JP2017519774A5

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Publication number: JP2017519774A5
Application number: JP2016574392A
Authority: JP
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2018-06-14
Anticipated expiration: 2035-06-25

Claims

タグ化核酸断片ライブラリを調製する方法であって、
（ａ）細胞集合を溶解試薬に直接接触させて細胞溶解物を生成するステップであって、前記溶解試薬は１つまたは複数のプロテアーゼを含み、前記細胞溶解物は標的核酸を含む、ステップと；
（ｂ）前記１つまたは複数のプロテアーゼを不活性化させて不活性化細胞溶解物を形成するステップと；
（ｃ）少なくとも１つのトランスポザーゼと、移動鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを、前記標的核酸および前記トランスポゾン末端組成物が転移反応する条件下で前記不活性化細胞溶解物に直接適用して混合物を生成するステップであって、
（ｉ）前記標的核酸を断片化して複数の標的核酸断片を生成し、
（ｉｉ）前記トランスポゾン末端組成物の移動鎖を複数の前記標的核酸断片それぞれの5’末端に連結して複数の5’タグ化標的核酸断片を生成する、ステップと、を含む方法。
（ｉ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は単一の反応管において実行される、
（ｉｉ）前記細胞集合が最小の細胞集合であり、前記最小の細胞集合は１個、２個、３個、４個、若しくは５個の細胞を含む、
（ｉｉｉ）前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、サブチリシン及びその変異体である、
（ｉｖ）前記細胞溶解物中の１つ若しくは複数のプロテアーゼの濃度は、４．５ｍＡＵ／ｍＬ〜５００ｍＡＵ／ｍＬである、任意に、前記細胞溶解物中の１つ若しくは複数のプロテアーゼの濃度は、２２．５ｍＡＵ／ｍＬである
（ｖ）前記細胞集合はステップ（ａ）においてｐＨ７．０〜ｐＨ１０．０で前記溶解試薬に接触する、任意に、前記細胞集合はｐＨ７．０〜ｐＨ９．０で前記溶解試薬に接触する
（ｖｉ）前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、ステップ（ｂ）において、温度を上昇させることにより不活性化させる、任意に、前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、温度を５０℃〜８０℃まで上昇させることにより不活性化させる、任意に、前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、温度を７０℃まで上昇させることにより不活性化させる、又は
（ｖｉｉ）前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、該１つ若しくは複数のプロテアーゼの１つ若しくは複数の阻害剤を加えることにより不活性化させる、請求項１に記載の方法。
前記溶解試薬は１つまたは複数の界面活性剤を含み、
任意に、前記１つまたは複数の界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、任意に、前記１つまたは複数の界面活性剤はトリトンを含む、
請求項１に記載の方法。
前記標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、該標的核酸はステップ（ｃ）においてトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端組成物を適用させる前は前記二本鎖ＤＮＡのままである、請求項１に記載の方法。
前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡである、染色体ＤＮＡ若しくはその断片を含む、又はゲノム若しくは部分ゲノムを含む、請求項４に記載の方法。
前記少なくとも１つのトランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼであり、
任意に、前記少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物はＴｎ５トランスポゾン末端を含む、又は、前記移動鎖は、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、およびアドレスタグドメインのうち１つ若しくは複数を含むタグドメインを備える、
請求項１に記載の方法。
（ｄ）前記5’タグ化標的核酸断片に3’タグが連結する条件下で、ステップ（ｃ）による混合物を、少なくとも１つの核酸修飾酵素とともに直接インキュベーションして、複数のジタグ化標的核酸断片を生成するステップをさらに含み、
