JP4439262B2 - 操作されたテンプレートおよび単一プライマー増幅におけるそれらの使用 - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、米国仮出願第６０／３２３，４５５号（２００１年９月１９日出願）に対して優先権を主張する。

（技術分野）
本開示は、標的核酸配列の増幅に有用な操作されたテンプレートに関する。より詳細には、その反対の末端に相補配列を含むように操作されたテンプレートが、入れ子式（ｎｅｓｔｅｄ）オリゴヌクレオチド伸長反応（ＮＯＥＲ）により提供される。この操作されたテンプレートは、単一プライマー増幅（ＳＰＡ）により操作されたテンプレート内で標的核酸を増幅することを可能にする。特に有用な実施形態において、この操作されたテンプレート由来の標的配列は、発現ビヒクルにクローン化されて、例えば、抗体ライブラリーのような、ポリペプチドまたはタンパク質のライブラリーを提供する。

（関連技術の背景）
核酸増幅および増幅産物の検出の方法は、核酸配列の検出、同定、定量および配列解析において補助する。核酸増幅は、関連遺伝子由来の（例えば、抗体）ライブラリーの構築における重要な工程である。これらのライブラリーは、特定の所望の活性を有する抗体についてスクリーニングされ得る。核酸分析は、病原体の検出および同定、規定された表現型を生じる遺伝子変更の検出、遺伝的疾患または疾患に対する感受性の診断、疾患の発症における遺伝子発現および規定された刺激に応じた遺伝子発現の評価、ならびに種々のゲノムプロジェクトのために重要である。核酸増幅方法の他の適用としては、希少な細胞の検出、病原体の検出、および悪性疾患における変更された遺伝子発現の検出などが挙げられる。核酸増幅はまた、定性的分析（例えば、規定された核酸配列の存在の検出）および規定された遺伝子配列の定量（例えば、病原性配列の量の評価、ならびに遺伝子の増殖または欠失の決定、および正常細胞型から悪性細胞型への細胞の形質転換などにおいて有用）のために有用である。核酸配列における配列変更の検出は、遺伝子分析に関連する場合、変異体遺伝子型の検出、薬物耐性をもたらす変異の検出、薬理ゲノム学（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）などのために重要である。

核酸増幅の多くのバリエーションが存在する（例えば、指数関数的増幅、関連（ｌｉｎｋｅｄ）線形増幅、ライゲーションベースの増幅、および転写ベースの増幅）。指数関数的核酸増幅方法の一例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは、多数の刊行物に開示されている。例えば、Ｍｕｌｌｉｓら Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．ＥＰ２０１，１８４；Ｍｕｌｌｉｓら 米国特許第４，５８２，７８８号；Ｅｒｌｉｃｈら ＥＰ５０，４２４、ＥＰ８４，７９６、ＥＰ２５８，０１７、ＥＰ２３７，３６２；およびＳａｉｋｉ Ｒ．ら米国特許第４，６８３，１９４号を参照のこと。実際、このポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、最も一般的に使用される標的増幅方法である。ＰＣＲは、変性、２つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーの、標的鎖のそれぞれ反対の鎖へのハイブリダイゼーションおよびヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長の複数のサイクルに基づいて、標的配列の複数の二本鎖コピーを産生する。

単一プライマーを使用する増幅方法もまた、開示されている。例えば、米国特許第５，５０８，１７８号；同第５，５９５，８９１号；同第５，６８３，８７９号；同第５，１３０，２３８号；および同第５，６７９，５１２号を参照のこと。プライマーは、米国特許第５，７４４，３０８号に開示されるように、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラプライマーであり得る。

いくつかの増幅方法は、テンプレート切換え（ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）オリゴヌクレオチド（ＴＳＯ）およびブロックオリゴヌクレオチドを使用する。例えば、キメラＤＮＡプライマーが利用されるテンプレート切換え増幅は、米国特許第５，６７９，５１２号；同第５，９６２，２７２号；同第６，２５１，６３９号に開示され、そしてＰａｔｅｌら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：２９６９−２９７４（１９９６）により開示される。

しかし、以前に記載された標的増幅方法は、いくつかの欠点を有する。例えば、転写ベースの増幅方法（例えば、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）および転写媒介増幅（ＴＭＡ））は、ポリメラーゼプロモーター配列の、プライマーによる増幅産物への組込み（非特異的増幅を生じる傾向のあるプロセス）の必要性により制限される。現行の増幅方法の欠点の別の例は、異なる温度で最適な結合を有し得る２つの結合事象の要件、および天然に存在する配列を含むプライマーの使用である。この要因の組合せは、ミスプライミングおよび結果としての標的配列以外の配列の増幅の増加した可能性を生じる。

従って、これらの欠点を克服する改善された核酸増幅方法の必要性が存在する。本明細書中に提供される本発明は、この必要性を満たし、そしてさらなる利益を提供する。

（要旨）
核酸の新規な増幅方法がここで開示されており、この方法は、以下の工程：ａ）プライマーをテンプレート核酸配列にアニーリングする工程であって、このプライマーは、このテンプレートにアニーリングする第１の部分および所定の配列の第２の部分を有する、工程；ｂ）ポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは、このプライマーの第１の部分がテンプレートにアニーリングする位置と、テンプレートの末端（このポリヌクレオチドは、第１末端および第２末端を有する）との間のテンプレートの部分にアニーリングしかつ相補的であり、ここでこの第１末端がプライマーを組み込む、工程；ｃ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを、テンプレートから分離する工程；ｄ）入れ子式オリゴヌクレオチドを、工程（ｂ）で合成されたポリヌクレオチドの第２末端にアニーリングする工程であって、この入れ子式オリゴヌクレオチドは、このポリヌクレオチドの第２末端にアニーリングする第１の部分およびプライマーの第２部分と同じ所定の配列を有する第２部分を有する、工程；ｅ）工程（ｂ）で合成されたポリヌクレオチドを伸長して、所定の配列に相補的であるその末端部分を提供する工程；ならびにｆ）所定の配列を有する単一のプライマーを使用して伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程、を包含する。

代替の実施形態において、この方法は、以下の工程：プライマーおよび境界オリゴヌクレオチドを、テンプレート核酸配列にアニーリングする工程であって、このプライマーは、このテンプレートにアニーリングする第１部分および所定の配列の第２部分を有する、工程；ｂ）ポリヌクレオチドを合成する工程であって、このポリヌクレオチドは、このプライマーの第１部分がテンプレートにアニーリングする位置と、境界オリゴヌクレオチドがアニーリングするテンプレートの部分との間のテンプレートの部分に対してアニーリングしかつ相補的であり、このポリヌクレオチドが、第１末端および第２末端を有し、ここでこの第１末端が、プライマーを組み込む、工程；ｃ）工程（ｂ）で合成されたポリヌクレオチドを、テンプレートから分離する工程；ｄ）入れ子式オリゴヌクレオチドを、工程（ｂ）で合成されたポリヌクレオチドの第２末端へアニーリングする工程であって、この入れ子式オリゴヌクレオチドは、このポリヌクレオチドの第２末端へアニーリングする第１部分およびプライマーの第２部分と同じ所定の配列を有する第２部分を有する、工程；ｅ）工程（ｂ）で合成されたポリヌクレオチドを伸長して、所定の配列に対して相補的であるその終結部分を提供する工程；ならびにｆ）所定の配列を有する単一のプライマーを使用してこの伸長されたポリヌクレオチドを増幅する工程、を包含する。

その第１末端において所定の配列を有しそしてその他方の末端において所定の配列に相補的な配列を有する操作された核酸鎖自体が、本開示の新規な局面であることもまた企図される。

別の局面において、本開示は、核酸鎖を増幅する新規な方法を提供し、この方法は、その第１末端に所定の配列を有し、そしてその他方の末端に所定の配列に相補的な配列を有する操作された核酸鎖を提供する工程；ならびにポリメラーゼおよびヌクレオチドの存在下においてヌクレオチドの重合に適切な条件下で、この操作された核酸鎖を、所定の配列を有するプライマーと接触させる工程を包含する。

本明細書中に記載される増幅プロセスおよび操作されたテンプレートを使用して、適切な発現ベクターに連結され得る増幅産物を調製し得る。次いで、このベクターを使用して、標的配列によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質を産生するための標準的な方法を使用して適切な宿主生物を形質転換し得る。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される技術は、関連した配列のファミリーを増幅して、複雑なライブラリー（例えば、抗体ライブラリー）を構築するために使用される。

（好ましい実施形態の詳細な説明）
本開示は、標的核酸配列を増幅させる方法を提供する。特に有用な実施形態において、標的核酸配列は、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子である。本開示はまた、増幅産物が、適切な発現系においてクローン化され得、そして発現され得る方法を記載する。特に有用な実施形態において、本明細書中に記載される技術は、関連するファミリーの配列を増幅させ、複雑なライブラリー（例えば、抗体ライブラリー）を構築するために使用される。

標的核酸配列は、単一プライマーのみを含むプロセスによって指数関数的に増幅される。単一プライマー（すなわち、各々異なる配列を有する順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方を必要としない）を使用する能力は、増幅されるべき標的配列を含む核酸の鎖を操作することによって達成される。操作された核酸の鎖（本明細書中で時々、「操作されたテンプレート」といわれる）は、２つのテンプレートから調製される；つまり、１）増幅されるべき配列を含む天然の核酸または合成の核酸（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ）である開始物質および２）入れ子式オリゴヌクレオチド。開始物質は、元のテンプレートと考えられ得る。入れ子式オリゴヌクレオチドは、操作された核酸の鎖の生成の間、元のテンプレートのヌクレオチド配列を伸長するテンプレートとして使用される。操作される核酸の鎖は、一連の操作によって元のテンプレートから作製され、その反対の末端に相補的配列を生じる。この配列は、単一プライマーのみを使用して増幅を可能にするこれらの相補的配列である。

