JP5758125B2 - 抗体ライブラリーを作製およびスクリーニングするための新規な方法 - Google Patents
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Description
a)一次プライマー(I)を、抗体の重鎖または軽鎖をコードする少なくとも1つのRNA(ここでは「センス」RNAと表す)を含むべき該RNA抽出物または混合物と接触させる工程(この一次プライマーは該「センス」RNAの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、該抗体の重鎖および/または軽鎖の定常領域Cをコードする配列に含まれる);
b)該一次プライマー(I)から、「アンチセンス」cDNAと表される一本鎖cDNAを合成する工程;
c)必要に応じて、工程a)でハイブリダイズされなかった一次プライマー(I)を除去する工程;
d)該「アンチセンス」cDNAを、その5’末端とその3’末端の間に共有結合を導入することによってアニーリングする工程;
e)「センス」二次プライマーと表される二次プライマー(II)を、工程d)で得られた「アンチセンス」環状cDNAと接触させる工程(この「センス」二次プライマー(II)は該「アンチセンス」環状cDNAとハイブリダイズすることができる);
f)該二次プライマー(II)から該「アンチセンス」cDNAを増幅させる工程;および
g)それにより増幅された「センス」相補的DNA直鎖を回収する工程
を含む。
h)「アンチセンス」三次プライマーと呼ばれる三次プライマー(III)を、工程g)で得られた「センス」直鎖DNAと接触させる工程(この「アンチセンス」三次プライマー(III)は該DNA直鎖の3’末端と5’末端の間に含まれる直鎖DNAの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、定常領域Cをコードするこの直鎖DNAの配列に相当する)
i)該三次プライマー(III)から、相補的「アンチセンス」DNA鎖の合成によりコンカテマーを作製する工程、および
j)それにより得られた二本鎖DNAコンカテマーを予め作製したベクター内にクローニングする工程
を含んでなる。
図1は、抗体の重鎖をコードする「センス」RNA鎖を示し(点線)、該RNAはこの例ではハイブリドーマから回収されたものである。最初に記載したように、このRNA鎖は精製されたものである。このRNA鎖は5’3’方向に、可変領域をコードする配列ならびに定常領域Cをコードする配列を含んでなる。より詳しくは、可変領域Vは、5’−UTR単位、シグナルペプチド(Ps)ならびにv、dおよびj遺伝子からなる。遺伝子vは可変遺伝子に相当し、遺伝子dは多様性遺伝子に相当し、遺伝子jは接合遺伝子に相当する。
I.RNAの精製
遠心分離により予め濃縮した5×106細胞のハイブリドーマから全RNAを単離し、細胞ペレットとして−80℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、RNAを単離するために変性させる。全RNAの単離にはMini Kit RNeasy(登録商標)(Qiagen)を用いる。全RNAの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するRLTバッファー600μLを加えることにより溶解した後、太さ20ゲージのニードルに6回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に600μLの容量の70%エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各600μlの2アリコートでRNeasyミニカラムに適用する。各適用の後に10,000gで15秒間の遠心分離を行う。このRNeasyミニカラムを500μLのRPEバッファー(Qiagen)で洗浄した後、10,000gで15秒間遠心分離する。次に、このRNeasyミニカラムを新しい遠沈管に移し、500μLのRPEバッファーを追加して洗浄した後、10,000gで2分間遠心分離する。次に、このミニカラムRNeasyを新しい遠沈管に入れ、このカラムにRNアーゼ/DNアーゼ不含水(Ambion)50μLを加える。このRNeasyミニカラムを再び10,000gで1分間遠心分離する。次に、精製された全RNAを260/280nmでの分光光度測定により定量した後すぐにcDNAの合成に用いる。
cDNAの合成は、鋳型としての全RNAと重鎖CHssDNAの遺伝子の特異的プライマー(5’PO4−AGC AGA CCC GGG GGC CAG TGG ATA GAC AG3’、配列番号1)または軽鎖VLssDNAの遺伝子の特異的プライマー(5’PO4−TCC AGA TGT TAA CTG CTC ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA TAC AG 3’、配列番号2)を用いることにより、逆転写スーパースクリプトIII(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、制限部位を天然に含むように、または親配列の若干の改変により制限部位の包含を可能とするように選択される。重鎖のプライマーの配列は、制限部位Xma Iを含むように改変される。軽鎖のプライマーの配列はそれに対して天然制限部位Hpa Iを含んでなる。cDNAの第一鎖の合成は、2.5μgの全RNA、1μLのdNTP混合物(各10mM、Ozyme)、遺伝子の特異的プライマー2μL(1μM、5’リン酸化、Eurogentec)を用いて行い、総て、DNアーゼ/RNアーゼ不含水(Ambion)で総量14μLとする。それにより得られた混合物を5分間65℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に4μLの5×「第一鎖バッファー」(Invitrogen)、1μLのDTT(1M)および1μLのスーパースクリプトIII(200U/μL)を加える。この反応混合物を次に55℃で1時間インキュベートし、これらの酵素を15分間70℃に加熱することにより不活性化する。
