WO2004085680A1 - 標的ヌクレオチド配列の検出方法、該方法の実施に用いる検出ターゲット構造およびその製造方法、並びに標的ヌクレオチド配列検出用アッセイキット - Google Patents

Abstract

本発明は、標的ヌクレオチド配列を検出するために有用な検出ターゲット構造の製造方法が提供される。たとえば、標的核酸（１）から検出ターゲット構造を製造する方法が提供される。標的核酸（１）は、その一部に標的ヌクレオチド配列２を含む（図１Ａ）。本発明の方法に従うと、標的核酸（１）の標的ヌクレオチド配列２以外の部分が２本鎖になるように、プライマーを用いて核酸の伸長を行い検出ターゲット構造４が製造される（図１Ｂ）。これにより製造された検出ターゲット構造、これを用いた標的ヌクレオチド配列検出方法、検出ターゲット構造製造用キット、および標的ヌクレオチド配列検出用アッセイキットも開示される。

Description

明 細 書

標的ヌク レオチ ド配列の検出方法、 該方法の実施に用いる検 出ターゲッ ト構造およびその製造方法、 並びに標的ヌク レオ チ ド配列検出用ア ツセィ キッ ト

技術分野

本発明は、 標的ヌ ク レオチ ド配列を検出するために有用な 検出ターゲッ ト構造の製造方法、 これによ り 製造された検出 ターゲッ ト構造、 これを用いた標的ヌ ク レオチ ド配列 出方 法、 検出ターゲッ ト構造製造用キッ ト、 および標的ヌ ク レオ チ ド配列検出用ア ツセィ キッ ト に関する。

背景技術

特定の核酸配列を含む核酸鎖を検出するために、 一般的に 次のよ う な手段が用い られている。 例えば、 そのよ う な方法 は、 検出対象である核酸鎖に相補的な 1 対のプライマ ーを用 いて増幅 した後で電気泳動を行ってその存在を検出する方法 や、 検出対象である標的ヌ ク レオチ ド配列に相補的な核酸鎮 を核酸プローブと して固定化した基体を用いて、 ハイブリ ダ ィゼーショ ンを行う 方法である。 また、 一般的には、 これら の検出に用いられるプライマーや核酸プローブは、 1 5塩基 程度以上の連続する特異的な配列をもつオリ ゴヌ ク レオチ ド である。 し力 しなが ら、 そのよ う なオリ ゴヌ ク レオチ ドを既 存のプライマ ーまたは核酸プローブ設計ソフ トな どを利用 し て設計した と しても、 反応系において標的ヌ ク レオチ ド配列 に高次構造が存在した り 、 部分的に類似する配列が存在 して いた り する こ と も多く 、 このよ う な場合、 ミ スアニー リ ング やセルフハイプリ ダイゼーシヨ ンなどを招 く こ と になる。 こ のよ う な従来の方法では、 目的とする標的ヌク レオチ ド配列 を高精度に効率よ く 検出する こ と は容易ではない。 また、 最 適な検出条件を設定するためには、 多く の時間と費用を費や さな く てはならない。

例えば、 核酸配列を高感度にかつ効率よ く 検出する方法と しては、 これまでの と ころ、 「ハイブリ ダイゼーショ ン法」 (特開平 6 — 7 0 7 9 9号公報を参照されたい） や 「部分二 重鎖 D N Aを利用 した D N A検出方法」 （特開平 1 1 一 3 3 2 5 6 6 号公報を参照されたい） などが提案されている。 こ れら の方法は、 検出すべき標的核酸の一部領域に相補的な配 列を含む核酸プローブと 当該標的核酸と をハイブ リ ダイ ズす る際、 そのハイ プリ ダイゼーショ ン反応の前またはハイ ブリ ダイゼーシ ョ ン反応時に、 前記核酸プローブの結合部位以外 の標的核酸の配列に対して相捕的な核酸鎖を添加 し、 ァニー リ ングして一部に 2本鎖を形成する方法である。 これ ら の方 法は、 何れも標的核酸の配列上で、 核酸プローブが認識する 領域を 1 本鎖に、 残り の領域を 2本鎖にする こ と によって非 特異的なハイブリ ダィゼーシ ョ ンを防ぐこ と を 目 的と してい る。

しかしながら上記の方法には、 実際に使用する には解決さ れるべき多く の問題点が存在している。 そのよ う な問題点の 幾つかは以下の通 り である。

"( 1 ) 「標的核酸」 と 「保護鎖」 と の二種類の分子を 1 本 鎖状態で調製する こ と が必須であるために工程数が多く なつ て しま う こ と ；

( 2 ) 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が限定される こ と。 非 特異的なハイブリ ダィゼーシ ョ ンを避ける為に、 ハイ プリ ダ ィゼーシ ョ ン反応液中には、 核酸プローブ以外の遊離 1 本鎖 核酸分子が出来るだけ存在しないこ と が望ま しい。 しかしな が ら、 標的核酸と保護鎖をアニーリ ングする際には、 長い核 酸同士を液体中で分子運動依存的に対合させるために、 分子 内高次構造などの影響によって理想的なァニーリ ングが行わ れず、 ハイ プリ ダイゼーシ ョ ンの効率が著しく 低下する場合 も多い。 これを防止するためには、 標的ヌ ク レオチ ド配列の 設計が限定されて しま う ；

( 3 ) 標的核酸作出に多く の時間が掛かる こ と。 これは、 例えば、 保護鎖と標的核酸との間の正確な塩基対形成を行わ せる 目的から、 長い時間をかけてァエー リ ング反応を行 う ェ 程が必須と なるためである ；

( 4 ) 特に、 「部分二重鎖 D N Aを利用 した D N A検出方 法」 (特開平 1 1 — 3 3 2 5 6 6 号公報を参照されたい） で は、 非対称 P C Rを用いて標的鎖と保護鎖と を作出する こ と が必要である こ と。 このため、 上記 ( 2 ) の問題をク リ ア し て定性分析が達成されたと しても、 社会的ニーズの高い定量 分析には対応できない。

発明の開示

本発明の 目的は、 標的ヌク レオチ ド配列を検出するために 有用な検出ターゲッ ト構造の製造方法、 これによ り 製造され た検出ターゲッ ト構造、 これを用いた標的ヌ ク レオチ ド配列 検出方法および標的ヌ ク レオチ ド配列検出用ア ツセィ キッ ト を提供する こ とである。

本発明は、 上記の課題を解決するために次のよ う な手段を 見出 した。

本発明の第 1 の側面に従 う と、 標的ヌ ク レオチ ド配列を検 出するために有用な検出ターゲッ ト構造の製造方法であ つ て ： 標的核酸の 3 ' 端付近に位置する標的ヌク レオチ ド配列 の 5 ' 端よ り も 5 ' 側にある配列に対して相補的なプライマ 一と、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 前記標的核酸 と を、 適切な伸長反応が得られる条件下で反応させる こ と を 含んでな り ； それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部 分と を含み、 前記 1 本鎖核酸部分には前記標的ヌ ク レオチ ド 配列が含まれ、 前記 2本鎖核酸部分には少な く と も前記標的 ヌク レオチ ド配列を除く 領域の標的核酸とそれに相捕的な保 護鎖が含まれる検出ターゲッ ト構造を得る方法が提供される。

本発明の第 2 の側面に従 う と、 標的ヌ ク レオチ ド配列を検 出する ために有用な検出ターゲッ ト構造の製造方法であつ て ： 標的核酸の 5 ' 端付近に位置する標的ヌ ク レオチ ド配列 の 3 ， 端よ り も 3 ， 側にある配列に対 して相補的で、 且つ 3 ' 末端に伸長不可能な修飾を含むス ト ッパー核酸と、 標的 核酸の 3 ' 端付近の配列に対して相補的なプライマーと 、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 前記標的核酸と を、 適 切な伸長反応が得られる条件下で反応させる こ と を含んでな り ； それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含 み、 前記 1 本鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前記 2本鎖核酸部分には少なく と も標的ヌク レオチ ド配列を 除く 領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる検出 ターゲッ ト構造を得る方法が提供される。

本発明の第 3 の側面に従 う と、 標的ヌ ク レオチ ド配列を検 出する ために有用な検出ターゲッ ト構造の製造方法であつ て ： 第 1 の標的核酸の 3 ' 端付近に位置する第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側にある配列に対して相補 的な第 1 のプライマーと、 第 1 の標的核酸に相補的な 2 の 標的核酸の 5 ' 端付近に位置する第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配 列の 3 ' 端よ り も 3 ' 側にある配列に対して相補的で、 且つ 3 ， 末端に伸長不可能な修飾を含むス ト ッパー核酸と、 第 2 の標的核酸の 3 ' 端付近の配列に対して相補的な第 2 のブラ イマ一と 、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 第 1 およ び第 2 の標的核酸と を、 適切な伸長反応が得られる条件下で 反応させる こ と を含んでな り ； それによつて、 1 本鎖核酸部 分と 2本鎖核酸部分と を含み、 前記 1 本鎖核酸部分には標的 ヌク レオチ ド配列が含まれ、 前記 2本鎖核酸部分には少なく と も標的ヌク レオチ ド配列を除く 領域の標的核酸とそれに相 補的な保護鎖が含まれる検出ターゲッ ト構造を得る方法が提 供される。

本発明の第 4 の側面に従 う と、 標的ヌク レオチ ド配列を検 出する ために有用な検出 ターゲッ ト構造の製造方法であつ て ： 標的核酸の 3 ' 端付近に位置する第 1 の標的ヌク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側にある配列に対して相補的な第 1 のプライマーと、 前記標的核酸の 5 ' 端付近に位置する第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列の 3 ' 端よ り も 3 ' 側にある配列 に対して相補的で、 且つ 3 ' 末端に伸長不可能な修飾を含む ス ト ッパー核酸と、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 前記標的核酸と を、 適切な伸長反応が得られる条件下で反応 させる こ と を含んでな り ； それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み、 前記 1 本鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前記 2本鎖核酸部分には少な く と も 標的ヌ ク レオチ ド配列を除く領域の標的核酸とそれに相補的 な保護鎖が含まれる検出ターゲッ ト構造を得る方法が提供さ れる。

本発明の第 5 の側面に従 う と、 標的ヌ ク レオチ ド配列を検 出する ために有用な検出ターゲッ ト構造の製造方法であつ て ： 3 ， 端付近の第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列と、 第 1 の標 的ヌ ク レオチ ド配列よ り も 5 ' 側に存在する第 2 の標的ヌク レオチ ド配列と、 第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列よ り も 5 ' 側 に存在する第 3 の標的ヌ ク レオチ ド配列と、 5 ' 端付近の第 4 の標的ヌ ク レオチ ド配列と を含む標的核酸における、 第 1 第 2 および第 3 の標的ヌク レオチ ド配列の各々の 5 ， 端よ り も 5 ' 側に存在する夫々の配列に対して相補的な第 1 、 第 2 および第 3 のプライマーと、 第 2 、 第 3 および第 4 の標的ヌ ク レオチ ド配列の 3 ' 端よ り も 3 ' 側に存在する夫々 の配列 に対して相補性を有し、 3 ' 末端に伸長不可能な修飾を含む 第 1 、 第 2および第 3 のス ト ッパー核酸と 、 ヌ ク レオチ ド伸 長活性を有する酵素と、 前記標的核酸と を、 適切な伸長反応 が得られる条件下で反応させる こ と を含んでな り ； それによ つて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み、 前記 1 本 鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前記 2本鎖 核酸部分には少な く と も標的ヌ ク レオチ ド配列を除く 領域の 標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる検出ターゲッ ト 構造を得る方法が提供される。

本発明の第 6 の側面に従 う と、 標的ヌ ク レオチ ド配列を検 出する ために有用な検出ターゲッ ト構造の製造方法であ つ て ： （ 1 ) 標的核酸の 3 ' 端付近に位置する標的ヌク レオチ ド配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、 お よび前記標的ヌク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側の配列 に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少な く と も 含む第 1 のプライマーと ； 前記標的核酸の 5 ' 端付近の配列 に相同性を有し、 5 ' 端に核酸分解酵素耐性核酸を含む第 2 のプライマーと ； ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と ； 当 該標的核酸とその相補鎮からなる 2本鎖核酸と を、 適切な増 幅反応が得られる条件下で反応させる こ と と ； ( 2 ) 前記 ( 1 ) の反応する こ と によ り 得られた増幅産物を、 前記分解 酵素非耐性核酸を分解でき る核酸分解酵素によって消化する こ と と を具備し ； それによ つて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核 酸部分と を含み、 前記 1 本鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド 配列が含まれ、 前記 2本鎖核酸部分には少な く と も標的ヌ ク レオチ ド配列を除く 領域の標的核酸とそれに相捕的な保護鎖 が含まれる検出ターゲッ ト構造を得る方法が提供される。

本発明の第 7 の側面に従 う と、 標的ヌク レオチ ド配列を検 出する ために有用な検出ターゲッ ト構造の製造方法であ つ て ：

( 1 ) 第 1 の標的核酸の 3 ' 端付近に位置する第 1 の標的 ヌ ク レオチ ド配列に相補的であ り 、 且つ核酸分解酵素非耐性 核酸から なる配列、 および第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸 からなる配列を少な く と も含む第 1 のプライマーと、

第 2 の標的核酸の 3 ， 端付近に位置する第 2 の標的ヌ ク レ ォチ ド配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列 および第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ， 側の 配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なく と も含む第 2 のプライマーと、

ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 当該第 1 の標的核 酸と第 2 の標的核酸からなる 2本鎖核酸と を、 適切な増幅反 応が得られる条件下で反応する こ と と 、

( 2 ) 前記 ( 1 ) の反応する こ と によ り 得られた增幅産物 を、 核酸分解酵素によ り 消化する こ と と を含んでな り 、

それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み 前記 1 本鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前 記 2本鎖核酸部分には少な く と も標的ヌク レオチ ド配列を除 く 領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる前記検 出ターゲッ ト構造を得る方法が提供される。

本発明の第 8 の側面に従 う と、 標的ヌク レオチ ド配列を検 出する方法であって ： （ 1 ) 請求項 1 から 7 の何れか 1 項に 記載'の方法を用いる こ と によ り 、 サ ンプル中の標的核酸に基 づいて検出タ ーゲッ ト構造を製造する こ と と ； （ 2 ) 前記 ( 1 ) で製造された検出ターゲッ ト構造に対して、 前記標的 ヌク レオチ ド配列に相補的な核酸プローブを、 適切なハイプ リ ダイゼーシ ョ ンが得られる条件下で反応させる こ と と ；

( 3 ) 前記 （ 2 ) の反応によ り 生じたハイ ブリ ダィゼーシ ョ ンを検出する こ と によ り 、 前記標的ヌ ク レオチ ド配 の存在 を検出する こ と と を具備する方法が提供される。

