JP2007537751A - 特定の核酸を同時に増幅する方法 - Google Patents

Abstract

増幅アーティファクトを最小限にする複数の標的配列を増殖する方法を提供する。各フラグメントが少なくとも１つの定められた末端配列を有する標的配列を含むようにフラグメントを断片化する。プライマーペアモチーフ及び標的配列を含んでいるフラグメントの定められた配列に相補的な１つ又は２つの突出末端を全て含むセレクター構築物をフラグメントに接触させる。結合のあと、選択された標的配列はセレクターに共通するプライマーペアモチーフに特異的なプライマーペアを用いて同時に増幅させる。
【選択図】図２

Description

発明の分野

本発明は、従来法において見られる増幅アーティファクトを生成せずに、同時に複数の特定の核酸を増幅するためのＰＣＲ法に関する。本発明は増幅生成物の解析にも関係する。

ヒトゲノムの解明に改革をもたらした技術の中でＰＣＲは最も貢献した技術である。今日、ヒトゲノムの配列を同定するための方法の大部分はＰＣＲを用いた標的配列の増幅を含む。

ＰＣＲの重要な問題は、多数の特定のＤＮＡ配列が同じ反応管の中で同時に増幅されるときに、不要な増幅生成物が生じることである。マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲ中の望まれない増幅生成物は、添加されたプライマーペアの数に関係し、それに応じて増加する。プライマーの設計に十分な注意を払ったとしても、ＰＣＲは通常、１０回の増幅反を行うと以降、応不正確な増幅生成物が生成する。それゆえ、多くの核酸配列の同定および解析を含む研究のためには、多くの分離したＰＣＲを行わなければならなかった。

今日、ＰＲＣを行うには、通常、約２時間を要し、ある程度の量の標的物質を必要とする。多くのＰＣＲを行う研究において、評価のために、多くの時間及び、高い費用、標的ＤＮＡを多く収集することを必要していた。

従来のマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲに関係する問題を克服するための多くの方法が開発されてきたが、十分に成功を伴うものは存在しない。

国際公開公報第９６／４１０１２号は、２回の増幅を伴い、各３’末端におけるテンプレート特異配列と各５’末端におけるユニバーサルプライマー配列を含むプライマーペアを用いるマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｒｅｘ）ＰＣＲの方法を開示していた。増幅の第一反応は、特定のプライマー配列を用い、第二反応はユニバーサルプライマー配列を用いた。

ＤＯＰ−ＰＣＲ（変性オリゴヌクレオチドプライムＰＣＲ）は、変性されたプライマーを使用することによりいくつかの異なる生成物を生産するために設計されたＰＣＲの一形態である（チャン等（Ｚａｎｇ， ｅｔ ａｌ．）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）８９巻，Ｐ．５８４７−５８５１、１９９２年；チャン及びネルソン（Ｃｈｅｕｎｇ ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ）著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ）９３巻，Ｐ．１４６７６−１４６７９、１９９６年）。この方法は、主に「全ゲノム増幅」のために用いるものであり、同時に増幅される多数の標的を選択的に選ぶ手段を欠いている。

更に、アダプターリゲーションＰＣＲ（ａｄａｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｉｏｎ ＰＣＲ）と言われる多くのＤＮＡを増幅する方法が異なる方式で開発されてきた。ブルー等（Ｂｒｏｕｔｅ， ｅｔ ａｌ．）による米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ）９８巻，Ｐ．２０６−２１１、２００１年）には各標的に対する一の特異的プライマーと一の共通のプライマーとを用いたアプローチが開示されている。ケネディー等（Ｋｅｎｎｅｄｙ，ｅｔ ａｌ．）（ネイチャーバイオレクノロジー（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）２１巻，Ｐ．１２３３−１２３７、２００３年）は、消化された全ゲノムサンプルにおいてアダプター連結反応を用いたフラグメントの選択、及び複雑性を低減する（ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）ための方法を開示した。この消化されたサンプルへのアダプターの結合のあとに特定のサイズを増幅するためのＰＣＲを行う。これら全ての方法は、多くの特定のフラグメントを増幅すると、必ず、多くの不要なＤＮＡ標的が増幅する点において共通する。

カロウ（Ｃａｌｌｏｗ， ｅｔ ａｌ．）（核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）３２巻、Ｅ２１、２００３年）はタイプＩＩ制限酵素切断の工程を含む標的の特異的選択と同時にアダプター−リゲーションＰＣＲを使用するための技術を開示した。この方法は同時に大きなセットの特定の標的を増幅するため能力を欠いており、それゆえ、適用に制限があった。

