmente o en parte. Las técnicas para obtener y producir los ácidos nucleicos usados en la presente invención son bien conocidas por los expertos en la técnica. Si el ácido nucleico contiene dos hebras, es necesario separar las hebras del ácido nucleico antes de que se pueda usar como el molde original, ya sea como una etapa separada o simultáneamente con la síntesis de los productos de extensión del cebador. Adicionalmente, si el material de partida es ADN de primera hebra, ventajosamente se puede crear ADN de segunda hebra mediante procesos dentro del conocimiento de los expertos en la técnica, y se puede usar como el molde original a partir del cual se crea el molde modificado mediante ingeniería genética.
El ADNc de primera hebra es un molde original particularmente útil para los presentes métodos. Los métodos adecuados para generar moldes de ADN son conocidos y se seleccionan fácilmente por los expertos en la técnica. En una forma de realización preferida, el ADNc de 1ª hebra se sintetiza en una reacción en la que la transcriptasa inversa cataliza la síntesis de ADN complementario a cualquier material de partida de ARN, en presencia de un cebador oligodesoxinucleotídico y los cuatro trifosfatos de desoxinucleótidos, dATP, dGTP, dCTP, y TTP. La reacción se inicia hibridando el cebador oligo-desoxinucleotídico al extremo 3' de ARNm, seguido de la adición por etapas de los desoxinucleótidos apropiados, según se determina mediante relaciones de emparejamiento de bases con la secuencia nucleotídica de ARNm, al extremo 3' de la cadena en crecimiento. Como apreciarán los expertos en la técnica, todo ARNm en una muestra se puede usar para generar ADNc de primera hebra a través de la hibridación de oligo dT a la cola polyA del ARNm.
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Una vez se obtiene el molde original, se hibrida un cebador 20 y un oligonucleótido frontera 30 al molde original 10. (Véase la figura 1). Se polimeriza una hebra de ácido nucleico complementario a la porción del molde original, comenzando en el extremo 3' del cebador hasta alrededor del extremo 5' del oligonucleótido frontera.
El cebador 20 que se hibrida al molde original comprende una primera porción 22 de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde original, y una segunda porción 25 que se hibrida al molde original, y opcionalmente comprende un sitio de restricción 23 entre las porciones primera y segunda. El cebador se hibrida al molde original adyacente a la secuencia diana 12 a amplificar. Se contempla que el cebador se puede hibridar al molde original corriente arriba de la secuencia diana a amplificar, o que el cebador se puede solapar con el comienzo de la secuencia diana 12 a amplificar, como se muestra en la figura 1. La secuencia predeterminada de la porción 22 no hibridante del cebador no es natural en el molde original, y se selecciona para proporcionar una secuencia a la que se puede hibridar el único cebador usado durante el proceso de amplificación como se describe con detalle más abajo. Opcionalmente, la secuencia predeterminada puede comprender un sitio de restricción útil para la inserción de una porción del molde modificado mediante ingeniería genética en un vector de expresión como se describe de forma más completa en la presente memoria a continuación.
El oligonucleótido frontera 30 que se hibrida al molde original sirve para terminar la polimerización del ácido nucleico. Como oligonucleótido frontera 30, se puede utilizar cualquier oligonucleótido capaz de terminar la polimerización del ácido nucleico. En una forma de realización preferida, el oligonucleótido frontera comprende una primera porción 35 que se hibrida al molde original 10, y una segunda porción 32 que no es susceptible a una reacción de extensión. Las técnicas para evitar que el oligonucleótido frontera actúe como un sitio de extensión están dentro del alcance de un experto en la técnica. A título de ejemplo, la porción 32 del oligonucleótido frontera 30 se puede diseñar de forma que no se hibride al molde original 10 como se muestra en la figura 1. En dichas formas de realización, el oligonucleótido frontera 30 evita la polimerización adicional, pero no sirve como un cebador para la síntesis de ácido nucleico, debido a que su extremo 3' no se hibrida con el molde original 10. Como alternativa, el extremo 3' del oligonucleótido frontera 30 se puede diseñar para que comprenda un ácido nucleico bloqueado para lograr el mismo efecto. Por ejemplo, en el documento WO 99/14226 se describe un ácido nucleico bloqueado.
Los expertos en la técnica imaginarán otras formas para asegurarse de que no se produce la extensión del extremo 3' del oligonucleótido frontera.
Los cebadores y oligonucleótidos descritos en la presente memoria se pueden sintetizar usando métodos consolidados para la síntesis oligonucleotídica que son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos, comprendiendo cebadores de la presente invención, comprenden oligómeros lineales de monómeros o elementos de unión naturales o modificados, tales como desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y similares, que son capaces de unirse específicamente a un polinucleótido diana por medio de un patrón regular de interacciones monómero con monómero, tal como el emparejamiento de bases de Watson-Crick. Habitualmente, los monómeros están unidos mediante enlaces de fosfodiéster o sus análogos, para formar oligonucleótidos que tienen un tamaño desde unas pocas unidades monoméricas, por ejemplo 3-4, a varias decenas de unidades monoméricas. Un cebador es típicamente monocatenario, pero puede ser bicatenario. Los cebadores son típicamente ácidos desoxirribonucleicos, pero para los métodos de la presente descripción puede ser útil una amplia variedad de cebadores de origen natural y sintético conocidos en la técnica. Un cebador es complementario al molde para el que está diseñado para hibridarse, para servir como un sitio para el inicio de la síntesis, pero no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. En tal caso, la hibridación específica del cebador al molde depende de la restricción de las condiciones de hibridación. Los cebadores se pueden marcar con, por ejemplo, restos cromógenos, radioactivos, o fluorescentes, y se pueden usar como restos detectables.
La polimerización del ácido nucleico se puede lograr usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. La polimerización generalmente se logra enzimáticamente, usando una ADN polimerasa que añade secuencialmente nucleótidos libres según las instrucciones del molde. Varias ADN polimerasas diferentes son adecuadas para uso en el presente proceso. En ciertas formas de realización, los criterios de selección comprenden la falta de actividad exonucleasa, o ADN polimerasas que no posean una exonucleasa potente. Las ADN polimerasas con baja actividad exonucleasa para uso en el presente proceso se pueden aislar a partir de fuentes naturales, o se pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante. Los ejemplos ilustrativos de polimerasas que se pueden usar son, sin limitación, T7 Sequenase v. 2.0, el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I que carece de actividad exonucleasa, el fragmento de Klenow de Taq polimerasa, ADN polimerasa de Pfu exo.-, ADN polimerasa de Vent. (exo.-), y ADN polimerasa de Deep Vent. (exo.-).
En una forma de realización particularmente útil, el uso de un oligonucleótido frontera se evita eliminando las porciones innecesarias del material de partida mediante digestión. En esta forma de realización, que se muestra esquemáticamente en la figura 2A, se hibrida un oligonucleótido de restricción 70 al material de partida 100 en una localización preseleccionada. El oligonucleótido de restricción proporciona una porción bicatenaria en el material de partida que contiene un sitio de restricción 72. Los sitios de restricción adecuados comprenden, pero no se limitan a, Xho I, Spe I, Nhe1, Hind III, Nco I, Xma I, Bgl II, Bst I, y Pvu I. Al exponerlo a una enzima de restricción adecuada, el material de partida se digiere y de ese modo se acorta para eliminar la secuencia innecesaria, a la vez que se conserva la secuencia diana deseada 12 (o una porción de la misma) a amplificar en lo que se usará como el molde original 110. Una vez se obtiene el molde original 110, se híbrida un cebador 20 al molde original 110 (véase la figura 2B) adyacente a o solapando con la secuencia diana 12 como se describe anteriormente en relación con formas de realización previas. Se polimeriza una hebra de ácido nucleico 40 complementaria a la porción del molde original entre el extremo 3' del cebador 20 y el extremo 5' del molde original 110. Como apreciarán los expertos en la técnica, en esta forma de realización en la que se emplea un oligonucleótido de restricción para generar el molde original, no es necesario usar un oligonucleótido frontera, debido a que se puede permitir que transcurra la extensión del cebador totalmente hasta el extremo 5' del molde original acortado 110.
Una vez que la polimerización está terminada (es decir, la hebra 40 en crecimiento alcanza el oligonucleótido frontera 30 o el extremo 5' del molde original acortado 110), la hebra complementaria recientemente sintetizada se separa del molde original mediante cualquier método desnaturalizante adecuado, comprendiendo medios físicos, químicos o enzimáticos. La separación de la hebra también se puede inducir mediante una enzima de la clase de enzimas conocidas como helicasas o la enzima RecA, que tiene actividad helicasa, y en presencia de riboATP, que se sabe que desnaturaliza el ADN. Las condiciones de reacción adecuadas para separar las hebras de ácidos nucleicos con helicasas se describen en Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Vol. XLIII "DNA: Replication and Recombination" (New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1978), B. Kuhn et al., "DNA Helicases", p. 63-67, y las técnicas para usar RecA se repasan en C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16:405-37 (1982).
