CN114480592A - 基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术 - Google Patents

基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术 Download PDF

Info

Publication number
CN114480592A
CN114480592A CN202011168590.0A CN202011168590A CN114480592A CN 114480592 A CN114480592 A CN 114480592A CN 202011168590 A CN202011168590 A CN 202011168590A CN 114480592 A CN114480592 A CN 114480592A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
reaction
target gene
udg
strand displacement
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202011168590.0A
Other languages
English (en)
Inventor
谢国明
翁智
张章
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Medical University
Original Assignee
Chongqing Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Medical University filed Critical Chongqing Medical University
Priority to CN202011168590.0A priority Critical patent/CN114480592A/zh
Publication of CN114480592A publication Critical patent/CN114480592A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Abstract

本专利基于磁性纳米富集技术和传统PCR技术改造后获得一种经济、简便、高效单链靶基因的获取方法；采用UDG介导PCR技术来获得检测探针，解决探针化学合成技术长度的限制；采用链置换反应技术来提高靶基因与检测探针反应的特异性，实现对靶基因的特异检测。当样本为突变型靶基因时，能够与检测探针自发的发生链置换反应，荧光信号迅速增高；当为野生型靶基因时，由于存在不匹配位点，影响链置换反应的热力学和动力学，故不利于与长链检测探针产生链置换过程，荧光信号增长缓慢。分析荧光曲线图的结果，便可快速对样本进行基因分型。