一本鎖cDNAを、cDNAの3’OH末端と5’PO4末端の間に共有結合を導入するリガーゼCircLigase(商標)(Epicentre)を用いてアニーリングする。PO4基は、cDNAの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に5’末端に予め導入された。アニーリング反応は16μLの精製cDNA、2μLの反応バッファー10×CircLigase(Epicentre)、1μLのATP(1mM)、1μLのCircLigase(100U/μL)を用いて行う。次に、反応物を60℃で1時間インキュベートした後、80℃で10分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をDNアーゼ/RNアーゼ不含水で50μLとし、これに250μLのPBバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をPCR精製キットマイクロ遠心カラムに移し、10,000gで1分間遠心分離する。このカラムを750μLのPEバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び10,000gで1分間遠心分離する。このカラムをもう一度10,000gで1分間遠心分離する。次にこれを新しい1.5mLのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に30μLのEB(10mM Tris−HCl pH8.0、Qiagen)を加えてcDNAを溶出し、全体を再び10,000gで1分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングcDNAを−20℃で保存する。
アニーリングした一本鎖cDNAを、増幅キットillustra TempliPHi(商標)(Amersham Biosciences)とcDNAの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は5μLのバッファーTempliPHi、0.5μLのアニーリングcDNAおよび0.25μLのセンスおよびアンチセンスプライマー(100μM、Sigma ProOligo)を用いて行う。これらのプライマーを表1に示す。
増幅の後、二本鎖DNAコンカテマーを、そのcDNAの合成に用いたオリゴヌクレオチドプライマーに適合する制限酵素で消化する。増幅された免疫グロブリンの重鎖を次のように消化する:7.5μLの増幅DNA、0.5μLのBSA 20×、1μLのバッファー4 10×(NEB)、1μLのXma I(NEB)。この混合物を37℃で4時間インキュベートした後、65℃で20分間酵素を不活性化する。増幅された免疫グロブリンの軽鎖は次のように消化する:7.5μの増幅DNA、0.5μLの水、1μLのバッファー4 10×(NEB)、1μLのHpa I(NEB)。この混合物を37℃で4時間インキュベートする。消化された重鎖および軽鎖を次に、それぞれ配列決定ベクターpUC18およびPGEM−Tにクローニングする。次に、クローニングされたDNAインサートを「BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit」(Applied Biosystems)とこれらの配列決定ベクターに相当するプライマーを用いて配列決定する。
ハイブリドーマから抗体の可変ドメインの配列を得るための標準的なアプローチは、該可変ドメインをPCRにより、センスプライマーとしてはシグナルペプチドに、そしてアンチセンスプライマーとしては、重鎖では定常ドメインCH1、軽鎖ではCκの5’に存在するプライマーを用いて増幅させることからなる。その抗体が由来する生物によって天然に用いられているシグナルペプチドの可能性のある既知の推定配列の総てとハイブリダイズすることができるように、通常用いられるセンスプライマーは縮重配列に相当することを述べておくべきであろう。
同様のアプローチを行い、同じ結果(示されていない)が得られた。
I.RNAの精製
遠心分離により予め濃縮した5×106細胞のハイブリドーマから全RNAを単離し、細胞ペレットとして−80℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、RNAを単離するために変性させる。全RNAの単離にはMini Kit RNeasy(登録商標)(Qiagen)を用いる。全RNAの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するRLTバッファー600μLを加えることにより溶解した後、太さ20ゲージのニードルに6回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に600μLの容量の70%エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各600μlの2アリコートでRNeasyミニカラムに適用する。各適用の後に10,000gで15秒間の遠心分離を行う。このRNeasyミニカラムを500μLのRPEバッファー(Qiagen)で洗浄した後、10,000gで15秒間遠心分離する。次に、このRNeasyミニカラムを新しい遠沈管に移し、500μLのRPEバッファーを追加して洗浄した後、10,000gで2分間遠心分離する。次に、このミニカラムRNeasyを新しい遠沈管に入れ、このカラムにRNアーゼ/DNアーゼ不含水(Ambion)50μLを加える。このRNeasyミニカラムを再び10,000gで1分間遠心分離する。次に、精製された全RNAを260/280nmでの分光光度測定により定量した後すぐにcDNAの合成に用いる。
