JP7259182B2

JP7259182B2 - ｉｎｓｉｔｕ分子検出のためのハイブリダイゼーション連鎖反応法

Info

Publication number: JP7259182B2
Application number: JP2018555974A
Authority: JP
Inventors: エバンアール．ドーハーティ、; ジョージエム．チャーチ、
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2016-04-25
Filing date: 2017-04-25
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2037-04-25
Also published as: US20240124932A1; US20210381049A1; EP3449016A4; US20190218608A1; CA3210120A1; US11718874B2; CN109415761A; CN116200465A; EP3449016A1; CA3022290A1; WO2017189525A1; US11713485B2; CN109415761B; CA3210120C; AU2017257624A1; AU2023210577A1; JP2019518434A; AU2017257624B2

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／３２６，９５９号に基づく優先権を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容は全ての目的において参照により本明細書に援用される。

政府利益に関する陳述
本発明は、米国立科学財団によって授与された助成金第ＤＧＥ１１４４１５２号及び米国立衛生研究所によって授与された助成金第ＨＧ００５５５０号を基に、政府援助を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

ハイブリダイゼーション連鎖反応法はＣｈｏｉ、ＨａｒｒｙＭＴ、ＶｉｃｔｏｒＡ．Ｂｅｃｋ、及びＮｉｌｅｓＡ．Ｐｉｅｒｃｅによる「Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ：ｈｉｇｈｅｒｇａｉｎ，ｌｏｗｅｒｃｏｓｔ，ｇｒｅａｔｅｒｄｕｒａｂｉｌｉｔｙ．」（ＡＣＳｎａｎｏ８．５（２０１４）：４２８４－４２９４）で説明がなされている。他の方法として米国特許出願公開第２００５／０２６０６３５号、同第２００６／０２２８７３３号、及び米国特許第７，７２７，７２１号に記載されているものが挙げられる。

本開示の実施形態は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（「ＨＣＲ」）に基づく、１以上もしくは複数の（one or more or a plurality of）プローブセットを使用する、生物試料などの試料中の１以上もしくは複数の分子を同定及び／又は配列決定するための方法を対象とする。一般に、ハイブリダイゼーション連鎖反応法では、核酸イニシエーター配列（ＤＮＡイニシエーター配列など）と、２以上又は複数の準安定ＨＣＲモノマーとが使用され、これらは、二本鎖部分の一端にあるリンカーと、前記二本鎖配列の他端の一本鎖に結合した一本鎖配列（トーホールド配列（toe hold sequence）など）とによって連結された二本鎖部分を形成し得る。例示的な準安定ＨＣＲモノマーとして、トーホールド配列を有するＤＮＡヘアピンが挙げられる。理解のし易さのために、準安定ＨＣＲモノマーの例としてヘアピン配列を挙げる場合があるが、異なる構造を有する他の準安定ＨＣＲモノマーを用いてもよい。イニシエーター配列が第一のヘアピン配列の一本鎖にハイブリダイズすると、前記第一のヘアピン配列が開いて一本鎖状の標識された伸展物を生じ、これが次に、第二のヘアピン配列とハイブリダイズすると、前記第二のヘアピン配列が開いて一本鎖状の伸展物を生じ、これが次に、第三のヘアピン配列とハイブリダイズする、などして、複数の標識を有するポリマーが形成され得る。ハイブリダイゼーション連鎖反応の使用に関して、材料及び方法は、その全体が参照によって本明細書に援用される米国特許出願公開第２００６／０２２８７３３号に記載されている。

本明細書に記載の方法には、リンカー又はリンカー配列によって一方の端で連結された二本鎖部分を含むと本明細書において通常は理解される、安定又は準安定なヘアピンなどのＨＣＲモノマーのプールからの、核酸分子のハイブリダイゼーションの連鎖反応を開始させる、ＤＮＡ又はＲＮＡであるイニシエーター鎖の存在、量、及び局在によってコード化された情報の読み取りに使用できる、ダイナミックなＤＮＡベース検出プラットフォームとして、ハイブリダイゼーション連鎖反応（「ＨＣＲ」）が組み入れられている。ＨＣＲは、イニシエーター鎖に局在化される検出可能な部分（フルオロフォアなど）の数を増加させることにより、シグナルを増幅する。イニシエーター鎖は、複数の標的分子を含む試料中の特定の標的分子と関連付けされるようにイニシエーター鎖を設計可能な範囲での、情報の符号化であると言われている。

本開示は、ハイブリダイゼーション連鎖反応サイクル戦略を提供する。プローブセットを使用することで、２～１０回の連続反応、５～１００回の連続反応、１０～１００回の連続反応、又は２０～１００回の連続反応など、連続して実行される、複数のＨＣＲ反応が生じ；あるいは、２～１０回の連続反応セット、１０～１００回の連続反応セット、又は２０～１００回の連続反応セットなど、連続して実行される一連の併発反応として生じ、各反応セットは２～４回のＨＣＲ反応、２～１０回のＨＣＲ反応、２～２０回のＨＣＲ反応、５～２０回のＨＣＲ反応、又は５～５０回のＨＣＲ反応を含んでいる。これらの連続反応又は連続した一連の併発反応を用いることで、１０～１，０００、１０～１０，０００、１００～１，０００，０００、５００～１００，０００、又は１，０００～１０，０００分析物など、複数の分析物の連続標識又は組み合わせ標識が可能となる。本開示は、連続的なプロービング事象のスケジュールを用いる、修飾されているか未修飾であるかを問わない、標的分析物に対して一連のプローブを使用する方法を提供する。本開示は、標的分析物に対するプローブと、１又は複数のＨＣＲイニシエーター配列との間の関連付けをプログラムする方法を提供する。本開示は、ＨＣＲイニシエーター配列の機能性をプログラムする方法を提供する。本開示は、ＨＣＲポリマーのプログラム可能な構築／分解のための、修飾又は未修飾を問わない、一連のＨＣＲヘアピンを使用する方法を提供する。本開示は、ＨＣＲポリマーと蛍光シグナルとの間の関連付けをプログラムする方法を提供する。

図１Ａ～図１Ｃに示され、その全体が参照によって本明細書に援用されるＡＣＳＮａｎｏ８．５（２０１４）：４２８４－４２９４に記載されている特徴が、本明細書に記載の方法に組み込まれている。図１Ａ～図１Ｃは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を介したin situ増幅を図示している。図１ＡはＨＣＲの仕組みを示している。対応するイニシエーターを検出すると、準安定性の蛍光性ヘアピンが自己集合して蛍光性増幅ポリマーになる。一本鎖セグメント「ｂ^＊－ａ^＊」から構成されるイニシエーターＩ１が、Ｈ１の一本鎖トーホールド「ａ」への塩基対形成を介して、ヘアピンＨ１と核形成し、ヘアピンを開く分枝点移動が仲介せられ、一本鎖セグメント「ｃ^＊－ｂ^＊」を含有する複合体Ｉ１・Ｈ１が形成される。この複合体が、一本鎖トーホールド「ｃ」への塩基対形成によってヘアピンＨ２と核形成し、ヘアピンを開く分枝点移動が仲介せられ、一本鎖セグメント「ｂ^＊－ａ^＊」を含有する複合体Ｉ１・Ｈ１・Ｈ２が形成される。このようにしてイニシエーター配列が再生成され、これが、Ｈ１重合工程とＨ２重合工程とを交互に行う連鎖反応の基礎となる。赤色の星はフルオロフォアを示している。図１Ｂはin situハイブリダイゼーションのプロトコルを図示している。検出段階では、１以上もしくは複数のイニシエーター鎖を含むプローブセットが、ｍＲＮＡターゲットにハイブリダイズされ、使用されなかったプローブは試料から洗い流される。増幅段階では、図１Ａで説明されたようなイニシエーター及び複数のヘアピンによるハイブリダイゼーション連鎖反応を用いて、ヘアピンからの、繋留された蛍光性増幅ポリマーの自己集合がイニシエーターにより惹起され、未使用のヘアピンは試料から洗い流される。図１Ｃは実験のタイムラインを示している。標的ｍＲＮＡの数にかかわらず、同じ２段階プロトコルが使用される。多重実験（三色を用いた例が図示されている）において、異なる標的ｍＲＮＡに対するプローブセット（１セットにつき５本のプローブが図示）は、スペクトル的に別個のフルオロフォアで標識された直交性ＨＣＲ増幅カスケードを開始させる直交性イニシエーターを有する。

「ＨＣＲシステム」、「ＨＣＲプローブセット」、又は「ＨＣＲイニシエーター／ヘアピンセット」には、１又は複数の核酸イニシエーター鎖と、１又は複数の準安定ＨＣＲモノマー（例えば、核酸ヘアピン）とが含まれ、これらは一緒になってハイブリダイゼーション連鎖反応ポリマーを形成できる。本明細書に記載の方法によれば、ＨＣＲシステムは、直交性又は他の核酸種との非反応性など、所望の特性を獲得するための、また、所望の動態学的・熱力学的な特性を有するための、基準を用いて設計される。ＨＣＲシステムは、化学的な核酸合成など、標準的な方法を用いて合成することができ、インテグレイテッド・ＤＮＡ・テクノロジーズ社（ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ＩＤＴ、アイオワ州コーラルビル）、Ｗ．Ｍ．ケック財団オリゴ・シンセシス・リソース（Ｗ．Ｍ．ＫｅｃｋＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＯｌｉｇｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓＲｅｓｏｕｒｃｅ）（コネティカット州ニューヘブン）、又はモレキュラー・インスツルメンツ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）（カリフォルニア州パサデナ）などの商業的供給源が挙げられる。あるいは、ＨＣＲシステム成分は標準的な酵素法を用いて合成及び／又は増幅されてもよく、例えば、ＰＣＲ後の一本鎖のλエキソヌクレアーゼ消化によるｓｓＤＮＡの生成（その全体が参照によって本明細書に援用されるＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２０１４）：１４－２３を参照）、又は、インビトロ転写後の逆転写によるｓｓＤＮＡ生成（その全体が参照によって本明細書に援用されるＳｃｉｅｎｃｅ３４８：６２３３（２０１５）：ａａａ６０９０を参照）などがある。

ハイブリダイゼーション連鎖反応の特徴を活用する本明細書に記載の方法は、ＨＣＲ反応の全体に亘って各標的が固有のＨＣＲシグナル又はＨＣＲシグナルセットと関連付けられるように、複数の標的分子、分子の実体、分子の性質、又は分子組成の連続標識又は組み合わせ標識のための、連続して実行される、又は連続して実行される一連の併発反応としての、１以上もしくは複数のＨＣＲ反応の設計によって、例えば生物試料内（in situ）などで、１又は複数の分析物又は標的分子を検出するために、使用することができる。標的分子としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びその類似体などの核酸高分子、タンパク質を含むアミノ酸重合体、上記のいずれかの化学修飾体、脂質、代謝産物、生体分子、及び他の小分子、並びに上記いずれかの１又は複数を含む分子組成物が挙げられる。

標的分子又は分析物は、イニシエーター鎖に連結され得るプローブの標的となる。本開示においては、前記プローブはリンカーによって前記イニシエーター鎖に連結されていてもよい。本開示においては、前記イニシエーター鎖は前記プローブから除去可能であってもよい。本開示においては、前記リンカーは切断可能なリンカーであってもよい。本開示においては、前記リンカーは、結合及び分離し得るあらゆる分子結合対から形成されればよい。前記結合対は、前記プローブ及び前記イニシエーターが直接的には連結されないが、分子の該結合対を介して間接的に連結されるように、前記プローブと前記イニシエーター鎖とを連結する。

本明細書に記載の方法は、急速且つ等温のシグナル増幅及び同一試料中の種々の分析物又は標的分子の検出を可能にする。本明細書に記載の方法は、以下を含む：異なる分析物を検出するための独立した直交性のＨＣＲシステムを同時に用いることによる多重化、異なる分析物を検出するためのスペクトル的に別個の色素で標識された独立した直交性のＨＣＲシステムを同時に用いることによる多重化、ＨＣＲシステムにつき１又は複数のフルオロフォアを同時に用いてのように（その全体が参照によって本明細書に援用されるＳｃｉｅｎｃｅ２９７：８３６－８４０（２００２）を参照）、組み合わせバーコーディング又は比色的バーコーディングによる、スペクトル的に別個の標識の空間の拡張、プローブが標的に特異的に結合するまでイニシエーターを保護する惹起されたプローブを用いることによる特異性、未反応のＨＣＲシステム成分が抑制された蛍光を示す、増幅ポリマーへの構築の際に分離されるフルオロフォア／クエンチャー対と共に自己消光ＨＣＲシステム成分を用いることによるバックグラウンドの低減、ホルムアルデヒドで固定された生物試料又はポリアクリルアミドハイドロゲルなどの小細孔マトリックスに迅速に拡散し浸透する小型ＨＣＲシステム成分を用いることによる試料への効率的な浸透、特定の最終サイズのポリマーへの指数関数的な成長をもたらす非線形ＨＣＲ機構を用いることによる高感度な定量的増幅、並びに、直線的、二次方程式的、又は指数関数的なポリマー成長を示すＨＣＲシステムを用いることによるプログラム可能な増幅。

従って、本明細書に記載の方法は標的分子又は分析物を解析するために循環法（ｃｙｃｌｉｃｍｅｔｈｏｄ）を利用しているため、本明細書に記載の方法は解析のために追跡可能な標的分子又は分析物を利用する。すなわち、特定の標的分子又は分析物は、本明細書に記載のＨＣＲを用いる反復的又は循環的な解析を受けるので、同一試料中に存在し得る他の標的分子又は分析物とスペクトル的に分離可能な形で追跡される。特定の標的分子又は分析物を追跡する方法の一例として、三次元マトリクス中に試料を固定することによるものがあり、これにより、標的分子又は分析物のそれぞれが、前記マトリクス内に固定の既知の位置を有し、本明細書に記載の反復的又は循環的なＨＣＲ手順にかけることができ、ＨＣＲからもたらされるシグナルを監視及び解析することで、同一又は特定の標的分子又は分析物についての時間順のシグナルが得られる。

ある特定の方法段階の反復又は循環など、本明細書に記載の方法は、既知のシステムに付随する直交性ＨＣＲシステムの数に関する上限を克服している点が有利である。ＡＣＳＮａｎｏ８．５（２０１４）：４２８４－４２９４を参照されたい。ＨＣＲは、５つの直交性ＤＮＡＨＣＲプローブセットに限定されることが知られている。同時に使用するために、ＨＣＲプローブセットは互いに非反応性でなければならず、これは典型的にはＨＣＲプローブセットを同時にコンピュータで設計することにより達成される。この工程は多量の計算を必要とする場合があり、同時に設計されるプローブセット数のスケーリングは計算コストを劇的に増加させる可能性がある。実際には、核酸配列空間がＨＣＲシステムの機能ドメイン（例えば、イニシエータードメイン及び増殖領域）のサイズによって規定されるとして、ＨＣＲプローブセット数の増大は、核酸配列空間におけるプローブセット間の距離が縮まるため、バックグラウンド及び偽陽性増幅の増加を代償とする。他にも、核酸配列「設計空間」のサイズを増加することによるＨＣＲプローブをより特異的にするための操作に関連した代償が存在する場合があり、例えば、長い増殖領域を有するＨＣＲプローブセットほど、重合するのに有意により長い時間がかかり得る。

本明細書に記載の方法は、既知のシステムに付随する固有のバーコーディング限界を克服している点で有利である。各ＨＣＲプローブセットをＮ個のスペクトル的に別個の色素のうちの１つで標識した場合、Ｎ個の分析物が同時に標識され得る。組み合わせ及び単色のバーコードが全て使用された場合、同時に標識される分析物の数は２^Ｎ－１個となる。

生物系は、分子種、分子的性質、及び分子構成の点において、膨大な複雑さを示す。本明細書に記載の方法は、生物系内の分子の名前、存在量、及び局在を決定する（例えば生物系の分子構成を測定する）目的で、複数の分子種、分子構成、及び分子的性質を同時に多重標識するために、使用できる。標的分析物のある特定の特性は、測定されることが望ましい標的の存在、局在、存在量、数、名前、性質、立体配置、又は他の特性に関する、いくらかの「一次情報」を含んでいる。ここで、「情報」とは、生物系内での、原子、分子、化合物、又は分子複合体の特定の空間的及び／又は時間的な配置によって伝達又は表現される、測定されることが望ましいものを広く指すとされる。検出時、この情報又はいくらかのその断片は、標的分析物からヒト又はコンピュータシステムへと標識及び検出を介して伝達される。

Ｎ個の直交性の、独立した、且つスペクトル的に別個のＨＣＲシステムを特定として、本明細書に記載の方法は、線形又は指数関数的なバーコーディングのための、分析物を連続標識する方法段階を用いることにより、より大きな多重性を可能にする。線形バーコーディングは、Ｎ個のＨＣＲシステムを連続的にｋ回再利用（すなわち同じものを使用）し、合計ｋ×Ｎ個の分析物を標識する。これは、ＨＣＲの各回の間に各ＨＣＲイニシエーターが異なる分析物と関連付けられるように、各回のＨＣＲ増幅及び検出の間で分析物とＨＣＲイニシエーターとの間の関連付けを変化させることにより、達成できる。指数関数的バーコーディングは、Ｎ個のＨＣＲシステムを連続的にｋ回再利用（すなわち同じものを使用）し、合計Ｎ^ｋ個の分析物を標識する。これは、各分析物が逐次ＨＣＲサイクルの全体に亘って多数のＨＣＲイニシエーターと関連付けられるように（各分析物はそれぞれの逐次ＨＣＲサイクル中に０～１のＨＣＲシステムと関連付けられる）、ＨＣＲ増幅及び検出の各サイクル間で分析物とＨＣＲイニシエーターとの間の関連付けを変化させることにより、達成できる。故に、ＨＣＲサイクルの全体に亘って、標的分析物と関連付けられた組み合わせ標識は、各サイクル内の個々のＨＣＲシグナルから構成される。両方の場合で、標的分析物と、検出される蛍光シグナルを生成すると理解されるＨＣＲ反応との間の関係は、ＨＣＲ反応が分析物標識（in situ標識など）を目的としてコードされる一連の蛍光シグナルを生成するように経時的に設計されるという点において、プログラム可能である。まとめると、この科学技術は、標識プロセス全体の中で工程が循環され得る、すなわち連続的且つ繰り返して発生するため、循環的ＨＣＲ（ＣＨＣＲ）と呼ばれる。

本開示は、試料をプローブと接触させる工程、前記試料をＨＣＲイニシエーター配列と接触させる工程、前記試料を準安定ＨＣＲモノマー（ヘアピンなど）と接触させる工程、及び、前記試料を蛍光性部分と接触させる工程を含み、前記プローブは前記標的分析物と結合し、前記ＨＣＲイニシエーター配列は前記プローブと関連付けられ、前記イニシエーター配列は前記対応するヘアピンと核形成して繋留された増幅ポリマーの自己集合を惹起し、前記繋留された増幅ポリマーは前記蛍光性部分と関連付けられ、前記試料の蛍光を測定することにより前記標的分析物が検出される、ＨＣＲ反応の標識カスケードを「プログラム」するための方法及び材料を提供する。

本開示はさらに、前記試料をプローブと接触させる工程、前記試料をＨＣＲイニシエーター配列と接触させる工程、前記試料を準安定ＨＣＲモノマー（ヘアピンなど）と接触させる工程、及び前記試料を前記蛍光性部分と接触させる工程を含み、前記プローブは前記標的分析物と結合し、前記ＨＣＲイニシエーター配列は前記プローブと関連付けられ、前記イニシエーター配列は前記対応するヘアピンと核形成して繋留された増幅ポリマーの自己集合を惹起し、前記繋留された増幅ポリマーは前記蛍光性部分と関連付けられ、前記試料の蛍光を測定することにより前記標的分析物が検出され；前記ＨＣＲポリマーから前記蛍光性部分を分離させ、洗浄などによって前記試料からそれを除去する工程、前記ＨＣＲポリマーを分解若しくは解体し、洗浄などによって前記試料から構成断片を除去する工程、前記プローブと接触している前記標的分析物から前記ＨＣＲイニシエーター配列を解離若しくは除去し、洗浄などによって前記試料から除去する工程、及び／又は、前記標的分析物から前記プローブを解離させ、洗浄などによって前記試料からそれを除去する工程も含む、標識カスケードを「プログラム」するための方法及び材料を提供する。

循環的ＨＣＲは、とりわけ、各情報伝達工程のプログラマビリティを達成するための方法及び材料によって可能となる。「プログラマビリティ」とは、情報伝達又は標識カスケードの各工程をゲーティング可能にする、すなわち、前記情報伝達又は標識カスケードが１以上もしくは複数の入力に依存している、所定の不連続なスケジュールに従って実行可能とする材料及び方法を指し；あるいは、各工程は、特異的に解除させることが可能であり（すなわち、前記標識カスケード内の後の工程に移った情報が、検出された後に、選択的に不活性化される、除去される、破壊される又は検出不可にされる）；又は、各工程はゲーティングされることも可逆的であることも両方可能である。「ゲーティングされた（ｇａｔｅｄ）」とは、本明細書で使用される場合、「不活性な」、「阻害された」、「進行不可な」を意味する場合があり、「ゲーティングされていない（ｕｎｇａｔｅｄ）」とは、本明細書で使用される場合、「活性がある」、「活性化された」、「阻害されていない」、「進行可能な」、などを意味する場合がある。

本開示は、以下の工程を含む、生物試料中の標的分析物を検出するための方法を提供する：前記試料をイニシエーター配列を含むプローブと接触させる工程、前記試料を１以上もしくは複数の準安定な蛍光性ＨＣＲモノマー（ヘアピンなど）と接触させる工程、（ここで、前記プローブは前記標的分析物と結合し、前記イニシエーター配列は前記対応するヘアピンと核形成して繋留された蛍光性増幅ポリマーの自己集合を開始させる）、並びに、前記試料の蛍光を測定することにより前記試料中の前記標的分析物を検出する工程。一実施形態では、複数の標的分析物を検出するために複数のプローブが添加され得る。別の実施形態では、マルチプレックス検出のために、スペクトル的に別個のフルオロフォアを有する複数の準安定な蛍光性ヘアピンが添加され得る。一実施形態では、前記分析物は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びそれらの類似体を包含する核酸高分子を含む。別の実施形態では、前記分析物は、タンパク質及びその化学修飾物を包含するアミノ酸重合体を含む。さらに別の実施形態では、前記分析物は、脂質、代謝産物、生体分子、及び他の小分子を含む。一実施形態では、前記イニシエーター配列はＤＮＡイニシエーター配列である。別の実施形態では、本開示による方法は、マルチプレックス検出のための、線形又は指数関数的なバーコーディングのための、分析物の連続標識をさらに含む。一実施形態では、本開示による方法は、リンカープローブ又は第二プローブを前記標的分析物に結合させることをさらに含む。別の実施形態では、前記リンカープローブ又は第二プローブは、前記イニシエーター配列を含む前記プローブに結合する。ある実施形態では、前記イニシエーター配列は、前記標的分析物に対して、共通又は特有である。一実施形態では、前記プローブが前記標的分析物に特異的に結合して、前記イニシエーター配列が活性化されるまで、前記イニシエーター配列が保護又は阻害されるように、前記プローブは、惹起された、又は活性化可能なプローブである。ある実施形態では、標的分析物と関連付けられた固有の標識は、循環的ＨＣＲを用いる、１以上もしくは複数の個々のＨＣＲシグナルから構成される。

本開示は、生物試料をプローブと接触させる工程、前記試料を前記プローブと関連付けられるＨＣＲイニシエーター配列と接触させる工程、前記生物試料をヘアピンなどの準安定ＨＣＲモノマーと接触させる工程、を含み、前記プローブは前記生物試料中の標的分析物と結合し、前記ＨＣＲイニシエーター配列は前記プローブと関連付けられ、前記イニシエーター配列は前記対応するヘアピンと核形成して繋留された増幅ポリマーの自己集合を惹起し、前記繋留された増幅ポリマーは前記蛍光性部分と関連付けられ、前記ポリマーの蛍光を測定することにより前記標的分析物が前記生物試料中で検出される、in situイメージング法をさらに提供する。

一実施形態では、複数の標的分析物をイメージングするために複数のプローブが添加され得る。別の実施形態では、マルチプレックスイメージングのために、スペクトル的に別個のフルオロフォアを有する複数の準安定な蛍光性ヘアピンが添加され得る。別の実施形態では、本開示による方法は、マルチプレックス検出のための、線形又は指数関数的なバーコーディングのための、分析物の連続標識をさらに含む。一実施形態では、本開示による方法は、前記標的分析物に固有のリンカープローブ又は第二プローブを前記標的分析物に結合させることをさらに含む。別の実施形態では、前記リンカープローブ又は第二プローブは、前記イニシエーター配列を含む前記プローブに結合する。ある実施形態では、前記イニシエーター配列は、前記標的分析物に対して、共通又は特有である。一実施形態では、前記プローブが前記標的分析物に特異的に結合して、前記イニシエーター配列が活性化されるまで、前記イニシエーター配列が保護又は阻害されるように、前記プローブは惹起されたプローブである。本開示による方法は、数回のハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」及び検出サイクルをさらに含む。

本開示は、１又は複数の核酸イニシエーター鎖、及び準安定な核酸蛍光性のＨＣＲモノマー（ヘアピンなど）を含むプローブを含み、前記イニシエーター鎖は前記対応するヘアピンと核形成してＨＣＲ蛍光性ポリマーの自己集合を開始させることが可能である、ハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」システムを提供する。一実施形態では、複数の標的分析物をイメージングするために複数のプローブが存在する。別の実施形態では、マルチプレックスイメージングのために、スペクトル的に別個のフルオロフォアを有する複数の準安定な蛍光性ヘアピンが存在する。一実施形態では、前記システムは、直交性又は他の核酸種との非反応性など、所望の特性を獲得するための、並びに、所望の動態学的・熱的な特性を有するための、基準を用いて設計される。一実施形態では、前記ヘアピンは化学的及び／又は酵素的な合成で生成できる。いくつかの実施形態では、数回のハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」及び検出サイクルが実行され得る。一実施形態では、前記イニシエーター及びヘアピンは再利用可能である。別の実施形態では、前記蛍光シグナルはプログラムによって生成およびリセット可能である。

一態様によれば、本開示は、以下を含む、試料中の１又は複数の標的分析物を検出するための方法を提供する：前記試料を１又は複数のプローブセットと接触させること（各プローブセットはリンカーに対して各々対応する１又は複数の第一プローブを含み、各プローブセットは標的分析物に対して特異的である）、前記試料を前記リンカーに結合する１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと接触させること、前記試料を１又は複数のＨＣＲ増幅因子システムと接触させること、ここで、各ＨＣＲ増幅因子システムは２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含み、前記ＨＣＲモノマーのうちの少なくとも１つは検出可能な標識を含み、前記第一プローブは前記標的分析物と結合し、前記リンカーは前記第一プローブを前記イニシエーターと連結し、前記イニシエーターが前記対応するＨＣＲ増幅因子モノマーと接触し、自己集合し繋留された核酸増幅ポリマー産物のハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起し、前記検出可能な標識が検出される。一実施形態では、標的分析物にそれぞれ特異的な複数のプローブセットが、プログラム可能であり、かつ時間的に順序付けられたハイブリダイゼーション連鎖反応用に設計される。別の実施形態では、前記検出可能な標識は蛍光標識であり、経時的に生成された蛍光シグナルは全体として、分子の実体、分子の性質、又は分子構成を含む各標的分析物の固有の一群の情報を与える。一実施形態では、前記試料は前記プローブセット及び前記イニシエーターと同時に接触させることができる。別の実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子システムは２つの準安定なＤＮＡヘアピンから構成される。一実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子システムの前記検出可能な標識は、マルチプレックス検出のためのスペクトル的に別個の蛍光シグナルを含む。別の実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子システムの前記検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションによる蛍光シークエンシング、ライゲーションによる蛍光シークエンシング、又は合成による蛍光シークエンシングのための、シークエンシング用鋳型を含む。いくつかの実施形態では、前記標的分析物は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びそれらの類似体を包含する核酸高分子を含む。他の実施形態では、前記標的分析物は、タンパク質及びその化学修飾物を包含するアミノ酸重合体を含む。いくつかの実施形態では、前記標的分析物は、脂質、代謝産物、生体分子、及び他の小分子を含む。ある実施形態では、前記イニシエーターは、核酸ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）開始領域を含む。一実施形態では、前記イニシエーターはＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子モノマーは、リンカーによって連結された準安定なＤＮＡ二重鎖を含む。いくつかの実施形態では、前記標的分析物は連続標識される。一実施形態では、各サイクルが１又は複数のＨＣＲシステムの検出可能な標識の検出を含む、ＨＣＲのサイクルの全体からの、組み合わされ、時間的に順序付けられた、一連の検出ラベルは、各標的分析物に対して、固有の複合標識を含む。別の実施形態では、前記複合標識は、マルチプレックス検出のための、線形又は指数関数的なバーコードを含む。一実施形態では、前記固有の複合標識は、バーコード化されたメッセージを含む。別の実施形態では、前記バーコード化されたメッセージは、エラー検出又はエラー修正についての情報を含む、追加の情報をさらに含有する。一実施形態では、一連のプログラム可能であり、かつ時間的に順序付けられたハイブリダイゼーション連鎖反応及び対応する蛍光シグナルの設計は、各標的分析物用の固有のバーコード化されたメッセージを含む。一実施形態では、循環的ＨＣＲは、各情報伝達工程がプログラム可能であることにより可能となる。前記プログラマビリティは、情報伝達の各工程を、ゲーティング及び／又は解除可能にすることを指す。ゲーティングされた情報伝達は、情報伝達が１又は複数の入力に依存する、所定の、不連続なスケジュールに従った遂行を指す。一実施形態では、１又は複数の第一プローブセットの前記標的への結合は２回以上繰り返される。一実施形態では、前記第一プローブ及び前記リンカーは、共有結合性又は非共有結合性の相互作用を介して連結される。別の実施形態では、前記リンカー及び前記イニシエーターは、共有結合性又は非共有結合性の相互作用を介して連結される。一実施形態では、前記リンカーは、結合であってもよく、又は、イニシエーター配列を含むオリゴヌクレオチドの配列部分に相補的であり、前記イニシエーター配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、配列部分を含んでいてもよい。別の実施形態では、前記第一プローブと前記リンカーとの間の連結はプログラム可能に破壊又は解除される。一実施形態では、前記リンカーと前記イニシエーターとの間の連結は、プログラム可能に破壊又は解除される。別の実施形態では、前記リンカーは、イニシエーターがＨＣＲを開始させることを防ぐ、保護基に対応するイニシエーター配列を含む。一実施形態では、前記イニシエーター配列は、保護オリゴヌクレオチドによって保護される。別の実施形態では、前記保護基が前記リンカーからプログラム可能に破壊され、これにより、前記イニシエーターがＨＣＲを開始させることが可能となる。一実施形態では、トーホールド鎖置換によって保護オリゴヌクレオチドを除去するために、脱保護オリゴヌクレオチドが導入され得る。別の実施形態では、前記ＨＣＲポリマーは前記検出可能な標識を検出した後に分解又は解体される。一実施形態では、前記ＨＣＲポリマーと前記検出用標識との間の連結は、検出後にプログラム可能に破壊又は解除される。別の実施形態では、前記第一プローブの前記標的への結合、及び前記第一プローブと、前記リンカーと、前記イニシエーターと、前記ポリマーと、前記検出用部分との間の連結は、プログラム可能に破壊及び解除され得る。ある実施形態では、前記方法は、数回のハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」及び検出サイクルをさらに含む。他の実施形態では、前記方法は、生物試料のin situイメージングに使用できる。