この方法は、ゲノムを３２７６８のオーバーハング変異体（非方向性）へフラグメント化するために消化されたゲノムＤＮＡの５’−オーバーハングである４塩基を生産することができるタイプＩＩ制限酵素を用いる。自己のダブルサイドアダプターへのハイブリダイゼーションおよび結合が生じてしまうと、あらゆるタイプＩＩ制限酵素について８８％の成功率を生じることから、全１６パリンドローム４塩基の組み合わせは避けなければならない。他の４塩基のオーバーハングでない１のダブルサイドアダプターのハイブリダイゼーションおよび結合を避けるために、他のアダプターのオーバーハングに相補的な組み合わせを用いることができる。このような制限が存在することにより、増幅する標的の数の増加に対して適切なアダプターを検出することが困難となる。

選択の１例として、ヒトＤＮＡからの１０フラグメントのランダムセットが同時に増幅するために選択された場合、全てに対応しているアダプターを見つける可能性はたった５０％である。または、より悪い場合には、５０フラグメントのランダムセットは、同時に増幅するために選択されたときには５０フラグメント全てを選択する対応するアダプターのプールを見つけるチャンスはほとんど無い（２．２×１０^−９％）。ヒトゲノムのような複雑なＤＮＡサンプルにおける全てのフラグメントを選択するために４塩基の組み合わせのみを用いる、この制限は、特定の標的の大きなセットの同時増幅のための方法とはなり得ない。この方法はゲノムのサブセットの増幅および少数の標的の増幅に用いることはできるが、不要なＤＮＡを増幅せずに、特定の標的を多量に増幅するような自由性を欠いている。

国際公開第０３／０１２１１９号および国際公開第０３／０４４２２９号は、ローリング環状増幅と呼ばれる、ゲノムフラグメントを環状化し、それらを増幅する方法を開示した。これらの２の刊行物は選択されたフラグメントのＰＣＲ増幅を開示しておらず、セレクターの設計に関する記載を含んでいない。

したがって、増幅アーティファクトを生成せずに、同一反応で複数の特定のＤＮＡ配列を増幅する方法に対する必要性がいまだ存在する。

本発明は、多数の特定の核酸配列のマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＤＮＡ増幅反応において不要な増幅生成物を減らす新規な方法を導入することにより、これらの要求を満たし、より少ない反応生成物を生じ、それゆえ少数の標的物質を使用する方法を提供する。他の側面において、本発明は同時に増幅されるべきＤＮＡの複合サンプルから複数の所望の核酸配列を選択する方法を提供する。

本発明は、標的特異的オリゴヌクレオチド構築物である「セレクター」の特定の標的核酸配列へのハイブリダイゼーションおよび連結に基づく。このセレクターは全て一般的なプライマーペアモチーフである共通の配列を含む。すべての特異的に結合された配列は１または少数のプライマーペアを用いたマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）方式において増幅することができる。

本発明の第一の側面はセレクター構築物である。

本発明の第二の側面において、本発明は請求項１において定義する方法を提供する。

第一の工程において、サンプル核酸は、セレクターに結合させることができるフィッティング末端を生成するために、任意のあらかじめ決められた位置で切断される。このステップは制限酵素の１またはプールをサンプルに付加することにより行うことが好ましい。

次のステップにおいて核酸が二本鎖であれば消化した核酸を１本鎖に変性する。

次のステップにおいてセレクターを個々の標的配列末端へハイブリダイズ及び連結させる。

最後のステップにおいて、新しく形成された分子（対応しているセレクターに結合している選択された標的）を１つの共通プライマーペアを用いて同じ反応管の中で同時に増幅する。

増幅反応の後、この生成物は、ＤＮＡマイクロアレイ、ゲル電気泳動またはマススペクトロメトリー等の、当分野で知られている核酸解析方法を用いて解析することができる。

本発明の好ましい態様において、核酸サンプルはＤＮＡサンプルである。

本発明の第三の側面は本発明の方法を実行するための試薬のキットに関係する。

本発明の第４の側面は、本発明の方法に用いるためのセレクターの設計と制限酵素の選択の方法である。

本発明の態様を示し、以下の記載と共に本発明の説明するために図面を添付する。

図１は本発明の方法の第一工程を示す。制限酵素の１つまたはプールを用いてゲノムＤＮＡを消化することにより、定められた末端を有するフラグメントが生成する。消化されたフラグメントを１本鎖ＤＮＡへと変性し、設計されたセレクターと混合する。各セレクターは、お互いにハイブリダイズしている長および短の２のオリゴヌクレオチドからなる。一方は１又は２の標的特異末端と少なくとも１のプライマーモチーフとを含み、より短い他方は少なくとも１のプライマーモチーフを含む。