cDNAの合成は、鋳型としての全RNAと重鎖IGHClpOの特異的プライマー(5’PO4−ACA AAC GCG TAT AGC CCT TGA CCA GGC ATC C3’、配列番号14)または軽鎖IGKpOの遺伝子の特異的プライマー(5’PO4−ACA AAC GCG TTG GTG GGA AGA TGG ATA CAG3’、配列番号15)を用いることにより、逆転写酵素スーパースクリプトIII(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、天然配列の5’末端に付加された制限部位Mlu Iを含んでなる。第一鎖cDNAの合成は、2.5μgの全RNA、1μLのDNTP混合物(各10mM、Ozyme)、遺伝子の特異的プライマー1μL(50μM、5’リン酸化、Eurogentec)を用いて行い、総て、DNアーゼ/RNアーゼ不含水(Ambion)で総量10μLとする。それにより得られた混合物を5分間65℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に4μLの5×「Prime Scriptバッファー」(Takara)、0.5μLのRNアーゼ阻害剤(40U/uL)、1μLのPrime Script RTase(200U/μL)を加えた後、20μlのH2Oで容量を整える。この反応混合物を次に50℃で1時間インキュベートし、これらの酵素を15分間70℃に加熱することにより不活性化する。
一本鎖cDNAを、cDNAの3’OH末端と5’PO4末端の間に共有結合を導入するリガーゼCircLigase(商標)(Epicentre)を用いてアニーリングする。PO4基は、cDNAの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に5’末端に予め導入された。アニーリング反応は1μLの精製cDNA、1μLの反応バッファー10×CircLigase(Epicentre)、1μLのATP(1mM)、1μLのCircLigase(100U/μL)および6μlのH2Oを用いて行う。次に、反応物を60℃で1時間インキュベートした後、80℃で10分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をDNアーゼ/RNアーゼ不含水で50μLとし、これに250μLのPBバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をPCR精製キットマイクロ遠心カラムに移し、10,000gで1分間遠心分離する。このカラムを750μLのPEバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び10,000gで1分間遠心分離する。このカラムをもう一度10,000gで1分間遠心分離する。次にこれを新しい1.5mLのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に30μLのEB(10mM Tris−HCl pH8.0、Qiagen)を加えてcDNAを溶出し、全体を再び10,000gで1分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングcDNAを−20℃で保存する。
アニーリングした一本鎖cDNAを、増幅キットillustra TempliPHi(商標)(Amersham Biosciences)とcDNAの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は4μLのH2O、0.5μLのアニーリングcDNAおよび0.5μLのセンスおよびアンチセンスプライマー(100μM、Sigma ProOligo)を用いて行う。これらのプライマーを表3に示す。
増幅の後、二本鎖DNAコンカテマーを、そのcDNAの合成に用いたオリゴヌクレオチドプライマーに適合する制限酵素で消化する。増幅された免疫グロブリンの重鎖を次のように消化する:8μLの増幅DNA、1μLのバッファー3 10×(NEB)、1μLのMlu I(NEB)。この混合物を37℃で4時間インキュベートした後、65℃で20分間酵素を不活性化する。増幅された免疫グロブリンの軽鎖は次のように消化する:8μの増幅DNA、1μLのバッファー3 10×(NEB)、1μLのMlu I(NEB)。この混合物を37℃で4時間インキュベートした後、65℃で20分間酵素を不活性化する。消化された重鎖および軽鎖を次に、それぞれ配列決定ベクターpGEM−Tにクローニングする。次に、クローニングされたDNAインサートを「BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit」(Applied Biosystems)とこれらの配列決定ベクターに相当するプライマーを用いて配列決定する。
1.RNAの精製