La hebra complementaria recientemente sintetizada comprende así secuencias proporcionadas por el cebador 20 (por ejemplo, la secuencia predeterminada 22, el sitio de restricción opcional 23 y la porción hibridante 25 del cebador) así como la porción recientemente sintetizada 45 que es complementaria a la porción del molde original 10 entre la localización en la que el cebador 20 se hibridó al molde original 10 y la porción del molde original 10 a la que se hibridó el oligonucleótido frontera 30 o el extremo 5' acortado del molde original. Véase la figura 4.
Opcionalmente, se llevan a cabo múltiples rondas de polimerización (preferentemente, 15-25 rondas) usando el molde original y un cebador, para producir múltiples copias de la hebra complementaria recientemente sintetizada para uso en etapas subsiguientes. La obtención de múltiples copias de la hebra complementaria recientemente sintetizada en este punto en el proceso (en lugar de esperar hasta que se produzca el molde completo modificado mediante ingeniería genética antes de amplificar) ayuda a asegurar que se incorporen copias exactas de la secuencia diana en los moldes modificados mediante ingeniería genética producidos en último lugar. Se cree que múltiples rondas de polimerización basadas en el molde original proporcionan una mayor probabilidad de que se logrará una mejor representación de todos los miembros de la librería, proporcionando por lo tanto una mayor diversidad en comparación con una única ronda de polimerización.
En una forma de realización alternativa, las hebras recientemente sintetizadas se producen hibridando el cebador 20 como se describe anteriormente al molde original 10, y llevando a cabo múltiples rondas de polimerización, ya sea sin la presencia de un oligonucleótido de bloqueo o bien eliminando una porción del molde original. En esta forma de realización, que se muestra esquemáticamente en la figura 3, el cebador se extiende a lo largo de la longitud completa del molde original para proporcionar una hebra recientemente sintetizada de longitud completa 140. A continuación, se hibrida un oligonucleótido de restricción 170 a la hebra recientemente sintetizada de longitud completa. El oligonucleótido de restricción proporciona una porción bicatenaria en la hebra recientemente sintetizada que contiene un sitio de restricción. Los sitios de restricción adecuados comprenden, pero no se limitan a, Xho I, Spe I, Nhe1, Hind III, Nco I, Xma I, Bgl II, Bst I, Pvu I, Xcm I, BsaJ I, Hpa I, ApaL I, Sac I, Dra III y Sma I. Al exponerla a una enzima de restricción adecuada, la hebra recientemente sintetizada se digiere y de ese modo se acorta. Entonces se puede hibridar un oligonucleótido anidado 50 a la hebra recientemente sintetizada acortada 142, para completar la preparación del molde modificado mediante ingeniería genética, como se describe con más detalle más abajo.
La siguiente etapa en la preparación del molde modificado mediante ingeniería genética implica hibridar un oligonucleótido anidado 50 al extremo 3' de la hebra complementaria recientemente sintetizada, por ejemplo como se muestra en la figura 4. Como se observa en la figura 4, el oligonucleótido anidado 50 proporciona un molde para la polimerización adicional necesaria para completar el molde modificado mediante ingeniería genética. El oligonucleótido anidado 50 comprende una porción 52 que no se hibrida y/o comprende bases modificadas para la hebra complementaria recientemente sintetizada, evitando de ese modo que el oligonucleótido anidado sirva como un cebador. El oligonucleótido anidado 50 también comprende una porción 55 que se hibrida al extremo 3' de la hebra complementaria recientemente sintetizada. La porción 55 puede tener la misma frontera con la porción recientemente sintetizada 45, o se puede extender más allá de la porción recientemente sintetizada 45 como se muestra en la figura 4. El oligonucleótido anidado 50 puede comprender también opcionalmente una porción 56 que define un sitio de restricción. La porción final 58 del oligonucleótido anidado 50 contiene la misma secuencia predeterminada que la porción 22 del cebador 20. Desde el punto en el que la porción 55 se extiende más allá del extremo 3' del comienzo de la hebra complementaria recientemente sintetizada, el oligonucleótido anidado sirve como un molde para la polimerización adicional para formar el molde modificado mediante ingeniería genética. Se debería de entender que el oligonucleótido anidado puede contener parte de la secuencia diana (si parte de la misma se truncó al formar el molde original), o puede comprender genes que codifican un polipéptido o proteína (o una porción de la misma) tal como, por ejemplo, una o más CDR o regiones de marco o regiones constantes de un anticuerpo. También se contempla que se pueda emplear una colección de oligonucleótidos anidados que tengan diferentes secuencias, proporcionando de ese modo una variedad de moldes que dan como resultado una librería de diversos productos. De este modo, la polimerización extenderá la hebra complementaria recientemente sintetizada añadiendo un ácido nucleico adicional 60 que es complementario al oligonucleótido anidado como se muestra en la figura 4. Las técnicas para lograr la polimerización están dentro del alcance de un experto en la técnica. Como se ha señalado previamente, en ciertas formas de realización se puede preferir seleccionar una polimerasa adecuada, una enzima que carezca de actividad exonucleasa.
Una vez que la polimerización está terminada, el molde modificado mediante ingeniería genética 120 se separa del oligonucleótido anidado 50 mediante técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como, por ejemplo, desnaturalización por calor. El molde modificado por ingeniería genética 120 resultante contiene una porción derivada del cebador original 20, una porción 45 que es complementaria a una porción del molde original, y una porción 65 que es complementaria a una porción del oligonucleótido anidado (véase la figura 5). De forma significativa, el extremo 3' del molde modificado mediante ingeniería genética 120 comprende una porción 68 que contiene una secuencia que es complementaria a la secuencia predeterminada de la porción 22 del cebador 20. Esto permite la amplificación de la secuencia deseada contenida en el molde modificado mediante ingeniería genética 120 usando un único cebador que tiene la misma secuencia que la secuencia predeterminada de la porción 22 del cebador usando técnicas conocidas por los expertos normales en la técnica. Durante la amplificación con cebador único, se prefiere la presencia de una polimerasa que tiene actividad exonucleasa, debido a que se sabe que tales enzimas proporcionan una función de "corrección" y tienen una procesabilidad relativamente mayor en comparación con polimerasas que carecen de actividad exonucleasa.
La figura 6 ilustra las etapas implicadas en la amplificación con cebador único del molde de ADNc recientemente sintetizado. Cuando el cebador está presente en la mezcla de reacción, se hibrida a las secuencias que flanquean el molde y amplifica el molde. Cuando el cebador no está presente, se cree que hay una autohibridación interna entre la secuencia predeterminada del extremo 5' y la secuencia del extremo 3' que es complementaria a la secuencia predeterminada. En una forma de realización preferida, la secuencia predeterminada y la secuencia predeterminada complementaria se pueden diseñar para que se hibriden a temperaturas más altas, a fin de evitar el cebado erróneo durante la reacción de amplificación con cebador único.
Después de que se lleva a cabo la amplificación, los productos se pueden detectar usando cualquiera de las técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Los ejemplos de métodos usados para detectar ácidos nucleicos comprenden, sin limitación, hibridación con oligonucleótidos específicos de alelos, escisión con endonucleasas de restricción, análisis de polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP), electroforesis en gel, tinción con bromuro de etidio, transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia, ensayo de FRET de horquilla, y ensayo de TaqMan.
Una vez que el ácido nucleico modificado mediante ingeniería genética es amplificado un número deseado de veces, se pueden usar sitios de restricción 23 y 66, o cualesquiera sitios de restricción internos, para digerir la hebra de forma que la secuencia de ácido nucleico diana se pueda ligar a un vector de expresión adecuado. El vector se puede usar entonces para transformar un organismo hospedante apropiado usando métodos estándar para producir el polipéptido o proteína codificado por la secuencia diana.
En formas de realización particularmente útiles, los métodos descritos en la presente memoria se usan para amplificar secuencias diana que codifican anticuerpos o porciones de los mismos, tales como, por ejemplo, las regiones variables (ya sea de cadena ligera o pesada) usando ADNc de un anticuerpo. De esta manera, se puede amplificar e identificar una librería de anticuerpos. De este modo, por ejemplo, partiendo de ARNm de anticuerpo, se puede producir y digerir un ADNc de primera hebra para proporcionar un molde original. Se puede diseñar un cebador para que se hibride corriente arriba a una región determinante complementaria (CDR) seleccionada, de forma que la hebra de ácido nucleico recientemente sintetizada comprenda la CDR. A título de ejemplo, si la secuencia diana es CDR3 de cadena pesada, el cebador se puede diseñar para que se hibride a la región del marco uno (FR1) de cadena pesada. Los expertos en la técnica imaginarán fácilmente cómo diseñar cebadores apropiados para que se hibriden a otros sitios corriente arriba, o para reproducir otras dianas seleccionadas dentro del ADNc del anticuerpo basándose en esta descripción.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar, pero no limitar, la presente invención o invenciones:
Ejemplo 1
Amplificación de un repertorio de genes variables de cadena pesada de IgM.