図２は次なる工程を説明する。セレクターは選択され消化された１本鎖ＤＮＡ（ＳＳＤＮＡ）である標的の各末端に連結される。この工程は、以下のＡ、Ｂ、及びＣのような別の方法で行うこともできる。Ａ．セレクターを直鎖の消化された１本鎖標的に結合する。Ｂ．環状ＤＮＡ分子を形成するために１のセレクターを１の選択された１本鎖標的の両末端に結合する。Ｃ．セレクターの１の末端を１本鎖選択標的の１の末端に結合し、他の末端を標的の内部にハイブリダイズさせる。この構築物をエンドヌクレアーゼ分解活性を有する酵素の添加により切断し、連結反応によりセレクターに結合するのに適した標的の両末端を作る。

図３はセレクターの標的への各結合を同時に行うことができ、共通のプライマーペアを用いてマルチプレックスＰＣＲにおいて増幅することができる、本手段のスキームの例を示す。

図４および図５は実施例１の実験の結果を示す。

以下の方法の説明において、セレクター／標的分子の増幅はＰＣＲにより例証されるが、他の増幅方法も度同様に用いることができる。増幅される各テンプレートに対するプライマーペアを用いて同時に多くのテンプレートを増幅する方法と比較して、有利なことに、本明細書で開示される発明は同時に行われる核酸増幅の性能が改善されている。このような従来のＰＣＲは所望の増幅された標的の解析を阻害する増幅アーティファクトを生成することが当業者に知られている。

本発明の目的のために、以下の語句を以下のように定義する。

「セレクター構築物」または「セレクター」は標的の特異なオリゴヌクレオチド構築物である。本明細書のセレクターは１つまたは２つの標的特異的末端と少なくとも１つのプライマーモチーフとを有する１の長いオリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つのプライマーモチーフを含む１つの短いオリゴヌクレオチドである、２の部分的にハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドを意味する。この長いオリゴヌクレオチドオおよび短いオリゴヌクレオチドはそれぞれ独立してＤＡＮ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたは任意の他の合成核酸誘導体であってもよい。好ましくは、両ヌクレオチドはＤＮＡである。

「プライマーモチーフ」の語はＰＣＲ反応におけるプライマーハイブリダイゼーションに適したセグメントを含む核酸配列である。その様なプライマーモチーフは当業者に知られており、任意のその様なモチーフを本発明に用いることができる。

「定められた末端配列（ｄｅｆｉｎｅｄ ｅｎｄ）」は、核酸分野の当業者に知られているあらゆる核酸の５’または３’末端を意味する。通常、この定められた末端配列は、少なくとも１の制限酵素または制限酵素のプールを用いて核酸サンプルを処理することにより得られる。同様に、「定められた内部配列」の語は核酸分野の当業者に知られている核酸の内部配列である。

「標的」、「標的配列」または「標的核酸配列」の語は、サンプル由来の増幅されるサブシークエンスである。核酸サンプルはいくつかの標的配列を含む。例えば、実施例１の核酸配列サンプルは９６個の標的配列を含むが、数百個またはそれ以上の標的配列を含むサンプルもある。

「同時」増幅の語は、通常、同じ反応管内で、同時に起こる複数の増幅反応を意味する。マルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲは同時増幅のバリエーションの一つである。

本発明の第一の側面はセレクター構築物自体である。

通常、セレクターの中の長いオリゴヌクレオチドは、１つまたは２つの標的に特異的な末端及び少なくとも１のプライマーモチーフを含んでいる。各標的に特異的な末端は、通常、５乃至５０ヌクレオチド長であり、好ましくは１０乃至２０ヌクレオチドであり、プライマーモチーフは通常１０乃至５０ヌクレオチド長であり、好ましくは３０乃至４０ヌクレオチドである。

セレクター中の短いオリゴヌクレオチドは通常１０乃至５０ヌクレオチド長、好ましくは３０乃至４０ヌクレオチドであり、少なくとも１つのプライマーモチーフをそれぞれに含んでいる。この短いオリゴヌクレオチドは長いオリゴヌクレオチドの中のプライマーモチーフに相補的である。

