JP2007537751A5 - - Google Patents

Claims (10)

1. 核酸サンプル中の複数の標的配列を増幅する方法であって、
   （ａ）標的配列を含む各フラグメントが少なくとも１つの定められた末端配列を有するフラグメントになるように、前記核酸サンプルをフラグメント化する工程と、
   （ｂ）前記核酸サンプルが二本鎖である場合に、前記核酸サンプルを変性させる工程と、（ｃ）
   （ｉ）長鎖オリゴヌクレオチドと、これにハイブリダイズしている短鎖オリゴヌクレオチ ドを含み、標的配列含有核酸フラグメントの定められた２つの末端配列に相補的であるか 、あるいは１つの定められた末端配列と１つの定められた内部配列とに相補的である、２ つの突出末端を前記長鎖オリゴヌクレオチドが含むとを特徴とし、及び前記セレクター構 築物がプライマーペアモチーフを含むように、前記長鎖オリゴヌクレオチド及び短いオリ ゴヌクレオチドが少なくとも１つのプライマーモチーフを含むことを特徴とするセレクタ ー構築物、及び
   （ｉｉ）の２つのセレクター構築物であって、その各々が長鎖オリゴヌクレオチドと、これにハイブリダイズしている短鎖オリゴヌクレオチドとを含み、前記長鎖オリゴヌクレオチドの各々が１つの突出末端配列を含み、前記突出末端配列が前記標的配列含有核酸フラグメントのそれぞれの定義された末端配列に相補的であり、並びに前記２つのセレクター構築物がプライマーペアモチーフを含むように、前記長鎖オリゴヌクレオチド及び短いオリゴヌクレオチドが少なくとも１つのプライマーペアモチーフを含むことを特徴とする２つのセレクター構築物
   のいずれかの複数の２本鎖のセレクター構築物と１本鎖である前記フラグメントとを接触させる工程と、
   （ｄ）前記セレクターの突出末端配列を前記フラグメントにハイブリダイズさせる工程と 、
   （ｅ）連結反応により前記セレクターと前記フラグメントを結合する工程と、
   （ｆ）前記セレクターの少なくともサブセットに共通なプライマーペアモチーフに特異的 なプライマーペアを用いて選択された標的配列を同時に増幅する工程であって、前記サブ セットが固有のプライマーペアモチーフを有することを特徴とする工程、
   とを含むことを特徴とする方法であって、
   （ｃ）（ｉ）において、前記セレクター構築物の突出末端が、標的配列含有核酸フラグメ ントの定義された内部配列に相補的である場合、ハイブリダイズさせる工程（ｄ）の後の 標的配列含有核酸配列において突出している末端を、結合工程（ｅ）の前に、エンドヌク レオチド分解酵素によりハイブリダイゼーション二重ポジション（ｄｕｐｌｅｘ ｐｏｓ ｉｔｉｏｎ）で切断することを特徴とする方法。
2. 前記セレクターが共通するプライマーモチーフを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記エンドヌクレオチド分解酵素がＦＬＡＰエンドヌクレオチド分解酵素であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記核酸サンプルをフラグメント化する工程が少なくとも１の制限酵素を用いて行われ ることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の方法。
5. 前記増幅する工程がＰＣＲで行われることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１請 求項に記載の方法。
6. 請求項１の（ｃ）（ｉ）において、前記セレクター及び前記フラグメントを結合し、環 状化した後、残った直鎖ＤＮＡフラグメントを酵素的消化により除去することを特徴とす る請求項１に記載の方法。
7. ゲル電気泳動、ハイブリダイゼーションアレイ、合成による配列決定、液体クロマトグ ラフィーおよび／またはマススペクトロメトリーを用いて生成された増幅生成物を解析す る工程を更に含むことを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１請求項に記載の方法。
8. 遺伝的変異、微生物の同定、発現解析、ゲノムの配列決定および／またはＤＮＡコピー 数の測定のために、請求項１乃至７のいずれか１請求項に記載の方法を使用する方法。
9. 請求項１に記載の方法において用いるためのセレクター構築物を設計し、制限酵素を選 択する方法であって、
   （ａ）核酸配列の中に、増幅されるべき標的配列に隣接している制限部位を見つける工程 と、
   （ｂ）（ｉ）標的配列を含む一本鎖フラグメントが、標的配列中にのみ見られる２つの定 められた末端配列を有するような、または、
   （ｉｉ）標的配列を含む１本鎖フラグメントが標的配列中に見られる１つの定められた 末端及び１つの定められた内部配列を有するようにサンプル配列を切断する制限酵素を選 択する工程と、
   （ｃ）各セレクターが、
   （ｉ）標的配列を含むフラグメントの１の定められた配列に相補的な１の定められた末 端配列、
   ｂ）プライマーモチーフ、及び
   ｃ）妥当な場合、標的配列含有フラグメントの他の定められた末端配列または標的配列 の定められた内部配列のいずれかに相補的な１以上の定められた末端配列、
   を含有するように標的配列を含む各フラグメントのためのセレクターを設計する工程とを 、含む方法。
10. 請求項９の方法を実施するためのソフトウェアコード手段を含むコンピュータプログラ ム製品。