Síntesis y modificación de ADNc de 1ª hebra
Se usó ARNm de linfocitos de sangre periférica (PBL) humanos para generar ADNc de 1ª hebra tradicional con un cebador de oligo dT usando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript para RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) esencialmente según las instrucciones del kit. El producto de ADNc de primera hebra se limpió sobre una columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Se añadió un oligonucleótido de restricción al ADNc de primera hebra a fin de generar una región de ADN bicatenario que se pudiese digerir mediante la endonucleasa de restricción EcoR I. La secuencia del oligonucleótido de restricción (CMEcoR I) fue 5' TCC TGT GAG AAT TCC CCG TCG 3' (SEC ID nº 1). La reacción se montó con ADNc de 1ª hebra y 0,1 uM de oligonucleótido. La muestra se calentó hasta 95ºC durante 2 minutos, y después se mantuvo a 64ºC durante dos minutos para permitir que se produjese la hibridación específica. Se añadió a la muestra una cantidad apropiada de 10X tampón de restricción H (Roche Diagnostics), y se enfrió adicionalmente hasta 37ºC. Se añadió la endonucleasa de restricción EcoR I (New England Biolabs) y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La enzima de restricción se inactivó por calor a 65ºC durante 20 minutos, y después la muestra se enfrió hasta 4ºC.
Amplificación lineal de 2ª hebra y extensión con oligonucleótido anidado
El ADNc de 1ª hebra digerido con EcoR I se usó como el molde original en una reacción de ADNc de 2ª hebra junto con el cebador "TMX24VH3a" (0.4 uM final), los dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). El cebador se diseñó para que contuviese la secuencia TMX24 predeterminada, un sitio de restricción Xho I y una región que se hibrida al ADNc de 1ª hebra en la región del marco 1 de los genes de cadena pesada de anticuerpo humano. La secuencia de "TMX24VH3a" fue 5' GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG CTC GAG GAR GTG CAG CTG GTG GAG 3' (SEC ID nº 2), en la que R representa una mezcla molar igual de bases A y G. La muestra se desnaturalizó por calor a 95ºC durante 1 minuto, después se sometió 20 veces a ciclos de 95ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 1 minuto. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. Entonces se añadió un oligonucleótido anidado, denominado "TMX24CM0", sobre hielo hasta una concentración final de 0,08 uM. La secuencia de "TMX24CM0" fue 5' GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG ACT AGT AAT TCT CAC AGG AGA CGA GGG GGA 3' (SEC ID nº 3), que contiene un sitio de endonucleasa de restricción Spe I para ser usado en etapas de clonación subsiguientes. El extremo 3' del oligonucleótido anidado se diseñó para evitar el alargamiento mediante incorporación de una adenosina enlazada inversa (3'-3' en lugar de 3'-5'). Los ADNc de 2ª hebra se alargaron adicionalmente desde el oligonucleótido anidado desnaturalizando por calor a 94ºC durante 5 segundos, después se sometieron a ciclos 4 veces para la hibridación y alargamiento a 68ºC durante 10 segundos y 95º durante 5 segundos, seguido de 68º durante 30 segundos y 4ºC. El ADNc de 2ª hebra o molde modificado mediante ingeniería genética resultante se limpió entonces usando una columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Esta etapa elimina los oligonucleótidos y permite el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo.
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Amplificación con cebador único (SPA)
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplificó usando una mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, los dNTP, y un único cebador (TMX24) que tiene la secuencia de 5' GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG 3' (SEC ID nº 4). Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 35 veces a ciclos de 95º durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. Esto fue seguido de 3 minutos adicionales a 68ºC y un mantenimiento a 4ºC.
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Clonación y secuenciación
Los productos de la amplificación, de aproximadamente 450 pb, se purificaron en gel y después se digirieron mediante Xho I y Spe I y se clonaron en pBluescript KS+ (Stratagene). Los clones individuales se recogieron y se determinó su secuencia de ADN. Los 16 clones analizados fueron una cadena pesada de IgM, poseyendo cada una secuencias de CDR3 diferentes de longitud variable, indicando de ese modo que mediante este método se amplificó una población diversa de cadenas de anticuerpo (véase la Tabla 1).
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TABLA 1
1 
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Ejemplo 2
A fin de clonar productos de VH en un vector, de forma que se pudiese reconstituir la región constante de CH1 de IgM natural, se utilizó un sitio distinto del EcoR I en CH2 para la digestión del ADNc de 1ª hebra con endonucleasa. Como apreciarán los expertos en la técnica, cuando se usa Taq polimerasa para este protocolo, se añade una A terminal a muchas de las hebras de ADN recientemente sintetizadas. A fin de maximizar la diversidad, se tuvo en cuenta la presencia de esa A terminal en el diseño del oligonucleótido anidado. Sin embargo, la presencia de esa A extra da como resultado la pérdida del sitio de reconocimiento de EcoR I. El análisis de la región constante de IgM reveló que se podrían usar potencialmente otros sitios de restricción naturales para este método, tal como Dra III. El resultado de usar el sitio de restricción natural Dra III en el dominio CH1 es que el sitio EcoR I corriente arriba queda sin modificar y se puede usar para clonar el repertorio de cadena pesada. Los insertos de cadena pesada se clonan mediante Xho I y EcoR I en un vector apropiado que tiene el dominio CH1 de IgM restante procedente de EcoR I al dominio
CH2.
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Síntesis y modificación del ADNc de 1ª hebra
Se usó ARNm de linfocitos de sangre periférica (PBL) humanos para generar ADNc de 1ª hebra tradicional con un cebador oligo dT. Esto se realizó usando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript para RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) según esencialmente las instrucciones del kit. Se añadió un oligonucleótido de restricción al ADNc de primera hebra, a fin de generar una región de ADN bicatenario que se pudiese digerir mediante la endonucleasa de restricción Dra III. La secuencia del oligonucleótido de restricción (CMDra III) fue 5' GAC GAA CAC GTG GTG TGC AAA G 3' (SEC ID nº 21). La reacción se montó con ADNc de 1ª hebra y 1 uM de oligonucleótido. La muestra se calentó hasta 95ºC durante 2 minutos, y después se mantuvo a 64ºC durante dos minutos para permitir que se produjese la hibridación específica. Se añadió a la muestra una cantidad apropiada de tampón de restricción H 10X (Roche Diagnostics), y se enfrió adicionalmente hasta 37ºC. Se añadió la endonucleasa de restricción Dra III (New England Biolabs) y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La enzima de restricción se inactivó por calor a 65ºC durante 20 minutos, y después la muestra se enfrió hasta 4ºC.
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Amplificación lineal de la 2ª hebra y extensión con el oligonucleótido anidado
Se usó ADNc de 1ª hebra digerido con Dra III como el molde original en una reacción de ADNc de 2ª hebra junto con el cebador "TMX24VH1a" (0.4 uM final), los dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). El cebador se diseñó para que contuviese la secuencia TMX24 predeterminada, un sitio de restricción Xho I y una región que se hibrida al ADNc de primera hebra en la región del marco 1 de los genes de cadena pesada de anticuerpos humanos. La secuencia de "TMX24VH1a" fue 5'GTGCTGGCCGTTGGAAGAGGAGTGCTCGAG
CAGGTKCAGCTGGTGCAG 3' (SEC ID nº 22), en la que K representa una mezcla molar igual de bases G y T. La mezcla se desnaturalizó por calor a 94ºC durante 1 minuto, después se sometió 20 veces a ciclos de 94ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 2 minutos. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. Se añadió un oligonucleótido anidado, denominado "TMX24CMnpt", sobre hielo hasta una concentración final de 0,2 uM. Como se muestra en la figura 7, la secuencia de "TMX24CMnpt" (SEC ID nº 23) comprende tres nucleótidos terminales 3' que tienen estructuras modificadas que se diseñaron para evitar el alargamiento del oligonucleótido. Específicamente, el oligonucleótido anidado presenta tres nucleótidos terminales modificados con fosforotioato y 2'OMe que se diseñan para evitar la extensión y proteger frente a la actividad exo- y endonucleasa. El nucleótido del extremo 3' de este oligonucleótido no es hibridante (g en lugar de c). Los ADNc de 2ª hebra se alargaron adicionalmente desde el oligonucleótido anidado desnaturalizando por calor a 94ºC durante 1 minuto, hibridando y alargando a 68ºC durante 2 minutos, seguido de 4ºC. El ADNc de segunda hebra o el molde modificado mediante ingeniería genética resultante se limpió entonces usando una columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Esta etapa elimina los oligonucleótidos y permite el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo. Este procedimiento se repitió y se extendió al resto del panel de cebadores de VH (véase la lista de cebadores) para generar una librería de productos de inmunoglobulina que se pueden clonar en un vector apropiado.
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Cebadores específicos del marco 1 de VH:
100
En las secuencias anteriores, R es una mezcla por igual de A y G, K es una mezcla por igual de G y T, y S es una mezcla por igual de C y G.
Amplificación con cebador único (SPA)
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplificó usando mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, los dNTP y un único cebador (TMX24) que tiene la secuencia 5' GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG 3' (SEC ID nº 4). Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, y después se sometieron a ciclos 30 veces desde 95ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. A esto le siguieron 3 minutos adicionales a 68ºC y un mantenimiento a 4º.