Description

基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测 技术
技术领域
本发明涉及一种检测技术，特别涉及一种基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反 应的SNPs检测技术。
背景技术
单核苷酸多态性(SNPs)是单个核苷酸的改变所引起的DNA序列多态性，是人类基因组 中最常见、最稳定的变异形式。人类基因组中存在着约30-1000万个SNPs位点，这些SNPs 影响着人类对疾病的易感性以及对病原体、化学品、药品、疫苗等的反应。因此SNPs的检测 在疾病的风险性评估、诊断、治疗，实现精准医疗等方面均有巨大的价值。
目前，国内外已有多种技术用于检测基因组复杂区域中的SNPs，基于不同的目的可划分 为两类：一类是扫描全基因组以发现新SNPs的技术，主要包括新一代测序技术、比较基因组 杂交、荧光原位杂交和代表性寡核苷酸微阵列分析等；另一类是针对已知SNPs进行检测的技 术，主要包括实时定量PCR技术、等位基因特异性PCR技术、多重可扩增探针杂交技术和连 接酶依赖的探针多重扩增技术等。尽管上述各种方法在基因检测上具有较高的准确性，但从 临床诊断的角度来看，这些方法存在很多局限性，或操作繁琐、或通量不高、或价格昂贵、 或周期长等，并不能满足临床医学检测简单快速的需要，也限制了其在临床上的应用。
本技术基于磁性纳米富集技术和传统PCR技术改造后获得一种经济、简便、高效单链靶 基因的获取方法；采用UDG介导PCR技术来获得检测探针，解决探针化学合成技术长度的限 制；采用链置换反应技术来提高靶基因与检测探针反应的特异性，从而实现对靶基因的特异 检测。
发明内容
本发明的目的是开发出一种简单、快速、准确的SNPs检测技术。
具体技术方案如下：
一种基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术，其方法包括以 下步骤：
(1)、磁性纳米粒子的制备取一定量的六水合氯化铁和七水硫酸亚铁，将其溶解于除氧 的超纯水(18.2MΩcm，25℃)中，混合均匀形成Fe3+:Fe2+摩尔比为1.75:1的反应液；在连续搅拌及N2保护下，缓慢滴加适量的氨水溶液(NH3-H2O，28.0％～30.0％)直到最终PH 接近10，反应液由原来的橙红色变为黑色，然后升温至80℃再孵育30min；反应结束后，黑 色沉淀物用磁铁分离，然后用超纯水和无水乙醇交替洗涤5次，最后得到Fe3O4固体，于80℃ 的真空烘箱中干燥至恒重，密封保存以备后续使用。
(2)、磁珠联合不对称PCR富集单链靶基因使用Primer-BLAST根据不对称PCR的原则 设计引物，并将上游引物的5`端用生物素标记；按照PCR Master Mix 10μl、模板1μl、上下游引物各1μl(浓度比为5:1)，用ddH20补充至20μl配制反应体系；按下列条件进行PCR：步骤一，95℃预变性30s；步骤二，95℃10s，60℃30s，重复步骤二39次；将PCR产物 与0.5mg标记有链霉亲和素的磁珠混合，孵育5min；5min后，通过施加外部磁场分离磁珠， 然后用洗涤缓冲液洗涤，以去除蛋白质和盐污染，最终将单链靶基因富集在纳米磁珠表面。
(3)、UDG介导PCR获得与靶基因长度匹配的长链检测探针利筛选获取含不同基因型 靶基因的细胞，利用DNA吸附柱快速提取DNA，并用NANO-DROP1000型紫外分光光度计 验证；将PCR上游引物中dTTP用dUTP代替，下游引物则标记上荧光基团(FAM)，PCR 反应底物为dATP，dTTP，dCTP和dGTP和高保真DNA聚合酶；按照普通PCR的反应条件， 进行扩增反应；PCR产物与1U的UDG酶在Reaction buffer(200mM Tris-HCl、pH 8.2、10 mM EDTA、100nM Nacl)中混合,50℃孵育5min；5min后，产物按照1:5的比例与上样 缓冲液混合，进行12％的非变性PAGE分析，并通过切胶仪切下切下相应的产物条带；使用 EZ-10柱式DNA纯化试剂盒(生工，中国)进行纯化，最终获得纯化后的长链检测探针。 (4)、通过链置换反应检测SNPs将获得的具有Toehold位点的长检测探针与富集有单链 靶基因的磁性纳米粒子在均相溶液中充分反应；经过磁性分离后，通过荧光分光光度计对上 清液的荧光信号进行检测，从而实现临床样本中SNPs的准确快速检测。
所述步骤(2)中不对称PCR所用的上下游引物的比例可为5:1、10:1、20:1。
所述步骤(3)中进行UDG介导PCR时，要注意聚合酶的选择，这里使用的是Taq DNA聚 合酶；从古细菌属分离出的DNA聚合酶，例如pfu DNA聚合酶，会抑制反应的进行。
所述步骤(4)中所用的缓冲液为1×TEM buffer(溶液含有10mmol/L Tris-HCl，11.5mmol/L Mg2+，pH 8.0)，反应温度为25℃。
本发明耦合UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应来准确快速检测SNPs。如图1所 示其检测原理为在PCR反应液中加入不等量的上下游引物，含量较多的用生物素标记，经过 指数扩增和线性扩增后获得具有杂交活性的单链靶基因。所获得的单链靶基因中可能会混有 上、下游引物，dNTP，DNA聚合酶等杂质，对后续的检测可能造成未知的干扰。用链霉亲和 素-生物素分离技术，用链霉亲和素功能化的磁性纳米粒子富集并迅速分离、纯化生物素标记 的单链靶基因。在分离富集靶基因后，需要制备与靶基因长度相匹配的长检测探针。首先， 筛选获取含突变型靶基因的细胞，利用DNA吸附柱快速提取DNA，并用NANO-DROP1000型紫 外分光光度计验证。基于UDG介导PCR来获得与目标靶基因长度匹配的长链检测探针技术是 利用UDG能特异性地水解单链或双链DNA上的dUTP这一特性，耦合以突变型基因为模板的 PCR扩增技术，获得与靶基因长度匹配并具有杂交活性的检测探针。