別の態様によれば、本開示は、１又は複数のプローブセット（各プローブセットはリンカーに対して各々対応する１又は複数の第一プローブを含み、各プローブセットは標的分析物に対して特異的である）、イニシエーター、並びに、１又は複数のＨＣＲ増幅因子システム（各ＨＣＲ増幅因子システムは２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含み、前記ＨＣＲモノマーの少なくとも１つは検出可能な標識を含む）、を含み、前記イニシエーターは前記対応するＨＣＲ増幅因子モノマーと接触し、自己集合し繋留された核酸増幅ポリマー産物のハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起し、前記検出可能な標識が検出される、循環的ハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」システムを提供する。一実施形態では、標的分析物にそれぞれ特異的な複数のプローブセットが、プログラム可能であり、かつ時間的に順序付けられたハイブリダイゼーション連鎖反応用に設計される。別の実施形態では、経時的に生成された蛍光シグナルは全体として、分子の実体、分子の性質、又は分子構成を含む各標的分析物の固有の一群の情報を与える。一実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子モノマーはＤＮＡヘアピンである。別の実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子モノマーの前記検出可能な標識は、マルチプレックス検出のためのスペクトル的に別個の蛍光シグナルをさらに含む。一実施形態では、前記システムは、直交性又は他の核酸種との非反応性など、所望の特性を獲得するための、並びに、所望の動態学的・熱力学的な特性を有するための、基準を用いて設計される。別の実施形態では、前記ＨＣＲモノマーは化学的及び／又は酵素的な合成で生成できる。一実施形態では、非蛍光性ＨＣＲモノマーが使用され得る。別の実施形態では、前記非蛍光性ＨＣＲモノマーはＨＣＲ重合段階の際又はその後に蛍光標識される。一実施形態では、非蛍光性モノマーから形成されたポリマーがＨＣＲ重合段階後に蛍光標識される。別の実施形態では、前記非蛍光性モノマーから形成されたポリマーは、ハイブリダイゼーションによる蛍光シークエンシング、ライゲーションによる蛍光シークエンシング、若しくは合成による蛍光シークエンシングによって、酵素反応によって、又は化学反応によって、ＨＣＲ重合段階後に蛍光標識される。ある実施形態では、２回以上のハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」及び蛍光検出が実行され得る。他の実施形態では、前記プローブ、リンカー、イニシエーター及びＨＣＲモノマーは再利用され得る。一実施形態では、前記リンカーは、イニシエーターを含むオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列である。別の実施形態では、前記リンカーは、前記イニシエーターからのプログラム可能な分離のための官能基を含む。一実施形態では、前記リンカーは、イニシエーターがＨＣＲを開始させることを防ぐ、保護基に対応するイニシエーターを含む。別の実施形態では、前記第一プローブの前記標的に対する結合、並びに、前記第一プローブと、前記リンカーと、前記イニシエーターと、前記ポリマーと、前記検出可能な標識との間の連結を、各回のハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」及び検出サイクルの間に途絶及び解除させることができ、これにより、前記システムのプログラマビリティが可能となる。一実施形態では、前記検出可能な標識の検出はプログラムによって生成及びリセットされ得る。別の実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子モノマーは、前記ポリマーのプログラム可能な解体又は分解のための官能基を含有する。一実施形態では、前記官能基はトーホールド鎖置換配列を含む。別の実施形態では、前記官能基は、化学的に不安定性の、酵素に対して不安定性の、又は光に対して不安定性の化学基を含む。ある実施形態では、前記標的分析物への前記プローブ結合は、化学的処理、酵素処理、ＲＮＡＩＳＨ用プローブのデオキシリボヌクレアーゼ処理、５’ ｐｈｏｓＩＳＨ用プローブのエキソヌクレアーゼ処理、核酸プローブのヌクレアーゼ処理、ペプチドプローブのプロテアーゼ処理、熱若しくは変性剤の使用による核酸ハイブリダイゼーションの破壊、熱若しくは変性剤の使用によるアプタマー結合の破壊、又は、熱若しくは変性剤の使用による抗体とタンパク質との間の結合の破壊を含む方法によって解除される。一実施形態では、前記システムは、結合したプローブへのＨＣＲイニシエーター機能的連結をプログラムするための方法を含む。別の実施形態では、結合プローブへのＨＣＲイニシエーター機能的連結をプログラムするための前記方法は、ａ）ハイブリダイゼーションによる配列決定を用いて相補的核酸分子を有するリンカープローブにイニシエーターを加えるための核酸ハイブリダイゼーションの使用、ｂ）リンカープローブにイニシエーターを加えるための酵素の使用、ｃ）リンカープローブにハイブリダイズしたイニシエーターを除去するための核酸ハイブリダイゼーションを破壊するための熱若しくは変性剤の使用、ｄ）リンカープローブを介して標的分子に局在するイニシエーターから保護鎖を除去するためのトーホールド鎖置換の使用、並びに、ｅ）前記イニシエーターと前記リンカープローブとの間の化学結合を破壊する化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって前記イニシエーターが除去可能であるようにするための、前記イニシエーターとリンカープローブとの間への化学物質、酵素、又は光に対して不安定な基の挿入、を含む。一実施形態では、前記リンカープローブにイニシエーターを加える酵素は、スプリントライゲーション反応を触媒するＤＮＡリガーゼである。別の実施形態では、前記システムは、ハイブリダイゼーション連鎖反応を逆行させるための方法を含む。一実施形態では、ハイブリダイゼーション連鎖反応を逆行させるための方法は、ａ）１又は複数の相補ＤＮＡ鎖の追加がＨＣＲポリマーの分解を引き起こすように、トーホールド鎖置換のための１又は複数の付加配列を含む修飾ＨＣＲモノマーを使用すること、並びに、ｂ）ＨＣＲポリマーが化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって断片化又は破壊可能であるように、ＨＣＲモノマーのＤＮＡ骨格内に１又は複数の酵素的若しくは化学的に感受性の基、又は光に対して不安定な基を含む、修飾ＨＣＲモノマーを使用すること、を含む。一実施形態では、前記システムは、前記ＨＣＲポリマー蛍光シグナルの機能的生成をプログラムするための方法を含む。ある実施形態では、前記蛍光シグナルのＨＣＲポリマー機能的生成をプログラムするための方法は、ａ）合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）を用いてプローブすることが可能な付加配列を含む修飾ＨＣＲモノマーを用いることで、蛍光性部分を前記ＨＣＲポリマーに導入すること、ｂ）ＨＣＲＤＮＡモノマー骨格と蛍光性部分との間に酵素、化学物質、又は光に対して不安定な基を含む修飾ＨＣＲモノマーを用いることで、前記蛍光性部分を化学的処理、酵素的処理、又は光処理で除去できるようにすること、ｃ）ＳＢＳ、ＳＢＬ、又はＳＢＨなどによりＨＣＲポリマーを標識可能な修飾蛍光プローブであって、トーホールド鎖置換のための付加配列を含む修飾蛍光プローブを用いることで、前記蛍光プローブと前記ＨＣＲポリマーとの間のハイブリダイゼーションの破壊により前記蛍光プローブを前記ＨＣＲポリマーから除去できるようにすること、並びに、ｄ）ＳＢＳ、ＳＢＬ、又はＳＢＨなどによりＨＣＲポリマーを標識可能な修飾蛍光プローブであって、前記ＨＣＲポリマー骨格と蛍光性部分との間に酵素、化学物質、又は光に対して不安定な基を含む修飾蛍光プローブを用いることで、化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって前記蛍光性部分を除去できるようにすること、を含む。

一態様によれば、本開示は、以下を含む、ハイブリダイゼーション連鎖反応（HCR）によってin situで生物試料中の１又は複数の標的分析物を検出するための方法を提供する：前記試料を１又は複数のプローブセットと接触させること（各プローブセットはリンカーに対して各々対応する１又は複数の第一プローブを含み、各プローブセットは標的分析物に対して特異的である）、前記試料を１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと接触させること、前記試料を１又は複数のＨＣＲ増幅因子システムと接触させること、ここで、各ＨＣＲ増幅因子システムは２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含み、前記ＨＣＲモノマーのうちの少なくとも１つは検出可能な標識を含み、前記第一プローブは前記標的分析物と結合し、前記リンカーは前記第一プローブを前記イニシエーターと連結し、前記イニシエーターが前記対応するＨＣＲ増幅因子モノマーと接触し、自己集合し繋留された核酸増幅ポリマー産物のハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起し、前記検出可能な標識が検出される。一実施形態では、標的分析物にそれぞれ特異的な複数のプローブセットが、プログラム可能であり、かつ時間的に順序付けられたハイブリダイゼーション連鎖反応用に設計される。別の実施形態では、経時的に生成された蛍光シグナルは全体として、分子の実体、分子の性質、又は分子構成を含む各標的分析物の固有の一群の情報を与える。一実施形態では、前記試料は前記プローブセット及び前記イニシエーターと同時に接触させることができる。別の実施形態では、前記標的分析物への前記プローブ結合が解除可能であることにより、ハイブリダイゼーション連鎖反応を用いて前記標的分析物を再プローブし、シグナルを増幅することが可能である。ある実施形態では、前記標的分子への前記前記プローブ結合は、化学的処理、酵素処理、ＲＮＡＩＳＨ用プローブのデオキシリボヌクレアーゼ処理、５’ ｐｈｏｓＩＳＨ用プローブのエキソヌクレアーゼ処理、核酸プローブのヌクレアーゼ処理、ペプチドプローブのプロテアーゼ処理、熱若しくは変性剤の使用による核酸ハイブリダイゼーションの破壊、熱若しくは変性剤の使用によるアプタマー結合の破壊、又は、熱若しくは変性剤の使用による抗体とタンパク質との間の結合の破壊を含む方法によって解除される。一実施形態では、前記方法は、結合したプローブへのＨＣＲイニシエーター機能的連結をプログラムするための方法をさらに含む。一実施形態では、結合プローブへのＨＣＲイニシエーター機能的連結をプログラムするための前記方法は、ａ）ハイブリダイゼーションによる配列決定を用いて相補的核酸分子を有するリンカープローブにイニシエーターを加えるための核酸ハイブリダイゼーションの使用、ｂ）リンカープローブにイニシエーターを加えるための酵素の使用、ｃ）リンカープローブにハイブリダイズしたイニシエーターを除去するための核酸ハイブリダイゼーションを破壊するための熱若しくは変性剤の使用、ｄ）リンカープローブを介して標的分子に局在するイニシエーターから保護鎖を除去するためのトーホールド鎖置換の使用、並びに、ｅ）前記イニシエーターと前記リンカープローブとの間の化学結合を破壊する化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって前記イニシエーターが除去可能であるようにするための、前記イニシエーターとリンカープローブとの間への化学物質、酵素、又は光に対して不安定な基の挿入、を含む。一実施形態では、前記リンカープローブにイニシエーターを加える酵素は、スプリントライゲーション反応を触媒するＤＮＡリガーゼである。一実施形態では、前記方法は、ハイブリダイゼーション連鎖反応を逆行させるための方法をさらに含む。一実施形態では、ハイブリダイゼーション連鎖反応を逆行させるための方法は、ａ）１又は複数の相補ＤＮＡ鎖の追加がＨＣＲポリマーの分解を引き起こすように、トーホールド鎖置換のための１又は複数の付加配列を含む修飾ＨＣＲモノマーを使用すること、並びに、ｂ）ＨＣＲポリマーが化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって断片化又は破壊可能であるように、ＨＣＲモノマーのＤＮＡ骨格内に１又は複数の酵素的若しくは化学的に感受性の基、又は光に対して不安定な基を含む、修飾ＨＣＲモノマーを使用すること、を含む。一実施形態では、前記方法は、前記ＨＣＲポリマー蛍光シグナルの機能的生成をプログラムするための方法をさらに含む。一実施形態では、前記蛍光シグナルのＨＣＲポリマー機能的生成をプログラムするための方法は、ａ）合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）を用いてプローブすることが可能な付加配列を含む修飾ＨＣＲモノマーを用いることで、蛍光性部分を前記ＨＣＲポリマーに導入すること、ｂ）ＨＣＲＤＮＡモノマー骨格と蛍光性部分との間に酵素、化学物質、又は光に対して不安定な基を含む修飾ＨＣＲモノマーを用いることで、前記蛍光性部分を化学的処理、酵素的処理、又は光処理で除去できるようにすること、ｃ）ＳＢＳ、ＳＢＬ、又はＳＢＨなどによりＨＣＲポリマーを標識可能な修飾蛍光プローブであって、トーホールド鎖置換のための付加配列を含む修飾蛍光プローブを用いることで、前記蛍光プローブと前記ＨＣＲポリマーとの間のハイブリダイゼーションの破壊により前記蛍光プローブを前記ＨＣＲポリマーから除去できるようにすること、並びに、ｄ）ＳＢＳ、ＳＢＬ、又はＳＢＨなどによりＨＣＲポリマーを標識可能な修飾蛍光プローブであって、前記ＨＣＲポリマー骨格と蛍光性部分との間に酵素、化学物質、又は光に対して不安定な基を含む修飾蛍光プローブを用いて、化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって前記蛍光性部分を除去できるようにすること、を含む。

別の態様において、本開示は、試料を循環的ハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」システムと２回以上接触させることを含み、試料中の各標的分析物がＨＣＲサイクルの全数に亘って１つの増幅された蛍光シグナルと関連付けられる、１又は複数の標的分析物を検出するための方法を提供する。一実施形態では、ＨＣＲサイクル及び循環的ＨＣＲによって生成されたスペクトル的に分解可能な蛍光シグナルの組み合わせは、標的分析物に対する固有の標識を含む。

別の態様において、本開示は、試料を循環的ハイブリダイゼーション連鎖反応「ＨＣＲ」システムと２回以上接触させることを含み、試料中の各標的分析物がＨＣＲサイクルの全数に亘って２以上の増幅された蛍光シグナルと関連付けられる、１又は複数の標的分析物を検出するための方法を提供する。一実施形態では、各標的分析物によって生成された前記増幅された蛍光シグナルは、インフォマティクス的に複合標識へと組み合わされる。一実施形態では、各標的分析物は固有の複合標識と関連付けられる。別の実施形態では、前記試料は固定される。一実施形態では、前記複合標識はＨＣＲサイクル間の標的分析物の空間不変性によって生成される。一実施形態では、前記標的分析物は三次元マトリックスに結合される。別の実施形態では、前記複合標識はＨＣＲサイクル間の標的分析物の空間不変性によって生成される。一実施形態では、前記複合標識はＨＣＲサイクル間の標的分析物の位置順序不変性によって生成される。別の実施形態では、前記循環的ＨＣＲシステムの１又は複数の成分は三次元マトリックスに結合される。一実施形態では、前記複合標識はＨＣＲサイクル間の標的分析物の空間不変性によって生成される。別の実施形態では、前記複合標識はＨＣＲサイクル間の標的分析物の位置順序不変性によって生成される。一実施形態では、前記標的分析物と前記ＨＣＲ蛍光シグナルとの間の関連はプログラム可能である。別の実施形態では、前記標的分析物と前記ＨＣＲ蛍光シグナルとの間の関連はプログラム可能である。

一つの態様において、本開示は、以下を含む、試料中の１又は複数の標的分析物を検出するための方法を提供する：（Ａ）前記試料を１又は複数のプローブセットと接触させること（各プローブセットはリンカーをそれぞれ有する１又は複数の第一プローブを含み、各プローブセットは標的分析物に特異的であり、前記リンカーを有する１又は複数の第一プローブは前記標的分析物と結合する）；（Ｂ）前記試料を前記リンカーに結合する１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと接触させること；（Ｃ）前記試料を２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーと接触させること（前記１又は複数のイニシエーターは前記２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーと接触し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起して、自己集合し繋留された核酸増幅ポリマー産物を生成する）；並びに、（Ｄ）１又は複数の検出可能な標識を前記繋留された核酸増幅産物に結合させ、所望により前記１又は複数の検出可能な標識を検出すること。一実施形態では、前記プローブが前記標的分析物から除去可能であるか、前記イニシエーターが前記リンカーから除去可能であるか、前記核酸増幅ポリマー産物が前記イニシエーターから除去可能であるか、又は、前記１若しくは複数の検出可能な標識が前記核酸増幅ポリマー産物から除去可能である。別の実施形態では、前記プローブが前記標的分析物から除去可能であり、前記イニシエーターが前記リンカーから除去可能であり、かつ、前記核酸増幅ポリマー産物が前記イニシエーターから除去可能である。一実施形態では、前記プローブは前記標的分析物から除去可能である。別の実施形態では、前記イニシエーターは前記リンカーから除去可能である。一実施形態では、前記核酸増幅ポリマー産物は前記イニシエーターから除去可能である。別の実施形態では、前記１又は複数の検出可能な標識は前記核酸増幅ポリマー産物から除去可能である。別の実施形態では、前記プローブが前記標的分析物から除去可能であり、前記イニシエーターが前記リンカーから除去可能であり、前記核酸増幅ポリマー産物が前記イニシエーターから除去可能であり、かつ、前記１若しくは複数の検出可能な標識が前記核酸増幅ポリマー産物から除去可能である。

別の態様において、本開示は、以下を含む、試料中の１又は複数の標的分析物を検出するための方法を提供する：（Ａ）前記試料を１又は複数のプローブセットと接触させること（各プローブセットはリンカーをそれぞれ有する１又は複数の第一プローブを含み、各プローブセットは標的分析物に特異的であり、前記リンカーを有する１又は複数の第一プローブは前記標的分析物と結合する）；（Ｂ）前記試料を前記リンカーに結合する１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと接触させること；（Ｃ）前記試料を検出標識を含む２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーと接触させること（前記１又は複数のイニシエーターは前記２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーと接触し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起して、自己集合し繋留された核酸増幅ポリマー産物を生成する）；並びに、（Ｄ）所望により前記１又は複数の検出可能な標識を検出すること。一実施形態では、前記プローブは前記標的分析物から除去可能である。別の実施形態では、前記イニシエーターは前記リンカーから除去可能である。さらに別の実施形態では、前記核酸増幅ポリマー産物は前記イニシエーターから除去可能である。

一つの態様において、本開示は、以下を含む、試料中の標的分析物を同定するための方法を提供する：（ａ）前記試料を１又は複数のプローブと接触させること（前記１又は複数のプローブの特定のプローブはリンカーと結合しており、前記特定のプローブは前記標的分析物の配列に相補的な配列を有し、前記試料を前記１又は複数のプローブと接触させると、前記特定のプローブが前記標的分析物に結合する）；（ｂ）前記１又は複数のＨＣＲイニシエーターのうちの特定のＨＣＲイニシエーターが前記リンカーに結合することを可能にするのに十分な条件下で、前記試料を１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと接触させること（前記特定のＨＣＲイニシエーターは前記特定のプローブからは独立しており、前記試料を前記１又は複数のＨＣＲイニシエーターと接触させた後、前記リンカーが前記プローブを前記特定のＨＣＲイニシエーターに接続する）；（ｃ）前記試料を１又は複数のＨＣＲ増幅因子と接触させて、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させること（前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子のうちの特定のＨＣＲ増幅因子は、検出可能な標識を含む少なくとも１つのＨＣＲモノマーを含み、これにより、前記特定のプローブに結合した、前記ＨＣＲモノマーを含む増幅産物を生成する）；並びに、（ｄ）前記増幅産物を検出し、それにより、前記標的分析物を同定すること。一実施形態では、前記方法は、前記試料を、プログラム可能であり、かつ時間的に順序付けられたハイブリダイゼーション連鎖反応を可能にするように構成された、各特定の標的分析物に特異的な複数のプローブセットと接触させることをさらに含む。別の実施形態では、前記検出可能な標識は蛍光標識であり、前記検出は蛍光シグナルの検出を含み、経時的に生成された蛍光シグナルは全体として、各標的分析物の分子の実体、分子の性質、又は分子構成を含む固有の一群の情報を与える。一実施形態では、前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子は２つの準安定なＤＮＡヘアピンを含む。別の実施形態では、前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子の前記検出可能な標識は、マルチプレックス検出のためのスペクトル的に別個の蛍光シグナルを含む。一実施形態では、前記ＨＣＲモノマーの前記検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションによる蛍光シークエンシング、ライゲーションによる蛍光シークエンシング、又は合成による蛍光シークエンシングのための、シークエンシング用鋳型を含む。別の実施形態では、前記標的分析物は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ類似体、及びＤＮＡ類似体を包含する核酸高分子、タンパク質、並びにその化学修飾体を含む。さらに別の実施形態では、前記標的分析物は、脂質、代謝産物、生体分子、及び他の小分子を含む。一実施形態では、前記方法は、標的分析物を連続標識することをさらに含む。一実施形態では、前記連続標識は、各分析物を複数のＨＣＲイニシエーターと結合させることを含む。別の実施形態では、前記特定のＨＣＲ増幅因子は、２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む。一実施形態では、前記特定の前記標的分析物への結合は２回以上繰り返される。一実施形態では、前記リンカーは、結合であってもよく、又は、イニシエーター配列を含むオリゴヌクレオチドの配列部分に相補的であり、前記イニシエーター配列を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする、配列部分を含んでいてもよい。ある実施形態では、前記方法は、前記特定のプローブと前記リンカーとの間の結合、前記リンカーと前記ＨＣＲイニシエーターとの間の結合、又は前記特定のプローブと前記ＨＣＲイニシエーターとの間の結合を破壊する又は解除させることをさらに含む。一実施形態では、前記リンカーは、前記ＨＣＲイニシエーターが前記ＨＣＲを開始させることを防ぐ、保護基に対応するイニシエーター配列を含む。別の実施形態では、前記保護基は保護オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、前記方法は、前記保護基を前記リンカーから破壊し、それによって、前記ＨＣＲイニシエーターが前記ＨＣＲを開始させることを可能にすることをさらに含む。一実施形態では、前記破壊は、前記試料に脱保護オリゴヌクレオチドを導入して、トーホールド鎖置換により前記保護基を除去することを含む。別の実施形態では、前記方法は、前記検出後に増幅産物を分解又は解体することをさらに含む。一実施形態では、前記方法は、前記検出後に増幅産物と検出用標識との間の結合を破壊する又は解除させることをさらに含む。別の実施形態では、前記方法は、前記特定のプローブの前記標的分析物への結合を破壊する又は解除させることをさらに含む。さらに別の実施形態では、前記方法は、複数の検出サイクルを含む複数回のハイブリダイゼーション連鎖反応を実施することをさらに含む。一実施形態では、前記複数回のハイブリダイゼーション連鎖反応は、１若しくは複数のＨＣＲイニシエーター又は１若しくは複数のＨＣＲ増幅因子の再利用を含む。別の実施形態では、前記方法は、前記特定のＨＣＲイニシエーターと前記特定のプローブとの間の機能的連結をプログラムすることをさらに含み、前記プログラムは、ａ）ハイブリダイゼーションによる配列決定を用いて相補的核酸分子を有するリンカープローブに前記ＨＣＲイニシエーターを加えるための核酸ハイブリダイゼーションの使用、ｂ）リンカープローブに前記ＨＣＲイニシエーターを加えるための酵素の使用、ｃ）リンカープローブにハイブリダイズした前記ＨＣＲイニシエーターを除去するための核酸ハイブリダイゼーションを破壊するための熱若しくは変性剤の使用、ｄ）リンカープローブを介して標的分子に局在する前記ＨＣＲイニシエーターから保護鎖を除去するためのトーホールド鎖置換の使用、又は、ｅ）前記イニシエーターと前記リンカープローブとの間の化学結合を破壊する化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって前記イニシエーターが除去可能であるようにするための、前記イニシエーターとリンカープローブとの間への化学物質、酵素、又は光に対して不安定な基の挿入、を含む。一実施形態では、前記リンカープローブに前記ＨＣＲイニシエーターを加える酵素は、スプリントライゲーション反応を触媒するＤＮＡリガーゼである。別の実施形態では、前記方法は、前記ハイブリダイゼーション連鎖反応を逆行又は停止することをさらに含む。一実施形態では、ハイブリダイゼーション連鎖反応の逆行又は停止は、ａ）１又は複数の相補ＤＮＡ鎖の追加が増幅産物の分解を引き起こすように、トーホールド鎖置換のための１又は複数の付加配列を含む修飾ＨＣＲモノマーを使用すること、又は、ｂ）増幅産物が化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって断片化又は破壊されるように、ＨＣＲモノマーのＤＮＡ骨格内に１又は複数の酵素的若しくは化学的に感受性の基、又は光に対して不安定な基を含む、修飾ＨＣＲモノマーを使用すること、を含む。別の実施形態では、前記方法は、以下によって、前記増幅産物からの蛍光シグナルの生成をプログラムすることをさらに含む：ａ）合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）を用いてプローブすることが可能な付加配列を含む修飾ＨＣＲモノマーを用いることで、蛍光性部分を前記増幅産物に導入すること、ｂ）前記ＨＣＲモノマーのＤＮＡ骨格と蛍光性部分を含む前記検出可能な標識との間に酵素、化学物質、又は光に対して不安定な基を含む修飾ＨＣＲモノマーを用いることで、前記蛍光性部分を化学的処理、酵素的処理、又は光処理で除去できるようにすること、ｃ）合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）により増幅産物を標識可能な修飾蛍光プローブであって、トーホールド鎖置換のための付加配列を含む修飾蛍光プローブを用いることで、前記蛍光プローブと前記増幅産物との間のハイブリダイゼーションを破壊することで前記蛍光プローブを前記増幅産物から除去できるようにすること、又は、ｄ）ＳＢＳ、ＳＢＬ、又はＳＢＨなどにより増幅産物を標識可能な修飾蛍光プローブであって、前記増幅産物の骨格と蛍光性部分を含む検出可能な標識との間に酵素、化学物質、又は光に対して不安定な基を含む修飾蛍光プローブを用いて、化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって前記蛍光性部分を除去できるようにすること。一実施形態では、前記特定のプローブが前記標的分析物から除去可能であるか、前記ＨＣＲイニシエーターが前記リンカーから除去可能であるか、前記増幅産物が前記ＨＣＲイニシエーターから除去可能であるか、又は、前記検出可能な標識が前記増幅産物から除去可能である。

別の態様において、本開示は、１又は複数のプローブ（前記１又は複数のプローブのうちの特定のプローブはリンカーに結合しており、前記特定のプローブは標的分析物の配列に相補的な配列を有する）、１又は複数のＨＣＲイニシエーター（前記１又は複数のＨＣＲイニシエーターのうちの特定のＨＣＲイニシエーターは前記特定のプローブからは独立しており、前記特定のＨＣＲイニシエーターは、前記リンカーに結合し、前記プローブを前記特定のＨＣＲイニシエーターに連結するように構成される）、並びに、１又は複数のＨＣＲ増幅因子（前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子のうちの特定のＨＣＲ増幅因子は検出可能な標識を含む少なくとも１つのＨＣＲモノマーを含む）、を含み、前記特定のＨＣＲイニシエーターは、前記ＨＣＲモノマーに結合し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起して、前記特定のプローブに結合した、前記ＨＣＲモノマーを含む増幅産物を生成するように構成される、循環的ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）システムを提供する。一実施形態では、前記システムは、各々特定の標的分析物に特異的であり、かつプログラム可能で時間的に順序付けられたハイブリダイゼーション連鎖反応用に設計されている、複数のプローブセットをさらに含む。一実施形態では、前記複数のプローブセットは、経時的に生成される蛍光シグナルを与えるように構成され、経時的に生成される蛍光シグナルはその全体として、分子の実体、分子の性質、又は分子構成を含む各標的分析物についての固有の一群の情報を与える。別の実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子の各々が、そのそれぞれがＤＮＡヘアピンである２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む。別の実施形態では、前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子は、マルチプレックス検出のためのスペクトル的に別個の蛍光シグナルを含む検出可能な標識を含む２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む。一実施形態では、前記ＨＣＲモノマーは非蛍光性ＨＣＲモノマーである。別の実施形態では、前記非蛍光性ＨＣＲモノマーは、増幅産物の生成の際又はその後に蛍光標識されるように構成される。一実施形態では、前記非蛍光性モノマーから形成された増幅産物は、ハイブリダイゼーションによる蛍光シークエンシング、ライゲーションによる蛍光シークエンシング、若しくは合成による蛍光シークエンシングによって、酵素反応によって、又は化学反応によって、前記増幅産物の生成後に蛍光標識される。別の実施形態では、前記１若しくは複数のプローブ、前記リンカー、１若しくは複数のＨＣＲイニシエーター、又は１若しくは複数のＨＣＲ増幅因子は、再利用されるように構成される。一実施形態では、前記リンカーは、前記ＨＣＲイニシエーターを含むオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列である。別の実施形態では、前記リンカーは、前記イニシエーターからのプログラム可能な分離のための官能基を含む。一実施形態では、前記検出可能な標識の検出はプログラムによって生成及びリセットされ得る。別の実施形態では、前記ＨＣＲモノマーは、前記増幅産物のプログラム可能な解体又は分解のための官能基を含有する。一実施形態では、前記官能基はトーホールド鎖置換配列を含む。別の実施形態では、前記官能基は、化学的に不安定性の、酵素に対して不安定性の、又は光に対して不安定性の化学基を含む。一実施形態では、前記特定のプローブの前記標的分析物への結合は、ハイブリダイゼーション連鎖反応の間に破壊又は解除されるように構成される。別の実施形態では、前記標的分析物への前記特定のプローブの結合は、化学的処理、酵素処理、ＲＮＡin situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）用プローブのデオキシリボヌクレアーゼ処理、５’ ｐｈｏｓＩＳＨ用プローブのエキソヌクレアーゼ処理、核酸プローブのヌクレアーゼ処理、ペプチドプローブのプロテアーゼ処理、熱若しくは変性剤の使用による核酸ハイブリダイゼーションの破壊、熱若しくは変性剤の使用によるアプタマー結合の破壊、又は、熱若しくは変性剤の使用による抗体とタンパク質との間の結合の破壊、によって破壊又は解除される。

一つの態様において、本開示は、以下を含む、試料中の標的分析物を同定するための方法を提供する：（ａ）前記試料を前記標的分析物の配列に相補的な配列を含む第一プローブと接触させること；（ｂ）前記試料を前記第一プローブに結合するように構成された第二プローブと接触させること（前記第一プローブと前記第二プローブとの結合が、検出可能な標識を含む少なくとも１つのＨＣＲ増幅因子の存在下でハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を促進して、前記検出可能な標識を含む増幅産物を生成し、前記第二プローブは前記ＨＣＲ増幅因子及び前記第一プローブからは独立している）；並びに、（ｃ）前記検出可能な標識を検出することにより、前記標的分析物を同定すること。一実施形態では、前記ＨＣＲはポリメラーゼ連鎖反応ではない。別の実施形態では、前記増幅産物は前記第一プローブに結合している。一実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子は前記第二プローブの配列に相補的な配列を有する。別の実施形態では、前記第一プローブは、前記第一プローブが前記第二プローブに結合することを可能にするリンカーに結合している。一実施形態では、前記第一プローブが、前記ＨＣＲを開始させるＨＣＲイニシエーターを含む。別の実施形態では、前記第一プローブは、前記試料の前記第二プローブとの前記接触の前に前記ＨＣＲイニシエーターが前記ＨＣＲを開始させることを防ぐ保護基を含む。一実施形態では、前記保護基は保護オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、前記第二プローブが、前記ＨＣＲを開始させる前記ＨＣＲイニシエーターを含む。一実施形態では、前記第二プローブは検出可能な標識を含まない。別の実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子は、２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む。一実施形態では、前記２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーの各々が、準安定なＤＮＡヘアピンを含む。