Clonación y secuenciación
Los productos de la amplificación, de aproximadamente 450 pb, se purificaron en gel y se digirieron mediante Xho I y EcoR I. Los insertos se clonaron en cualquier vector de expresión adecuado que contiene la porción restante del dominio CH1 de IgM procedente del sitio EcoR I nativo hasta, o comprendiendo una porción de, el dominio CH2 y un sitio de restricción compatible para la clonación de los fragmentos amplificados.
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Ejemplo 3
Construcción de una librería de presentación fagémida a partir de ARNm de un donante positivo a la hepatitis B.
Síntesis y modificación de ADNc de 1ª hebra para cadenas pesada de IgG y ligera Kappa
Se usó ARNm de linfocitos de sangre periférica (PBL) humanos procedente de donante vacunado contra la hepatitis B para generar ADNc de 1ª hebra tradicional con un cebador oligo dT. Esto se realizó usando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript para RT-PCR (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES) según esencialmente las instrucciones del kit. Se añadió oligonucleótido de restricción "CGApaL I" para IgG o "CKSac I" para la cadena ligera kappa al ADNc de primera hebra, a fin de generar una región de ADN bicatenario que se pudiese digerir mediante la endonucleasa de restricción ApaL I para IgG o Sac I para la cadena ligera kappa. La secuencia de "CGApaL I" es 5'CCA GCG GCG TGC ACA CCT TCC3' (Seq ID No. 39). La secuencia de "CKSac I" es 5'AGG GCC TGA GCT CGC CCG TC 3' (Seq ID No. 40). La reacción se montó con ADNc de 1ª hebra, 1 uM de oligonucleótido, y una cantidad apropiada de tampón de restricción A 10X (Roche Diagnostics). La muestra se calentó hasta 95ºC durante 2 minutos, y después se mantuvo a 64ºC durante dos minutos para permitir que se produjese la hibridación específica, y se enfrió hasta 37ºC. Se añadió la endonucleasa de restricción ApaL I o Sac I (New England Biolabs) y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La enzima de restricción se inactivó por calor para Sac I a 65ºC durante 20 minutos, y después la muestra se enfrió hasta 4ºC.
La digestión de los ADNc de 1ª hebra por cada endonucleasa de restricción se verificó mediante amplificación por PCR usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estos productos no se usaron para clonar los genes de anticuerpos. Se observó amplificación positiva del ADN de 1ª hebra digerido en reacciones que usan el cebador de control interno 5' VBVH1a y el 3' CG0 para IgG y el cebador de control interno 5' VBVK1a y el 3' CK0 para kappa. Una buena amplificación con los cebadores 5' VBVH1a/3' CG0 o 5' VBVK1a/3' CK0 y una amplificación mínima con los cebadores 5' VBVH1a/3' CG1Z o 5' VK1a/3' CK1dx2 indican una digestión con éxito del molde de ADNc de 1ª hebra con cada endonucleasa de restricción. Las secuencias de los cebadores usados para la PCR de comprobación fueron VBVH1a: 5' GAG CCG CAC GAG CCC CTC GAG CAG GTK CAG CTG GTG CAG 3' (SEC ID nº 41), CG0: 5' GRG CGC CTG AGT TCC ACG ACA CCG 3' (SEC ID nº 42), VBVK1a: 5' GAC GCG CAC AAC ACG GAG CTC RAC ATC CAG ATG ACC CAG 3' (SEC ID nº 43), CK0: 5' GTG ACT TCG CAG GCG TAG ACT T 3' (SEC ID nº 44), CG1z: 5' GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG 3' (SEC ID nº 45), CK1dx2: 5' AGA CAG TGA GCG CCG TCT AGA ATT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT TTG TGA CGG GCG AAC TCA G 3' (SEC ID nº 46).
Amplificación lineal de 2ª hebra de cadena ligera y extensión con el oligonucleótido anidado
Se usó ADNc de 1ª hebra digerido con Sac I como el molde original para montar múltiples reacciones de ADNc de 2ª hebra usando un cebador específico del marco 1 (0,4 uM final), los dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). Los cebadores se diseñaron para que contuviesen la secuencia TMX24K predeterminada 5'GAC GAC CG G CTA CCA AGA GGA GTG3' (SEC ID nº 47) para kappa, un sitio de restricción Xba I, y una región que se hibridó a ADNc de 1ª hebra en la región del marco 1 de los genes de cadena ligera kappa de anticuerpos humanos. Esas secuencias de hibridación derivaron de los cebadores de la base de datos VBase (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html) que se diseñaron basándose en las secuencias conocidas de anticuerpos humanos, y se afirma que cubren todo el repertorio de anticuerpos humanos de genes de cadena ligera
kappa.
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Cebadores específicos del marco 1 de la cadena ligera kappa:
101
102 
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En las secuencias anteriores, R es una mezcla por igual de A y G, M es una mezcla por igual de A y C, Y es una mezcla por igual de C y T, W es una mezcla por igual de A y T, y S es una mezcla por igual de C y G.
Las muestras se desnaturalizaron por calor a 94ºC durante 1 minuto, después se sometieron 20 veces a ciclos desde 94ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 2 minutos. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. El oligonucleótido anidado denominado "TMX24CKnpt" para las cadenas kappa se añadió en hielo hasta una concentración final de 0,2 uM. "TMX24CKnpt" contiene la secuencia predeterminada TMX24K, y la secuencia fue 5' GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG CTC GAG CTC AGG CCC TGA TGG GTG ACT TCG CT 3' (SEC ID nº 61). Los ADNc de 2ª hebra se alargaron posteriormente desde el oligonucleótido anidado desnaturalizando por calor a 94ºC durante 1 minuto, hibridando y alargando a 68ºC durante 2 minutos, seguido de 4ºC. El ADNc de 2ª hebra resultante (molde modificado mediante ingeniería genética) se limpió usando una columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Esta etapa elimina los oligonucleótidos libres y permite el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo.
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Amplificación con cebador único (SPA) de la cadena ligera
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplificó usando la mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, los dNTP, y el cebador "TMX24K" para las cadenas kappa. La secuencia para "TMX24K" es 5'GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG 3' (SEC ID nº 62). Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 30 veces a ciclos desde 90ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. Esto fue seguido de 3 minutos adicionales a 68ºC y un mantenimiento a 4ºC.
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Clonación de la cadena ligera
Los productos de la amplificación de kappa se purificaron en gel y después se digirieron mediante Xba I y Sac I. Los insertos se clonaron en un vector de expresión adecuado que contiene la porción restante de la región constante de la cadena ligera kappa. El producto ligado se introdujo en una E. coli mediante electroporación, y se hizo crecer toda la noche a 37ºC. A la mañana siguiente se preformó una preparación DNA maxi prep (QIAGEN) para recuperar el ADN de la librería de cadena ligera. El ADN de la librería de cadena ligera se usó entonces en etapas subsiguientes para clonar en los fragmentos Fd de cadena pesada mediante Xho I/Age I para completar la construcción de la
librería.
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Amplificación lineal de 2ª hebra de cadena pesada y extensión con oligonucleótido anidado
Se usó ADNc de 1ª hebra digerido con ApaL I como el molde original para montar múltiples reacciones de ADNc de 2ª hebra usando un cebador específico del marco 1 (0,4 uM final), los dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). Los cebadores se diseñaron para contener la secuencia TMX24 predeterminada, un sitio de restricción Xho I, y una región que se hibridó al ADNc de 1ª hebra en la región del marco 1 de los genes de cadena pesada de anticuerpos humanos. Esas secuencias de hibridación derivaron de los cebadores de las bases de datos VBase que se diseñaron basándose en las secuencias conocidas de anticuerpos humanos y se afirma que cubren todo el repertorio de anticuerpos humanos de genes de cadena pesada.
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Cebadores específicos del marco 1 de la cadena pesada:
103
En las secuencias anteriores, R es una mezcla por igual de A y G, K es una mezcla por igual de G y T, y S es una mezcla por igual de C y G.
Las muestras se desnaturalizaron por calor a 94ºC durante 1 minuto, después se sometieron 20 veces a ciclos desde 94ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 2 minutos. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. Se añadió sobre hielo hasta una concentración final de 0,2 uM un oligonucleótido anidado denominado "TMX24CGnpt" (secuencia 5' GTG CTG GCC GTT GGA AGA GGA GTG TGT TTG CAC GCC GCT GGT CAG RGC GCC TGA GTT G 3' (SEC ID nº 77)). Como se muestra en la figura 1 para el oligonucleótido anidado de IgM, los tres nucleótidos 3' terminales se modificaron para evitar la extensión del oligonucleótido. Los ADNc de 2ª hebra se alargaron adicionalmente a partir del oligonucleótido anidado desnaturalizando por calor a 94ºC durante 1 minuto, hibridando y alargando a 68ºC durante 2 minutos, seguido de 4ºC. El ADNc de 2ª hebra (el molde modificado mediante ingeniería genética) resultante se limpió entonces usando una columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Esta etapa eliminó los oligonucleótidos libres y permitió el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo.