将PCR上游引物中dTTP 用dUTP代替，下游引物则标记上荧光基团，PCR反应底物为dATP，dTTP，dCTP和dGTP和高 保真DNA聚合酶；UDG能特异性地识别DNA链上的dUTP部分，并从DNA上有效水解去除dUTP； PCR扩增得到含有dUTP并且末端标记有荧光基团的反应产物，经UDG处理后可获得大量具有 Toehold位点的检测探针。将获得的具有Toehold位点检测探针与磁性纳米粒子修饰的靶基 因在均相溶液中充分反应。突变型靶基因与检测探针能够自发的发生链置换反应；由于野生 型靶基因存在不匹配位点，影响链置换反应的热力学和动力学，故而不能与长链检测探针产 生链置换过程。经过磁性纳米分离富集技术分离后，利用引物上标记的荧光标签，通过荧光 分光光度计或荧光定量PCR仪、荧光显微镜分别对上清液和磁性纳米颗粒表面的荧光信号进 行检测，来实现临床样本中SNPs的准确快速检测。
为了有效的富集单链靶基因，磁性纳米粒子的性质非常重要。因此，我们对磁性纳米粒 子进行了磁滞回曲线测试和电镜表征。从图2-5中可以看到，磁滞回线成S型曲线，而电镜 下的纳米粒子也大小均匀，显示出纳米粒子优越的性能。此外，我们还使用了非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳和Toehold探针对不对称PCR进行了表征。如图6所示，其中当改变引物浓度 比例时，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳出现了清晰的单链靶基因条带。而根据荧光曲线图结果 所示(图7，图8)，我们可以看到荧光信号先经历了指数扩增，后又变为线性增长，这进一步 表明了单链靶基因的生成。随后，我们使用检测技术对与G6PD缺乏症密切相关的1376G>T 突变位点进行了检测。首先，我们在体系中加入了尿素，尿素对反应的影响可从图9-12中看 出，随着尿素浓度的升高，核酸链的Tm值随之降低。尿素的加入限制的增强了探针的特异性。 当我们将富集后的靶基因与探针在反应液中混合后，结果如图13所示，突变型靶基因与检测 探针能够自发的发生链置换反应，荧光信号迅速增高；野生型靶基因存在不匹配位点，影响 链置换反应的热力学和动力学，故而不能与长链检测探针产生链置换过程，故荧光信号增长 缓慢。分析荧光曲线图的结果，便可对样本进行基因分型。
附图说明
图1是UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应检测SNPs的示意图
图2是磁性富集所用磁珠的zeta电位
图3是磁性富集所用磁珠的粒径
图4是磁性富集所用磁珠的磁滞回线
图5是磁性富集所用磁珠的电镜扫描图
图6是不对称PCR的聚丙烯酰胺凝胶电泳表征图
图7是taqman探针对不对称PCR的表征
图8是双链引物探针对不对称PCR的表征
图9是2M尿素下，探针对1376G>T突变位点的识别效率
图10是2M尿素不同时间下，探针对1376G>T突变位点的识别效率
图11是探针在不同浓度尿素下的熔解曲线
图12是探针在不同浓度尿素下的熔解温度线性图谱
图13是检测方法对G6PD1376突变反应的反应效果
具体实施方式
基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术，按以下步骤操作：
(1)、磁性纳米粒子的制备取一定量的六水合氯化铁和七水硫酸亚铁，将其溶解于除氧 的超纯水(18.2MΩcm，25℃)中，混合均匀形成Fe3+:Fe2+摩尔比为1.75:1的反应液；在连续搅拌及N2保护下，缓慢滴加适量的氨水溶液(NH3-H2O，28.0％～30.0％)直到最终PH 接近10，反应液由原来的橙红色变为黑色，然后升温至80℃再孵育30min；反应结束后，黑 色沉淀物用磁铁分离，然后用超纯水和无水乙醇交替洗涤5次，最后得到Fe3O4固体，于80℃ 的真空烘箱中干燥至恒重，密封保存以备后续使用。
(2)、磁珠联合不对称PCR富集单链靶基因使用Primer-BLAST根据不对称PCR的原则 设计引物，并将上游引物的5`端用生物素标记；按照PCR Master Mix 10μl、模板1μl、上下游引物各1μl(浓度比为5:1)，用ddH20补充至20μl配制反应体系；按下列条件进行PCR：步骤一，95℃预变性30s；步骤二，95℃10s，60℃30s，重复步骤二39次；将PCR产物 与0.5mg标记有链霉亲和素的磁珠混合，孵育5min；5min后，通过施加外部磁场分离磁珠， 然后用洗涤缓冲液洗涤，以去除蛋白质和盐污染，最终将单链靶基因富集在纳米磁珠表面。
(3)、UDG介导PCR获得与靶基因长度匹配的长链检测探针利筛选获取含不同基因型 靶基因的细胞，利用DNA吸附柱快速提取DNA，并用NANO-DROP1000型紫外分光光度计 验证；将PCR上游引物中dTTP用dUTP代替，下游引物则标记上荧光基团(FAM)，PCR 反应底物为dATP，dTTP，dCTP和dGTP和高保真DNA聚合酶；按照普通PCR的反应条件， 进行扩增反应；PCR产物与1U的UDG酶在Reaction buffer(200mM Tris-HCl、pH 8.2、10 mM EDTA、100nM Nacl)中混合,50℃孵育5min；5min后，产物按照1:5的比例与上样 缓冲液混合，进行12％的非变性PAGE分析，并通过切胶仪切下切下相应的产物条带；使用 EZ-10柱式DNA纯化试剂盒(生工，中国)进行纯化，最终获得纯化后的长链检测探针。 (4)、通过链置换反应检测SNPs将获得的具有Toehold位点的长检测探针与富集有单链 靶基因的磁性纳米粒子在均相溶液中充分反应；经过磁性分离后，通过荧光分光光度计对上 清液的荧光信号进行检测，从而实现临床样本中SNPs的准确快速检测。