遠心分離により予め濃縮した5×106細胞のハイブリドーマから全RNAを単離し、細胞ペレットとして−80℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、RNAを単離するために変性させる。全RNAの単離にはMini Kit RNeasy(登録商標)(Qiagen)を用いる。全RNAの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するRLTバッファー600μLを加えることにより溶解した後、太さ20ゲージのニードルに6回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に600μLの容量の70%エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各600μlの2アリコートでRNeasyミニカラムに適用する。各適用の後に10,000gで15秒間の遠心分離を行う。このRNeasyミニカラムを500μLのRPEバッファー(Qiagen)で洗浄した後、10,000gで15秒間遠心分離する。次に、このRNeasyミニカラムを新しい遠沈管に移し、500μLのRPEバッファーを追加して洗浄した後、10,000gで2分間遠心分離する。次に、このミニカラムRNeasyを新しい遠沈管に入れ、このカラムにRNアーゼ/DNアーゼ不含水(Ambion)50μLを加える。このRNeasyミニカラムを再び10,000gで1分間遠心分離する。次に、精製された全RNAを260/280nmでの分光光度測定により定量した後すぐにcDNAの合成に用いる。
cDNAの合成は、鋳型としての全RNAと重鎖IGHClpOの特異的プライマー(5’PO4−ACA AAC GCG TAT AGC CCT TGA CCA GGC ATC C3’、配列番号14)または軽鎖IGKpOの遺伝子の特異的プライマー(5’PO4−ACA AAC GCG TTG GTG GGA AGA TGG ATA CAG3’、配列番号15)を用いることにより、逆転写酵素スーパースクリプトIII(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、制限部位を天然に含むように、または親配列の若干の改変により制限部位の包含を可能とするように選択される。重鎖および軽鎖のプライマーの配列は、5’末端に制限部位Mlu Iを含むように改変される。cDNAの第一鎖の合成は、2.5μgの全RNA、1μLのDNTP混合物(各10mM、Ozyme)、遺伝子の特異的プライマー2μL(50μM、5’リン酸化、Eurogentec)を用いて行い、総て、DNアーゼ/RNアーゼ不含水(Ambion)で総量14μLとする。それにより得られた混合物を5分間65℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に4μLの5×「第一鎖バッファー」(Invitrogen)、1μLのDTTおよびスーパースクリプトIII(200U/μL)を加える。この反応混合物を次に50℃で1時間インキュベートし、これらの酵素を15分間70℃に加熱することにより不活性化する。
第一鎖の合成が完了したところで、次にこれをPCR精製キット(Qiagen)で処理して組み込まれなかったプライマーを除去する。cDNAの合成は、DNアーゼ/RNアーゼ不含水50μLを加え、それに250μLのPBバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合することにより完了させる。次に、この混合物をPCR精製キットマイクロ遠心カラムに移した後、10,000gで1分間遠心分離する。このカラムを750μLのPEバッファー(Qiagen)で洗浄した後、10,000gで1分間遠心分離する。このカラムを再び10,000gで1分間遠心分離する。その後、これを1.5mLの新しいマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に30μLのEBバッファー(10mM Tris−HCl pH8.0、Qiagen)を加えてcDNAを溶出し、その後、全体を再び10,000gで1分間遠心分離する。その後、回収されたcDNAを−20℃で保存する。
一本鎖cDNAを、cDNAの3’OH末端と5’PO4末端の間に共有結合を導入するリガーゼCircLigase(商標)(Epicentre)を用いてアニーリングする。PO4基は、cDNAの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に5’末端に予め導入された。アニーリング反応は16μLの精製cDNA、2μLの反応バッファー10×CircLigase(Epicentre)、1μLのATP(1mM)、1μLのCircLigase(100U/μL)を用いて行う。次に、反応物を60℃で1時間インキュベートした後、80℃で10分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をDNアーゼ/RNアーゼ不含水で50μLとし、これに250μLのPBバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をPCR精製キットマイクロ遠心カラムに移し、10,000gで1分間遠心分離する。このカラムを750μLのPEバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び10,000gで1分間遠心分離する。このカラムをもう一度10,000gで1分間遠心分離する。次にこれを新しい1.5mLのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に30μLのEB(10mM Tris−HCl pH8.0、Qiagen)を加えてcDNAを溶出し、全体を再び10,000gで1分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングcDNAを−20℃で保存する。
アニーリングした一本鎖cDNAを、増幅キットillustra TempliPHi(商標)(Amersham Biosciences)とcDNAの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は5μLの水、0.5μLのアニーリングcDNAおよび0.5μLのセンスおよびアンチセンスプライマー(100μM、Sigma ProOligo)を用いて行う。これらのプライマーは上記の実施例3のものと同じであるので、表3に示されている。