任意に、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は単一の反応管において実行される、
請求項１に記載の方法。
前記核酸修飾酵素はポリメラーゼであり、前記3'タグは、前記5'タグ化標的核酸断片の3'末端を伸長することにより形成され、
任意に、
（ｉ）前記核酸修飾酵素はリガーゼであり、前記3'タグは、前記5'タグ化標的核酸断片の3'末端にオリゴヌクレオチドをライゲーションすることにより形成される、又は
（ｅ）１つ若しくは複数のジタグ化標的核酸断片を増幅して、該ジタグ化核酸断片の5'末端および／若しくは3'末端に追加の配列を有する、タグ化核酸断片のライブラリを生成するステップをさらに含む、
請求項７に記載の方法。
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）は、単一の反応管において実行され、
任意に、
（ｉ）前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写介在増幅反応、若しくはループ介在増幅反応のうち１つ若しくは複数の使用を含む、
（ｉｉ）前記増幅は、前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の3'タグに対し相補的な単一プライマーを用いるＰＣＲを含む、又は
（ｉｉｉ）前記増幅は第１プライマーおよび第２プライマーを用いるＰＣＲを含み、前記第１プライマーの少なくとも3'末端部は前記ジタグ化標的核酸断片の3'タグの少なくとも一部に対し相補的であり、前記第２プライマーの少なくとも3'末端部は、前記ジタグ化標的核酸断片の5'タグの少なくとも一部の配列を示し、任意に、前記第１プライマーの5'末端部は前記ジタグ化標的核酸断片の3'タグに対し非相補的であり、前記第２プライマーの5'末端部は前記ジタグ化標的核酸断片の5'タグの少なくとも一部の配列を示さず、任意に、前記第１プライマーは、第１ユニバーサル配列を含み、および／若しくは、前記第２プライマーは第２ユニバーサル配列を含む
請求項８に記載の方法。
前記タグ化核酸断片をシークエンシングするステップをさらに含み、
任意に、
（ｉ）前記タグ化核酸断片のシークエンシングには、合成によるシークエンシング、ブリッジＰＣＲ、チェーンターミネーションシークエンシング、ハイブリッド形成によるシークエンシング、ナノポアシークエンシング、およびライゲーションによるシークエンシングのうち１つまたは複数の使用を含む、
（ｉｉ）前記タグ化核酸断片のシークエンシングには次世代シークエンシングの使用を含む、
（ｉｉｉ）コピー数多型を分析するステップをさらに含む、又は
（ｉｖ）一塩基多型を分析するステップをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
（ａ）１つまたは複数のプロテアーゼを有する溶解試薬、および、
（ｂ）少なくとも１つのトランスポザーゼと、移動鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを有する転移反応組成物を含み、
任意に、前記１つまたは複数のプロテアーゼはサブチリシンおよびその変異体である、
タグ化核酸断片ライブラリを調製するためのキット。
前記溶解剤は１つまたは複数の界面活性剤を含み、
任意に、前記１つまたは複数の界面活性剤はトリトンを含む、
請求項１１に記載のキット。
前記少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物は、タグドメインと、前記移動鎖を含む3'部分とを含み、
任意に、
（ｉ）前記タグドメインは、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、およびアドレスタグドメインのうち１つ若しくは複数を含む、又は
（ｉｉ）前記転移反応組成物は２つ以上のトランスポゾン末端組成物を含み、該２つ以上のトランスポゾン末端組成物はそれぞれ、少なくとも１ヌクレオチドが異なる移動鎖を含む、
請求項１１に記載のキット。
（ｉ）前記トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである、
（ｉｉ）前記トランスポゾン末端組成物はＴｎ５トランスポゾン末端を含む、
（ｉｉｉ）キットはポリメラーゼをさらに含む、
（ｉｖ）キットはリガーゼをさらに含む、又は
（ｖ）増幅反応用試薬をさらに含む、
請求項１１に記載のキットであって、
任意に、前記増幅反応用試薬はＰＣＲ用試薬であり、
任意に、前記増幅反応用試薬は少なくとも１つのプライマーを含み、
任意に、（ａ）前記少なくとも１つのプライマーは、前記移動鎖の少なくとも一部分の配列を示す3'部分を含む、（ｂ）前記少なくとも１つのプライマーは、ユニバーサル配列を含む5'部分を含む。
（ｉ）サイズ選択試薬をさらに含み、任意に、前記サイズ選択試薬はＡＭＰｕｒｅＸＰビーズを含む
（ｉｉ）ライブラリ正規化試薬をさらに含む、又は
（ｉｉｉ）固体表面を有する装置をさらに含み、任意に、ａ）前記装置はフローセル装置である、若しくはｂ）前記固体表面は、分子を規則正しいパターンで固定するのに適したパターン付き表面を含む、
請求項１１に記載のキット。