Claims (4)

1.一种基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术，其方法包括以下步骤：
(1)、磁性纳米粒子的制备 取一定量的六水合氯化铁和七水硫酸亚铁，将其溶解于除氧的超纯水(18.2MΩcm，25℃)中，混合均匀形成Fe3+:Fe2+摩尔比为1.75:1的反应液；在连续搅拌及N2保护下，缓慢滴加适量的氨水溶液(NH3-H2O，28.0％～30.0％)直到最终PH接近10，反应液由原来的橙红色变为黑色，然后升温至80℃再孵育30min；反应结束后，黑色沉淀物用磁铁分离，然后用超纯水和无水乙醇交替洗涤5次，最后得到Fe3O4固体，于80℃的真空烘箱中干燥至恒重，密封保存以备后续使用。
(2)、磁珠联合不对称PCR富集单链靶基因 使用Primer-BLAST根据不对称PCR的原则设计引物，并将上游引物的5`端用生物素标记；按照PCR Master Mix 10μl、模板1μl、上下游引物各1μl(浓度比为5:1)，用ddH20补充至20μl配制反应体系；按下列条件进行PCR：步骤一，95℃预变性30s；步骤二，95℃ 10s，60℃ 30s，重复步骤二39次；将PCR产物与0.5mg标记有链霉亲和素的磁珠混合，孵育5min；5min后，通过施加外部磁场分离磁珠，然后用洗涤缓冲液洗涤，以去除蛋白质和盐污染，最终将单链靶基因富集在纳米磁珠表面。
(3)、UDG介导PCR获得与靶基因长度匹配的长链检测探针 利筛选获取含不同基因型靶基因的细胞，利用DNA吸附柱快速提取DNA，并用NANO-DROP1000型紫外分光光度计验证；将PCR上游引物中dTTP用dUTP代替，下游引物则标记上荧光基团(FAM)，PCR反应底物为dATP，dTTP，dCTP和dGTP和高保真DNA聚合酶；按照普通PCR的反应条件，进行扩增反应；PCR产物与1U的UDG酶在Reaction buffer(200mM Tris-HCl、pH 8.2、10mM EDTA、100nM Nacl)中混合,50℃孵育5min；5min后，产物按照1:5的比例与上样缓冲液混合，进行12％的非变性PAGE分析，并通过切胶仪切下切下相应的产物条带；使用EZ-10柱式DNA纯化试剂盒(生工，中国)进行纯化，最终获得纯化后的长链检测探针。
(4)、通过链置换反应检测SNPs将获得的具有Toehold位点的长检测探针与富集有单链靶基因的磁性纳米粒子在均相溶液中充分反应；经过磁性分离后，通过荧光分光光度计对上清液的荧光信号进行检测，从而实现临床样本中SNPs的准确快速检测。
2.如权利要求1所述的基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术，其方法步骤(2)中不对称PCR所用的上下游引物的比例可为5:1、10:1、20:1。
3.如权利要求1所述的基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术，其方法步骤(3)中进行UDG介导PCR时，要注意聚合酶的选择，这里使用的是Taq DNA聚合酶；从古细菌属分离出的DNA聚合酶，例如pfu DNA聚合酶，会抑制反应的进行。
4.如权利要求1所述的基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术，其制备方法步骤(4)中所用的缓冲液为1×TEM buffer(溶液含有10mmol/L Tris-HCl，11.5mmol/L Mg2+，pH 8.0)，反应温度为25℃。
CN202011168590.0A 2020-10-27 2020-10-27 基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术 Pending CN114480592A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011168590.0A CN114480592A (zh) 2020-10-27 2020-10-27 基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011168590.0A CN114480592A (zh) 2020-10-27 2020-10-27 基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114480592A true CN114480592A (zh) 2022-05-13