Amplificación con cebador único (SPA)
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplificó usando la mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, los dNTP, y el cebador "TMX24". Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, después se sometieron 30 veces a ciclos desde 95ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. Esto fue seguido de 3 minutos adicionales a 68ºC y un mantenimiento a 4ºC.
Clonación de la cadena pesada y producción de la librería
Los productos amplificados se reunieron y después se purificaron en gel. El ADN se recuperó con el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN). El ADN se digirió secuencialmente con enzimas de restricción Xho I y Age I, y después se purificó en gel. El sitio Age I está presente de forma natural en el CH1 de la región constante de IgG corriente arriba del sitio ApaL I. El ADN se recuperó con el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN).
El ADN de la librería de cadena ligera se digirió secuencialmente con Xho I y Age I, y después se purificó en gel. El ADN de librería de cadena ligera se ligó con los fragmentos de cadena pesada. El ADN ligado se colocó sobre una columna spin (Kit de Purificación de PCR, QIAGEN) para eliminar el tampón de reacción y para concentrar el ADN. La transformación final se realizó en células XL-1 Blue (Stratagene) electrocompetentes.
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Colocación en bandeja e identificación de la librería en HBs Ag
La librería se colocó en bandeja sobre HBs Ag inmovilizado, durante 4 rondas esencialmente como se describe en Barbas III, CF, Burton, DR, Scott, JK, y Silverman, GJ (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Los clones individuales procedentes de las rondas 2ª, 3ª y 4ª de la colocación en bandeja se identificaron mediante ELISA sobre HBs Ag.
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Síntesis de ADNc de 1ª hebra y modificación para la cadena ligera lambda
Se usó ARNm de PBL humano procedente de un donante vacunado contra la hepatitis B para generar el ADNc de 1ª hebra tradicional con un cebador oligo dT. Esto se realizó usando la Síntesis de Primera Hebra SuperScript para RT-PCR (INVITROGEN LIFE TECHNOLOGIES) según esencialmente las instrucciones del kit. Se añadió oligonucleótido de restricción "CLSma I" al ADNc de 1ª hebra, a fin de generar una región de ADN bicatenario que se pudiese digerir mediante la endonucleasa de restricción Sma 1. La secuencia de "CLSma I" es 5'GAC TTC TAC CCG GGA GCY GTG3' (SEC ID nº 78), en la que Y es una mezcla de C y T. La reacción se montó con ADNc de 1ª hebra, 1 uM de oligonucleótido, y una cantidad apropiada de tampón de restricción A 10X (Roche Diagnostics). La muestra se calentó hasta 95ºC durante 2 minutos, y después se mantuvo a 64ºC durante dos minutos para permitir que se produjese la hibridación específica, y se enfrió hasta 37ºC. Se añadió la endonucleasa de restricción Sma I (New England Biolabs) y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La enzima de restricción se inactivó por calor a 65ºC, y después la muestra se enfrió hasta 4ºC.
La digestión del ADNc de 1ª hebra mediante la endonucleasa de restricción se verificó mediante amplificación por PCR usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estos productos no se usaron para clonar los genes de anticuerpos. Se observó amplificación positiva del ADNc de 1ª hebra digerido en reacción que usa el cebador de control interno 5'VBVL1a y 3'CL0. Una buena amplificación con los cebadores 5'VBVL1a/3'CL0 y una amplificación mínima con los cebadores 5'VBVL1a/3'CL2dx2 indicaron la digestión con éxito del molde de ADNc de 1ª hebra con Sma I. Las secuencias de los cebadores para la PCR de comprobación fueron VBVL1a 5' GAC GCG CAC A AC ACG GAG CTC CAG TCT GTG CTG ACT CAG 3' (SEC ID nº 79), CL0 5'CCT CAG AGG AGG GYG GG A ACAG3' (SEC ID nº 80) y CL2dx2 5' AGA CAG TGA CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG 3' (SEC ID nº 81).
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Amplificación lineal de 2ª hebra de cadena ligera lambda y extensión con el oligonucleótido anidado
Se usó ADNc de 1ª hebra digerido con Sma I como el molde original para montar múltiples reacciones de ADNc de 2ª hebra usando un cebador específico del marco 1 (0,4 uM final), los dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). Los cebadores se designaron para que contuviesen la secuencia TMX24L predeterminada, un sitio Xba I, y una región que se hibrida al ADNc de 1ª hebra en la región del marco de genes de cadena ligera lambda de anticuerpos humanos. Estas secuencias de hibridación derivan de los cebadores de la base de datos VBase (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html) que se diseñan basándose en las secuencias conocidas de anticuerpos humanos y se afirma que cubren todo el repertorio de anticuerpos humanos de genes de cadena ligera lambda. Los cebadores específicos del marco 1 de la cadena ligera lambda son los usados en el Ejemplo 4. Las muestras se desnaturalizaron por calor a 94ºC durante 1 minuto, y después se sometieron a ciclos 20 veces desde 94ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 2 minutos. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. Se añadió sobre hielo un oligonucleótido anidado denominado "TMX24CLnpt" como se muestra en el Ejemplo 4, hasta una concentración final de 0,2 uM. Como se muestra en la figura 7 para el oligonucleótido anidado de IgM "TMX24CMnpt", los nucleótidos 3' terminales de "TMX24CLnpt" se modifican para evitar la extensión del oligonucleótido. Los ADNc de 2ª hebra se alargaron adicionalmente a partir del oligonucleótido anidado desnaturalizando por calor a 94ºC durante 1 minuto, hibridando y alargando a 68ºC durante 2 minutos, seguido de 4ºC. Los ADNc de 2ª hebra (el molde modificado mediante ingeniería genética) resultantes se limpiaron usando el Kit de Purificación de PCR (QIAGEN). Esta etapa elimina los oligonucleótidos libres y permite el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo.
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Amplificación con cebador único (SPA) de cadena ligera lambda
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplificó usando la mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, los dNTP, y el cebador "TMX24L". La secuencia predeterminada de TMX24L es 5'GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA CAG3' (SEC ID nº 82). Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 30 veces a ciclos desde 95ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. Esto fue seguido de 3 minutos adicionales a 68ºC y un mantenimiento a 4ºC.
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Clonación de la cadena ligera lambda
Los productos de la amplificación de la cadena ligera lambda se limpiaron mediante el kit de purificación de PCR (QIAGEN), y se digirieron mediante Xba I y Sac I. El inserto se purificó en gel usando un kit de extracción en gel (QIAGEN), y se clonó en un vector apropiado que contiene la porción restante de la región constante de la cadena ligera lambda. El producto ligado se introdujo en una E. coli mediante electroporación, y se hizo crecer toda la noche a 37ºC. A la mañana siguiente se llevó a cabo una DNA maxi prep (QIAGEN) para recuperar el ADN de la librería de cadena ligera lambda.
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Clonación de la cadena pesada y producción de la librería lambda de IgG
El ADN de la librería de cadena ligera lambda preparado anteriormente se digirió secuencialmente mediante Xho I y Age I para la inserción de los fragmentos Fd de cadena pesada preparados también para la librería kappa de IgG como se describe previamente. El producto ligado se introdujo entonces en una E. coli mediante electroporación, y se hizo crecer toda la noche a 37ºC. A la mañana siguiente se llevó a cabo una DNA maxi prep (QIAGEN) para recuperar el ADN de la librería lambda de IgG.
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Colocación en bandeja e identificación de la librería sobre HBs Ag
La colocación en bandeja y la identificación se llevaron a cabo como se describió previamente para la librería kappa de IgG. Análisis de secuenciación de ADN y caracterización de Fabs aislados Se analizaron mediante secuenciación de ADN clones que mostraron unión específica a HBsAg y unión mínima a una proteína no específica, ovoalbúmina, mediante identificación por ELISA. Véanse las figuras 8a-e. Se aisló un total de 38 Fabs kappa de IgG distintos (25 cadenas pesadas y 37 cadenas ligeras) y 17 Fabs lambda de IgG distintos (13 cadenas pesadas y 16 cadenas ligeras) para HBsAg a partir de las librerías obtenidas del ARNm de PBL procedente de un donante vacunado contra la hepatitis B.
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Ejemplo 4
Construcción de una librería de anticuerpos que presentan fagos a partir de ARNm de PBL humano.