セレクターの突出末端は選択された標的核酸へ特異的にハイブリダイズするように設計されている。ハイブリダゼーションの後、セレクター及び標的核酸は連結反応により共有結合的に結合される。多くの個々の設計されたセレクターのそれぞれ特異的な標的配列へのハイブリダイズ及び連結は同時に行うことができる。もしセレクターが不完全にハイブリダイズしても、すなわち、セレクターの末端が標的核酸に正しくハイブリダイズしない場合は、連結イベントが起こらないので、続くＰＣＲにおいて増幅生成物が生成しない。

本発明の第二の側面に関する方法は、増幅および評価しようとする配列を含むフラグメントへＤＮＡサンプルを切断する工程を含む。サンプルＤＮＡはセレクターに結合させることができるように定められた末端配列を生成するために、制限酵素の１またはプールを添加して好ましくは切断することが好ましい。消化されたＤＮＡサンプルを、その後１本鎖ＤＮＡへ変性し、セレクターの標的特異末端へのハイブリダイズによる選択のために調製される。この工程は異なる方法で行うことができる。Ａ）選択された１本鎖標的の各末端にセレクターを特異的にハイブリダイズさせ、連結する（図２Ａ）。Ｂ）環状分子を形成するために、選択された１本鎖標的を、各標的の両末端に結合する１のセレクターをハイブリダイズし連結する（図２Ｂ）。Ｃ）セレクターの１の特定の末端を標的の３’末端に結合し、およびセレクターの他の末端を標的の内部配列にハイブリダイズさせる。標的の突出５’アームは、リミアキヴ等（Ｌｙｍｉａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，）（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２６０巻、Ｐ．７７８−７８３、１９９３年）に記載の方法により、ハイブリダイゼーション二重（ｄｕｐｌｅｘ）ポジションにおいて、内部ヌクレオチド分解酵素により切断する。セレクターの両端は環状分子を形成するために、選択された一本鎖標的に結合する（図２Ｃ）。この前駆体を用いて、制限酵素の認識配列の存在による制限なしに、標的の５’末端を選択することができる。この工程も所望の配列のみを含み、且つ構築物及び定められた配列を有する構築物を生成することができる。幾つかの適用のためには均一な長さの増幅フラグメントを生成することが好ましく、また、他の製品のためには、フラグメントの同定のためにフラグメントの長さを用いる場合、又は、各フラグメントからの全ての関係する情報が増幅生成物に含まれていることを確認する場合には、均一でない長さのフラグメントを生成することが有利である。

上の側面は、ＤＮＡを用いて説明される。しかし、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡを用いても行われる。ＤＮＡはｃＤＮＡでもよく、ゲノムＤＮＡ又は他の起源由来のＤＮＡでもよい。

選択された１本鎖標的に対するセレクターの結合は酵素的連結反応により行うことが好ましい。

環状のセレクター／標的構築物が生成されると、残りのＤＮＡフラグメントを除去するためにヌクレオチド分解酵素を用いることが可能であり、したがって、このフラグメントから非特異的増幅生成物が生じるリスクを減らすことができる。

さらにこの側面において、本発明は選択された標的のマルチプレックスＰＣＲを提供する。選択された標的は同じプライマーモチーフを持つ（選択手順により選択された）１つ又は２つのセレクターを含み、１つのジェネラルプライマーのみを用いたマルチプレックスＰＣＲに用いることができる。これは、セレクターに結合した標的のみが増幅されることになり、かつ、セレクターに結合した全ての標的が、幾つかのプライマーペアを用いた従来のマルチプレックスＰＣＲにおいて生成していたあらゆる増幅アーティファクトを生成することなく増幅される。

この側面の１つの態様において、セレクターは幾つかのサブセットに分けられる。これらのサブセットの各々は独特のプライマーペアモチーフを有する。従って、異なるプライマーペアモチーフは異なる標的配列に用いられる。

ＰＣＲは好ましい増幅方法であるけれども、他の方法を用いることも可能である。これらの方法は、例えば、リザルディ他（Ｌｉｚａｒｄｉ ｅｔ ａｌ.） （Ｌｉｚａｒｄｉ, Ｐ.Ｍ.、 Ｈｕａｎｇ, Ｘ.、Ｚｈｕ, Ｚ.,Ｂｒａｙ-Ｗａｒｄ, Ｐ.、Ｔｈｏｍａｓ, Ｄ.Ｃ. ＆ Ｗａｒｄ, Ｄ.Ｃ.、ネイチャージェネティクス（Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ）１９巻、Ｐ．２２５−３２. １９９８年）が開示したＨＲＣＡ（Ｈｙｐｅｒｂｒａｎｃｈｅｄ ｒｏｌｌｉｎｇ−ｃｉｒｃｌｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ及びＳＤＡ（ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ Ｕ.）トレンドジェネティクス（Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ）９巻, Ｐ．１９９-２０４（１９９３年））を含む。