精製形態または非精製形態の任意の核酸は、本明細書中で記載されるプロセスのための開始物質として使用され得、但し、この開始物質は、増幅されるべき標的核酸配列を含むかまたは含むと疑われる。従って、このプロセスで使用される開始物質は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡを含む）であり得、このＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖であっても、二本鎖であってもよい。さらに、各々の一本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドが、使用され得る。これらの核酸の任意の混合物をまた使用しても、または同じプライマーもしくは異なるプライマーを使用して本明細書中の前記増幅反応から生成された核酸を使用してもよい。増幅されるべき標的核酸配列は、より大きな分子の小部分であっても、別個の分子として最初に存在していてもよい。開始核酸は、１つを超える所望の核酸配列を含み得、これらは、同じであっても異なっていてもよい。従って、本プロセスは、巨大量の１つの標的核酸配列を産生するためだけでなく、同じ核酸分子または異なる核酸分子上に位置する１つを越える異なる標的核酸配列を同時に増幅するためにも有用であり得る。

核酸は、以下の任意の供給源（例えば、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、プラスミド、クローン化されたＤＮＡまたはＲＮＡ）から得られても、任意の供給源（細菌、酵母、ウイルス、およびより高等な生物（例えば、植物または動物）を含む）由来の天然のＤＮＡまたはＲＮＡから得られてもよい。核酸は、天然に存在しても、全体または一部のいずれかが合成であってもよい。本発明で使用される核酸を得る技術および生成する技術は、当業者に周知である。核酸が、二本鎖を含む場合、核酸の鎖を元のテンプレートとして使用し得る前に、別々の工程かまたはプライマー伸長産物の合成と同時にかのいずれかで、分離することが必要である。さらに、開始物質が第１鎖ＤＮＡである場合、第２鎖ＤＮＡは、有利には、当業者の視野内のプロセスによって生成され得、操作されたテンプレートが生成される元のテンプレートとして使用される。

第１鎖ｃＤＮＡは、本方法に関して、特に有用な元のテンプレートである。ＤＮＡテンプレートを生成するために適切な方法は、公知であり、当業者に容易に選択される。好ましい実施形態において、第１鎖ｃＤＮＡは、逆転写酵素が、オリゴデオキシヌクレオチドプライマーおよび４つのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびＴＴＰ）の存在下で、任意のＲＮＡ開始物質に対して相補的なＤＮＡの合成を触媒する反応において、合成される。反応は、ｍＲＮＡの３’末端に対するオリゴデオキシヌクレオチドプライマーのアニーリングによって開始され、伸長する鎖の３’末端に、ｍＲＮＡヌクレオチド配列との塩基対形成関係によって決定されるように適切なデオキシヌクレオチドの段階的な付加が続く。当業者が認識するように、サンプル中の全てのｍＲＮＡは、オリゴｄＴの、ｍＲＮＡのポリＡ尾部へのアニーリングによって第１鎖ｃＤＮＡを生成するために使用され得る。

一旦、オリジナルのテンプレートが得られると、プライマー２０および境界オリゴヌクレオチド３０が、オリジナルテンプレート１０にアニールされる（図１を参照のこと）。プライマーの３’末端で始まり、境界オリゴヌクレオチドの５’末端あたりまでの元のテンプレートの部分に相補的な核酸の鎖が、重合される。

元のテンプレートにアニールされるプライマー２０は、好ましくは、元のテンプレートにアニールしない、所定の配列の第１部分２２および元のテンプレートにアニールする第２部分２５を含み、そして必要に応じて、第１の部分と第２の部分との間に制限部位２３を含む。プライマーは、増幅されるべき標的配列１２に隣接する元のテンプレートにアニールする。プライマーが、増幅されるべき標的配列の上流の元のテンプレートにアニールし得るか、またはプライマーが、図１に示されるように増幅されるべき標的配列１２の開始と重なり得ることが企図される。プライマーの非アニーリング部分２２の所定の配列は、元のテンプレートにおいてネイティブではなく、そして増幅プロセスの間使用される単一プライマーが、下記に詳述されるようにハイブリダイズし得る配列を提供するように選択される。必要に応じて、所定の配列は、操作されたテンプレートの一部を、本明細書中以下に、より完全に記載されるような発現ベクターへの挿入に有用な制限部位を含み得る。

元のテンプレートにアニールされる境界オリゴヌクレオチド３０は、核酸の重合を終結させる。核酸重合を終結させ得る任意のオリゴヌクレオチドは、境界オリゴヌクレオチド３０として使用され得る。好ましい実施形態において、境界オリゴヌクレオチドは、第１の部分３５および第２の部分３２を含み、この第１の部分は、元のテンプレート１０にアニールし、そしてこの第２の部分は、伸長反応を受けにくい。境界オリゴが、伸長のための部位として作用することを妨げるための技術は、当業者の視野内である。例として、境界オリゴ３０の部分３２は、それが図１に示されるような元のテンプレート１０にアニールしないように設計され得る。このような実施形態において、境界オリゴヌクレオチド３０は、重合をさらに阻止するが、核酸合成のためのプライマーとして働かない。なぜなら、その３’末端は、元のテンプレート１０とハイブリダイズしないからである。あるいは、境界オリゴ３０の３’末端は、ロックされた（ｌｏｃｋｅｄ）核酸を含み、同じ効果を達成するように設計され得る。ロックされた核酸は、例えば、ＷＯ９９／１４２２６に開示され、この内容は、参考として本明細書中に援用される。当業者は、境界オリゴの３’末端の伸長が生じないことを保証する他の方法を構想する。

本明細書中に記載のプライマーおよびオリゴヌクレオチドを、当該分野で周知の確立されたオリゴヌクレオチド合成方法を使用して合成し得る。オリゴヌクレオチド（本発明のプライマーを含む）としては、天然モノマーまたは改変モノマーの直鎖オリゴマーあるいは連結物（ｌｉｎｋａｇｅ）（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドなど）が挙げられ、これらは、ワトソン−クリック塩基対形成のような通常パターンのモノマー−モノマー相互作用によって、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合し得る。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合またはそれらのアナログによって連結され、数個のモノマー単位（例えば、３〜４）〜数十のモノマー単位のサイズの範囲に亘るオリゴヌクレオチドを形成する。プライマーは、代表的には、一本鎖であるが、二本鎖であってもよい。プライマーは、代表的には、デオキシリボ核酸であるが、当該分野で公知の広範な種々の合成プライマーおよび天然に存在するプライマーが、本開示の方法に有用であり得る。プライマーは、テンプレートに相補的であり、そのテンプレートにハイブリダイズして、合成を開始するための部位としての機能を果たすように設計されるが、テンプレートの正確な配列を反映する必要はない。このような場合、テンプレートに対するプライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーを、例えば、色素生成性部分、放射活性部分、または蛍光部分で標識し得、そして検出可能部分として使用し得る。

核酸の重合を、当業者に公知の方法を使用して達成し得る。重合を、一般的に、テンプレートの指示に従って遊離ヌクレオチドを順次付加するＤＮＡポリメラーゼを使用して酵素的に達成する。いくつかの異なるＤＮＡポリメラーゼが、本発明のプロセスにおける使用に適切である。特定の実施形態において、選択基準としては、エキソヌクレアーゼ活性の欠損または強力なエキソヌクレアーゼを保持しないＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。本発明のプロセスにおける使用のための低いエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを、天然供給源から単離し得るか、または組換えＤＮＡ技術を介して作製し得る。使用し得るポリメラーゼの例示的な例としては、Ｔ７ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖ．２．０、エキソヌクレアーゼ活性を欠損する、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｔａｑポリメラーゼのクレノウフラグメント、ｅｘｏ．−Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ．（ｅｘｏ．−）ＤＮＡポリメラーゼおよびＤｅｅｐ Ｖｅｎｔ．（ｅｘｏ．−）ＤＮＡポリメラーゼであるが、これらに限定されない。

特に有用な実施形態では、境界オリゴヌクレオチドの使用を、消化により出発材料の不要部分を除去することによって回避する。この実施形態（図２Ａにで概略的に示す）では、制限オリゴヌクレオチド７０を、前もって選択された位置で出発材料１００にアニーリングする。この制限オリゴヌクレオチドは、制限部位７２を含む、出発材料における二本鎖部分を提供する。適切な制限部位としては、Ｘｈｏ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｘｍａ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓｔ ＩおよびＰｖｕ Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。適切な制限酵素への曝露により、この出発材料を消化し、それにより、増幅されるべき所望の標的配列１２（またはその部分）を維持しつつ、不要な配列を除去するように短くし、最初のテンプレート１１０として使用する。一旦、最初のテンプレート１１０を得ると、前記実施形態と関連して上記に記載されるように、標的配列１２と隣接するかまたは重複する最初のテンプレート１１０（図２Ｂを参照のこと）に、プライマー２０をアニーリングする。プライマー２０の３’末端と最初のテンプレート１１０の５’末端との間の最初のテンプレートの一部に相補的な核酸４０の１つの鎖を重合する。当業者が理解するように、この実施形態（最初のテンプレートを作製するために制限オリゴヌクレオチドが使用される）では、境界オリゴヌクレオチドを使用する必要性はない。なぜなら、短縮された最初のテンプレート１１０の５’末端までプライマー伸長を進行させ得るからである。

一旦、重合が完了すると（すなわち、伸長中の鎖４０が、境界オリゴヌクレオチド３０または短縮された最初のテンプレート１１０の５’末端に達すると）、新たに合成したこの相補鎖を、任意の適切な変性方法（物理的手段、化学的手段または酵素的手段が挙げられる）によって最初のテンプレートから分離する。鎖の分離をまた、ヘリカーゼまたは酵素ＲｅｃＡ（これは、ヘリカーゼ活性を有し、そしてリボＡＴＰの存在下でＤＮＡを変性することが知られている）として公知の酵素の分類からの酵素によって引き起こし得る。ヘリカーゼを用いて核酸の鎖を分離するために適切な反応条件は、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ ｏｎ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第ＸＬＩＩＩ巻「ＤＮＡ：Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９７８），Ｂ．Ｋｕｈｎら、「ＤＮＡ Ｈｅｌｉｃａｓｅｓ」、６３−６７頁によって記載され、そしてＲｅｃＡを使用するための技術は、Ｃ．Ｒａｄｄｉｎｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：４０５−３７（１９８２）において概説される。

従って、新たに合成した相補鎖は、プライマー２０によって提供される配列（例えば、所定の配列２２、任意の制限部位２３およびプライマーのアニーリング部分２５）ならびにプライマー２０が最初のテンプレート１０にアニーリングされた位置と、境界オリゴヌクレオチド３０がアニーリングされるかまたは短縮された最初のテンプレートの５’末端がアニーリングされるかのいずれかの最初のテンプレート１０の部分との間の最初のテンプレート１０の部分に相補的である新たに合成した部分４５を含む。図４を参照のこと。