Síntesis de ADNc de 1ª hebra y modificación para cadenas ligeras
Se usó ARNm de PBL humano procedente de donante para generar ADNc de 1ª hebra tradicional con un cebador oligo dT usando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript para RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) esencialmente según las instrucciones del kit. Las reacciones de cadena ligera kappa y lambda se montaron separadamente. Se añadió oligonucleótido de restricción "CKSac I" o "CLSma I" al ADNc de 1ª hebra, a fin de generar una región de ADN bicatenario que se pudiese digerir mediante la endonucleasa de restricción Sac I para kappa o Sma I para las cadenas ligeras lambda. Puesto que hay múltiples regiones constantes lambda (C1, C2, C3, y C6), es importante señalar que el sitio Sma I se conserva entre todos los dominios constantes de lambda funcionales (C1, C2, C3, y C6). La secuencia "CKSac I" es 5'AGG GCC TGA GCT CGC CCG TC 3' (Seq ID No. 179), la secuencia "CLSma I" es 5' GAC TTC TAC CCG GGA GCY GTG 3' (Seq ID No. 180), en la que Y es una mezcla de C y T. Las reacciones se montaron con ADNc de 1ª hebra y 1 uM de oligonucleótido. La muestra se calentó hasta 95ºC durante 2 minutos, y después se mantuvo a 64ºC durante dos minutos para permitir que se produjese la hibridación específica. Se añadió a las muestras una cantidad apropiada de tampón de restricción A 10X (Roche Diagnostics), y se enfrió adicionalmente hasta 37ºC. Se añadió la endonucleasa de restricción Sac I o Sma I (New England Biolabs) y se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La enzima de restricción se inactivó por calor a 65ºC durante 20 minutos, y después la muestra se enfrió hasta 4ºC.
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Amplificación lineal de 2ª hebra de cadena ligera y extensión a partir del oligonucleótido anidado
Se usó ADNc de 1ª hebra de kappa digerido con Sac I o ADNc de 1ª hebra de lambda digerido con Sma I como los moldes originales para montar múltiples reacciones de ADNc de 2ª hebra usando un cebador específico del marco 1 (0,4 uM final), los dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). Los cebadores se diseñaron para que contuviesen la secuencia TMX24K (para kappa) o TMX24L (para lambda), un sitio de restricción Xba I, y una región que se hibridó a ADNc de 1ª hebra en la región del marco 1 de los genes de cadena kappa o lambda de anticuerpos humanos. Esas secuencias de hibridación derivan de los cebadores de la base de datos VBase (www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html) que se diseñan basándose en las secuencias conocidas de anticuerpos humanos y se afirma que cubren todo el repertorio de anticuerpos humanos de genes de cadena ligera. Los cebadores específicos del marco 1 de la cadena ligera kappa son los usados en el Ejemplo 3. Véase la siguiente lista de cebadores para uso en la amplificación de lambda.
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Cebadores específicos del marco 1 de la cadena ligera lambda:
104
En las siguientes secuencias, R es una mezcla por igual de A y G, M es una mezcla por igual de A y C, Y es una mezcla por igual de C y T, W es una mezcla por igual de A y T, y S es una mezcla por igual de C y G.
Las muestras se desnaturalizaron por calor a 94ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 20 veces a ciclos desde 94ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 2 minutos. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. Se añadió sobre hielo un oligonucleótido anidado denominado "TMX24CKnpt" para cadenas kappa, o "TMX24CLnpt" para cadenas lambda, hasta una concentración final de 0,2 uM. Las secuencias de los oligonucleótidos anidados son: "TMX24CKnpt" 5' GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG CTC GAG CTC AGG CCC TGA TGG GTG ACT TCG CT 3' (SEC ID nº 196) y "TMX24CLnpt" 5' GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA CAG AAG AGC TCC TGG GTA GAA GTC ACT KAT SAG RCA CAG 3' (SEC ID nº 197). Como se muestra en la figura 7 para el oligonucleótido anidado de IgM, los tres nucleótidos 3' terminales se modifican para evitar la extensión del oligonucleótido. Los ADNc de 2ª hebra se alargaron adicionalmente a partir de los oligonucleótidos anidados desnaturalizando por calor a 94ºC durante 1 minuto, hibridando y alargando a 68ºC durante 2 minutos, seguido de 4ºC. Los ADNc de 2ª hebra (los moldes modificados mediante ingeniería genética) resultantes se limpiaron usando la columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Esta etapa elimina los oligonucleótidos libres y permite el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo.
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Amplificación con cebador único (SPA) de la cadena ligera
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplifica usando la mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, los dNTP, y el cebador "TMX24K" para las cadenas kappa o "TMX24L" para las cadenas lambda. La secuencia para "TMX24K" es 5' GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA GTG 3' (SEC ID nº 198), y para "TMX24L" es 5' GAC GAC CGG CTA CCA AGA GGA CAG 3' (SEC ID nº 199). Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 30 veces a ciclos desde 95ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. A esto le siguieron 3 minutos adicionales a 68ºC, y un mantenimiento a 4ºC.
Clonación de la cadena ligera
Los productos de la amplificación de kappa y lambda se limpiaron usando un kit de purificación de PCR (QUIAGEN), y se purificaron separadamente en gel. Esos productos se digirieron mediante Xba I y Sac I. Los insertos se clonaron en un vector apropiado que contiene la porción restante de la región constante de la cadena ligera respectiva. El producto ligado se introdujo en E. coli mediante electroporación, y se hizo crecer toda la noche a 37ºC. A la mañana siguiente se llevó a cabo una DNA maxiprep para recuperar el ADN de la librería de cadena ligera. Las preps de ADN de la librería de cadena ligera se usan como el vector de clonación para la inserción de los fragmentos Fd de cadena pesada mediante Xho I/EcoR I para completar la construcción de la librería.
Síntesis de ADNc de 1ª hebra y modificación para cadenas pesadas
Se usó ARNm de PBL humanos procedente de un donante para generar ADNc de 1ª hebra tradicional con un cebador oligo dT. Esto se realizó usando el Sistema de Síntesis de Primera Hebra SuperScript para RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) esencialmente según sus instrucciones. Se añadió oligonucleótido de restricción CMDra III al ADNc de primera hebra, a fin de generar una región de ADN bicatenario que se pudiese digerir mediante la endonucleasa de restricción Dra III. La reacción se montó con ADNc de primera hebra y 1 uM de oligonucleótido. La muestra se calentó hasta 95ºC durante 2 minutos y después se mantuvo a 64ºC durante dos minutos para permitir que se produjese la hibridación específica. Se añadió a la muestra una cantidad apropiada de tampón de restricción H 10X (Roche Diagnostics), y se enfrió adicionalmente hasta 37ºC. Se añadió la endonucleasa de restricción Dra III (New England Biolabs), y se incubó a 37ºC durante 30 minutos, seguido del enfriamiento a 4ºC.
La digestión de los ADNc de 1ª hebra mediante Dra III se verificó mediante amplificación por PCR. Los productos de la amplificación no se usarán para clonar fragmentos de anticuerpos. Se observa amplificación positiva del ADNc de 1ª hebra digerido en reacciones usando el cebador de control interno 5' VBVH1a y 3' CM0 en dos condiciones de tampón diferentes. Una buena amplificación con los cebadores 5' VBVH1a/3' CM0 y una amplificación mínima con los cebadores 5' VBVH1a/3' CM1 indican una digestión con éxito del molde de ADNc de 1ª hebra con Dra III.
Amplificación lineal de 2ª hebra de cadena pesada y extensión con oligonucleótido anidado
Se usó ADNc de 1ª hebra digerido con Dra III como el molde original para montar múltiples reacciones de ADNc de 2ª hebra usando un cebador específico del marco 1 (0,4 uM final), los dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). Los cebadores se diseñaron para que contuviesen la secuencia TMX24, un sitio de restricción Xho I, y una región que se hibridó al ADNc de 1ª hebra en la región del marco 1 de los genes de cadena pesada de anticuerpos humanos. Esas secuencias de hibridación derivan de los cebadores de la base de datos VBase que se diseñan basándose en las secuencias conocidas de anticuerpos humanos y se afirma que cubren todo el repertorio de anticuerpos humanos de genes de cadena pesada como se describe anteriormente en el ejemplo 3. Los cebadores específicos del marco 1 de cadena pesada son los enumerados en el ejemplo 3.
Las muestras se desnaturalizaron por calor a 94ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 20 veces a ciclos desde 94ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 2 minutos. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. Se añadió un oligonucleótido anidado, denominado "TMX24CMnpt" (como se usó en el Ejemplo 3), sobre hielo hasta una concentración final de 0,2 uM. Los ADNc de 2ª hebra se alargaron adicionalmente a partir del oligonucleótido anidado desnaturalizando por calor a 94ºC durante 1 minuto, hibridando y alargando a 68ºC durante 2 minutos, seguido de 4ºC. El ADNc de 2ª hebra (molde modificado mediante ingeniería genética) resultante se limpió entonces usando una columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Esta etapa eliminó los oligonucleótidos libres y permitió el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo.
Amplificación con cebador único (SPA) de cadena pesada
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplificó usando la mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, los dNTP, y el cebador "TMX24". Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 30 veces a ciclos desde 95ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. A esto le siguieron 3 minutos adicionales a 68ºC y un mantenimiento a 4ºC.
Clonación de la cadena pesada y producción de la librería
Los productos de amplificación de aproximadamente 500 pb se purificaron en gel, y entonces se digirieron mediante Xho I y EcoR 1. Los insertos se clonaron en un vector apropiado que contiene la porción restante del dominio CH1 de IgM. El producto ligado que contiene una librería de Fab se introdujo en E. coli mediante electroporación.