別の態様において、本開示は、検出可能な標識を検出するためのディテクター、及び前記ディテクターに作動的に接続されたコントローラー、を含む、試料中の標的分析物を同定するためのシステムを提供し、前記コントローラーは以下を指示するように個別又は集合的にプログラムされた１又は複数のコンピュータプロセッサを含む：（ｉ）前記試料を前記標的分析物の配列に相補的な配列を含む第一プローブと接触させること；（ｉｉ）前記試料を前記第一プローブに結合するように構成された第二プローブと接触させること（前記第一プローブと前記第二プローブとの結合が、検出可能な標識を含む少なくとも１つのＨＣＲ増幅因子の存在下でハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を促進して、前記検出可能な標識を含む増幅産物を生成し、前記第二プローブは前記ＨＣＲ増幅因子及び前記第一プローブからは独立している）；並びに、（ｉｉｉ）前記ディテクターを用いて前記検出可能な標識を検出することにより前記標的分析物を同定すること。

別の態様において、本発明は、検出可能な標識を含む、且つ、ＨＣＲを促進するように構成された、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）増幅因子；前記標的分析物の配列に相補的な配列を含む第一プローブ；並びに、前記第一プローブに結合するように構成された、且つ、検出可能な標識を含まない、且つ、前記ＨＣＲ増幅因子及び前記第一プローブからは独立している、第二プローブ、を含む、試料中の標的分析物を同定するためのキットを提供する。一実施形態では、前記キットは、前記ＨＣＲを行うために、前記ＨＣＲ増幅因子、第一プローブ及び前記第二プローブを使用するための説明書をさらに含む。別の実施形態では、前記キットは、前記第一プローブと前記第二プローブとの間の前記リンカーを切断することで、前記１又は複数のＨＣＲイニシエーターが１又は複数のＨＣＲ増幅因子と共に前記連鎖反応を開始させることを防ぐように構成された、切断剤をさらに含む。別の実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子は前記第二プローブの配列に相補的な配列を有する。一実施形態では、前記第一プローブは、前記第一プローブが前記第二プローブに結合することを可能にするリンカーに結合している。別の実施形態では、前記第一プローブが、前記ＨＣＲを開始させるＨＣＲイニシエーターを含む。一実施形態では、前記第一プローブは、前記第一プローブの前記第二プローブとの結合の前に前記ＨＣＲイニシエーターが前記ＨＣＲを開始させることを防ぐ保護基を含む。別の実施形態では、前記保護基は保護オリゴヌクレオチドを含む。一実施形態では、前記第二プローブが、前記ＨＣＲを開始させる前記ＨＣＲイニシエーターを含む。別の実施形態では、前記ＨＣＲ増幅因子は、２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む。

さらなる態様において、本開示は、以下を含む、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）増幅産物の生成を中断するための方法を提供する：（ａ）第二プローブに結合した、且つ、標的分析物の配列に相補的な配列を含む、且つ、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を促進するのに十分な条件下で前記標的分析物にハイブリダイズして増幅産物を生成する、第一プローブを含む試料を準備すること；並びに、（ｂ）前記試料を、前記第一プローブを前記標的分析物から切り離すことなく前記第一プローブを前記第二プローブから切り離すための切断剤と接触させることで、前記ＨＣＲを妨げ、前記増幅産物の生成を中断すること。

本発明のある実施形態のさらなる特徴及び利点は、以下の実施形態の説明及びその図面において、並びに特許請求の範囲から、より十分に理解されることとなる。

本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面を含む本特許又は出願公開のコピーが、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、米国特許商標庁により提供される。本実施形態の上記及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて、下記の例示的な実施形態の詳細な説明から、より十分に理解されることとなる。
図１Ａ～図１Ｃは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を介したin situ増幅を示した図である。図１Ａは、ＨＣＲの仕組み示した図である。対応するイニシエーターを検出すると、準安定性の蛍光性ヘアピンが自己集合して蛍光性増幅ポリマーになる。一本鎖セグメント「ｂ^＊－ａ^＊」から構成されるイニシエーターＩ１が、Ｈ１の一本鎖トーホールド「ａ」への塩基対形成を介して、ヘアピンＨ１と核形成し、前記ヘアピンＨ１を開く分枝点移動が仲介せられ、一本鎖セグメント「ｃ^＊－ｂ^＊」を含有する複合体Ｉ１・Ｈ１が形成される。この複合体が、一本鎖トーホールド「ｃ」への塩基対形成によってヘアピンＨ２と核形成し、ヘアピンを開く分枝点移動が仲介せられ、一本鎖セグメント「ｂ^＊－ａ^＊」を含有する複合体Ｉ１・Ｈ１・Ｈ２が形成される。このようにしてイニシエーター配列が再生成され、これが、Ｈ１重合工程とＨ２重合工程とを交互に行う連鎖反応の基礎となる。赤色の星はフルオロフォアを示している。図１Ｂは、in situハイブリダイゼーションのプロトコルを示した図である。検出段階：各プローブがイニシエーターＩ１及びイニシエーターＩ２並びにｍＲＮＡターゲットに相補的な領域を含有するＤＮＡプローブセットが、ｍＲＮＡターゲットにハイブリダイズされ；未結合プローブは前記試料から洗い流される。増幅段階：イニシエーターが繋留された蛍光性増幅ポリマーの自己集合を惹起し；未重合のヘアピンは前記試料から洗い流される。図１Ｃは、実験のタイムラインを示した図である。標的ｍＲＮＡの数にかかわらず、同じ２段階プロトコルが使用される。多重実験（三色を用いた例が図示されている）において、異なる標的ｍＲＮＡに対するプローブセット（１セットにつき５本のプローブが図示）は、スペクトル的に別個のフルオロフォアで標識された直交性ＨＣＲ増幅カスケードを開始させる直交性イニシエーターを有する。図２Ａ及び図２Ｂは、循環的ＨＣＲ技術の情報伝達工程Ａ～Ｄの概略を示した図である。一次情報は、調査中の分子種、分子的性質、又は分子構成など、検出中の分析物の特性である。工程Ａでは、結合したプローブの存在によって分析物の一次情報が表されるように、分析物が、標的分析物と特異的に結合するプローブの標的とされる。工程Ｂでは、前記プローブによって運ばれる分析物情報又はそのいくらかの断片が、リンカーを介して、ＨＣＲイニシエーターへと伝達される。前記ＨＣＲイニシエーターは、前記分析物と関連付けられた前記プローブと関連付けられる。前記リンカーが前記プローブを前記イニシエーターに接続する。工程Ｃでは、前記ＨＣＲイニシエーターの存在及び局在へと伝達された、前記分析物情報又はいくらかのその断片が、ＨＣＲポリマーとして知られる、ヘアピンなどの、１又は複数の準安定ＨＣＲモノマーのハイブリダイゼーション連鎖反応の開始により、ＤＮＡポリマーに変換される。準安定性ＨＣＲモノマーが前記試料に添加されると、前記イニシエーターがまず準安定ＨＣＲモノマーに結合し、その後、１又は複数の残余ＨＣＲモノマーの連鎖反応が生じて、前記ＨＣＲポリマーが形成される。工程Ｄでは、ＨＣＲポリマーの存在及び局在へと伝達された、前記分析物情報又はいくらかのその断片が、デジタルカメラを備えた顕微鏡などの光子ディテクターを用いて測定可能な増幅された蛍光シグナルに変換される。前記ＨＣＲポリマーは、１以上もしくは複数の検出可能な部分と関連付けられる。これらの工程Ａ～Ｄは、図１に示されるＨＣＲ増幅ｍＲＮＡ蛍光in situハイブリダイゼーション実験など、ＨＣＲを用いた分析物検出実験における、一般的方法及び情報伝達系統を説明している。循環的ＨＣＲは、とりわけ、各情報伝達工程のプログラマビリティを達成するための方法及び材料によって可能となる。「プログラマビリティ」とは、情報伝達の各工程を、ゲーティング可能にする、すなわち、前記情報伝達が複数の入力に依存している、所定の不連続なスケジュールに従って実行可能とする材料及び方法を指し；あるいは、各工程は、特異的に解除させることが可能であり（すなわち、前記プロセス内の後の工程に移った情報が、検出された後に、選択的に破壊される、又は除去される、又は検出不可にされる）；又は、各工程はゲーティングされることも可逆的であることも両方可能である。前記検出可能な部分は前記ＨＣＲポリマーから除去可能なものであっても除去されてもよく、前記ＨＣＲポリマーは前記イニシエーターから除去可能なものであっても除去されてもよく、前記イニシエーターは前記プローブから除去可能なものであっても除去されてもよく、前記プローブは前記分析物から除去可能なものであっても除去されてもよい。これは、情報伝達が連続的且つ不可逆的である、例えば、プローブ（ｍＲＮＡ配列に相補的な配列の領域であり、該ｍＲＮＡと結合する）がＨＣＲイニシエーターと不可逆的に連結せられ、相補的ＨＣＲヘアピンの導入後にＨＣＲポリマーの生成を開始させる、図１のＨＣＲ反応とは対照的である。工程Ｃのプログラマビリティは、例えば、イニシエーターとＨＣＲヘアピンとの間の反応が、反応の進行に要するＨＣＲヘアピン以外の別の入力シグナルを要求するなど、何らかの方法でゲーティングされること、並びに、ＨＣＲポリマーの形成が、ポリマーの標的化分解などによって、解除可能であること、を示すことが意図されている。情報伝達工程間のプログラマビリティは、両端に矢印を有する図２Ｂ中の連結線によって表される。図３は、循環的ＨＣＲを用いる分析物検出実験を通じての、分析物の一次情報の、情報学的表示及び物理学的表示の概略を示した図である。一次情報は、調査中の分子種、分子的性質、又は分子構成など、検出中の分析物の特性である。一次情報は、「標識」と称される情報学的標識と一意に関連付けられる。標識は本明細書では２進列として表されるが、分析物若しくはその一次情報、例えば遺伝子名、又はそれへの参照、に対応する英数字値など、一次情報のあらゆる記号的表現を伝達することが意図される。この情報学的標識は、検出されたメッセージを含む時間空間的に体系化された蛍光シグナルを介して伝達される、情報学的メッセージによって一意的に表される。この情報学的標識及び情報学的メッセージは同じものであってもよいし、あるいは、該メッセージは、エラー検出又はエラー修正の目的で使用される追加情報のように、該標識を参照するのに厳密に必要となるものを超える追加情報を含んでもよい。この例では、「メッセージ」は、標識のビットストリングと、その後に続く標識の逆ビットストリングとして構築されている。このメッセージを検出する際は、標識の各ビットを２回検出することで、ある特定のエラーが検出されることを可能とする（例えば、標識の最初のビットが、メッセージの最初のビットにおいて「０」、その後メッセージの最後のビットとして「１」、として検出された場合、プロービング、ＨＣＲ、イメージング、又は画像処理の間など、メッセージの伝達又は検出の間にエラーが生じていることが明らかである）。このメッセージは、固有の一連の時間的に順序付けられた蛍光性ＨＣＲシグナルに変換され、これが検出されるメッセージとなる。ＨＣＲシグナルの時間的順序付けは、一連の実験プロトコル及び実験材料（例えば、第一（工程Ａ）プローブ、工程Ｂプローブ、工程Ｃプローブ、及び／又は工程Ｄプローブ、顕微鏡、他の試薬等）として設計される、且つ、実験によって実施される、循環的ＨＣＲの方法及び材料のプログラマビリティによって可能となる。図４は、２つの標的分析物の連続検出のための、２回の循環的ＨＣＲに亘る、標的分子へのプローブ結合のプログラミングの概略を示した図である。時点０において、２つの標的分子が試料中に存在している。時点１において、短い赤線として表されている、化学結合又は分子間相互作用などの、ただし循環的ＨＣＲの工程Ｂによって説明されるようにあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される、ある特定のリンカーを介した、ＨＣＲイニシエーター「ｉ１」に対応する、オレンジ色の三角形として表されている、「プローブα」と称されている、抗体、アプタマー、又はＤＮＡ／ＲＮＡＩＳＨ用プローブなどの、第一（工程Ａ）プローブが、前記試料に添加され、標的１に結合する。時点２において、ＨＣＲヘアピンが前記試料に導入され、前記イニシエーターと接触し、その後、増幅された蛍光性ＨＣＲシグナルを生成する。時点３において、プローブαが前記試料から取り除かれ、循環的ＨＣＲの工程Ｃに記載のあらゆる方法を用いて前記ＨＣＲポリマーも取り除かれる。時点４において、化学結合又は分子間相互作用などの、ただし循環的ＨＣＲの工程Ｂによって説明されるようにあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される、ある特定のリンカーを介した、同じＨＣＲイニシエーター「ｉ１」に対応する新たなプローブ「プローブβ」が、前記試料に添加され、標的２に結合し；時点５において、ＨＣＲヘアピンが前記試料に添加され、前記イニシエーターに接触し、その後、増幅された蛍光性ＨＣＲシグナルを生成する。時点６において、プローブβが前記試料から取り除かれ、循環的ＨＣＲの工程Ｃに記載のあらゆる方法を用いて前記ＨＣＲポリマーも取り除かれる。この例では、２つの標的分子を連続的に検出するために、同じＨＣＲ蛍光シグナル増幅ヘアピン及びイニシエーターが２回のＨＣＲに亘って再利用される。１回目のＨＣＲは時点１～３に表されており、一方、２回目のＨＣＲは時点４～６に表されている。ＨＣＲ蛍光の検出が二進法の１として表され、ＨＣＲ蛍光の欠如が二進法の０として表される場合、標的１に対応する検出メッセージは「１０」であり、一方、標的２に対応する検出メッセージは「０１」である。従って、これら２つの分子の検出は同じＨＣＲ蛍光シグナル増幅ヘアピン及びイニシエーターを利用するが、検出メッセージを構成する定序性の一連の蛍光シグナルは各特定の標的分子に固有である。図５Ａ～図５Ｃは、循環的ＨＣＲ法の工程Ａを介した第一プローブ結合をプログラムする特異的機構の概略を示した図である。図５Ａは、化学結合又は分子間相互作用などの、ただし循環的ＨＣＲの工程Ｂによって説明されるようにあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される、「リンカーα」と称される、リンカーを介して、ＨＣＲイニシエーターに対応する、且つ増幅された蛍光ＨＣＲシグナルを介して後に検出される、「プローブα」と称される、核酸又は核酸類似体アプタマーと工程１で結合した、標的分析物を示している。この概略図では、前記リンカーは、循環的ＨＣＲの工程Ｂ～Ｄを通じての全ての下流の情報伝達を表す。工程２では、前記アプタマーと前記標的分子との間の水素結合及び疎水性相互作用などの相互作用を不安定化する、ホルムアミドなどの変性剤による処理でのように、前記アプタマーと前記標的分子との間の結合が破壊される。次にプローブαが前記試料から洗い流される。工程３では、同じ第一プローブ、アプタマープローブαが、前記試料に再導入され、標的分子と再度結合するが、異なるリンカーである「リンカーβ」と対応し、これは循環的ＨＣＲ反応の下流工程Ｂ～Ｄを表す。例えば、リンカーβがリンカーαとは異なるスペクトルのＨＣＲ蛍光シグナルと関連付けられているという点で、リンカーβはリンカーαと異なる場合がある。図５Ｂは、工程１において、標的分析物が、ＨＣＲイニシエーターに対応する、第一プローブとしての抗体「プローブα」と結合し、その後、「リンカーα」と称される、化学結合又は分子間相互作用などの、リンカーを介して、増幅された蛍光ＨＣＲシグナルを介して検出されることを示している。工程２において、前記抗体と前記標的分子との間の結合は図５Ａの工程２と同様に破壊される。工程３において、異なる抗体「プローブβ」が導入され、ＨＣＲイニシエーターに対応する、同じ標的分析物と結合し、その後、５Ａの工程１の「リンカーα」とは異なる、「リンカーβ」と称される、化学結合又は分子間相互作用などの、リンカーを介して、増幅された蛍光ＨＣＲシグナルを介して、検出される。図５Ｃは、「プローブα」と称されるＩＳＨ用の核酸プローブ又は核酸類似体プローブが結合している、ＲＮＡ標的分子又はＤＮＡ標的分子が用いられている以外、図５Ａと同じ工程Ａの可逆性を示している。この例では、紫外光で誘導すると核酸アニーリングを中断させる、プローブαに組み入れられた光に対して不安定な基の活性化；又は、標的ＲＮＡ分子に結合したＩＳＨ用ＤＮＡプローブαを消化するためのデオキシリボヌクレアーゼ酵素での処理でのように、循環的ＨＣＲ工程Ａの解除が図５Ｃの工程２において仲介されている。図６は、工程Ｂの両方の方法、すなわち、工程Ｂプローブによる前記ＨＣＲイニシエーターの前記第一プローブに対する物理的関連付けのプログラミング、及び、ゲーティングされたＨＣＲイニシエーターの状態のプログラミング、を利用した、２回の連続した循環的ＨＣＲを通して２つの標的分析物を連続検出するための、前記第一プローブと前記ＨＣＲイニシエーター配列「ｉ１」との間の機能的連結のプログラミングの概略を示した図である。時点０において、２つの標的分析物が存在し、第一プローブと結合しており、リンカーモチーフも含んでいるが、機能的ＨＣＲイニシエーター配列は含んでいない。標的１は、「プローブα」に結合されており、該プローブは「リンカーα」と称される結合部分も含んでいる。標的２は、「プローブβ」に結合されており、該プローブは「リンカーβ」と称される、ゲーティングされた不活性ＨＣＲイニシエーター「ｉ１^＊」に結合している。時点１では、相補的核酸配列などの、リンカーαの結合部分に対する相補的な結合部分を含む工程Ｂプローブが、リンカーαに結合しており、また、前記ＨＣＲイニシエーター配列「ｉ１」も含んでいる；時点２において、ＨＣＲヘアピンが添加され、増幅された蛍光ＨＣＲシグナルが生成され、これが検出される。時点３において、時点１から得られるＨＣＲ蛍光シグナルが、本明細書の工程Ｃに記載の方法及び材料を用いて除去され、前記工程Ｂプローブが、本明細書に記載の方法によって第一プローブαから除去又は分離され、前記試料から洗い流される。時点４において、第一プローブβのリンカーβに含まれる前記ゲーティングされたＨＣＲイニシエーター配列が、入力シグナルの使用などにより、活性化される。時点５において、ＨＣＲヘアピンが添加され、増幅された蛍光ＨＣＲシグナルが生成され、これが検出される。時点６において、時点１から得られるＨＣＲ蛍光シグナルが、本明細書の工程Ｃに記載の方法及び材料を用いて除去され、リンカーβ内に存在するＨＣＲイニシエーターが不活性化される。このように、イニシエーター配列「ｉ１」に対応するＨＣＲシステムが、２つの標的分析物の検出のために連続して使用される。１回目のＨＣＲは時点１～３に表されており、一方、２回目のＨＣＲは時点４～６に表されている。図７Ａ～図７Ｃは、循環的ＨＣＲの工程Ｂをプログラムする方法の概略を示した図である。図７Ａでは、分析物が「プローブα」に結合されており、該プローブはＨＣＲイニシエーター配列「ｉ１」への結合を含んでいる。これらの間にある結合は、タンパク質標的分析物の検出のためのＨＣＲイニシエーター配列オリゴヌクレオチドの抗体プローブα上への直接結合と同様に、共有結合であってもよい。しかし、前記イニシエーター配列が、付加配列「ａ」も含む、紫色で示されている、保護オリゴで保護されているため、ＨＣＲ重合反応を惹起できないので、前記結合は機能的結合ではない。工程１において、工程Ｂプローブと称される脱保護オリゴが、前記試料に導入され、トーホールド鎖置換によって前記保護鎖を除去する。置換された保護鎖は前記試料から洗い流される。その後、ＨＣＲヘアピンが添加され、増幅された蛍光ＨＣＲシグナルが生成され、これが検出される。工程２において、前記イニシエーター「ｉ１」が再び、相補的な保護鎖「ｉ１’」で覆われることにより、ＨＣＲ重合反応を惹起できなくされる。図７Ｂでは、標的分析物が第一工程Ａプローブ「β」に結合されており、該プローブは、ＨＣＲイニシエーター配列を含んでいないが、代わりに、「リンカーβ」と称される、ＤＮＡオリゴヌクレオチド配列などの、追加の結合部分「ｂ」を含んでいる。工程１において、工程Ｂプローブ「ｂ’－ｉ１」と称されるオリゴヌクレオチドプローブが、前記試料に添加され、リンカーβにハイブリダイズされ、前記ＨＣＲイニシエーター配列「ｉ１」を導入する。その後、ＨＣＲヘアピンが添加され、増幅された蛍光ＨＣＲシグナルが生成され、これが検出される。工程２において、モチーフ「ｂ」に相補的な工程Ｂプローブ「ｂ’－ｉ１」の領域と前記イニシエーター配列「ｉ１」を含む領域との間の結合が、オリゴヌクレオチド「ｂ’－ｉ１」の骨格内の架橋性ホスホロチオエート結合の硝酸銀切断などによって切断され（図では、切断可能な基が「ｂ’－ｉ１」の小さな黄色の円で表されている）、第一工程Ａプローブが、ＨＣＲ重合反応を惹起できない状態に戻される。図７Ｃは、以下の点以外は図７Ｂと同じ工程Ｂ反応を示しており、図７Ｃでは、前記第一プローブと前記ＨＣＲイニシエーターとの間の機能的連結をつくる機構が、リンカーモチーフに相補的な配列を含むオリゴヌクレオチド「ａ^２’」及びＨＣＲイニシエーター配列「ｉ１」を含む別の配列を前記第一プローブ上に結合させるライゲーション反応による配列決定によるものである。前記ライゲーション反応による配列決定は、オリゴ「ａ^１’」によって惹起される。工程２において、前記イニシエーター「ｉ１」が再び、相補的な保護鎖「ｉ１’」で覆われることにより、ＨＣＲ重合反応を惹起できなくされる。図８は、工程Ａ及び工程Ｂを用いる循環的ＨＣＲの実行を示した図である。時点０において、２つの標的分析物が試料中に存在している。時点１～３の間で示される、１回目のＨＣＲにおいて、第一の分析物が検出される。時点１において、標的１は第一プローブ「α」と結合しており、該プローブは「リンカーα」を介してＨＣＲイニシエーター配列「ｉ１」に機能的に連結しており、該リンカーは、共有結合、又は工程Ｂプログラマビリティにおいて本明細書に記載される方法を用いるプログラム可能な結合であると理解される。時点２において、ＨＣＲイニシエーター「ｉ１」に対応するＨＣＲヘアピンが試料に添加され、イニシエーター「ｉ１」と接触し；ＨＣＲポリマーが形成され、増幅された蛍光シグナルが検出される。時点３において、標的１において、工程Ｂが、前記イニシエーター「ｉ１」を前記リンカーから切断するなどにより、解除される。この時点で、時点２で検出された蛍光シグナルがもはや存在しないように、工程Ｃ及び工程Ｄも解除されたと理解される。時点４において、工程Ａが、標的被験体２と結合する第一プローブ「β」の導入により次のサイクルに反復適用され、該プローブは、共有結合、又は工程Ｂプログラマビリティとして本明細書に記載される方法を用いるプログラム可能な結合であると理解される、「リンカーα」を介してＨＣＲイニシエーター配列「ｉ１」に機能的に連結している。時点５において、ＨＣＲイニシエーター「ｉ１」に対応するＨＣＲヘアピンが試料に添加され、イニシエーター「ｉ１」と接触し；ＨＣＲポリマーが形成され、増幅された蛍光シグナルが検出される。時点６において、ＨＣＲイニシエーターを不活性状態「ｉ１^＊」にゲーティングしたように、工程Ｂが標的２について解除される。このようにして、２つの標的分析物の検出のために、工程Ａ及び工程Ｂが協調的に循環される。図９は、工程Ｃ（ＨＣＲ重合反応）のプログラミングの概略を示した図である。時点０において、２つの標的分子が存在している。標的１は第一プローブ「α」と結合しており、該プローブは「リンカーα」を介してＨＣＲイニシエーター配列「ｉ１」に機能的に連結している。標的２は第一プローブ「β」と結合しており、該プローブは、リンカーを介してと見なされて、ＨＣＲイニシエーター配列「ｉ２」に機能的に連結している。前記リンカーは、共有結合であっても、工程Ｂプログラマビリティとして本明細書に記載される方法を用いるプログラム可能な結合であってもよい。時点１において、イニシエーター「ｉ１」に対応するＨＣＲヘアピンが試料に添加され、「ｉ１」に前記対応するＨＣＲヘアピンが接触し、赤色蛍光シグナルを示す赤色の星で表されるＨＣＲポリマーが形成され、これが検出される。前記ＨＣＲポリマーが後に時点２で分解又は解体されることで、前記試料がＨＣＲポリマーを含まない以前の状態に戻される。時点３において、イニシエーター「ｉ２」に対応するＨＣＲヘアピンが試料に添加され、「ｉ２」に前記対応するＨＣＲヘアピンが接触し、同じ赤色蛍光シグナルを示す赤色の星で表されるＨＣＲポリマーが形成され、これが検出される。前記ＨＣＲポリマーが後に時点４で分解又は解体されることで、前記試料がＨＣＲポリマーを含まない以前の状態に戻される。１回目のＨＣＲは時点１～２に表されており、一方、２回目のＨＣＲは時点３～４に表されている。図１０Ａ～図１０Ｃは、循環的ＨＣＲの工程Ｃをプログラムするための材料及び方法の概略を示した図である。図９Ａは、リンカーを介してイニシエーター配列「ｉ１」に機能的に結合している、第一プローブ「α」が結合した標的分析物を示しており、該リンカーは「Ｌ」と表されているが、循環的ＨＣＲの工程Ｂに記載されたあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される。工程１において、切断可能な蛍光性ＨＣＲヘアピンが試料に添加される。青色の星は蛍光性部分を表し；一方、青色の四角はＨＣＲヘアピンの骨格内の５’又は３’架橋性ホスホロチオエート結合などの、切断可能な部分を表している。前記ヘアピンがイニシエーター配列「ｉ１」と接触し、増幅された蛍光性ＨＣＲポリマーを標的分析物において形成し、これが検出される。工程２において、架橋性ホスホロチオエート結合の例においての硝酸銀などの、切断可能な部分の切断を触媒する試薬が、試料に添加され、これにより、前記ＨＣＲヘアピンの、青色の四角で表される修飾された骨格の部位における切断が引き起こされる。ＨＣＲポリマーがそれにより断片化され、断片は試料から洗い流される。この図では、配列「ｉ１」に相補的な断片がイニシエーター配列に結合したまま残って、イニシエーターを効率的に覆い、これが、循環的ＨＣＲの工程Ｂ及び工程Ｃの協調的な解除となる。図１０Ｂは、リンカーを介してイニシエーター配列「ｉ１」に機能的に結合している、第一プローブ「α」が結合した標的分析物を示しており、該リンカーは「Ｌ」と表されているが、循環的ＨＣＲの工程Ｂに記載されたあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される。工程１において、切断可能な蛍光性ＨＣＲヘアピンが試料に添加される。青色の星は蛍光性部分を表し、ＨＣＲヘアピンは、ヘアピンの紫色のセグメントとして表される、付加配列モチーフハンドルを含む。前記ヘアピンがイニシエーター配列「ｉ１」と接触し、増幅された蛍光性ＨＣＲポリマーを標的分析物において形成し、これが検出される。前記ＨＣＲポリマーは一本鎖配列として前記付加的ハンドルモチーフも含む。工程２において、トーホールド置換鎖（総称的に、本明細書では工程Ｃプローブと称される）が、前記試料に添加され、前記ＨＣＲポリマーの付加的ハンドル配列に結合し、トーホールド鎖置換反応を誘導し、これにより、前記ＨＣＲポリマーが二本鎖断片に解体され、試料から洗い流される。図１０Ｃは、リンカーを介してイニシエーター配列「ｉ１」に機能的に結合している、第一プローブ「α」が結合した標的分析物を示しており、該リンカーは「Ｌ」と表されているが、循環的ＨＣＲの工程Ｂに記載されたあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される。工程１において、切断可能な蛍光性ＨＣＲヘアピンが試料に添加される。青色の星は蛍光性部分を表し、ＨＣＲヘアピンは、エキソヌクレアーゼＴｅｒｍｉｎａｔｏｒに認識される５’一リン酸などの、エキソヌクレアーゼによって認識される、赤色の三角形で表される追加の修飾を含む。前記ヘアピンがイニシエーター配列「ｉ１」と接触し、増幅された蛍光性ＨＣＲポリマーを標的分析物において形成し、これが検出される。工程２において、この修飾されたヘアピンを標的とするエキソヌクレアーゼが、試料に添加され、修飾されたＨＣＲポリマーを認識し、構成要素であるオリゴヌクレオチドを単一ヌクレオチドへと消化し、これが試料から洗い流される。図１０Ａ～図１０Ｃのそれぞれにおいて、試料は、ＨＣＲポリマーが存在しない状態、又は関連付けられたシグナルが存在する状態のままである。図１１は、可逆的なＨＣＲ重合の例の図をさらに示した図である。左）構成要素であるモノマーの鎖がｄＵ核酸塩基を含んでいる、ＨＣＲポリマーが、ＵＤＧ酵素とＥｎｄｏＶＩＩＩ酵素とを組み合わせて二本鎖ＤＮＡのｄＵ部位に切れ目を入れる、ＵＳＥＲ酵素反応によって酵素的に分解されている。右）付加的３’又は５’トーホールド置換ドメイン配列を有するＨＣＲポリマーが、完全相補的配列を含む新たなＤＮＡ鎖の導入によって分解されている。二本鎖ＤＮＡモノマーは洗浄除去される。図１２は、工程Ｄ、前記ＨＣＲポリマーへの蛍光性部分の関連付け、のプログラミングの概略を示した図である。時点０では、２つの標的分析物１及び２が、リンカーを介して、イニシエーター配列「ｉ１」及び「ｉ２」にそれぞれ機能的に連結している、第一工程Ａプローブ「α」及び「β」にそれぞれ結合しており、該リンカーは、「Ｌ」と表されているが、循環的ＨＣＲの工程Ｂに記載されたあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される。イニシエーター「ｉ１」及び「ｉ２」によって惹起される直交性ＨＣＲシステムに対応するＨＣＲヘアピンが、試料に添加され、第一プローブα及びβにそれぞれ連結している、イニシエーター配列「ｉ１」及び「ｉ２」と接触し、標的分析物にＨＣＲポリマーを形成している。時点１において、プローブαに連結したイニシエーター「ｉ１」によって生成された前記ＨＣＲポリマーが、蛍光性部分に結合され、この蛍光を検出することで、標的分析物１を検出する。時点２において、前記蛍光性部分が前記ＨＣＲポリマーから除去される。時点３において、プローブβに連結したイニシエーター「ｉ２」によって生成された前記ＨＣＲポリマーが、蛍光性部分に結合され、この蛍光を検出することで、標的分析物２を検出する。時点４において、前記蛍光性部分が前記ＨＣＲポリマーから除去される。この例では、２つの標的分析物を標識するために、ただ１つの蛍光性部分が連続で再利用される。１回目のＨＣＲは時点１～２に表されており、一方、２回目のＨＣＲは時点３～４に表されている。図１３は、循環的ＨＣＲの工程Ｄのプログラミングの概略を示した図である。分析物に、リンカーを介してイニシエーター配列「ｉ１」に機能的に結合している、第一工程Ａプローブが結合しており、該リンカーは「Ｌ」と表されているが、循環的ＨＣＲの工程Ｂに記載されたあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される。付加的ハンドル配列を含むＨＣＲヘアピンが、試料に添加され、イニシエーター配列「ｉ１」と接触し、前記標的分析物でＨＣＲポリマーを形成する。前記ＨＣＲポリマーは前記付加的ハンドルも含む。工程１で、前記ＨＣＲヘアピンの前記ハンドルに相補的な、蛍光性工程Ｄプローブが、前記試料に添加され、前記ＨＣＲポリマーの前記ハンドル配列にハイブリダイズし、増幅された蛍光シグナルを前記ポリマーに、ひいては前記標的分析物に結合し、これが検出される。工程２で、前記ＨＣＲポリマーがそれ以上蛍光標識されないように、工程Ｄの方法及び材料に記載されるように、前記蛍光性工程Ｄプローブが、前記ＨＣＲポリマーから取り除かれるか、又は、特異的に分解される。図１４Ａ～図１４Ｂは、工程Ｄの方法及び材料を用いた、ＨＣＲポリマーの循環式蛍光標識を示した図である。図１４Ａは、ハイブリダイゼーションによる配列決定（例えば、蛍光プローブをＨＣＲ単位複製配列に含まれる特定の配列にハイブリダイズする）、又は、合成若しくはライゲーションによる配列決定などによって、プログラムで蛍光標識されている、生成されたＨＣＲ単位複製配列を有する、ＨＣＲイニシエーターに機能的に連結した、オレンジ色の三角形で表される、いくつかの第一プローブで標識された、青色の丸で表された、標的分析物を示している。ここで、シグナルは２つのサイクル間で付加的であり、例えば、蛍光とポリマーとの関連付けのプログラマビリティのみを用いて、蛍光とポリマーとの解離のプログラマビリティは用いない。図１４Ｂは、フルオロフォアを有する、ハイブリダイゼーションによる配列決定又はライゲーション反応による配列決定などにより、ＨＣＲポリマーに結合された、工程Ｄプローブを示している。イメージング後、前記蛍光性部分は、ＤＮＡ鎖内の架橋硫黄原子ホスホロチオエート結合の銀切断（ｓｉｌｖｅｒｃｌｅａｖａｇｅ）でのように、前記ＨＣＲ単位複製配列から化学的に切断され、前記ＨＣＲポリマー上に二本鎖オーバーハングが残るが、前記試料は暗状態にリセットされる。図１５Ａ～図１５Ｄは、検出メッセージとして指数関数的な標識空間内にバーコードを構成する複数サイクルのＨＣＲに亘る組み合わせシグナルの検出の実行の概略を示した図である。図１５Ａでは、２つの標的がそれぞれ、オレンジ色の三角形で示される、４種の独立した第一プローブで標識されており、これらはそれぞれ、循環的ＨＣＲ実験中に時間的に順序付けられた蛍光シグナルを生成する。各々の時間的に順序付けられた蛍光シグナルは「標識」と称され、ｎは標識の合計である。各々固有の標識が、蛍光スペクトルシグナル及び循環的ＨＣＲ反応内の時点の固有の組み合わせに対応している。例えば、１回目の循環的ＨＣＲにおけるＣＹ３シグナルは「標識ａ」として理解することができ、一方、２回目の循環的ＨＣＲにおけるＣＹ３シグナルは「標識ｆ」として理解することができる。なお、両方の標的分析物が「標識ａ」を共有しているが、一連の全ての定序性の蛍光シグナルに亘って、各標的分析物は固有の一連の定序性の標識を有しており、標的１の場合は［ａ、ｄ、ｈ、ｍ］であり、標的２の場合は［ａ、ｆ、ｇ、ｎ］である。例えば、この例の第一プローブは、各ｍＲＮＡ標的１及び２について、４つのＩＳＨ用プローブであり得る。循環的ＨＣＲが行われ、定序性の蛍光シグナルが検出される。ＨＣＲサイクル及び検出イベントの全体の後に、各標的分析物について組み合わせ標識が生成され、該組み合わせ標識が、標的分析物の分子種など、ある特定の一次情報に位置付けられる。図１５Ｂでは、標的１及び標的２のそれぞれが、いくつかの独立した標識を含む、オレンジ色の三角形として示されている、単一の第一プローブと結合しており、ここで、各々の固有の標識は、蛍光スペクトルシグナル及び循環的ＨＣＲ反応内時点の固有の組み合わせと理解される。この例では、前記第一プローブはタンパク質標的１及び２に結合した抗体とすることができ；これらの標識は、循環的ＨＣＲ実験で連続的に又は同時に工程Ｂプローブによってハイブリダイズされる、別々のＤＮＡリンカーモチーフであると理解することができる。循環的ＨＣＲが行われ、定序性の蛍光シグナルが検出される。ＨＣＲサイクル及び検出イベントの全体の後に、各標的分析物について組み合わせ標識が生成され、該組み合わせ標識が、標的分析物の分子種など、いくつかの一次情報に位置付けられる。図１５Ｃは、図１５Ａの標識を、一連の、時間的に順序付けられた、スペクトル的に別個のＨＣＲシグナルに位置付けている、参照表を示している。左の列は標識インデックスを含む。列「ＨＣＲサイクル」はサイクル数又は循環的ＨＣＲ反応内の検出時点を指す。この例では、ｎ個の標識が、ｋ個の直交性の、スペクトル的に別個のＨＣＲシステムによって、ｃｅｉｌ（ｎ／ｋ）回のサイクルで、検出される。列「ＨＣＲインデックス」は、前記ｋ個の直交性の、スペクトル的に別個のＨＣＲシステムのうちのどれが、ＨＣＲの各サイクル中の各標識に対応しているかを指している。図１５Ｄは、バーコードを構成する、図１５Ａに示された標的によって生成された定序性のＨＣＲシグナルセットであると理解される、検出メッセージを、検出されている分析物の正体に位置付けている、参照表を示している。前記バーコードは、それぞれ図１５ＣのＨＣＲインデックスに対応している、３つ組の値から、すなわち［１、２、３］の組から、構成される。この例では、前記ＨＣＲインデックスは、スペクトル的に別個の蛍光性部分で各々標識された、３つの直交性ＨＣＲシステムを指し得る。バーコード内の値の順番は、図１５ＣのＨＣＲサイクルの順番と一致する。図１６は、図１５Ａ、図１５Ｃ、及び図１５Ｄに示された試料に対して行われたＨＣＲ実験のサイクルを示した図である。循環的ＨＣＲ実験内の各回のＨＣＲで、オレンジ色の三角形として示される、第一プローブは、ＨＣＲサイクル数及びＨＣＲシステム又はスペクトル的に別個の蛍光シグナルの組み合わせを一意に参照する、「標識ｘ」と称されるリンカーに結合している。工程Ｂは、ＤＮＡハイブリダイゼーションでのように、「ｉ１」、「ｉ２」、又は「ｉ３」の組のうちの１つである、ＨＣＲイニシエーター配列に第一プローブを機能的に連結する、工程Ｂプローブの導入によって、プログラムされる。この例では、各々のＨＣＲサイクルでは、３つの工程Ｂプローブセットが第一プローブリンカーにハイブリダイズし、イニシエーター配列を付加する。３つの直交性ＨＣＲシステムに対応するＨＣＲヘアピンが添加され、前記イニシエーターと接触し、ＨＣＲヘアピンを形成し、増幅された蛍光シグナルが検出される。この例では、３つのＨＣＲシステムのそれぞれが、スペクトル的に別個の蛍光シグナルを有すると理解できる。次の回のＨＣＲの間に、前のサイクルからのイニシエーターが試料から除去されるように、工程Ｂが解除される。後のサイクルの各々において、異なる第一プローブセットを３つのＨＣＲイニシエーターのうちの１つに機能的に連結するために、新たな工程Ｂプローブが添加される。３つの直交性ＨＣＲシステムはＨＣＲの各サイクルで再利用される。各サイクルからのシグナルは、表５Ｄを用いて標的分析物にマップされる、バーコードへと組み合わされる。図１７Ａ及び図１７Ｂは、循環的ＨＣＲを用いた、標的核酸分子の指数関数的バーコーディングの一例を示した図である。緑色で示されたＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子が標的とされ、２４の順序付けられたビット（２^２４）から構成される固有の情報学的標識を割り当てられる。この情報学的標識は、１２の順序付けられた４つ組数値、すなわち、１２の順序付けられた、［０、１、２、３］の組から選択される整数、から構成される固有のバーコードへと変換される。バーコードは、４つの値からなる３つの「チャンク」、「ｂ１－ｂ４」、「ｂ５－ｂ８」、及び「ｂ９－ｂ１２」、に分けられる。個々の４つ組の値、すなわち［０、１、２、３］、のそれぞれは、イニシエーター配列及びヘアピンを含む固有の、直交性の、スペクトル的に分解可能なＨＣＲシステムに対応する。４つ組のバーコード列、すなわち「ｂ１」から「ｂ１２」、における各位置において、「リンカー」と称される合計４８の固有の配列のために、４つの固有の配列が、可能な４つ組の値、すなわち［０、１、２、３］、のそれぞれに割り当てられる。この４８のうちの１つに相補的なプローブが、その結合パートナーと特異的にハイブリダイズし、その他の４７のリンカーモチーフのいずれとも非特異的に結合しないように、リンカー配列は、ある特定の反応条件下でハイブリダイゼーションに対して直交性であるように設計される。標的ＲＮＡ又は標的ＤＮＡに対して、前記標的ＲＮＡ配列又はＤＮＡ配列に相補的な配列（青色で表示）を含む、数にして３ｋに等しい、複数の第一プローブが設計される。各々の第一プローブは、第一プローブのプール全体に亘って各標識がｋ回存在するように、３つのチャンクのうちの１つのバーコードに割り当てられる。図１７Ａにおいて、第一プローブは各々、標的分子に割り当てられたバーコードについて、各プローブに割り当てられた４つのチャンク内の各バーコード位置の４つ組の値に割り当てられた４つの配列を含むように、オリゴヌクレオチドの３’及び５’末端において付加配列で修飾される。標的ＲＮＡ分子又は標的ＤＮＡ分子は複数個の第一プローブとハイブリダイズする。図１７Ｂにおいて、循環的ＨＣＲの各サイクル中、バーコードの各位置について各位置「ｂｘ」の４つ組の値［０、１、２、３］に対応する、４つの工程Ｂプローブのプールが試料に添加される。４つ組の値に対応する４つの工程Ｂプローブは、それぞれ、イニシエーターｉ_ｑと称される、４つの直交性のスペクトル的に分解可能なＨＣＲシステムのうちの１つに対するＨＣＲイニシエーターとして機能する付加配列を含む。図１７Ｂにおいて、配列「ｂ_ｎ」を含む４つの工程Ｂプローブセットがアニールされ、過剰分は洗い流される。各工程Ｂプローブは、４つ組の値ｑ＝［０、１、２、３］に対応する４つの「ｂ_ｎ」配列のうちの１つを含み；従って、工程Ｂプローブは、一意的に唯一「ｂ_ｎ，ｑ」と称することができ、ここで、ｎはＨＣＲのサイクル及びそのサイクルで検出されているバーコード位置を指し、ｑは４つ組の値［０、１、２、３］を指す。図１７Ｂの工程１において、ＨＣＲヘアピンが試料に添加され、イニシエーターと接触し、ＨＣＲポリマーｑがイニシエーターｉ_ｑにおいて生成され、増幅された蛍光シグナルが生成され、これが検出される。図１７Ｂの工程２において、ＨＣＲ単位複製配列は、循環的ＨＣＲの工程Ｃをプログラムするための方法及び材料を用いて分解されており、リンカー工程Ｂプローブも工程Ｂをプログラムするための方法及び材料を用いて試料から除去されている。このアプローチを用いて循環的ＨＣＲの工程Ｂ及び工程Ｃが計１２回循環されて、各値が４つのスペクトル的に別個の増幅されたＨＣＲ蛍光シグナルのうちの１つに対応する、１２値バーコードのそれぞれの位置が検出される。４Ｎ直交性リンカードメインを介して、各サイクルが４つの可能な４つ組の値を読み取るＮ＝１２サイクルの循環的ＨＣＲを用いて、１６，０００，０００超の固有のバーコード（バーコードスペース４^１２）を生成するために、４つの直交性の、独立した、スペクトル的に別個のＨＣＲシステムしか用いない。図１８Ａ～図１８Ｄは、指数関数的バーコーディングプローブ設計の一例を示した図である。プローブセットの１つの設計では、各プローブが、標的ＲＮＡ分子又は標的ＤＮＡ分子（緑色で表示）に対する、標的化されたハイブリダイゼーションのための領域（青色で表示）、並びに、ＨＣＲのサイクル（Ｎ）及びＨＣＲプローブセット（ｋ）に関する一対の複合情報を含む情報保持標識配列、を含む。ここで、標的核酸に対する第一プローブの標的化ハイブリダイゼーションのための配列は２５～４２塩基長であり、第一プローブの標識配列部分は２５塩基長である。全てのプローブセットは、各々が、標的バーコードにおける４つ組のシグナル値をコードし、［ＦＡＭ、ＣＹ３、ＴｅｘａｓＲｅｄ、及びＣｙ５］の組からなるスペクトル的に分解可能な蛍光シグナルを用いて検出され、２０個の直交性の情報保持プローブセットを必要とし、且つ、１０２４の可能なバーコード（４^５）を与える、４つの直交性ＨＣＲプローブセットを用いる５サイクルのＨＣＲ用に設計される。図１８Ａは、第一プローブの設計、並びに第一プローブセットをハイブリダイズする工程及び次の循環的ＨＣＲを行う工程を含む手順の順番を示している。図１８Ｂは、実験デザインの一部としてのサイクル、直交性ＨＣＲシステム、及び蛍光シグナルに対しての、セット０～１９の、標識配列の部分的マップを含む、表を含んでいる。図１８Ｃは、４つの工程Ｂプローブが試料にハイブリダイズされ、そのうちの１つが各標的分子における第一プローブにアニールする、第一サイクルのＨＣＲを示している。過剰な工程Ｂプローブは洗い流され、ＨＣＲヘアピンが試料に添加され、ＨＣＲヘアピンはイニシエーターと接触し、重合して、蛍光標識されたＨＣＲポリマーになる。蛍光シグナルが検出されるが、バーコードの第一位における４つ組の値のうちの１つであると理解される。このパネルでは、標的分子は、ＣＹ３蛍光シグナルを有する、ＨＣＲシステム番号２に対応する、バーコードの第一位における値２を有する。シグナルの検出の後、循環的ＨＣＲ工程Ｃとして記載される方法を用いて前記ＨＣＲポリマーが試料から除去され、第一プローブがそれ以上、機能的ＨＣＲイニシエーターを含まない、又はそれに結合しないように、工程Ｂも解除される。図１８Ｄは、４つの工程Ｂプローブが試料にハイブリダイズされ、そのうちの１つが各標的分子における第一プローブにアニールする、第二サイクルのＨＣＲを示している。過剰な工程Ｂプローブは洗い流され、ＨＣＲヘアピンが試料に添加され、ＨＣＲヘアピンはイニシエーターと接触し、重合して、蛍光標識されたＨＣＲポリマーになる。蛍光シグナルが検出されるが、バーコードの第一位における４つ組の値のうちの１つであると理解される。このパネルでは、標的分子は、ＦＡＭ蛍光シグナルを有する、ＨＣＲシステム番号１に対応する、バーコードの第一位における値１を有する。シグナルの検出の後、循環的ＨＣＲ工程Ｃとして記載される方法を用いて前記ＨＣＲポリマーが試料から除去され、第一プローブがそれ以上、機能的ＨＣＲイニシエーターを含まない、又はそれに結合しないように、工程Ｂも解除される。３つの追加のＨＣＲサイクルの後、図示されていないが、循環的ＨＣＲにおいて生成される、固有の組み合わせのバーコードを構成する、５つの増幅された蛍光シグナルの固有の組み合わせを用いて、各標的分子は同定される。図１９は、標的核酸分子を検出するための工程Ａ～工程Ｄを用いる循環的ＨＣＲ実験の概略を示した図である。工程１は、第一ＩＳＨ用プローブセットの標的分析物への導入及び結合を対象とする。工程２は、第一プローブに相補的な配列と、ＨＣＲイニシエーターも含む、循環的ＨＣＲ工程Ｂプローブの導入及び結合でのように、ＨＣＲイニシエーターと第一プローブとの間の機能的な連結を確立することを対象とする。この図では、循環的ＨＣＲ工程Ｂプローブは、緑色の丸によって表示されている、切断可能な基を含む。工程３は、イニシエーターと接触し、ＨＣＲポリマーとして知られる繋留された核酸高分子へと重合する、ＨＣＲヘアピンの導入を対象とする。この図では、ＨＣＲヘアピンは、緑色の丸によって表示されている、切断可能な基で修飾される。工程４は、ポリマー上にオレンジ色の点として表示されている蛍光性部分による、前記ＨＣＲポリマーの蛍光標識を対象とする。工程５は、前記ＨＣＲポリマーの蛍光標識を解除させることによる、循環的ＨＣＲ工程Ｄのプログラミングを対象とする。工程６は、切断可能な部分と反応し、また、第一プローブからＨＣＲイニシエーターを切断する、化学薬品の導入でのように、前記ＨＣＲポリマーを切断することによる、循環的ＨＣＲ工程Ｂ及びＣのプログラミングを対象とする。工程７は、前記試料からの前記ＨＣＲポリマー断片の洗い流しを対象とする。工程８は、ＲＮＡ標的は消化しない、デオキシリボヌクレアーゼを用いたＩＳＨ用ＤＮＡプローブの消化のように、第一プローブを標的分析物から除去することによる、循環的ＨＣＲ工程Ａのプログラミングを対象とする。工程９は、前駆物質としての新たな循環的ＨＣＲ工程Ｂプローブセットを生成中の新たなＨＣＲポリマーに導入することによる、循環的ＨＣＲ工程Ｂのプログラミングを対象とする。図２０は、インビトロ転写又はポリメラーゼ伸長とその後のλエキソヌクレアーゼ消化による一本鎖ＤＮＡヘアピンの生成を用いた、多重ＨＣＲヘアピンを合成するための方法の概要を示した図である。図２１は、ＨＣＲ標識戦略Ｉを示した図である。二本鎖鋳型ＤＮＡが、化学合成を通じて、又は化学合成とその後のＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長を通じて、生成される。二本鎖鋳型ＤＮＡは、ＨＣＲヘアピンのための配列、及び、蛍光プローブハイブリダイゼーション又はトーホールド鎖置換のためのハンドルなどのあらゆる付加配列、を含む。二本鎖鋳型ＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列などの、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。二本鎖鋳型ＤＮＡは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でのように、精製されてもよい。二本鎖鋳型ＤＮＡを用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）によりＲＮＡ分子が生成される。前記ＲＮＡは前記二本鎖鋳型ＤＮＡから精製されてもよい。前記ＲＮＡ分子を逆転写（ＲＴ）用の鋳型として用いて、相補的な一本鎖ＤＮＡ分子が生成される。前記ＲＮＡが分解され、且つ／又は、前記一本鎖ＤＮＡが精製され、準安定ヘアピンに折り畳まれる。ＨＣＲヘアピンが、末端デオキシトランスフェラーゼ反応などによる、いくつかの方法で蛍光標識されて、１又は複数の末端蛍光修飾ＤＮＡ塩基が追加される。前記ＲＴプライマーは、得られる一本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれる、１又は複数のフルオロフォアを含む。蛍光性ＤＮＡ塩基は逆転写中に一本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれる。あるいは、逆転写などの間に、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、合成による配列決定（ＳＢＳ）、又はライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）による蛍光標識のための部位として機能する付加配列が、ＨＣＲ分子に追加される。図２２はＨＣＲ標識戦略ＩＩを示した図である。ＤＮＡポリメラーゼ伸長と、その後の一方のＤＮＡ鎖のλエキソヌクレアーゼ消化によって、ＰＡＧＥによって精製されてもよい、一本鎖ＤＮＡ分子が残って、一本鎖ＤＮＡヘアピンが生成され、ＨＣＲヘアピンへと折り畳まれる。ＨＣＲヘアピンが、末端デオキシトランスフェラーゼ反応などによる、いくつかの方法で蛍光標識されて、１又は複数の末端蛍光修飾ＤＮＡ塩基が追加される。エキソヌクレアーゼ消化から保護されたＤＮＡ鎖は１又は複数のフルオロフォアを含み得る。蛍光性ＤＮＡ塩基はポリメラーゼ伸長中に一本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれる。あるいは、逆転写などの間に、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、合成による配列決定（ＳＢＳ）、又はライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）による蛍光標識のための部位として機能する付加配列が、ＨＣＲ分子に追加される。図２３は、循環的ＨＣＲの３つのサイクルから得られる循環的ＨＣＲ実験データの概略を示した図である。縦軸は時間軸を示し、時間軸上の３つの時点はＨＣＲの３つのサイクルに対応している。各々の箱は単一細胞の４色画像を示している。これらの４つの色は、循環的ＨＣＲの各時点で使用される４つの直交性ＨＣＲシステムに対応する、スペクトル的に分解可能な４つの蛍光性部分からのシグナルに対応している。「標的１」と標識された箱は、箱「標的１」を各時点の蛍光性ＨＣＲシグナルに結び付けている矢印によって示される、特定の標的分析物に対する複合標識を示している。この図では、標的分析物１は、固有の時間順の複合標識、又はバーコード、［０、３、２］によって、同定される。箱「ＨＣＲシグナル」は、各シグナルと関連付けられた４つ組の数値と共に、４つの直交性ＨＣＲシステムに対応する、スペクトル的に分解可能な４つの蛍光シグナルを示している。多数の標的分析物が細胞内で同時に検出される。ＨＣＲの各サイクル内で、蛍光シグナルは減衰し、あるいは、一意的に同定するものではなくなるが、ＨＣＲサイクルの全体を通じては、組み合わされた時間順の複合シグナルは、各標的分析物の固有の同定標識である。各標的分析物を経時的に追跡することにより、各サイクルからのシグナルが複合標識に組み合わされる。各標的分析物は、特定の分子種、分子的性質、又は分子構成と同定される。このようにして、各標的分析物の存在量だけでなく、各標的分析物の空間的局在及び空間的分布を測定できる。図２４は、修飾合成ＨＣＲ試薬、具体的には循環的ＨＣＲの工程Ｃをプログラムするための切断可能なＨＣＲモノマー、の使用のインビトロ実証を示した図である。この１％アガロースＤＮＡ電気泳動ゲルは、レーン１にサイズラダーを示しており、サイズバンドは矢印で示された２５ｂｐ、０．５ｋｂ、及び２．６５ｋｂに対応している。レーン２は、イニシエーター無し且つ切断無しのモノマーが準安定モノマーの最少の増幅漏れを示すことを示している。レーン３は、これらのヘアピンの場合は架橋性ホスホロチオエート結合を切断する硝酸銀である、切断試薬の存在下、ヘアピン及びモノマーが分解され、バンドが現れないことを示している。レーン４は、イニシエーター及びモノマーの存在下、ただし切断試薬は含まれない場合、モノマーは、数キロベースサイズにまで達するより高度な分子量スメアとして見られる、より大きなポリマーへと増幅することを示している。図２５Ａ～図２５Ｃは、循環的ＨＣＲ技術のある特定の実行を示した図である。図２５Ａは、ビーズ上のＨＣＲ蛍光増幅を示している。ビーズをＤＮＡオリゴとＰＢＳ緩衝液中で３０分間ハイブリダイズさせることにより、ストレプトアビジン結合磁気ビーズ（ダイナビーズ社）をビオチン修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドに結合し、その後、ビーズが上清と一緒に除去されることを防ぐために磁石を用いて数回洗浄した。「＋工程Ｂプローブ」と称される１つのビーズプールを、次に、第一ビオチン化プローブに相補的なＨＣＲイニシエーターを含む第二プローブと、２×ＳＳＣ中で１０分間インキュベートすることにより、アニールさせた。「－工程Ｂプローブ」は、第二オリゴをなくしたのみで、ＳＳＣ中でインキュベートした。どちらのビーズセットも、０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ５分間、５回洗浄した。次に、ビーズを正電荷のガラスに添加した。ＣＹ３標識ＨＣＲ増幅因子モノマーをプロトコル（モレキュラー・インスツルメンツ社）に従ってスナップ冷却し、５００ｕＬ体積の５×ＳＳＣに対して各３０ｐｍｏｌをビーズに添加し、室温で４時間インキュベートした。どちらのビーズも、０．２×ＳＳＣ中でそれぞれ５分間、５回洗浄した。ビーズを広視野及びＣＹ３チャネルの両方でイメージングしたところ、工程Ｂプローブを有するビーズの選択的な増幅を示した。このように、第一プローブから、ＨＣＲ蛍光シグナルの検出までの、標識カスケードは、分断された。図２５Ｂでは、キイロショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の胚を回収し、標準的なプロトコルに従って透過処理した後、標識Ｘ試薬と一緒にインキュベートして、アクリダイト（ａｃｒｙｄｉｔｅ）部分を有するＲＮＡを修飾した。これらの胚を次に、アクリルアミドヒドロゲルマトリックス内に包埋して、ＲＮＡ分子を該ヒドロゲルに結合させた。この試料を次に、プロテアーゼで広範に処理することで、試料を純化し、自己蛍光を低減させた。この試料を、ＳＳＣ及びクラウディング剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇａｇｅｎｔ）であるデキストラン硫酸を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中で一晩インキュベートすることによる、表１中の配列を使用する、ＲＮＡＰＯＬＩＩｍＲＮＡに対するin situハイブリダイゼーションに用いた。表２からの標識ＩＤ０を有する胚工程Ｂプローブを、次に、第一プローブにハイブリダイズした。ＨＣＲによって、ショウジョウバエ胚内の増幅された蛍光点の生成が生じた。図２５Ｃは、初代ヒト線維芽細胞内の５００のｍＲＮＡのプールを標的とする大規模多重循環的ＨＣＲＩＳＨからのＨＣＲの２つのサイクルを示している。ヒト線維芽細胞をガラス上で培養し、固定し、透過処理した。一連の５００のｍＲＮＡを標的とするＤＮＡＩＳＨ用プローブプールを試料に加え、ＳＳＣ及びクラウディング剤であるデキストラン硫酸を含有するハイブリダイゼーション緩衝液中で４８時間インキュベートした。工程Ｂリンカープローブのある特定のサブセットを第一プローブにハイブリダイズし、ＨＣＲを用いて、蛍光性工程Ｄプローブのハイブリダイゼーションのための付加的ハンドルを各々有する、非蛍光性の、直交性の繋留されたＨＣＲポリマーの２集団を生成した。サイクル１では、ある特定の工程Ｄプローブを前記ポリマーのあるサブセットにハイブリダイズし、これを用いて増幅された蛍光シグナルを生成し、これを検出した。この試料を次に硝酸銀で処理し、工程Ｄプローブからフルオロフォアを切断した。サイクル２では、その他の工程Ｄプローブをポリマーのその他のサブセットにハイブリダイズして、サイクル１と同じ蛍光性部分を用いて増幅された蛍光シグナルを生成し、これを検出した。