必要に応じて、最初のテンプレートおよびプライマーを使用する、複数回の重合（好ましくは、１５〜２５回）を実施して、引き続く工程で使用するための複数コピーの新たに合成した相補鎖を作製する。このプロセスにおけるこの時点にて（増幅工程の前に、完全な操作されたテンプレートが作成されるまで待たずに）、複数コピーの新たに合成した相補鎖を作製することは、標的配列の正確なコピーの最終的に作製される操作されたテンプレート中への組み込みを確実にすることに役立つ。最初のテンプレートに基づく複数ラウンドの重合は、ライブラリーの全メンバーのよりよい提示が達成されることのより高い可能性を提供し、それ故、単回の重合と比較してより高い多様性を提供すると考えられる。

代替の実施形態において、上記のようなプライマー２０を、最初のテンプレート１０にアニーリングし、そして複数回の重合化を実施することによって、ブロックオリゴヌクレオチドが存在しなくても、最初のテンプレートの一部を除去する工程がなくても、新たに合成した鎖を作製し得る。この実施形態（図３において概略的に示す）では、全長の最初のテンプレートに沿ってプライマーを伸長して、全長の新たに合成した鎖１４０を提供する。次に、制限オリゴヌクレオチド１７０を、全長の新たに合成した鎖にハイブリダイズさせる。この制限オリゴヌクレオチドは、制限部位を含む新たに合成した鎖の二本鎖部分を提供する。適切な制限部位としては、Ｘｈｏ Ｉ、Ｓｐｅ Ｉ、Ｎｈｅｌ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ、Ｎｃｏ Ｉ、Ｘｍａ Ｉ、Ｂｇｌ ＩＩ、Ｂｓｔ Ｉ、Ｐｖｕ Ｉ、Ｘｃｍ Ｉ、ＢｓａＪ Ｉ、Ｈｐａ Ｉ、ＡｐａＬ Ｉ、Ｓａｃ Ｉ、Ｄｒａ ＩＩＩおよびＳｍａ Ｉが挙げられるが、これらに限定されない。適切な制限酵素への曝露により、新たに合成した鎖を消化し、それにより短くする。次いで、下記により詳細に記載するように、入れ子式オリゴヌクレオチド５０を、短縮した新たに合成した鎖１４２にハイブリダイズして、操作したテンプレートの調製を完了する。

操作したテンプレートを調製する際の次の工程は、例えば、図４に示すように、入れ子式オリゴヌクレオチド５０を、新たに合成した相補鎖の３’末端にアニーリングさせる工程を包含する。図４に示すように、入れ子式オリゴヌクレオチド５０は、操作したテンプレートを完了するために必要なさらなる重合のためのテンプレートを提供する。入れ子式オリゴヌクレオチド５０は、新たに合成した相補鎖にハイブリダイズせず、そして／または改変された塩基を含む部分５２を含み、それによって、入れ子式オリゴヌクレオチドがプライマーとして働くことを防ぐ。入れ子式オリゴヌクレオチド５０はまた、新たに合成した相補鎖の３’末端にハイブリダイズする部分５５を含む。部分５５は、新たに合成した部分４５と境界を共にし得る（ｃｏｔｅｒｍｉｎｏｕｓ）か、または図４に示すように、新たに合成した部分４５を越えて伸長し得る。入れ子式オリゴヌクレオチド５０はまた、必要に応じて、制限部位を規定する部分５６を含み得る。入れ子式オリゴヌクレオチド５０の最後の部分５８は、プライマー２０の部分２２と同じ所定の配列を含む。部分５５が、新たに合成した相補鎖の最初の３’末端を越えて伸長する位置から、入れ子式オリゴヌクレオチドは、さらなる重合のためのテンプレートとして機能して、操作したテンプレートを形成する。入れ子式オリゴが標的配列の一部を含み得る（標的配列の一部が、最初のテンプレートを形成する工程において短縮された場合）か、または例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲまたはフレームワーク領域または定常領域のようなポリペプチドまたはタンパク質（もしくはその部分）をコードする遺伝子を含み得ることが理解されるべきである。異なる配列を有する入れ子式オリゴヌクレオチドの収集物を使用して、それにより多様な生成物のライブラリーを結果として得る種々のテンプレートを提供し得る。従って、重合は、図４に示すように、入れ子式オリゴヌクレオチドに相補的であるさらなる核酸６０を付加することによって、新たに合成した相補鎖を伸長する。重合を達成するための技術は、当業者の範囲内である。前述のように、適切なポリメラーゼ（エキソヌクレアーゼ活性を欠く酵素）は、特定の実施形態において好ましくあり得る。

一旦、ポリマー化（重合）が完結すると、操作されたテンプレート１２０は、例えば、熱変性のような当業者に周知の技術によって、入れ子式オリゴヌクレオチド５０から分離される。この得られた操作されたテンプレート１２０は、オリジナルプライマー２０に由来する部分、このオリジナルテンプレートに相補的な部分４５、およびこの入れ子式オリゴヌクレオチドの部分に相補的な部分６５を含む（図５を参照のこと）。顕著なことに、操作されたテンプレート１２０の３’末端は、プライマー２０の部分２２の予め決定された配列に相補的な配列を含む部分６８を含む。これは、当業者に公知の技術を使用して、プライマー部分２２の予め決定された配列と同一の配列を有する単一のプライマーを使用して操作したテンプレート１２０の中に含まれた所望の配列の増幅を可能にした。単一のプライマー増幅の間に、エンドヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの存在が好適であるが、これは、このような酵素が「校正（プルーフリーディング）」機能を提供しそしてエキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼと比較して相対的に高いプロセッシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）が有することが知られているためである。

図６は、新規に合成されるｃＤＮＡテンプレートの単一プライマー増幅に関連する工程を図示する。このプライマーが反応混合物中に存在する場合に、このプライマーは、そのテンプレートに隣接する配列に相補的な３’末端配列にハイブリダイズし、そして、そのテンプレートを増幅させる。プライマーが存在しない場合に、５’末端の予め決定された配列とこの予め決定された配列との間の内部自己アニーリングが存在すると考えられている。好ましい実施形態において、この予め決定された配列およびその相補的な予め決定された配列は、その単一プライマー増幅反応の間のミスプライマーリング（ｍｉｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）を避けるために高温でアニーリングを行うように設計され得る。

増幅が実施された後に、この生成物は、当業者に公知の技術のうちの任意のものを使用して検出され得る。核酸を検出するために使用される方法の例としては、これらに限定されるわけではないが、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション分析、制限エンドヌクレアーゼ切断分析、一本鎖コンフォメーション多型（ＳＳＣＰ）分析、ゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色、蛍光共鳴エネルギー移動、ヘアピンＦＲＥＴアッセイ、およびＴａｑＭａｎアッセイが挙げられる。

一旦、この操作された核酸が、所望する回数で増幅されると、制限部位２３および６６または任意の内部制限部位は、その鎖を消化してその結果としてその標的核酸配列が適切な発現ベクターに連結され得るために使用され得る。次いで、このベクターは、この標的配列によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質を産生するための標準的な方法を使用して、適切な宿主生物を形質転換させるために使用され得る。

特に有用な実施形態において、本明細書中で記載される方法は、抗体のｃＤＮＡを使用して、抗体または例えば可変領域（軽鎖または重鎖のいずれか）のようなその抗体の部分をコードする標的配列を増幅するために使用される。この様式で、抗体のライブラリーは増幅され、そしてスクリーニングされ得る。従って、例えば、抗体ｍＲＮＡを用いて開始される場合に、第１鎖のｃＤＮＡが、産生されそして消化されて、オリジナルテンプレートを提供し得る。プライマーは、選択された相補性決定領域（ＣＤＲ）に対して上流でアニーリングして、その結果、その新規に合成された核酸鎖がＣＤＲを含むように設計され得る。例として、その標的配列が重鎖ＣＤＲ３である場合に、そのプライマーは、その重鎖フレームワーク１（ＦＲ１）領域にアニーリングするように設計され得る。当業者は、本開示に基づいて、他の上流部位にアニーリングするかまたはその抗体ｃＤＮＡ内の他の選択された標的を再生するための適切なプライマーを設計する方法を容易に想到する。

以下の実施例は、非限定的に、本発明を例示するために提供される：

（実施例１）
（ＩｇＭ重鎖可変領域遺伝子のレパートリーの増幅）
（第１鎖ｃＤＮＡの合成および改変）
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用するが、本質的にはそのキット指示書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、オリゴｄＴプライマーとともに従来型の第１鎖ｃＤＮＡを生成した。第１鎖ｃＤＮＡ生成物を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）で浄化した。制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲ Ｉによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、制限オリゴオリゴヌクレオチドを、その第１鎖ｃＤＮＡに添加した。制限オリゴヌクレオチド（ＣＭＥｃｏＲ Ｉ）の配列は、５’ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＡＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＧ ＴＣＧ ３’（配列番号（Ｓｅｑ．ＩＤ Ｎｏ．）１）であった。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび０．１μＭオリゴヌクレオチドとともに開始した。このサンプルを、９５℃で２分間加熱して、次いで、２分間、６４℃で保持し、特異的なアニーリングが生じることを可能にした。適量の、１０×制限緩衝液Ｈ（（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を、このサンプルに添加して、そして、３７℃までさらに冷却した。制限エンドヌレアーゼＥｃｏＲ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加して、そして、３０分間、３７℃でインキュベートした。制限酵素を、２０分間、６５℃で熱インキュベートして、次いで、このサンプルを４℃まで冷却した。

（第二鎖線形増幅および入れ子式オリゴ伸長）
ＥｃｏＲ Ｉで消化された第一鎖ｃＤＮＡを、プライマー「ＴＭＸ２４ＶＨ３ａ」（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とともに、第二鎖ｃＤＮＡ反応における最初のテンプレートとして使用した。このプライマーを、所定のＴＭＸ２４配列、Ｘｈｏ Ｉ制限部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域において第一鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域、を含むように設計した。この「ＴＭＸ２４ＶＨ３ａ」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＧＡＲ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＡＧ ３’（配列番号２）であった（ここで、Ｒは、塩基Ａおよび塩基Ｇの等モル混合物を表わす）。このサンプルを、９５℃にて１分間熱変性させ、次いで９５℃にて５秒間、５６℃にて１０秒間、および６８℃にて１分間というサイクルを２０サイクル行った。これにより、第二鎖ｃＤＮＡの線形増幅が可能になる。次いで、「ＴＭＸ２４ＣＭ０」と呼ばれる入れ子式オリゴを、氷上で、０．０８μＭの最終濃度になるまで加えた。この「ＴＭＸ２４ＣＭ０」の配列は、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＡＴ ＴＣＴ ＣＡＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＧＡ ＧＧＧ ＧＧＡ ３’（配列番号３）であった（この配列は、引き続くクローニング工程において使用されるＳｐｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む）。この入れ子式オリゴの３’末端は、逆連結（３’−５’ではなく、３’−３’）アデノシンの取り込みによる伸長を防止するように設計される。この第二鎖ｃＤＮＡを、９４℃にて５秒間熱変性させることによって、入れ子式オリゴをさらに伸長させ、次いでアニーリングおよび伸長のために、６８℃にて１０秒間および９５℃にて５秒間、続いて６８℃にて３０秒間および４℃というサイクルを４サイクル行った。次いで、得られた第二鎖ｃＤＮＡまたは作製したテンプレートを、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して洗浄した。この工程は、オリゴヌクレオチドを取り除き、そして下流プロトコルのための単純な緩衝液交換を可能にする。

（単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
操作されたテンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰｓ、および単一プライマー（ＴＭＸ２４）（このプライマーは、５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ３’（配列番号４）の配列を有する）を使用して、増幅した。このサンプルを、９５℃にて１分間熱変性させ、次いで９５℃にて５秒間および６８℃にて１分間というサイクルを３５サイクル行った。この後、さらに６８℃にて３分間行って、４℃で維持した。

（クローニングおよび配列決定）
約４５０ｂｐの増幅産物をゲル精製し、次いで、Ｘｈｏ ＩおよびＳｐｅ Ｉによって消化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。個々のクローンを選択し、そしてそれらのＤＮＡ配列を決定した。分析した１６個の全てのクローンは、ＩｇＭ重鎖であり、これらの各々が、可変の長さを有する異なるＣＤＲ３配列を有し、それによって、抗体鎖の多種多様な集団がこの方法によって増幅されることが示された（表１を参照のこと）。

。

（実施例２）
ＶＨ産物をベクターにクローニングして、それによってネイティブＩｇＭ ＣＨ１定常領域が再構築され得るように、ＣＨ１中のＥｃｏＲ Ｉ以外の部位を、第一鎖ｃＤＮＡエンドヌクレアーゼ消化のために利用した。当業者が理解するように、Ｔａｑポリメラーゼをこのプロトコルのために使用する場合、末端Ａが、多数の新たな合成ＤＮＡ鎖に加えられる。多様性を最大にするために、その末端Ａの存在を、入れ子式オリゴヌクレオチドの設計において考慮した。しかし、過剰なＡの存在は、ＥｃｏＲ Ｉ認識部位の欠損を生じさせる。ＩｇＭ定常領域の分析により、この方法のために潜在的に使用され得る他のネイティブな制限部位（例えば、Ｄｒａ ＩＩＩ）が明らかとなった。ＣＨ１ドメインにおいてＤｒａ ＩＩＩのネイティブ制限部位を使用した結果は、その上流のＥｃｏＲ Ｉ部位が未改変のままであり、その重鎖レパートリーをクローニングするためにこの部位を使用することができるということである。この重鎖のインサートは、Ｘｈｏ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉによって、適切なベクター（これは、ＥｃｏＲ ＩからＣＨ２ドメインまでにわたって残っているＩｇＭ ＣＨ１ドメインを有する）にクローニングされる。

（第一鎖ｃＤＮＡの合成および改変）
ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用して、オリゴｄＴプライマーを用いて伝統的な第一鎖ｃＤＮＡを作製した。基本的にはキットの説明書に従って、ＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、これを行った。制限オリゴヌクレオチドをこの第一鎖ｃＤＮＡに加えて、制限エンドヌクレアーゼＤｒａ ＩＩＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成した。この制限オリゴヌクレオチド（ＣＭＤｒａ ＩＩＩ）の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＡ ＣＡＣ ＧＴＧ ＧＴＧ ＴＧＣ ＡＡＡ Ｇ ３’（配列番号２１）であった。反応を、第一鎖ｃＤＮＡおよび１μＭオリゴヌクレオチドを用いて開始した。このサンプルを、９５℃まで２分間加熱し、次いで６４℃にて２分間維持することで、特定のアニーリングが生じるのを可能にした。適切な量の１０×制限緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をこのサンプルに加え、３７℃までさらに冷却した。制限エンドヌクレアーゼＤｒａ ＩＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。この制限酵素を、６５℃にて２０分間熱不活化させ、次いでこのサンプルを４℃まで冷却した。

（第２鎖の線形増幅および入れ子式オリゴ伸長）
ＤｒａＩＩＩで消化した第１鎖ｃＤＮＡを、プライマー「ＴＭＸ２４ＶＨ１ａ」（終濃度０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と一緒に用いて、第２鎖ｃＤＮＡ反応における元のテンプレートとして使用した。このプライマーを、所定のＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域中で、第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。「ＴＭＸ２４ＶＨ１ａ」の配列は、５’ＧＴＧＣＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＴＣＧＡＧＣＡＧＧＴＫＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧ３’（配列番号２２）であり、ここで、Ｋは、ＧおよびＴの塩基の等モル濃度混合物を表す。このサンプルを、９４℃で１分間、熱変性させ、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間のサイクルを２０回繰り返した。このことは、第２鎖ｃＤＮＡの線形増幅を可能にした。「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」と名付けられた入れ子式オリゴを、終濃度０．２μＭまで氷上で添加した。図７に示される様に、「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」の配列（配列番号２３）は、オリゴヌクレオチドの伸長を妨げるように設計された、改変された構造を有する３つの３’末端ヌクレオチドを含む。具体的には、この入れ子式オリゴは、ホスホロチオエートおよび２’ＯＭｅを有する、３つの末端改変ヌクレオチドを有し、この２’ＯＭｅは、伸長を妨げ、そしてエキソヌクレアーゼ活性およびエンドヌクレアーゼ活性に対して保護するように設計される。このオリゴの３’末端ヌクレオチドは、非ハイブリダイズ性である（ｃの代わりにｇ）。第２鎖ｃＤＮＡをさらに、９４℃で１分間の熱変性、６８℃で２分間のアニーリングおよび伸長、その後４℃にすることによって、入れ子式オリゴから伸長した。次いで、得られた第２鎖ｃＤＮＡまたは操作されたテンプレートを、ＱＩＡＧＥＮ遠心カラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて浄化した。この工程は、オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのために、簡単な緩衝液交換を可能にする。この手順を、ＶＨプライマーパネル（プライマーリスト参照）の停止（ｒｅｓｔ）まで反復および伸長して、免疫グロブリン生成物のライブラリーを調製した。これら生成物を適切なベクターにクローニングし得る。

（ＶＨフレームワーク１特異的プライマー：）

上記の配列において、ＲはＡおよびＧの等量の混合であり、ＫはＧおよびＴの等量の混合であり、そしてＳはＣおよびＧの等量の混合である。

(単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
操作されたテンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰおよび単独プライマー（ＴＭＸ２４）（これは、配列５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ３’（配列番号４）を有する）を使用して増幅した。これらのサンプルを、９５℃で１分間、熱変性させ、次いで９５℃で５秒間、および６８℃で１分間のサイクルを３０回繰り返した。この後に、６８℃でさらに３分、そして４℃で保持した。

（クローニングおよび配列決定）
約４５０ｂｐの増幅産物をゲル精製し、そしてＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩによって消化した。これらのインサートを、ネイティブＥｃｏＲＩ部位からＣＨ２ドメインまで（またはその一部を含む）のＩｇＭ ＣＨ１ドメインの残存部分、および増幅されたフラグメントをクローニングするための適合性の制限部位を含む、任意の適切な発現ベクターにクローニングする。

（実施例３）
（Ｂ型肝炎ポジティブなドナーのｍＲＮＡ由来の、ファージミドディスプレイライブラリーの構築）
（ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖のための第１鎖ｃＤＮＡ合成および改変）
Ｂ型肝炎ワクチン接種されたドナー由来のヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｍＲＮＡを使用して、オリゴｄＴプライマーを用いて伝統的な第１鎖ｃＤＮＡを調製した。このことは、本質的にキットの指示書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用して行った。ＩｇＧに対する制限オリゴヌクレオチド「ＣＧＡｐａＬ Ｉ」、またはκ軽鎖のための「ＣＫＳａｃ Ｉ」を、２本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、第１鎖ｃＤＮＡに添加した。この２本鎖ＤＮＡ領域を、ＩｇＧについては制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬ Ｉによって、またはκ軽鎖については制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩによって消化し得る。「ＣＧＡｐａＬ Ｉ」配列は、５’ＣＣＡ ＧＣＧ ＧＣＧ ＴＧＣ ＡＣＡ ＣＣＴ ＴＣＣ３’（配列番号３９）である。「ＣＫＳａｃ Ｉ」配列は、５’ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＴＣ３’（配列番号４０）である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡ、１μＭのオリゴヌクレオチドおよび適切な量の１０×制限緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に設定した。これらのサンプルを、９５℃で２分間加熱し、次いで６４℃で２分間保持して、特異的なアニーリングを生じさせ、そして３７℃に冷ました。制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬ ＩまたはＳａｃ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。制限酵素を、Ｓａｃ Ｉについては６５℃で２０分間、加熱不活性化し、次いでサンプルを４℃に冷却した。

各々の制限エンドヌクレアーゼによる第１鎖ｃＤＮＡの消化は、当業者に公知の技術を使用するＰＣＲ増幅によって確認した。これらの産物は、抗体遺伝子のクローニングには使用しなかった。消化した第１鎖ｃＤＮＡのポジティブな増幅は、ＩｇＧについては５’ＶＢＶＨ１ａおよび３’ＣＧ０の内部コントロールプライマーを使用する反応において、そしてκについては５’ＶＢＶＫ１ａおよび３’ＣＫ０の内部コントロールプライマーを使用する反応において、観察された。プライマー５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＧ０またはプライマー５’ＶＢＶＫ１ａ／３’ＣＫ０を用いた良好な増幅、およびプライマー５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＧ１Ｚまたはプライマー５’ＶＢＶＫ１ａ／３’ＣＫ１ｄｘ２を用いた最小限の増幅は、各々の制限エンドヌクレアーゼを用いた第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾の良い消化を示す。確認ＰＣＲのために使用したプライマーの配列は、以下であった：