各種選択方法に応じて、最適サイズの選択された標的を構築することが可能である。このような性質は本発明の方法を異なる核酸解析方法に適応することを容易ならしめる。

増幅生成物の解析は例えば、ゲル電気泳動、マイクロアレイ技術、ハイブリダイゼーションアッセイ、合成による配列決定、液体クロマトグラフィー、マスクロマトグラフィー等の本発明の技術分野で既知の方法により行われる。

この方法は、例えば、遺伝的変異解析、微生物の同定、発現解析、ゲノムの配列決定、又はＤＮＡコピー数の測定の目的で使用することができる。

例えば、セレクターコンセプトは診断医療の分野において有望な性質を有する。スハウテン等（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ ｅｔ ａｌ.）（核酸リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ）、３０巻,ｅ５７（２００２年））は、例えば染色体の欠失及び複製のような特定の染色体配列におけるコピー数の変化を検出するための、多重結合依存プローブ増幅法（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｂｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）（ＭＬＰＡ）を発展させた。この量的解析は電気泳動によるＰＣＲ増幅されたサイズ標識されたＭＬＰＡプローブのセットの分離に基づいている。

ＭＬＰＡプローブのセットの分離の替わりに、セレクター反応から生成された異なるサイズのＰＣＲプローブがサイズ分離手段を用いて分離することができる。セレクターは病原標的を選択するように設計することができ、標的の同時増幅の後に増幅生成物の量的解析を行う。

反応のマルチプレックスの性質により、増幅された生成物は大容量配列決定、ジェノタイピング、ヘパトタイピング、又は比較ゲノムハイブリダイゼーションのような高度な並行分析にも適している。４５４ライフサイエンスにより発展した合成方法による大量並行行配列決定はセレクター技術からの利益を得る大容量配列決定システムの一例である。

本発明の第三の側面は、本発明のマルチプレップＰＣＲを実施するための試薬を含むキットである。このキットは少なくとも増幅する標的に対するセレクターを、別個に、または混合物として含む。このセレクターは特定の制限酵素または制限酵素のプールを用いたときに、所望の標的を選択するように設計されている。このキットは追加的にこれらの制限酵素を含んでいる。

更に、このキットは、上で説明したように、緩衝液、リガーゼ及び／又はポリメラーゼ、チューブのような用具、並びに本発明の第二の側面の方法におけるキットの使用方法に関する取り扱い説明書を含む。

本発明の第四の側面は、セレクターの設計及び制限酵素の選択方法である。好ましくは、核酸サンプルの配列が知られているものが好ましい。セレクターの設計及び制限酵素の選択のための方法は、ｘ）核酸配列の中に、増幅されるべき標的配列に隣接している制限部位を見つける工程と、
ｘｉ）ａ）標的配列を含む一本鎖フラグメントが、標的配列中にのみ見られる２の定められた末端配列を有するような、または、
ｂ）標的配列を含む１本鎖フラグメントが標的配列中に見られる１つの定められた末端及び１つの定められた内部配列を有するようにサンプル配列を切断する制限酵素を選択する工程と、
ｘｉｉ)各セレクターが、ａ）標的配列を含むフラグメントの１つの定められた配列に相補的な１つの定められた末端配列、
ｂ）プライマーモチーフ
ｃ）妥当な場合、標的配列含有フラグメントの他の定められた末端配列または標的配列の定められた内部配列のいずれかに相補的な１つ以上の定められた末端配列、
を含有するように標的配列を含む各フラグメントのためのセレクターを設計する工程とを、含む。

好ましくは、本発明のこの側面は、コンピュータプログラムにおいて実施される。したがって、本発明のこの側面の１つの態様は、本発明の第一の側面に関する方法の特定に態様において使用するための、セレクターの設計及び制限酵素の選択の方法を実施するためのソフトウェアーコード手段を含むコンピュータプログラム製品である。

以下の実施例は、本発明の方法に手順を説明する。このこの実施例は、説明のために参照され、本発明を限定するものではない。

実施例１
実施例１は、９６個の特定の標的核酸に対する９６セレクターのハイブリダイズ及び連結並びに図３に記載の、その後に続く１つのプライマーペアを用いたマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）ＰＣＲを説明する。増幅された生成物はマイクロアレイ及びゲル電気泳動を用いて解析された。プライマーペアの配列及びセレクターに含まれる２つのタイプのオリゴヌクレオチド（長及び短）を表１に記載する。