本開示は、以下の工程を含む、試料中の１又は複数の標的分析物を検出するための方法を提供する：（Ａ）前記試料を１又は複数のプローブセットと接触させる工程（各プローブセットはリンカーをそれぞれ有する１又は複数の第一プローブを含み、各プローブセットは標的分析物に特異的であり、前記リンカーを有する１又は複数の第一プローブは前記標的分析物と結合する）、（Ｂ）前記試料を前記リンカーに結合する１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと接触させる工程、（Ｃ）前記試料を２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーと接触させる工程（前記１又は複数のイニシエーターは前記２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーと接触し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起して、自己集合し繋留された核酸増幅ポリマー産物を生成する）、並びに、（Ｄ）１又は複数の検出可能な標識を前記繋留された核酸増幅産物に結合させ、所望により前記１又は複数の検出可能な標識を検出する工程。本開示により以下が提供される：前記プローブが前記標的分析物から除去可能であるか、前記イニシエーターが前記リンカーから除去可能であるか、前記核酸増幅ポリマー産物が前記イニシエーターから除去可能であるか、又は、前記１若しくは複数の検出可能な標識が前記核酸増幅ポリマー産物から除去可能である。本開示により以下が提供される：前記プローブが前記標的分析物から除去可能であり、前記イニシエーターが前記リンカーから除去可能であり、前記核酸増幅ポリマー産物が前記イニシエーターから除去可能であり、かつ、前記１若しくは複数の検出可能な標識が前記核酸増幅ポリマー産物から除去可能である。

本開示は、以下の工程を含む、試料中の１又は複数の標的分析物を検出するための方法を提供する：（Ａ）前記試料を１又は複数のプローブセットと接触させる工程（各プローブセットはリンカーをそれぞれ有する１又は複数の第一プローブを含み、各プローブセットは標的分析物に特異的であり、前記リンカーを有する１又は複数の第一プローブは前記標的分析物と結合する）、（Ｂ）前記試料を前記リンカーに結合する１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと接触させる工程、（Ｃ）前記試料を検出標識を含む２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーと接触させる工程（前記１又は複数のイニシエーターは前記２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーと接触し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起して、自己集合し繋留された核酸増幅ポリマー産物を生成する）、並びに、（Ｄ）所望により前記１又は複数の検出可能な標識を検出する工程。本開示は以下を実現する：前記プローブが前記標的分析物から除去可能であること。本開示は以下を実現する：前記イニシエーターが前記リンカーから除去可能であること。本開示は以下を実現する：前記核酸増幅ポリマー産物が前記イニシエーターから除去可能であること。

本開示の態様は、多くの回数の逐次ＨＣＲ反応に亘る、Ｎ個の直交の、独立した、且つスペクトル的に分解可能なＨＣＲシステムによって生成される、標的分析物と蛍光シグナルとの間のプログラム可能な関連付けを生成して、Ｎ個より多い分析物を標識することを対象とし、ＨＣＲ技術の成分間の情報伝達性連結は、モジュール式、すなわち、図２に示されるような、別々の工程又は活性として示されるもの、とされる。図２において、分析物中の情報は、調査中の分子種、分子的性質、又は分子構成など、原子、分子、化合物、又は分子複合体の特定の空間的及び／又は時間的な配置によって伝達又は表現される、測定されることが望ましいものを広く指すとされる。検出時、この情報又はいくらかのその断片は、標的分析物からヒト又はコンピュータシステムへと標識及び検出を介して伝達される。「伝達される」とは、本明細書において、情報、又はいくらかのその断片、又はいくらかのその表現が、分子接触又は光子などによる、物理的相互作用又は電磁相互作用を介して伝えられることを指す。

一次情報は、調査中の分子種、分子的性質、又は分子構成など、検出中の分析物の特性である。この情報は、結合したプローブの存在によって分析物の一次情報が表されるように、標的分析物と特異的に結合するプローブによって運ばれている分析物を介して伝達される。前記プローブによって運ばれる分析物情報又はそのいくらかの断片が、リンカーを介して、ＨＣＲイニシエーターへと伝達される。前記ＨＣＲイニシエーターの存在及び局在へと伝達された、前記分析物情報又はいくらかのその断片が、ＨＣＲポリマーとして知られる、１又は複数の準安定ヘアピンのハイブリダイゼーション連鎖反応の開始により、ＤＮＡポリマーに伝達される。ＨＣＲポリマーの存在及び局在へと伝達された、前記分析物情報又はいくらかのその断片が、デジタルカメラを備えた顕微鏡などの光子ディテクターを用いて測定可能な増幅された蛍光シグナルに伝達される。これらの工程は、図１及び図２に示されるような、ＨＣＲを用いた分析物検出実験における情報伝達系統を説明している。本開示の関連において、「情報伝達系統」は、以下の個々の方法工程を指し得る：プローブを標的分析物と可逆的に結合するなどの結合工程、イニシエーター鎖を前記プローブと可逆的に結合するなどの結合工程、ＨＣＲポリマーを生成するための、前記イニシエーター鎖を準安定ＨＣＲモノマーと可逆的に結合するなどの結合工程、並びに、前記ＨＣＲポリマーを１以上もしくは複数の検出可能な標識又は部分と可逆的に結合するなどの結合工程。前記方法における各工程は、前の工程に戻るように、究極的には最初の標的分析物に戻るように、可逆的であり得る。前記方法における各工程は、複数回、解除及び反復、又は循環されてもよい。