本発明の第 9 の側面に従 う と、 上記第 1 から第 7 の側面の 何れか 1 に記載の方法によ り製造された検出ターゲッ ト構造 が提供される。

本発明の第 1 0 の側面に従う と、 上記第 8 の側面に記載の 検出方法を行う ために、 プライマー、 ヌク レオチ ド伸長活性 を有する酵素、 ス ト ッパー核酸、 核酸増幅用酵素、 核酸分解 酵素および第 9 の側面に従 う検出タ一ゲッ ト構造からなる群 よ り 少な く と も 1選択された構成要素を具備する標的ヌ ク レ ォチ ド配列検出用ア ツセィ キッ トが提供される。

図面の簡単な説明

図 1 は、 本発明の概要を示す図である。

図 2 は、 本発明の 1 態様である第 1 の例を示す図である。 図 3 は、 本発明の 1 態様である第 2 の例を示す図である。 図 4 は、 本発明の 1 態様である第 3 の例を示す図である。 図 5 は、 本発明の 1 態様である第 4 の例を示す図である。 図 6 は、 本発明の 1 態様である第 5 の例を示す図である。 図 7 は、 本発明の 1 態様である第 6 の例を示す図である。 図 8 は、 本発明の 1 態様である第 7 の例を示す図である。 図 9 は、 本発明の 1 態様である第 8 の例を示す図である。 0 は 本発明の 1 態様である第 9 の例を示す図である 1 は 本発明の 1態様である第 1 0 の例を示す図であ る。

2 は、 本発明の 1態様である第 の例を示す図であ る。

図 1 3 は、 実施例 1 において、 本発明に従 う方法によ り 製 造した検出ターゲッ ト構造を用いて標的ヌク レオチ ド配列を 検出 した結果を示す図である。

図 1 4 は、 実施例 2 において、 本発明に従 う方法によ り 製 造した検出ターゲッ ト構造を用いて標的ヌ ク レオチ ド配列を 検出 した結果を示す図である。

図 1 5 は、 実施例 5 において用いた本発明の 1 例を示す図 である。

図 1 6 は 実施例 6 において用いた本発明の 1 例を示す図 である。

図 1 7 は 実施例 7 において、 本発明に従 う 方法によ り 製 造した検出ターゲッ 1、構造を用いて標的ヌ ク レオチ ド配列を 検出 した結果を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

1 . 発明の素描

本発明の態様に従 う と、 図 1 に示すよ う な標的核酸 1 から 検出ターゲッ ト構造を製造する方法が提供される。 標的核酸

1 は、 その一部に標的ヌク レオチ ド配列 2 を含む （図 1 A ) 具体的には、 本発明の方法に従 う と、 標的核酸 1 の標的ヌク レオチ ド配列 2以外の部分が 2本鎖になる よ う に、 プライマ 一を用いて核酸の伸長を行い検出ターゲッ ト構造 4が製造さ れる （図 1 B ) 。 即ち、 本発明に従 う検出ターゲッ ト構造の 製造方法は、 基本的には、 標的ヌ ク レオチ ド配列 2 を含む標 的核酸 1 を铸型と して用いて伸長反応または増幅反応を行う こ と を具備する方法である。 このよ う な本発明の態 «に従う 検出ターゲッ ト構造の製造方法によ り 製造された検出ターグ ッ ト構造 4 も本発明の更なる態様である。 また、 本発明の態 様に従う検出タ ーゲッ ト構造を利用 して、 標的ヌ ク レオチ ド 配列の検出を行 う こ と が可能である。 そのよ う な検出方法は. 例えば、 図 1 C に示すよ う に検出ターゲッ ト構造 4 の標的ヌ ク レオチ ド配列 2 に相補的な核酸プロ ーブ 5 を用い、 これを 標的ヌ ク レオチ ド配列 2 に対して反応させ、 生じたハイ プリ ダイゼーシ ヨ ンを検出する こ と に よ り 、 例えば、 サンプル中 に標的ヌ ク レオチ ド配列が存在する こ と、 または標的ヌ ク レ ォチ ド配列を含む標的核酸が存在する こ と を検出する こ と が 可能である。 こ のよ う な標的ヌ ク レオチ ド配列の検出方法も 本発明の範囲内である。

2 . 用語の説明

こ こ において使用 される 「サンプル」 と は、 核酸を含む試 料であればよ く 、 ヒ ト を含む真核生物から採取された組織お よび細胞、 原核生物、 ウィルス、 ウイ ロイ ドなどを含む検体 から、 必要に応 じて抽出、 増幅および精製な ど、 それ自身公 知の何れかの手段によって調製されればよ く 、 人工合成され た核酸分子であっても よい。

こ こ において使用 される 「標的ヌ ク レオチ ド配列」 の語は. 検出 しょ う とする 1 つの連続する配列を指す。 「標的核酸」 は標的ヌ ク レオチ ド配列を含む核酸を指し、 1 つの標的核酸 には 1 以上の標的ヌク レオチ ド配列が含まれても よい。 こ こ において使用 される 「核酸」 の語は、 D N A、 R N A、 S - オリ ゴ、 メ チルホスホネー トオリ ゴ、 P N A (即ち、 ぺプチ ド核酸） および L N A (即ち、 ロ ック核酸） などの核酸およ び核酸類似体、 それらの幾つかを共に含む核酸および核酸類 似体、 並びにそれらの混合物な ど、 一般的にその一部の構造 を塩基配列によって表すこ とができる物質を総括的に示す語 である。 また、 本発明において用いられる核酸は、 天然に存 在する も のであっても、 人工的に合成されたものであっても . またはそれらの混合物であっても よい。 こ こにおいて使用 さ れる 「ヌ ク レオチ ド」 と は、 上記のよ う な核酸を構成する 1 つの塩基に対応する単位をい う。 また、 「オリ ゴヌク レオチ ド」 と は、 上記のよ う な人工的に合成された核酸断片を指 し . 「オ リ ゴ D N A」 はその う ちの D N A断片を指す。

本発明における 「検出ターゲッ ト構造」 と は、 標的ヌ ク レ ォチ ド配列とそれに対応する核酸プローブと のハイプリ ダイ ゼーシヨ ンを利用 して実行される標的ヌ ク レオチ ド配列の検 出方法において、 核酸プローブを実際に結合させるために、 サンプルに含まれる元の標的核酸を基礎に して調製され製造 された製造物を指す。 特に、 本発明の態様に従 う 検出ターゲ ッ ト構造の製造方法に り 得られた検出ターゲッ ト構造は、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み、 前記 1 本鎖核酸 部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前記 2本鎖核酸部 分には少な く と も標的ヌク レオチ ド配列を除く領域の標的核 酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる。 即ち、 本発明の方法 に従い提供される検出ターゲッ ト構造と は、 1本鎖核酸部分 と 2本鎖核酸部分と を含む特定の構造を有する核酸である。 また、 当該検出ターゲッ ト構造は、 「検出用標的構造核酸」 および 「標的構造核酸」 と も称する こ と も可能である。

本発明における 「伸長する」 および 「伸長反応を行 う 」 は 同義であ り 、 鎵型である核酸に対して適切な条件下でプライ マーと核酸合成酵素を用い、 核酸を伸長して鐯型核酸の相補 鎖を形成する こ と をい う 。 また、 本発明におけ る 「増幅す る」 および 「増幅反応を行う」 は同義であ り 、 铸型である核 酸に対して適切な条件下でプライマ一と核酸合成酵素を用い , 核酸を伸長して铸型核酸の相補鎖を形成し 2本鎖を与える こ と と 、 得られた 2本鎖を変性あるいは鎖の置換反応な どによ り 1 本鎮を与える こ と と、 得られた 1 本鎖を铸型と して用い . 適切な条件下でプライマーと核酸合成酵素を用いて、 再度核 酸を伸長 して铸型核酸の相補鎖を形成して 2本鎖を与える こ と と を具備する反応を指す。 言い換えれば 「増幅」 と は、 1 本鎖への変換を前後の伸長反応の間で行いなが ら 2 回以上の 伸長反応を繰り 返し行う こ と をい う。

こ こで使用 される 「適切な伸長が得られる条件」 と は、 伸 長されるべき核酸およびプライマー、 ヌク レオチ ド伸長活性 を有する酵素、 伸長時に取り 込まれる核酸合成基質並びに伸 長反応に必要な補酵素などが存在し、 且つ温度および： p Hな どの諸条件が適切に制御され、 目的とする核酸が伸長され得 る条件をい う。 また、 こ こ で使用される 「適切な増幅が得ら れる条件」 と は、 増幅されるべき核酸およびプライマ ー 、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素、 伸長時に取り 込まれる核 酸合成基質並びに伸長反応に必要な補酵素な どが存在 し、 且 つ温度および p Hな どの諸条件が適切に制御される条件で行 われる伸長反応が、 少なく と も 2 回以上繰り 返して行われ、 目的とする核酸が増幅され得る条件をい う 。

本発明における 「保護鎖」 と は、 本発明の態様に従 う'検出 ターゲッ ト構造の製造方法において標的核酸を铸型と して形 成された核酸であ り 、 標的ヌ ク レオチ ド配列と は異なる部分 の標的核酸の配列に相補的な配列であ る。 こ の保護鎖の存在 によ り 、 標的ヌ ク レオチ ド配列以外の部位に核酸プローブや 他の核酸またはその標的核酸自身などが結合する こ と による 予期せぬ 2本鎖または立体構造の形成を防ぐこ と が可能であ 。

こ こにおいて使用 される 「ハイ ブリ ッ ドを検出する」 およ び 「結合を検出する」 は同義であ り 、 適切なハイ プリ ダイゼ ーショ ンが得られる条件下で、 複数の核酸について反応を行 つた場合に、 その複数の核酸の中に少なく と も 1 組の相補鎖 が存在していれば得られるハイ プリ ッ ドまたは結合を検出す る こ と を示す。 例えば、 このよ う なハイブリ ッ ドまたは結合 は、 当該相捕鎖の少な く と も何れか 1 に予め付与した標識物 質を検出する こ と によ り 検出が達成されても よ く 、 ハイ プリ ッ ドに存在する結合に対して選択的に結合する挿入剤を利用 して検出されても よい。 また、 適切なハイ ブリ ダィゼーショ ンが得られる条件下で複数の核酸について反応を行った場合 であっても、 その複数の核酸の中に相補鎖が存在 していなけ ればハイ ブリ ッ ドは得られない。 こ こで使用 される 「適切な ハイブリ ダィゼーシヨ ンが得られる条件」 と は、 ある 1 つの 反応系において互いに相補性を有する核酸鎖が存在していれ ば、 反応を行う こ と によ り ハイプリ ダイゼーショ ンが得られ る条件をいい、 例えば、 ス ト リ ンジェン ト な条件であればよ い。

3 . 検出ターゲッ ト構造の製造方法

( I ) プライマーの結合位置を調節する こ と によ り 所望の 検出ターゲッ ト構造を製造する方法

以下の第 1 の例から第 3 の例は、 3 ， 端付近に標的ヌ ク レ ォチ ド配列を含む標的核酸を基に して検出ターゲッ ト構造を 製造する方法である。 これらの例は、 標的核酸に対するブラ イ マ一の結合位置を調節する方法である。

( 1 ) 第 1 の例

図 2 を用いて、 本発明の態様に従う検出ターゲッ ト構造の 製造方法の第 1 の例を説明する。 標的核酸 2 1 は、 3 ' 端付 近に標的ヌ ク レオチ ド配列 2 2 を含む (図 2 A ) 。 標的核酸 2 1 における標的ヌ ク レオチ ド配列 2 2 の位置よ り も 5 ' 側 (即ち、 標的ヌ ク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側） の配 列に対してプライマー 2 3 を結合させ、 適切な伸長反応が得 られる条件下で核酸を伸長する （図 2 B ) 。 これによつて標 的核酸 2 1 に相補的な保護鎖 2 4 が形成され、 2本鎖核酸部 分と標的ヌ ク レオチ ド配列を含む 1 本鎖核酸部分と を有する 検出ターゲッ ト構造 2 5 が得られる （図 2 B ) 。

このよ う な本発明の態様に従 う反応によ り.得られた検出タ 一ゲッ ト構造 2 5 は、 図 2 Cに示すよ う に、 核酸プローブ 2 6 を用いた標的ヌク レオチ ド配列の検出に利用する こ と が可 能である。 標的ヌク レオチ ド配列 2 2 に対する核酸ブローブ 2 6 の結合を検出する こ と によ り 標的ヌク レオチ ド配列 2 2 または標的核酸 2 1 の検出が可能である。

こ こで使用され得るプライマ ーは何れの種類の核酸であつ ても よ く 、 その長さは、 実施者が選択したプライマーの配列 に特異的なハイ プリ ダイゼーショ ンが得られるために充分な 長さがあればよい。 例えば、 そのよ う な特異的なハイプリ ダ ィゼーショ ンが得られる長さの例は、 5塩基長以上であれば よ く 、 好ま しく は 9塩基長以上である。

こ こで使用され得る伸長反応は、 プライマ ー 2 3 が、 標的 核酸 2 1 を铸型と して核酸を合成 して、 保護鎖 2 4 を含む 2 本鎖を形成 し得る条件下で行われればよい。 そのよ う な条件 は、 ヌク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 伸長時に取 り 込 まれる核酸合成基質と、 伸長反応に必要な補酵素などが存在 し、 且つ温度および： Hなどの諸条件が適切に制御される条 件であればよい。 本発明において使用 され得る酵素は、 例え ば、 5 ' から 3 ' へ核酸鎖を伸長する活性を有する酵素であ ればよい。 本明細書では 「核酸鎖を伸長する活性」 を 「ヌク レオチ ド伸長活性」 と略して用いる こ と もある。 例えば、 核 酸合成酵素であればよ く 、 D N Aポリ メ ラーゼおよび R N A ポリ メ ラーゼな どのポリ メ ラーゼであっても、 逆転写酵素で あっても よい。 また、 適切な温度の制御は、 ヒーターな どの それ自身公知の手段によ り 、 標的核酸 2 1 およびプライマー 2 3 の配列や、 酵素の種類などを基に実施者によ り選択され た温度に制御されてよい。 また、 p Hの制御は、 それ自身公 知の手段によ り 塩の種類、 その組み合わせおよび濃虔な どに よって制御すればよい。 また、 伸長反応時に取り 込まれる核 酸合成基質は、 一般的に使用されるそれ自身公知の核酸合成 基質類であってよい。 詳細な条件は、 使用する酵素、 配列お よび核酸の種類などに応じて実施者が選択でき るであろ う。 本発明において使用 され得る標的ヌ ク レオチ ド配列 2 2 は 実施者が検出 しょ う とする配列であればよ く 、 長さは、 5塩 基〜 3 0 0塩基、 好ま しく は 9塩基〜 5 0塩基であればよい また、 本明細書において用いる 「 3 ' 端付近」 と は、 標的 核酸の最も 3 ' 端に位置する塩基から約 A番目 までの塩基を 示し、 後述において用いる 「 5 ， 端付近」 と は 5 ， 端に位置 する塩基から約 A番目 目 までの塩基を示す。 例えば、 標的ヌ ク レオチ ド配列が 3 ' 端付近に存在する場合には、 最も 3 ' 端に位置する塩基を含んでも、 含まな く て も よい。 こ こで 「 A」 番目 とは、 問題と なる標的ヌク レオチ ド配列の塩基数 の 2分の 1 の長さである。 即ち ：

A = (標的ヌク レオチ ド配列の塩基数） Z 2

である。

好ま しく は、 以上のよ う な本発明の態様に従 う方法は次の よ う'に行っても よい。 即ち、 標的核酸の 3 ' 端付近に存在す る標的ヌ ク レオチ ド配列の 5 ' 側に隣接または標的ヌ ク レオ チ ド配列よ り も 5 ' 側に存在する 9塩基以上の配列に対して 相補的な配列を有する核酸からなるプライマーと、 核酸合成 酵素と を、 当該標的核酸を含むサンプルに対して添加 し、 標 的核酸を錡型と して伸長反応を行 う。 これによ り 、 .1 本鎖核 酸部分と 2本鎖核酸部分を含む検出ターゲッ ト構造 製造す る。

検出ターゲッ ト構造を製造する場合には、 当該サンプルは 標的核酸を含むこ とが必要であるが、 必ずしも標的核酸のみ を含む必要はな く 、 他の核酸と共に含まれても よい。 本発明 の態様に従 う反応を行 う ためには、 サンプルにおける標的核 酸の量が、 サンプルに含まれる核酸全体の約 3 %以上、 よ り 好ま しく は 1 0 %以上、 更に好ま しく は 2 0 %以上である こ と が好ま しい。 また、 必要に応 じて、 本発明に従 う方法に供 する前に、 それ自身公知の何れかの増幅手段によ り標的核酸 を増幅 して も よい。 増幅手段の例は、 P C R増幅、 および ucleic acid s t r an a amp 11 r ι c a tion ( N A S B A ) 、 Transcription mediated amplification ( T M A ) 、 Li gase chain reaction ( L C R ) 、 Strand displacement amplification ( S D A ) 、 I sot her ma 1 and し himeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids ( I C A N N ) お よ び Rolling circle amplification ( R C A ) 法、 Loop mediated amplification ( L A M P ) 法 などである。

上述のよ う な本発明の態様では、 標的核酸におけるプライ マーの結合部位によ り 、 結果と して得られる検出ターゲッ ト 構造の 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分の境界が決定される。 当該検出ターゲッ ト構造においては、 標的ヌ ク レオチ ド配列 の両側に 1 本鎖のヌ ク レオチ ドが約 1 0 0塩基まで存在 して も よいが、 標的ヌク レオチ ド配列のみが 1 本鎖である こ と力 s 好ま しい。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で標的ヌク レオチ ド配列の設計が 自 由にでき、 且つ短時間で 簡便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ と が可能である。 従 つて、 経済性および操作性が向上される。

( 2 ) 第 2の例

図 3 を用いて、 本発明の態様に従 う 検出ターゲッ ト構造の 製造方法の第 2 の例を説明する。 上述 した第 1 の例において は標的核酸が 1 本鎖であつたが、 第 2 の例では、 2本鎖の標 的核酸が用いられる例を示す。

図 3 を参照されたい。 まず、 2本鎖の標的核酸 3 1 を用意 する。 標的核酸 3 1 は、 第 1 の標的核酸 3 1 a と、 3 ， 端付 近に標的ヌ ク レオチ ド配列 3 2 を含む第 2 の標的核酸 3 1 b と を含む (図 3 A ) 。

適切な伸長が得られる条件下で、 標的核酸 3 1 に対して、 第 1 のプライマ ー 3 3 a と第 2 のプライマ ー 3 3 b と を添カロ して伸長反応を行う （図 3 Bおよび C ) 。 その結果、 第 1 の 伸長産物である 2本鎖 3 6 (図 3 B ) と、 第 2 の伸長産物で ある検出ターゲッ ト構造 3 5 が得られる （図 3 C ) 。 得られ た検'出ターゲッ ト構造 3 5 は、 標的ヌク レオチ ド配列 3 2 を 含む 1本鎖核酸部分と、 標的ヌ ク レオチ ド配列を含まない第 2 の標的核酸 3 1 b および保護鎖 3 4 b を含む 2本鎮核酸部 分と を含む。

また、 第 2 の例において適切な伸長が得られる条件と は、 標的核酸 3 1 に対してプライマー 3 3 a および b が適切に結 合する こ と も具備する。 例えば、 当該伸長に先駆けてそれ自 身公知の変性手段、 例えば、 熱、 アルカ リ 、 および塩の添加 などの手段によって 2本鎖の標的核酸 3 1 を 1 本鎖に解離さ れても よい。

以上の本発明の態様に従 う第 2 の例は、 標的核酸が 2本鎖 である こ と以外は、 第 1 の例と 同様に実施する こ と が可能で ある。 また、 第 2 の例において使用 され得る反応の条件や、 標的核酸、 プライマーおよび検出ターゲッ ト構造についての 各条件も、 第 1 の例に従って変更 しても よい。

当該伸長反応によ り 得られた検出ターゲッ ト構造 3 5 を、 核酸プロ ーブ 3 7 を用いた標的ヌ ク レオチ ド配列の検出に利 用する こ と が可能である (図 3 D ) 。 例えば、 第 1 の例に記 載の方法と 同様に、 標的ヌ ク レオチ ド配列 3 2 に対する核酸 プロ ーブ 3 6 の結合を検出する こ と によって標的ヌ ク レオチ ド配列の検出が可能である。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ と が可能である。 従つ て、 経済性および操作' |½が向上される。

( 3 ) 第 3 の例

図 4 を用いて、 本発明の態様に従う検出ターゲッ ト構造の 製造方法の第 3 の例を説明する。 第 2 の例においては、 2本 鎖標的核酸 3 1 から 1 つの検出ターゲッ ト構造 3 5 が得られ たのに対して、 第 3 の例では 2本鎖標的核酸 4 1 から 2つの 検出ターゲッ ト構造 4 5 a および 4 5 b が得られる。 このこ と以外は第 2 の例と 同様の手順によ り 第 3 の例を実施する こ とが可能である。

図 4 を参照されたい。 2本鎖の標的核酸 4 1 は、 3 ' 端付 近に第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列 4 2 a を含む第 1 の標的核 酸 4 l a と、 3 ， 端付近に第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 4 2 b を含む第 2 の標的核酸 4 l b と を含む （図 4 A ) 。

適切な伸長が得られる条件下で、 標的核酸 4 1 に対して、 第 1 のプライマ ー 4 3 a と第 2 のプライマ ー 4 3 b と を添加 し、 核酸の伸長反応を行う （図 4 B ) 。 その結果、 第 1 の伸 長産物である第 1 の検出ターゲッ 1、構造 4 5 a と、 第 2 の伸 長産物であ る第 2 の検出 タ一ゲッ ト構造 4 5 b が得 られる

(図 4 B ) 。 各々 の検出ターゲッ ト構造 4 5 a および b は、 標的ヌ ク レオチ ド配列 4 2 a または b を含む 1本鎖核酸部分 と、 標的核酸 4 1 a または b の一部分およびそれに対 して相 補的な保護鎖 4 4 a または b を含む 2本鎖核酸部分と を含む _t 以上のよ う な本発明の態様に従 う第 3 の例は、 2本鎮の標 的核酸から 2つの検出ターゲッ ト構造が得られる こ と以外は. 第 2 の例の方法と同様に実施する こ とが可能である。 従って . 第 3 の例における適切な伸長が得られる条件、 その他の第 3 の例において使用され得る反応の条件、 並びに標的核酸、 プ ライマーおよび検出ターゲッ ト構造についての条件も、 上述 した第 2 の例において記載された条件と同様の条件であって よ く 、 また、 第 2の例と 同様に種々の変更を行っても よい。

当該伸長反応によ り 得られた検出ターゲッ ト構造 4 5 a お よび Zまたは検出ターゲッ ト構造 4 5 b は、 核酸プローブ 4 6 a および Zまたは核酸プローブ 4 6 b を用いた標的'ヌ ク レ ォチ ド配列の検出に利用する こ と が可能である （図 4 C ) 。 例えば、 第 1 の例に記載された方法と 同様に、 標的ヌ ク レオ チ ド配列 4 2 a および Zまたは b に対する核酸プローブ 4 6 a および または b の結合を検出する こ と によって標的ヌク レオチ ド配列の検出が可能である。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ とが可能である。 従つ て、 経済性および操作性が向上される。 更に、 第 3 の例に従 えば、 2 箇所の標的ヌ ク レオチ ド配列を同時に検出する こ と が可能になる。

( I I ) ス ト ッパー核酸を使用する方法

以下の第 4の例から第 6 の例は、 5 ， 端付近に標的ヌ ク レ ォチ ド配列を含む標的核酸を基に して検出ターゲッ ト構造を 製造する方法である。

( 4 ) 第 4 の例

図 5 を用いて、 本発明の態様に従う検出ターゲッ ト構造の 製造方法の第 4 の例を説明する。 標的核酸 5 1 は、 標的ヌク レオチ ド配列 5 2 を 5 ' 端付近に含む （図 5 A ) 。 まず最初 に、 標的核酸 5 1 の 3 ' 端付近にプライマー 5 3 の結合する ための配列を選択する。 また、 標的核酸 5 1 における標的ヌ ク レオチ ド配列 5 2 の位置よ り も 3 ， 側にス ト ッパー核酸 5 5 の結合するための配列を選択する。 ス ト ッパー核酸 5 5 の 3 ' 末端は、 それ以上 3 ' 側に伸長反応が進まないよ う に伸 長不可能な修飾がなされている。

ス ト ッパー核酸 5 5 が、 標的核酸 5 1 における標的ヌ ク レ ォチ ド配列 5 2 よ り も 3 ' 側の部位に結合して存在した状態 で、 標的核酸 5 1 の 3 ' 端付近の配列に結合するプライマー 5 3 を用いて、 適切な伸長反応が得られる条件下で、 5 ， か ら 3 ' に向けて核酸を伸長する。 その結果、 保護鎖 5 4 が形 成される (図 5 B ) 。 上記の通 り ス ト ッパー核酸 5 5 の 3 ， 末端は、 それ以上伸長反応を受けないよ う に修飾がな されて いる。 そのため、 ス ト ッパー核酸 5 5 よ り も先には伸長反応 は進まない。 従って、 標的核酸 5 1 に含まれる標的ヌ ク レオ チ ド配列 5 2 は 1 本鎖のままで維持される。

こ こで使用され得るプライマー 5 3 は、 何れの種類の核酸 であっても よ く 、 その長さ は、 実施者が選択したプライ マー の配列に特異的なハイ プリ ダィゼーショ ンが得られるために 充分な長さがあればよい。 例えば、 そのよ う な特異的なハイ プリ ダイゼーショ ンが得られる長さの例は、 上述の第 1 の例 に記載される通 り でよい。

こ こで使用され得るス ト ッパー核酸は、 何れの種類の核酸 であってよ く 、 所望する位置の配列に特異的に結合するのに 充分な長さがあればよい。 例えば、 そのよ う な特異的な結合 が得られる長さの例は、 5塩基長以上であればよ く 、 好ま し く は 9塩基長以上である。 ス ト ッパー核酸の 3 ' 末端の修飾 は、 それ以上 3 ， 側に伸長反応が進まないよ う な修飾であれ ば何れの修飾がなされても よい。 これらに限定される もので はないが、 例えば、 3 ' 末端の リ ン酸化およびダイデォキシ ヌク レオチ ドの使用な どの手段であればよい。 また、 '使用さ れるヌク レオチ ド伸長活性を有する酵素の種類に応じて、 そ れらの修飾の種類が選択されても よい。 図 5 では、 当該修飾 の 1 例と してス ト ッパー核酸 5 5 の 3 ， 末端が リ ン酸化され た例を示 した。 図中、 当該修飾は丸印に 「 P」 で示す。

こ こで使用 され得る伸長反応は、 プライマー 5 3 が、 標的 核酸 5 1 を鍩型と して核酸の伸長を開始し、 保護鎖 5 2 を含 む 2本鎖を形成 し得る条件下で行われればよい。 そのよ う な 条件は、 例えば、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 伸 長時に取り 込まれる核酸合成基質類と、 伸長反応に必要な捕 酵素などが存在 し、 且つ温度および p Hな どの諸条件が適切 に制御される条件であればよい。 本発明において使用 され得 る酵素は、 上述 した第 1 の例に記載の通 り であってよい。 ま た、 適切な温度の制御および p I- Iの制御も上述した第 1 の例 の記載の通 り であってよい。

本発明において使用 され得る標的ヌ ク レオチ ド配列 5 2 は 実施者が検出 しょ う とする配列であればよ く 、 長さは、 5塩 基〜 3 0 0塩基、 好ま しく は 9塩基〜 5 0塩基であればよい また、 標的ヌ ク レオチ ド配列 5 2 は、 標的核酸 5 1 の 5 ， 端 付近に存在する が、 5 ' 末端を含む塩基を含んでいて も、 5 ' 末端を含む塩基を含まなく ても よい。 以上のよ う な本発明の態様に従 う方法は、 好ま しく は以下 のよ う に行っても よい。 即ち、 標的核酸の 5 ' 端付近に存在 する標的ヌ ク レオチ ド配列の 3 ' 側に隣接または標的ヌ ク レ ォチ ド配列よ り も 3 ⁵ 側に存在する 9塩基以上の配列に対し て相補的な配列を有 し、 且つその 3 ' 末端が水酸基 （一 O H ) 以外の官能基と なる よ う に修飾された核酸であるス ト ッ パー核酸と、 標的核酸の 3 ' 端付近の配列に相捕的な核酸で あるプライマーと、 核酸合成酵素と を、 当該標的核酸を含む サンプルに対して添加し、 当該標的核酸を铸型と して伸長反 応を行う。 それによ り 、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を具備する検出ターゲッ ト構造が製造される。

また、 上述の方法では、 当該プライマーに対する伸長反応 は、 標的ヌ ク レオチ ド配列の検出方法において使用 される標 的ヌ ク レオチ ド配列に相補的な核酸プローブ配列と 同 じ極性 の保護鎮を合成する。

この よ う な本発明 ©態様に従 う反応によ り 得られた検出タ ーゲッ ト構造 5 7 を、 核酸プローブ 5 6 を用いた標的ヌ ク レ ォチ ド配列の検出に利用する こ と が可能である (図 5 C ) 。 標的ヌ ク レオチ ド配列 5 2 に対する核酸プローブ 5 6 の結合 は、 上述 した第 1 の例に記載の手段によ り 行ってよい。

上述のよ う な本発明の態様では、 標的核酸を铸型と して用 い、 プライマーとス ト ッパー核酸を用いて核酸を伸長する方 法が示された。 即ち、 検出ターゲッ ト構造に含まれる 1 本鎖 核酸部分と 2本鎖核酸部分と の境界は、 伸長反応の停止位置 をス ト ッパー核酸の結合する部位を選択する こ と によって制 御される こ と によ り 決定される。 それによ り 、 得られる検出 ターゲッ ト構造は標的核酸上の標的ヌ ク レオチ ド配列の領域 が 1 本鎖であ り 、 他の領域が 2本鎖と なる。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ と が可能である。 従つ て、 経済性および操作性が向上される。

( 5 ) 第 5 の例

図 6 を用いて、 本発明の態様に従 う検出ターゲッ ト構造の 製造方法の第 5 の例を説明する。 上述 した第 4 の例において は標的核酸 5 1 が 1 本鎮であつたが、 第 5 の例では、 2本鎮 の標的核酸を用いる。 ，

図 6 を参照されたい。 2本鎖の標的核酸 6 1 を用意する。 標的核酸 6 1 は、 5 ' 端付近に標的ヌ ク レオチ ド配列 6 2 を 含む第 1 の標的核酸 6 1 a と、 第 2 の標的核酸 6 1 b と を含 む (図 6 A ) 。

まず最初に、 標的核酸 6 l a の 3 ' 端付近にプライマー 6 3 の結合するための配列を設定する。 また、 標的核酸 6 1 a における標的ヌク レオチ ド配列 6 2 の位置よ り も 3 ， 側にス ト ッパー核酸 6 5 の結合するための配列を設定する。 ス ト ツ パー核酸 6 5 の 3 ' 末端は、 それ以上 3 ， 側に伸長反応が進 まなレ、よ う に修飾がなされている。

ス ト ッパー核酸 6 5 が、 標的核酸 6 1 a における標的ヌク レオチ ド配列 6 2 の位置よ り も 3 ' 側の配列に結合して存在 する状態で、 標的核酸 6 1 a の 3 ' 端付近の配列に結合する プライマー 6 3 a と 、 標的核酸 6 1 b の 3 ' 端付近の配列に 結合するプライマ ー 6 3 b と を用いて、 適切な伸長反応が得 られる条件下で、 5 ' から 3 ' に向けて核酸を伸長する （図 6 B ) 。 当該伸長によ り保護鎖 6 4 a と 6 4 b が形成される _c 当該伸長反応の後に、 第 1 の標的核酸 6 1 a を基に第 1 の 伸長産物である検出ターゲッ ト構造 6 7が得られ、 第 2 の標 的核酸 6 1 b を基に第 2 の伸長産物である 2本鎖 6 8 が得ら れる。

第 5 の例における適切な伸長が得られる条件と は、 標的核 酸 6 1 a および b に対して、 プライマ ー 6 3 a および b が適 切に結合する こ と も具備する。 例えば、 当該伸長に先駆けて、 それ自身公知の変性手段、 例えば、 熱、 アルカ リ 、 および塩 の添加な どの手段によ り 2本鎖の標的核酸 6 1 を 1 本鎖に解 離しても よい。

以上の態様に従 う 第 5 の例は、 標的核酸が 2本鎮である こ と以外は、 第 4 の例と 同様に実施する こ とが可能である。 ま た、 第 5 の例において使用 され得る反応の条件や、 標的核酸. ス ト ッパー核酸、 プライマーおよび検出ターゲッ ト構造など についての条件も、 第 4 の例に従って変更 してよい。

当該伸長反応によ り 得られた検出ターゲッ ト構造 6 7 を、 核酸プローブ 6 9 を用いた標的ヌ ク レオチ ド配列の検出に利 用する こ とが可能である （図 6 C ) 。 標的ヌ ク レオチ ド配列 6 2 に相補的な核酸プローブ 6 9 の当該標的ヌ ク レオチ ド配 列 6' 2への結合を検出する こ と によって、 標的ヌ ク レオチ ド 配列の検出が可能である。 当該結合の検出は、 上述の第 1 の 例と 同様の方法によ り 行っても よい。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ とが可能である。 従つ て、 経済性および操作性が向上される。

( 6 ) 第 6 の例

図 7 を用いて、 本発明の態様に従 う検出ターゲッ ト構造の 製造方法の第 6 の例を説明する。 前述の第 5 の例においては、 2本鎖標的核酸 6 1 から 1 つの検出ターゲッ ト構造 6 7 が得 られたのに対して、 以下に記載する第 6 の例では、 2本鎖標 的核酸 7 1 に含まれる各々 の核酸 7 1 a および 7 1 b 力、 ら 夫々検出ターゲッ ト構造 7 6 a と 7 6 b が得られる。 このこ と以外は第 5 の例に記載の方法と 同様に第 6 の例を実施する こ と が可能である。

図 7 を参照されたい。 2本鎖の標的核酸 7 1 は、 5 ， 端付 近に第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列 7 2 a を含む第 1 の標的核 酸 7 l a と、 5 ' 端付近に第 2 の標的ヌク レオチ ド配列 7 2 b を含む第 2 の標的核酸 7 1 b と を含む。

まず最初に、 標的核酸 7 1 a の 3 ' 端付近にプライ マー 7 3 a の結合するための配列を設定する。 また、 標的核酸 7 1 a の標的ヌ ク レオチ ド配列 7 2 a よ り も 3 ' 側にス ト ッパー 核酸 7 5 a が結合するための配列を設定する。 ス ト ッパー核 酸 7 5 a の 3 ' 末端は、 それ以上 3 ' 側に伸長反応が進まな いよ'う に修飾されている。 同様に、 標的核酸 7 1 b の 3 ' 端 付近にプライマー 7 3 b の結合するための配列を設定する。 また、 標的核酸 7 1 b の標的ヌ ク レオチ ド配列 7 2 b よ り も 3 ， 側にス ト ッパー核酸 7 5 b の結合するための配列を設定 する。 ス ト ッパー核酸 7 5 b の 3 ， 末端は、 それ以上 3 ' 側 に伸長反応が進まないよ う に修飾されている。 図 7 では、 ズ ト ッパー核酸 7 5 a および b の 3 ' 末端がそれ以上 3 ' 側に 伸長反応が進まないよ う に修飾されている こ と を丸印によ り 示した。

ス ト ッパー核酸 7 5 a および 7 5 が、 夫々、 標的核酸 7 1 a および 7 1 b における標的ヌ ク レオチ ド配列 7 2 a およ び 7 2 b よ り も 3 ' 側の配列に結合して存在する状態で、 標 的核酸 7 1 a および 7 1 b の 3 ， 端付近に結合するプライマ 一 7 3 a および 7 3 b を用いて、 適切な伸長反応が得られる 条件下で、 5 ， から 3 ' 方向に核酸を伸長する。 その結果、 保護鎖 7 4 a および b が形成され、 第 1 の伸長産物である検 出ターゲッ ト構造 7 6 a と、 第 2 の伸長産物である検出ター ゲッ ト構造 7 6 b が得られる。 標的ヌ ク レオチ ド配列 7 2 a および b の部分は、 両者 と も 1 本鎖のままで維持される。 夫々 の検出タ一ゲッ ト構造 7 6 a および b は、 標的ヌ ク レオ チ ド配列 7 2 a および b を含む 1 本鎖核酸部分と、 標的核酸 7 1 a および b の一部分とそれに対して相補的な保護鎖 7 4 a および b と を含む 2本鎖核酸部分と を夫々含む。

以上の本発明の態様に従う第 6 の例は、 標的核酸をなす 2 本鎖から、 2つの検出ターゲッ ト構造が得られる こ と以外は, 第 5 の例の方法と 同様に実施する こ と が可能である。 従って . 第 6 の例における適切な伸長が得られる条件、 その他の使用 され得る反応の条件や、 標的核酸、 ス ト ッパー核酸、 プライ マーおよび検出ターゲッ ト構造についての条件は、 上述 した 第 5 の例における条件と 同様の条件であってよ く 、 また、 第 5 の例と 同様に種々 の変更を行 う こ と が可能である。

また、 当該伸長反応によ り得られた検出ターゲッ ト構造 7 6 a および検出ターゲッ ト構造 7 6 b を、 核酸プローブ 7 7 a および核酸プローブ 7 7 b を用いた標的ヌク レオチ ド配列 の検出に利用する こ と が可能である。 例えば、 前述した何れ のか例と 同様に、 標的ヌ ク レオチ ド配列 7 2 a および b に対 する核酸プローブ 7 7 a および b の結合を検出する こ と によ り標的ヌ ク レオチ ド配列の検出が可能である。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ とが可能である。 従つ て、 経済性および操作性が向上される。 更に、 第 6 の例に従 えば、 2 箇所の標的ヌ ク レオチ ド配列を同時に検出する こ と が可能になる。

( I I I ) プライマーの結合位置を調節する こ と と、 ス ト ッパー核酸を用いる こ と によって核酸プローブ結合部分を形 成する方法

上述の （ I ) と （ I I ) に記載の方法を組み合わせる こ と によ り 、 更に種々のタ イ プの標的ヌク レオチ ド配列を自 由に 設計する こ とが可能になる。 そのよ う な例を以下の第 7 の例 から第 9 の例に示す。

( 7 ) 第 7の例 図 8 を用いて、 本発明の態様に従 う検出ターゲッ ト構造の 製造方法の第 7 の例を説明する。 前述の第 6 の例においては、 第 1 の標的核酸と第 2 の標的核酸は、 何れもその 5 ' 端付近 に標的ヌ ク レオチ ド配列を有していた。 これに対して、 以下 に説明する第 7 の例においては、 第 1 の標的核酸においては 3 ' 端付近に標的ヌ ク レオチ ド配列が存在し、 第 2 の標的核 酸では 5 ' 端付近に標的ヌ ク レオチ ド配列が存在する。

図 8 を参照されたい。 2本鎖である標的核酸 8 1 は、 第 1 の標的核酸 8 1 a と第 2 の標的核酸 8 1 b と を含む。 第 1 の 標的核酸 8 1 a の 3 ， 端付近には第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配 列 8 2 a が存在する。 第 2 の標的核酸 8 1 b の 5 ' 端付近に は第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 8 2 b が存在する。 第 1 の標 的核酸 8 2 a と第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 8 2 b は、 互い に相補的であっても、 相補的ではなく ても よい。

第 1 の標的核酸から第 1 の検出ターゲッ ト構造 8 6 a を作 出する こ と は、 上述した第 1 の例に示した方法と 同様の方法 によ り 行 う こ とが可能である。 即ち、 第 1 の標的核酸におけ る標的ヌ ク レオチ ド配列 8 2 a の存在する位置よ り も 5 ' 側 の配列に相補的な配列を有するプライマー 8 3 a を用いて適 切な伸長が得られる条件下で伸長反応を行って保護鎖 8 4 a を与え、 検出ターゲッ ト構造 8 6 a を作出すればよい。 また 第 1 の例に記載したの と 同様に種々の変更を行っても よい。

第 2 の標的核酸から第 2 の検出ターゲッ ト構造 8 6 b を作 出ずる こ と は、 上述の第 5 の例に示した方法と 同様の方法に よ り 行う こ とが可能である。 即ち、 第 2 の標的核酸の 3 ' 端 付近に一部の配列に相補的なプライマー 8 3 b を用いて、 ス ト ッパー核酸 8 5 の存在する条件下で、 適切な伸長が得られ る条件下で伸長反応を行って保護鎖 8 4 b を与え、 検出ター ゲッ ト構造 8 6 b を作出すればよい。 こ こで、 ス ト ッパー核 酸 8 5 は、 標的核酸 8 1 b における標的ヌ ク レオチ ド配列 8 2 b の存在する位置よ り も 3 ' 側の配列に相補的な配列を有 する。 このよ う な第 2 の標的核酸からの検出ターゲッ ト構造 の作出は、 ま た、 上述 した第 5 の例に記載 したの と 同様に 種々 の変更を行っても よい。 また、 図 8 では、 3 ' 側方向へ の伸長反応を阻害するためのス ト ッパー核酸 8 5 の 3 ' 末端 における修飾を丸印によって示 した。

上述の第 1 の標的核酸に対する伸長と、 第 2 の標的核酸に 対する伸長は、 同時に行っても よ く 、 または順次に行っても よい。 例えば、 同時に行う場合は、 上述した 2本鎖を標的核 酸と して用いる他の例と 同様に、 第 1 の標的核酸と第 2 の標 的核酸の両方について適切な伸長反応が得られる条件下で、 伸長反応を行えばよい。

また、 第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列と第 2 の標的ヌ ク レオ チ ド配列は、 同 じ長さで 1 0 0 %の相補性を有していて も よ く 、 一方が他方よ り も長く ても よ く 、 同 じ長さで両末端が多 少ずれていても よい。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ とが可能である ので、 経済性および操作性が向上される。 また更に、 第 7 の例に従 えば、 1 箇所の標的ヌク レオチ ド配列を 2本の相捕鎖につい て同時または順次に検出する こ とが可能である。 従って、 目 的とする標的ヌ ク レオチ ド配列の検出を確実に行 う こ と が可 能であ り 、 判定精度の向上が可能である。 例えば、 一塩基多 型 Single nucleotide polymorphisms ξΧ _Ν S Ν Ρ と s己 す） を検出場合などに特に有利である。

また、 当該検出ターゲッ ド構造を用いての標的ヌク レオチ ド配列検出は、 上述した他の例と 同様に、 第 1 の標的ヌ ク レ ォチ ド配列 8 2 a に対して相補的な核酸プローブ 8 7 a と、 第 2 の標的ヌク レオチ ド配列 8 2 b に対して相補的な核酸プ ローブ 8 7 b と を用いて、 それらの標的核酸への結合を検出 する こ と によ り 行えばよレヽ。

( 8 ) 第 8 の例

図 9 を用いて、 本発明の態様に従 う検出ターゲッ ト構造の 製造方法の第 8 の例を説明する。 図 9 を参照されたい。 1 本 鎖である標的核酸 9 1 は、 3 ， 端付近に第 1 の標的ヌ ク レオ チ ド配列 9 2 を有し、 5 ， 端付近に第 2 の標的ヌ ク レオチ ド 配列 9 3 を有する （図 9 A ) 。 このよ う な標的核酸 9 1 力 ら 検出ターゲッ ト構造 9 7 を製造する （図 9 B ) 。 標的核酸 9 1 における第 1 の標的ヌク レオチ ド配列 9 2 の存在する位置 よ り も 5 ' 側の一部の配列に相補的なプライマー 9 4 と 、 標 的核酸 9 1 における第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 9 3 の存在 する位置よ り も 3 ' 側の一部の配列に相捕的なス ト ッパ一核 酸 9' 5 が存在し、 適切な伸長反応が得られる条件下で伸長反 応を行って保護鎖 9 6 を与え、 検出ターゲッ ト構造 9 7 を作 出する。 図 9 では、 3 ' 側方向への伸長反応を阻害するため のス ト ッパー核酸 9 5 の 3 ' 末端における修飾を丸印によつ て示した。

検出は、 第 1 の標的ヌク レオチ ド配列 9 2 に対して相補的 な第 1 の核酸プローブ 9 8 と、 第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 9 3 に対して相捕的な第 2 の核酸プローブ 9 9 と を用いて、 それぞれの標的ヌク レオチ ド配列への核酸プローブの結合を、 上述した他の例と 同様の方法によ り 検出すればよい。

上記した第 8 の例では、 標的核酸と して 1 本鎖を用いたが、 2本鎖の標的核酸に対しても同様に第 8 の例の方法を適用す る こ とが可能である。 また、 第 8 の例は、 上述した第 1 の例、 第 2 の例、 第 4 の例および第 5 の例の方法に従ってそれらの 変更 と 同様に所望の変更を行っても よい。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ とが可能であるので、 経済性および操作性が向上される。

( 9 ) 第 9 の例

図 1 0 を用いて、 3 以上の標的ヌク レオチ ド配列を含む標 的核酸についての検出ターゲッ ト構造を製造する方法の例を 説明する。 図 1 0 を参照されたい。 1 本鎖である標的核酸 1 0 1 は、 3 ， 側、 即ち 3 ' 端付近の第 1 の標的ヌ ク レオチ ド 配列 1 0 2 a 、 第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 1 0 2 b 、 第 3 の檩的ヌ ク レオチ ド配列 1 0 2 c 、 最も 5 ， 側、 即ち 5 ， 端 付近の第 4 の標的ヌク レオチ ド配列 1 0 2 d を有する （図 1 0 A ) 。 このよ う な標的核酸 1 0 1 から検出ターゲッ ト構造 を製造する。 まず、 標的核酸 1 0 1 における第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列 1 0 2 a の 5 ' 端よ り も 5 ， 側の配列に相補的 な第 1 のプライマー 1 0 3 a と、 第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配 列 1 0 2 b の 5 ' 端よ り も 5 ' 側の配列に相補的な第 2 のプ ライマー 1 0 3 b と、 第 3 の標的ヌク レオチ ド配列 1 0 2 c の 5 ' 端よ り も 5 ， 側の配列に相補的な第 3 のプライマー 1 0 3 c を用意する。 更に、 3 つのス ト ッパー核酸を用意する。 第 1 のス ト ッパー核酸 1 0 5 a は、 標的核酸 1 0 1 における 第 2 の標的ヌク レオチ ド配列の存在する位置よ り も 3 ' 側の 配列に相補的な配列を有する。 第 2 のス ト ッパ一核酸 1 0 5 b は、 第 3 の標的ヌ ク レオチ ド配列の存在する位置よ り も 3 ， 側の配列に相補的な配列を有する。 第 3 のス ト ッパー核 酸 1 0 5 c は、 第 3 の標的ヌク レオチ ド配列の存在する位置 よ り も 3 ⁵ 側の配列に相補的な配列を有する。

第 1 のプライマー 1 0 3 a 、 第 2 のプライマー 1 0 3 b お よび第 2 のプライマー 1 0 3 c と、 第 1 のス ト ッパー核酸 1 0 5 a 、 第 2 のス ト ッパ一核酸 1 0 5 b および第 3 のス ト ツ パー核酸 1 0 5 c が存在し、 適切な伸長反応が得られる条件 下で伸長反応を行って第 1 の保護鎖 1 0 6 a 、 第 2 の保護鎖 1 0 6 b および第 3 の保護鎖 1 0 6 c を与え、 検出ターゲッ ト構造 1 0 7 を作出する （図 1 0 B ) 。

このよ う に作出された検出ターゲッ ト構造 1 0 7 は、 一度 に 4'箇所の標的ヌク レオチ ド配列の存在について検出する こ とが可能である。 そのよ う な検出は、 上述の何れかの例と 同 様に、 第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列 1 0 2 a 、 第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 1 0 2 b 、 第 3 の標的ヌク レオチ ド配列 1 0 2 c および第 4 の標的ヌク レオチ ド配列 1 0 2 d に対する、 夫々 の核酸プローブ 1 0 8 a 、 1 0 8 b 、 1 0 8 c および 1 0 8 d の結合を検出する こ と によ り 行えばよい。

上記の第 9 の例では、 1 つの標的核酸上に標的ヌク レオチ ド配列が 4つある例を示したが、 標的ヌク レオチ ド配列の数 が 3 以上ある場合には第 9 の例の方法を適用 してよい。 また 標的ヌク レオチ ド配列は、 必ずしも標的核酸の 5 ' および, または 3 ' 端に接して存在 しな く と も よ く 、 幾つかの塩基を 残した何れかの端に存在しても よ く 、 標的核酸の中央付近に のみ存在 しても よい。 また、 図 1 0 では、 3 ， 側方向への伸 長反応を阻害するためのス ト ッパー核酸 1 0 5 a 、 b および c の夫々 の 3 ' 末端における修飾を丸印によって示した。 また上記の第 9 の例では、 標的核酸と して 1 本鎖を用いた が、 2本鎖の標的核酸に対しても同様に第 9 の例の方法を適 用する こ と が可能である。 その場合、 2本鎖から 1 つの検出 ターゲッ ト構造を得ても 2つの検出ターゲッ ト構造を得ても よい。 また、 第 9 の例は、 上述 した第 1 の例、 第 2 の例、 第 4 の例および第 5 の例の方法に従ってそれらの例における変 更と 同様に所望の変更を行っても よい。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に'検出ターゲッ ト構造を製造する こ とが可能であるので、 経済性および操作性が向上される。 ( I V ) 酵素によ り 核酸プローブ結合部分を形成する方法 以下の第 1 0 および ' 1 1 の例は、 一旦、 標的核酸の全長を 複製して 2本鎖を作成した後に、 所望する標的ヌ ク レオチ ド 配列部分のみを 1 本鎖にする方法の例である。 具体的には、 核酸増幅に用い られるプライマーの少なく と も一部配列を予 め核酸分解酵素耐性と なる よ う修飾しておき、 このプライマ 一を用いて試料を伸長または増幅し、 伸長または増幅後に得 られた 2本鎮核酸をェキソヌ ク レアーゼを用いて修飾部分ま で消化する。 これによ り 、 1本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分 と を有する検出ターゲッ ト構造を作出する こ とが可能である ( 1 0 ) 第 1 0 の例

図 1 1 を用いて、 本発明の態様に従 う検出ターゲッ ト構造 の製造方法の第 1 0 の例を説明する。 検出ターゲッ ト構造の 基礎となる標的核酸 1 1 1 は、 第 1 の標的核酸 1 1 1 a と第 2 の標的核酸 1 1 1 b とからなる 2本鎖標的核酸 1 1 1 であ る。 第 1 の標的核酸 1 1 l a の 3 ' 端付近に標的ヌ ク レオチ ド配列 1 1 2 が存在する。 この よ う な標的核酸 1 1 1 を、 第 1 のプライマー 1 1 3 a と第 2 のプライマー 1 1 3 b と を用 いて、 保護鎖 1 1 4 a および b を伸長する。

こ こで第 1 のプライマー 1 1 3 a は、 第 1 の標的核酸 1 1 1 a の 3 ' 端付近の配列に相補的なプライマーであ り 、 標的 ヌ ク レオチ ド配列 1 1 2 に相補的な配列と、 当該標的ヌ ク レ ォチ ド配列よ り も 5 ' 側の標的核酸上の配列に対して相補的 な配列を含む。 また、 第 1 のプライマー 1 1 3 a に含まれる 標的ヌク レオチ ド配列に相捕的な配列部分は、 核酸分解酵素 非耐性のヌ ク レオチ ドで構成される。 また、 少な く と も当該 標的ヌク レオチ ド配列よ り も 5 ' 側の配列に相捕的な配列の 一部分、 好ま しく は標的ヌ ク レオチ ド配列に隣接する配列を 含む一部分の配列が核酸分解酵素耐性核酸である。 一方、 第

2 のプライマー 1 1 3 b は、 第 2 の標的核酸 1 1 1 b の 3 ' 端付近の配列に相補的なプライマーである。 第 2 のプライマ 一 1 1 3 b は、 少な く と も 5 ， 端が核酸分解酵素耐性である ので、 核酸分解酵素によ る消化は受けない。

上記のよ う な標的核酸 1 1 1 と第 1 のプライマー 1 1 3 a および第 2 のプライマー 1 1 3 b と を存在させ、 適切な伸長 反応が得られる条件下で、 核酸を伸長する (図 1 1 A ) 。 そ の後、 得られた 2本鎖を変性して 1 本鎖にする。 更に得られ た 1 本鎖を鑤型と して、 上述と 同 じ第 1 のプライマ一 1 1 3 a と第 2 のプライマー 1 1 3 b を用いて、 適切な伸長反応が 得 られる条件下で伸長反応を行 う (図 1 1 B ) 。 その後、

5 ' 末端側から核酸を分解する核酸分解酵素を、 適切な分解 活性が得られる条件下で反応させる (図 1 1 C ) 。 この反応 系に存在する核酸の う ち、 露出された 5 ' 末端に核酸分解酵 素耐性ヌ ク レオチ ドが含まれない核酸は、 当該核酸分解酵素 によって分解される。 これによ り 、 保護鎖 1 1 4 a ' と保護 鎖 1 1 4 b と を具備する検出ターゲッ ト構造 1 1 6 が得られ る （図 1 1 C ) 。

この よ う に得られた検出ターゲッ ト構造 1 1 6 に対して、 核酸プローブ 1 1 5 をハイ ブリ ダィズし、 上述の他の例と 同 様にこの結合を検出する こ と によ り標的ヌ ク レオチ ド配列の 検出を行 う こ と が可能である （図 1 1 D ) 。

こ こで使用される核酸分解酵素は、 5 ' 末端側から核酸を 分解するエタ ソヌク レアーゼな どのヌ ク レアーゼであればよ < 、 例えば、 T 7 Ge n e 6 Exo nu c l e a s e な どを好ま し < 使用で さ る。

上述したよ う に本発明において使用 され得る標的ヌク レオ チ ド配列は、 実施者が検出 しょ う とする配列であればよ く 、 長さは、 5塩基〜 3 0 0塩基、 好ま しく は 9塩基〜 5 0塩基 であればよい。 また、 標的ヌ ク レオチ ド配列 1 1 2 は、 標的 核酸の 3 ， 端付近に存在し、 上述 した他の例と 同様に、 3 ， 末端を含んで存在しても よ く 、 3 ， 末端を含まずに端から離 れた位置に配置しても よい。

こ こで使用 され得る第 1 のプライマ ーは、 上述 したよ う に 特定の位置が核酸分解酵素に耐性であ り 、 標的ヌ ク レオチ ド 配列に対応する部分は核酸分解酵素非耐性の核酸である。 第 1 のプライマ ーは、 そのよ う な条件が得られれば何れの種類 の核酸であっても よい。 その長さ は、 実施者が選択した第 1 のプライマーの配列に特異的なハイ ブリ ダイゼーショ ンが得 られるために充分な長さであ り 、 且つ上述のよ う な標的ヌ ク レオチ ド配列の塩基長よ り も長い塩基長であればよい。 例え ば、 本例において使用 され得る第 1 のプライマーの長さの例 は、 6塩基長以上であればよ く 、 好ま しく は 1 0塩基長以上 である。 また、 上述したよ う に、 本例において使用される第 1 めプライマ ーは、 標的核酸の 3 ' 端付近に存在する標的ヌ ク レオチ ド配列よ り も 5 ' 側に隣接またはよ り 5 ， 側に存在 するヌク レオチ ドに相捕的な部分が核酸分解酵素耐性である 核酸分解酵素耐性であるヌク レオチ ドの数は、 1 から 3 0 0 塩基であればよ く 、 好ま しく は 1 塩基から 5 0塩基、 よ り好 ま し く は 1塩基から 3 0塩基であればよい。 第 1 のプライマ 一の結合する標的ヌク レオチ ド配列に相補的な部分は、 核酸 分解酵素非耐性のヌ ク レオチ ドで構成される。 また、 第 1 の プライマーは、 当該核酸分解酵素耐性ヌク レオチ ドょ り も さ らに 3 ⁵ 側に核酸分解酵素非耐性ヌ ク レオチ ドを含んでいて あ よい。

こ こで使用 される第 2 のプラ イ マーは、 少な く と もその 5 ' 末端に核酸分解酵素に耐性であるヌク レオチ ドを含み、 それ以外の部分は核酸分解酵素非耐性ヌク レオチ ドを含めば よい。 第 2 のプライマーの全長は、 5 カゝら 1 0 0塩基であれ ばよ く 、 好ま しく は 6塩基から 5 0塩基、 よ り 好ま しく は 1 0塩基カゝら 3 5塩基であればよい。 また、 第 2 のプライマー の核酸分解酵素非耐性核酸は、 約 4塩基から約 9 9塩基であ ればよ く 、 好ま しく は約 5塩基から約 4 9塩基、 よ り 好ま し く は 9塩基から 3 4塩基である。

本例において所望するヌク レオチ ドを、 核酸分解酵素耐性 とするには、 それ自身公知の何れかの核酸分解酵素耐性化手 段を用いてヌ ク レオチ ドを修飾すればよい。 例えば、 そのよ う な手段は、 フォス フォジエステル結合部分へのホス ホロチ ォエ ー ト修飾な どであるが、 .これに限定される も のではない また、 適切に伸長反応が得られる条件下と は、 例えば、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 伸長時に取り 込まれる 核酸合成基質と、 伸長反応に必要な捕酵素な どが存在 し、 且 つ温度および p Hなどの諸条件が適切に制御される条件であ ればよい。 本発明において使用 され得る酵素は、 上述 した第 1 の例において使用可能な酵素であってよい。 また、 適切な 温度の制御や p Hの制御な どの.条件も上述の第 1 の例に記載 した条件を用いてよい。