A fin de producir la librería de Fab sobre la superficie del bacteriófago, se usó una cepa supresora de células tales como XL1BLUE (Stratagene). Tras la electroporación, las células se agitaron durante 1 hora a 37º, y después se añadió carbenicilina hasta 20 ug/ml. Después de agitar una hora a 37ºC, la carbenicilina se incrementó hasta 50 ug/ml durante una hora adicional a 37ºC. Entonces se añadió el fago auxiliar VCS-M13 (Stratagene) para proporcionar todos los componentes necesarios para la generación de partículas fagémidas, y el volumen del cultivo se incrementó hasta 100 ml de medio SB. Después de una hora a 37ºC, se añadió canamicina hasta 70 ug/ml para seleccionar las bacterias que contienen ADN del fago auxiliar. El cultivo se agitó a 37º toda la noche. Durante ese tiempo las bacterias produjeron nuevas partículas fagémidas que tienen Fab presentado sobre su superficie. A la siguiente mañana, las partículas fagémidas se pueden aislar haciendo girar las células bacterianas y precipitando entonces las partículas fagémidas del sobrenadante con 4% de PEG 8000 y NaCl 0,5 M sobre hielo durante 30 minutos. El fago precipitado forma un pelete al centrifugarlo a 14.300 xg. El pelete se puede resuspender en PBS/1% de BSA. La preparación se puede filtrar para eliminar el desecho bacteriano. La librería resultante se almacena a 4º.
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Ejemplo 5
Construcción de una librería de presentación fagémida a partir de ARNm de ratones inmunizados con IgE o un CH2\sim4 de Fc de IgE recombinante.
Síntesis de ADNc de 1ª hebra y modificación para las cadenas pesada y ligera kappa de IgG
Se usó ARNm de bazo de ratón procedente de ratones inmunizados con IgE humano o IgE humano recombinante para generar ADNc de 1ª hebra tradicional con un cebador de oligo dT. Esto se realizó usando Síntesis de Primera Hebra SuperScript para RT-PCR (Invitrogen Life Technologies) esencialmente según las instrucciones del kit. Se añadió al ADNc de 1ª hebra oligonucleótido de restricción "mCG1Xcm I" para IgG1, "mCG2aBsaJ I" para IgG2a, o "mCKHpa I" para la cadena ligera kappa, a fin de generar una región de ADN bicatenario que se pudiese digerir mediante la endonucleasa de restricción Xcm I para IgG1, BsaJ I para IgG2a, o Hpa I para la cadena ligera kappa. Las secuencias de "mCG1Xcm I" es 5'CTAACTCCAT GGTGACCCTGGGATG3' (SEC ID nº 200). La secuencia de "mCG2aBsaJ I" es 5'CAACTGGCTCCTCGGT GACTCTAG3' (SEC ID nº 201), la secuencia de "mCKHpa I" es 5'CAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGG3' (SEC nº 202). La reacción se montó con ADNc de 1ª hebra, 1 uM de oligonucleótido, y una cantidad apropiada de tampón NE 10x (New England Biolab) o tampón de restricción A 10X (Roche Diagnostics). La muestra se calentó hasta 95ºC durante 2 minutos, y después se mantuvo a 64ºC durante dos minutos para permitir que se produjese la hibridación específica, y se enfrió hasta 37ºC para Xcm I y Hpa I, y 60ºC para BsaJ I. La endonucleasa de restricción Xcm I, BsaJ I, o Hpa I (New England Biolabs) se añadió y se incubó a 37ºC durante 30 minutos, 60ºC durante 30 minutos, y 37ºC durante 10 minutos, respectivamente. La enzima de restricción se inactivó por calor para Xcm I a 65ºC durante 20 minutos, y para BsaJ I a 80ºC durante 20 minutos, y después la muestra se enfrió hasta 4ºC.
La digestión de los ADNc de 1ª hebra mediante cada endonucleasa de restricción se verificó mediante amplificación por PCR usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Estos productos no se usaron para la clonación de los genes de anticuerpos. Se observó amplificación positiva del ADNc de 1ª hebra digerido en reacciones que usan el cebador de control interno 5' TMX24mVHIIBshort y el 3' mCG1 para IgG1, el cebador de control interno 5' TMX24mVHIIBshort y el 3' mCG2a para IgG2a, y el cebador de control interno 5' TMX24mVKIVshort y el 3' mCK0 para kappa. Una buena amplificación con los cebadores 5' TMX24mVHIIBshort/3' mCG1 o los cebadores 5' TMX24mVHIIBshort / 3' mCG2a o 5' TMX24mVKIVshort/3' mCK0, y una amplificación mínima con los cebadores 5' TMX24mVHIIBshort/3' mCGIB o 5' TMX24mVHIIBshort/3' mCG2aB o 5' TMX24mVKIVshort/3' mCKB indican una digestión exitosa del molde de ADNc de 1ª hebra con cada endonucleasa de restricción. Las secuencias de los cebadores usados para la PCR de comprobación fueron
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Amplificación lineal de 2ª hebra de cadena ligera y extensión con oligonucleótido anidado
Se usó ADNc de 1ª hebra digerido con Hpa I como el molde original para montar múltiples reacciones de ADNc de 2ª hebra usando un cebador específico del marco 1 (0,4 uM final), dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). Los cebadores se diseñaron para contener la secuencia TMX24mK para kappa, una sitio de restricción Xba I, y una región que se hibridó a ADNc de 1ª hebra en la región del marco 1 de genes de cadena ligera kappa de anticuerpos de ratón. Esas secuencias de hibridación se diseñaron basándose en las secuencias conocidas de anticuerpos de ratón derivados de la base de datos Kabat (http://immuno.bme.nwu.edu/) para cubrir todo el repertorio de anticuerpos de ratón de genes de cadena ligera kappa.
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D. Cebadores específicos del marco 1 de kappa:
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en los que R es una mezcla por igual de A y G, M es una mezcla por igual de A y C, K es una mezcla por igual de G y T, W es una mezcla por igual de A y T, y S es una mezcla por igual de C y G.
Las muestras se desnaturalizaron por calor a 94ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 20 veces a ciclos desde 94ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 2 minutos. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. Se añadió sobre hielo un oligonucleótido anidado, denominado "TMX24mCKnoer", para las cadenas kappa hasta una concentración final de 0,2 uM. La secuencia de "TM24CKnpt" fue 5'GACGACCGGCTAC
CAAGAGGAGTGTCCGGATGTTAACTGCTCACTGGATGGT GGGAAGATGG2'OMe[A(ps)U(ps)U(ps)](propil) 3' (SEC ID nº 220). Los ADNc de 2ª hebra se alargaron adicionalmente desde el oligonucleótido anidado desnaturalizando por calor a 94ºC durante 1 minuto, hibridando y alargando a 68ºC durante 2 minutos, seguido de 4ºC. El ADNc de 2ª hebra resultante (molde modificado mediante ingeniería genética) se limpió usando la columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Esta etapa elimina los oligonucleótidos libres y permite el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo.
Amplificación con cebador único (SPA) de cadena ligera
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplificó usando la mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, los dNTP, y el cebador "TMX24mK" para las cadenas kappa. La secuencia para "TMX24mK" es 5'GACGACCGGCTACCAAGAGGAGTG3' (SEC ID nº 221). Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 25 veces a ciclos desde 95ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. A esto le siguieron 3 minutos adicionales a 68ºC, y un mantenimiento a 4º.
Clonación de la cadena ligera
Los productos de la amplificación de kappa se purificaron en gel y se digirieron entonces mediante XbaI y BspE I. Los insertos se clonaron en un vector de expresión adecuado que contiene la porción restante de la región constante de cadena ligera kappa. El producto ligado se introdujo en E. coli mediante electroporación y se hizo crecer toda la noche a 37ºC. A la mañana siguiente se llevó a cabo un DNA maxiprep para recuperar el ADN de la librería de la cadena ligera. El ADN de la librería de la cadena ligera se usó en etapas subsiguientes para la clonación en los fragmentos de Fd de cadena pesada mediante Xho I/Bln I para completar la construcción de la librería como se describe más abajo en Clonación de la Cadena Pesada.
Amplificación lineal de 2ª hebra de cadena pesada y extensión con oligonucleótido anidado
Los ADNc de 1ª hebra digeridos mediante Xcm I y BsaJ I se usaron para montar múltiples reacciones de ADNc de 2ª hebra usando un cebador específico del marco 1 (0,4 uM final), los dNTP, enzima AmpliTaq y su tampón de reacción 10X (Applied Biosystems). Los cebadores se diseñaron para que contuviesen la secuencia TMX24mH, un sitio de restricción Xho I, y una región que se hibridó a ADNc de 1ª hebra en la región del marco 1 de genes de cadena pesada de anticuerpos de ratón. Esas secuencias de hibridación se diseñaron basándose en las secuencias conocidas de anticuerpos de ratón derivadas de la base de datos Kabat (http://immuno.bme.nwu.edu/) para cubrir todo el repertorio de anticuerpos de ratón de genes de cadena pesada.