Family

ID=81490939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011168590.0A Pending CN114480592A (zh) 2020-10-27 2020-10-27 基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480592A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117417994A (zh) * 2023-12-17 2024-01-19 广州嘉检医学检测有限公司 一种文库污染检测试剂盒及检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102428191A (zh) * 2009-03-18 2012-04-25 塞昆纳姆股份有限公司 热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用
CN105705659A (zh) * 2013-08-28 2016-06-22 赛卢拉研究公司 大规模平行单细胞分析
CN109415761A (zh) * 2016-04-25 2019-03-01 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102428191A (zh) * 2009-03-18 2012-04-25 塞昆纳姆股份有限公司 热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用
CN105705659A (zh) * 2013-08-28 2016-06-22 赛卢拉研究公司 大规模平行单细胞分析
CN109415761A (zh) * 2016-04-25 2019-03-01 哈佛学院董事及会员团体 用于原位分子检测的杂交链反应方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHANG ZHANG等: "Toehold-mediated nonenzymatic DNA strand displacement coupling UDG mediated PCR and multi-code magnetic beads for DNA genotyping", MICROCHEMICAL JOURNAL *
张章: "基于核酸链置换反应的核酸生物传感检测方法研究", 中国博士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117417994A (zh) * 2023-12-17 2024-01-19 广州嘉检医学检测有限公司 一种文库污染检测试剂盒及检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dunbar Applications of Luminex® xMAP™ technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection
US11035012B2 (en) Capture probes immobilizable via L-nucleotide tail
WO2006102309A2 (en) Methods, compositions, and kits for detection of micro rna
CN108220399B (zh) 一种基于通用探针技术的荧光定量pcr方法
CN107760772A (zh) 用于核酸配对末端测序的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒
CN106554955A (zh) 构建pkhd1基因突变的测序文库的方法和试剂盒及其用途
CN114480592A (zh) 基于UDG介导PCR、磁性纳米富集和链置换反应的SNPs检测技术
Feng et al. High-sensitive electrochemical detection of point mutation based on polymerization-induced enzymatic amplification
CN113186257A (zh) 一种基于液态芯片技术的pcr扩增后恒温杂交方法
CN108676799A (zh) 基于编码悬浮微芯片的级联扩增检测miRNAs的探针、试剂盒及方法
CN110241175B (zh) 一种Tet2序列偏好性的研究方法
TWI771847B (zh) 擴增和確定目標核苷酸序列的方法
CN113150769B (zh) 一种多荧光核酸探针的制备方法及其应用
CN114875180A (zh) 一种用于SARS-CoV-2检测的DNA步行器及其制备方法
CN114875178A (zh) 一种基于杂交链式反应的SARS-CoV-2检测体系及检测方法
CN105779570B (zh) 一种检测snp位点的方法
CN102559856A (zh) 去除测序文库中的载体片段的方法
CA3141738A1 (en) Method of digital multiplex detection and/or quantification of biomolecules and use thereof
WO2013085026A1 (ja) 塩基変異の検出方法及び検出用キット
CN104928349B (zh) 一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法
Liu et al. Gene point mutation information translation and detection: Leveraging single base extension and CRISPR/Cas12a
CN105400877B (zh) 一种基于免疫酶联反应的基因组snp位点检测方法
Liu et al. PCR amplification on magnetic nanoparticles: Application for high‐throughput single nucleotide polymorphism genotyping
CN105603055B (zh) 多重聚合酶链式反应方法及其应用
CN116042928B (zh) 用于扩增和检测消化道病毒核酸序列的引物组

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination