JP2004290055A - ターゲットの製造方法、標的配列検出方法、ターゲットおよび標的配列検出用アッセイキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】3’端付近に標的配列を含む標的核酸における前記標的配列の5’端よりも5’側に存在する配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
【選択図】 図2
Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法、これにより製造されたターゲット、これを用いた標的配列検出方法、ターゲット製造用キットおよび標的配列検出用アッセイキットに関する。
【0002】
【従来の技術】
特定の核酸配列を含む核酸鎖を検出するためには一般的に次のような手段が用いられている。例えば、そのような方法は、検出対象である核酸鎖に相補的な1対のプライマーを用いて増幅した後で電気泳動を行ってその存在を検出する方法や、検出対象である標的配列に相補的な核酸鎖を核酸プローブとして固定化した基体を用いて、ハイブリダイゼーションを行う方法である。また、一般的には、これらの検出に用いられるプライマーや核酸プローブは、15塩基程度以上の連続する特異的な配列をもつオリゴヌクレオチドである。しかしながら、そのようなオリゴヌクレオチドを既存のプライマーまたは核酸プローブ設計ソフトなどを利用して設計したとしても、反応系において標的配列に高次構造が存在したり、部分的に類似する配列が存在していたりすることも多く、このような場合、ミスアニーリングやセルフハイブリダイゼーションなどを招くことになる。このような従来の方法では、目的とする標的配列を高精度に効率よく検出することは容易ではない。また、最適な検出条件を設定するためには、多くの時間と費用を費やさなくてはならない。
【0003】
例えば、核酸配列を高感度にかつ効率よく検出する方法としては、これまでのところ、「ハイブリダイゼーション法」(特許文献1を参照されたい)や「部分二重鎖DNAを利用したDNA検出方法」(特許文献2を参照されたい)などが提案されている。これらの方法は、検出すべき標的核酸の一部領域に相補的な配列を含む核酸プローブと当該標的核酸とをハイブリダイズする際、そのハイブリダイゼーション反応の前またはハイブリダイゼーション反応時に、前記核酸プローブの結合部位以外の標的核酸の配列に対して相補的な核酸鎖を添加し、アニ―リングして一部に2本鎖を形成する方法である。これらの方法は、何れも標的核酸の配列上で、核酸プローブが認識する領域を1本鎖に、残りの領域を2本鎖にすることによって非特異的なハイブリダイゼーションを防ぐことを目的としている。
【0004】
しかしながら上記の方法には、実際に使用するには解決されるべき多くの問題点が存在している。そのような問題点の幾つかは以下の通りである。
【0005】
(1)「標的核酸」と「保護鎖」との二種類の分子を1本鎖状態で調製することが必須であるために工程数が多くなってしまうこと;
(2)標的配列の設計が限定されること。非特異的なハイブリダイゼーションを避ける為に、ハイブリダイゼーション反応液中には、核酸プローブ以外の遊離1本鎖核酸分子が出来るだけ存在しないことが望ましい。しかしながら、標的核酸と保護鎖をアニ―リングする際には、長い核酸同士を液体中で分子運動依存的に対合させるために、分子内高次構造などの影響によって理想的なアニ―リングが行われず、ハイブリダイゼーションの効率が著しく低下する場合も多い。これを防止するためには、標的配列の設計が限定されてしまう;
(3)標的核酸作出に多くの時間が掛かること。これは、例えば、保護鎖と標的核酸との間の正確な塩基対形成を行わせる目的から、長い時間をかけてアニーリング反応を行う工程が必須となるためである;
(4)特に、「部分二重鎖DNAを利用したDNA検出方法」(特許文献2を参照されたい)では、非対称PCRを用いて標的鎖と保護鎖とを作出することが必要であること。このため、上記(2)の問題をクリアして定性分析が達成されたとしても、社会的ニーズの高い定量分析には対応できない。
【0006】
【特許文献1】
特開平6−70799号公報
【0007】
【特許文献2】
特開平11−332566号公報
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法、これにより製造されたターゲット、これを用いた標的配列検出方法および標的配列検出用アッセイキットを提供することである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記の課題を解決するために次のような手段を見出した。即ち、
本発明の第1の側面に従うと、標的核酸の3’端付近に位置する標的配列の5’端よりも5’側の配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法;
本発明の第2の側面に従うと、標的核酸の5’端付近に位置する標的配列の3’端よりも3’側の配列に対して相補性を有し、且つ3’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、標的核酸の3’端付近の配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法;
本発明の第3の側面に従うと、第1の標的核酸の3’端付近に位置する第1の標的配列の5’端よりも5’側の配列に対して相補性を有する第1のプライマーと、第1の標的核酸に相補的な第2の標的核酸の5’端付近に位置する第2の標的配列の3’端よりも3’側の配列に対して相補性を有し、3’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、第2の標的核酸の3’端付近の配列に対して相補性を有する第2のプライマーと、伸長活性を有する酵素と、第1および第2の標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法;本発明の第4の側面に従うと、標的核酸の3’端付近に位置する第1の標的配列の5’端よりも5’側の配列に対して相補性を有する第1のプライマーと、前記標的核酸の5’端付近に位置する第2の標的配列の3’端よりも3’側の配列に対して相補性を有し、3’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法;
本発明の第5の側面に従うと、3’端付近の第1の標的配列と、第1の標的配列よりも5’側に存在する第2の標的配列と、第2の標的配列よりも5’側に存在する第3の標的配列と、5’端付近の第4の標的配列とを含む標的核酸における、第1、第2および第3の標的配列の各々の5’端よりも5’側に存在する夫々の配列に対して相補性を有する第1、第2および第3のプライマーと、第2、第3および第4の標的配列の3’端よりも3’側に存在する夫々の配列に対して相補性を有し、3’末端に伸長不可能な修飾を含む第1、第2および第3のストッパー核酸と、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法;
本発明の第6の側面に従うと、(1)標的核酸の3’端付近に位置する標的配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および前記標的配列の5’端よりも5’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第1のプライマーと、前記標的核酸の5’端付近の配列に相同性を有し、5’端に核酸分解酵素耐性核酸を含む第2のプライマーと、伸長活性を有する酵素と、当該標的核酸とその相補鎖からなる2本鎖核酸とを、適切な増幅反応が得られる条件下で反応することと、
(2)前記(1)の反応することにより得られた増幅産物を、前記分解酵素非耐性核酸を分解することの可能な核酸分解酵素によって消化することと、
を具備する1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法;
本発明の第7の側面に従うと、(1)第1の標的核酸の3’端付近に位置する第1の標的配列に相補的であり、且つ核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および第1の標的配列の5’端よりも5’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第1のプライマーと、
第2の標的核酸の3’端付近に位置する第2の標的配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および第2の標的配列の5’端よりも5’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第2のプライマーと、
伸長活性を有する酵素と、当該第1の標的核酸と第2の標的核酸からなる2本鎖核酸とを、適切な増幅反応が得られる条件下で反応することと、
(2)前記(1)の反応することにより得られた増幅産物を、核酸分解酵素により消化することと、
を具備する1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法;
本発明の第8の側面に従うと、(1)請求項1から7の何れか1項に記載の方法を用いてサンプル中の標的核酸を基にターゲットを製造することと、
(2)前記(1)で製造されたターゲットに対して、前記標的配列に相補的な核酸プローブを、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応することと、
(3)前記(2)の反応により生じた結合を検出することにより、標的配列の存在を検出することと、
を具備する標的配列検出方法;
本発明の第9の側面に従うと、上記第1から第7の側面の何れか1に記載の方法により製造されたターゲット;
本発明の第10の側面に従うと、上記第8の側面に記載の検出方法を行うために、プライマー、伸長活性を有する酵素、ストッパー核酸、核酸増幅用酵素、核酸分解酵素および第9の側面に従うターゲットからなる群より少なくとも1選択された構成要素を具備する標的配列検出用アッセイキット;
が提供される。
【0010】
【発明の実施の形態】
1.発明の概要
本発明の態様に従うと、図1に示すような標的核酸1からターゲットを製造する方法が提供される。標的核酸1は、その一部に標的配列2を含む(図1A)。具体的には、本発明の方法に従うと、標的核酸1の標的配列2以外の部分が2本鎖になるように、プライマーを用いて核酸の伸長を行いターゲット4が製造される(図1B)。即ち、本発明に従うターゲット製造方法は、基本的には、標的配列2を含む標的核酸1を鋳型として用いて伸長反応または増幅反応を行うことを具備する方法である。このような本発明の態様に従うターゲット製造方法により製造されたターゲット4も本発明の更なる態様である。また、本発明の態様に従うターゲットを利用して、標的配列の検出を行うことが可能である。そのような検出方法は、例えば、図1Cに示すようにターゲット4の標的配列2に相補的な核酸プローブ5を用い、これを標的配列2に対して反応させ、生じたハイブリダイゼーションを検出することにより、例えば、サンプル中に標的配列が存在すること、または標的配列を含む標的核酸が存在することを検出することが可能である。このような標的配列の検出方法も本発明の範囲内である。
【0011】
2.用語の説明
ここにおいて使用される「サンプル」とは、核酸を含む試料であればよく、ヒトを含む真核生物から採取された組織および細胞、原核生物、ウイルス、ウイロイドなどを含む検体から、必要に応じて抽出、増幅および精製など、それ自身公知の何れかの手段によって調製されればよく、人工合成された核酸分子であってもよい。
【0012】
ここにおいて使用される「標的配列」の語は、検出しようとする1つの連続する配列を指す。「標的核酸」は標的配列を含む核酸を指し、1つの標的核酸には1以上の標的配列が含まれてもよい。ここにおいて使用される「核酸」の語は、DNA、RNA、S−オリゴ、メチルホスホネートオリゴ、PNA(即ち、ペプチド核酸)およびLNA(即ち、ロック核酸)などの核酸および核酸類似体、それらの幾つかを共に含む核酸および核酸類似体、並びにそれらの混合物など、一般的にその一部の構造を塩基配列によって表すことができる物質を総括的に示す語である。また、本発明において用いられる核酸は、天然に存在するものであっても、人工的に合成されたものであっても、またはそれらの混合物であってもよい。ここにおいて使用される「ヌクレオチド」とは、上記のような核酸を構成する1つの塩基に対応する単位をいう。また、「オリゴヌクレオチド」とは、上記のような人工的に合成された核酸断片を指し、「オリゴDNA」はそのうちのDNA断片を指す。
【0013】
本発明における「ターゲット」とは、標的配列とそれに対応する核酸プローブとのハイブリダイゼーションを利用して実行される標的配列の検出方法において、核酸プローブを実際に結合させるために、サンプルに含まれる元の標的核酸を基礎にして調製され製造された製造物を指す。特に、本発明の態様に従うターゲット製造方法により得られたターゲットは、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる。即ち、本発明の方法に従い提供されるターゲットとは、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含む特定の構造を有する核酸である。また、当該ターゲットは、「検出用標的構造核酸」および「標的構造核酸」とも称することも可能である。
【0014】
本発明における「伸長する」および「伸長反応を行う」は同義であり、鋳型である核酸に対して適切な条件下でプライマーと核酸合成酵素を用い、核酸を伸長して鋳型核酸の相補鎖を形成することをいう。また、本発明における「増幅する」および「増幅反応を行う」は同義であり、鋳型である核酸に対して適切な条件下でプライマーと核酸合成酵素を用い、核酸を伸長して鋳型核酸の相補鎖を形成し2本鎖を与えることと、得られた2本鎖を変性あるいは鎖の置換反応などにより1本鎖を与えることと、得られた1本鎖を鋳型として用い、適切な条件下でプライマーと核酸合成酵素を用いて、再度核酸を伸長して鋳型核酸の相補鎖を形成して2本鎖を与えることとを具備する反応を指す。言い換えれば「増幅」とは、1本鎖への変換を前後の伸長反応の間で行いながら2回以上の伸長反応を繰り返し行うことをいう。
【0015】
ここで使用される「適切な伸長が得られる条件」とは、伸長されるべき核酸およびプライマー、伸長活性を有する酵素、伸長時に取り込まれる核酸合成基質並びに伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびpHなどの諸条件が適切に制御され、目的とする核酸が伸長され得る条件をいう。また、ここで使用される「適切な増幅が得られる条件」とは、増幅されるべき核酸およびプライマー、伸長活性を有する酵素、伸長時に取り込まれる核酸合成基質並びに伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびpHなどの諸条件が適切に制御される条件で行われる伸長反応が、少なくとも2回以上繰り返して行われ、目的とする核酸が増幅され得る条件をいう。
【0016】
本発明における「保護鎖」とは、本発明の態様に従うターゲット製造方法において標的核酸を鋳型として形成された核酸であり、標的配列とは異なる部分の標的核酸の配列に相補的な配列である。この保護鎖の存在により、標的配列以外の部位に核酸プローブや他の核酸またはその標的核酸自身などが結合することによる予期せぬ2本鎖または立体構造の形成を防ぐことが可能である。
【0017】
ここにおいて使用される「ハイブリッドを検出する」および「結合を検出する」は同義であり、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で、複数の核酸について反応を行った場合に、その複数の核酸の中に少なくとも1組の相補鎖が存在していれば得られるハイブリッドまたは結合を検出することを示す。例えば、このようなハイブリッドまたは結合は、当該相補鎖の少なくとも何れか1に予め付与した標識物質を検出することにより検出が達成されてもよく、ハイブリッドに存在する結合に対して選択的に結合する挿入剤を利用して検出されてもよい。また、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で複数の核酸について反応を行った場合であっても、その複数の核酸の中に相補鎖が存在していなければハイブリッドは得られない。ここで使用される「適切なハイブリダイゼーションが得られる条件」とは、ある1つの反応系において互いに相補性を有する核酸鎖が存在していれば、反応を行うことによりハイブリダイゼーションが得られる条件をいい、例えば、ストリンジェントな条件であればよい。
【0018】
3.ターゲット製造方法
(I)プライマーの結合位置を調節することにより所望のターゲットを製造する方法
以下の第1の例から第3の例は、3’端付近に標的配列を含む標的核酸を基にしてターゲットを製造する方法である。これらの例は、標的核酸に対するプライマーの結合位置を調節する方法である。
【0019】
(1)第1の例
図2を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第1の例を説明する。標的核酸21は、3’端付近に標的配列22を含む(図2A)。標的核酸21における標的配列22の位置よりも5’側(即ち、標的配列の5’端よりも5’側)の配列に対してプライマー23を結合させ、適切な伸長反応が得られる条件下で核酸を伸長する(図2B)。これによって標的核酸21に相補的な保護鎖24が形成され、2本鎖核酸部分と標的配列を含む1本鎖核酸部分とを有するターゲット25が得られる(図2B)。
【0020】
このような本発明の態様に従う反応により得られたターゲット25は、図2Cに示すように、核酸プローブ26を用いた標的配列の検出に利用することが可能である。標的配列22に対する核酸プローブ26の結合を検出することにより標的配列22または標的核酸21の検出が可能である。
【0021】
ここで使用され得るプライマーは何れの種類の核酸であってもよく、その長さは、実施者が選択したプライマーの配列に特異的なハイブリダイゼーションが得られるために充分な長さがあればよい。例えば、そのような特異的なハイブリダイゼーションが得られる長さの例は、5塩基長以上であればよく、好ましくは9塩基長以上である。
【0022】
ここで使用され得る伸長反応は、プライマー23が、標的核酸21を鋳型として核酸を合成して、保護鎖24を含む2本鎖を形成し得る条件下で行われればよい。そのような条件は、伸長活性を有する酵素と、伸長時に取り込まれる核酸合成基質と、伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびpHなどの諸条件が適切に制御される条件であればよい。本発明において使用され得る酵素は、例えば、5’から3’へ核酸鎖を伸長する活性を有する酵素であればよい。本明細書では「核酸鎖を伸長する活性」を「伸長活性」と略して用いることもある。例えば、核酸合成酵素であればよく、DNAポリメラーゼおよびRNAポリメラーゼなどのポリメラーゼであっても、逆転写酵素であってもよい。また、適切な温度の制御は、ヒーターなどのそれ自身公知の手段により、標的核酸21およびプライマー23の配列や、酵素の種類などを基に実施者により選択された温度に制御されてよい。また、pHの制御は、それ自身公知の手段により塩の種類、その組み合わせおよび濃度などによって制御すればよい。また、伸長反応時に取り込まれる核酸合成基質は、一般的に使用されるそれ自身公知の核酸合成基質類であってよい。詳細な条件は、使用する酵素、配列および核酸の種類などに応じて実施者が選択できるであろう。
【0023】
本発明において使用され得る標的配列22は、実施者が検出しようとする配列であればよく、長さは、5塩基〜300塩基、好ましくは9塩基〜50塩基であればよい。
【0024】
また、本明細書において用いる「3’端付近」とは、標的核酸の最も3’端に位置する塩基から約A番目までの塩基を示し、後述において用いる「5’端付近」とは5’端に位置する塩基から約A番目目までの塩基を示す。例えば、標的配列が3’端付近に存在する場合には、最も3’端に位置する塩基を含んでも、含まなくてもよい。ここで「A」番目とは、問題となる標的配列の塩基数の2分の1の長さである。即ち:
A=(標的配列の塩基数)/2
である。
【0025】
好ましくは、以上のような本発明の態様に従う方法は次のように行ってもよい。即ち、標的核酸の3’端付近に存在する標的配列の5’側に隣接または標的配列よりも5’側に存在する9塩基以上の配列に対して相補的な配列を有する核酸からなるプライマーと、核酸合成酵素とを、当該標的核酸を含むサンプルに対して添加し、標的核酸を鋳型として伸長反応を行う。これにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分を含むターゲットを製造する。
【0026】
ターゲットを製造する場合には、当該サンプルは標的核酸を含むことが必要であるが、必ずしも標的核酸のみを含む必要はなく、他の核酸と共に含まれてもよい。本発明の態様に従う反応を行うためには、サンプルにおける標的核酸の量が、サンプルに含まれる核酸全体の約3%以上、より好ましくは10%以上、更に好ましくは20%以上であることが好ましい。また、必要に応じて、本発明に従う方法に供する前に、それ自身公知の何れかの増幅手段により標的核酸を増幅してもよい。増幅手段の例は、PCR増幅、および Nucleic acid strand amplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids(ICANN)および Rolling circle amplification(RCA)法、Loop mediated amplification (LAMP)法などである。
【0027】
上述のような本発明の態様では、標的核酸におけるプライマーの結合部位により、結果として得られるターゲットの1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分の境界が決定される。当該ターゲットにおいては、標的配列の両側に1本鎖のヌクレオチドが約100塩基まで存在してもよいが、標的配列のみが1本鎖であることが好ましい。
【0028】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で標的配列の設計が自由にでき、且つ短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【0029】
(2)第2の例
図3を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第2の例を説明する。上述した第1の例においては標的核酸が1本鎖であったが、第2の例では、2本鎖の標的核酸が用いられる例を示す。
【0030】
図3を参照されたい。まず、2本鎖の標的核酸31を用意する。標的核酸31は、第1の標的核酸31aと、3’端付近に標的配列32を含む第2の標的核酸31bとを含む(図3A)。
【0031】
適切な伸長が得られる条件下で、標的核酸31に対して、第1のプライマー33aと第2のプライマー33bとを添加して伸長反応を行う(図3BおよびC)。その結果、第1の伸長産物である2本鎖36(図3B)と、第2の伸長産物であるターゲット35が得られる(図3C)。得られたターゲット35は、標的配列32を含む1本鎖核酸部分と、標的配列を含まない第2の標的核酸31bおよび保護鎖34bを含む2本鎖核酸部分とを含む。
【0032】
また、第2の例において適切な伸長が得られる条件とは、標的核酸31に対してプライマー33aおよびbが適切に結合することも具備する。例えば、当該伸長に先駆けてそれ自身公知の変性手段、例えば、熱、アルカリ、および塩の添加などの手段によって2本鎖の標的核酸31を1本鎖に解離されてもよい。
【0033】
以上の本発明の態様に従う第2の例は、標的核酸が2本鎖であること以外は、第1の例と同様に実施することが可能である。また、第2の例において使用され得る反応の条件や、標的核酸、プライマーおよびターゲットについての各条件も、第1の例に従って変更してもよい。
【0034】
当該伸長反応により得られたターゲット35を、核酸プローブ37を用いた標的配列の検出に利用することが可能である(図3D)。例えば、第1の例に記載の方法と同様に、標的配列32に対する核酸プローブ36の結合を検出することによって標的配列の検出が可能である。
【0035】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【0036】
(3)第3の例
図4を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第3の例を説明する。第2の例においては、2本鎖標的核酸31から1つのターゲット35が得られたのに対して、第3の例では2本鎖標的核酸41から2つのターゲット45aおよび45bが得られる。このこと以外は第2の例と同様の手順により第3の例を実施することが可能である。
【0037】
図4を参照されたい。2本鎖の標的核酸41は、3’端付近に第1の標的配列42aを含む第1の標的核酸41aと、3’端付近に第2の標的配列42bを含む第2の標的核酸41bとを含む(図4A)。
【0038】
適切な伸長が得られる条件下で、標的核酸41に対して、第1のプライマー43aと第2のプライマー43bとを添加し、核酸の伸長反応を行う(図4B)。その結果、第1の伸長産物である第1のターゲット45aと、第2の伸長産物である第2のターゲット45bが得られる(図4B)。各々のターゲット45aおよびbは、標的配列42aまたはbを含む1本鎖核酸部分と、標的核酸41aまたはbの一部分およびそれに対して相補的な保護鎖44aまたはbを含む2本鎖核酸部分とを含む。
【0039】
以上のような本発明の態様に従う第3の例は、2本鎖の標的核酸から2つのターゲットが得られること以外は、第2の例の方法と同様に実施することが可能である。従って、第3の例における適切な伸長が得られる条件、その他の第3の例において使用され得る反応の条件、並びに標的核酸、プライマーおよびターゲットについての条件も、上述した第2の例において記載された条件と同様の条件であってよく、また、第2の例と同様に種々の変更を行ってもよい。
【0040】
当該伸長反応により得られたターゲット45aおよび/またはターゲット45bは、核酸プローブ46aおよび/または核酸プローブ46bを用いた標的配列の検出に利用することが可能である(図4C)。例えば、第1の例に記載された方法と同様に、標的配列42aおよび/またはbに対する核酸プローブ46aおよび/またはbの結合を検出することによって標的配列の検出が可能である。
【0041】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。更に、第3の例に従えば、2箇所の標的配列を同時に検出することが可能になる。
【0042】
(II)ストッパー核酸を使用する方法
以下の第4の例から第6の例は、5’端付近に標的配列を含む標的核酸を基にしてターゲットを製造する方法である。
【0043】
(4)第4の例
図5を用いて、本発明の態様に従うターゲットの製造方法の第4の例を説明する。標的核酸51は、標的配列52を5’端付近に含む(図5A)。まず最初に、標的核酸51の3’端付近にプライマー53の結合するための配列を選択する。また、標的核酸51における標的配列52の位置よりも3’側にストッパー核酸55の結合するための配列を選択する。ストッパー核酸55の3’末端は、それ以上3’側に伸長反応が進まないように伸長不可能な修飾がなされている。
【0044】
ストッパー核酸55が、標的核酸51における標的配列52よりも3’側の部位に結合して存在した状態で、標的核酸51の3’端付近の配列に結合するプライマー53を用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で、5’から3’に向けて核酸を伸長する。その結果、保護鎖54が形成される(図5B)。上記の通りストッパー核酸55の3’末端は、それ以上伸長反応を受けないように修飾がなされている。そのため、ストッパー核酸55よりも先には伸長反応は進まない。従って、標的核酸51に含まれる標的配列52は1本鎖のままで維持される。
【0045】
ここで使用され得るプライマー53は、何れの種類の核酸であってもよく、その長さは、実施者が選択したプライマーの配列に特異的なハイブリダイゼーションが得られるために充分な長さがあればよい。例えば、そのような特異的なハイブリダイゼーションが得られる長さの例は、上述の第1の例に記載される通りでよい。
【0046】
ここで使用され得るストッパー核酸は、何れの種類の核酸であってよく、所望する位置の配列に特異的に結合するのに充分な長さがあればよい。例えば、そのような特異的な結合が得られる長さの例は、5塩基長以上であればよく、好ましくは9塩基長以上である。ストッパー核酸の3’末端の修飾は、それ以上3’側に伸長反応が進まないような修飾であれば何れの修飾がなされてもよい。これらに限定されるものではないが、例えば、3’末端のリン酸化およびダイデオキシヌクレオチドの使用などの手段であればよい。また、使用される伸長活性を有する酵素の種類に応じて、それらの修飾の種類が選択されてもよい。図5では、当該修飾の1例としてストッパー核酸55の3’末端がリン酸化された例を示した。図中、当該修飾は丸印に「P」で示す。
【0047】
ここで使用され得る伸長反応は、プライマー53が、標的核酸51を鋳型として核酸の伸長を開始し、保護鎖52を含む2本鎖を形成し得る条件下で行われればよい。そのような条件は、例えば、伸長活性を有する酵素と、伸長時に取り込まれる核酸合成基質類と、伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびpHなどの諸条件が適切に制御される条件であればよい。本発明において使用され得る酵素は、上述した第1の例に記載の通りであってよい。また、適切な温度の制御およびpHの制御も上述した第1の例の記載の通りであってよい。
【0048】
本発明において使用され得る標的配列52は、実施者が検出しようとする配列であればよく、長さは、5塩基〜300塩基、好ましくは9塩基〜50塩基であればよい。また、標的配列52は、標的核酸51の5’端付近に存在するが、5’末端を含む塩基を含んでいても、5’末端を含む塩基を含まなくてもよい。
【0049】
以上のような本発明の態様に従う方法は、好ましくは以下のように行ってもよい。即ち、標的核酸の5’端付近に存在する標的配列の3’側に隣接または標的配列よりも3’側に存在する9塩基以上の配列に対して相補的な配列を有し、且つその3’末端が水酸基(−OH)以外の官能基となるように修飾された核酸であるストッパー核酸と、標的核酸の3’端付近の配列に相補的な核酸であるプライマーと、核酸合成酵素とを、当該標的核酸を含むサンプルに対して添加し、当該標的核酸を鋳型として伸長反応を行う。それにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを具備するターゲットが製造される。
【0050】
また、上述の方法では、当該プライマーに対する伸長反応は、標的配列の検出方法において使用される標的配列に相補的な核酸プローブ配列と同じ極性の保護鎖を合成する。
【0051】
このような本発明の態様に従う反応により得られたターゲット57を、核酸プローブ56を用いた標的配列の検出に利用することが可能である(図5C)。標的配列52に対する核酸プローブ56の結合は、上述した第1の例に記載の手段により行ってよい。
【0052】
上述のような本発明の態様では、標的核酸を鋳型として用い、プライマーとストッパー核酸を用いて核酸を伸長する方法が示された。即ち、ターゲットに含まれる1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分との境界は、伸長反応の停止位置をストッパー核酸の結合する部位を選択することによって制御されることにより決定される。それにより、得られるターゲットは標的核酸上の標的配列の領域が1本鎖であり、他の領域が2本鎖となる。
【0053】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【0054】
(5)第5の例
図6を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第5の例を説明する。上述した第4の例においては標的核酸51が1本鎖であったが、第5の例では、2本鎖の標的核酸を用いる。
【0055】
図6を参照されたい。2本鎖の標的核酸61を用意する。標的核酸61は、5’端付近に標的配列62を含む第1の標的核酸61aと、第2の標的核酸61bとを含む(図6A)。
【0056】
まず最初に、標的核酸61aの3’端付近にプライマー63の結合するための配列を設定する。また、標的核酸61aにおける標的配列62の位置よりも3’側にストッパー核酸65の結合するための配列を設定する。ストッパー核酸65の3’末端は、それ以上3’側に伸長反応が進まないように修飾がなされている。
【0057】
ストッパー核酸65が、標的核酸61aにおける標的配列62の位置よりも3’側の配列に結合して存在する状態で、標的核酸61aの3’端付近の配列に結合するプライマー63aと、標的核酸61bの3’端付近の配列に結合するプライマー63bとを用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で、5’から3’に向けて核酸を伸長する(図6B)。当該伸長により保護鎖64aと64bが形成される。
【0058】
当該伸長反応の後に、第1の標的核酸61aを基に第1の伸長産物であるターゲット67が得られ、第2の標的核酸61bを基に第2の伸長産物である2本鎖68が得られる。
【0059】
第5の例における適切な伸長が得られる条件とは、標的核酸61aおよびbに対して、プライマー63aおよびbが適切に結合することも具備する。例えば、当該伸長に先駆けて、それ自身公知の変性手段、例えば、熱、アルカリ、および塩の添加などの手段により2本鎖の標的核酸61を1本鎖に解離してもよい。
【0060】
以上の態様に従う第5の例は、標的核酸が2本鎖であること以外は、第4の例と同様に実施することが可能である。また、第5の例において使用され得る反応の条件や、標的核酸、ストッパー核酸、プライマーおよびターゲットなどについての条件も、第4の例に従って変更してよい。
【0061】
当該伸長反応により得られたターゲット67を、核酸プローブ69を用いた標的配列の検出に利用することが可能である(図6C)。標的配列62に相補的な核酸プローブ69の当該標的配列62への結合を検出することによって、標的配列の検出が可能である。当該結合の検出は、上述の第1の例と同様の方法により行ってもよい。
【0062】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【0063】
(6)第6の例
図7を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第6の例を説明する。前述の第5の例においては、2本鎖標的核酸61から1つのターゲット67が得られたのに対して、以下に記載する第6の例では、2本鎖標的核酸71に含まれる各々の核酸71aおよび71bから夫々ターゲット76aと76bが得られる。このこと以外は第5の例に記載の方法と同様に第6の例を実施することが可能である。
【0064】
図7を参照されたい。2本鎖の標的核酸71は、5’端付近に第1の標的配列72aを含む第1の標的核酸71aと、5’端付近に第2の標的配列72bを含む第2の標的核酸71bとを含む。
【0065】
まず最初に、標的核酸71aの3’端付近にプライマー73aの結合するための配列を設定する。また、標的核酸71aの標的配列72aよりも3’側にストッパー核酸75aが結合するための配列を設定する。ストッパー核酸75aの3’末端は、それ以上3’側に伸長反応が進まないように修飾されている。同様に、標的核酸71bの3’端付近にプライマー73bの結合するための配列を設定する。また、標的核酸71bの標的配列72bよりも3’側にストッパー核酸75bの結合するための配列を設定する。ストッパー核酸75bの3’末端は、それ以上3’側に伸長反応が進まないように修飾されている。図7では、ストッパー核酸75aおよびbの3’末端がそれ以上3’側に伸長反応が進まないように修飾されていることを丸印により示した。
【0066】
ストッパー核酸75aおよび75bが、夫々、標的核酸71aおよび71bにおける標的配列72aおよび72bよりも3’側の配列に結合して存在する状態で、標的核酸71aおよび71bの3’端付近に結合するプライマー73aおよび73bを用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で、5’から3’方向に核酸を伸長する。その結果、保護鎖74aおよびbが形成され、第1の伸長産物であるターゲット76aと、第2の伸長産物であるターゲット76bが得られる。標的配列72aおよびbの部分は、両者とも1本鎖のままで維持される。夫々のターゲット76aおよびbは、標的配列72aおよびbを含む1本鎖核酸部分と、標的核酸71aおよびbの一部分とそれに対して相補的な保護鎖74aおよびbとを含む2本鎖核酸部分とを夫々含む。
【0067】
以上の本発明の態様に従う第6の例は、標的核酸をなす2本鎖から、2つのターゲットが得られること以外は、第5の例の方法と同様に実施することが可能である。従って、第6の例における適切な伸長が得られる条件、その他の使用され得る反応の条件や、標的核酸、ストッパー核酸、プライマーおよびターゲットについての条件は、上述した第5の例における条件と同様の条件であってよく、また、第5の例と同様に種々の変更を行うことが可能である。
【0068】
また、当該伸長反応により得られたターゲット76aおよびターゲット76bを、核酸プローブ77aおよび核酸プローブ77bを用いた標的配列の検出に利用することが可能である。例えば、前述した何れのか例と同様に、標的配列72aおよびbに対する核酸プローブ77aおよびbの結合を検出することにより標的配列の検出が可能である。
【0069】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。更に、第6の例に従えば、2箇所の標的配列を同時に検出することが可能になる。
【0070】
(IV)プライマーの結合位置を調節することと、ストッパー核酸を用いることによって核酸プローブ結合部分を形成する方法
上述の(I)と(II)に記載の方法を組み合わせることにより、更に種々のタイプの標的配列を自由に設計することが可能になる。そのような例を以下の第7の例から第9の例に示す。
【0071】
(7)第7の例
図8を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第7の例を説明する。前述の第6の例においては、第1の標的核酸と第2の標的核酸は、何れもその5’端付近に標的配列を有していた。これに対して、以下に説明する第7の例においては、第1の標的核酸においては3’端付近に標的配列が存在し、第2の標的核酸では5’端付近に標的配列が存在する。
【0072】
図8を参照されたい。2本鎖である標的核酸81は、第1の標的核酸81aと第2の標的核酸81bとを含む。第1の標的核酸81aの3’端付近には第1の標的配列82aが存在する。第2の標的核酸81bの5’端付近には第2の標的配列82bが存在する。第1の標的核酸82aと第2の標的配列82bは、互いに相補的であっても、相補的ではなくてもよい。
【0073】
第1の標的核酸から第1のターゲット86aを作出することは、上述した第1の例に示した方法と同様の方法により行うことが可能である。即ち、第1の標的核酸における標的配列82aの存在する位置よりも5’側の配列に相補的な配列を有するプライマー83aを用いて適切な伸長が得られる条件下で伸長反応を行って保護鎖84aを与え、ターゲット86aを作出すればよい。また、第1の例に記載したのと同様に種々の変更を行ってもよい。
【0074】
第2の標的核酸から第2のターゲット86bを作出することは、上述の第5の例に示した方法と同様の方法により行うことが可能である。即ち、第2の標的核酸の3’端付近に一部の配列に相補的なプライマー83bを用いて、ストッパー核酸85の存在する条件下で、適切な伸長が得られる条件下で伸長反応を行って保護鎖84bを与え、ターゲット86bを作出すればよい。ここで、ストッパー核酸85は、標的核酸81bにおける標的配列82bの存在する位置よりも3’側の配列に相補的な配列を有する。このような第2の標的核酸からのターゲットの作出は、また、上述した第5の例に記載したのと同様に種々の変更を行ってもよい。また、図8では、3’側方向への伸長反応を阻害するためのストッパー核酸85の3’末端における修飾を丸印によって示した。
【0075】
上述の第1の標的核酸に対する伸長と、第2の標的核酸に対する伸長は、同時に行ってもよく、または順次に行ってもよい。例えば、同時に行う場合は、上述した2本鎖を標的核酸として用いる他の例と同様に、第1の標的核酸と第2の標的核酸の両方について適切な伸長反応が得られる条件下で、伸長反応を行えばよい。
【0076】
また、第1の標的配列と第2の標的配列は、同じ長さで100%の相補性を有していてもよく、一方が他方よりも長くてもよく、同じ長さで両末端が多少ずれていてもよい。
【0077】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能であるので、経済性および操作性が向上される。また更に、第7の例に従えば、1箇所の標的配列を2本の相補鎖について同時または順次に検出することが可能である。従って、目的とする標的配列の検出を確実に行うことが可能であり、判定精度の向上が可能である。例えば、一塩基多型(Single nucleotide polymorphism、以下、SNPと記す)を検出場合などに特に有利である。
【0078】
また、当該ターゲットを用いての標的配列検出は、上述した他の例と同様に、第1の標的配列82aに対して相補的な核酸プローブ87aと、第2の標的配列82bに対して相補的な核酸プローブ87bとを用いて、それらの標的核酸への結合を検出することにより行えばよい。
【0079】
(8)第8の例
図9を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第8の例を説明する。図9を参照されたい。1本鎖である標的核酸91は、3’端付近に第1の標的配列92を有し、5’端付近に第2の標的配列93を有する(図9A)。このような標的核酸91からターゲット97を製造する(図9B)。標的核酸91における第1の標的配列92の存在する位置よりも5’側の一部の配列に相補的なプライマー94と、標的核酸91における第2の標的配列93の存在する位置よりも3’側の一部の配列に相補的なストッパー核酸95が存在し、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行って保護鎖96を与え、ターゲット97を作出する。図9では、3’側方向への伸長反応を阻害するためのストッパー核酸95の3’末端における修飾を丸印によって示した。
【0080】
検出は、第1の標的配列92に対して相補的な第1の核酸プローブ98と、第2の標的配列93に対して相補的な第2の核酸プローブ99とを用いて、それぞれの標的配列への核酸プローブの結合を、上述した他の例と同様の方法により検出すればよい。
【0081】
上記した第8の例では、標的核酸として1本鎖を用いたが、2本鎖の標的核酸に対しても同様に第8の例の方法を適用することが可能である。また、第8の例は、上述した第1の例、第2の例、第4の例および第5の例の方法に従ってそれらの変更と同様に所望の変更を行ってもよい。
【0082】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能であるので、経済性および操作性が向上される。
【0083】
(9)第9の例
図10を用いて、3以上の標的配列を含む標的核酸についてのターゲットを製造する方法の例を説明する。図10を参照されたい。1本鎖である標的核酸101は、3’側、即ち3’端付近の第1の標的配列102a、第2の標的配列102b、第3の標的配列102c、最も5’側、即ち5’端付近の第4の標的配列102dを有する(図10A)。このような標的核酸101からターゲットを製造する。まず、標的核酸101における第1の標的配列102aの5’端よりも5’側の配列に相補的な第1のプライマー103aと、第2の標的配列102bの5’端よりも5’側の配列に相補的な第2のプライマー103bと、第3の標的配列102cの5’端よりも5’側の配列に相補的な第3のプライマー103cを用意する。更に、3つのストッパー核酸を用意する。第1のストッパー核酸105aは、標的核酸101における第2の標的配列の存在する位置よりも3’側の配列に相補的な配列を有する。第2のストッパー核酸105bは、第3の標的配列の存在する位置よりも3’側の配列に相補的な配列を有する。第3のストッパー核酸105cは、第3の標的配列の存在する位置よりも3’側の配列に相補的な配列を有する。
【0084】
第1のプライマー103a、第2のプライマー103bおよび第2のプライマー103cと、第1のストッパー核酸105a、第2のストッパー核酸105bおよび第3のストッパー核酸105cが存在し、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行って第1の保護鎖106a、第2の保護鎖106bおよび第3の保護鎖106cを与え、ターゲット107を作出する(図10B)。
【0085】
このように作出されたターゲット107は、一度に4箇所の標的配列の存在について検出することが可能である。そのような検出は、上述の何れかの例と同様に、第1の標的配列102a、第2の標的配列102b、第3の標的配列102cおよび第4の標的配列102dに対する、夫々の核酸プローブ108a、108b、108cおよび108dの結合を検出することにより行えばよい。
【0086】
上記の第9の例では、1つの標的核酸上に標的配列が4つある例を示したが、標的配列の数が3以上ある場合には第9の例の方法を適用してよい。また、標的配列は、必ずしも標的核酸の5’および/または3’端に接して存在しなくともよく、幾つかの塩基を残した何れかの端に存在してもよく、標的核酸の中央付近にのみ存在してもよい。また、図10では、3’側方向への伸長反応を阻害するためのストッパー核酸105a、bおよびcの夫々の3’末端における修飾を丸印によって示した。
【0087】
また上記の第9の例では、標的核酸として1本鎖を用いたが、2本鎖の標的核酸に対しても同様に第9の例の方法を適用することが可能である。その場合、2本鎖から1つのターゲットを得ても2つのターゲットを得てもよい。また、第9の例は、上述した第1の例、第2の例、第4の例および第5の例の方法に従ってそれらの例における変更と同様に所望の変更を行ってもよい。
【0088】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能であるので、経済性および操作性が向上される。
【0089】
(V)酵素により核酸プローブ結合部分を形成する方法
以下の第10および11の例は、一旦、標的核酸の全長を複製して2本鎖を作成した後に、所望する標的配列部分のみを1本鎖にする方法の例である。具体的には、核酸増幅に用いられるプライマーの少なくとも一部配列を予め核酸分解酵素耐性となるよう修飾しておき、このプライマーを用いて試料を伸長または増幅し、伸長または増幅後に得られた2本鎖核酸をエキソヌクレアーゼを用いて修飾部分まで消化する。これにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを有するターゲットを作出することが可能である。
【0090】
(10)第10の例
図11を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第10の例を説明する。ターゲットの基礎となる標的核酸111は、第1の標的核酸111aと第2の標的核酸111bとからなる2本鎖標的核酸111である。第1の標的核酸111aの3’端付近に標的配列112が存在する。このような標的核酸111を、第1のプライマー113aと第2のプライマー113bとを用いて、保護鎖114aおよびbを伸長する。
【0091】
ここで第1のプライマー113aは、第1の標的核酸111aの3’端付近の配列に相補的なプライマーであり、標的配列112に相補的な配列と、当該標的配列よりも5’側の標的核酸上の配列に対して相補的な配列を含む。また、第1のプライマー113aに含まれる標的配列に相補的な配列部分は、核酸分解酵素非耐性のヌクレオチドで構成される。また、少なくとも当該標的配列よりも5’側の配列に相補的な配列の一部分、好ましくは標的配列に隣接する配列を含む一部分の配列が核酸分解酵素耐性核酸である。一方、第2のプライマー113bは、第2の標的核酸111bの3’端付近の配列に相補的なプライマーである。第2のプライマー113bは、少なくとも5’端が核酸分解酵素耐性であるので、核酸分解酵素による消化は受けない。
【0092】
上記のような標的核酸111と第1のプライマー113aおよび第2のプライマー113bとを存在させ、適切な伸長反応が得られる条件下で、核酸を伸長する(図11A)。その後、得られた2本鎖を変性して1本鎖にする。更に得られた1本鎖を鋳型として、上述と同じ第1のプライマー113aと第2のプライマー113bを用いて、適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反応を行う(図11B)。その後、5’末端側から核酸を分解する核酸分解酵素を、適切な分解活性が得られる条件下で反応させる(図11C)。この反応系に存在する核酸のうち、露出された5’末端に核酸分解酵素耐性ヌクレオチドが含まれない核酸は、当該核酸分解酵素によって分解される。これにより、保護鎖114a’と保護鎖114bとを具備するターゲット116が得られる(図11C)。
【0093】
このように得られたターゲット116に対して、核酸プローブ115をハイブリダイズし、上述の他の例と同様にこの結合を検出することにより標的配列の検出を行うことが可能である(図11D)。
【0094】
ここで使用される核酸分解酵素は、5’末端側から核酸を分解するエクソヌクレアーゼなどのヌクレアーゼであればよく、例えば、T7 Gene6 Exonucleaseなどを好ましく使用できる。
【0095】
上述したように本発明において使用され得る標的配列は、実施者が検出しようとする配列であればよく、長さは、5塩基〜300塩基、好ましくは9塩基〜50塩基であればよい。また、標的配列112は、標的核酸の3’端付近に存在し、上述した他の例と同様に、3’末端を含んで存在してもよく、3’末端を含まずに端から離れた位置に配置してもよい。
【0096】
ここで使用され得る第1のプライマーは、上述したように特定の位置が核酸分解酵素に耐性であり、標的配列に対応する部分は核酸分解酵素非耐性の核酸である。第1のプライマーは、そのような条件が得られれば何れの種類の核酸であってもよい。その長さは、実施者が選択した第1のプライマーの配列に特異的なハイブリダイゼーションが得られるために充分な長さであり、且つ上述のような標的配列の塩基長よりも長い塩基長であればよい。例えば、本例において使用され得る第1のプライマーの長さの例は、6塩基長以上であればよく、好ましくは10塩基長以上である。また、上述したように、本例において使用される第1のプライマーは、標的核酸の3’端付近に存在する標的配列よりも5’側に隣接またはより5’側に存在するヌクレオチドに相補的な部分が核酸分解酵素耐性である。核酸分解酵素耐性であるヌクレオチドの数は、1から300塩基であればよく、好ましくは1塩基から50塩基、より好ましくは1塩基から30塩基であればよい。第1のプライマーの結合する標的配列に相補的な部分は、核酸分解酵素非耐性のヌクレオチドで構成される。また、第1のプライマーは、当該核酸分解酵素耐性ヌクレオチドよりもさらに3’側に核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドを含んでいてもよい。
【0097】
ここで使用される第2のプライマーは、少なくともその5’末端に核酸分解酵素に耐性であるヌクレオチドを含み、それ以外の部分は核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドを含めばよい。第2のプライマーの全長は、5から100塩基であればよく、好ましくは6塩基から50塩基、より好ましくは10塩基から35塩基であればよい。また、第2のプライマーの核酸分解酵素非耐性核酸は、約4塩基から約99塩基であればよく、好ましくは約5塩基から約49塩基、より好ましくは9塩基から34塩基である。
【0098】
本例において所望するヌクレオチドを、核酸分解酵素耐性とするには、それ自身公知の何れかの核酸分解酵素耐性化手段を用いてヌクレオチドを修飾すればよい。例えば、そのような手段は、フォスフォジエステル結合部分へのホスホロチオエート修飾などであるが、これに限定されるものではない。
【0099】
また、適切に伸長反応が得られる条件下とは、例えば、伸長活性を有する酵素と、伸長時に取り込まれる核酸合成基質と、伸長反応に必要な補酵素などが存在し、且つ温度およびpHなどの諸条件が適切に制御される条件であればよい。本発明において使用され得る酵素は、上述した第1の例において使用可能な酵素であってよい。また、適切な温度の制御やpHの制御などの条件も上述の第1の例に記載した条件を用いてよい。
【0100】
また上記の例では、図11の(A)の後に更なる1回の伸長を行っているが、これを更に繰り返してもよい。即ち、本例のような本発明の態様に従う方法においては、2回以上の伸長することを含む増幅反応を具備していてもよい。このような増幅は、それ自身公知の何れかの増幅手段により行ってよい。増幅手段の例は、PCR増幅、および Nucleic acid strand amplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids(ICANN)および Rolling circle amplification(RCA)法、Loop mediated amplification (LAMP)法などである。本例においては、増幅反応を行うことにより、より多くのターゲットが同時に製造される。
【0101】
サンプルに含まれる標的核酸を用いて、上述の第10の例を用いて本発明に従うターゲットを製造する場合、ここでサンプルは標的核酸を含めばよいが、必ずしも標的核酸のみを含む必要はなく、他の核酸と共に含まれてもよい。しかしながら、好ましく本発明の態様に従う反応を行うためには、サンプルにおける標的核酸の量が、サンプルに含まれる核酸全体の約3%以上であればよく、より好ましくは10%以上、更に好ましくは20%以上である。また、必要に応じて、本発明に従う方法に供する前に、それ自身公知の何れかの増幅手段により標的核酸を増幅してもよい。増幅手段の例は、PCR増幅および Nucleic acid strand amplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids(ICANN)および Rolling circle amplification(RCA)法、Loop mediated amplification (LAMP) 法などである。
【0102】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【0103】
(11)第11の例
図12を用いて、本発明の態様に従うターゲット製造方法の第11の例を説明する。ターゲット製造の基礎となる標的核酸121は、第1の標的核酸121aと第2の標的核酸121bとからなる2本鎖標的核酸121である(図12A)。第11の例は、第1および第2の標的核酸の両方の3’端付近に標的配列122aおよびbが存在する場合の例である。従って、上述の第10の例の変形例である。
【0104】
第1の標的核酸121aの3’端付近の第1の標的配列122aに相補的な配列を有する第1のプライマー123aと、第2の標的配列112bに相補的な配列を有する第2のプライマー123bとを用いて伸長反応を行う(図12A)。次に、得られた2本鎖を変性し、得られた1本鎖について同様の第1のプライマー123aと第2のプライマー123bと伸長活性を有する酵素を用いて、再度伸長を行う(図12B)。次に核酸分解酵素により5’末端から核酸分解酵素非耐性核酸を分解する。それにより、1本鎖核酸部分として存在する標的配列122aおよびbと相補鎖124a’およびb’からなる2本鎖核酸部分とを具備する点対称なターゲット126が得られる(図12C)。
【0105】
ここで、プライマー123aとbは、各々5’端側に核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドを含むが、この核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドは標的配列122aおよびbに対応する部分に存在すればよい。また、各標的核酸における標的配列の存在位置よりも5’側のと領域相補的な配列中に核酸分解酵素耐性ヌクレオチド部分が存在する。
【0106】
本第11の例では、当該伸長反応に続いて、核酸分解酵素により各保護鎖124aおよびbの5’端に存在する核酸分解酵素非耐性ヌクレオチドが分解される。従って、本第11の例において使用される第1のプライマー123aと第2のプライマー123bは、両者とも基本的な構造は、第10の例において記載した第1のプライマーと同様でよい。即ち、標的配列に相補的な配列となる部分に核酸分解酵素に対して非耐性であるヌクレオチドが含まれ、それよりも3’側に存在する配列の一部が、好ましくは標的配列に相補的な配列に隣接する部分の配列が、核酸分解酵素耐性ヌクレオチドである。このような第1のプライマー123aと第2のプライマー123bの構成以外は、本第11の例は、上述した第10の例と同様の方法により行ってよく、更に第10の例の変更と同様に所望の変更を行ってもよい。
【0107】
このように得られたターゲット126に対して、核酸プローブ125aおよびbを同時または順次にハイブリダイズし、上述した他の例と同様の方法によりこの結合を検出することによって標的配列を検出することが可能である(図12D)。
【0108】
上述のような本発明の態様に従う方法により、少ない工程で、標的配列の設計が自由にでき、短時間で簡便にターゲットを製造することが可能である。従って、経済性および操作性が向上される。
【0109】
4.ターゲット
上述のような本発明の方法に従って製造されたターゲットも本発明に含まれる。また、このような本発明に従うターゲットは、標的配列またはこれを含む標的核酸の検出に好ましく使用される。また、本発明に従い製造されたターゲットは、溶液中で遊離した状態で使用されても、ビーズおよび基板などの基体に固定化された状態で使用されてもよい。即ち、遊離型のターゲットおよび基体に固定化されたターゲットの何れも本発明として提供される。
【0110】
一般的に、標的配列の検出は、目的とする標的配列に対して相補的な核酸プローブを結合させ、その結合を検出することにより行われる。多くの場合において標的配列は、サンプル中で単独で存在するよりも、複数の異なる配列を有する核酸と共に存在したり、一部に標的配列を含む標的核酸に含まれて存在したり、また等しい配列を有する標的配列や標的核酸が数多く集まって存在する。従って、標的配列やそれを含む標的核酸の自己相補性による二次構造や、他の配列とのクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性は低くない。そのような予期しない結合が生じれば、その結果、標的配列の検出の精度は低くなる。しかしながら、本発明のターゲットによれば、自己相補性や他の配列との相補性による意図しないハイブリダイゼーションの発生を抑制することが可能である。
【0111】
5.標的配列検出方法
上述のような本発明に従い製造されたターゲットを用いて標的配列または標的核酸を検出する方法も本発明に含まれる。
【0112】
即ち、当該検出の対象となるサンプルを用意する。次に所望に応じて目的の配列を含む核酸を増幅する。その後、上述した本発明の態様に従う方法によりターゲットを製造する。次に、検出の対象となる標的核酸に対して相補的な核酸プローブを、製造された当該ターゲットに対して、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応させる。その結果、当該サンプル中に標的核酸が存在する場合には、当該核酸プローブと標的配列との間にハイブリダイゼーションが生じる。従って、このハイブリダイゼーションによる結合を検出すれば、サンプル中の標的配列または標的核酸の存在を検出することが可能である。
【0113】
本発明において使用され得る核酸の増幅手段は、それ自身公知の増幅手段であればよく、例えば、PCR増幅、および Nucleic acid strand amplification(NASBA)、Transcription mediated amplification(TMA)、Ligase chain reaction(LCR)、Strand displacement amplification(SDA)、Isothermal and Chimeric primer−initiated Amplification of Nucleic acids(ICANN)および Rolling circle amplification(RCA)法、Loop mediated amplification (LAMP)法などであればよい。本発明において、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件とは、標的配列に含まれる塩基の種類、核酸プローブ固定化基体に具備される核酸プローブの種類、試料核酸の種類およびそれらの状態などの諸条件に応じて、当業者であれば適宜選択することが可能である。
【0114】
また、本発明に従うターゲットを使用する標的配列の検出方法において用いられる検出手段は、核酸プローブを使用して実施されるそれ自身公知の一般的な検出手段であればよい。例えば、そのような検出手段は、核酸プローブに予め蛍光標識、化学発光物質および色素などの検出可能な標識物質を付与しておき、これを検出する検出方法や、当該結合部分に対して特異的に結合可能なインタカレータを検出することを利用した検出方法、並びに電気化学的に当該結合部分を認識する物質を用いて電気化学的検出方法などである。
【0115】
6.アッセイキット
(1)ターゲット製造用キット
本発明の態様に従うと、上述のような本発明の態様に従うターゲットを製造するためのターゲット製造用キットも本発明に含まれる。
【0116】
本発明の態様に従うターゲット製造用キットは、上述したような種々のプライマー、核酸合成酵素、核酸合成基質、ストッパー核酸を得るための必要な試薬、核酸分解酵素、核酸の核酸分解酵素耐性化のために必要な試薬、核酸プローブ、核酸プローブを標識するための標識物質および他の試薬、並びに所望の基体の少なくとも1を具備すればよく、それらの幾つかを組み合わせて具備してもよい。
【0117】
(2)標的配列検出用アッセイキット
本発明はまた、上述したような本発明の態様に従うターゲットを用いて標的配列を検出するための標的配列検出用アッセイキットも提供する。本発明の態様に従う標的配列検出用アッセイキットは、本発明の態様に従うターゲット、核酸プライマー、結合を検出するための検出可能な標識物質および検出を行うための種々の試薬の少なくとも1を具備すればよく、それらの幾つかを組み合わせて具備してもよい。また更に、上述したターゲット製造用キットに具備される上述したような種々のプライマー、核酸合成酵素、核酸合成基質、ストッパー核酸を得るための必要な試薬、核酸分解酵素、核酸の核酸分解酵素耐性化のために必要な試薬、核酸プローブ、核酸プローブを標識するための標識物質および試薬、ビーズおよび基板などの基体、並びに核酸プローブ固定化基体なども、少なくとも1またはそれらの幾つかを組み合わせた形態で具備してもよい。
【0118】
【実施例】
実施例1
上述したストッパー核酸を用いる図5に示すような第4の例を本発明に係る実施例1として行い、更にその結果を従来法により得られる結果と比較した。MBL遺伝子コード領域のSNPを含む領域に対応する1本鎖DNAを標的核酸として利用し、本発明および従来法の両方法によってターゲットを作出した。次に、同領域上のSNPを検出するための核酸プローブ固定化基体をもちいてMBL遺伝子のSNP検出を行った。具体的な方法は以下の通りである。
【0119】
MBL遺伝子中で検出したいSNPを含む領域と同じ配列(即ち、配列番号1)を持つ1本鎖DNAを標的核酸とし、これを終濃度1012コピー/mL程度となるように調整した。
【0120】
また、保護鎖の伸長は、ストッパー核酸の存在下でプライマーを用いて行った。即ち、終濃度0.4μMの3’リン酸化オリゴDNA(配列番号2)をストッパー核酸として用い、終濃度0.2μMのオリゴDNA(配列番号3)をプライマーとして用いた。これらのストッパー核酸とプライマーとを終濃度0.04U/μLの耐熱性DNA合成酵素Pyrobest DNA polymerase (Takara)と共に前記標的核酸に添加した。ストッパー核酸とプライマーの配列は以下の通りである。
【0121】
配列番号2:GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC
配列番号3:CATGGTCCTCACCTTGGTGT。
【0122】
次に、至適酵素反応溶液組成にて66℃10分間の反応を行った。反応後、1/9量の20xSSC緩衝液、1/9量の10mM EDTA溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加して、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、3’末端にチオール基を導入することにより基板に具備される金電極に固定化された配列番号4および配列番号5に示される核酸を核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0123】
比較対照である従来法は以下のように行った。標的核酸である1本鎖DNAと別途合成した1本鎖の保護鎖(即ち、配列番号6の核酸鎖)とを混合し2xSSC緩衝液中で95℃で5分の熱変性後95℃から30℃まで30分間かけて徐々に冷却することでアニーリングを行なった。核酸プローブとして配列番号4および配列番号5を含む核酸を基板の金電極上に固定化した、前述と同様の核酸プローブ固定化チップに対して前記アニーリング後に得られた従来法によるターゲットを添加した。次に、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0124】
また、もう1つの従来法として、保護鎖を含まない1本鎖の標的核酸(配列番号1)をターゲットとして用いて標的配列を検出した。核酸プローブとして配列番号4および配列番号5を含む前述と同様の核酸プローブ固定化チップに添加し、上記と同様にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0125】
以上の結果を図13に示す。以上のハイブリダイゼーションの結果、ストッパー核酸としての配列番号2の3’リン酸化オリゴDNAと、プライマーとしての配列番号3のオリゴDNAとを使用し、これに耐熱性DNA合成酵素を添加して作出したターゲットを用いて行った本発明の方法に係る実験区のみから、対応するSNPを検出する核酸プローブに対する特異的なハイブリダイゼーションが生じたことを示す電流信号を検出することができた(図13)。
【0126】
更に、同様の比較実験を異なる配列を有する標的核酸を用いて行ったが、何れの場合にも本発明に係る方法で作出したターゲットを用いて検出した場合からのみ、安定的かつ特異的な信号が検出された。また、保護鎖を伴わずに標的核酸を1本鎖DNAのままでターゲットとして検出を行った場合や、標的核酸と別途合成した保護鎖とを混合して熱変性およびアニ―リングによりターゲットを作出して検出を行った場合など、従来法を用いた場合では、図13に示す結果と同様にほとんどの場合において好ましい結果は得られなかった。
【0127】
また、図7に示す本発明の第6の例に従ってターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。即ち、標的核酸として2本鎖核酸を用い、互いに異なる部位を標的配列とし、2本鎖標的核酸に含まれる各々の鎖から夫々にターゲットを作成し、同様に標的配列の検出を行った。その結果、本発明に従う方法によりターゲットを作出した場合にのみ、特異的なハイブリダイゼーションを確認することができた。
【0128】
以上の結果から、本発明の方法による検出は、従来法に比べて、特異的、効率的および高感度に標的核酸を検出することが可能であった。従って、標的DNAを作出する際の経済性および操作性が向上される。
【0129】
実施例2
図2に示す本発明の第1の例に係る方法、即ち、プライマーの結合位置を調節することにより所望のターゲットを製造する方法を行い、それにより得られたターゲットを用いる標的配列の検出を、実施例2とし行った。それにより得られた結果を従来法による結果と比較した。
【0130】
MxA遺伝子を含む溶液をサンプルとし、MxA遺伝子プロモーターのSNPを含む領域に対応する1本鎖DNA(配列番号7)を標的核酸とした。また、当該SNPを含む配列を標的配列とした。これらについて、本発明に係る方法および従来法の両方法を用いて夫々にターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。標的配列の検出手段は、標的配列に相補的な配列を有する核酸プローブを基体に固定化して得た核酸プローブ固定化基体に対するハイブリダイゼーションの有無の検出により行った。この検出により、MxA遺伝子プロモーターのSNPの遺伝子型を検出することが可能である。
【0131】
MxA遺伝子中で検出したいSNPを含む領域と同じ配列を持つ標的1本鎖DNAを標的核酸として、終濃度1012コピー/ml程度となるように調整した。プライマーとしてオリゴDNA(配列番号8)を用意した。終濃度0.4μMの当該プライマーと終濃度0.04U/μlのPCR用酵素Pyrobest DNApolymerase (Takara)を前記標的核酸に添加した。プライマーの配列は以下の通りである;
配列番号8:GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。
【0132】
伸長反応は、至適酵素反応溶液組成にて66℃10分間行った。反応後1/9量の20xSSC緩衝液、1/9量の10mM EDTA溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加して、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、5’末端にチオール基を導入することにより金電極に固定化された配列番号9および配列番号10を夫々核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0133】
比較対照である従来法は以下のように行った。標的核酸である1本鎖DNAと別途合成した1本鎖の保護鎖(即ち、配列番号11の核酸鎖)とを混合し、2xSSC緩衝液中で95℃で5分の熱変性後95℃から30℃まで30分間かけて徐々に冷却することでアニーリングを行なった。核酸プローブとして配列番号9および配列番号10を含む核酸を基板の金電極上に固定化した、前述と同様の核酸プローブ固定化チップに対して前記アニーリング後に得られた従来法によるターゲットを添加した。次に、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0134】
また、もう1つの従来法として、保護鎖を含まない1本鎖の標的核酸(配列番号7)をターゲットとして用いて標的配列を検出した。核酸プローブとして配列番号9および10を夫々に含む上記と同様の核酸プローブ固定化チップに添加し、上記と同様にハイブリダイゼーションを行い、電流応答を測定した。
【0135】
その結果、本発明に係る方法により作出したターゲットを用いて検出を行った実験区のみから、対応するSNPを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションが行われたことを示す電流信号が検出された(図14)。さらに、複数種の異なる配列を有する標的核酸についても同様に比較実験を行ったが、何れの場合にも、本発明に基づく方法で作出したサンプルからのみ安定的かつ特異的な信号が検出された。これに対して、保護鎖なしで標的核酸を1本鎖DNAのままでターゲットとして検出を行った場合や、標的核酸と別途合成した保護鎖を混合して熱変性およびアニ―リングによりターゲットを作成して検出を行った場合など、従来法を用いた場合では、図14と同様にほとんどの場合において好ましい結果は得られなかった。
【0136】
また、図4に示す本発明の第3の例に従ってターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。即ち、標的核酸として2本鎖核酸を用い、互いに異なる部位を標的配列とし、2本鎖標的核酸に含まれる各々の鎖から夫々にターゲットを作成した。また更に、図8に示す本発明の第7の例に従ってターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。即ち、標的核酸として2本鎖核酸を用い、互いに相補的な部位を夫々標的配列とし、2本鎖標的核酸に含まれる各々の鎖から夫々にターゲットを作成した。以上のような本発明の方法に従って2本鎖標的核酸から2種類のターゲットを作出し、それを用いて標的配列を検出する方法を行った結果は何れの場合にも、標的配列に対する特異的なハイブリダイゼーションが確認された。また、これらの結果と従来の方法と比較すると、本発明に係る方法は、何れの従来の方法よりも高感度に標的配列を検出することが可能であった。
【0137】
以上の結果から、本発明の方法による検出は、従来法に比べて、特異的、効率的および高感度に標的核酸を検出することが可能であった。従って、標的DNAを作出する際の経済性および操作性が向上される。
【0138】
実施例3
上述したストッパー核酸を用いる本発明に係るターゲット作出方法における種々の条件を検討した。MBL遺伝子コード領域のSNPを含む領域に対応する1本鎖DNAを標的核酸として利用し、プライマーとして使用する添加するオリゴDNAの種類を変えて標的核酸構造を作出した。その後、同領域上のSNPを検出するための核酸プローブ固定化基体をもちいてMBL遺伝子のSNPの検出を行った。
【0139】
MBL遺伝子中で検出したいSNPを含む領域と同じ配列(配列番号1)を持つ標的1本鎖DNAを標的核酸として用意した。これを終濃度1012コピー/ml程度となるように合成および増幅して調整した。ストッパー核酸は、以下のような配列番号2、配列番号12、配列番号13および配列番号14で示される3’リン酸化オリゴDNAを用意した。終濃度0.4μMの何れかのストッパー核酸、即ち、3’リン酸化オリゴDNA(配列番号2、配列番号12、配列番号13または配列番号14)と、プライマーとして終濃度0.2μMのオリゴDNA(配列番号3)と、終濃度0.04U/μlの耐熱性DNA合成酵素Pyrobest DNA polymerase (Takara)を標的核酸に添加した。使用したストッパー核酸およびプライマーの配列は以下の通りである;
配列番号2:GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC
配列番号12:GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAA
配列番号13:CACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAA
配列番号14:CCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC
配列番号3:CATGGTCCTCACCTTGGTGT。
【0140】
続いて、至適酵素反応溶液組成にて66℃10分間反応を行って核酸を伸長した。反応後、1/9量の20xSSC緩衝液および1/9量の10mM EDTA溶液を添加し、予め3’末端にチオール基を導入し金電極上に固定化した配列番号4および配列番号5により示される配列を有する核酸プローブと35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0141】
その結果、何れの実験区からも特異的な信号が得られたが、ストッパー核酸である3’リン酸化オリゴDNAとして配列番号2または配列番号12を用い、これとプライマーであるオリゴDNA配列番号3と耐熱性DNA合成酵素を添加した実験区については、ストッパー核酸である3’リン酸化オリゴDNAとして配列番号13または配列番号14を用いた場合に比べて、対応するSNPを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションが行われたことを示す電流信号がより高感度に検出された。即ち、以上の結果から、本発明の方法により標的DNAを作出する際には、ストッパー核酸である3’リン酸化オリゴDNAの3’末端と核酸プローブの5’末端とが隣接するように設計することがより好ましいことが明らかになった。
【0142】
実施例4
本発明に係る、プライマーの結合位置を調節することにより所望のターゲットを製造する方法について、そのターゲット製造条件を更に検討した。MxA遺伝子プロモーター領域のSNPを含む領域に対応する1本鎖DNAを標的核酸として用いた。使用するプライマーの配列を複数用意し、それらを用いてターゲットを作出した。得られたターゲットを、同領域上のSNPを検出するための核酸プローブ固定化基体に添加して反応させ、MxA遺伝子のSNP検出を行った。
【0143】
MxA遺伝子中で検出したいSNPを含む領域と同じ配列を持つ1本鎖DNA(配列番号7)を標的核酸として用いた。このような標的核酸を合成し増幅して調整した。プライマーとして、3種類の配列(配列番号8、配列番号15または配列番号16)の何れかを有する核酸を用意した。終濃度0.4μMのプライマーと終濃度0.04U/μlのPCR用酵素Pyrobest DNA polymerase (Takara)を当該標的核酸に添加した。添加したプライマーの配列は以下の通りである;
配列番号8:GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC
配列番号15:CCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC
配列番号16:CGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。
【0144】
前記標的核酸、プライマーおよび酵素の混合物を至適酵素反応溶液組成にて66℃10分間反応を行った。反応後、1/9量の20xSSC緩衝液、1/9量の10mM EDTA溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加し、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、5’末端にチオール基が導入され基板に具備される金電極に固定化された配列番号9および配列番号5に示される核酸を夫々核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0145】
その結果、何れの実験区からも対応するSNPを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションが行われたことを示す電流信号が検出された。特に、使用したプライマーの配列によって得られた信号強度に差が見られたことは興味深い。信号強度とプライマー配列の関係は、配列番号8>>配列番号15>配列番号16の順であった。即ち、以上の結果から、本発明の方法によりターゲットを作出する際には、添加するプライマーの5’末端と核酸プローブの3’末端とが、隣接するように設計することがより好ましいことが分かった。
【0146】
実施例5
上述した図6に示す第5の例に係る方法によりターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。本実施例では、2本鎖核酸を標的核酸として用いる場合の条件について検討した。即ち、MBL遺伝子コード領域のSNPを含む領域に対応するPCR産物を標的核酸として用い、幾つかの異なる条件下で本発明に係るターゲットを作出した。得られたターゲットを、同領域上のSNPを検出するための核酸プローブを固定化した基体である核酸プローブ固定化チップを用いて、MBL遺伝子のSNP検出を行った。
【0147】
予めSNP型の判明しているヒトゲノムDNAを鋳型とし、配列番号17と配列番号3を夫々に含むオリゴDNAをプライマーとして用いてPCR法を行った。このPCRにより、MBL遺伝子における検出しようとするSNPの含まれる領域が増幅された。この増幅産物に対して、終濃度0.4μMのストッパー核酸である3’リン酸化オリゴDNA(配列番号2)および終濃度0.04U/μlの耐熱性DNA合成酵素Pyrobest DNA polymerase (Takara)、並びに終濃度0.2μMの第1のプライマーであるオリゴDNA(配列番号17)および/または終濃度0.2μMの第2のプライマーであるオリゴDNA(配列番号3)を添加した。使用したオリゴDNAの配列は以下の通りである;
配列番号17:GTCCCATTTGTTCTCACTGC
配列番号3:CATGGTCCTCACCTTGGTGT
配列番号2:GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC。
【0148】
次に、至適酵素反応溶液組成にて95℃5分、66℃10分間の反応を行った。反応後、1/9量の20xSSC緩衝液、1/9量の10mM EDTA溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加し、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、3’末端にチオール基を導入することにより、基板に具備される金電極に固定化された配列番号4および配列番号5に示される核酸を各々核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0149】
その結果、PCR産物に対してプライマーとしての配列番号17のオリゴDNAおよび配列番号3のオリゴDNA、ストッパー核酸としての配列番号2の3’リン酸化オリゴDNA、並びに耐熱性DNA合成酵素を全て添加した実験区のみから、対応するSNPを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションの行われたことを示す信号が検出された。更に異なる複数種の標的核酸を用意し、それらに対して同様な実験を行った。その結果、何れの場合も、安定的且つ特異的に信号を検出できたのは、上述と同様の方法でターゲットを作出した場合にのみであった。それに対して、それ以外の方法でターゲットを作出した場合には、ほとんどの場合に好ましい結果は得られなかった。また、上述のように増幅産物を標的核酸として使用する場合、上述のようなPCR法以外の何れの増幅手段により得られた増幅産物であっても標的核酸として使用することが可能である。例えば、ICAN産物に関しても上記と同様な方法でターゲットを作出し(図15を参照されたい)、得られたターゲットを用いても同様に良好な標的配列の特異的検出が確認された。以上の結果から、2本鎖核酸を標的核酸として用いて本発明に係るターゲットを作出する場合には、核酸プローブとの反応時に、標的核酸に対して相補的な鎖が遊離した1本鎖核酸としてハイブリダイゼーション溶液中に存在しないことが望ましいことが明かになった。従って、標的核酸である2本鎖の両方の鎖が、当該ハイブリダイゼーション時には2本鎖となるように、プライマーが添加されることが望ましい。
【0150】
実施例6
本実施例では、上述した図3に示す第2の例に係る方法によりターゲットを作出し、標的配列の検出を行った。本実施例では、2本鎖核酸を標的核酸として用いる場合の条件について検討した。即ち、MxA遺伝子プロモーター領域のSNPを含む領域に対応するPCR産物を標的核酸として用い、幾つかの異なる条件下で本発明に係るターゲットを作出した。得られたターゲットを、同領域上のSNPを検出するための基体に核酸プローブを固定化した核酸プローブ固定化チップを用いて、MxA遺伝子のSNPを検出した。
【0151】
予めSNP型の判明しているヒトゲノムDNAを鋳型とし、配列番号18と配列番号19を夫々に含むオリゴDNAをプライマーとして用いてPCR法を行った。このPCRにより、MxA遺伝子における検出しようとするSNPの含まれる領域が増幅された。この増幅産物に対して、終濃度0.4μMの第1のプライマーであるオリゴDNA(配列番号18)および/または第2のプライマーであるオリゴDNA(配列番号8)、並びに終濃度0.04U/μlのPCR用酵素Pyrobest DNA polymerase (Takara)を添加した。添加したオリゴDNAの配列は以下の通りである;
配列番号18:GAGCTAGGTTTCGTTTCTGC
配列番号19:CGCTAGTCTCCGCCACGAAC
配列番号8:GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。
【0152】
次に、至適酵素反応溶液組成にて95℃5分、66℃10分間の反応を行った。反応後、1/9量の20xSSC緩衝液、1/9量の10mM EDTA溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加し、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、5’末端にチオール基を導入することにより、基板に具備される金電極上に固定化された配列番号9および配列番号10に示される核酸を各々核酸プローブとして含む。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0153】
その結果、PCR産物に対してプライマーとしての配列番号19のオリゴDNAおよび配列番号8のオリゴDNA、並びに耐熱性DNA合成酵素を添加した実験区のみから、対応するSNPを検出する核酸プローブに特異的なハイブリダイゼーションの行われたことを示す信号が検出された。更に異なる複数種の標的核酸を用意し、それらに対して同様な実験を行った。その結果、何れの場合も、安定的且つ特異的に電流信号を検出できたのは、上述と同様の方法でターゲットを作出した場合にのみであった。それに対して、それ以外の方法でターゲットを作出した場合には、ほとんどの場合に好ましい結果は得られなかった。また、上述のように増幅産物を標的核酸として使用する場合、上述のようなPCR法以外の何れの増幅手段により得られた増幅産物であっても標的核酸として使用することが可能である。例えば、ICAN産物に関しても上記と同様な方法でターゲットを作出し(図16を参照されたい)、得られたターゲットを用いても同様に良好な標的配列の特異的検出が確認された。以上の結果から、2本鎖核酸試料を標的核酸として用いて本発明に係るターゲットを作出する場合には、核酸プローブとの反応時に、標的核酸に対して相補的な核酸が遊離した1本鎖核酸としてハイブリダイゼーション溶液中に存在しないことが望ましいことが明らかになった。従って、標的核酸である2本鎖の両方の鎖が当該ハイブリダイゼーション時には2本鎖となるようのに、プライマーが添加されることが望ましい。
【0154】
実施例7
本実施例では、上述した図11に示す第10の例および図12に示す第11の例のように酵素により1本鎖核酸部分を形成する方法に従って、ターゲットを製造した。このターゲットにより標的配列を検出した結果と、従来法により作成したターゲットを用いて標的配列を検出した結果を比較した。標的核酸としてイネゲノムを用い、標的配列を含むイネゲノムPCR増幅断片の存否判定を、核酸プローブを固定化した基体を用いて行った。
【0155】
まず、精米からイネゲノムDNAを抽出し調整した。このイネゲノムDNAを以下の4つのプライマーを用いて、これらのプライマーによって挟まれる領域をPCRによって増幅した。使用したプライマーの配列は以下の通りである;
プライマー;
配列番号20:tacCTGGTTGATGTATACAGATCTGGTT
配列番号21:ATCCCTCGATCCCTCtagCATTAT
配列番号22:TACCTGGTTGATGTAtacAGATCTGGTT
配列番号23:atcCCTCGATCCCTCTAGCATTAT
ここで、これらの配列、配列番号20、配列番号21、配列番号22および配列番号23において小文字表記した塩基は、その3’側に存在するフォスフォジエステル結合部分にホスホロチオエート修飾が施されている。
【0156】
当該増幅産物に、T7 Gene6 Exonucleaseと添付バッファーを添加し、至適条件下で完全消化を行った。反応後、酵素反応液に1/9量の20xSSC緩衝液、1/9量の10mM EDTA溶液を添加し、予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加し、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、5’末端にチオール基を導入することにより、基板に具備される金電極上に固定化された配列番号24、配列番号25および配列番号26により示される核酸を各々核酸プローブとして含む。
【0157】
核酸プローブ;
配列番号24:TACCTGGTTGATGTA
配列番号25:ATCCCTCGATCCCTC
配列番号26:ACAACGCCTCCGATG(対照用)。
【0158】
また、このハイブリダイゼーション反応を行なう際には、対照実験としてPCR産物にT7 Gene6 Exonuclease処理を行っていないもの、ホスホロチオエート修飾を行っていないプライマーでPCR増幅を行ったもの、T7 Gene6 Exonuclease処理を行ったもの、従来法である「部分二重鎖DNAを利用したDNA検出方法」(特開平11−332566)の方法に従って作出した標的構造についても同様にハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0159】
その結果、PCR産物にT7 Gene6 Exonuclease処理を行っていない場合、およびホスホロチオエート修飾を行わないプライマーでPCR増幅しT7 Gene6 Exonuclease処理を行った場合、PCRをプライマー配列番号20と配列番号23の組み合わせで行ってT7 Gene6Exonucleaseで処理した場合においては、ハイブリダイゼーションが生じたことを示す結果は得られなかった。また、「部分二重鎖DNAを利用したDNA検出方法」(特開平11−332566)に従って作出した標的では、ある程度の信号が得られるもののバックグラウンドの信号が大きくなりS/N=1.2程度であった。これに対し、当該PCRを、プライマー配列番号20と配列番号21の組み合わせで行った場合では核酸プローブ配列番号24により、またプライマー配列番号22と配列番号23の組み合わせでPCRを行った場合では核酸プローブ配列番号25によって特異的な信号がS/N>>2で得られた(図17)。また、配列番号21と配列番号22の組み合わせでPCRを行った場合では、配列番号24と配列番号25の両方の核酸プローブとの特異的なハイブリダイゼーションがS/N>>2で行われたことを確認することができた。更に、複数のPCR断片が同時に存在するマルチプレックスPCR産物についても実験を行った。その結果、本発明の方法によりターゲットを作出した場合、従来の方法に比べて高い特異性が観察された。以上の結果から、本発明の方法によりターゲットを作出する場合では、従来に比べて経済性および操作性が向上し、且つ特異的、効率的および/または高感度に標的核酸を検出することが可能となることが示された。
【0160】
実施例8
マルチプレックスPCRによる増幅産物に対して本発明に従うターゲット製造方法を適用し、それにより得られた産物をハイブリダイゼーションによる検出に使用した例を以下に説明する。
【0161】