図３に示されるように、分析物の一次情報は、循環的ＨＣＲを用いる分析物検出実験を通じて、情報学的表現及び物理学的表現の両方を有する。一次情報は、「標識」と称される情報学的標識と一意に関連付けられる。標識は２進列として表すことができるが、分析物若しくはその一次情報、例えば遺伝子名、又はそれへの参照、に対応する英数字値など、一次情報のあらゆる記号的表現を伝達することが意図される。この情報学的標識は、検出されたメッセージを含む時間空間的に体系化された蛍光シグナルを介して伝達される、情報学的メッセージによって一意的に表される。この情報学的標識及び情報学的メッセージは同じものであってもよいし、あるいは、該メッセージは、エラー検出又はエラー修正の目的で使用される追加情報のように、該標識を参照するのに厳密に必要となるものを超える追加情報を含んでもよい。例えば、「メッセージ」は、標識のビットストリングと、その後に続く標識の逆ビットストリングとして構築されている場合がある。このメッセージを検出する際は、標識の各ビットを２回検出することで、ある特定のエラーが検出されることを可能とする（例えば、標識の最初のビットが、メッセージの最初のビットにおいて「０」、その後メッセージの最後のビットとして「１」、として検出された場合、プロービング、ＨＣＲ、イメージング、又は画像処理の間など、メッセージの伝達又は検出の間にエラーが生じていることが明らかである）。エラー検出及びエラー修正についての追加情報を含むメッセージを構築するための他の方法としては、反復符号、パリティビットの使用、チェックサムの使用、リードソロモン符号、ゴーレイ符号、及びハミング符号が挙げられる。このメッセージは、固有の一連の時間的に順序付けられた蛍光性ＨＣＲシグナルに変換され、これが検出されるメッセージとなる。ＨＣＲシグナルの時間的順序付けは、一連の実験プロトコル及び実験材料（例えば、第一（工程Ａ）プローブ、工程Ｂプローブ、工程Ｃプローブ、及び／又は工程Ｄプローブ、顕微鏡、他の試薬等）として設計される、且つ、実験によって実施される、循環的ＨＣＲの方法及び材料のプログラマビリティによって可能となる。

循環的ＨＣＲは、とりわけ、各情報伝達工程のプログラマビリティを達成するための方法及び材料によって可能となる。「プログラマビリティ」とは、情報伝達の各工程を、ゲーティング可能にする、すなわち、前記情報伝達が複数の入力に依存している、所定の不連続なスケジュールに従って実行可能とする材料及び方法を指し；あるいは、各工程は、特異的に解除させることが可能であり（すなわち、前記プロセス内の後の工程に移った情報が、検出された後に、選択的に破壊される、又は検出不可にされる）；又は、各工程はゲーティングされることも可逆的であることも両方可能である。

本明細書において、分析物は本明細書に記載のＨＣＲ法を用いて調べられているものである。工程Ａでは、結合したプローブの存在によって分析物の一次情報が表されるように、分析物が、標的分析物と特異的に結合するプローブの標的とされる。工程Ｂでは、前記プローブによって運ばれる分析物情報、又はそのいくらかの断片が、リンカーを介して、ＨＣＲイニシエーターへと伝達される。工程Ｃでは、前記ＨＣＲイニシエーターの存在及び局在へと伝達された、前記分析物情報又はいくらかのその断片が、ＨＣＲポリマーとして知られる、１又は複数の準安定ＨＣＲモノマー又はヘアピンのハイブリダイゼーション連鎖反応の開始により、ＤＮＡポリマーに変換される。工程Ｄでは、ＨＣＲポリマーの存在及び局在へと伝達された、前記分析物情報又はいくらかのその断片が、デジタルカメラを備えた顕微鏡などの光子ディテクターを用いて測定可能な増幅された蛍光シグナルに変換される。この情報の流れは、標識カスケードとも称され、図２に図示される。

ＡからＢ、Ｃ、Ｄへのフローチャートの各工程において、又は、これらの工程のあらゆるサブセットについて、前記方法はさらに本明細書に記載されるような所望の回数循環せられる。すなわち、循環的ＨＣＲは、これらの情報伝達工程を多数回循環するために、これらの情報伝達工程のプログラマビリティを達成するための方法及び材料によって可能となる。各工程は多くの回数、循環、すなわち反復できる。循環的ＨＣＲの好ましい実行において、１又は複数の情報伝達工程Ａ～Ｄ（すなわち、前記第一プローブが前記分析物に結合し、第一プローブがＨＣＲイニシエーター配列に機能的に連結し、前記イニシエーターがヘアピン構造と接触し、前記ハイブリダイゼーション連鎖反応が生じ、得られたポリマーが検出可能なシグナルを生成し、これが検出される（蛍光シグナルなど））は、これらの工程が１回又は複数回反復されることを可能にするために、可逆的にされる。

「解除する」、「解除される」又は解除可能な」とは、本明細書で述べられる場合、結合した、若しくは連結された分子の除去若しくは分離、又は、前記試料からの蛍光性部分の除去、又は、前記試料を検出されるべき検出可能な部分又は活性部分が無い状態にまで戻すこと、を指し得る。検出可能な部分は、本明細書に記載される方法、又は当業者に公知の方法を用いて、除去できる。これにより、スペクトル的に別個のシグナルの空間全体を、毎回使用できるようになる。あるいは、これらのシグナルは付加的であってよく、その場合、各回のＨＣＲが新たなシグナルを既存のシグナルに加える。その場合、前記新たなシグナルを推測するために、計算によって、既存のシグナルが減算され得る。「解除する」、「解除される」又は解除可能な」とは、状態Ｄにあり修飾されている試料を工程Ａ、Ｂ、又はＣの試料に置くなど、試料をより初期の段階に戻すことを指し得る。

循環的ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＣＨＣＲ）は、ＨＣＲ反応の全体に亘って各標的が固有のＨＣＲシグナル又はＨＣＲシグナルセットと関連付けられるように、複数の標的分子、分子の実体、分子の性質、又は分子組成の連続標識又は組み合わせ標識のための、連続して実行される、又は連続して実行される一連の併発反応としての、１以上もしくは複数のＨＣＲ反応の設計によって、１又は複数の分析物又は標的分子を検出するために、使用することができる。標的分子としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びその類似体などの核酸高分子、タンパク質を含むアミノ酸重合体、上記のいずれかの化学修飾体、脂質、代謝産物、生体分子、及び他の小分子、並びに上記いずれかの１又は複数を含む分子組成物が挙げられる。

循環的ＨＣＲは、ＨＣＲの各サイクルからの蛍光シグナルが、個々の蛍光シグナルに含有されるよりも情報量が多い複合標識、又はバーコード、へと組み合わされることを可能にすることによって、多重分析物検出を達成する。試料中に存在する蛍光シグナルの検出後、デジタル顕微鏡法でのように、情報が獲得される。ＣＨＣＲ実験の検出時点は、循環中のＣＨＣＲ工程Ａ～Ｄのいかなる組み合わせによっても決定され得る。例えば、検出時点のいくつかのサブセットは循環中の工程Ｄ中に起り得る、すなわち、第一プローブ及びリンカーを介して蛍光シグナルを標的分析物に繋留されたＨＣＲポリマーと結合するサイクルは、機能的なＨＣＲイニシエーターを含有する、本明細書に記載のプログラム不可又はプログラム可能なＣＨＣＲ工程Ｂ法のいずれか、と理解される。同一実験内の検出時点の別のサブセットは、工程Ｂ～Ｄを繰り返す間に、すなわち、ＨＣＲイニシエーターを第一プローブに機能的に連結し、繋留されたＨＣＲポリマーを生成し、増幅された蛍光シグナルを検出することによって、起り得る。これらの時点のサブセットは逐次的又は交互的であり得る。検出時点はＣＨＣＲ実験の設計によって決定される。いずれにしても、それぞれ別々の検出イベントは画像データの獲得であると理解される。検出イベントの間に、ＨＣＲによって生成された蛍光シグナルと標的分析物との間の関連付けは何らかの変化を起こす。蛍光シグナルと標的分析物との間の関連付けは付加的であってよく、その場合、新たな蛍光シグナルが各サイクルで添加される。あるいは、蛍光シグナルと標的分析物との間の関連付けは、以前のシグナルが破棄され、新たなシグナルが確立されるように、交換されてもよい。

時間順のシグナルから構成される複合標識は、多重度において、又は理論的情報量において、変動し得る。ＨＣＲの各サイクルにおいて、Ｎ個のスペクトル的に分解された直交性ＨＣＲシステムを用いて、蛍光シグナルを生成すると仮定する。これらのＮ個のスペクトル的に分解されたシグナルは、あらゆる特定の画像において特定波長から光を検出するために帯域フィルタを用いるなど、当業者に公知の手法を用いるものとは区別可能な発光スペクトルを有する蛍光性部分であり得る。あるいは、Ｎ個のスペクトル的に分解されたシグナルは、蛍光性部分の「比色的」組み合わせを含み得る。複合標識、又はバーコードは、１つの循環的ＨＣＲ実験内の２以上の検出イベントから得られた情報を組み合わせることによって、標的分析物を標識するために、使用される。

循環的ＨＣＲ実験を通じて、標的分子当たり２以上の蛍光シグナルを検出することによって、指数関数的バーコーディング又は組み合わせバーコーディングが可能となる。用語「組み合わせ」とは、特に、集合の全要素をいくつかの連続又は順序に並べる行為に関連する順列という数学的概念を指して用いられ、集合から選択されるｋ個の異なる要素の定序配列である（ｋが集合の大きさと等しい場合、これらは集合の順列である）、部分順列を含む。循環的ＨＣＲ技術では、この連続又は順序は、ＣＨＣＲ工程Ａ～Ｄのうちの一つ又は複数を循環させるなどによる、循環的ＨＣＲ実験を通じての蛍光検出イベントの時間的順序として理解される。集合の要素は、ＣＨＣＲのあらゆる単一時点内でＨＣＲシステム全体によって生成されるスペクトル的に分解可能な蛍光シグナル全ての集合であると理解される。単一時点内の各々異なるＨＣＲシグナルがＮ個のスペクトル的に別個の色素のうちの１つによって生成される場合、これらのシグナルは、このサイズＮの集合の要素である。全ての単一色及び組み合わせが使用された場合、スペクトル的に分解可能な蛍光シグナルの集合の要素が２^Ｎ－１個ある（例えば、単一色の赤及び青がある場合、異なるシグナルの集合は、３種のシグナル、赤、青、並びに、同時の赤及び青が組み合わされたシグナル、を含むと見なされる）。

用語「指数関数的」は、特に、バーコードスペースがサイクルの数、すなわち定序性の検出イベントの数、に伴って指数関数的に伸びる場合を指して用いられる。例えば、一連のＮ個の異なるシグナルが各時点で用いられ、且つ、ｋ個の時点が循環的ＨＣＲ中の検出に用いられる場合（ＣＨＣＲ工程Ａ～Ｄのうちの一つ又は複数の循環でのように）、バーコード長さはｋであると理解され、可能なバーコードのスペースはＮ^ｋであり、同定可能な異なる標識の上限、すなわち、ＣＨＣＲ実験内で検出可能な標的分析物の数、が定められる。この例では、各標的分析物は各時点の蛍光シグナルと関連付けられる。

ＣＨＣＲの各サイクルにおいて、０～１個の異なるシグナルが各標的分析物と関連付けられる。各標的分析物が循環的ＨＣＲ中の厳密に１つの時点で異なるシグナルを生成する場合、バーコーディングは直線的になると理解される。例えば、標識可能な標的分析物の数は、各追加サイクルにつき、高々Ｎ個の異なるシグナルだけ、直線的に増加する。従って、ｋ回のサイクルを用い、各時点でＮ個の異なるシグナルを用いた場合、高々Ｎ×ｋ個の標的分析物の検出が可能である。

計算上は、Ｎ個の異なるシグナルが各時点で使用されるｋ回のサイクルを含む循環的ＨＣＲ実験の中で、長さａの複合バーコードで別々に標識可能な標的分析物の数の上界は、ｋ／ａ×Ｎ^ａに等しい。この式を用いて、より初期の値を容易に求めることができる。各標的分析物がｋ個の時点の各々に蛍光シグナルを有する初期の場合では、複合バーコードの長さはａ＝ｋであり、前記式は既知のＮ^ｋを減少させる。各標的分析物がｋ個の検出時点を有する循環的ＨＣＲ実験の厳密に１つの時点に蛍光シグナルを有する場合では、前記式はｋ×Ｎまで減少する。１≦ａ≦ｋを特定として、各標的分析物が長さａの複合標識と関連付けられる循環的ＨＣＲ実験を構築することが可能である。

この式は、単なる、循環的ＨＣＲ実験の中で別々に標識可能な標的分析物の数の上界の説明である。説明の通り、長さａを有する、検出される情報学的メッセージは、エラー検出又はエラー修正に使用される情報など、固有の標的分析物標識の同定に必要な情報を超えるいくらかの情報を含み得る。

長さが１より大きい複合標識、又はバーコード、を構築するために、すなわち指数関数的バーコーディングが使用されるいずれの場合も、時間順の複合標識を構築するのに、サイクル間又は時点間で標的分析物からのシグナルを連結することが必要である。これは、典型的には、生物試料の化学的固定、又はヒドロゲルなどの三次元マトリックスへの標的分析物の架橋結合などにより、標的分析物を空間的に固定して、ＨＣＲのサイクル間の標的分子の空間的組織化を防ぐことによって、達成される。しかし、ＨＣＲシグナルを単一の標的分析物に位置付けできるように、標的分析物の位置を経時的に追跡することによって、標的分析物からのシグナルを連結することも可能である。例えば、追跡部分を標的分析物に付けて、これを、連続的に又は標的分析物の位置を経時的に追跡するのに十分な時間間隔を置いて検出してもよい。各ＨＣＲ検出イベントで、ＨＣＲシグナルは特定の標的分子と関連付けられ得る。各時点からのＨＣＲシグナルを特定の標的分子に位置付けることを可能にするいかなる方法も、個々の蛍光シグナルからの複合標識の構築を可能にする。

単一の検出イベントは一次情報の全てを伝達し、標的分析物を同定するのに十分であることから、長さが１に等しい循環的ＨＣＲを用いて生成される固有の標識のために、すなわち、各標的分析物がＨＣＲサイクル全体を通じて厳密に１つの増幅された蛍光シグナルを生成する循環的ＨＣＲ標識法のために、標的分析物を経時的に追跡する必要はない。

ある特定の実施態様において複合標識を構築する場合、単一の標的分子と関連付けられたシグナルを検出することが重要になり得る。例えば、２つの標的分子が回折限界距離内で空間的に位置している場合、それらが生成する蛍光シグナルは回折限界顕微鏡法を用いて重ね合わされる。従って、これら２つの標的分子に対する複合標識は、これらが異なる標識から成る複合標識である場合、回旋しており、回旋した複合標識から下層にある複合標識を同定できない場合がある。しかし、この問題を回避するための、循環的ＨＣＲに適合する戦略はいくつもある。例えば、シグナルを空間的に分解するために、多くの既存の超解像顕微鏡法を用いることができる。これらは、物体が確率論的に明滅し、後に回折限界未満の精度で局限される、ＤＮＡＰＡＩＮＴ、ＳＴＯＲＭ、ＰＡＬＭ、ＳＯＦＩなどの、確率論的な超分解能法、及び、ＳＴＥＤ、ＳＩＭなど、の確定的超解像顕微鏡法、のいずれかを含む。循環的ＨＣＲ発明の態様は、全ての個々の標的分子が各検出イベント内で空間的に分解可能な（すなわちパーティショニング）、各サブセット中の標的分析物の濃度が十分に低くなるように、循環的ＨＣＲ実験におけるいずれかの１時点の複合標識のサブセットのみを検出し、その後、別のサブセットなどを検出することによって、新規の確率論的又は確定的な超分解能検出法を可能にし得る。ある特定の実施態様において、標的分析物は、個々に分解できるように標的分析物を物理的に分離する（Ｓｃｉｅｎｃｅ３４７（６２２１）：５４３－５４８）における膨張するマトリックスなど、膨潤性の三次元マトリックスに物理的に結合され得る。他の実施態様では、第一プローブ若しくは複数の第一プローブ、リンカー、工程Ｂプローブ、ＨＣＲイニシエーター、ＨＣＲポリマー、又は検出可能な標識、又は検出中の一次情報を含む又は検出中の一次情報であるあらゆる対象物が、前記膨張するマトリックスに結合され得る。複合標識を個々の標的分子に対して構築できるように、検出中の個々の標的分子を分解することを可能にする、又は、個々の標的分子に対応する複合標識を回収できるように、検出された回旋した複合標識の情報学的デコンボリューションを可能にする、いかなる方法も、循環的ＨＣＲを用いる複合標識の検出のために、可能である。

工程Ａ）１又は複数の第一プローブによる複数の標的分子の循環的標識
本明細書に記載の方法において、試料中の複数の標的分子は、１以上もしくは複数の第一プローブを標的分子に結合する工程を含めて、連続して又は、好ましくは、同時に、各々個々に検出される。第一プローブは「第一プローブ」、「第一工程Ａプローブ」、又は「工程Ａプローブ」とも称される。後に、検出可能な部分又は検出可能な標識を含む核酸ヘアピン分子のハイブリダイゼーション連鎖反応が、複数の検出可能な部分又は検出可能な標識を前記プローブと、それによって前記標的分子に、会合させる。前記検出可能な部分又は検出可能な標識が、検出される。工程Ａのプログラマビリティは、前記標的分析物と前記第一プローブとの間の関連付けを逆進させるための方法及び材料によって可能となる。図４～５を参照されたい。

前記プローブは分析物検出の特異性に関与している。各プローブは、標的分析物と、親和性又は反応性による結合など、化学結合又は分子間相互作用（例えば疎水性、電荷等）を形成しなければならない。ある特定の条件下で、各プローブは、標的被験体に対してある特定の特異性を有し、これは変性できる。前記第一プローブは、前記実験条件下、且つ、前記試料との関連においての、プローブそれ自体の結合特性又は反応特性によって、検出及び伝達されている一次情報を特定する。例えば、特定のタンパク質種に結合している第一プローブは、前記タンパク質種の存在及び名前の情報を伝達又は検出するとみなされるので、そのタンパク質種の存在、名前、数、存在量、及び空間的又は経時的な分布を測定するのに使用することができる。第一プローブが修飾体又はある特定の方法で修飾された分子種に特異的に結合していることで、前記分子種の存在及び名称の両方並びに修飾状態についての情報が伝達され得る。第一プローブは、ある特定の高次構造で、又はある特定の状況（例えば局所環境、試料前処理）において、分子種に特異的に結合し得る。第一プローブは、一群又は一連の関連タンパク質又は関連核酸分子に結合することで、一連の可能な分子種のうちの１つの存在についての情報を伝達し得る。第一プローブが、ある特定の速度論的オンオフ速度で、原子、分子、又は分子複合体の１以上もしくは複数の空間的配置に結合し得るが、ここで、伝達される情報は確率的性質を有し、結合した分子種があらゆる特定の種であるという確率は、第一プローブの結合性及び結合速度特性、第一プローブによる結合への標的候補の濃度及び到達性、並びに他の実験条件、に関連しており、これらの全て又は一部は既知である、推定値であるか、又はデータ解析の過程で測定され得る。

第一プローブの例としては、標的核酸に相補的な核酸配列を含む、in situハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）用のＤＮＡオリゴヌクレオチド及び及びＲＮＡオリゴヌクレオチド；標的核酸に結合する、核酸類似体プローブ；タンパク質、修飾タンパク質、及び他の種類の生体分子を含む標的分析物に結合する、抗体、ナノボディ、単鎖可変領域フラグメント、ファージディスプレイ粒子等の、免疫タンパク質（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｔｅｉｎ）、免疫由来タンパク質（ｉｍｍｕｎｅ－ｄｅｒｉｖｅｄｐｒｏｔｅｉｎ）、又はペプチド断片；標的分析物に結合する、核酸ポリマーリガンド及び核酸類似体ポリマーリガンドを含むアプタマー；ある特定の炭水化物分析物と結合する、レクチンなどの、タンパク質；任意の条件下で他の分子に対して任意の非ランダム結合パターンを示す他の種類のリガンドが挙げられるが、これらに限定はされない。

図４は、第一プローブと標的分析物との間の相互作用のプログラミングを対象とする。図５Ａは、第一プローブとしてのアプタマーの例を対象とする。図５Ｂは、第一プローブとしての抗体の例を対象とする。図５Ｃは、オリゴヌクレオチドＩＳＨ用第一プローブの例を対象とする。

工程Ａの可逆性の方法は本来的に前記プローブの性質に関連している。工程Ａの可逆性は、標的分析物とプローブとの間の化学結合又は分子間相互作用を解除させるあらゆる手段によって達成され得る。例えば、核酸のアニーリングを途絶させ、結合したＩＳＨ用ＤＮＡプローブ又はＩＳＨ用ＲＮＡプローブを標的核酸分子から除去するために、温度、塩濃度、並びに／又は塩酸グアニジン、尿素、及びホルムアミドなどの変性剤を用いることができる。温度、塩、並びに／又は塩酸グアニジン、尿素、及びホルムアミドなどの変性剤は、抗体及びレクチンなどのペプチドリガンド間の相互作用を途絶させ、該リガンドの標的分析物への結合を解除させるのにも使用することができる。酵素的処理は、ＤＮＡプローブを消化するが標的分子は消化しない、ｍＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子を標的とするＩＳＨ用ＤＮＡプローブのデオキシリボヌクレアーゼ消化でのように、プローブを特異的に分解することにより、プローブ結合を解除させることができる。オリゴヌクレオチド又は核酸類似体プローブ、並びにペプチドプローブは、標的分子からの分解又は置換においてのように、プローブを不安定にする、光、化学物質、又は酵素処理に対して感受性の化学基を含有するように合成できる。例えば、抗体プローブは、該抗体の特異的な分解を引き起こす、アミノ酸重合体の骨格内に切断可能な基を有する非天然アミノ酸残基を含有していてもよい。核酸又は核酸類似体の第一プローブは、オリゴヌクレオチドの高次構造を変化させて核酸アニーリングを途絶させる、Ａｇイオンによって切断される、３’又は５’架橋性ホスホロチオエート結合、又は紫外光によって切断される、光切断可能な基、又は紫外光での処理により原子的高次構造を変化させる、光に対して不安定な基などの、修飾塩基又は修飾糖骨格を含有していてもよい。アゾベンゼン含有グアニジウム誘導体の導入（Ｂｅｒｇｅｎｅｔａｌ２０１６ＡＣＳＮａｎｏＬｅｔｔｅｒｓ．）は、標的核酸からプローブ結合を途絶させる、光可逆的核酸アニーリングのための、感光性介入物として機能し得る。

標的分析物とプローブとの間の化学結合又は分子間相互作用の解除の後、その場合該プローブは未結合であるか又は特異的に分解されているが、該プローブ又はプローブ断片は、洗浄などによって、前記試料から除去される。しかしながら、標的分析物の少なくとも一部はインタクトなままであり、循環的ＨＣＲの後のサイクルでプローブすることが可能なままである。

例えば、デオキシリボヌクレアーゼを用いたＩＳＨ用ＤＮＡプローブの特異的分解によって、標的ｍＲＮＡ分子はインタクトのままであり、同じ又は新たな第一プローブセットを用いて再プローブすることが可能なままである。別の例では、タンパク質標的が１サイクルのＨＣＲでプローブされ；後に、前記タンパク質標的プローブは尿素などの変性剤での処理により前記タンパク質から除去され、前記第一プローブは洗浄除去される。その後、前記標的タンパク質は、同じ又は新たな第一プローブセットを用いて再プローグ可能である。あるいは、循環的ＨＣＲの後のサイクルが核酸などの他の種類の分子を標的とする場合があり、これはプロービングやタンパク質プローブの除去（すなわち、工程Ａプログラマビリティの進行及び解除の機構）の影響を受けない。

ＨＣＲの各サイクルでの目的分析物の標識の解除若しくは取り消し、又は第一プローブの標的分子からの分離は、例えば、熱、又は変性剤（例えば尿素、又はホルムアミド）の使用、又は、デオキシリボヌクレアーゼ酵素によって消化されないＲＮＡ分子に結合したＤＮＡプローブのデオキシリボヌクレアーゼＩ消化でのような、ハイブリダイズした核酸プローブの酵素消化などによって、ハイブリダイズした核酸プローブを標的核酸から取り除くことによって、行われ得る。結合した抗体は熱又は化学的処理（例えばホルムアミド）によって除去され得る。しかしながら、標的分析物の標識化の解除は、前記ＨＣＲポリマー及び関連付けされた蛍光シグナルの除去を必ずしも必要とせず；すなわち、これらの方法は、工程Ｃ及び工程Ｄを解除するための方法と組み合わせることができる。例えば、１又は複数の光に対して不安定な基を含有する第一プローブの高次構造変化を引き起こすことによる、ＩＳＨ用核酸プローブと標的核酸との間のアニーリングの途絶は、光に対して不安定な基を含有しない場合があり、そのため、標的分子から分離されているが、重合されたままである、前記ＨＣＲポリマーそれ自体を必ずしも除去するものではない。従って、工程Ａのこの解除を、工程Ｂ、工程Ｃ、及び／又は工程Ｄの解除と組み合わせることで、ＨＣＲイニシエーター、ＨＣＲポリマー、又は前記ＨＣＲポリマーと関連付けされた蛍光シグナルの除去を促進して、前記試料を循環的ＨＣＲの後の回の検出に適した状態に戻すことができる。

工程Ａの直交性の循環システムをいくつか組み合わせて、プログラムによって第一プローブのサブセットを１サイクル内で結合又は未結合状態にしてもよい。例えば、第一プローブを除去するために他を化学的に不安定な基を用いて同時に又は連続して循環させながら、第一プローブのサブセットを光に対して不安定な基を用いて循環させることができる。

所望の複数の標的分子の全てが、同時に、正確に１回、第一プローブでプローブされ、工程Ｂ～工程Ｄのいずれかのプログラマビリティを用いる循環的ＨＣＲ反応が行われる場合のように、循環的ＨＣＲ反応は工程Ａプログラマビリティを利用しない場合がある。この場合、プローブは標的分子から決して除去されない。

工程Ｂ）ＨＣＲイニシエーターへの第一プローブのプログラム可能な機能的結合
所望の複数の標的分子の全て、又はいくつかの所望のその一部が、それに結合したプローブ又はプローブセットを有するように、プローブ又はプローブセットを複数の標的分子の各々に結合する工程を含み、各プローブは、循環的ＨＣＲ工程Ｂ～Ｄ、すなわち、ＨＣＲイニシエーターへの機能的連結、ＨＣＲ重合反応の惹起、及び前記ＨＣＲポリマーによる増幅された蛍光シグナルの生成、を介して情報を伝達可能である、本明細書に記載の方法において、試料中の複数の標的分子は検出される。第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の機能的結合は、第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の、化学結合及び分子間相互作用から構成される、物理的結合、並びに、ゲーティングされた、又はゲーティングされていない（例えば、適切な条件下、且つ、ヘアピンなどの相補的ＨＣＲモノマーの存在下で、ＨＣＲを惹起できる）のようなＨＣＲイニシエーターの状態、の両方を説明することが意図される。第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の機能的結合は、物理的結合が確立及び／若しくは特異的に解除され得るように、第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の物理的結合を調節することによって；又は、イニシエーターが、適切な条件下、且つ相補的ヘアピンの存在下でＨＣＲを特異的に惹起できるようになるように、及び／若しくは、適切な条件下、且つ相補的ヘアピンの存在下でＨＣＲを特異的に惹起できなくなるように、ＨＣＲイニシエーターをゲーティングすることによって；又はその両方によって、プログラムできる。

第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間のプログラム可能な機能的連結は、「工程Ｂプローブ」と称される、ＨＣＲイニシエーターを第一プローブに物理的に結合するための第二プローブの使用によって、可能となる。工程Ａプローブの結合部分（核酸配列の場合）又は結合部分の結合対に相補的な核酸配列に結合したイニシエーター分子を含む工程Ｂプローブが、試料に添加され、工程Ｂプローブは標的分子に結合した工程Ａプローブに結合する。次に、対応するヘアピン分子が添加され、本明細書に記載のようにハイブリダイゼーション連鎖反応が実行される。このようにして、前記試料中の各標的分子は、工程Ｂプローブに対する第二の結合部位を有する第一工程Ａプローブに結合する。同じイニシエーター配列又は共通の一連のイニシエーター配列のうちの１つを、循環的ＨＣＲ実験を通じて、標的分子のそれぞれに結合する又は関連付けするために、ＨＣＲイニシエーターモチーフを含有する工程Ｂプローブが使用される。このようにして、同一又は共通のイニシエーター配列及びヘアピン配列を、各検出工程時に、又は、複数個の標的分子中の各標的分子の検出のために、使用できる。前記検出可能な部分又は検出可能な標識が、検出される。工程Ａプローブがそれ以上ＨＣＲイニシエーターに物理的に結合せず、それ故に「解除した」又は「リセットされた」又はＨＣＲ重合反応を惹起不可と見なされるように、ＨＣＲイニシエーターモチーフを含有する工程Ｂプローブは、後に第一工程Ａプローブから、剥奪、除去、又は分離され得る。このようにして、標的分子を検出する前記システムの機能が解除、すなわちより初期の状態へと戻され、第二の分析物又は標的分析物のサブセットが検出可能になる。その後、前記プロセスは、次の標的分子又は標的分子セットの工程Ａプローブの結合部分に特異的な１又は複数の工程Ｂプローブを用いて、第二及びその後の標的分子又は標的分子のサブセットに対して繰り返され、ここで、前記工程Ｂプローブは同じＨＣＲイニシエーター配列、及び第一の標的分子又は標的分子セットと共に使用された同じ検出可能な部分又は検出可能な標識を有する。このようにして、各標的分子に、前記イニシエーター及びヘアピン分子を使用、すなわち「再利用」できる。

ある態様において、第一工程Ａプローブ（すなわち、標的分析物との結合に関与するが、ＨＣＲイニシエーター配列を含有する工程Ｂプローブへの結合のための第二の結合部位も有する、第一プローブ）と、ＨＣＲイニシエーターを有する工程Ｂプローブとの間に化学結合（イオン結合、共有結合、又は水素結合）を形成するための、方法及び材料が提供される。これらの方法としては、以下が挙げられる：例えば、図７Ｂのように、核酸工程Ｂプローブを第一工程Ａプローブ上の相補的配列にアニールすることによる、ハイブリダイゼーションによる配列決定；工程Ｂプローブ内のＨＣＲイニシエーター配列を工程Ａプローブに連結している、安定な二本鎖の核酸又は核酸類似体を形成するための、図７Ｃのような、ライゲーションによる配列決定；又は、工程Ａプローブ上に存在するエピトープと特異的に結合する、抗体、アプタマー、若しくはタンパク質リガンドでのように、工程ＢプローブとしてＨＣＲイニシエーター配列に結合したリガンドの使用（例えば、ビオチン化第一プローブに結合するストレプトアビジン修飾ＨＣＲイニシエーター配列）。