本発明の種々の選択肢、すなわち、間接的アプローチおよび複合アプローチ(直接的アプローチとも呼ばれる)を実証するために、全重鎖に関して得られた配列のアライメントを、それぞれ両アプローチを用いて行った。
本発明に従ってクローニングされた抗体のスクリーニングを行うために、真核生物発現ベクターを、ヒト抗体の重鎖の定常部分のC末端にトランスメンブランドメイン(DTM)を含むように改変した。宿主細胞で発現された抗体が培養上清中ではもはや発現されずに細胞の表面で保持されるように、このDTMをIfG1型のヒト重鎖の定常ドメインとともにシスでクローニングした(図13)。Mlu Iによる制限およびDTMを含有するベクター中での連結により、それらの5’UTR部分とシグナルペプチドを含んでなる可変部分を定常ドメインとともにシスで挿入することができ、軽鎖は同様にDTMを含まないベクターにクローニングする(図13)。ネズミ抗体の重鎖および軽鎖の可変部分は発現ベクター中にヒト定常ドメイン:IgG1(重鎖)またはIgk(軽鎖)とともに、重鎖の場合にはDTMを伴ってシスでクローニングする。次に、宿主CHO細胞の、重鎖および軽鎖の発現ベクターでの同時トランスフェクションを、リポフェクタミンによるトランスフェクションにより行った。血清を含む増殖培地中での48時間の増殖時間の後、細胞をPBSで洗浄した。
本実施例では、限定されるものではないが、本発明の適用に好ましいプライマーの配列を一覧化する。
Claims (32)
- 抗体、または抗体の重鎖および/もしくは軽鎖をコードするRNAを発現することができる細胞由来のRNAの抽出物または混合物から、少なくとも1つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNA配列を作製する方法であって、少なくとも以下の工程:
a)一次プライマー(I)を、抗体の重鎖または軽鎖をコードする少なくとも1つのRNA(ここでは「センス」RNAと表す)を含み得る該RNA抽出物または混合物と接触させる工程(この一次プライマーは該「センス」RNAの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、このフラグメントは、該抗体の重鎖または軽鎖の定常領域Cをコードする配列に含まれる)であって、前記一次プライマー(I)が、定常領域Cに相当するセンスRNA配列の5’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である、工程;
b)該一次プライマー(I)から、「アンチセンス」cDNAと表される一本鎖cDNAを合成する工程;
d)該「アンチセンス」cDNAを、該cDNAの5’末端と3’末端の間に共有結合を形成することによってアニーリングする工程;
e)「センス」二次プライマーと表される二次プライマー(II)を、工程d)で得られた「アンチセンス」環状cDNAと接触させる工程(この「センス」二次プライマー(II)は、該「アンチセンス」環状cDNAとハイブリダイズすることができる);
f)該二次プライマー(II)から「センス」cDNAを増幅させる工程;および
g)工程f)で得られた増幅された「センス」相補的DNA直鎖を回収する工程を含んでなる、方法。 - 「アンチセンス」cDNAと表される一本鎖cDNAを合成する工程b)の後に、以下の工程:
c)工程a)で該RNAの配列のフラグメントとハイブリダイズされなかった一次プライマー(I)を除去する工程
をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 前記二次プライマー(II)が、前記「アンチセンス」cDNA配列の5’末端と、定常領域Cに相当する前記「アンチセンス」cDNAの配列の3’末端の間に含まれる配列に特異的である、請求項1または2に記載の方法。
- 前記二次プライマー(II)が、「アンチセンス」cDNA配列の5’末端に位置するか、または隣接する配列と特異的である、請求項3に記載の方法。
- 前記一次プライマー(I)が、20〜60ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖DNAの配列からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二次プライマー(II)が、10〜100ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖DNAの配列からなる、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二次プライマー(II)が、19〜100ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖DNAの配列からなる、請求項6に記載の方法。
- 一次プライマー(I)のハイブリダイゼーションのための工程a)の前に、RNAの変性のための工程を含んでなる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体を産生することができる前記細胞が、ハイブリドーマからなる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAが、脾細胞、結節またはBリンパ球に起源するRNAから選択される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAが、Bリンパ球に起源する、請求項10に記載の方法。
- 前記アニーリング工程が、「ssDNAリガーゼ」と表される一本鎖DNAの5’末端と3’末端を共有結合によって結合させることができるリガーゼと接触させることにより行われる、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガーゼが、CircLigase(商標)またはサーモファージssDNAから選択される、請求項12に記載の方法。