オリゴヌクレオチド及び設計
セレクター設計のために選択された９６個のｃＤＮＡクローン配列のヒトゲノム配列を解析した。各ｃＤＮＡ配列について、最も高いスコアリングヒットを生じるゲノム配列を標的配列として用いた。この標的配列及び両サイドの配列情報の付加的な７００ヌクレオチドをダウンロードし、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで制限消化を行った。制限フラグメントは、前記ｃＤＮＡに相補的な連続した少なくとも７０ヌクレオチドを含み、かつ、それらが１４０乃至７５０ヌクレオチドの長さである場合、選択に適しているとされた。セレクタープローブは各標的の１の適したフラグメントに対して設計された。このセレクター（長）、５’−リン酸化ベクター（短）、及びプライマー配列を表１に示す。

９６個のフラグメントの環化及び増幅
ゲノムＤＮＡはヒト血液サンプルから抽出された（フレキシゲン（Ｆｌｅｘｉｇｅｎｅ），キアゲン）。Ｉ；１０ＵのＦｓｐ（ファーメンタス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ））及び１０ＵのＨｐｙＣＨ４ Ｖ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｗｅ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））並びにＩＩ；１０ＵのＡｃｕ Ｉ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））及び１０ＵのＣｖｉＡ ＩＩ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））の２つの制限酵素の組み合わせを１０μｇのゲノムＤＮＡ及び０．５μｇのＢＳＡに添加し、ＮＥＢ緩衝液で、総量を５０μｌにした。制限消化は３７℃で１時間行った。１６ｐＭのそれぞれ異なる８７個及び９個のセレクターを含む２つの異なる環状反応物を１μｇのＤＮＡＩ及びＩＩからの制限酵素消化物と混合した。１０ｎＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＮＡＤ、及び３．２ｎＭのベクターオリゴヌクレオチドを補い、２．５ＵのプラチナＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）オリゴヌクレオチド５Ｕのアンプリガーゼ（Ａｍｐｌｉｇａｓｅ）（Ｅｐｏｃｅｎｔｕｒｅ）を用いて、総量２５μｌのＰＣＲ緩衝液（インビトロジェン）の中でこの環化反応を行った。この環化反応は９５℃で１５分間、６０℃で２０分間、インキュベートし５０℃で一晩インキュベーションした。セレクターを含む直鎖を分解して、環化ＤＮＡの濃度を高めるために、１０μｌの環化混合物（０．４μｇ ＤＮＡ）を、５ＵのＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ９．０、３ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２μｇのＢＳＡの混合物に添加し、３７℃で２時間及びその後９５℃で１０分間インキュベーショトした。０．５ＵプラチナタックＤＮＡポリメラーゼ（インビトロジェン）、０．２５ｍＭｄＮＴＰ、０．４μＭＣｙ−３標識前方向及び後ろ方向プライマー及び２ｍＭＭｇＣｌ２を含む、１ＸＰＣＲバッファー（インビチロジェン）へ添加された、４μｌの各エンドヌクレアーゼが処理した環反応物（各８０μｇ ＤＮＡ）を用いて増幅を行った。サイクルは９５℃２分間、その後、５９℃３０秒、５５℃３０秒及び７２℃２０秒を４０サイクル行った。同じ手順をリガーゼなしで行った。

アレイハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡアレイはウプサラ（Ｕｐｐｓａｌａ）大学におけるマイクロアレイコア施設から入手した。アレイはこの施設の製造基準に従って調製された。つまり、７５００のｃＤＮＡクローンを配列確定してる既知のジーンコレクション（Ｓｅｐｕｅｎｃｅ Ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｋｎｏｗｎ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｅｓａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）から得た。クローン挿入は標準手順を用いて調製し、カルテシアン プロシス（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｐｒｏｓｙｓ）５５１０Ａ（カルテシアンテクノロジー）Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））プリンターを用いたウルトラギャップ（Ｕｌｔｒａｇａｐ）スライド（コーニングライフサイエンス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ））上で二重にプリントした。スライドはＵＶ−ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ１８００（ストラタジェン（Ｓｔｒａｔａｅｇｎ））を用いた４５０ｍＪＵＶ−ライトを用いてクロス−リンクさせた。アレイの質を検証するために、Ｃｙ−３標識したランダム９マーをこのアレイの１つにハイブリダイズさせた（オペロン）。２５μｌの増幅反応物を、５５℃一晩で、２５μｌのＭＩＣＲＯＭＡＸハイブリダイゼーションバッファー（ＮＥＷ）を用いてハイブリダイズさせた。このアレイを２分間、０．０２×ＳＳＣ及び０．１％トライトンＸ−１００で洗浄し、０．１ｍＭＮａＣｌ_２で５秒間、トランスファーし、その後、ジーンピックス（ＧｅｎｅＰｉｘ）４０００Ｂ（アキオンインスツルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ））を用いてスキャンした。イメージをジーンピックス（ＧｅｎｅＰｉｘ）Ｐｒｏ５．０（アキオンインスツルメンツ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ））を用いて解析した。シグナルは、局所的なバックグラウンドに対する蛍光が二重スポットの両方に対して基準値を超える場合、陽性であると定義された。この基準値は、陰性であると期待されるスポットの０．５％未満が陽性として得点されるように設定されていた。

