JP2005503802A5 - - Google Patents

Claims (22)

1. 核酸を増幅する方法であって、以下：
   ａ）プライマーをテンプレートにアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニールする第１部分および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
   ｂ）該プライマーの第１部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドが、その第１末端および第２末端に該プライマーを有する、工程；
   ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
   ｄ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの第２末端に、テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該テンプレートオリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第２末端にアニールする第１部分、および該プライマーの第２部分と同一な所定の配列を有する該第２部分を有する、工程；
   ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的な該ポリヌクレオチドの終結部分を提供する工程；ならびに
   ｆ）該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
   を包含する、方法。
2. 請求項１に記載の方法であって、前記テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程が、異なる配列を有するテンプレートオリゴヌクレオチドのコレクションを提供する工程、および工程（ｂ）において合成された前記ポリヌクレオチドとテンプレートオリゴヌクレオチドの該コレクションとを接触させる工程を包含する、方法。
3. 前記テンプレートが、前記プライマーにアニーリングする前に消化される、請求項１に記載の方法。
4. 工程（ｂ）において合成された前記ポリヌクレオチドが、前記テンプレートオリゴヌクレオチドにアニーリングされる前に消化される、請求項１に記載の方法。
5. 核酸を増幅する方法であって、以下：
   ａ）プライマーおよび境界オリゴヌクレオチドをテンプレートにアニーリングする工程であって、該プライマーは、該テンプレートにアニールする第１部分および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
   ｂ）該プライマーの第１部分が該テンプレートにアニールする位置と該境界オリゴヌクレオチドがアニールする該テンプレートの部分との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドが、その第１末端および第２末端に該プライマーを有する、工程；
   ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
   ｄ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドの第２末端に、テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該テンプレートオリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第２末端にアニールする第１部分、および該プライマーの第２部分と同一な所定の配列を有する第２部分を有する、工程；
   ｅ）工程（ｂ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的なそれらの終結部分を提供する工程；
   ｆ）該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
   を包含する、方法。
6. 請求項５に記載の方法であって、前記テンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程が、異なる配列を有するテンプレートオリゴヌクレオチドのコレクションを提供する工程、および工程（ｂ）において合成された前記ポリヌクレオチドとテンプレートオリゴヌクレオチドの該コレクションとを接触させる工程を包含する、方法。
7. 操作された核酸鎖であって、該核酸鎖の第１末端に所定の配列およびそのもう一方の末端に該所定の配列に相補的な配列を有する、核酸鎖。
8. 核酸鎖を増幅する工程であって：
   操作された核酸鎖を提供する工程であって、該核酸鎖は、該核酸鎖の第１末端に所定の配列およびそのもう一方の末端に該所定の配列に相補的な配列を有する、工程；
   ヌクレオチドの重合化に適切な条件下で、ポリメラーゼおよびヌクレオチドの存在下において該所定の配列を有するプライマーと、該操作された核酸鎖とを接触させる工程、
   を包含する、方法。
9. 抗体ライブラリーをコードする核酸のコレクションを作製する方法であって、該方法は、以下：
   ａ）テンプレートの多様な集団を提供する工程；
   ｂ）該テンプレートの多様な集団と少なくとも１つのプライマーとを接触させる工程であって、該少なくとも１つプライマーは、該テンプレートにアニールする第１部分、および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
   ｃ）該プライマーの第１部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第１末端および第２末端に該プライマーを有する、工程；
   ｄ）該テンプレートから、工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
   ｅ）工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドの第２末端に、少なくとも１つのテンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該少なくとも１つのテンプレートオリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第２末端にアニールする第１部分、および該プライマーの該第２部分と同一な所定の配列を有する該第２部分を有する、工程；
   ｆ）工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的なそれらの終結部分を提供する工程；ならびに
   ｇ）該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させる工程、
   を包含する、方法。
10. 抗体ライブラリーを作製する方法であって、該方法は、以下：
    ａ）テンプレートの多様な集団を提供する工程；
    ｂ）該テンプレートの多様な集団と少なくとも１つのプライマーとを接触させる工程であって、該少なくとも１つプライマーは、該テンプレートにアニールする第１部分、および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
    ｃ）該プライマーの第１部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第１末端および第２末端に該プライマーを有する、工程；
    ｄ）該テンプレートから、工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドを分離する工程；
    ｅ）工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドの第２末端に、少なくとも１つのテンプレートオリゴヌクレオチドをアニーリングする工程であって、該少なくとも１つのテンプレートオリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第２末端にアニールする第１部分、および該プライマーの該第２部分と同一な所定の配列を有する該第２部分を有する、工程；
    ｆ）工程（ｃ）において合成された該ポリヌクレオチドを伸長させ、該所定の配列に相補的なそれらの終結部分を提供する工程；
    ｇ）該所定の配列を有する単一プライマーを用いて、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅させて、増幅核酸ライブラリーを作製する、工程；ならびに
    ｈ）該増幅核酸ライブラリーを使用して該抗体ライブラリーを発現する工程、
    を包含する、方法。
11. 核酸に所定の配列を添加して、該核酸を該添加された所定の配列を用いて増幅する方法であって、該方法は、以下：
    ａ）オリゴヌクレオチドをテンプレートにアニーリングして、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む核酸の二本鎖部分を含む複合体を形成する工程；
    ｂ）該複合体を、制限エンドヌクレアーゼ認識部位で該複合体を切断する制限エンドヌクレアーゼとともにインキュベートして、５’末端および３’末端を有する短縮テンプレートを生成する、工程；
    ｃ）プライマーを該短縮テンプレートにアニールする工程であって、該プライマーが、該短縮テンプレートにアニールする第１部分および該短縮テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
    ｄ）該プライマーの第１部分が該短縮テンプレートにアニールする位置と該短縮テンプレートの５’末端との間の、該短縮テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドが、ｉ）その第１末端のプライマー、およびｉｉ）該短縮テンプレートの５’末端に相補的な第２末端を含む、工程；
    ｅ）該短縮テンプレートから、工程（ｄ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
    ｆ）入れ子式オリゴヌクレオチドを、工程（ｄ）において合成されたポリヌクレオチドの第２末端にアニールする工程であって、該入れ子式オリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの第２末端にアニールする第１部分および該プライマーの第２部分と同一の所定の配列を有する第２部分を有する、工程；
    ｇ）工程（ｄ）において合成されたポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的なその終結部分を含む伸長されたポリヌクレオチドを生成する、工程；
    ｈ）該所定の配列を有する単一のプライマーを使用して、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する、工程、
    を包含する、方法。
12. 請求項１１に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドが、工程（ｄ）において合成されるポリヌクレオチドの第２末端にアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼによって、３’方向に伸長され得ない、方法。
13. 請求項１２に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼによる前記３’末端の伸長を妨げる、その３’末端における１つ以上の改変塩基を含む、方法。
14. 請求項１２に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドが、工程（ｄ）において合成された前記ポリヌクレオチドにアニールしない３’末端を含む、方法。
15. 請求項１１に記載の方法であって、工程（ａ）の前に、前記テンプレートを増幅する工程をさらに包含する、方法。
16. 請求項１１に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドが、ｉ）相補性決定領域、ｉｉ）フレームワーク領域、およびｉｉｉ）定常領域からなる群より選択される抗体の一部をコードする、方法。
17. 所定の配列を核酸に添加し、そして該核酸を該添加された所定の配列で増幅する方法であって、該方法が、以下の工程：
    ａ）プライマーをテンプレートにアニールする工程であって、該プライマーが、該テンプレートにアニールする第１部分および該テンプレートにアニールしない所定の配列の第２部分を有する、工程；
    ｂ）該プライマーの第１部分が該テンプレートにアニールする位置と該テンプレートの５’末端との間の該テンプレートの部分に相補的なポリヌクレオチドを合成する工程であって、該ポリヌクレオチドが、ｉ）その第１末端のプライマー、およびｉｉ）該テンプレートの５’末端に相補的な第２末端を含む、工程；
    ｃ）該テンプレートから、工程（ｂ）において合成されたポリヌクレオチドを分離する工程；
    ｄ）オリゴヌクレオチドを工程（ｃ）の分離されたポリヌクレオチドにアニールして、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む核酸の二本鎖部分を含む複合体を形成する、工程；
    ｅ）該複合体を、該制限エンドヌクレアーゼ認識部位で該複合体を切断する制限エンドヌクレアーゼとともにインキュベートして、５’末端および３’末端を有する短縮ポリヌクレオチドを生成する、工程；
    ｆ）入れ子式オリゴヌクレオチドを該短縮ポリヌクレオチドの３’末端にアニールする工程であって、該入れ子式オリゴヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドの３’末端にアニールする第１部分および該プライマーの第２部分と同一の所定の配列を有する第２部分を有する、工程；
    ｇ）該短縮ポリヌクレオチドを伸長して、該所定の配列に相補的なその終結部分を含む伸長されたポリヌクレオチドを生成する、工程；
    ｈ）該所定の配列を有する単一のプライマーを使用して、該伸長されたポリヌクレオチドを増幅する、工程、
    を包含する、方法。
18. 請求項１７に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドが、工程（ｅ）において合成される前記短縮ポリヌクレオチドの３’末端にアニールした後、ＤＮＡポリメラーゼによって、３’方向に伸長され得ない、方法。
19. 請求項１７に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼによる前記３’末端の伸長を妨げる、その３’末端における１つ以上の改変塩基を含む、方法。
20. 請求項１７に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドが、工程（ｅ）において合成された前記短縮ポリヌクレオチドにアニールしない３’末端を含む、方法。
21. 請求項１７に記載の方法であって、工程（ａ）の前に、前記テンプレートを増幅する工程をさらに包含する、方法。
22. 請求項１７に記載の方法であって、前記入れ子式オリゴヌクレオチドが、ｉ）相補性決定領域、ｉｉ）フレームワーク領域、およびｉｉｉ）定常領域からなる群より選択される抗体の一部をコードする、方法。