（軽鎖第２鎖の線形増幅および入れ子式オリゴ伸長）
Ｓａｃ Ｉで消化した第１鎖ｃＤＮＡを、元のテンプレートとして使用して、フレームワーク１特異的プライマー（終濃度０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する、複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応を設定した。これらのプライマーを、κ鎖について所定のＴＭＸ２４κ配列 ５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ３’（配列番号４７）、ＸｂａＩ制限部位、およびヒト抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域中で、第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列を、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）から誘導し、これらの配列は、ヒト抗体の公知の配列に基づいて設計され、そしてκ軽鎖遺伝子の全体のヒト抗体レパートリーをカバーすることが報告されている。

（κ軽鎖フレームワーク１特異的プライマー：）

上記の配列において、ＲはＡおよびＧの等量混合物であり、ＭはＡおよびＣの等量混合物であり、ＹはＣおよびＴの等量混合物であり、ＷはＡおよびＴの等量混合物であり、そしてＳはＣおよびＧの等量混合物である。

これらのサンプルを、９４℃で１分間、熱変性させ、次いで９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間のサイクルを２０回繰り返した。このことは、第２鎖
ｃＤＮＡの線形増幅を可能にした。κ鎖に対する「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」と名付けられた入れ子式オリゴを、終濃度０．２μＭまで氷上で添加した。「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」は、所定の配列ＴＭＸ２４Ｋを含み、そしてこの配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＣＴ３’（配列番号６１）であった。第２鎖ｃＤＮＡをさらに、９４℃で１分間の熱変性、６８℃で２分間のアニーリングおよび伸長、その後４℃にすることによって、入れ子式オリゴから伸長した。得られた第２鎖ｃＤＮＡ（操作されたテンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮ遠心カラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて浄化した。この工程は、遊離オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのために、簡単な緩衝液交換を可能にする。

（軽鎖単一プライマーの増幅（ＳＰＡ））
操作されたテンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、およびκ鎖に対するプライマー「ＴＭＸ２４Ｋ」を使用して増幅した。「ＴＭＸ２４Ｋ」の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ３’（配列番号６２）である。これらのサンプルを、９５℃で１分間、熱変性させ、次いで９５℃で５秒間、および６８℃で１分間のサイクルを、３０回繰り返した。これは、６８℃でさらに３分間、そして４℃で保持した。

（軽鎖のクローニング）
κ鎖増幅産物をゲル精製し、次いでＸｂａＩおよびＳａｃＩにより消化した。これらのインサートを、κ軽鎖定常領域の残存部分含む、適切な発現ベクターにクローニングした。このライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションによって導入し、そして３７℃で一晩培養した。翌朝、ＤＮＡマキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）（ＱＩＡＧＥＮ）を実施して、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収した。次いで、この軽鎖ライブラリーＤＮＡを、次いで、Ｘｈｏ Ｉ／Ａｇｅ Ｉによって重鎖Ｆｄフラグメント中にクローニングする工程において使用して、ライブラリー構築物を完成した。

（重鎖第２鎖直線増幅および入れ子式オリゴ伸長）
ＡｐａＬ Ｉ消化した第１鎖ｃＤＮＡを、元のテンプレートとして使用して、フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素および１０×反応混合物（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する、複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応を構築した。これらのプライマーを、所定のＴＭＸ２４配列、ＸｈｏＩ制限部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域において第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングされる領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列を、ヒト抗体の既知の配列に基づいて設計されたＶＢａｓｅデータベースプライマーから誘導した。これらは、重鎖遺伝子のヒト抗体レパートリー全体をカバーすることが報告される。

重鎖特異的フレームワーク１特異的プライマー：

上記の配列において、Ｒは、ＡおよびＧの等量の混合であり、Ｋは、ＧおよびＴの等量の混合であり、そしてＳは、ＣおよびＧの等量の混合である。

これらのサンプルを、９４℃で１分間熱変性させ、次いで、（９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間および６８℃で２分間）×２０回のサイクルにかけた。これにより、第２鎖ｃＤＮＡの直線増幅が可能であった。「ＴＭＸ２４ＣＧｎｐｔ」と称される入れ子式オリゴヌクレオチド（配列５’ＧＴＧ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＴＴ ＧＧＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＴＧＴ ＴＴＧ ＣＡＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＣＡＧ ＲＧＣ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＴＴ Ｇ ３’（配列番号７７））を、氷上で、０．２μＭの最終濃度まで添加した。ＩｇＭ入れ子式オリゴについて図１で示されるように、３つの３’末端ヌクレオチドを、オリゴの伸長を防止するように改変した。第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の熱変性、アニーリングおよび６８℃で２分間の伸長によって、入れ子式オリゴからさらに伸長させ、その後４℃にした。得られた第２鎖ｃＤＮＡ（操作されたテンプレート）を、次いで、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して清浄化した。この工程により、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのための単なる緩衝液交換が可能となった。

（単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
操作したテンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰおよびプライマー「ＴＭＸ２４」を使用して増幅した。これらのサンプルを、９５℃で１分間熱変性させ、次いで、（９５℃で５秒間および６８℃で１分間）×３０回のサイクルにかけた。次に、さらに３分間６８℃にし、そして４℃で維持した。

（重鎖のクローニングおよびライブラリーの生成）
増幅産物をプールし、次いでゲル精製した。ＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。このＤＮＡを、続いてＸｈｏＩ制限酵素およびＡｇｅＩ制限酵素で消化し、次いでゲル精製した。ＡｇｅＩ部位は、ＡｐａＬ Ｉ部位の上流のＩｇＧ定常領域のＣＨ１中に天然に存在する。ＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて回収した。

軽鎖ライブラリーＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩで連続的に消化し、次いでゲル精製した。この軽鎖ライブラリーＤＮＡを、重鎖フラグメントと連結した。連結したＤＮＡを、反応緩衝液を除去し、そしてＤＮＡを濃縮するために、スピンカラム（ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）上に配置した。最終的な形質転換を、エレクトロコンピテントＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で行った。

（ＨＢｓ Ａｇ上でのライブラリーのパニングおよびスクリーニング）
このライブラリーを、実質的に、Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ， ＣＦ， Ｂｕｒｔｏｎ， ＤＲ， Ｓｃｏｔｔ， ＪＫ， ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ， ＧＪ （２００１） Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されるように、固定化ＨＢｓ Ａｇ上で４回にわたってパニングした。第２回、第３回および第４回のパニング由来の個々のクローンを、ＨＢｓ Ａｇ上でＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。

（λ軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および改変）
Ｂ型肝炎ワクチン接種したドナー由来のヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを使用して、オリゴｄＴプライマーを用いて従来の第１鎖ｃＤＮＡを生成した。これを、キットの指示書に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ （ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を使用して行った。制限オリゴヌクレオチド「ＣＬＳｍａ Ｉ」を、制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を作成するために、第１鎖ｃＤＮＡに添加した。「ＣＬＳｍａ Ｉ」配列は、５’ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＹ ＧＴＧ３’（配列番号７８）であり、ここで、Ｙは、ＣおよびＴの混合である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡ、１μＭオリゴヌクレオチド、および適切な量の１０×制限緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて構成した。このサンプルを、９５℃まで２分間加熱し、次いで６４℃で２分間維持して、特異的アニーリングを生じさせ、そして３７℃まで冷却した。制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。制限酵素を、６５℃で加熱不活化し、次いでサンプルを４℃まで冷却した。

制限エンドヌクレアーゼによる第１鎖ｃＤＮＡの消化を、当業者に公知の技術を使用するＰＣＲ増幅によって確認した。これらの産物は、抗体遺伝子のクローニングに使用しなかった。５’ＶＢＶＬ１ａおよび３’ＣＬ０内部コントロールプライマーを使用して、消化した第１鎖ｃＤＮＡの陽性の増幅が、反応物中で観察された。

プライマー５’ＶＢＶＬ１ａ／３’ＣＬ０を用いた良好な増幅、およびプライマー５’ＶＢＶＬ１ａ／３’ＣＬ２ｄｘ２を用いた最小の増幅は、ＳｍａＩによる第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾よい消化を示した。ＰＣＲをチェックするためのプライマーの配列は、ＶＢＶＬ１ａ（５’ＧＡＣ ＧＣＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＧＡＧ ＣＴＣ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ３’（配列番号７９））、ＣＬ０ （５’ＣＣＴ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＧ ＧＹＧ ＧＧＡ ＡＣＡＧ３’（配列番号８０））およびＣＬ２ｄｘ２（５’ＡＧＡ ＣＡＧ ＴＧＡ ＣＧＣ ＣＧＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＧＡ ＡＣＡ ＴＴＣ ＴＧＴ ＡＧＧ ３’（配列番号８１））であった。

（λ軽鎖第２鎖直線増幅および入れ子式オリゴ伸長）
ＳｍａＩ消化した第１鎖ｃＤＮＡを、元のテンプレートとして使用して、フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる、複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応を構築した。これらのプライマーは、所定のＴＭＸ２４Ｌ配列、ＸｂａＩ部位およびヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク領域において第１鎖ｃＤＮＡにアニールする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列を、ヒト抗体の既知の配列に基づいて設計され、そしてλ軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーをカバーすることが報告される、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）から誘導する。λ軽鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例４において使用したものである。

これらのサンプルを、９４℃で１分間熱変性させ、次いで、（９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間）×２０回のサイクルにかけた。このことにより、第２鎖ｃＤＮＡの直線増幅が可能となった。実施例４に示されるような、「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」と称される入れ子式オリゴヌクレオチドを、０．２μＭの最終濃度にまで、氷上で添加した。ＩｇＭ入れ子式オリゴヌクレオチド「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」について図７に示されるように、「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」の３’末端ヌクレオチドを、オリゴ伸長を防止するために改変する。第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間の熱変性、アニーリングおよび６８℃で２分間の伸長によって、入れ子式オリゴヌクレオチドからさらに伸長させ、その後４℃にした。得られた第２鎖ｃＤＮＡ（操作されたテンプレート）を、ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して清浄化した。この工程により、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのための、単なる緩衝液の交換が可能となった。