予めSNP型の判明しているヒトゲノムDNAを鋳型とし、MxA遺伝子プロモーター領域およびMBL遺伝子コード領域のうちのSNPを含む領域を増幅するために、プライマー配列番号17、配列番号3、配列番号18および配列番号19を用いてマルチプレックスPCRを行った。反応後PCR産物に終濃度0.4μMのプライマー(配列番号8)と終濃度0.4μMのストッパー核酸としての3’リン酸化オリゴDNA(配列番号2)と、各々終濃度0.2μMの2種類のプライマー(各々配列番号17または配列番号19を有す)と終濃度0.04U/μlのPCR用酵素Pyrobest DNA polymerase (Takara)、を添加して、95℃5分間、66℃10分間で反応を行った。
【0162】
ここで使用した夫々のオリゴDNAの配列は以下の通りである。
【0163】
配列番号17:GTCCCATTTGTTCTCACTGC
配列番号3:CATGGTCCTCACCTTGGTGT
配列番号18:GAGCTAGGTTTCGTTTCTGC
配列番号19:CGCTAGTCTCCGCCACGAAC
配列番号2:GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC
配列番号8:GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。
【0164】
当該反応後、酵素反応液に1/9量の20xSSC緩衝液、1/9量の10mM EDTA溶液を添加し、これを予め用意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加して、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行った。ここで使用した核酸プローブ固定化チップは、固定化核酸プローブとして、予め3’末端にチオール基を導入され基板に具備される金電極上に固定化された配列番号4および配列番号5の核酸と、予め5’末端にチオール基を導入され基板に具備される金電極上に固定化された配列番号9および配列番号10の核酸を具備する。当該ハイブリダイゼーションの後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。その結果、対応するSNPを検出する核酸プローブにおいてハイブリダイゼーションの生じたことを示す特異的な電流信号が検出された。
【0165】
以上の結果から、本発明に従う方法によりターゲットを形成し、それを標的配列の検出に用いると、複数種のDNA断片混合液を試料とした場合であっても高い特異性をもって標的配列の検出が可能であることが明らかとなった。
【0166】
実施例9
本実施例では、上述した図9に示す第8の例のように、1本鎖核酸である標的核酸上に存在する2ヶ所の標的配列を同時に検出することの出来るターゲットを作成し、これを用いたハイブリダイゼーションによって標的配列の検出を行った。
【0167】
MBL遺伝子の配列であって、SNP領域を両端に含むDNA領域と同一の配列(配列番号27)を有する標的1本鎖DNAを標的核酸とした。この標的核酸を合成し増幅して、終濃度1012コピー/ml程度となるように調整した。これに、終濃度0.4μMのプライマー配列番号28、ストッパー核酸としての終濃度0.4μMの3’リン酸化オリゴDNA配列番号2、および終濃度0.04U/μlのPCR用酵素Pyrobest DNA polymerase (Takara)を添加し、66℃10分間で反応を行った。ここで、使用したオリゴDNAの配列は以下の通りである。
【0168】
配列番号2:GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC
配列番号28:CCCATCTTTGCCTGGGAAGCCGTTGATGCC
当該反応後、酵素反応液に1/9量の20xSSC緩衝液、1/9量の10mM EDTA溶液を添加した。これを、予め3’末端にチオール基を導入し金電極上に固定化した配列番号4を有する核酸プローブおよび配列番号5を有する核酸プローブ、並びに予め5’末端にチオール基を導入し金電極上に固定化した配列番号29を有する核酸プローブおよび配列番号30を有する核酸プローブに対して添加し、35℃で1時間ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリダイゼーション後、0.2xSSCで15分間洗浄を行い、最後に、ヘキスト33258の電流応答を測定した。
【0169】
その結果、対応するSNPを検出する核酸プローブに対してハイブリダイゼーションの生じたことを示す特異的な信号が検出された。また、同様な設計により図10に示す第9の例のような本発明に従う方法によっても、1本鎖の標的核酸上に3箇所以上の標的配列が存在する場合のターゲットを作成した(図10)。作成されたターゲットを用いて当該4箇所の標的核酸を検出したところ、特異的なハイブリダイゼーションの得られたことが確認された。
【0170】
以上の結果から、本発明に従う方法によって、1本鎖の標的核酸上に存在する複数箇所の標的配列を同時に検出することが可能である。
【0171】
また、上述の実施例1から実施例9におけるターゲットの検出は、金電極上での電流応答を利用した電気化学的検出方法により行った例を示した。しかしながら、実施例1から実施例9の何れも、製造したターゲットに対して蛍光標識物質をそれ自身公知の方法により付与し、対応する核酸プローブを固定化した基体に対して夫々反応させた後で蛍光強度を測定することによっても、同様に検出を行うことが可能であった。
【0172】
【発明の効果】
本発明に基づく方法を用いると、標的核酸設計の際の自由度が得られると共に標的核酸検出における特異性、効率性および感度が向上され、且つ低費用および/または短時間で標的核酸構造を作出することが可能になる。
【0173】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の概要を示す図。
【図2】本発明の1態様である第1の例を示す図。
【図3】本発明の1態様である第2の例を示す図
【図4】本発明の1態様である第3の例を示す図
【図5】本発明の1態様である第4の例を示す図
【図6】本発明の1態様である第5の例を示す図
【図7】本発明の1態様である第6の例を示す図
【図8】本発明の1態様である第7の例を示す図
【図9】本発明の1態様である第8の例を示す図
【図10】本発明の1態様である第9の例を示す図
【図11】本発明の1態様である第10の例を示す図
【図12】本発明の1態様である第11の例を示す図
【図13】実施例1において、本発明に従う方法により製造したターゲットを用いて標的配列を検出した結果を示す図。
【図14】実施例2において、本発明に従う方法により製造したターゲットを用いて標的配列を検出した結果を示す図。
【図15】実施例5において用いた本発明の1例を示す図。
【図16】実施例6において用いた本発明の1例を示す図。
【図17】実施例7において、本発明に従う方法により製造したターゲットを用いて標的配列を検出した結果を示す図。
【符号の説明】
1,21,31,41,51,61,71,81,91,101,111,121,151,161.標的核酸 2,22,32,42,52,62,72,82,92,93,102,112,122,152,162.標的配列 3,24,34,44,54,64,74,84,96,106,114,124,154,164.保護鎖 4,25,35,45,57,67,76,86,97,107,116,126,156,165.ターゲット 5,26,37,46,56,69,77,87,98,99,108,115,125,158,167.核酸プローブ 23,33,43,53,63,73,83,94,103,113,123,153,163.プライマー 36,68,157,166.2本鎖核酸 55,65,75,85,95,105,155,.ストッパー核酸
Claims (10)
- 標的核酸の3’端付近に位置する標的配列の5’端よりも5’側の配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
- 標的核酸の5’端付近に位置する標的配列の3’端よりも3’側の配列に対して相補性を有し、且つ3’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、標的核酸の3’端付近の配列に対して相補性を有するプライマーと、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
- 第1の標的核酸の3’端付近に位置する第1の標的配列の5’端よりも5’側の配列に対して相補性を有する第1のプライマーと、第1の標的核酸に相補的な第2の標的核酸の5’端付近に位置する第2の標的配列の3’端よりも3’側の配列に対して相補性を有し、3’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、第2の標的核酸の3’端付近の配列に対して相補性を有する第2のプライマーと、伸長活性を有する酵素と、第1および第2の標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
- 標的核酸の3’端付近に位置する第1の標的配列の5’端よりも5’側の配列に対して相補性を有する第1のプライマーと、前記標的核酸の5’端付近に位置する第2の標的配列の3’端よりも3’側の配列に対して相補性を有し、3’末端に伸長不可能な修飾を含むストッパー核酸と、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
- 3’端付近の第1の標的配列と、第1の標的配列よりも5’側に存在する第2の標的配列と、第2の標的配列よりも5’側に存在する第3の標的配列と、5’端付近の第4の標的配列とを含む標的核酸における、第1、第2および第3の標的配列の各々の5’端よりも5’側に存在する夫々の配列に対して相補性を有する第1、第2および第3のプライマーと、第2、第3および第4の標的配列の3’端よりも3’側に存在する夫々の配列に対して相補性を有し、3’末端に伸長不可能な修飾を含む第1、第2および第3のストッパー核酸と、伸長活性を有する酵素と、前記標的核酸とを、適切な伸長反応が得られる条件下で反応することにより、1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。
- (1)標的核酸の3’端付近に位置する標的配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および前記標的配列の5’端よりも5’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第1のプライマーと、前記標的核酸の5’端付近の配列に相同性を有し、5’端に核酸分解酵素耐性核酸を含む第2のプライマーと、伸長活性を有する酵素と、当該標的核酸とその相補鎖からなる2本鎖核酸とを、適切な増幅反応が得られる条件下で反応することと、
(2)前記(1)の反応することにより得られた増幅産物を、前記分解酵素非耐性核酸を分解することの可能な核酸分解酵素によって消化することと、
を具備する1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。 - (1)第1の標的核酸の3’端付近に位置する第1の標的配列に相補的であり、且つ核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および第1の標的配列の5’端よりも5’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第1のプライマーと、
第2の標的核酸の3’端付近に位置する第2の標的配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、および第2の標的配列の5’端よりも5’側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なくとも含む第2のプライマーと、
伸長活性を有する酵素と、当該第1の標的核酸と第2の標的核酸からなる2本鎖核酸とを、適切な増幅反応が得られる条件下で反応することと、
(2)前記(1)の反応することにより得られた増幅産物を、核酸分解酵素により消化することと、
を具備する1本鎖核酸部分と2本鎖核酸部分とを含み、前記1本鎖核酸部分には標的配列が含まれ、前記2本鎖核酸部分には少なくとも標的配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる、標的配列を検出するためのターゲットの製造方法。 - (1)請求項1から7の何れか1項に記載の方法を用いてサンプル中の標的核酸を基にターゲットを製造することと、
(2)前記(1)で製造されたターゲットに対して、前記標的配列に相補的な核酸プローブを、適切なハイブリダイゼーションが得られる条件下で反応することと、
(3)前記(2)の反応により生じた結合を検出することにより、標的配列の存在を検出することと、
を具備する標的配列検出方法。 - 請求項1から7の何れか1項に記載の方法により製造されたターゲット。
- 請求項8に記載の検出方法を行うために、プライマー、伸長活性を有する酵素、ストッパー核酸、核酸増幅用酵素、核酸分解酵素および請求項9に記載のターゲットからなる群より少なくとも1選択された構成要素を具備する標的配列検出用アッセイキット。
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