- 増幅工程f)が、一本鎖環状DNAの配列を増幅させることができる酵素とともに適用される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、BSE DNAポリメラーゼラージフラグメント、またはバクテリオファージφ29の「ローリングサークルポリメラーゼ」からなる、請求項14に記載の方法。
- 細胞由来のRNAの抽出物または混合物から、少なくとも1つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNA配列を配列決定するための方法であって、請求項1〜15のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNA配列を作製するための方法を適用すること、およびDNA配列を作製するための該方法の工程g)において回収された「センス」直鎖DNAを配列決定するための工程をさらに含んでなることを特徴とする、方法。
- 細胞由来のRNAの抽出物または混合物から、少なくとも1つの抗体の少なくとも1つの重鎖または軽鎖をコードするDNAのバンクを作製するための方法であって、請求項1〜16のいずれか一項に記載の少なくとも1つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNA配列を作製するための方法を適用すること、および以下の工程:
h)「アンチセンス」三次プライマーと表される三次プライマー(III)を、工程g)で得られた該「センス」直鎖DNAと接触させる工程(この「アンチセンス」三次プライマー(III)は、該「センス」DNA直鎖の3’末端と5’末端の間に含まれる「センス」直鎖DNAの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、定常領域Cをコードするこの「センス」直鎖DNAの配列に相当する)、
i)該三次プライマー(III)から、相補的「アンチセンス」DNA鎖の合成によりコンカテマーを作製する工程、および
j)工程i)で得られた二本鎖DNAコンカテマーを予め作製したベクター内にクローニングする工程
をさらに含んでなることを特徴とする、方法。 - 前記三次プライマー(III)が、定常領域Cに相当する「センス」直鎖DNAの配列の5’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である、請求項17に記載の方法。
- 工程j)の前に、用いられるプライマーに相当する配列においてコンカテマーをセグメント化することからなる工程をさらに含んでなる、請求項17に記載の重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするDNAのバンクを作製するための方法。
- 一次プライマー(I)が、制限部位を含んでなる、請求項19に記載の方法。
- コンカテマーをセグメント化するための前記工程j)が、一次プライマー(I)に含まれる制限部位の、特異的制限エンドヌクレアーゼによる酵素的消化により適用される、請求項19または20に記載の方法。
- 工程j)に用いられるベクターが、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインをコードする配列をさらに含んでなる、請求項17〜21のいずれか一項に記載の方法。
- 重鎖の定常ドメインをコードする前記配列が、膜アンカーを含む免疫グロブリン由来の配列、またはトランスメンブランC末端領域を含んでなる配列からなる、請求項22に記載の方法。
- 工程j)で得られたベクターで、該ベクター内に挿入された二本鎖DNAフラグメントによりコードされた抗体の重鎖または軽鎖を発現することができる宿主細胞をトランスフェクトするための工程k)をさらに含んでなる、請求項17〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 工程k)の前記宿主細胞が、細胞表面で、挿入された二本鎖DNAフラグメントによりコードされた抗体を発現することができる細胞である、請求項24に記載の方法。
- 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項25に記載の方法。
- 前記真核細胞が、CHO、COS、HEKおよびNIH−3T3細胞から選択される、請求項26に記載の方法。
- RNAの抽出物または混合物が由来する細胞が、ヒト起源である、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 抗体のライブラリーを作製するための、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 所定の疾病に対する活性抗体をイン・ビトロでスクリーニングするための方法であって、請求項24〜28のいずれか一項に記載の方法が該所定の疾患に罹患している患者の血液サンプルに適用される工程を含んでなる、方法。
- 前記所定の疾患が、癌である、請求項30に記載の方法。
- 請求項1〜15のいずれか一項の記載に従って細胞由来のRNAの抽出物または混合物から少なくとも1つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNA配列を作製すること、請求項16の記載に従って細胞由来のRNAの抽出物または混合物から少なくとも1つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするDNA配列を配列決定すること、または、請求項17〜28のいずれか一項の記載に従って細胞由来のRNAの抽出物または混合物から少なくとも1つの抗体の少なくとも1つの重鎖または軽鎖をコードするDNAのバンクを作製すること、を含んでなる、抗体のライブラリーを作製する方法。
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