（λ軽鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
操作されたテンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰおよびプライマー「ＴＭＸ２４Ｌ」を使用して増幅した。ＴＭＸ２４Ｌの所定の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ３’（配列番号８２）である。これらのサンプルを、９５℃で１分間熱変性させ、次いで、（９５℃で５秒間および６８℃で１分間）×３０回のサイクルにかけた。その後さらに３分間６８℃にし、そして４℃で維持した。

（λ軽鎖クローニング）
λ軽鎖増幅産物を、ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）によって清浄化し、そしてＸｂａＩおよびＳｃａＩで消化した。挿入物を、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してゲル精製し、そしてλ軽鎖定常領域の残りの部分を含む適切なベクター中にクローニングした。連結産物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉに導入し、そして３７℃で一晩増殖させた。次の朝、ＤＮＡ ｍａｘｉ ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）を実施して、λ軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収した。

（重鎖クローニングおよびＩｇＧλライブラリーの生成）
上記で調製したλ軽鎖ライブラリーＤＮＡを、以前に記載されたようにＩｇＧκライブラリーについてもまた調製された重鎖Ｆｄフラグメントの挿入のために、ＸｈｏＩおよびＡｇｅＩによって連続的に消化した。次いで、連結産物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉに導入し、そして３７℃で一晩増殖させた。次の朝、ＤＮＡ ｍａｘｉ ｐｒｅｐ（ＱＩＡＧＥＮ）を実施して、完全ＩｇＧλライブラリーＤＮＡを回収した。

（ＨＢｓ Ａｇ上でのライブラリーのパニングおよびスクリーニング）
パニングおよびスクリーニングを、ＩｇＧκライブラリーについて以前に記載されたように実施した。

（単離されたＦａｂのＤＮＡ配列決定分析および特徴づけ）
ＥＬＩＳＡスクリーニングにより、ＨＢｓＡｇに対する特異的結合および非特異的タンパク質（オボアルブミン）に対する最少の結合を示すクローンを、ＤＮＡ配列決定によって分析した。図８ａ〜ｅを参照のこと。ＨＢｓＡｇに対する合計３８個の別個のＩｇＧκＦａｂ（２５個の重鎖および３７個の軽鎖）および１７個の別個のＩｇＧλＦａｂ（１３個の重鎖および１６個の軽鎖）を、Ｂ型肝炎ワクチン接種したドナー由来のＰＢＬ ｍＲＮＡから作成されたライブラリーから単離した。

（実施例４）
（ヒトＰＢＬ ｍＲＮＡからのファージディスプレイライブラリーの構築）
（軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および改変）
ドナー由来のヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を実質的にキットの指示書に従って使用して、オリゴｄＴプライマーを用いて、従来の第１鎖ｃＤＮＡを生成した。κ軽鎖およびλ軽鎖を、別々に構成する。制限オリゴヌクレオチド「ＣＫＳａｃ Ｉ」または「ＣＬＳｍａ Ｉ」を、κ軽鎖については制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩによって、またはλ軽鎖については制限エンドヌクレアーゼＳｍａＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、第１鎖ｃＤＮＡに添加する。複数のλ定常領域（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ６）が存在するので、このＳｍａＩ部位が、全ての機能的λ定常ドメイン（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３およびＣ６）間で保存されていることに留意することが重要である。「ＣＫＳａｃ Ｉ」配列は、５’ＡＧＧ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＣＧＣ ＣＣＧ ＴＣ ３’（配列番号１７９）であり、「ＣＬＳｍａ Ｉ」配列は５’ＧＡＣ ＴＴＣ ＴＡＣ ＣＣＧ ＧＧＡ ＧＣＹ ＧＴＧ ３’（配列番号１８０）であり、ここで、Ｙは、ＣおよびＴの混合である。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび１μＭのオリゴヌクレオチドを用いて構成する。このサンプルを、９５℃で２分間加熱し、次いで２分間６４℃に維持して、特異的なアニーリングを生じさせる。適切な量の１０×制限緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をサンプルに添加し、そしてさらに３７℃まで冷却する。制限エンドヌクレアーゼＳｃａＩまたはＳｍａＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。この制限酵素を６５℃で２０分間加熱インキュベートし、次いでサンプルを４℃まで冷却する。

（軽鎖第２鎖直線増幅および入れ子式オリゴ伸長）
ＳａｃＩ消化したκ第１鎖ｃＤＮＡまたはＳｍａＩ消化したλ第１鎖ｃＤＮＡを元のテンプレートとして使用して、フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる、複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応を構築する。プライマーを、ＴＭＸ２４Ｋ配列（κについて）またはＴＭＸ２４Ｌ配列（λについて）、ＸｂａＩ制限部位、およびヒト抗体κ軽鎖遺伝子またはヒト抗体λ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域において第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計する。これらのアニーリング配列を、ヒト抗体の既知の配列に基づいて設計され、そして軽鎖遺伝子の全ヒト抗体レパートリーをカバーすることが報告されている、ＶＢａｓｅデータベースプライマー（ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／ｐｕｂｌｉｃ／ＩＮＴＲＯ．ｈｔｍｌ）から誘導する。κ軽鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例３において使用したものである。λ増幅において使用するためのプライマーの、以下の表を参照のこと。

λ軽鎖フレームワーク１特異的プライマー：

上記の配列において、Ｒは、ＡおよびＧの等量混合であり、Ｍは、ＡおよびＣの等量混合であり、Ｙは、ＣおよびＴの等量混合であり、Ｗは、ＡおよびＴの等量混合であり、そしてＳは、ＣおよびＧの等量混合である。

これらのサンプルを、９４℃で１分間熱変性し、次いで（９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間および６８℃で２分間）×２０回のサイクルにかける。これにより、第２鎖ｃＤＮＡの直線増幅が可能となった。κ鎖について「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」またはλ鎖について「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」と称される入れ子式オリゴヌクレオチドを、氷上で、０．２μＭの最終濃度まで添加する。入れ子式オリゴヌクレオチド配列は、以下である：「ＴＭＸ２４ＣＫｎｐｔ」（５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＣ ＡＧＧ ＣＣＣ ＴＧＡ ＴＧＧ ＧＴＧ ＡＣＴ ＴＣＧ ＣＴ ３’（配列番号１９６））および「ＴＭＸ２４ＣＬｎｐｔ」（５’ ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＧＣ ＴＣＣ ＴＧＧ ＧＴＡ ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＣＴ ＫＡＴ ＳＡＧ ＲＣＡ ＣＡＧ ３’（配列番号１９７））。ＩｇＭ入れ子式オリゴについて図７で示されるように、３つの３’末端ヌクレオチドを、オリゴ伸長を防止するために改変する。第２鎖ｃＤＮＡは、９４℃で１分間の熱変性、アニーリングおよび６８℃で２分間の伸長によって、入れ子式オリゴからさらに伸長され、その後４℃にされる。得られた第２鎖ｃＤＮＡ（操作されたテンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を使用して清浄化する。この工程は、遊離のオリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのための単純な緩衝液交換を可能にする。

（軽鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
操作されたテンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、ならびにκ鎖についてプライマー「ＴＭＸ２４Ｋ」またはλ鎖について「ＴＭＸ２４Ｌ」を使用して増幅する。「ＴＭＸ２４Ｋ」の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＧＴＧ ３’（配列番号１９８）であり、そして「ＴＭＸ２４Ｌ」の配列は、５’ＧＡＣ ＧＡＣ ＣＧＧ ＣＴＡ ＣＣＡ ＡＧＡ ＧＧＡ ＣＡＧ ３’（配列番号１９９）である。サンプルを、９５℃で１分間熱変性させ、次いで（９５℃で５秒間および６８℃で１分間）×３０回のサイクルにかける。その後、さらに３分間６８℃にし、そして４℃で維持する。

（軽鎖クローニング）
κおよびλ増幅産物を、ＰＣＲ精製キット（ＱＵＩＡＧＥＮ）を使用して清浄化し、そして別々にゲル精製した。これらの産物を、ＸｂａＩおよびＳａｃＩで消化する。挿入物を、それぞれの軽鎖定常領域の残りの部分を含む適切なベクター中にクローニングする。連結産物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、そして３７℃で一晩増殖させる。次の朝、ＤＮＡ ｍａｘｉｐｒｅｐを実施して、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収する。軽鎖ライブラリーＤＮＡ ｐｒｅｐを、Ｘｈｏ Ｉ／ＥｃｏＲ Ｉによる重鎖Ｆｄフラグメントの挿入についてのクローニングベクターとして使用して、ライブラリーの構築を完了する。

（重鎖についての第１鎖ｃＤＮＡの合成および改変）
ドナー由来のヒトＰＢＬ ｍＲＮＡを使用して、オリゴｄＴプライマーを用いて従来の第１鎖ｃＤＮＡを生成する。これを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を実質的にそれらの指示書に従って使用して行う。制限オリゴヌクレオチドＣＭＤｒａ ＩＩＩを、制限エンドヌクレアーゼＤｒａＩＩＩによって消化され得る二本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、第１鎖ｃＤＮＡに添加する。この反応を、第１鎖ｃＤＮＡおよび１μＭのオリゴヌクレオチドを用いて構成する。このサンプルを、９５℃で２分間加熱し、次いで６４℃で２分間維持して、特異的アニーリングを生じさせる。適切な量の１０×制限緩衝液Ｈ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）をこのサンプルに添加し、そして３７℃までさらに冷却する。制限エンドヌクレアーゼＤｒａ ＩＩＩ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートし、その後４℃で冷却する。

Ｄｒａ ＩＩＩによる第１鎖ｃＤＮＡの消化を、ＰＣＲ増幅によって確認する。増幅産物は、抗体フラグメントをクローニングするためには使用しない。消化された第１鎖ｃＤＮＡの陽性の増幅が、５’ＶＢＶＨ１ａおよび３’ＣＭ０内部コントロールプライマーを、２つの異なる緩衝液条件下で使用して、この反応において観察される。プライマー５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＭ０を用いる良好な増幅およびプライマー５’ＶＢＶＨ１ａ／３’ＣＭ１を用いる最少の増幅は、第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの首尾よいＤｒａ ＩＩＩ消化を示す。