Cebadores específicos del marco 1 de la cadena pesada:
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en los que R es una mezcla por igual de A y G, M es una mezcla por igual de A y C, Y es una mezcla por igual de C y T, y S es una mezcla por igual de C y G.
Las muestras se desnaturalizaron por calor a 94ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 20 veces a ciclos desde 94ºC durante 5 segundos, 56ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 2 minutos. Esto permitió la amplificación lineal del ADNc de 2ª hebra. Se añadió un oligonucleótido anidado, "TMX24mCG1noer" para IgG1 y "TMX24mCG2anoer" para IgG2a, sobre hielo hasta una concentración final de 0,2 uM. La secuencia de "TMX24mCG1noer" fue 5'GACGT
GGCCGTTGGAAGAGGAGTGCCTAGGGTTACCATGGAGTTAGTTTGGGCAGCAGA2'OMe[U(ps)C(ps)A(ps)]
(propyl) 3' (SEC ID nº 230) y "TMX24mCG2anoer" fue 5'GACGTGGCCGTTGGAAGAGGAGTGCCTAGGGT
CATCGAGGAGCCAGTTGTATCTCCACA2'OMe[C(ps)A(ps)U(ps)](propil) 3' (SEC ID nº 231).
Los ADNc de 2ª hebra se alargaron adicionalmente a partir del oligonucleótido anidado desnaturalizando por calor a 94ºC durante 1 minuto, hibridando y alargando a 68ºC durante 2 minutos, seguido de 4ºC. El ADNc de 2ª hebra resultante (molde modificado mediante ingeniería genética) se limpió usando una columna QIAGEN spin (Kit de Purificación de PCR). Esta etapa elimina los oligonucleótidos libres y permite el intercambio simple de tampones para protocolos aguas abajo.
Amplificación con cebador único (SPA) de cadena pesada
El molde modificado mediante ingeniería genética se amplificó usando mezcla de polimerasas Advantage 2 (Clontech) y su tampón de reacción 10X, dNTP, y el cebador "TMX24mH" para cadenas pesadas. La secuencia para "TMX24mH" es 5' GACGTGGCCGTTGGAAGAGGAGTG 3' (SEC ID nº 232). Las muestras se desnaturalizaron por calor a 95ºC durante 1 minuto, y después se sometieron 28 veces a ciclos para IgG1 y 30 veces para IgG2a desde 95ºC durante 5 segundos y 68ºC durante 1 minuto. Esto fue seguido de 3 minutos adicionales a 68ºC y un mantenimiento a 4º.
Clonación de cadena pesada
Los productos de la amplificación de cadena pesada se purificaron en gel y se digirieron entonces mediante Xho I y Bin I. Los insertos se clonaron en ADN de librerías de cadena kappa que contienen la porción restante de la región constante de cadena pesada para IgG1 e IgG2a. El producto ligado se introdujo en E. coli mediante electroporación y se hizo crecer toda la noche a 37ºC. A la mañana siguiente se llevó a cabo un DNA maxiprep para recuperar el ADN de la librería de kappa IgG1 o IgG2a kappa.
Colocación en bandeja e identificación de librerías en CH2\sim4 de Fc de IgE recombinante
Las librerías se colocaron en bandejas en CH2\sim4 de Fc de IgE recombinante durante 4 rondas esencialmente como se describe en Barbas III, CF Burton, DR, Scott, JK, y Silverman, GJ (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Los clones individuales procedentes de las rondas 2ª, 3ª y 4ª de la colocación en bandeja se seleccionaron mediante ELISA sobre CH2\sim4 de Fc de IgE recombinante.
\newpage
Los clones que mostraron una unión específica a CH2\sim4 de Fc de IgE y una unión mínima a una proteína no específica, ovoalbúmina mediante ELISA se analizaron mediante secuenciación de ADN. Se aislaron de las librerías de ratones un total de 31 Fabs distintos para CH2\sim4 de Fc de IgE. Véanse las figuras 9a-d.
Se entenderá que se pueden realizar diversas modificaciones a las formas de realización descritas en la presente memoria. Por lo tanto, la descripción anterior no se debería interpretar como limitativa, sino meramente como ejemplo de formas de realización preferidas.

Claims (13)

1. Método para amplificar ácido nucleico, que comprende:
a)
hibridar un cebador a un molde, presentando el cebador una primera porción que se hibrida al molde y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde;
b)
sintetizar un polinucleótido que es complementario a la porción del molde entre la localización a la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y el extremo del molde, presentando el polinucleótido el cebador en un primer extremo del mismo y un segundo extremo;
c)
separar el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) del molde;
d)
hibridar un oligonucleótido molde al segundo extremo del polinucleótido sintetizado en la etapa (b), presentando el oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo del polinucleótido y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador;
e)
extender el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en el que dicho oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3'; y
f)
amplificar el polinucleótido extendido usando un cebador único que tiene la secuencia predeterminada.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de hibridar un oligonucleótido molde comprende proporcionar una colección de oligonucleótidos molde que tienen diferentes secuencias, y poner en contacto la colección de oligonucleótidos molde con el polinucleótido sintetizado en la etapa (b).
3. Método según la reivindicación 1, en el que el molde se digiere antes de hibridarse al cebador.
4. Método según la reivindicación 1, en el que el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) se digiere antes de hibridarlo al oligonucleótido molde.
5. Método para amplificar ácido nucleico, que comprende:
a)
hibridar un cebador y un oligonucleótido frontera a un molde, presentando el cebador una primera porción que se hibrida al molde y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida al molde, en el que el oligonucleótido frontera se une al molde en una posición corriente abajo del extremo 3' del cebador y terminará la extensión de cebador a lo largo del molde en aproximadamente la posición a la que se une el extremo 5' del oligonucleótido frontera;
b)
sintetizar un polinucleótido que es complementario a la porción del molde entre la localización en la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y la porción del molde a la que se hibrida el oligonucleótido frontera, presentando el polinucleótido el cebador en un primer extremo del mismo y un segundo extremo;
c)
separar el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) del molde;
d)
hibridar un oligonucleótido molde al segundo extremo del polinucleótido sintetizado en la etapa (b), presentando el oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo del polinucleótido y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador;
e)
extender el polinucleótido sintetizado en la etapa (b) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en el que dicho oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3'; y
f)
amplificar el polinucleótido extendido usando un cebador único que tiene la secuencia predeterminada.
\vskip1.000000\baselineskip
6. Método según la reivindicación 5, en el que la etapa de hibridar un oligonucleótido molde comprende proporcionar una colección de oligonucleótidos molde que tienen diferentes secuencias, y poner en contacto la colección de oligonucleótidos molde con el polinucleótido sintetizado en la etapa (b).
7. Método para producir una librería de anticuerpos, que comprende:
a)
proporcionar una población diversa de moldes;
\newpage
b)
poner en contacto la diversa población de moldes con por lo menos un cebador, presentando el por lo menos un cebador una primera porción que se hibrida a los moldes y una segunda porción de secuencia predeterminada que no se hibrida a los moldes;
c)
sintetizar polinucleótidos que son complementarios a la porción de los moldes entre la localización en la que la primera porción del cebador se hibrida al molde y el extremo de los moldes, presentando los polinucleótidos el cebador en un primer extremo del mismo y un segundo extremo;
d)
separar los polinucleótidos sintetizados en la etapa (c) de los moldes;
e)
hibridar por lo menos un oligonucleótido molde al segundo extremo de los polinucleótidos sintetizados en la etapa (c), presentando el por lo menos un oligonucleótido molde una primera porción que se hibrida al segundo extremo de los polinucleótidos y una segunda porción que tiene la misma secuencia predeterminada que la segunda porción del cebador;
f)
extender los polinucleótidos sintetizados en la etapa (c) para proporcionar una porción terminal del mismo que es complementaria a la secuencia predeterminada, en el que dicho por lo menos un oligonucleótido molde no se extiende en su extremo 3'; y
g)
amplificar los polinucleótidos extendidos usando un único cebador que tiene la secuencia predeterminada.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método según la reivindicación 1 ó 5, en el que el extremo 3' de dicho oligonucleótido molde no se hibrida al polinucleótido sintetizado en la etapa (b).
9. Método según la reivindicación 1 ó 5, en el que el extremo 3' de dicho oligonucleótido molde comprende bases modificadas que evitan la extensión en el extremo 3' de dicho oligonucleótido molde.
10. Método según la reivindicación 5, en el que el extremo 3' de dicho oligonucleótido frontera no se hibrida al molde.
11. Método según la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido frontera comprende un ácido nucleico bloqueado que evita la extensión en el extremo 3' de dicho oligonucleótido frontera.
12. Método según la reivindicación 7, en el que el extremo 3' de dicho por lo menos un oligonucleótido molde no se hibrida al polinucleótido sintetizado en la etapa (c).
13. Método según la reivindicación 7, en el que el extremo 3' de dicho por lo menos un oligonucleótido molde comprende bases modificadas que evitan la extensión en el extremo 3' de dicho oligonucleótido molde.
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