この方法の性能は、増幅のための９６個のゲノムフラグメントのセットの公平な選択、及びその後の７５００ヒトｃＤＮＡ配列のアレイへのハイブリダーゼーションによる生成物の解析により評価された。ＵＵ（ウプサラ大学における（Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））のパターン中のアレイの９６ポジションにおけるｃＤＮＡ配列に対応するゲノムの中の標的が選択された。９６個のセレクターの設計における第一の工程は、全ての標的に対して適したフラグメントを生成した制限酵素の組み合わせを見つけるための、ヒトゲノムＤＮＡ配列のｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの制限消化を行うことである。８７個及び９個の適したフラグメントを形成する、酵素を用いた２つの異なる制限酵素の組み合わせが、それぞれ、選択された。全てのセレクタープローブは約１９０ｂｐの増幅生成物を生成するために設計された。このセレクタープローブは標準９６穴プレート合成として得られ、８７個のセレクタープローブを含むプール及び９個のセレクタープローブを含むプールの、２つのプール中で混合された。各プールはその後、２つの別々の環化反応において適切に消化されたゲノムＤＮＡサンプル由来のＤＮＡに結合された。これらはその後、エキソヌクレアーゼ処理、結合、及びユニバーサルＣｙ−３環状プライマーペアを用いたシングルＰＣＲで増幅させた。このＰＣＲ生成物を１．５％アガロースゲル（図４Ａ）上で解析した。このゲル解析は約１９０ｂｐのシャープなバンドを示した。このことは、特異的な増幅が行われたことを示している。このＰＣＲ生成物はその後、７．５ｋのｃＤＮＡマイクロアレイへハイブリダイズさせた（図４Ｂ）。

この方法の再現性を評価するために、５つの異なるＤＮＡサンプルを用いて実験を繰り返した。第一にアレイの質を確認するために、Ｃｙ−３標識されたランダム９マーを同じスポット区画由来のアレイにハイブリダイズさせた。この解析結果は９６個のセレクターの７個の選択されたスポットがｃＤＮＡを欠くことを示した（データ示さず）。このことは、解析可能なスポット数の限界が８９個であることを示している。次にこのサンプルを５つの異なるスライドにハイブリダイズし、基準値が各スライドに対して７６８４個のうちのの３８個（０．５％）のスポットがＵＵパターンの外の陽性と評価された。これらのスポットは不正確な増幅生成物又はミスプリンティング又はクロスハイブリダーゼーションを示す。陽性シグナルを生成する選択されたフラグメントの７９個（８９％）及び７１個（８０％）が５の実験全てにおいて陽性と評価された。７９個の陽性フラグメントの平均シグナル強度を図５に示す。このシグナル強度は、２４％の平均偏差で再現可能であった。

これらの結果から、本方法は、平行して複数の特定の標的を特異的に増幅可能であることが確認された。ゲル解析は更に、検出されたバンドが２００ヌクレオチド長のみであり、これが選択標的のサイズであることから、本方法が選択された配列のみを増幅することが確認された。

図１は本発明の第一の工程を示す。 図２は本発明の第二の工程を示す。 図３は本発明のマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｕｌｅｚ）ＰＣＲの例を示す。 図４は実施例１の実験の結果を示す。 図５は実施例１の実験の結果を示す。

Claims (17)