（重鎖第２鎖の直線増幅および入れ子式オリゴ伸長）
Ｄｒａ ＩＩＩ消化した第１鎖ｃＤＮＡを元のテンプレートとして用い、フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応を構築する。これらのプライマーは、ＴＭＸ２４配列、１つのＸｈｏ Ｉ制限部位、およびヒト抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域中の第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計される。これらのアニーリング配列は、ヒト抗体の既知の配列に基づいて設計され、そして上で実施例３に記載したように、重鎖遺伝子のヒト抗体レパートリー全体を網羅すると報告されているＶＢａｓｅデータベースプライマー由来である。用いた重鎖フレームワーク１特異的プライマーは、実施例３に列挙したプライマーである。

サンプルを９４℃で１分間加熱変性させ、次いで（９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間）×２０のサイクルにかけた。これにより、第２鎖ｃＤＮＡを直線増幅が可能であった。「ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔ」（実施例３で使用したように）と称される入れ子式オリゴヌクレオチドを氷上で添加し、０．２μＭの最終濃度にまでする。その第２鎖ｃＤＮＡを、９４℃で１分間加熱変性させ、６８℃で２分間アニーリングおよび伸長させ、入れ子式オリゴからさらに伸長させ、次いで４℃にする。次いで、生じた第２鎖ｃＤＮＡ（操作したテンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮスピンカラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて清浄化する。この工程は、遊離オリゴヌクレオチドを除去し、以降のプロトコルでの簡単な緩衝液の交換を可能にする。

（重鎖単一プライマー増幅（ＳＰＡ））
操作したテンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、およびプライマー「ＴＭＸ２４」を用いて増幅させる。このサンプルを、９５℃で１分間熱変成させ、次いで（９５℃で５秒間、および６８℃で１分間）×３０のサイクルにかけた。これに引き続き、６８℃でさらに３分間置き、４℃にて維持する。

（重鎖クローニングおよびライブラリー作製）
約５００ｂｐの増幅産物を、ゲル精製し、次いでＸｈｏ ＩおよびＥｃｏＲ Ｉにより消化する。この挿入物は、適切なベクターにクローニングされ、ＩｇＭ ＣＨ１ドメインの残りの部分を包含する。Ｆａｂライブラリーを含む連結産物を、エレクトロポレーションにより、Ｅ．ｃｏｌｉに導入する。

バクテリオファージの表面上のＦａｂライブラリーを作製するために、抑制株細胞（例えば、ＸＬ１ＢＬＵＥ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））が用いられる。エレクトロポレーション後、細胞を３７℃で１時間振盪し、次いでカルベニシリンを２０μｇ／ｍｌまで添加する。３７℃で１時間の振盪後、カルベニシリンを５０μｇ／ｍｌまで増加し、３７℃でさらに１時間振盪する。次いで、このＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を添加し、ファージミド粒子の産生に必要な全ての成分を提供し、培養物の容量を、１００ｍｌ（ＳＢ培地）まで増加させる。３７℃にて１時間後、カナマイシンを７０μｇ／ｍｌまで添加し、ヘルパーファージＤＮＡを含むバクテリアを選択する。この培養物を、３７℃で一晩振盪する。その間に、細菌は、その表面上にＦａｂが展示される新しいファージミド粒子を産生する。翌朝、ファージミド粒子を、細菌細胞をスピンアウトし、次いで、４％ＰＥＧ ８０００および０．５Ｍ ＮａＣｌ（氷上にて３０分間）を有する上清からファージミド粒子を沈殿させることにより単離し得る。遠心分離（１４，３００×ｇ）で、ファージペレットを沈殿させる。このペレットを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ中に再懸濁し得る。この調製物を濾過し、細菌の細片を除去し得る。得られたライブラリーを、４℃で保存する。

（実施例５）
（ＩｇＥまたは組換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４で免疫したマウスのｍＲＮＡ由来のファージミド表示ライブラリーの構築）
（ＩｇＧ重鎖およびκ軽鎖についての第１鎖ｃＤＮＡ合成および改変）
ヒトＩｇＥまたは組換えヒトＩｇＥで免疫したマウス由来のマウス脾臓ｍＲＮＡを用い、オリゴｄＴプライマーを有する従来の第１鎖ｃＤＮＡを生成した。これは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、実質的に製造業者の指示に従って用いてなされた。制限オリゴヌクレオチド（ＩｇＧ１に対して「ｍＣＧ１Ｘｃｍ Ｉ」、ＩｇＧ２ａに対して「ｍＣＧ２ａＢｓａＪ Ｉ」、またはκ軽鎖に対して「ｍＣＫＨｐａ Ｉ」）を、ＩｇＧ１に対する制限エンドヌクレアーゼＸｃｍ Ｉ、ＩｇＧ２ａに対する制限エンドヌクレアーゼＢｓａＪ Ｉ、またはκ軽鎖に対する制限エンドヌクレアーゼＨｐａ Ｉによって消化され得る２本鎖ＤＮＡ領域を生成するために、第１鎖ｃＤＮＡに添加した。「ｍＣＧ１Ｘｃｍ Ｉ」配列は、５’ＣＴＡＡＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＧＧＡＴＧ３’（配列番号２００）である。「ｍＣＧ２ａＢｓａＪ Ｉ」配列は、５’ＣＡＡＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣＴＣＴＡＧ３’（配列番号２０１）である。「ｍＣＫＨｐａ Ｉ」配列は、５’ＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧ３’（配列番号２０２）である。第１鎖ｃＤＮＡオリゴヌクレオチド（１μＭ）、および適切な量の１０×ＮＥＢ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ）または１０×制限緩衝液Ａ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、反応を構成した。このサンプルを９５℃で２分間加熱し、次いで６４℃で２分間維持して特異的アニーリングを生じさせ、そしてＸｃｍ ＩおよびＨｐａ Ｉに対して３７℃まで冷却し、ＢｓａＪ Ｉに対して６０℃まで冷却した。この制限エンドヌクレアーゼＸｃｍ Ｉ、ＢｓａＪ Ｉ、またはＨｐａ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加し、各々、３７℃で３０分間、６０℃で３０分間、および３７℃で１０分間、インキュベートした。これらの制限酵素を、Ｘｃｍ Ｉについては６５℃で２０分間、ＢｓａＪ Ｉについては８０℃で２０分間加熱して失活させ、次いでそのサンプルを、４℃まで冷却した。

各制限エンドヌクレアーゼによる第１鎖ｃＤＮＡの消化を、当業者に公知の技術を用いて、ＰＣＲ増幅により確認した。これらの産物は、抗体遺伝子のクローニングに用いなかった。消化した第１鎖ｃＤＮＡの正の増幅が、ＩｇＧ１に対して５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢｓｈｏｒｔおよび３’ｍＣＧ１内部制御プライマーを用いた反応、ＩｇＧ２ａに対して５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢｓｈｏｒｔおよび３’ｍＣＧ２ａ内部制御プライマーを用いた反応、ならびにκに対して５’ＴＭＸ２４ｍＶＫＩＶｓｈｏｒｔおよび３’ｍＣＫ０内部制御プライマーを用いた反応において観察された。プライマー５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢｓｈｏｒｔ／３’ｍＣＧ１またはプライマー５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢｓｈｏｒｔ／３’ｍＣＧ２ａまたは５’ＴＭＸ２４ｍＶＫＩＶｓｈｏｒｔ／３’ｍＣＫ０を用いた良好な増幅およびプライマー５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢｓｈｏｒｔ／３’ｍＣＧ１Ｂまたはプライマー５’ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢｓｈｏｒｔ／３’ｍＣＧ２ａＢまたは５’ＴＭＸ２４ｍＶＫＩＶｓｈｏｒｔ／３’ｍＣＫＢを用いた最小の増幅は、各制限エンドヌクレアーゼによる第１鎖ｃＤＮＡテンプレートの消化の成功を示す。チェックＰＣＲのために用いたプライマーの配列は、
ＴＭＸ２４ｍＶＨＩＩＢｓｈｏｒｔ（配列番号２０３）
５’ＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＹＣ３’
ｍＣＧ１（配列番号２０４）
５’ＣＡＴＧＧＡＧＴＴＡＧＴＴＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧ３’
ｍＣＧ１Ｂ（配列番号２０５）
５’ＣＡＡＣＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＧＧＴＣＴＣ３’
ｍＣＧ２ａ（配列番号２０６）
５’ＣＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＴＴＧＴＡＴＣＴＣＣＡＣ３’
ｍＣＧ２ａＢ（配列番号２０７）
５’ＣＣＡＣＡＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＡＣＴＧ３’
ＴＭＸ２４ｍＶＫＩＶｓｈｏｒｔ（配列番号２０８）
５’ＧＡＣＧＡＣＣＧＧＣＴＡＣＣＡＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＡＷＴＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ３’
ｍＣＫ０（配列番号２０９）
５’ＣＴＧＣＴＣＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧ３’
ｍＣＫＢ（配列番号２１０）
５’ＧＡＧＴＧＧＣＣＴＣＡＣＡＧＧＴＡＴＡＧＣＴＧ３’
（軽鎖第２鎖の直線増幅および入れ子式オリゴ伸長）
Ｈｐａ Ｉ消化した第１鎖ｃＤＮＡを元のテンプレートとして用い、フレームワーク１特異的プライマー（最終０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応を構築した。これらのプライマーは、κに対するＴＭＸ２４ｍＫ配列、およびＸｂａ Ｉ制限部位、およびマウス抗体κ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域中の第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計される。これらのアニーリング配列は、κ軽鎖遺伝子のマウス抗体レパートリー全体を網羅するＫａｂａｔデータベース由来である（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／）、マウス抗体の既知の配列に基づいて設計された。

（Ｄ．κフレームワーク１特異的プライマー）

ここで、ＲはＡおよびＧの等量の混合であり、ＭはＡおよびＣの等量の混合であり、ＫはＧおよびＴの等量の混合であり、ＷはＡおよびＴの等量の混合であり、ＳはＣおよびＧの等量の混合である。

これらのサンプルを、９４℃で１分間、熱変性させ、次いで（９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間）×２０回のサイクルにかけた。このことは、第２鎖ｃＤＮＡの直線増幅を可能にした。κ鎖に対する、「ＴＭＸ２４ｍＣＫｎｏｅｒ」と名付けられた入れ子式オリゴを、最終濃度０．２μＭまで氷上で添加した。「ＴＭ２４ＣＫｎｐｔ」の配列は、

であった。第２鎖ｃＤＮＡをさらに、９４℃での１分間の熱変性、６８℃での２分間のアニーリングおよび伸長によって、入れ子式オリゴから伸長し、その後４℃にした。得られた第２鎖ｃＤＮＡ（操作されたテンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮ遠心カラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて浄化した。この工程は、遊離オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのために、簡単な緩衝剤交換を可能にする。

(軽鎖１本鎖プライマー増幅（ＳＰＡ））
操作されたテンプレートを、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰならびにκ鎖に対するプライマー「ＴＭＸ２４ｍＫ」を使用して増幅した。「ＴＭＸ２４ｍＫ」の配列は：

である。これらのサンプルを、９５℃で１分間、熱変性させ、次いで（９５℃で５秒間、および６８℃で１分間）×２５回のサイクルにかけた。これは、さらに６８℃で３分間および４℃での保持を続けた。

（軽鎖のクローニング）
κ増幅産物をゲル精製し、次いでＸｂａ ＩおよびＢｓｐＥ Ｉにより消化した。このインサートを、κ鎖定常領域の残存部分を含む、適切な発現ベクターにクローニングした。このライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションによって導入し、そして３７℃で一晩培養した。翌朝、ＤＮＡマキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）を実施して、軽鎖ライブラリーＤＮＡを回収した。この軽鎖ライブラリーＤＮＡを、Ｘｈｏ Ｉ／Ｂｌｎ Ｉによって重鎖Ｆｄフラグメント中にクローニングする、続く工程中で使用して、以下の「重鎖のクローニング」に記載されるライブラリーの構築を完了した。

（重鎖第２鎖の直線増幅および入れ子式オリゴの伸長）
Ｘｃｍ ＩおよびＢｓａＪ Ｉで消化した第１鎖ｃＤＮＡを使用して、フレームワーク１に特異的なプライマー（終濃度０．４μＭ）、ｄＮＴＰ、ＡｍｐｌｉＴａｑ酵素およびその１０×反応緩衝液（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する、複数の第２鎖ｃＤＮＡ反応を設定した。これらのプライマーを、ＴＭＸ２４ｍＨ配列、Ｘｈｏ Ｉ制限部位およびマウス抗体重鎖遺伝子のフレームワーク１領域中に第１鎖ｃＤＮＡにアニーリングする領域を含むように設計した。これらのアニーリング配列は、Ｋａｂａｔデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ／）由来のマウス抗体の公知の配列に基づき設計して、重鎖遺伝子のマウス抗体レパートリー全体をカバーした。

（重鎖フレームワーク１の特異的プライマー）

ここで、ＲはＡおよびＧの等量の混合であり、ＭはＡおよびＣの等量の混合であり、ＹはＣおよびＴの等量の混合であり、ＳはＣおよびＧの等量の混合である。

これらのサンプルを、９４℃で１分間、熱変性させ、次いで（９４℃で５秒間、５６℃で１０秒間、および６８℃で２分間）×２０回のサイクルにかけた。このことは、第２鎖ｃＤＮＡの直線増幅を可能にした。ＩｇＧ１に対する「ＴＭＸ２４ｍＣＧ１ｎｏｅｒ」、ＩｇＧ２ａに対する「ＴＭＸ２４ｍＣＧ２ａｎｏｅｒ」と名付けられた入れ子式オリゴを、終濃度０．２μＭまで氷上で添加した。「ＴＭＸ２４ｍＣＧ１ｎｏｅｒ」の配列は、

であり、そして「ＴＭＸ２４ｍＣＧ２ａｎｏｅｒ」は、

であった。

第２鎖ｃＤＮＡをさらに、９４℃で１分間の熱変性、６８℃で２分間のアニーリングおよび伸長することによって、入れ子式オリゴから伸長し、その後４℃にした。得られた第２鎖ｃＤＮＡ（操作されたテンプレート）を、ＱＩＡＧＥＮ遠心カラム（ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて浄化した。この工程は、遊離オリゴヌクレオチドを除去し、そして下流のプロトコルのために、簡単な緩衝液交換を可能にする。

（重鎖１本鎖プライマーの増幅（ＳＰＡ））
操作されたテンプレートを、重鎖に対して、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ポリメラーゼミックス（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）およびその１０×反応緩衝液、ｄＮＴＰ、およびプライマー「ＴＭＸ２４ｍＨ」を使用して増幅した。「ＴＭＸ２４ｍＨ」の配列は：

である。これらのサンプルを、９５℃で１分間、熱変性させ、次いで（９５℃で５秒間、および６８℃で１分間）を、ＩｇＧ１については２８回繰り返し、そしてＩｇＧ２ａについては３０回繰り返した。これに、さらに６８℃で３分間、および４℃での保持を続けた。

（重鎖のクローニング）
重鎖増幅産物をゲル精製し、次いでＸｈｏ ＩおよびＢｌｎ Ｉにより消化した。これらのインサートを、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａについての重鎖定常領域の残存部分を含む、κ鎖ライブラリーＤＮＡにクローニングした。このライゲーションされた産物を、Ｅ．ｃｏｌｉにエレクトロポレーションによって導入し、そして３７℃で一晩培養した。翌朝、ＤＮＡマキシプレップ（ｍａｘｉｐｒｅｐ）を実施して、ＩｇＧ１ κライブラリーＤＮＡまたはＩｇＧ２ａ κライブラリーＤＮＡを回収した。

（組換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４に対するライブラリーのパニングおよびスクリーニング）
ライブラリーを、本質的に以下に記載されるように、組換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４に対して４回パニングした：Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ、ＣＦ Ｂｕｒｔｏｎ、ＤＲ、Ｓｃｏｔｔ、ＪＫ、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ、ＧＪ（２００１）Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。パニングの第二ラウンド、第三ラウンド、第四ラウンド由来の、個々のクローンを、組換えＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４について、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。

ＥＬＩＳＡによって、ＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４に特異的な結合、および非特異的タンパク質（オブアルブミン）に対して最小限の結合を示したクローンを、ＤＮＡ配列決定によって分析した。ＩｇＥ Ｆｃ ＣＨ２〜４に対して、全部で３１個の異なるＦａｂを、マウスライブラリーから単離した。図９ａ〜ｄを参照のこと。

種々の改変が、本明細書中に記載される実施形態に対してなされ得ることが理解される。従って、上記の説明は、限定としてではなく、単なる好ましい実施形態の例示としてみなされるべきである。当業者は、本開示の範囲および精神の中での、他の改変を想起するであろう。

図１は、テンプレートにアニールされたプライマーおよび境界オリゴの模式図である。 図２Ａは、核酸鎖にアニールされた限定オリゴの模式図である。 図２Ｂは、短くされた５’末端を有するテンプレートにアニールされたプライマーの模式図である。 図３は、代替的実施形態の模式図であり、ここで、複数回の重合が、実施され、限定オリゴヌクレオチドは、元のテンプレートではなく新たに合成された鎖にアニールされる。 図４は、新たに合成された核酸鎖にアニールされた入れ子式オリゴの模式図である。 図５は、この開示に従って操作されたテンプレートの模式図である。 図６は、操作されたテンプレートの単一プライマー増幅の模式図である。 図７は、ＴＭＸ２４ＣＭｎｐｔと命名された入れ子式オリゴの配列を示す。 図８ａは、実施例３で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。 図８ｂは、実施例３で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。 図８ｃは、実施例３で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。 図８ｄは、実施例３で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。 図８ｅは、実施例３で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。 図９ａは、実施例５で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。 図９ｂは、実施例５で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。 図９ｃは、実施例５で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。 図９ｄは、実施例５で産生された単離Ｆａｂの配列を示す。

Claims (8)

1. 核酸を増幅する方法であって、以下：
   ａ）プライマーをテンプレートにアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニールする第１部分、および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
   ｂ）該プライマーの第１部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは第１末端および第２末端を有し、該第１末端は該プライマーを組み込んでいる、工程；
   ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
   ｄ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの第２末端に、入れ子式オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該入れ子式オリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第２末端にアニールする第１部分、および該プライマーの第２部分と同一な所定の配列を有する第２部分を有し、該入れ子式オリゴヌクレオチドはその３’末端で伸長されない、工程；
   ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；ならびに
   ｆ）該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程が、異なる配列を有する入れ子式オリゴヌクレオチドのコレクションを提供する工程、および工程（ｂ）において合成された前記ポリヌクレオチドと、該入れ子式オリゴヌクレオチドのコレクションとを接触させる工程を包含する、方法。
3. 前記テンプレートが、前記プライマーにアニーリングする前に消化される、請求項１に記載の方法。
4. 工程（ｂ）において合成された前記ポリヌクレオチドが、前記入れ子式オリゴヌクレオチドにアニーリングされる前に消化される、請求項１に記載の方法。
5. 前記入れ子式オリゴヌクレオチドの３’末端が、工程（ｂ）において合成された前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない、請求項１に記載の方法。
6. 前記入れ子式オリゴヌクレオチドの３’末端が、該３’末端の伸長を防ぐ改変された塩基を含む、請求項１に記載の方法。
7. 核酸を増幅する方法であって、以下：
   ａ）プライマーを、制限エンドヌクレアーゼで消化されたテンプレートにアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニールする第１部分、および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
   ｂ）該プライマーの第１部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは第１末端および第２末端を有し、該第１末端は該プライマーを組み込んでいる、工程；
   ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
   ｄ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの第２末端に、入れ子式オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該入れ子式オリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第２末端にアニールする第１部分、および該プライマーの第２部分と同一な所定の配列を有する第２部分を有する、工程；
   ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；ならびに
   ｆ）該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
   を包含する、方法。
8. 核酸を増幅する方法であって、以下：
   ａ）プライマーをテンプレートにアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニールする第１部分、および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
   ｂ）該プライマーの第１部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドは第１末端および第２末端を有し、該第１末端は該プライマーを組み込んでいる、工程；
   ｃ）工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを制限エンドヌクレアーゼで消化する工程；
   ｄ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
   ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの第２末端に、入れ子式オリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該入れ子式オリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第２末端にアニールする第１部分、および該プライマーの第２部分と同一な所定の配列を有する第２部分を有する、工程；
   ｆ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの末端部分を提供する工程；ならびに
   ｇ）該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
   を包含する、方法。

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