第一工程Ａプローブと工程Ｂプローブとの間の化学結合（イオン結合、共有結合、又は水素結合）を途絶するための、又は、第一プローブとＨＣＲイニシエーター配列との間の物理的な結合若しくは関連付けを何らかの方法で切断するための、さらなる方法及び材料が提供される。これらの方法としては、以下が挙げられる：温度、塩濃度、変性剤（尿素、ホルムアミド、塩酸グアニジン）によってアニールされた核酸間若しくは核酸類似体間の結合を途絶するための方法；又は、光処理若しくは化学剤若しくは酵素剤の導入でのような、前記結合が誘導時に途絶されるようにするための、工程Ａプローブと結合する工程Ｂプローブの部分のどこかに光に対して不安定な基、化学的に不安定な基、若しくは酵素に対して不安定な基を導入するための、工程Ｂプローブ材料及び方法（例えば、紫外光で処理すると高次構造を変化させる光に対して不安定な基は、オリゴヌクレオチドの高次構造を変化させて、工程Ａプローブと工程Ｂプローブとの間の核酸アニーリングを途絶させる）；光処理若しくは化学剤若しくは酵素剤の導入でのような、前記結合が誘導時に途絶されるようにするための、工程Ｂプローブと結合する工程Ａプローブの部分のどこかに光に対して不安定な基、化学的に不安定な基、若しくは酵素に対して不安定な基を導入するための、工程Ａプローブ材料及び方法（例えば、紫外光で処理すると高次構造を変化させる光に対して不安定な基は、オリゴヌクレオチドの高次構造を変化させて、工程Ａプローブと工程Ｂプローブとの間の核酸アニーリングを途絶させる）；物理的結合が破壊され、ＨＣＲイニシエーター配列が洗い流し又は除去可能であるように、光に対して不安定な基、化学的に不安定な基、若しくは酵素に対して不安定な基を、工程Ａプローブと結合する工程Ｂプローブの部分とＨＣＲイニシエーターとの間のどこかに導入するための工程Ｂプローブ材料及び方法（例えば、工程Ａプローブに相補的な領域とＨＣＲイニシエーター配列との間のＤＮＡオリゴヌクレオチドの骨格内の３’若しくは５’架橋性ホスホロチオエート結合の導入）；物理的結合が破壊され、ＨＣＲイニシエーター配列が洗い流し又は除去可能であるように、光に対して不安定な基、化学的に不安定な基、若しくは酵素に対して不安定な基を、標的分析物と結合する工程Ａプローブの部分と工程Ｂプローブと結合する部分との間のどこかに導入するための工程Ａプローブ材料及び方法（例えば、工程Ｂプローブに相補的な領域と標的分析物と接触する工程Ａ第一プローブの領域との間のＤＮＡオリゴヌクレオチドの骨格内の３’若しくは５’架橋性ホスホロチオエート結合の導入）；工程Ｂプローブ、若しくはＨＣＲイニシエーターを含有する若しくは工程Ａプローブへの結合に関与するその一部を特異的に分解するための工程Ｂプローブ材料及び方法（例えば、工程Ｂプローブが特異的に分解されるように、工程Ａプローブが修飾塩基によってデオキシリボヌクレアーゼ活性から保護される、ＤＮＡ工程Ｂプローブのデオキシリボヌクレアーゼ消化）；工程Ｂプローブへの結合に関与する結合部分を含有する工程Ａプローブの少なくとも一部を特異的に分解するための材料及び方法（例えば、ペプチド工程Ａプローブに結合したＤＮＡのデオキシリボヌクレアーゼ消化）。

一態様によれば、方法は、各分析物が１又は複数の第一プローブと関連付けられるが、第一プローブのいずれも本質的にＨＣＲイニシエーターでないように、いくつかの標的分析物を同時に標識することによって工程Ｂを循環させること、を含む。体系的に、第一プローブのサブセットは、ハイブリダイゼーションによる配列決定又はライゲーションによる配列決定でのように、ＨＣＲイニシエーターと関連付けられる。前者の場合では、第一工程Ａプローブに含まれる配列に相補的な、且つＨＣＲイニシエーター配列を有する核酸プローブが、試料にハイブリダイズされる。後者の場合では、ＤＮＡリガーゼを用いて、第一プローブ配列に部分的に相補的であるが、ＨＣＲイニシエーター配列を有する、ＤＮＡの第二鎖が共有結合的に伸長される。

第一プローブのＨＣＲイニシエーターとの関連付けは解除される場合があり、すなわち、例えば、工程Ｂプローブと称される、イニシエーター配列を有するハイブリダイズされた核酸プローブを、工程Ａプローブから取り除くことによって、工程Ａプローブ及びＨＣＲイニシエーターが分離される場合がある。ＨＣＲポリマーは置換される場合があり、ＨＣＲイニシエータードメインを有する核酸は、トーホールド鎖置換などによって、キャッピングされる場合がある。参照によって本明細書に援用される、ＮａｔｕｒｅＣｈｅｍｉｓｔｒｙ３：１０３－１１３（２０１１）を参照されたい。ＨＣＲイニシエータードメインを有する核酸は、結合しているプローブとＨＣＲイニシエーター配列との間の化学結合間に位置する架橋性硫黄ホスホロチオエート結合との硝酸銀反応などによって、化学的に切断される場合がある。ＨＣＲイニシエータードメインを有するＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ鎖を有する５’－ホスフェートのλエキソヌクレアーゼ消化（二本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼ）でのように、又は、それぞれｄＵ核酸塩基及びｄＩ核酸塩基を含むＤＮＡのＵＳＥＲシステム（ＵＤＧ／ＥｎｄｏＶＩＩＩ）若しくはＥｎｄｏＶ消化でのように、酵素的に又は化学的に消化される場合がある。あるいは、エンドヌクレアーゼが、イニシエーター配列を切断する場合がある。ＨＣＲイニシエーターと標的との間の関連付けの解除は、必ずしも前記ＨＣＲポリマー及び関連付けされた蛍光シグナルの除去を除去しなくてもよく、すなわち、これらの方法は、工程Ｃ及び工程Ｄを解除するための方法と組み合わせることができる。

さらに、第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間のプログラム可能な機能的連結は、第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の結合を特異的に解除するための、又は、第一プローブとＨＣＲイニシエーター配列との間の物理的結合若しくは関連付けを何らかの方法で切断するための、方法及び材料のみによって、可能となる。ある実施態様では、第一プローブが機能的に活性なＨＣＲイニシエーターを含む。次に、対応するヘアピン分子が添加され、本明細書に記載のようにハイブリダイゼーション連鎖反応が実行される。その後、第一プローブ上のＨＣＲイニシエーターは、第一プローブから物理的に分離されるか、又は分解される。図７Ｂの工程２は、図７Ｂ工程１の使用とは無関係の、第一プローブからの機能的なイニシエーターの除去を対象とする。新たな第一プローブが試料に添加され、同じＨＣＲイニシエーター配列が導入されてもよい。このようにして、各標的分子は、循環的ＨＣＲ実験を通じて、同じイニシエーター配列又は共通の一連のイニシエーター配列の１つと関連付けされ得る。このようにして、同一又は共通のイニシエーター配列及びヘアピン配列を、各検出工程時に、又は、複数個の標的分子中の各標的分子の検出のために、使用できる。前記検出可能な部分又は検出可能な標識が、検出される。第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の結合を特異的に解消するための方法及び材料は、上記のもの全てを含む。第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の結合が工程Ａに記載の結合方法のいずれかを含む場合、以下も工程Ｂに含まれると理解される：例えば、工程Ｂプローブを工程Ａプローブに結合するためのあらゆるリガンドの使用、及び、その結合を解消するあらゆる方法。

さらに、第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間のプログラム可能な機能的連結は、第一プローブに物理的に結合されたＨＣＲイニシエーターをゲーティングするための方法及び材料によって可能となる。工程Ｂは、第一プローブのＨＣＲを開始させる能力がいくつかの外部入力によって調節されるように、ＨＣＲイニシエーターをゲーティングすることによって、プログラムされ得る。工程Ｂは、ＨＣＲを開始させるために、あらゆる種類の物理的シグナル若しくは電磁シグナル若しくは原子的若しくは分子的な活性化剤の使用などの、別の入力にＨＣＲイニシエーターが依存するように、ＨＣＲイニシエーターをゲーティングする材料及び方法によって；又は、ＨＣＲイニシエーターがそれ以上ＨＣＲ重合反応を惹起できないように、あらゆる種類の物理的シグナル若しくは電磁シグナル若しくは原子的若しくは分子的な活性化剤の使用などの入力が、ＨＣＲイニシエーターを不活性化するように、ＨＣＲイニシエーターをゲーティングする方法及び材料によって；又はそれら両方によって、プログラムされ得る。ゲーティングされたＨＣＲイニシエーター分子を含む第一プローブが試料に添加され、標的分子に結合する。その後、ＨＣＲイニシエーターが活性化され得るが、ヘアピンなどのＨＣＲモノマーが試料に添加され、活性なイニシエーターと接触し、ＨＣＲポリマーを生成し、蛍光性部分などの、検出可能な部分が検出される。その後、ヘアピンが試料に添加されても、イニシエーターと接触できないように、又は、不活性なイニシエーターと接触するも重合反応を引き起こすことができないように、ＨＣＲイニシエーターが不活性化され得る。

ある実施態様では、第一プローブが機能的に活性なＨＣＲイニシエーターを含む。次に、対応するヘアピン分子が添加され、本明細書に記載のようにハイブリダイゼーション連鎖反応が実行される。その後、第一プローブ上のＨＣＲイニシエーターがゲーティングされるか、又はＨＣＲ重合反応を惹起できないようにされる。新たな第一プローブが試料に添加され、同じＨＣＲイニシエーター配列が導入され得る、又は、試料中に既に存在するが、そのＨＣＲイニシエーター配列はゲーティングされＨＣＲを惹起できない、既存の第一プローブが後に、ゲーティング解除され、ＨＣＲ重合反応を惹起できるようにされ得る。このようにして、各標的分子は、循環的ＨＣＲ実験を通じて、同じイニシエーター配列又は共通の一連のイニシエーター配列の１つと関連付けされ得る。このようにして、同一又は共通のイニシエーター配列及びヘアピン配列を、各検出工程時に、又は、複数個の標的分子中の各標的分子の検出のために、使用できる。前記検出可能な部分又は検出可能な標識が、検出される。

別の実施態様では、第一プローブが、ＨＣＲ重合反応を惹起できない、不活性な又はゲーティングされたＨＣＲイニシエーター配列を含む。第一プローブ上のＨＣＲイニシエーター配列のサブセットの全て又はいくつかがゲーティング解除され、対応するヘアピン分子が次に添加され、ハイブリダイゼーション連鎖反応が本明細書に記載の通りに実行される。一態様において、ＨＣＲの後のサイクル、ＨＣＲイニシエーター配列の他のサブセットがゲーティング解除され、各サイクルで追加のＨＣＲシグナルが生成される。別の態様では、第一プローブ上のＨＣＲイニシエーターが、後のＨＣＲサイクルが以前のシグナルが無い場合に新たなシグナルを生成するように、第一プローブから物理的に分離されるか、又は、分解、若しくはゲーティング、若しくはＨＣＲ重合反応を惹起できなくされる。このようにして、新たな第一プローブが試料に添加され、同じＨＣＲイニシエーター配列が導入され得る、又は、試料中に既に存在するが、そのＨＣＲイニシエーター配列はゲーティングされＨＣＲを惹起できない、既存の第一プローブが後に、ゲーティング解除され、ＨＣＲ重合反応を惹起できるようにされ得る。このようにして、各標的分子は、循環的ＨＣＲ実験を通じて、同じイニシエーター配列又は共通の一連のイニシエーター配列の１つと関連付けされ得る。このようにして、各標的分子は、循環的ＨＣＲ実験を通じて、同じイニシエーター配列又は共通の一連のイニシエーター配列の１つと関連付けされ得る。前記検出可能な部分又は検出可能な標識が、検出される。

ＨＣＲイニシエーターをゲーティングする方法としては、以下が挙げられる：ＨＣＲ重合反応を惹起できないように、ＨＣＲイニシエーター上に保護部分を導入する方法；図７Ａのように、ＨＣＲ重合反応を開始させるために利用できないように、ＨＣＲイニシエーターを相補鎖で保護する方法；保護鎖が付加配列を含む場合は、ＨＣＲイニシエーター配列を、一本鎖にし、且つ／又は、ＨＣＲ重合反応を開始させるために利用できるようにする、トーホールド鎖置換が生じるように、相補鎖を導入できるように（第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の機能的連結のプログラムに関与しているため、工程Ｂプローブとも称される）；ＨＣＲ重合反応を惹起できないように、光に対して不安定性の、化学的に不安定性の、又は酵素に対して不安定性の保護部分をＨＣＲイニシエーター上に導入及び／又は除去するための方法及び材料；一本鎖ＤＮＡイニシエーター配列がＨＣＲヘアピンと接触するのを阻止する、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質などの、結合部分の付加又は除去などによって、ＨＣＲイニシエーターを特異的に活性化するための、又は、ＨＣＲイニシエーターを特異的に不活性化するための、方法；ＨＣＲイニシエーターが、ＨＣＲヘアピンと接触可能にされる、又は、ＨＣＲヘアピンとの接触を妨げられるように、ＨＣＲイニシエーターの原子的構成を調節できるように、化学的に不安定性の、光に対して不安定性の、又は酵素に対して不安定性のＨＣＲイニシエーター配列及びその使用のための、方法及び材料；イニシエーター配列の相補的な保護鎖との二本鎖化でのように、イニシエーター配列を保護及び／又は脱保護することによって、工程Ｂを循環する方法。相補的な保護鎖はＤＮＡトーホールド鎖置換でのように置換され得る。保護鎖は、保護鎖の骨格内の架橋性硫黄ホスホロチオエート結合との硝酸銀反応などによって、化学的に切断され得る。保護鎖は、ＤＮＡ鎖を有する５’－ホスフェートのλエキソヌクレアーゼ消化（二本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼ）でのように、又は、それぞれｄＵ核酸塩基及びｄＩ核酸塩基を含むＤＮＡのＵＳＥＲシステム（ＵＤＧ／ＥｎｄｏＶＩＩＩ）若しくはＥｎｄｏＶ消化でのように、酵素的に又は化学的に消化され得る。保護鎖は、様々な波長の光への暴露後に原子的構成を変化させる光に対して不安定性の塩基を導入することによって、ハイブリダイズ解除を強制され得る。

大まかに、第一プローブ、又は標的分析物との接触及び結合に関与するその領域と、ＨＣＲイニシエーター配列との間の機能的連結は、「前記リンカー」、「リンカー」、「機能的リンカー」、「工程Ｂリンカー」、又は「プログラム可能なリンカー」と記載される。工程Ｂプログラマビリティを用いる循環的ＨＣＲの場合では、前記方法及び材料のいずれも、リンカー、例えば、第一プローブと、ＨＣＲイニシエーター又はゲーティングされた若しくはゲーティング可能なＨＣＲイニシエーターを含む工程Ａプローブとの間の物理的結合を確立する工程Ａプローブ及び工程Ｂプローブの組み合わされた結合部分、を構成する。

全ての第一プローブが、ゲーティングされていないＨＣＲイニシエーター、例えば、相補的なヘアピンの存在下、且つ、好適な環境下（例えば、水性緩衝液、温度等）で、ＨＣＲ重合反応を開始させるＨＣＲイニシエーター、と直接的に対応する場合においてのように、循環的ＨＣＲ反応は工程Ｂプログラマビリティを利用しない場合がある。この場合、第一プローブのＨＣＲイニシエーターへの機能的連結は、直接的な化学結合（例えば、抗体第一プローブ（例えばＳｏｌｕｌｉｎｋ）に直接結合したＤＮＡＨＣＲイニシエーター）によるもの；又は、標的核酸分子に相補的な核酸若しくは核酸類似体第一プローブの領域とＨＣＲイニシエーターモチーフを含有する領域との間の核酸の骨格内のホスホジエステル結合でのようなもの；又は、標的核酸分子に相補的な核酸若しくは核酸類似体第一プローブの領域と、ＨＣＲイニシエーターモチーフを含有する領域との間の非反応性スペーサー配列（例えば、ポリＴ、ポリＡ、若しくはポリ［ＴＡ］リピート）でのようなものであり得る。これらの例では、プローブとゲーティングされていないＨＣＲイニシエーターとの間の物理的結合は直接的なものであり、物理的結合、及びゲーティングされた又はされていないというようなＨＣＲイニシエーターの状態の両方を指す、機能的連結も、直接的なものであり、かつ、どのよう方法でも物理的に分離可能又はゲーティング可能であるようには設計されておらず；従って、工程Ｂはプログラム可能ではない。これらは「リンカー」とも称される。循環的ＨＣＲ反応は工程Ａ、工程Ｃ、及び工程Ｄのいずれかのプログラマビリティを利用し得る。

直交性の工程Ｂ戦略をいくつか組み合わせて、プログラムによってイニシエータードメインのサブセットを１サイクル内でアクセス可能且つ機能的なものにしてもよい。例えば、第一プローブのあるサブセットは、保護鎖によってゲーティングされたＨＣＲイニシエーターと一緒にサイクル内に存在し得るが、一方で、第一プローブの別のサブセットは、ＨＣＲイニシエーターを含まず、ＨＣＲイニシエーターを含む工程Ｂプローブに相補的な配列を含む。

図６は、２サイクルのＨＣＲを用いる２つの標的分析物の検出のための、工程Ｂの両方の方法、すなわち、工程ＢプローブによるＨＣＲイニシエーターの第一プローブへの物理的な関連付けをプログラムする方法、及び、ゲーティングされたＨＣＲイニシエーターの状態をプログラムする方法、の使用を対象とする。図７は、第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の機能的連結をプログラムする機構を対象とし、図７ＡはゲーティングされたＨＣＲイニシエーターの使用の例示であり、図７Ｂ及び図７Ｃは、ハイブリダイゼーションによる配列決定反応（７Ｂ）及びライゲーションによる配列決定反応（７Ｃ）を用いた、第一プローブとＨＣＲイニシエーターとの間の物理的結合のプログラミングの例示である。

工程Ｃ）循環的ＨＣＲ重合
本明細書に記載の方法では、試料中の複数の標的分子が検出され、循環的ＨＣＲ法におけるいくつかの所定の時点で、所望の複数個の標的分子のそれぞれがそれに結合した第一プローブ又は第一プローブセットを有するように、１以上もしくは複数の第一プローブを、複数の標的分子のそれぞれに結合させる工程を含み、それぞれの第一プローブはいくつかの所定の時点でＨＣＲイニシエーターに機能的に結合している。イニシエーターに対応して結合する、且つ、イニシエーターに対して固有であり得る、ヘアピン分子などの、準安定性ＨＣＲモノマーが添加され、ハイブリダイゼーション連鎖反応が本明細書に記載のように実行され、イニシエーターの部位で繋留されたＨＣＲポリマーが生成される。最初のＨＣＲモノマーがイニシエーターにハイブリダイズ又は結合しており、残りのＨＮＲモノマーが連続的に伸長されて前記ＨＣＲポリマーをなしている限りにおいて、ＨＣＲポリマーは「繋留」されている。いくつかの所定の時点で、繋留されたＨＣＲポリマーは、１以上もしくは複数の蛍光性又は検出可能な部分によって標識される。このように、前記試料中の各標的分子はＨＣＲイニシエーターを有するプローブに結合しており、標的分子を検出するためにヘアピン分子などのＨＣＲモノマーが添加される。この工程は、経時的に、試料中の各標的分子に対して連続的又は同時に実行され得る。各標的分子はＨＣＲイニシエーターを有するプローブに結合していてもよく、後に、ヘアピン分子などのＨＣＲモノマーが循環的ＨＣＲ法の間に１回又は複数回、標的分子の検出のために添加される。循環的ＨＣＲ法の全体を通じて、各分析物、又は、調査中の一次情報のそれぞれ固有の態様（分子種、分子的性質、若しくは分子構成など）は、循環的ＨＣＲを介して、固有の型の定序性の増幅された蛍光シグナルを生成する。循環的ＨＣＲでは、ＨＣＲヘアピン分子及び関連付けられた又は対応するイニシエーター配列は、各標的分子に対する縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）であり得る。定序性の一連のＨＣＲ重合反応の中で、重合の解除又はＨＣＲポリマーの分解若しくは分離でのように、ＨＣＲポリマーがＨＣＲ重合反応間で機能的に解除されて、同じ又は共通の一連のＨＣＲポリマーが繰り返し使用されてもよい。このように、試料中の複数個の標的分子の全てを検出するために、単一のＨＣＲシステム、又は一連の直交性ＨＣＲシステムを用いることができる。ＨＣＲポリマーを形成し、分解又は分離する能力は、各ＨＣＲ重合反応間で試料を機能的にリセットし、ＨＣＲシステムを循環的ＨＣＲのサイクル間で再利用可能にする、本明細書に記載の材料及び方法によって可能となる。

図９は、２つの直交性ＨＣＲシステムを用いるが、スペクトル的に分解可能な蛍光シグナルは１つのみを用いる、２つの標的分析物の検出のためのＨＣＲの２つのサイクルを対象としている。標的１が、イニシエーター配列「ｉ１」を含む、第一プローブ「α」に結合され、標的２が、イニシエーター配列「ｉ２」を含む、第一プローブ「β」に結合される。時点１において、イニシエーター「ｉ１」に対応するＨＣＲヘアピンが試料に添加され、「ｉ１」に前記対応するＨＣＲヘアピンが接触し、赤色蛍光シグナルを示す赤色の星で表されるＨＣＲポリマーが形成され、これが検出される。前記ＨＣＲポリマーが後に時点２で分解又は解体又は分離されることで、前記試料がＨＣＲポリマーを含まない以前の状態に戻される。時点３において、イニシエーター「ｉ２」に対応するＨＣＲヘアピンが試料に添加され、「ｉ２」に前記対応するＨＣＲヘアピンが接触し、同じ赤色蛍光シグナルを示す赤色の星で表されるＨＣＲポリマーが形成され、これが検出される。前記ＨＣＲポリマーが後に時点4で分解又は解体又は分離されることで、前記試料がＨＣＲポリマーを含まない以前の状態に戻される。

ある態様において、対応するＨＣＲヘアピンが存在するイニシエーター配列においてのみ生じるＨＣＲ重合反応のための方法が提供される。図９は、各時点で「ｉ１」又は「ｉ２」に対応するＨＣＲヘアピンが１セットのみ添加されるため、時点１及び時点３におけるＨＣＲ重合はそれぞれ、２つのイニシエーター配列、「ｉ１」及び「ｉ２」、のうちの一方においてのみ生じるため、これを対象としている。ある態様において、ＨＣＲ重合反応はイニシエーター配列の存在下で進行するが、該イニシエーター配列は、工程Ｂでのように、利用可能にされる又は活性化されることを必要とする場合がある。ある態様では、検出可能な部分が、工程Ｄにおいてのように、本明細書に記載のように、付加、活性化、除去又は「解除」され得る。ある態様では、前記ＨＣＲポリマーそれ自体が、工程Ｃのプログラマビリティを構成する、標的化された分解又は解体又は分離を受ける。

工程ＣはＨＣＲポリマーの標的化された分解又は解体又は分離によって解除される場合があり、すなわち、ＨＣＲポリマーが分解又は解体又は分離される場合がある。図１０Ｂに示されるように、１又は複数のＨＣＲポリマー鎖は、ＤＮＡトーホールド鎖置換でのように、置換され得る。１又は複数のＨＣＲポリマー鎖は、図１０Ａに示されるように、ＤＮＡ骨格内の架橋性硫黄ホスホロチオエート結合との硝酸銀反応などによって、化学的に切断され得る。１又は複数のＨＣＲポリマー鎖は、図１０Ｃに示されるように、ＤＮＡ鎖を有する５’－ホスフェートのλエキソヌクレアーゼ消化（二本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼ）でのように、又は、それぞれｄＵ核酸塩基及びｄＩ核酸塩基を含むＤＮＡのＵＳＥＲシステム（ＵＤＧ／ＥｎｄｏＶＩＩＩ）若しくはＥｎｄｏＶ消化でのように、酵素的に又は化学的に消化され得る。他の酵素としては、ｃａｓ９、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、並びに他の標的化されたエンドヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼが挙げられる。ＨＣＲ鎖は、ある特定の波長の光への暴露後に原子的構成を変化させる光に対して不安定性の塩基を導入することによって、ハイブリダイズ解除を強制され得る。これらの例示的な方法は、イニシエーターそれ自体を除去するものであっても、除去しないものであってもよい。数回の循環的ＨＣＲに亘る付加的なシグナルを防ぐために、工程Ａ及び工程Ｂを解除させるための上記方法が使用され得る。

直交性の工程Ｃ戦略をいくつか組み合わせて、プログラムによってＨＣＲポリマーのサブセットを１サイクル内で重合されるものとしてもよい。例えば、いくつかのポリマーは化学的手法を用いて分解され得るが、一方で、他のポリマーはトーホールド鎖置換を用いて同時に又は連続的に解体される。

ＨＣＲ重合反応を通じて形成された後にＨＣＲポリマーが試料中でインタクトなままである、すなわち、ＨＣＲポリマーが除去可能ではない場合においてのように、循環的ＨＣＲ反応は工程Ｃプログラマビリティを利用しない場合がある。それでも、循環的ＨＣＲ反応は工程Ａ、工程Ｂ、及び工程Ｄのいずれかのプログラマビリティを利用し得る。例えば、ＨＣＲポリマーは経時的に付加的に形成され得るが、工程Ｄプログラマビリティの使用によって、いずれかの１時点で１つのみのサブセットが蛍光性となる。あるいは、ＨＣＲポリマーは正確に１回形成され得るが、工程Ｄプログラマビリティの使用によって、いずれかの１時点で１つのみのサブセットが蛍光性となる。

工程Ｄ）ＨＣＲポリマーのプログラム可能な蛍光標識
本明細書に記載の方法では、試料中の複数の標的分子が検出され、循環的ＨＣＲ法におけるいくつかの所定の時点で、所望の複数個の標的分子のそれぞれがそれに結合した第一プローブ又は第一プローブセットを有するように、第一プローブ又は第一プローブセットを、複数の標的分子のそれぞれに結合させる工程を含み、それぞれの第一プローブはいくつかの所定の時点でＨＣＲイニシエーターに機能的に結合している。イニシエーターと関連付けられた又はイニシエーターに対して固有の、ヘアピン分子などの、ＨＣＲモノマーが添加され、ハイブリダイゼーション連鎖反応が本明細書に記載のように実行され、イニシエーターの部位で繋留されたＨＣＲポリマーが生成される。いくつかの所定の時点で、繋留ＨＣＲポリマーは、１以上もしくは複数の蛍光性又は検出可能な部分によって標識される。このように、試料中の各標的分子はＨＣＲイニシエーターを有するプローブに結合しており、標的分子を検出するためにヘアピン分子などのＨＣＲモノマーが添加される。この工程は、経時的に、試料中の各標的分子に対して連続的又は同時に実行され得る。各標的分子はＨＣＲイニシエーターを有するプローブに結合していてもよく、後に、ヘアピン分子などのＨＣＲモノマーが循環的ＨＣＲ法の間に１回又は複数回、標的分子の検出のために添加される。循環的ＨＣＲ法の全体を通じて、各分析物、又は、調査中の一次情報のそれぞれ固有の態様（分子種、分子的性質、若しくは分子構成など）は、循環的ＨＣＲを介して、固有の型の定序性の増幅された蛍光シグナルを生成する。循環的ＨＣＲでは、蛍光シグナルは、ＨＣＲのいずれかのサイクル中に、各標的分子に対する縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）となり得る。工程Ｄのプログラマビリティは、蛍光性部分を、ＨＣＲポリマーに特異的に結合できるように、且つ／又は、ＨＣＲポリマーから特異的に除去できるように、ＨＣＲポリマーを蛍光シグナルによりプログラムする方法によって可能となる。このように、定序性の一連のＨＣＲ重合反応の中で、同じ又は共通の一連の検出可能な部分が繰り返し使用され得る。

循環的ＨＣＲの工程Ｄのプログラマビリティは、ＨＣＲポリマーを蛍光部分などの検出可能な部分と特異的に関連付けするための材料及び方法；ＨＣＲポリマーから蛍光部分などの検出可能な部分を特的に除去する材料及び方法；又はそれら両方によって、可能となる。

蛍光性部分などの検出可能な部分を有する、工程Ｄプローブと称される、第二プローブの使用は、検出可能な部分の、前記ＨＣＲポリマーへの導入、及び／又は該ポリマーからの除去を可能にする。この工程は、検出可能な部分が標的分子に生成された全セットのＨＣＲポリマーの中及び間で同じであり得る、試料中の各標的分子に対して、連続的に又は同時に実行できる。このように、試料中の複数個の標的分子の全てを検出するために、単一の検出可能な部分を用いることができる。前記検出可能な部分又は検出可能な標識が、検出される。ある態様において、検出可能な部分又は検出可能な標識は検出後にＨＣＲポリマーから除去され、すなわち、検出可能な標識は除去可能である。このように、標的分子を検出するためのシステムの機能は解除される。ある態様において、ＨＣＲポリマーを形成するヘアピンなどの構成要素ＨＣＲモノマーはは、ＨＣＲポリマーが蛍光部分などの複数の検出可能な部分を含むように、蛍光部分などの検出可能な部分を含み；前記ＨＣＲポリマーはそれによって検出され；検出可能な部分又は検出可能な標識は検出後にＨＣＲポリマーから除去される。このように、標的分子を検出するためのシステムの機能は解除される。

図１２は、循環的ＨＣＲ工程Ｄプログラマビリティを用いた、ＨＣＲの２つのサイクルを対象としている。２つの標的分析物が、リンカーを介して、イニシエーター配列「ｉ１」及び「ｉ２」にそれぞれ機能的に連結している、第一工程Ａプローブ「α」及び「β」にそれぞれ結合しており、該リンカーは、「Ｌ」と表されているが、循環的ＨＣＲの工程Ｂに記載されたあらゆる種類のプログラム可能な又はプログラム不可なリンカーであると理解される。イニシエーター「ｉ１」及び「ｉ２」によって惹起される直交性ＨＣＲシステムに対応するＨＣＲヘアピンが、試料に添加され、第一プローブα及びβにそれぞれ連結している、イニシエーター配列「ｉ１」及び「ｉ２」と接触し、標的分析物にＨＣＲポリマーを形成している。連続して、イニシエーター「ｉ１」及び「ｉ２」と関連付けられた又はそれらに対応する各ＨＣＲポリマーが、青色の星で表される検出用蛍光部分に結合される。検出後、ＨＣＲポリマーはインタクトなままであるが、蛍光性部分はＨＣＲポリマーから除去され、それによって、試料はＨＣＲのサイクル間で検出可能な蛍光シグナルが無い状態に戻される。

ＨＣＲポリマーのプログラム可能な標識を可能にする方法及び材料は、検出可能な部分を含む、工程Ｄプローブと称される、プローブを結合するための核酸ハンドル部分を有するＨＣＲモノマー又はヘアピン分子を含む。１又は複数の検出可能な部分を含む１又は複数の相補的なオリゴヌクレオチド工程Ｄプローブが添加され、ＨＣＲポリマーのハンドルに結合する；１又は複数の検出可能な部分を含む、工程Ｄプローブと称されるリガンドに結合された、エピトープを有するＨＣＲモノマー又はヘアピン分子。１又は複数の検出可能な部分を含む１又は複数のリガンド工程Ｄプローブが添加され、ＨＣＲポリマーのエピトープに結合する。化学基又はハンドルを有するＨＣＲモノマー又はヘアピン分子、そのために、化学反応又は酵素反応は検出可能な部分を前記ＨＣＲポリマー上に特異的に結合できる；例えば、ターミナルトランスフェラーゼによる蛍光性ｄＮＴＰの付加のための利用可能な３’ＯＨ；又は、ＤＮＡリガーゼによる蛍光性オリゴの付加のための利用可能な５’リン酸；又は、ＮＨＳ－エステルに結合したフルオロフォアとの反応のための一級アミンを有する。

検出用部分のプログラム可能な除去、例えばＨＣＲポリマーの蛍光標識の解除、を可能にする方法及び材料としては、以下が挙げられる：蛍光性工程ＤプローブをＨＣＲポリマーから除去するために、温度、塩濃度、変性剤（尿素、ホルムアミド、塩酸グアニジン）によってアニールされた核酸間又は核酸類似体間の結合を途絶するための方法；光処理又は化学剤又は酵素剤の導入でのような、前記結合が誘導時に途絶されるようにするための、ＨＣＲポリマーと結合する工程Ｄプローブの部分のどこかに光に対して不安定な基、化学的に不安定な基、又は酵素に対して不安定な基を導入するための、工程Ｄプローブ材料及び方法（例えば、紫外光で処理すると高次構造を変化させる光に対して不安定な基は、オリゴヌクレオチドの高次構造を変化させて、工程ＤプローブとＨＣＲポリマーとの間の核酸アニーリングを途絶させる）；光処理又は化学剤又は酵素剤の導入でのような、前記結合が誘導時に途絶されるようにするための、工程Ｄプローブと結合するＨＣＲヘアピンの部分のどこかに光に対して不安定な基、化学的に不安定な基、又は酵素に対して不安定な基を導入するための、工程Ｄプローブ材料及び方法（例えば、紫外光で処理すると高次構造を変化させる光に対して不安定な基は、オリゴヌクレオチドの高次構造を変化させて、工程ＤプローブとＨＣＲポリマーとの間の核酸アニーリングを途絶させる）；物理的結合が破壊され、蛍光性又は検出用部分が洗い流し又は除去可能であるように、前記ＨＣＲポリマーと結合する工程Ｄプローブの部分と、蛍光又は検出用部分との間のどこかに光に対して不安定な基、化学的に不安定な基、又は酵素に対して不安定な基を導入するための、工程Ｄプローブ材料及び方法；（例えば、ＨＣＲポリマーに物理的に結合した工程Ｄプローブの領域と蛍光性又は検出用部分との間のＤＮＡオリゴヌクレオチドの骨格内の３’又は５’架橋性ホスホロチオエート結合の導入）；ポリマーと蛍光部分との間の物理的結合が破壊され、蛍光性又は検出用部分が洗い流し又は除去可能であるように、光に対して不安定な基、化学的に不安定な基、又は酵素に対して不安定な基を、ＨＣＲポリマーの形成に関与するＨＣＲヘアピンの部分と蛍光又は検出用部分を含む工程Ｄプローブの結合パートナーとの間のどこかに導入するためのＨＣＲモノマー又はヘアピン材料及び方法；（例えば、ＨＣＲポリマー内の別のＨＣＲヘアピンにアニールしたＨＣＲヘアピンの領域と、蛍光性又は検出用部分を含む工程Ｄプローブに対する結合パートナーを含む領域との間のＤＮＡオリゴヌクレオチドの骨格内の３’又は５’架橋性ホスホロチオエート結合の導入）；工程Ｄプローブ、又は前記蛍光性部分を含む、又は前記ＨＣＲポリマーへの結合に関与するその部分を特異的に分解するための工程Ｄプローブ材料及び方法；（例えば、工程Ｄプローブが特異的に分解されるように、ＨＣＲポリマーが修飾塩基によってデオキシリボヌクレアーゼ活性から保護される、ＤＮＡ工程Ｄプローブのデオキシリボヌクレアーゼ消化）；工程Ｄプローブの結合パートナーが前記ＨＣＲポリマーから除去され、それにより、拡散又は洗浄でのように、検出用又は蛍光部分を含む工程Ｄプローブの、ＨＣＲヘアピンからの除去を可能にするような、エピトープの酵素的又は化学的な消化、核酸ハンドルの切断又は断片化などの、工程Ｄプローブの結合パートナーを特異的に分解するためのＨＣＲモノマー又はヘアピン材料及び方法；検出用部分の蛍光励起／放出特性を永続的に除去するための蛍光性部分の光退色など、蛍光又は検出用部分をクエンチするための工程Ｄプローブ材料及び方法；又は、第一工程Ｄプローブの部分に結合し、クエンチ用の基を有する、第二工程Ｄプローブの導入など。

本開示により以下が提供される：ＨＣＲポリマーは、ハイブリダイゼーションによる蛍光配列決定、合成による配列決定、又はライゲーション反応による配列決定によって、蛍光シグナルを生成し得る。蛍光標識は、ＨＣＲポリマーからの蛍光性部分の酵素的若しくは化学的な切断によって、又はＤＮＡトーホールド鎖置換によって、分離又は「解除」され得る。図１３は、ＨＣＲポリマー上に存在する付加的ハンドル配列を介したＨＣＲポリマーへの循環的ＨＣＲ工程Ｄプローブのハイブリダイゼーション、及びその後の、蛍光シグナルの検出後のＨＣＲヘアピンからの蛍光性工程Ｄプローブの除去による、ＨＣＲポリマーへの蛍光のプログラミングを対象とする。図１４Ａは、循環的ＨＣＲ工程Ｄの付加的なプログラミングを対象とし、例えば、工程Ｄの各サイクルが追加の蛍光シグナルを試料に加えるように、蛍光のＨＣＲポリマーとの関連付けのみがプログラムされ、ＨＣＲポリマーからの蛍光の分離はプログラムされない。図１４Ｂは、ＨＣＲポリマーとの／からの蛍光シグナルの関連付け及び分離の両方のプログラマビリティを対象とする。

本開示は、工程Ｄプローブと称される、フルオロフォアを積んだオリゴがハイブリダイズされ得る、ＨＣＲポリマーを付加的な５’又は３’ハンドル配列で修飾することによる、ＨＣＲポリマーを蛍光標識するための方法を提供する。あるいは、ハンドルは、蛍光性部分をＨＣＲ単位複製配列のサブセットに組み込むためにＤＮＡポリメラーゼを用いる、ライゲーションによる配列決定又は合成による配列決定などの、酵素的配列決定反応のための、鋳型部位として機能し得る。例えば、第一のサイクルで、相補ＤＮＡ鎖工程Ｄプローブが、ＨＣＲプローブハンドル配列のサブセットにハイブリダイズされ、配列決定用プライマーとして働く。ポリメラーゼは、ＨＣＲポリマーのそのサブセット上に蛍光性塩基を組み込むために使用され得る。その後のサイクルで、ＨＣＲポリマースペースの他のサブセットを蛍光標識するために、直交性の配列決定用プライマーが使用される。別の例では、相補ＤＮＡ鎖工程Ｄプローブが、ＨＣＲプローブハンドル配列のサブセットにハイブリダイズされ、配列決定用プライマーとして働く。ポリメラーゼは、ＨＣＲポリマーのそのサブセット上に蛍光性塩基を組み込むために使用され得る。その後のサイクルで、ＤＮＡの４つの塩基のそれぞれが、ＨＣＲポリマースペースの他のサブセットを蛍光標識するために使用され、ここで、各塩基の鋳型組込みはＨＣＲポリマースペースのサブセットを対象とする。この例では、配列決定反応中に連続して組み込まれたそれぞれの蛍光標識されたヌクレオチドは、共通の蛍光色を使用し得る。

蛍光シグナルを分離又は「解除」させるため、フルオロフォア保持鎖工程ＤプローブはＤＮＡトーホールド鎖置換でのように置換され得る。蛍光性部分は、ＤＮＡ骨格内の架橋性硫黄ホスホロチオエート結合との硝酸銀反応などによって、化学的に切断され得る。蛍光性部分を有するＤＮＡは、ＤＮＡ鎖を有する５’－ホスフェートのλエキソヌクレアーゼ消化（二本鎖特異的デオキシリボヌクレアーゼ）でのように、又は、それぞれｄＵ核酸塩基及びｄＩ核酸塩基を含むＤＮＡのＵＳＥＲシステム（ＵＤＧ／ＥｎｄｏＶＩＩＩ）若しくはＥｎｄｏＶ消化でのように、酵素的に又は化学的に消化され、フルオロフォアを溶液中に放出し得る。あるいは、化学的に不安定性の、酵素に対して不安定性の、又は光に対して不安定な基が、ＨＣＲポリマー形成に関与する領域と、１又は複数の蛍光性部分を含む、工程Ｄプローブに対するハンドル又は結合部分との間に、ＨＣＲヘアピン内に、合成された場合のように、ＨＣＲポリマーそれ自体が工程Ｄの循環に関与する官能基を有しいてもよい。

直交性の独立したＨＣＲシステムの数Ｎがスペクトル的に別個の蛍光シグナルの数ｆよりも大きい場合では、スペクトル的に区別可能な蛍光シグナルを分離するために、ｋ回の連続的ＨＣＲサイクルに亘る時間的領域を使用することによって、別個のシグナルの数を実質的に増加させるために、循環的ＨＣＲ発明の工程Ｄを用いることができる。ｋ×ｆの組み合わせ空間は、Ｎによってのみ限定される。この実施態様では、Ｎ個の分析物が、Ｎ個のイニシエーター配列を有するＮ個のプローブで標識され、その後、Ｎ個のＨＣＲヘアピンが試料に添加され、蛍光性工程Ｄプローブのハイブリダイゼーションのためのハンドルとして働く固有の配列を各々有する、Ｎ種のＨＣＲポリマーの増幅がもたらされる。スペクトル的に別個のフルオロフォアを各々有する、ｆ個の工程Ｄプローブが、循環的ＨＣＲの各回で導入される。蛍光シグナルが検出され、所望により工程ＤプローブがＨＣＲポリマーから除去されるか、又は、本明細書に記載のように蛍光シグナルが解除せられる。工程Ｄの後のサイクルでは、Ｎ個のＨＣＲポリマーの別個のサブセットを標的とする、ｆ個の工程Ｄプローブが導入される。この方法は、時間的スペクトル的に別個の蛍光シグナルの数が、直交性の独立したＨＣＲシステムの数Ｎに常に等しくなることを確認するために、本明細書に記載される他の機構とは独立して、用いることができる。この方法は指数関数的バーコーディングに用いることができる。

直交性の工程Ｄ戦略をいくつか組み合わせて、プログラムによってＨＣＲポリマーのサブセットを１サイクル内で蛍光標識されるものとしてもよい。例えば、ＨＣＲポリマーのあるサブセットを、ＨＣＲポリマーのハンドル特徴上に蛍光性部分を含む相補的なオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることによって蛍光標識してよく、同時に、ＨＣＲポリマーの別のサブセットを、ＨＣＲポリマーに結合したビオチン基上へのストレプトアビジン部分に結合した蛍光性部分の結合によって蛍光標識してよい。

ＨＣＲモノマー又はヘアピンが、化学結合又はヘアピンに直接結合しているフルオロフォア、又は蛍光性核酸類似体を含むヘアピンなどによって、蛍光部分又は検出用部分を直接含み、除去可能でない場合でのように、循環的ＨＣＲ反応は工程Ｄプログラマビリティを利用しない場合がある。それでも、循環的ＨＣＲ反応は工程Ａ、工程Ｂ、及び工程Ｃのいずれかのプログラマビリティを利用し得る。例えば、ＨＣＲポリマーは直接的に蛍光性であってよいが、それでも、蛍光は、本明細書に記載の方法及び材料を用いる、ＨＣＲ重合の解除及び蛍光性ＨＣＲ断片の洗浄による除去によって、効率的に循環される。

循環的ＨＣＲ法の工程Ａ～Ｄ間の関連性
本明細書に記載の循環的ＨＣＲ法の工程Ａ～Ｄは、蛍光シグナルの検出及び解析までの第一プローブの結合によって捕捉された標的分析物の一次情報からの標識化及び検出カスケードを通じた情報の伝達に関連しているため、概念的にモジュール式である、すなわち、別々の工程として分離可能であるが、機能的には、モジュール式であるか、又は、特定の循環的ＨＣＲ法の実際の設計及び実行及び使用において協調され得る。いずれか１つの工程の実行又は解除は、循環的ＨＣＲ法の１又は複数の他の工程の実行及び／又は解除と協調され得る。

本発明のある態様では、循環的ＨＣＲのある工程の解除は、他の工程を効率的に解除させる。例えば、試料から洗い流される、ＨＣＲポリマーの断片への分解、すなわち工程Ｃの解除は、試料から関連付けられた蛍光を効率的に除去し、工程Ｄも効率的に解除させ得る。別の例として、ＲＮＡ標的を標的とするＩＳＨ用ＤＮＡプローブのデオキシリボヌクレアーゼ消化は、ＨＣＲイニシエーター及びＨＣＲポリマーの同時の消化により、工程Ａ及び工程Ｂ－Ｃを解除させ得る。

本発明のある態様では、複数の工程を循環することによって循環的ＨＣＲが行われる。図８は、工程Ａ及び工程Ｂを用いる循環的ＨＣＲの一例を対象とする。図８は、第一プローブからのＨＣＲイニシエーターのプログラム可能な不活性化又は物理的分離を用いる、２サイクルの工程Ｂと協調せられた、第一プローブのプログラム可能な添加を用いる、２サイクルの工程Ａを示している。図１９は、ＣＨＣＲの４つの工程Ａ～Ｄ全てのプログラマビリティを用いる、循環的ＨＣＲの一例を対象とする。

本開示を代表するものとして以下の実施例が挙げられる。これらの実施例及び他の等価な実施形態は本開示、図面及び添付の特許請求の範囲を考慮すれば明らかであるため、これらの実施例は本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

ＲＮＡの指数関数的な循環的ＨＣＲバーコーディングの例：２０個の直交性の独立したＨＣＲシステムが存在する。これらの２０個のＨＣＲシステムをペアに分け、１０個の順序付けられたビットをコードするシグナル０及びシグナル１として（例えば第一ペアは第一ビットをコードする）、各ペアが両方のフルオロフォアを有するように、２つのスペクトル的に別個の蛍光性着色剤のうちの１つで標識する。１０２４個の遺伝子の各々について、４０種のｓｍＲＮＡＦＩＳＨ用プローブセットを設計する（例えば、バイオサーチ・テクノロジーズ社（ＢｉｏｓｅａｒｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）製ＳｔｅｌｌａｒｉｓＲＮＡＦＩＳＨプローブデザイナーツールを使用）。各遺伝子に固有の１０ビット二進バーコード（例えば０１１１０１００１０）を割り当てる。各ｓｍＲＮＡＦＩＳＨ用プローブを、遺伝子バーコードを定める１０個のうちの３つのイニシエーター配列を有する、５’又は３’末端において、遺伝子バーコードに従って、標識する。遺伝子につき１２０部位（遺伝子につき４０のプローブ、プローブにつき３部位）のうち、バーコードの１０個の値のそれぞれが１２回現れるように、イニシエーターは特定の遺伝子のプローブの中で等しく分布する。これは、第一プローブの一部しか標的ＲＮＡにハイブリダイズしない場合であっても、バーコードの各値が検出可能であるように、重複性を与える。全てのプローブは、標準手順に従って、生物試料に同時にハイブリダイズされる。シグナルは１０回のＣＨＣＲの中で増幅され、各サイクルで２０個の標識のうちの２個を検出する。ＨＣＲ増幅及びイメージングのそれぞれの後、試料を硝酸銀で処理してＨＣＲポリマーの骨格を化学的に切断し、架橋性硫黄ホスホロチオエート修飾で修飾し、ＨＣＲポリマーを断片化し、ＣＨＣＲのサイクル間で蛍光シグナルが存在しないように断片を試料からから洗い流す。

１種類の色を用いる８サイクルのＨＣＲを使用する指数関数的なＲＮＡバーコーディングの例：１００個の遺伝子の各々について、４０種のｓｍＲＮＡＦＩＳＨ用プローブセットを設計する（例えば、バイオサーチ・テクノロジーズ社製ＳｔｅｌｌａｒｉｓＲＮＡＦＩＳＨプローブデザイナーツールを使用）。各遺伝子に固有の８ビット二進バーコード（例えば０１１１００１０）を割り当てる。ｓｍＲＮＡＦＩＳＨ用プローブを、バーコードのビットの１つに対応する、ＨＣＲイニシエーター配列Ｉ１（＝０）又はＩ２（＝１）（Ｃｈｏｉｅｔａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ８．５：４２８４－４２９４，２０１４）で、５’又は３’末端において、遺伝子バーコード（ｂａｒｏｄｅ）に従って、標識する。バーコード（１－８）の当該ビットに対応するイニシエーター配列を含有する各プール内の各遺伝子を標的とするプローブセットを含む、８サイクルのＨＣＲに対応する、合計８つのプローブプールを合成する。標準手順に従って、８サイクルの中で、これらのプローブを生物試料に連続的にハイブリダイズし、付加的ハンドルで各々修飾された、ＤＮＡＨＣＲセットのＨ１及びＨ２でシグナルを増幅する。各ＨＣＲ増幅の後、連続して、２つのＨＣＲポリマー種のそれぞれのハンドルに相補的な蛍光性ＣＨＣＲ工程Ｄプローブを、試料にハイブリダイズしてイメージングし、単一の蛍光性部分のみを用いて、「Ｉ１」ＨＣＲポリマー及び「Ｉ２」ＨＣＲポリマーの両シグナルを検出する（それぞれ、バーコード値０及び１）。シグナルはサイクル間で付加的であるが、ポリマー「Ｉ１」からのシグナルを、第二工程で検出されたシグナルから計算的に差し引くことで、「Ｉ２」ＨＣＲポリマーに対応する新たな仮想シグナルが得られる。検出後、試料をデオキシリボヌクレアーゼ混合物で処理して、結合したＩＳＨ用プローブ、ＨＣＲイニシエーター配列、及びＨＣＲポリマーを除去し、試料から除去する。エラー検出の一形態として機能する、バーコード間のハミング距離を最大化するために、１００のバーコードを２５５－バーコードスペース（２^８－１）内に割り当てる。

直線的タンパク質バーコーディングの例：８種のタンパク質標的を標的とする、８種の一次抗体（それぞれ４種が２種の宿主生物に由来）を、例えばシグマ社から、購入する。２種の一次抗体種の免疫グロブリンを認識できるが、交差反応性ではない、ＨＣＲイニシエーター配列Ｉ１及びＩ２を含有する２つのストレプトアビジン修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、それぞれ、二次抗体に結合できるように、ビオチンに結合してある、２種の二次抗体を購入する。各一次生物の１つを各々含有するペアにおいて、一次及び二次抗体染色を行い、シグナルを２つの直交性の、独立した、スペクトル的に別個のＤＮＡＨＣＲセットのＨ１及びＨ２によって増幅する。ＨＣＲ増幅及びイメージングのそれぞれの後、試料をホルムアミドで処理し、抗体とエピトープとの間の相互作用を途絶させ、各回の間に抗体及びイニシエーターを洗い流す。（４サイクル後に、８種の抗体全てが使用された）

循環的ＨＣＲ実験の実行プロトコルの例
循環的ＨＣＲ読み取りを含むＲＮＡin situハイブリダイゼーション
１．ＲＮＡin situハイブリダイゼーション用に生物試料を調製する
ａ．線維芽細胞をガラスボトム（ＭＡＴＴＥＫ）ディッシュ上に３０～８０％コンフルエントに播種する
ｂ．接着のために細胞を少なくとも１２時間増殖させる
ｃ．１×リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、２ｍＭバナジルリボヌクレオシド複合体（ＶＲＣ））を含む、ＰＢＳ中４％ＰＦＡを４℃で添加する
ｄ．３７℃で１０分間インキュベートする
ｅ．固定を止めるために、リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、２ｍＭＶＲＣ）を含むＰＢＳ中１００ｍＭグリシンを添加する
ｆ．２４℃で５分間インキュベートする
ｇ．リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、２ｍＭＶＲＣ）を含む、リボヌクレアーゼ非含有１×ＰＢＳで１分間、１回洗浄する
ｈ．リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、２ｍＭＶＲＣ）を含むリボヌクレアーゼ非含有１×ＰＢＳ中の０．１％トリトンＸで、細胞を３０分間透過処理する
ｉ．リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、２ｍＭＶＲＣ）を含む、リボヌクレアーゼ非含有１×ＰＢＳでそれぞれ１分間、２回洗浄する
ｊ．プレハイブリダイゼーション緩衝液である２×デンハート液＋１×リボヌクレアーゼ非含有ＰＢＳ＋リボヌクレアーゼ阻害剤（例えば、２ｍＭＶＲＣ）を添加する
ｋ．５分間インキュベートする
ｌ．２００ｕＬのハイブリダイゼーション緩衝液中の２ｎｍｏｌＲＮＡＩＳＨ用プローブプールを添加する（１ｍＬ用のレシピ）：
ｉ．１００ｕＬの２０×ＳＳＣ
ｉｉ．３００ｕＬのホルムアミド
ｉｉｉ．１０ｕＬのリボヌクレアーゼ阻害剤（例えばＶＲＣ）
ｉｖ．４０ｕＬの５０×デンハート液（最終的に２×）
ｖ．２００ｕＬの５０％ポリアクリル酸（ナトリウム塩）（分子量１０００）
ｖｉ．３５０ｕＬのＨ_２Ｏ
ｍ．３７℃で３６時間ハイブリダイズする

２．循環的ＨＣＲのための試料及びＨＣＲ用試薬の調製
ａ．２×０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０含有酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム緩衝液（ＳｏｄｉｕｍＡｃｅｔａｔｅＳｏｄｉｕｍＣｉｔｒａｔｅｂｕｆｆｅｒｗｉｔｈ０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０）（ＳＡＳＣＴ）で、試料を５分間５回洗浄する
ｂ．１０ｕＬの５×ＳＡＳＣ中のスナップ冷却（ｓｎａｐｃｏｏｌｉｎｇ）（９５℃で９０秒間加熱し、３０分間かけて卓上で室温に冷却）によって、ＨＣＲのサイクル毎に、ｄＵ塩基取り込みで修飾された、３０ｐｍｏｌの各ヘアピンを調製する。
ｃ．全てのスナップ冷却されたヘアピンをＨＣＲのサイクル毎に２００ｕＬの５×ＳＡＳＣＴの体積まで添加することで、ヘアピン溶液を調製する。

３．ＨＣＲの各サイクルの、前向き工程Ｂのための機構及び後向き工程Ｂ及びＣのための機構による、循環的ＨＣＲ：
ａ．２×ＳＳＣ＋３０％ホルムアミド＋２ｍＭＶＲＣ中、２．５ｕＭ濃度の各リンカー鎖を添加することにより、架橋性ホスホロチオエートで修飾された、リンカー鎖のサイクルサブセットを、３７℃で３０分間、ハイブリダイズする
ｂ．２×ＳＳＣＴでそれぞれ５分間５回洗浄する。
ｃ．ヘアピン溶液を試料に添加し、室温で３０分間～１６時間インキュベートする。
ｄ．２×ＳＳＣＴでそれぞれ５分間５回洗浄する。
ｅ．試料をイメージングする
ｆ．ＮＥＢ規格に従ってＵＳＥＲ反応を加え、３７℃で３０分間インキュベートして、ＨＣＲポリマーを分解する
ｇ．硝酸銀に、５０ｍＭの最終濃度まで加えて、リンカープローブからイニシエーター（ｉｎｉｔａｔｉｏｒ）を切断する
ｈ．２×ＳＳＣＴでそれぞれ５分間３回洗浄する。
ｉ．リンカー鎖の全てのサブセットが使用されるまで、３を繰り返す。

循環的ＨＣＲ読み取りを含むＤＮＡin situハイブリダイゼーション
１．ＲＮＡin situハイブリダイゼーション用に生物試料を調製する
ａ．線維芽細胞をガラスボトム（ＭＡＴＴＥＫ）ディッシュ上に３０～８０％コンフルエントに播種する
ｂ．接着のために細胞を少なくとも１２時間増殖させる
ｃ．１×デオキシリボヌクレアーゼ非含有ＰＢＳ中の４％ＰＦＡを４℃で添加する
ｄ．３７℃で１０分間インキュベートする
ｅ．固定を止めるために、１×デオキシリボヌクレアーゼ非含有ＰＢＳ中の１００ｍＭグリシンを添加する
ｆ．２４℃で５分間インキュベートする
ｇ．デオキシリボヌクレアーゼ非含有１×ＰＢＳで１分間、１回洗浄する
ｈ．デオキシリボヌクレアーゼ非含有１×ＰＢＳ中の０．１％トリトンＸで、細胞を透過処理する
ｉ．デオキシリボヌクレアーゼ非含有１×ＰＢＳでそれぞれ１分間、２回洗浄する
ｊ．２×ＳＳＣＴ＋５０％ホルムアミドで２回洗浄する
ｋ．Ｏｌｉｇｏｐａｉｎｔｓに従って（参照によって本明細書に援用される、Ｂｅｌｉｖｅａｕ、ＢｒｉａｎＪ．、ＮｉｃｈｏｌａｓＡｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓ、およびＣｈａｏ－ｔｉｎｇＷｕ．「ＶｉｓｕａｌｉｚｉｎｇＧｅｎｏｍｅｓｗｉｔｈＯｌｉｇｏｐａｉｎｔＦＩＳＨｐｒｏｂｅｓ．」ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（２０１４）：１４－２３）、Ｏｌｉｇｏｐａｉｎｔ設計で、各ゲノム遺伝子座が、それぞれ４つのＨＣＲポリマーセットの５つの循環式読み取り用に設計された、４種のスペクトル的に別個の蛍光性着色剤で検出される、一連の２０個の直交性の独立したＨＣＲシステムから５種のＨＣＲシグナルを用いてバーコード化されるように、ハイブリダイゼーション用マスターミックスを調製する。遺伝子座バーコードを構成する５個のＨＣＲイニシエーター配列を、Ｏｌｉｇｏｐａｉｎｔの３’及び５’非ゲノムハイブリダイズ用アーム又はハンドルに付加する。
ｌ．試料スライドを２×ＳＳＣＴ＋５０％ホルムアミド中、９２℃で２．５分間加熱する。
ｍ．試料を網羅可能な最少量のハイブリダイゼーション用マスターミックス中のＯｌｉｇｏｐａｉｎｔプローブ（通常、２０～３０ｐｍｏｌのＯｌｉｇｏｐａｉｎｔプローブが、固定された組織培養細胞において強い染色を生むのに十分である；組織切片及び全体包埋組織には１０倍多くのプローブが推奨される）を添加し、加熱・加湿した恒温器内で４２℃で１４時間超インキュベートする。

２．循環的ＨＣＲのための試料及びＨＣＲ用試薬の調製
ａ．試料を２×ＳＳＣＴで洗浄した後、６０℃で１５分間インキュベートする。
ｂ．試料を０．２×ＳＳＣで４回、それぞれ５分間洗浄する
ｃ．１０ｕＬの５×ＳＡＳＣ中のスナップ冷却（９５℃で９０秒間加熱し、３０分間かけて卓上で室温に冷却）によって、３０ｐｍｏｌの各ヘアピンを調製する。各々の独立した直交性のＨＣＲシステムが固有の直交性の２５塩基ハイブリダイゼーション部位を有するように、ＨＣＲヘアピンを、例えば蛍光プローブをハイブリダイズする、ハイブリダイゼーションによる配列決定による照合のための延長ハンドルで修飾する。ハイブリダイゼーション部位は、計算的ＤＮＡ設計ツールを用いてのように、相互直交性且つＨＣＲシステムに直交性であり、異種間ハイブリダイゼーションを防ぐように、計算的に設計できる。
ｄ．全てのスナップ冷却されたヘアピンをＨＣＲのサイクル毎に２００ｕＬの５×ＳＡＳＣＴの体積まで添加することで、ヘアピン溶液を調製する。
ｅ．２０のＨＣＲセット全てのヘアピン溶液を試料に添加し、室温で３０分間～１６時間インキュベートする。
ｆ．２×ＳＡＳＣＴでそれぞれ５分間５回洗浄する。

３．ＨＣＲの各サイクルの、前向き及び後向きの工程Ｄのための機構による、循環的ＨＣＲ：
ａ．ＨＣＲ読み取りの各サイクルにおいて、中間体の３’チオール－ｄＩ塩基を含む、スペクトル的に別個のフルオロフォアにそれぞれ結合した、４つのプローブをハイブリダイズし、２×ＳＡＳＣＴ中２．５ｕＭ濃度のプローブを室温で１０分間添加する
ｂ．０．２×ＳＡＳＣＴでそれぞれ５分間４回洗浄する
ｃ．イメージングする
ｄ．硝酸銀を５０ｍＭの最終濃度まで加えて、ＨＣＲポリマーのハンドルにハイブリダイズしたＤＮＡ鎖からフルオロフォアを切断する
ｅ．０．２×ＳＡＳＣＴでそれぞれ５分間４回洗浄する

指数関数的バーコーディングのさらなる実施形態
本開示の方法における指数関数的バーコーディングの一例を示す、図１７に示されているように、ＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子は、各々が３つの３’及び５’ハンドルモチーフのうちの１つを有する、複数の相補的なプローブに標的とされ、それらとハイブリダイズする。各プローブは、ＨＣＲのサイクル及びＨＣＲイニシエーターに関する複合情報を各々含む、４つのリンカードメインを含む。リンカーが、この情報保持ドメインにアニールしてイニシエーター配列を導入し、これを用いて、ＨＣＲ単位複製配列及び対応する蛍光シグナルが生成される。イメージングの後、記載された方法のいずれかを用いてシグナルがリセットされ、次のサイクルが行われる。４Ｎ直交性リンカードメインを介して１６，０００，０００超の固有のバーコード（４^１２）を生成するために、４つの直交性の、独立した、スペクトル的に別個のＨＣＲシステムしか使用しない。

本開示における指数関数的バーコーディングプローブ設計法の一例を示す、図１８に示すように、プローブセットの１つの設計では、各プローブは、標的ＲＮＡ分子又は標的ＤＮＡ分子に対しての標的化ハイブリダイゼーションのための領域、並びに、ＨＣＲのサイクル（Ｎ）及びＨＣＲプローブセット（ｋ）に関する一対の複合情報を含む情報保持プローブ配列、を含む。ここで、情報保持プローブは２５塩基長である。全てのプローブセットが、２０個の直交性の情報保持プローブセットを必要とし、１０２４の可能なバーコードを与える、４つの直交性ＨＣＲプローブセットを用いる５サイクルのＨＣＲ用に設計される。ＨＣＲの各サイクルにおいて、４つの工程Ｂプローブが試料に添加され、第一プローブの「標識」モチーフにハイブリダイズし、ＨＣＲイニシエーターを第一プローブに連結する。ＨＣＲを用いて蛍光シグナルが増幅及び検出される。

本開示における指数関数的バーコーディング法の一例を示す、図１５に示されるように、第一ＨＣＲサイクルにおいて、３つの工程Ｂプローブが添加され、ＨＣＲのサイクル及び増幅された蛍光性ポリマーを生成する直交性のスペクトルを区別可能なＨＣＲシステムについての複合情報を含む、工程Ｂプローブモチーフ「標識ｘ」を介して、情報を保持する第一プローブ配列をＨＣＲイニシエーターに連結する。ＨＣＲを用いて蛍光シグナルの読み取りが行われる。図１５Ａに示されるように、各標的分子において複数のプローブによって複合的な一連の定序性蛍光シグナルが生成され得るが、ここで、各第一プローブは、バーコードの一部分のみ、すなわち、第一プローブの結合を介して特異的に検出しようとする標的分析物における一次情報のための識別子、を含む。図１５Ｂに示すように、複合的な一連の定序性蛍光シグナルは各標的分子において単一のプローブによって生成され得るが、ここで、第一プローブはバーコード全体を含有する。

修飾ＨＣＲ試薬の合成法
構成に応じて、いくつかのＨＣＲプローブセット設計が可能である。これらのプローブは、概して、ＨＣＲ可能なヘアピンなどの直交性の一連の１又は複数の準安定ＨＣＲモノマーであるという特徴を有する。ＨＣＲヘアピンそれ自体が、酵素的合成だけでなく、化学的ＤＮＡ合成によって生成され得る。蛍光シグナルをプログラムによって生成及びリセットするための蛍光標識及び化学的性質などのさらなる特徴が導入される。

多重のＨＣＲモノマー又はＨＣＲヘアピンを合成するための本開示の方法の図式的概要が図２０に示される。

ＨＣＲ標識戦略Ｉ及びＩＩ
図２１は、本開示の方法におけるＨＣＲ標識戦略Ｉを対象としている。二本鎖鋳型ＤＮＡが、化学合成を通じて、又は化学合成とその後のＤＮＡポリメラーゼによる鎖伸長を通じて、生成される。二本鎖鋳型ＤＮＡは、ＨＣＲモノマー又はＨＣＲヘアピンのための配列、及び、蛍光プローブハイブリダイゼーション又はトーホールド鎖置換のためのハンドルなどのあらゆる付加配列、を含む。二本鎖鋳型ＤＮＡは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列などの、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む。二本鎖鋳型ＤＮＡは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）でのように、精製されてもよい。二本鎖鋳型ＤＮＡを用いて、インビトロ転写（ＩＶＴ）によりＲＮＡ分子が生成される。前記ＲＮＡは前記二本鎖鋳型ＤＮＡから精製されてもよい。前記ＲＮＡ分子を逆転写（ＲＴ）用の鋳型として用いて、相補的な一本鎖ＤＮＡ分子が生成される。前記ＲＮＡが分解され、且つ／又は、前記一本鎖ＤＮＡが精製され、準安定ヘアピンに折り畳まれる。ＨＣＲヘアピンが、末端デオキシトランスフェラーゼ反応などによる、いくつかの方法で蛍光標識されて、１又は複数の末端蛍光修飾ＤＮＡ塩基が追加される。前記ＲＴプライマーは、得られる一本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれる、１又は複数のフルオロフォアを含む。蛍光性ＤＮＡ塩基は逆転写中に一本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれる。あるいは、当業者に公知の方法を用いて、逆転写などの間に、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、合成による配列決定（ＳＢＳ）、又はライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）による蛍光標識のための部位として機能する付加配列が、ＨＣＲ分子に追加される。

図２２は、本開示の方法におけるＨＣＲ標識戦略ＩＩを対象としている。ＤＮＡポリメラーゼ伸長と、その後の一方のＤＮＡ鎖のλエキソヌクレアーゼ消化によって、ＰＡＧＥによって精製されてもよい、一本鎖ＤＮＡ分子が残って、一本鎖ＤＮＡヘアピンが生成され、ＨＣＲヘアピンへと折り畳まれる。ＨＣＲヘアピンが、末端デオキシトランスフェラーゼ反応などによる、いくつかの方法で蛍光標識されて、１又は複数の末端蛍光修飾ＤＮＡ塩基が追加される。エキソヌクレアーゼ消化から保護されたＤＮＡ鎖は１又は複数のフルオロフォアを含み得る。蛍光性ＤＮＡ塩基はポリメラーゼ伸長中に一本鎖ＤＮＡ分子に組み込まれる。あるいは、逆転写などの間に、ハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）、合成による配列決定（ＳＢＳ）、又はライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）による蛍光標識のための部位として機能する付加配列が、ＨＣＲ分子に追加される。

表１．例示的なＦＩＳＨ用プローブセット
（キイロショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）遺伝子ＲＮＡＰＩＩに対する循環的ＨＣＲのためのプローブセット）
表１は、工程Ｂを用いるＣＨＣＲのためのｍＲＮＡキイロショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）遺伝子ＲＮＡＰＩＩを標的とするＤＮＡＩＳＨ用プローブセットを含む。標識ＩＤ（工程Ｂプローブモチーフ）とは、ＨＣＲイニシエーターも含む工程Ｂプローブに相補的なハンドル配列を指す。各配列中の下線部の「ＴＡＴ」配列は、標的ｍＲＮＡに相補的な領域（小文字で表示）と工程Ｂプローブに相補的な領域（大文字で表示）との間のスペーサーとして働く。この遺伝子のためのバーコードは、一連の標識［０、４、８、１２、１６］によって定められ、これらはＣＨＣＲを介して一連の定序性の蛍光シグナルに変換され、ここで、標識とＨＣＲシグナルとの間の関係は第一プローブをＨＣＲイニシエーターに機能的に連結する工程Ｂプローブによって定められる。

表２．例示的なリンカーセット
（ＲＮＡＰＩＩプローブとＨＣＲイニシエーターとの間の切断可能なリンカーセット）
表２は、ＲＮＡＰＩＩを標的とする、表１に列挙されたものを含む複数の第一プローブに対応する工程Ｂプローブ配列を含む。列「標識ＩＤ」は、第一プローブに相補的な工程Ｂプローブ配列モチーフを指し、ＣＨＣＲのサイクル及びＨＣＲシグナルの両方に関する情報をコードする。「ＨＣＲシステム」とは、４つの直交性ＨＣＲシステムのうちのどれが各標識ＩＤと関連付けられているかを指す。「工程Ｂプローブ配列」は、各標識の第一プローブに含まれる配列の逆相補体である、第一プローブと結合する工程Ｂプローブの配列を指す。「スペーサー」は、第一プローブとＨＣＲイニシエーターを含む領域との結合に関与するプローブＢ配列の領域を空間的に分離するように設計された、短い配列である。ＨＣＲイニシエーター配列は表３に示される。列「リンカーオリゴ配列」は、大文字で示された工程Ｂプローブ配列と結合した、下線部で示されたスペーサー配列と結合した、小文字で示された、オリゴのための、ＨＣＲシステムに対応するＨＣＲイニシエーター配列を含む。Ｘは、硝酸銀溶液を用いて切断可能な架橋性ホスホロチオエート結合を含む５’チオール－ｄＩ修飾塩基を示す。

表３：例示的なＨＣＲイニシエーター配列

表４：例示的な修飾ＨＣＲヘアピン
（酵素的及び化学的切断を用いる切断可能なＨＣＲヘアピンの配列）
酵素的又は化学的切断のために設計されたいくつかの修飾ＨＣＲヘアピン配列。Ｋｅｙはオリゴ配列内に含まれる修飾された配列の参照を含む。

表５：ＨＣＲポリマーのプログラム可能な蛍光標識のための例示的な配列
蛍光シグナルの前記ＨＣＲポリマーとのプログラム可能な関連付けのための、前記ＨＣＲポリマーに対する蛍光プローブのＳＢＨのためのハンドル配列は、大文字で示される。ＨＣＲ重合に関与する配列は小文字で示される。切断可能な工程Ｄプローブも示されており、工程Ｄプローブを前記ＨＣＲポリマーにハイブリダイズすることで、蛍光をポリマーと会合させることができ、検出後、硝酸銀を加えることで、蛍光色素を工程Ｄプローブから切断し、ＨＣＲポリマーを非蛍光性状態に戻すことができる。

本願に引用された全ての参考文献、特許及び特許出願公開の内容は、全ての目的においてそれらの全体が参照によって本明細書に援用される。

均等物
他の実施形態が当業者には明らかである。上記の説明は、明確さのみを目的として提供された単なる例示であると理解されたい。本発明の精神及び範囲は上記の例に限定されず、特許請求の範囲によって包含される。上記で引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が参照によって援用されると明確に示されるのと同程度に、全ての目的においてそれらの全体が参照によって本明細書に援用される。
本発明は以下の態様を含む。
＜１＞（ａ）試料を１又は複数のプローブと接触させること、ここで、前記１又は複数のプローブのうちの特定のプローブはリンカーに結合しており、前記特定のプローブは標的分析物の配列に相補的な配列を有し、前記試料を前記１又は複数のプローブと接触させると前記特定のプローブが前記標的分析物に結合する；
（ｂ）前記試料を、１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと、前記１又は複数のＨＣＲイニシエーターのうちの特定のＨＣＲイニシエーターが前記リンカーに結合することを可能とするのに十分な条件下で接触させること、ここで、前記特定のＨＣＲイニシエーターは前記特定のプローブからは独立しており、前記試料を前記１又は複数のＨＣＲイニシエーターと接触させると、前記リンカーが前記プローブと前記特定のＨＣＲイニシエーターとを結合させる；
（ｃ）前記試料を１又は複数のＨＣＲ増幅因子と接触させて、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させること、ここで、前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子のうちの特定のＨＣＲ増幅因子が検出可能な標識を含むＨＣＲモノマーを少なくとも１つ含むことで、前記特定のプローブに結合した、前記ＨＣＲモノマーを含む増幅産物が生成される；及び
（ｄ）前記増幅産物を検出することで、前記標的分析物を同定すること、
を含む、試料中の標的分析物を同定する方法。
＜２＞プログラム可能であり、かつ時間的に順序付けられたハイブリダイゼーション連鎖反応を可能にするように構成された、各々特定の標的分析物に特異的な複数のプローブセットに、前記試料を接触させることをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜３＞前記検出可能な標識が蛍光標識であり、前記検出が蛍光シグナルの検出を含み、経時的に生成された蛍光シグナルは全体として、各標的分析物の分子の実体、分子の性質、又は分子構成を含む固有の一群の情報を与える、前記＜２＞に記載の方法。
＜４＞前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子が２つの準安定なＤＮＡヘアピンを含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜５＞前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子の検出可能な標識が、マルチプレックス検出のためのスペクトル的に別個の蛍光シグナルを含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜６＞前記ＨＣＲモノマーの検出可能な標識が、ハイブリダイゼーションによる蛍光シークエンシング、ライゲーションによる蛍光シークエンシング、又は合成による蛍光シークエンシングのための、シークエンシング用鋳型を含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜７＞前記標的分析物がＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ類似体、及びＤＮＡ類似体を包含する核酸高分子、タンパク質、並びにその化学修飾体を含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜８＞前記標的分析物が脂質、代謝産物、生体分子、及び他の小分子を含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜９＞複数の標的分析物を逐次標識することをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜１０＞前記逐次標識が各分析物を複数のＨＣＲイニシエーターと会合させることを含む、前記＜９＞に記載の方法。
＜１１＞前記特定のＨＣＲ増幅因子が２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜１２＞前記特定のプローブの標的分析物への前記結合が２回以上繰り返される、前記＜１＞に記載の方法。
＜１３＞前記リンカーが、結合（ｂｏｎｄ）であってもよく、又は、前記リンカーが、イニシエーター配列を含むオリゴヌクレオチドの配列部分に相補的であり、かつ前記イニシエーター配列を含む前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズする配列部分を含んでいてもよい、前記＜１＞に記載の方法。
＜１４＞前記特定のプローブと前記リンカーとの間の結合、前記リンカーと前記ＨＣＲイニシエーターとの間の結合、又は前記特定のプローブと前記ＨＣＲイニシエーターとの間の結合を、破壊する又は解除させることをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜１５＞前記ＨＣＲイニシエーターがＨＣＲを開始させることを防ぐ、保護基に対応するイニシエーター配列を、前記リンカーが含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜１６＞前記保護基が保護オリゴヌクレオチドである、前記＜１５＞に記載の方法。
＜１７＞前記リンカーの前記保護基を破壊することによって、前記ＨＣＲイニシエーターにＨＣＲを惹起させることをさらに含む、前記＜１５＞に記載の方法。
＜１８＞前記破壊が、前記試料に脱保護オリゴヌクレオチドを導入して、トーホールド鎖置換により前記保護基を除去することを含む、前記＜１７＞に記載の方法。
＜１９＞前記検出後に増幅産物を分解又は解体することをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜２０＞前記検出後に増幅産物と検出用標識との間の結合を破壊する又は解除させることをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜２１＞前記特定のプローブの前記標的分析物への結合を破壊する又は解除させることをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜２２＞複数の検出サイクルを含む複数回のハイブリダイゼーション連鎖反応を実施することをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜２３＞前記複数回のハイブリダイゼーション連鎖反応が、１若しくは複数のＨＣＲイニシエーター又は１若しくは複数のＨＣＲ増幅因子を再利用することを含む、前記＜２２＞に記載の方法。
＜２４＞前記特定のＨＣＲイニシエーターと前記特定のプローブとの間の機能的結合をプログラミングすることをさらに含み、前記プログラミングが、
ａ）ハイブリダイゼーションによる配列決定を用いて相補的核酸分子を有するリンカープローブに前記ＨＣＲイニシエーターを加えるために核酸ハイブリダイゼーションを使用すること、
ｂ）前記ＨＣＲイニシエーターをリンカープローブに加えるために酵素を使用すること、
ｃ）リンカープローブにハイブリダイズされたＨＣＲイニシエーターを除去するために核酸ハイブリダイゼーションを破壊するために熱若しくは変性剤を使用すること、
ｄ）リンカープローブを介して標的分子に局在しているＨＣＲイニシエーターから保護鎖を除去するためにトーホールド鎖置換を使用すること、又は
ｅ）イニシエーターとリンカープローブとの間の化学結合を破壊する化学的処理、酵素的処理、又は光処理でＨＣＲイニシエーターが除去できるようにするために、ＨＣＲイニシエーターとリンカープローブとの間に化学基、酵素基、又は光に対して不安定な基を取り込むこと
を含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜２５＞前記ＨＣＲイニシエーターを前記リンカープローブに加える酵素が、スプリントライゲーション反応を触媒するＤＮＡリガーゼである、前記＜２４＞に記載の方法。
＜２６＞前記ハイブリダイゼーション連鎖反応を逆行又は停止させることをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜２７＞ハイブリダイゼーション連鎖反応の逆行又は停止が、
ａ）１又は複数の相補ＤＮＡ鎖の追加により増幅産物の分解が起こるように、トーホールド鎖置換のための１又は複数の付加配列を含む修飾ＨＣＲモノマーを使用すること、又は
ｂ）増幅産物が化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって断片化又は破壊されるように、ＨＣＲモノマーのＤＮＡ骨格内に１又は複数の酵素的若しくは化学的に感受性の基又は光に対して不安定な基を含む、修飾ＨＣＲモノマーを使用すること、
を含む、前記＜２６＞に記載の方法。
＜２８＞ａ）合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）を用いてプローブすることが可能な付加配列を含む修飾ＨＣＲモノマーを用いることで、蛍光性部分を前記増幅産物に導入すること、
ｂ）前記ＨＣＲモノマーのＤＮＡ骨格と蛍光性部分を含む前記検出可能な標識との間に酵素、化学物質、又は光に対して不安定な基を含む修飾ＨＣＲモノマーを用いて、前記蛍光性部分を化学的処理、酵素的処理、又は光処理で除去できるようにすること、
ｃ）合成による配列決定（ＳＢＳ）、ライゲーションによる配列決定（ＳＢＬ）、又はハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）により増幅産物を標識可能な修飾蛍光プローブであって、トーホールド鎖置換のための付加配列を含む修飾蛍光プローブを用いることで、前記蛍光プローブと前記増幅産物との間のハイブリダイゼーションの破壊により前記蛍光プローブを前記増幅産物から除去できるようにすること、又は、
ｄ）ＳＢＳ、ＳＢＬ、又はＳＢＨなどにより増幅産物を標識可能な修飾蛍光プローブであって、前記増幅産物の骨格と蛍光性部分を含む検出可能な標識との間に酵素、化学物質、又は光に対して不安定な基を含む修飾蛍光プローブを用いて、化学的処理、酵素的処理、又は光処理によって前記蛍光性部分を除去できるようにすること
によって、前記増幅産物からの蛍光シグナルの生成をプログラムすることをさらに含む、前記＜１＞に記載の方法。
＜２９＞前記特定のプローブが前記標的分析物から除去可能であるか、前記ＨＣＲイニシエーターが前記リンカーから除去可能であるか、前記増幅産物が前記ＨＣＲイニシエーターから除去可能であるか、又は、前記検出可能な標識が前記増幅産物から除去可能である、前記＜１＞に記載の方法。
＜３０＞１又は複数のプローブ、ここで該１又は複数のプローブのうちの特定のプローブは、リンカーと結合しており、かつ標的分析物の配列に相補的な配列を有する；
１又は複数のＨＣＲイニシエーター、ここで該１又は複数のＨＣＲイニシエーターのうちの特定のＨＣＲイニシエーターは、前記特定のプローブからは独立しており、かつ前記リンカーに結合して前記プローブを前記特定のＨＣＲイニシエーターに連結するように構成される、特定のＨＣＲイニシエーターを含む；及び
１又は複数のＨＣＲ増幅因子、ここで該１又は複数のＨＣＲ増幅因子のうちの特定のＨＣＲ増幅因子は、検出可能な標識を含む少なくとも１つのＨＣＲモノマーを含む
を含み、
前記特定のＨＣＲイニシエーターは、前記ＨＣＲモノマーに結合し、ハイブリダイゼーション連鎖反応を惹起して、前記ＨＣＲモノマーを含み前記特定のプローブに結合している増幅産物を生成するように構成される、
循環的ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）システム。
＜３１＞各々特定の標的分析物に特異的であり、かつプログラム可能で時間的に順序付けられたハイブリダイゼーション連鎖反応用に設計されている、複数のプローブセットをさらに含む、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜３２＞前記複数のプローブセットが、経時的に生成される蛍光シグナルを与えるように構成され、前記経時的に生成される蛍光シグナルは全体として、分子の実体、分子の性質、又は分子構成を含む各標的分析物についての固有の一群の情報を与える、前記＜３１＞に記載のＨＣＲシステム。
＜３３＞前記ＨＣＲ増幅因子の各々が、そのそれぞれがＤＮＡヘアピンである２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜３４＞前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子が、マルチプレックス検出のためのスペクトル的に別個の蛍光シグナルを含む検出可能な標識を含む２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜３５＞前記ＨＣＲモノマーが非蛍光性ＨＣＲモノマーである、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜３６＞前記非蛍光性ＨＣＲモノマーが、増幅産物の生成の際又はその後に蛍光標識されるように構成される、前記＜３５＞に記載のＨＣＲシステム。
＜３７＞前記非蛍光性モノマーから形成された増幅産物が、ハイブリダイゼーションによる蛍光シークエンシング、ライゲーションによる蛍光シークエンシング、合成による蛍光シークエンシング、酵素反応、又は化学反応によって、前記増幅産物の生成後に蛍光標識される、前記＜３６＞に記載のＨＣＲシステム。
＜３８＞前記１若しくは複数のプローブ、前記リンカー、１若しくは複数のＨＣＲイニシエーター、又は１若しくは複数のＨＣＲ増幅因子が、再利用されるように構成される、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜３９＞前記リンカーが、前記ＨＣＲイニシエーターを含むオリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列である、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜４０＞前記リンカーが、前記イニシエーターからのプログラム可能な分離のための官能基を含む、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜４１＞前記検出可能な標識の検出をプログラムによって生成及びリセットできる、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜４２＞前記ＨＣＲモノマーが、前記増幅産物のプログラム可能な解体又は分解のための官能基を含有する、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜４３＞前記官能基がトーホールド鎖置換配列を含む、前記＜４２＞に記載のＨＣＲシステム。
＜４４＞前記官能基が、化学的に不安定な化学基、酵素に対して不安定な化学基、又は光に対して不安定な化学基を含む、前記＜４２＞に記載のＨＣＲシステム。
＜４５＞前記特定のプローブの前記標的分析物への結合が、ハイブリダイゼーション連鎖反応の間に破壊又は解除されるように構成される、前記＜３０＞に記載のＨＣＲシステム。
＜４６＞前記標的分析物への前記特定のプローブの結合が、化学的処理、酵素処理、ＲＮＡｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）用プローブのデオキシリボヌクレアーゼ処理、５’ｐｈｏｓＩＳＨ用プローブのエキソヌクレアーゼ処理、核酸プローブのヌクレアーゼ処理、ペプチドプローブのプロテアーゼ処理、熱若しくは変性剤の使用による核酸ハイブリダイゼーションの破壊、熱若しくは変性剤の使用によるアプタマー結合の破壊、又は、熱若しくは変性剤の使用による抗体とタンパク質との間の結合の破壊、によって破壊又は解除される、前記＜４５＞に記載のＨＣＲシステム。
＜４７＞（ｅ）試料を、標的分析物の配列に相補的な配列を含む第一プローブと接触させること；
（ｆ）前記試料を、前記第一プローブに結合するように構成された第二プローブと接触させること、ここで、前記第一プローブと前記第二プローブとの結合が、検出可能な標識を含む少なくとも１つのハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）増幅因子の存在下でＨＣＲを促進して、前記検出可能な標識を含む増幅産物を生成し、前記第二プローブは前記ＨＣＲ増幅因子及び前記第一プローブからは独立している；並びに、
（ｇ）前記検出可能な標識を検出することにより、前記標的分析物を同定すること、
を含む、試料中の標的分析物を同定する方法。
＜４８＞前記ＨＣＲがポリメラーゼ連鎖反応ではない、前記＜４７＞に記載の方法。
＜４９＞前記増幅産物が前記第一プローブに結合している、前記＜４７＞に記載の方法。
＜５０＞前記ＨＣＲ増幅因子が前記第二プローブの配列に相補的な配列を有する、前記＜４７＞に記載の方法。
＜５１＞前記第一プローブが、前記第一プローブが前記第二プローブに結合することを可能にするリンカーに結合している、前記＜４７＞に記載の方法。
＜５２＞前記第一プローブが、前記ＨＣＲを開始させるＨＣＲイニシエーターを含む、前記＜４７＞に記載の方法。
＜５３＞前記第一プローブが、前記試料を前記第二プローブ接触させる前に前記ＨＣＲイニシエーターが前記ＨＣＲを開始させることを防ぐ保護基を含む、前記＜５２＞に記載の方法。
＜５４＞前記保護基が保護オリゴヌクレオチドを含む、前記＜５３＞に記載の方法。
＜５５＞前記第二プローブが、前記ＨＣＲを開始させるＨＣＲイニシエーターを含む、前記＜４７＞に記載の方法。
＜５６＞前記第二プローブが検出可能な標識を含まない、前記＜４７＞に記載の方法。
＜５７＞前記ＨＣＲ増幅因子が２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む、前記＜４７＞に記載の方法。
＜５８＞前記２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーの各々が準安定なＤＮＡヘアピンを含む、前記＜５７＞に記載の方法。
＜５９＞検出可能な標識を検出するためのディテクター；及び
前記ディテクターに作動的に接続されたコントローラー、を含み、
前記コントローラーは、
（ｉ）前記試料を前記標的分析物の配列に相補的な配列を含む第一プローブと接触させること；
（ｉｉ）前記試料を前記第一プローブに結合するように構成された第二プローブと接触させること、ここで、前記第一プローブと前記第二プローブとの結合が、検出可能な標識を含む少なくとも１つのハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）増幅因子の存在下でＨＣＲを促進して、前記検出可能な標識を含む増幅産物を生成し、前記第二プローブは前記ＨＣＲ増幅因子及び前記第一プローブからは独立している；及び
（ｉｉｉ）前記検出可能な標識を検出するために前記ディテクターを使用することによって前記標的分析物を同定すること
を指示するように、個別又は集合的にプログラムされた、１又は複数のコンピュータプロセッサを含む、試料中の標的分析物を同定するためのシステム。
＜６０＞検出可能な標識を含み、かつハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を促進するように構成された、ＨＣＲ増幅因子；
標的分析物の配列に相補的な配列を含む第一プローブ；及び
前記第一プローブに結合するように構成され、検出可能な標識を含まず、かつ前記ＨＣＲ増幅因子及び前記第一プローブとは独立した、第二プローブ
を含む、試料中の標的分析物を同定するためのキット。
＜６１＞前記ＨＣＲを行うために前記ＨＣＲ増幅因子、第一プローブ及び前記第二プローブを使用するための説明書をさらに含む、前記＜６０＞に記載のキット。
＜６２＞前記第一プローブと前記第二プローブとの間のリンカーを切断することで、１又は複数のＨＣＲイニシエーターが１又は複数のＨＣＲ増幅因子と共に連鎖反応を開始させることを防ぐように構成された、切断剤をさらに含む、前記＜６０＞に記載のキット。
＜６３＞前記ＨＣＲ増幅因子が前記第二プローブの配列に相補的な配列を有する、前記＜６０＞に記載のキット。
＜６４＞前記第一プローブが、前記第一プローブが前記第二プローブに結合することを可能にするリンカーに結合している、前記＜６０＞に記載のキット。
＜６５＞前記第一プローブが、前記ＨＣＲを開始させるＨＣＲイニシエーターを含む、前記＜６０＞に記載のキット。
＜６６＞前記第一プローブが前記第二プローブに結合される前に前記ＨＣＲイニシエーターが前記ＨＣＲを開始させることを防ぐ保護基を前記第一プローブが含む、前記＜６５＞に記載のキット。
＜６７＞前記保護基が保護オリゴヌクレオチドを含む、前記＜６６＞に記載のキット。
＜６８＞前記第二プローブが前記ＨＣＲを開始させるＨＣＲイニシエーターを含む、前記＜６０＞に記載の方法。
＜６９＞前記ＨＣＲ増幅因子が２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む、前記＜６０＞に記載のキット。
＜７０＞（ａ）第二プローブに結合した第一プローブを含む試料を提供すること、ここで前記第一プローブは、標的分析物の配列に相補的な配列を含み、かつハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を促進するのに十分な条件下で前記標的分析物にハイブリダイズして増幅産物を生成する；及び
（ｂ）前記試料を、前記第一プローブを前記標的分析物から切り離すことなく前記第一プローブを前記第二プローブから切り離すための切断剤と接触させることで、前記ＨＣＲを妨げ、前記増幅産物の生成を中断すること
を含む、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）増幅産物の生産を中断する方法。

Claims

（ａ）試料を１又は複数のプローブと接触させること、ここで、前記１又は複数のプローブのうちの特定のプローブはリンカーに結合しており、前記特定のプローブは標的核酸分析物の配列に相補的な配列を有し、前記試料を前記１又は複数のプローブと接触させると前記特定のプローブが前記標的核酸分析物に結合する；
（ｂ）続いて、１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターを前記試料に加え、前記試料を、前記１又は複数のハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）イニシエーターと接触させて、前記１又は複数のＨＣＲイニシエーターのうちの前記特定のプローブからは独立した特定のＨＣＲイニシエーターが前記リンカーに結合することを可能とすること、ここで、前記試料を前記１又は複数のＨＣＲイニシエーターと接触させると、前記リンカーが前記特定のプローブと前記特定のＨＣＲイニシエーターとを結合させる；
（ｃ）前記試料を１又は複数のＨＣＲ増幅因子と接触させて、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始させること、ここで、前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子のうちの特定のＨＣＲ増幅因子が、検出可能な標識を含むＨＣＲモノマーを含み、前記ＨＣＲモノマーが前記特定のＨＣＲイニシエーターに結合することで、前記特定のプローブに結合した、検出可能な標識を含む前記ＨＣＲモノマーを含む増幅産物が生成される；
（ｄ）前記増幅産物を検出することで、前記標的核酸分析物を同定すること、及び
（ｅ）（ｄ）に続いて、
（ｉ）前記増幅産物から前記検出可能な標識を除去すること、
（ｉｉ）前記リンカーから前記特定のＨＣＲイニシエーターを除去すること、又は
（ｉｉｉ）前記標的核酸分析物から前記特定のプローブを除去すること、
を含む、試料中の標的核酸分析物を同定する方法。
前記検出可能な標識が蛍光標識を含み、前記検出が蛍光シグナルの検出を含み、経時的に生成された蛍光シグナルは全体として、前記標的核酸分析物の分子の実体、分子の性質、又は分子構成を含む固有の一群の情報を与える、請求項１に記載の方法。
前記１又は複数のＨＣＲ増幅因子が２つの準安定なデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）ヘアピンを含む、請求項１に記載の方法。
前記ＨＣＲモノマーの前記検出可能な標識が、ハイブリダイゼーションによる蛍光シークエンシング、ライゲーションによる蛍光シークエンシング、又は合成による蛍光シークエンシングのための、シークエンシング用鋳型を含む、請求項１に記載の方法。
前記特定のＨＣＲ増幅因子が２つ以上の準安定ＨＣＲモノマーを含む、請求項１に記載の方法。
前記リンカーが、前記特定のＨＣＲイニシエーターの第２の核酸配列部分に相補的である第１の核酸配列部分を含み、前記第１の核酸配列部分は前記第２の核酸配列部分にハイブリダイズする請求項１に記載の方法。
（ｃ）の前に、前記特定のＨＣＲイニシエーターがハイブリダイゼーション連鎖反応に関与することを防ぐ保護基に対応するイニシエーター配列を、前記リンカーが含む、請求項１に記載の方法。
前記保護基が保護オリゴヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
前記方法が、前記リンカーの前記保護基を除去することによって、前記特定のＨＣＲイニシエーターがハイブリダイゼーション連鎖反応に関与することを含む、請求項７に記載の方法。
前記リンカーからの前記保護基の除去が、前記リンカーに脱保護オリゴヌクレオチドを導入し、前記脱保護オリゴヌクレオチドを用いたトーホールド鎖置換反応を開始することを含む、請求項９に記載の方法。
（ｄ）の後に、前記増幅産物が分解又は解体される、請求項１に記載の方法。
前記方法が、複数のハイブリダイゼーション連鎖反応を実施すること、及び、前記複数のハイブリダイゼーション連鎖反応のハイブリダイゼーション連鎖反応の後に（ｄ）を繰り返すこと、を含む、請求項１に記載の方法。
前記複数のハイブリダイゼーション連鎖反応が、前記特定のＨＣＲイニシエーター又は１若しくは複数のＨＣＲ増幅因子を再利用することを含む、請求項１２に記載の方法。
（ｂ）において、前記特定のＨＣＲイニシエーターが、ハイブリダイゼーションによって前記リンカーと結合する、請求項１に記載の方法。
（ｂ）において、前記特定のＨＣＲイニシエーターが、酵素の補助によって前記リンカーと結合する、請求項１に記載の方法。
前記酵素が、スプリントライゲーション反応を触媒するＤＮＡリガーゼである、請求項１５に記載の方法。
（ｂ）において、前記特定のＨＣＲイニシエーターが、前記イニシエーターと前記リンカーとの間の破壊可能な結合を介して前記リンカーに結合しており、前記破壊可能な結合は、化学的に破壊可能、酵素的に破壊可能、又は光学的に破壊可能である、請求項１に記載の方法。
（ｃ）において、前記ＨＣＲモノマーが破壊可能な結合を含み、前記破壊可能な結合は、化学的に破壊可能、酵素的に破壊可能、又は光学的に破壊可能である、請求項１に記載の方法。
前記標的核酸分析物が、三次元マトリクス中に固定されている、請求項１に記載の方法。
前記方法が、前記ハイブリダイゼーション連鎖反応を逆行又は停止させることを含む、請求項１に記載の方法。
ハイブリダイゼーション連鎖反応の逆行又は停止が、トーホールド鎖置換反応を含む、請求項２０に記載の方法。