1. 核酸サンプル中の複数の標的配列を増幅する方法であって、
   ｉｖ）標的配列を含む各フラグメントが少なくとも１つの定められた末端配列を有するフラグメントに、前記核酸サンプルをフラグメント化する工程と、
   ｖ）前記核酸サンプルが二本鎖である場合に、前記核酸サンプルを変性させる工程と、
   ｖｉ）全てのセレクターがプライマーペアモチーフを含み、且つ個々のセレクターが標的配列を含むフラグメントの前記定められた末端配列に相補的な１つまたは２つの突出た末端配列を含む、複数の２本鎖のセレクター構築物と１本鎖フラグメントとを接触させる工程と、
   ｖｉｉ）前記セレクターの末端配列および前記フラグメントをハイブリダイズさせる工程と、
   ｖｉｉｉ）連結応によりセレクターとフラグメントを結合する工程と、
   ｉｘ）前記セレクターに共通なプライマーペアモチーフに特異的なプライマーペアを用いて前記選択された標的配列を同時に増幅する工程、とを含むことを特徴とする方法。
2. 前記全てのセレクターの共通するプライマーモチーフを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記標的配列のＤＮＡをフラグメント化する工程が少なくとも１の制限酵素を用いて行われることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 前記増幅する工程がＰＣＲで行われることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１請求項に記載の方法。
5. 前記セレクターが２の部分的にハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドを含み、前記２つの部分にハイブリダイズしているオリゴヌクレオチドが標的含有フラグメントの１または２の末端に対して特異的な１または２の末端と少なくとも１のプライマーモチーフとを有する１つの長いオリゴヌクレオチド、及び少なくとも１つのプライマーモチーフを含む１の短い相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１請求項に記載の方法。
6. 選択された一本鎖標的の１つの末端へ２つのセレクターをハイブリダイズさせ、及び結合することを特徴とする請求項１乃至５に記載のいずれか１請求項に記載の方法。
7. 少なくとも１つのセレクターの長いオリゴヌクレオチドが標的含有核酸フラグメントの定められた末端配列に相補的な１つの末端と同じ標的含有核酸フラグメントにおける内部配列に相補的な１の末端とを有することを特徴とする請求項５に記載の方法。
8. ハイブリダイゼーションの後、標的含有核酸フラグメントの突出末端をリゲーションの前にハイブリダイゼーション２重（ｄｕｐｌｅｘ）ポジションにおいて、ＦＬＡＰエンドヌクレオチド分解酵素により切断することを特徴とする請求項７に記載の方法。
9. 環状分子を形成するために、選択された一本鎖標的を、標的細胞の両末端に結合している１つのセレクターに結合することを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１請求項に記載の方法。
10. セレクター／標的の環状化および結合の後、残った直鎖ＤＮＡフラグメントを酵素的消化により除去することを特徴とする請求項７乃至９に記載の方法。
11. ゲル電気泳動、ハイブリダイゼーションアレイ、合成による配列決定、液体クロマトグラフィーおよび／またはマススペクトロメトリーを用いて生成された増幅生成物を解析する工程を更に含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１請求項に記載の方法。
12. 遺伝的変異、微生物の同定、発現解析、ゲノムの配列決定および／またはＤＮＡコピー数の測定のために、請求項１乃至１１のいずれか１請求項に記載の方法を使用する方法。
13. 全てのセレクターが共通のＰＣＲプライマーペアモチーフを含み、各セレクターがＤＮＡの定められた末端配列に相補的な１または２の突出末端配列を含むことを特徴とするセレクター構築物の複数を含むキット。
14. 請求項１乃至１０のいずれか１請求項に記載の方法を行うための使用説明書、及び少なくとも１の制限酵素、リガーゼまたはポリメラーゼを更に含む請求項１３に記載のキット。
15. 請求項１乃至１１のいずれか１請求項に記載の方法を実施するために請求項１３または１４に記載のキットを使用する方法。
16. 請求項１に記載の方法において用いるためのセレクター構築物を設計し、制限酵素を選択する方法であって、
    ｘ）核酸配列の中に、増幅されるべき標的配列に隣接している制限部位を見つける工程と、
    ｘｉ）ａ）標的配列を含む一本鎖フラグメントが、標的配列中にのみ見られる２つの定められた末端配列を有するような、または、
    ｂ）標的配列を含む１本鎖フラグメントが標的配列中に見られる１つの定められた末端及び１つの定められた内部配列を有するようにサンプル配列を切断する制限酵素を選択する工程と、
    ｘｉｉ）各セレクターが、
    ａ）標的配列を含むフラグメントの１の定められた配列に相補的な１の定められた末端配列、
    ｂ）プライマーモチーフ
    ｃ）妥当な場合、標的配列含有フラグメントの他の定められた末端配列または標的配列の定められた内部配列のいずれかに相補的な１以上の定められた末端配列、
    を含有するように標的配列を含む各フラグメントのためのセレクターを設計する工程とを、含む方法。
17. 請求項１６の方法を実施するためのソフトウェアコード手段を含むコンピュータプログラム製品。

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