また上記の例では、 図 1 1 の （ A ) の後に更なる 1 回の伸 長を行っているが、 これを更に繰り 返しても よい。 即ち、 本 例のよ う な本発明の態様に従 う方法においては、 2 回以上の 伸長する こ と を含む増幅反応を具備していても よい。 このよ う な増幅は、 それ自身公知の何れかの増幅手段によ り 行って よい。 増幅手段の例は、 P C R増幅、 および Nucleic acid strand amplification (NASB A) 、 Transcription mediated amplification (TMA) 、 L i ga s e chain reaction (LCR) 、 Strand displacement amplification (SDA) 、 Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids (ICANN) お よ び Rol 1 ing circle amplification (RCA) 法、] Loop mediated amplification (LAMP)法な どである。 本 例においては、 増幅反応を行う こ と によ り 、 よ り 多く の検出 ターゲッ ト構造が同時に製造される。

サンプルに含まれる標的核酸を用いて、 上述の第 1 0 の例 を用いて本発明に従 う検出ターゲッ ト構造を製造する場合、 こ こでサンプルは標的核酸を含めばよいが、 必ず しも標的核 酸めみを含む必要はな く 、 他の核酸と共に含まれても よい。 しか しなが ら、 好ま しく 本発明の態様に従 う反応を行 う ため には、 サンプルにおける標的核酸の量が、 サンプルに含まれ る核酸全体の約 3 %以上であればよ く 、 よ り 好ま し く は 1 0 %以上、 更に好ま しく _は 2 0 %以上である。 また、 必要に 応じて、 本発明に従 う方法に供する前に、 それ自身公知の何 れかの増幅手段によ り標的核酸を増幅しても よい。 増幅手段 の 列 は 、 P C R 増 幅 お よ び Nucleic acid strand amplification (NASBA 、 Transcription mediated amplification (TMA) 、 Ligase chain reaction (LCR) 、 Strand displacement amplification (SDA) 、 Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids (ICANN) お よ び Rolling circle amplification (RCA) 法、 Loop mediated amplification (LAMP) 法などである。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ と が可能である。 従つ て、 経済性および操作性が向上される。

( 1 1 ) 第 1 1 の例

図 1 2 を用いて、 本発明の態様に従 う検出ターゲッ ト構造 の製造方法の第 1 1 の例を説明する。 検出ターゲッ ト構造製 造の基礎と なる標的核酸 1 2 1 は、 第 1 の標的核酸 1 2 1 a と第 2 の標的核酸 1 2 1 b とカゝらなる 2本鎖標的核酸 1 2 1 である （図 1 2 A ) 。 第 1 1 の例は、 第 1 およぴ第 2 の標的 核酸の両方の 3 ' 端付近に標的ヌ ク レオチ ド配列 1 2 2 a お よび b が存在する場合の例である。 従って、 上述の第 1 0 の 例の変形例である。 第 1 の標的核酸 1 2 l a の 3 ， 端付近の第 1 の標的ヌ ク レ ォチ ド配列 1 2 2 a に相補的な配列を有する第 1 のプライマ 一 1 2 3 a と、 第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 1 1 2 b に相補 的な配列を有する第 2 のプライマー 1 2 3 b と を用いて伸長 反応を行 う （図 1 2 A ) 。 次に、 得られた 2本鎖を変性し、 得られた 1 本鎖について同様の第 1 のプライマー 1 2 3 a と 第 2 のプライマー 1 2 3 b とヌク レオチ ド伸長活性を有する 酵素を用いて、 再度伸長を行う （図 1 2 B ) 。 次に核酸分解 酵素によ り 5 ' 末端から核酸分解酵素非耐性核酸を分解する _t それによ り 、 1 本鎖核酸部分と して存在する標的ヌク レオチ ド配列 1 2 2 a および b と相補鎖 1 2 4 a ' および b ' 力、ら' なる 2本鎖核酸部分と を具備する点対称な検出ターゲッ ト構 造 1 2 6 が得られる (図 1 2 C ) 。

こ こで、 プライマー 1 2 3 a と b は、 各々 5 ' 端側に核酸 分解酵素非耐性ヌ ク レオチ ドを含むが、 こ の核酸分解酵素非 耐性ヌク レオチ ドは標的ヌ ク レオチ ド配列 1 2 2 a および b に対応する部分に存在すればよい。 また、 各標的核酸におけ る標的ヌ ク レオチ ド配列の存在位置よ り も 5 ' 側の と領域相 補的な配列中に核酸分解酵素耐性ヌ ク レオチ ド部分が存在す る。

本第 1 1 の例では、 当該伸長反応に続いて、 核酸分解酵素 によ り各保護鎖 1 2 4 a および b の 5 ， 端に存在する核酸分 解酵素非耐性ヌ ク レオチ ドが分解される。 従って、 本第 1 1 の树において使用される第 1 のプライマー 1 2 3 a と第 2 の プライマー 1 2 3 b は、 両者と も基本的な構造は、 第 1 0 の 例において記載した第 1 のプライマーと同様でよい。 即ち、 標的ヌ ク レオチ ド配列に相捕的な配列と なる部分に核酸分解 酵素に対して非耐性であるヌク レオチ ドが含まれ、 それよ り も 3 ' 側に存在する配列の一部が、 好ま しく は標的ヌ ク レオ チ ド配列に相補的な配列に隣接する部分の配列が、 核酸分解 酵素耐性ヌク レオチ ドである。 このよ う な第 1 のプライマー 1 2 3 a と第 2 のプライマー 1 2 3 b の構成以外は、 本第 1 1 の例は、 上述した第 1 0 の例と 同様の方法によ り 行ってよ く 、 更に第 1 0 の例の変更と同様に所望の変更を行っても よ レヽ

このよ う に得られた検出ターゲッ ト構造 1 2 6 に対して、 核酸プロープ 1 2 5 a および b を同時または順次にハイ プリ ダイ ズし、 上述 した他の例と 同様の方法によ り この結合を検 出する こ と によって標的ヌ ク レオチ ド配列を検出する こ と が 可能であ る (図 1 2 D ) 。

上述のよ う な本発明の態様に従 う方法によ り 、 少ない工程 で、 標的ヌ ク レオチ ド配列の設計が自 由にでき、 短時間で簡 便に検出ターゲッ ト構造を製造する こ とが可能である。 従つ' て、 経済性および操作性が向上される。

以上説明 した検出 タ ーゲ ッ ト 構造の製造方法の各態様 ( I ) 〜 （I V) によ り 得られる効果を、 よ り 具体的に例示す れば次の通 り である。

• NAT 遺伝子、 MDR 遺伝子、 CYP 2D 6 遺伝子などをは じめ と しだ種々 の ヒ ト代謝酵素遺伝子配列を対象と して、 検出ター ゲッ ト構造の製造方法 （ I ) 、 （ Π ) 、 ( I I I ) に従って作 成したサ ンプルをハイプリ ダイゼーシ ョ ン操作に使用 した場 合、 該遺伝子配列中に含まれる遺伝的多系を効率的かつ経済 的に検出でき る。

- Cyt b遺伝子、 D- Loop 領域な どをはじめ と した種々 の ヒ ト ミ ト コ ン ドリ ア遺伝子配列を対象と して、 検出タ ゲッ ト 構造の製造方法 （ I ) 、 ( Π ) 、 ( III) に従って作成 した サ ンプルをハイ プリ ダイゼーショ ン操作に使用 した場合、 該 遺伝子配列中に含まれる遺伝的多系を効率的かつ経済的に検 出でき る。

• Aspergillus 、 Candida 禺 、 Tri cnomonas )禹 、 Cryptosporidium 属をはじめ と した種々 の真核生物の r -RNA 遗伝子配列を対象 と して、 検出タ ーゲッ ト構造の製造方法 ( I ) 、 ( Π ) 、 ( III) に従って作成 したサンプルをハイ プリ ダイゼーシ ヨ ン操作に使用 した場合、 該遺伝子配列中に 含まれる遗伝的多系を効率的かつ経済的に検出でき る。

■ Aspergillus f禺 '、 Candida 、 Trichomonas 属 、

Cryptosporidium 属をはじめと した種々 の真核生物の r - RNA 遗伝子を対象と して、 検出ターゲッ ト構造の製造方法 ( V ) に従って作成したサ ンプルをハイ プリ ダイゼーショ ンに使用 した場合、 該ターゲッ ト構造を効率的かつ経済的に検出でき る。

• Helicobacter Ι ,、 Bacillus 偶 Clostridium属を fま じめ と した種々 の原核生物の r -RNA 遺伝子配列及び病原性関連 遺伝子配列を対象 と して、 検出タ ーゲッ ト構造の製造方法 ( I ) 、 ( Π ) 、 ( III) に従って作成 したサンプルをハイ プリ ダイゼーシ ョ ン操作に使用 した場合、 該遺伝子配列中に 含まれる遺伝的多系を効率的かつ経済的に検出でき る。

• Hel i cobacter属、 Bacillus属 Clostridium は じめ と した種々 の原核生物の r -RNA 遺伝子配列及ぴ病原性関連 遺伝子配列を対象と して、 検出タ ーゲッ ト構造の製造方法

( IV) に従って作成したサンプルをハイプリ ダィ ゼーシ ョ ン に使用 した場合、 該ターゲッ ト構造を効率的かつ経済的に検 出でき る。

■ MHV、 HPV、 HCV、 HBV、 HIV、 HEV をは じめ と した種々 の ウィルス遺伝子配列を対象と して、 検出ターゲッ ト構造の製 造方法 ( I ) 、 ( Π ) 、 ( III) に従って作成 したサンプル をハイプ リ ダイゼーシ ョ ン操作に使用 した場合、 該遺伝子配 列中に含まれる遺伝的多系を効率的かつ経済的に検出でき る ,

• MHV、 HPV、 HCV、 HBV、 HIV、 HEV をは じめ と した種々 の ゥィルス遣伝子配列を対象と して、 検出ターゲッ ト構造の製 造方法 ( IV) に従って作成 したサンプルをハイブリ ダィゼー シ ヨ ンに使用 した場合、 該ターゲッ ト構造を効率的かつ経済 的に検出でき る。

4 . 検出ターゲッ ト構造

上述のよ う な本発明の方法に従って製造された検出ターゲ ッ ト構造も本発明に含まれる。 また、 このよ う な本発明に従 う検出ターゲッ ト構造は、 標的ヌ ク レオチ ド配列またはこれ を含む標的核酸の検出に好ま しく 使用 される。 また、 本発明 に従い製造された検出ターゲッ ト構造は、 溶液中で遊離した 状態で使用 されても、 ビーズおょぴ基板な どの基体に固定化 された状態で使用されても よい。 即ち、 遊離型の検出ターゲ ッ ト構造および基体に固定化された検出ターゲッ ト構造の何 れも本発明 と して提供される。

一般的に、 標的ヌ ク レオチ ド配列の検出は、 目 的とする標 的ヌク レオチ ド配列に対して相補的な核酸プローブを結合さ せ、 その結合を検出する こ と によ り 行われる。 多く の場合に おいて標的ヌク レオチ ド配列は、 サンプル中で単独で存在す る よ り も、 複数の異なる配列を有する核酸と共に存在 した り 一部に標的ヌ ク レオチ ド配列を含む標的核酸に含まれて存在 した り 、 また等 しい配列を有する標的ヌク レオチ ド配列ゃ標 的核酸が数多く 集まって存在する。 従って、 標的ヌク レオチ ド配列やそれを含む標的核酸の 自 己相補性による二次構造や 他の配列と のク ロ スハイブリ ダイゼーショ ンが生じる可能性 は低く ない。 そのよ う な予期しない結合が生じれば、 その結 果、 標的ヌ ク レオチ ド配列の検出の精度は低く なる。 しかし なが ら、 本発明の検出ターゲッ ト構造によれば、 自 己相捕性 や他の配列と の相補性によ る意図 しないハイプリ ダイゼーシ ョ ンの発生を抑制する こ と が可能であ る。

5 . 標的ヌ ク レオチ ド配列検出方法

上述のよ う な本発明に従い製造された検出ターゲッ ト構造 を用いて標的ヌ ク レオチ ド配列または標的核酸を検出する方 法も本発明に含まれる。

即ち、 当該検出の対象と なるサンプルを用意する。 次に所 望 応じて 目的の配列を含む核酸を増幅する。 その後、 上述 した本発明の態様に従 う方法によ り検出ターゲッ ト構造を製 造する。 次に、 検出の対象となる標的核酸に対して相補的な 核酸プローブを、 製造された当該検出ターゲッ ト構造に対し て、 適切なハイ プリ ダイゼーショ ンが得られる条件下で反応 させる。 その結果、 当該サンプル中に標的核酸が存在する場 合には、 当該核酸プローブと標的ヌク レオチ ド配列と の間に ハイ ブリ ダィゼーシヨ ンが生じる。 従って、 このハイ ブリ ダ ィゼーシ ョ ンによる結合を検出すれば、 サンプル中の標的ヌ ク レオチ ド配列または標的核酸の存在を検出する こ とが可能 である。

本発明において使用 され得る核酸の増幅手段は、 それ自身 公知の増幅手段であればよ く 、 例えば、 P C R増幅、 および Nucleic acid strand amp 1 i f i ca t i on (NASBA)、 Tran s cr i p 11 on mediated am lification (TMA)、し igase chain reaction (し CR)、 Strand displacement amplification (SDA) 、 Isothermal and Chimeric primer-initiated Am lification of ucleic acids (ICANN)お よ ぴ olling circle amplification (RCA) 法、 Loop mediated amplification (LAMP)法な どであればよ い。 本発明において、 適切なハイ プリ ダイゼーシヨ ンが得ら れる条件と は、 標的ヌ ク レオチ ド配列に含まれる塩基の種類、 核酸プローブ固定化基体に具備される核酸プローブの種類、 試料核酸の種類およびそれらの状態な どの諸条件に応じて、 当業者であれば適宜選択する こ とが可能である。

また、 本発明に従 う 検出ターゲッ ト構造を使用する標的ヌ ク レ'ォチ ド配列の検出方法において用いられる検出手段は、 核酸プローブを使用 して実施されるそれ自身公知の一般的な 検出手段であればよい。 例えば、 そのよ う な検出手段は、 核 酸プローブに予め蛍光標識、 化学発光物質および色素な どの 検出可能な標識物質を付与しておき、 これを検出する検出方 法や、 当該結合部分に対して特異的に結合可能なイ ンタ力 レ ータ を検出する こ と を利用 した検出方法、 並びに電^化学的 に当該結合部分を認識する物質を用いて電気化学的検出方法 などである。

6 · ア ツセィ キ ッ ト

( 1 ) 検出ターゲッ ト構造製造用キッ ト

本発明の態様に従 う と、 上述のよ う な本発明の態様に従 う 検出ターゲッ ト構造を製造するための検出ターゲッ ト構造製 造用キッ ト も本発明に含まれる。

本発明の態様に従 う検出ターゲッ ト構造製造用キッ ト は、 上述 したよ う な種々 のプライマー、 核酸合成酵素、 核酸合成 基質、 ス ト ッパー核酸を得るための必要な試薬、 核酸分解酵 素、 核酸の核酸分解酵素耐性化のために必要な試薬、 核酸プ ローブ、 核酸プローブを標識するための標識物質および他の 試薬、 並びに所望の基体の少な く と も 1 を具備すればよ く 、 それらの幾つかを組み合わせて具備しても よい。

( 2 ) 標的ヌ ク レオチ ド配列検出用ア ツセィ キ ッ ト 本発明はまた、 上述したよ う な本発明の態様に従 う 検出タ ーゲッ ト構造を用いて標的ヌク レオチ ド配列を検出するため の標的ヌ ク レオチ ド配列検出用ア ツセィ キッ ト も提供する。 本発明の態様に従う標的ヌ ク レオチ ド配列検出用ア ツセィ キ ッ ト は、 本発明の態様に従 う検出ターゲッ ト構造、 核酸ブラ イマ一、 結合を検出するための検出可能な標識物質および検 出を行う ための種々 の試薬の少なく と も 1 を具備すればよ く 、 それらの幾つかを組み合わせて具備しても よい。 また更に、 上述した検出ターゲッ ト構造製造用キッ ト に具備される上述 したよ う な種々 のプライマー、 核酸合成酵素、 核酸合成基質、 ス ト ッパー核酸を得るための必要な試薬、 核酸分解酵素、 核 酸の核酸分解酵素耐性化のために必要な試薬、 核酸プローブ、 核酸プローブを標識するための標識物質および試薬、 ビーズ および基板な どの基体、 並びに核酸プローブ固定化基体など も、 少な く と も 1 またはそれらの幾つかを組み合わせた形態 で具備しても よい。

実施例 1

上述したス ト ッパー核酸を用いる図 5 に示すよ う な第 4 の 例を本発明に係る実施例 1 と して行い、 更にその結果を従来 法によ り 得られる結果と比較した。 M B L遺伝子コー ド領域 の S N P を含む領域に対応する 1 本鎮 D N Aを標的核酸と し て利用 し、 本発明および従来法の両方法によ って検出ターグ ッ ト構造を作出 した。 次に、 同領域上の S N P を検出するた めの核酸プローブ固定化基体をもちいて M B L遺伝子の S N P検出を行った。 具体的な方法は以下の通 り である。

M B L遺伝子中で検出 したい S N P を含む領域と 同 じ配列 (即ち、 配列番号 1 ) を持つ 1 本鎖 D N Aを標的核酸と し、 これを終濃度 1 0 ^{1 2} コ ピー/ m L程度と なる よ う に調整した _c ま'た、 保護鎖の伸長は、 ス ト ッパー核酸の存在下でプライ マーを用いて行った。 即ち、 終濃度 0 . 4 μ Μの 3 ， リ ン酸 化オ リ ゴ D N A (配列番号 2 ) をス ト ッパー核酸と して用い、 終濃度 0 . 2 _μ Μのオリ ゴ D N A (配列番号 3 ) をプライマ 一と して用いた。 これらのス ト ッパー核酸と プライマーと を 終濃度 0. 0 4 UZ Lの耐熱性 D N A合成酵素 P y r o b e s t IM A p o l y m e r a s e ( Γ a k a r a と共に前記標的核酸に添加 した。 ス ト ッパー核酸と プライマ 一の配列は以下の通 り である。

配列番号 2 ：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

配列番号 3 ：

CATGGTCCTCAC TTGGTGT。

次に、 至適酵素反応溶液組成にて 6 6 。C 1 0分間の反応を 行った。 反応後、 1 /' 9 量の 2 0 X S S C緩衝液、 1 / 9 量 の 1 0 m M E D T A溶液を添加し、 予め用意しておいた核 酸プローブ固定化チップに対して添加して、 3 5 °Cで 1 時間 ハイ プリ ダイゼーシ ョ ンを行った。 こ こ で使用 した核酸プロ ープ固定化チップは、 3 ， 末端にチオール基を導入する こ と によ り 基板に具備される金電極に固定化された配列番号 4お よび配列番号 5 に示される核酸を核酸プローブと して含む。 ハイ プリ ダイゼーシ ヨ ン後、 0 . 2 X S S C で 1 5分間洗浄 を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した _c 比較対照である従来法は以下のよ う に行った。 標的核酸で ある 1 本鎖 D N Aと別途合成した 1 本鎖の保護鎖 （即ち、 配 列番'号 6 の核酸鎖） と を混合し 2 X S S C緩衝液中で 9 5 °C で 5 分の熱変性後 9 5 °Cから 3 0 °Cまで 3 0分間かけて徐々 に冷却する こ と でァニーリ ングを行なった。 核酸プローブと して配列番号 4および配列番号 5 を含む核酸を基板の金電極 上に固定化 した、 前述と 同様の核酸プローブ固定化チップに 対して前記ァニー リ ング後に得られた従来法によ る検出ター ゲッ ト構造を添加した。 次に、 3 5 °Cで 1 時間ハイプリ ダィ ゼーシヨ ンを行った。 ハイブリ ダィゼーシ ョ ン後、 0 . 2 X S S Cで 1 5 分間洗浄を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した。

また、 も う 1 つの従来法と して、 保護鎖を含まない 1 本鎖 の標的核酸 （配列番号 1 ) を検出ターゲッ ト構造と して用い て標的ヌ ク レオチ ド配列を検出 した。 核酸プローブと して配 列番号 4 および配列番号 5 を含む前述と 同様の核酸プロ ーブ 固定化チップに添加 し、 上記と 同様にハイ プリ ダイゼーシ ョ ンを行った。 ハイブリ ダイゼーショ ン後、 0 . 2 X S S Cで 1 5分間洗浄を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応 答を測定した。

以上の結果を図 1 3 に示す。 以上のハイ プリ ダイゼーショ ンの結果、 ス ト ッパー核酸と しての配列番号 2 の 3 ' リ ン酸 化オ リ ゴ D N A と、 プライマー と しての配列番号 3 のオ リ ゴ D N Aと を使用 し、 これに耐熱性 D N A合成酵素を添加 して 作出 した検出ターゲッ ト構造を用いて行った本発明の方法に 係る実験区のみから、 対応する S N P を検出する核酸プロ一 プに対する特異的なハイプリ ダイゼーシ ョ ンが生じたこ と を 示ず電流信号を検出する こ とができた （図 1 3 ) 。

更に、 同様の比較実験を異なる配列を有する標的核酸を用 いて行ったが、 何れの場合にも本発明に係る方法で作出 した 検出ターゲッ ト構造を用いて検出 した場合からのみ、 安定的 かつ特異的な信号が検出された。 また、 保護鎖を伴わずに標 的核酸を 1 本鎖 D N Aのままで検出ターゲッ ト構造と して検 出を行った場合や、 標的核酸と別途合成した保護鎖と を混合 して熱変性およびァ -—リ ングによ り 検出ターゲッ ト構造を 作出 して検出を行った場合な ど、 従来法を用いた場合では、 図 1 3 に示す結果と 同様にほと んどの場合において好ま しい 結果は得られなかった。

また、 図 7 に示す本発明の第 6 の例に従って検出ターゲッ ト構造を作出 し、 標的ヌ ク レオチ ド配列の検出を行った。 即 ち、 標的核酸と して 2本鎖核酸を用い、 互いに異なる部位を 標的ヌ ク レオチ ド配列と し、 2本鎖標的核酸に含まれる各々 の鎖から夫々 に検出ターゲッ ト構造を作成 し、 同様に標的ヌ ク レオチ ド配列の検出を行った。 その結果、 本発明に従 う方 法によ り 検出ターゲッ ト構造を作出 した場合にのみ、 特異的 なハイブリ ダイゼーショ ンを確認する こ と ができた。

以上の結果から、 本発明の方法によ る検出は、 従来法に比 ベて、 特異的、 効率的および高感度に標的核酸を検出する こ とが可能であった。 従って、 標的 D N Aを作出する際の経済 性および操作性が向 される。

実施例 2

図 2 に示す本発明の第 1 の例に係る方法、 即ち、 プライマ 一の'結合位置を調節する こ と によ り所望の検出ターゲッ ト構 造を製造する方法を行い、 それによ り 得られた検出ターゲッ ト構造を用いる標的ヌク レオチ ド配列の検出を、 実施例 2 と し行った。 それによ り 得られた結果を従来法によ る結果と比 較した。

M x A遺伝子を含む溶液をサンプルと し、 M x A遺伝子プ 口モーターの S N P を含む領域に対応する 1 本鎖 D N A (配 列番号 7 ) を標的核酸と した。 また、 当該 S N P を含む配列 を標的ヌ ク レオチ ド配列と した。 これらについて、 本発明に 係る方法および従来法の両方法を用いて夫々 に検出ターゲッ ト構造を作出 し、 標的ヌク レオチ ド配列の検出を行った。 標 的ヌ ク レオチ ド配列の検出手段は、 標的ヌ ク レオチ ド配列に 相補的な配列を有する核酸プロ一ブを基体に固定化して得た 核酸プローブ固定化基体に対するハイ ブリ ダイゼーシ ョ ンの 有無の検出によ り 行った。 こ の検出によ り 、 M x A遺伝子プ 口モーターの S N P の遺伝子型を検出する こ とが可能である：

M X A遺伝子中で検出 したい S N P を含む領域と 同 じ配列 を持つ標的 1 本鎖 D N Aを標的核酸と して、 終濃度 1 0 ^{1 2} コ ピー/ m l 程度と なる よ う に調整した。 プライ マー と して オリ ゴ D N A (配列番号 8 ) を用意した。 終濃度 0.4μ Μの 当該プライ マーと終濃度 0.04UZ X 1 の P C R用酵素 P y r o D e s t D N A p o l y m e r a s e ( T a k a r a ) を前記標的核酸に添加 した。 プライマーの配列は以下 の通 り である ；

配列番号 8 ：

" GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。

伸長反応は、 至適酵素反応溶液組成にて 6 6 °C 1 0 分間行 つた。 反応後 1 / 9 量の 2 0 x S S C緩衝液、 1 Z 9 量の 1 0 m M E D T A溶液を添加し、 予め用意しておいた核酸プ ロープ固定化チップに対して添加 して、 3 5 °Cで 1 時間ハイ プリ ダイゼーシ ョ ンを行った。 こ こで使用 した核酸プローブ 固定化チップは、 5 ' 末端にチオール基を導入する こ と によ り 金電極に固定化された配列番号 9 お よび配列番号 1 0 を 夫々核酸プローブと して含む。 ハイプリ ダイゼーショ ン後、 0 . 2 x S S Cで 1 5 分間洗浄を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した。

比較対照である従来法は以下のよ う に行った。 標的核酸で ある 1本鎖 D N Aと別途合成した 1 本鎖の保護鎖 （即ち、 配 列番号 1 1 の核酸鎖） と を混合 し、 2 X S S C緩衝液中で 9 5 °Cで 5 分の熱変性後 9 5 °Cから 3 0 °Cまで 3 0分間かけて 徐々 に冷却する こ と でァニー リ ングを行なった。 核酸プロ一 ブと して配列番号 9 および配列番号 1 0 を含む核酸を基板の 金電極上に固定化した、 前述と 同様の核酸プローブ固定化チ ップに対 して前記アニー リ ング後に得られた従来法によ る検 出ターゲッ ト構造を添加 した。 次に、 3 5 °Cで 1 時間ハイ ブ V ダイゼーショ ンを行った。 ハイ ブリ ダイゼーシ ョ ン後、 0 . 2 X S S Cで 1 5分間洗浄を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した。

また、 も う 1 つの従来法と して、 保護鎖を含まない 1 本鎖 の標的核酸 （配列番号 7 ) を検出ターゲッ ト構造と して用い て檫的ヌ ク レオチ ド配列を検出 した。 核酸プローブと して配 列番号 9 および 1 0 を夫々 に含む上記と 同様の核酸プローブ 固定化チップに添加し、 上記と 同様にハイ ブリ ダィゼーショ ンを行い、 電流応答を測定した。

その結果、 本発明に係る方法によ り .作出 した検出ターゲッ ト構造を用いて検出を行った実験区のみから、 対応する S N P を検出する核酸プローブに特異的なハイブリ ダィゼーショ ンが行われたこ と を示す電流信号が検出された （図 1 4 ) 。 さ らに、 複数種の異なる配列を有する標的核酸についても同 様に比較実験を行ったが、 何れの場合にも、 本発明に基づく 方法で作出 したサンプルからのみ安定的かつ特異的な信号が 検出された。 これに対して、 保護鎖な しで標的核酸を 1 本鎖 D N Aのままで検出ターゲッ ト構造と して検出を行った場合 や、 標的核酸と別途合成した保護鎖を混合 して熱変性および ァニ一リ ングによ り 検出ターゲッ ト構造を作成して検出を行 つた場合な ど、 従来法を用いた場合では、 図 1 4 と 同様にほ と んどの場合において好ま しい結果は得られなかった。

また、 図 4 に示す本発明の第 3 の例に従って検出ターゲッ ト構造を作出 し、 標的ヌク レオチ ド配列の検出を行った。 即 ち、 標的核酸と して 2本鎖核酸を用い、 互いに異なる部位を 標的ヌ ク レオチ ド配列と し、 2本鎖標的核酸に含まれる各々 の鎖から夫々 に検出ターゲッ ト構造を作成 した。 また更に、 図 8 に示す本発明の第 7 の例に従って検出ターゲッ ト構造を 作出 し、 標的ヌ ク レオチ ド配列の検出を行った。 即ち、 標的 核酸と して 2本鎖核酸を用い、 互いに相補的な部位を夫々標 的 ク レオチ ド配列と し、 2本鎖標的核酸に含まれる各々 の 鎖から夫々 に検出ターゲッ ト構造を作成した。 以上のよ う な 本発明の方法に従って 2本鎖標的核酸から 2種類の検出ター ゲッ ト構造を作出 し、 それを用いて標的ヌ ク レオチ ド配列を 検出する方法を行った結果は何れの場合にも、 標的ヌ ク レオ チ ド配列に対する特異的なハイ プリ ダイゼーショ ンが確認さ れた。 また、 これらの結果と従来の方法と比較する と、 本発 明に係る方法は、 何れの従来の方法よ り も高感度に標的ヌク レオチ ド配列を検出する こ とが可能であった。

以上の結果から、 本発明の方法によ る検出は、 従来.法に比 ベて、 特異的、 効率的および高感度に標的核酸を検出する こ とが可能であった。 従って、 標的 D N Aを作出する際の経済 性および操作性が向上される。

実施例 3

上述したス ト ッパー核酸を用いる本発明に係る検出タ ーゲ ッ ト構造作出方法における種々 の条件を検討した。 M B L遺 伝子コー ド領域の S N P を含む領域に対応する 1 本鎖 D N A を標的核酸と して利用 し、 プライマーと して使用する添加す るオリ ゴ D N Aの種類を変えて標的核酸構造を作出 した。 そ の後、 同領域上の S N P を検出するための核酸プローブ固定 化基体をもちいて M B L遗伝子の S N P の検出を行った。

M B L遺伝子中で検出 したい S N P を含む領域と 同 じ配列 (配列番号 1 ) を持つ標的 1 本鎖 D N Aを標的核酸と して用 意した。 これを終濃度 1 0 ^{1 2} コ ピー/ m l 程度と なる よ う に 合成および増幅して調整した。 ス ト ッパー核酸は、 以下のよ う な配列番号 2 、 配列番号 1 2 、 配列番号 1 3および配列番 号 1 4で示される 3' リ ン酸化オリ ゴ D N Aを用意した。 終 濃度 0.4 μ Μの何れかの ス ト ッ パー核酸、 即ち、 3， リ ン酸 化オリ ゴ D Ν Α (配列番号 2、 配列番号 1 2 、 配列番号 1 3 または配列番号 1 4 ) と、 プライマーと して終濃度 0. 2 μ Μ のオ リ ゴ D N A (配列番号 3 ) と 、 終濃度 0.04U / /x 1 の 而ォ熱性 D Ν Α合成酵素 Pyrobest DNA polymerase (Takara) を標的核酸に添加した。 使用 したス ト ッパー核酸およびブラ イマ一の配列は以下の通 り である ；

配列番号 2 ：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

配列番号 1 2 ：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAA

配列番号 1 3 ：

CACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAA

配列番号 1 4 ：

CCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

配列番号 3 ：

CATGGTCCTCACCTTGGTGT。

続いて、 至適酵素反応溶液組成にて 6 6 °C 1 0分間反応を 行つ.て核酸を伸長 した。 反応後、 1 Z 9 量の 2 0 x S S C緩 衝液および 1 / 9 量の 1 0 m M E D T A溶液を添加 し、 予 め 3 ' 末端にチオール基を導入し金電極上に固定化した配列 番号 4および配列番号 5 によ り 示される配列を有する核酸プ ローブと 3 5 °Cで 1 時間ハイプリ ダイゼーシヨ ンを行なつた ハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ン後、 0 . 2 X S S C で 1 5分間洗浄 を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した その結果、 何れの実験区から も特異的な信号が得られたが、 ス ト ッパー核酸である 3 ' リ ン酸化オリ ゴ D N A と して配列 番号 2 または配列番号 1 2 を用い、 これと プライマーである オリ ゴ D N A配列番号 3 と耐熱性 D N A合成酵素を添加 した 実験区については、 ス ト ッパー核酸である 3 ' リ ン酸化オリ ゴ D N A と して配列番号 1 3 または配列番号 1 4 を用いた場 合に比べて、 対応する S N P を検出する核酸プローブに特異 的なハイ ブリ ダィゼーシヨ ンが行われたこ と を示す電流信号 がよ り 高感度に検出された。 即ち、 以上の結果から、 本発明 の方法によ り標的 D N Aを作出する際には、 ス ト ッパー核酸 であ る 3， リ ン酸化オリ ゴ D N Aの 3， 末端と核酸プローブ の 5 ， 末端とが隣接する よ う に設計する こ とがよ り 好ま しい こ と が明 らかになった。

実施例 4

本発明に係る、 プライ マーの結合位置を調節する こ と によ り 所望の検出ターゲッ ト構造を製造する方法について、 その 検出ターゲッ ト構造製造条件を更に検討した。 M X A遺伝子 プロモータ一領域の S N P を含む領域に対応する 1本鎖 D N Aを標的核酸と して用いた。 使用するプライマーの配列を複 数用意し、 それらを用いて検出ターゲッ ト構造を作出 した。 得られた検出ターゲッ ト構造を、 同領域上の S N P を検出す るための核酸プローブ固定化基体に添加して反応させ、 M x A遺伝子の S N P検出を行った。

M' X A遺伝子中で検出 したい S N P を含む領域と 同 じ配列 を持つ 1 本鎖 D N A (配列番号 7 ) を標的核酸と して用いた。 このよ う な標的核酸を合成し増幅して調整した。 プライマー と して、 3種類の配列 （配列番号 8 、 配列番号 1 5 または配 列番号 1 6 ) め何れかを有する核酸を用意した。 終濃度 0.4 のプラ イ マー と 終濃度 0.04U / / 1 の P C R用酵素 Pyrobest DNA polymerase (Takar a)を当該標的核酸に添カロし た。 添加 したプライマーの配列は以下の通 り である ；

配列番号 8 ：

GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC

配列番号 1 5 ：

CCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC

配列番号 1 6 ：

CGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC₀

前記標的核酸、 プライマーおよび酵素の混合物を至適酵素 反応溶液組成にて 6 6 °C 1 0分間反応を行った。 反応後、 1 9 量の 2 0 x S S C緩衝液、 1 Z 9 量の 1 0 m M E D T A溶液を添加 し、 予め用意しておいた核酸プローブ固定化チ ップに対 して添加 し、 3 5 °Cで 1 時間ハイ ブリ ダィゼーショ ンを行った。 こ こで使用 した核酸プローブ固定化チップは、 5 ' 末端にチオール基が導入され基板に具備される金電極に 固定化された配列番号 9および配列番号 5 に示される核酸を 夫々核酸プローブと して含む。 ハイプリ ダイゼーショ ン後、 0 . 2 X S S Cで 1 5 分間洗浄を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した。

そ'の結果、 何れの実験区から も対応する S N P を検出する 核酸プローブに特異的なハイプリ ダイゼーシ ョ ンが行われた こ と を示す電流信号が検出された。 特に、 使用 したプライマ 一の配列によって得られた信号強度に差が見られたこ と は興 味深い。 信号強度とプライマー配列の関係は、 配列番号 8 > >配列番号 1 5 >配列番号 1 6 の順であった。 即ち、 以上の 結果から、 本発明の方法によ り 検出ターゲッ ト構造を作出す る際には、 添加するプライ マーの 5 ' 末端と核酸プローブの 3 ' 末端とが、 隣接する よ う に設計する こ と がよ り 好ま しい こ と が分かった。

実施例 5

上述した図 6 に示す第 5 の例に係る方法によ り 検出ターゲ ッ ト構造を作出 し、 標的ヌ ク レオチ ド配列の検出を行った。 本実施例では、 2本鎖核酸を標的核酸と して用いる場合の条 件について検討した。 即ち、 M B L遺伝子コー ド領域の S N P を含む領域に対応する P C R産物を標的核酸と して用い、 幾つかの異なる条件下で本発明に係る検出ターゲッ ト構造を 作出 した。 得られた検出ターゲッ ト構造を、 同領域上の S N P を検出するための核酸プローブを固定化 した基体である核 酸プローブ固定化チップを用いて、 M B L遺伝子の S N P検 出を行った。

予め S N P型の判明 している ヒ トゲノ ム D N Aを鐯型と し、 配列番号 1 7 と配列番号 3 を夫々 に含むオリ ゴ D N Aをブラ イマ一と して用いて P C R法を行った。 こ の P C Rによ り 、 M B L遺伝子における検出 しよ う とする S N P の含まれる領 域が増幅された。 こ の増幅産物に対して、 終濃度 0.4 Mの ス ト ッパー核酸である 3， リ ン酸化オリ ゴ D N A (配列番号 2 ) お よび終濃度 0. 0411 / μ 1 の耐熱性 D N A合成酵素 Pyrobest DNA polymerase (Takara) , 並びに終濃度 0. 2 μ Μ の第 1 のプライマーであるオリ ゴ D N A (配列番号 1 7 ) お よび/または終濃度 0. 2 /z Mの第 2 のプライマーであるオリ ゴ D N A (配列番号 3 ) を添加 した。 使用 したオリ ゴ D N A の配列は以下の通 り である ；

配列番号 1 7 ：

GTCCCATTTGTTCTCACTGC

配列番号 3 ：

CATGGTCCTCACCTTGGTGT

配列番号 2 ：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC。

次に、 至適酵素反応溶液組成にて 9 5 °C 5 分、 6 6 °C 1 0 分間の反応を行った。 反応後、 1 / 9 量の 2 0 X S S C緩衝 液、 1 Z 9 量の 1 0 m M E D T A溶液を添加し、 予め用意 しておいた核酸プロ ーブ固定化チ ッ プに対 して添加 し、 3 5 °Cで 1 時間ハイ プ リ ダイゼーショ ンを行った。 こ こで使用 した核酸プローブ固定化チップは、 3 ， 末端にチオール基を 導入する こ と によ り 、 基板に具備される金電極に固定化され た配列番号 4および配列番号 5 に示される核酸を各々核酸プ ローブと して含む。 ハイブリ ダィゼーショ ン後、 0 . 2 X S S C で 1 5 分間洗浄を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の 電流応答を測定した。

そ'の結果、 P C R産物に対してプライマーと しての配列番 号 1 7 のオリ ゴ D N Aおよび配列番号 3 のオリ ゴ D N A、 ス ト ッパー核酸と しての配列番号 2 の 3 ' リ ン酸化オリ ゴ D N A、 並びに耐熱性 D N A合成酵素を全て添加 した実験区のみ から、 対応する S N P を検出する核酸プローブに特異的なハ イブリ ダイゼーシ ョ ンの行われたこ と を示す信号が検出され た。 更に異なる複数種の標的核酸を用意し、 それらに対して 同様な実験を行った。 その結果、 何れの場合も、 安定的且つ 特異的に信号を検出できたのは、 上述と 同様の方法で検出タ ーゲッ ト構造を作出 した場合にのみであった。 それに対して、 それ以外の方法で検出ターゲッ ト構造を作出 した場合には、 ほと んどの場合に好ま しい結果は得られなかった。 また、 上 述の よ う に増幅産物を標的核酸と して使用する場合、 上述の よ う な P C R法以外の何れの増幅手段によ り 得られた増幅産 物であっても標的核酸と して使用する こ と が可能である。 例 えば、 I C A N産物に関しても上記と 同様な方法で検出ター ゲッ ト構造を作出 し (図 1 5 を参照されたい） 、 得られた検 出ターゲッ ト構造を用いても同様に良好な標的ヌ ク レオチ ド 配列の特異的検出が確認された。 以上の結果から、 2本鎖核 酸を標的核酸と して用いて本発明に係る検出ターゲッ ト構造 を作出する場合には、 核酸プローブと の反応時に、 標的核酸 に対して相捕的な鎖が遊離した 1 本鎖核酸と してハイ ブリ ダ ィゼーシ ョ ン溶液中に存在しないこ と が望ま しいこ と が明か になった。 従って、 標的核酸である 2本鎖の両方の鎖が、 当 該ハイブリ ダィゼーシヨ ン時には 2本鎖と なる よ う に、 ブラ ィ 一が添加される こ とが望ま しい。

実施例 6 本実施例では、 上述した図 3 に示す第 2 の例に係る方法に よ り 検出ターゲッ ト構造を作出 し、 標的ヌク レオチ ド配列の 検出を行った。 本実施例では、 2本鎖核酸を標的核酸と して 用いる場合の条件について検討した。 即ち、 M X A遺伝子プ 口モーター領域の S N P を含む領域に対応する P C R産物を 標的核酸と して用い、 幾つかの異なる条件下で本発明に係る 検出ターゲッ ト構造を作出 した。 得られた検出ターゲッ ト構 造を、 同領域上の S N P を検出するための基体に核酸プロ一 プを固定化した核酸プローブ固定化チップを用いて、 M x A 遺伝子の S N P を検出 した。

予め S N P型の判明 している ヒ トゲノ ム D N Aを錶型と し、 配列番号 1 8 と配列番号 1 9 を夫々 に含むオリ ゴ D N Aをプ ライ マー と して用いて P C R法を行った。 この P C Rによ り 、 M x A遺伝子における検出 しよ う とする S N P の含まれる領 域が増幅された。 この増幅産物に対して、 終濃度 0.4 z Mの 第 1 のプライマ一であるオリ ゴ D N A (配列番号 1 8 ) およ ぴ /または第 2 のプライ マーであるオリ ゴ D N A (配列番号 8 ) 、 並びに終濃度 0.04UZ / 1 の P C R用酵素 P y r o b e s t D N A p o l y m e r a s e a k a r a ) を添加 した。 添加 したオリ ゴ D N Aの配列は以下の通 り である ；

配列番号 1 8 ：

GAGCTAGGTTTCGTTTCTGC

¾列番号 1 9 ：

CGCTAGTCTCCGCCACGAAC 配列番号 8 ：

GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC。

次に、 至適酵素反応溶液組成にて 9 5 °C 5分、 6 6 °C 1 0 分間の反応を行った。 反応後、 1 ノ 9 量の 2 0 x S S C緩衝 液、 1 / 9 量の 1 0 mM E D T A溶液を添加し、 予め用意 しておいた核酸プロ ーブ固定化チ ップに対 して添加 し、 3 5 °Cで 1 時間ハイ プリ ダイゼーシ ョ ンを行った。 こ こで使用 した核酸プローブ固定化チップは、 5 ' 末端にチオール基を 導入する こ と によ り 、 基板に具備される金電極上に固定化さ れた配列番号 9 および配列番号 1 0 に示される核酸を各々核 酸プロ一プと して含む。 ハイプリ ダィゼーショ ン後、 0 . 2 X S S C で 1 5 分間洗浄を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した。

そ の結果、 P C R産物に対してプライマーと しての配列番 号 1 9 のオリ ゴ D N Aおよび配列番号 8 のオリ ゴ D N A、 並 ひに耐熱性 D N A合成酵素を添加 した実験区のみから、 対応 する S N P を検出する核酸プローブに特異的なハイプリ ダイ ゼーショ ンの行われたこ と を示す信号が検出 された。 更に異 なる複数種の標的核酸を用意し、 それらに対して同様な実験 を行った。 その結果、 何れの場合も、 安定的且つ特異的に電 流信号を検出できたのは、 上述と 同様の方法で検出ターゲッ ト構造を作出 した場合にのみであった。 それに対して、 それ 以外の方法で検出ターゲッ ト構造を作出 した場合には、 ほと んどの場合に好ま しい結果は得られなかった。 また、 上述の よ う に増幅産物を標的核酸と して使用する場合、 上述のよ う な P C R法以外の何れの増幅手段によ り得られた増幅産物で あっても標的核酸と して使用する こ と が可能である。 例えば、 I C A N産物に関 しても上記と 同様な方法で検出ターゲッ ト 構造を作出 し （図 1 6 を参照されたい） 、 得られた検出ター ゲッ ト構造を用いても同様に良好な標的ヌク レオチ ド配列の 特異的検出が確認された。 以上の結果から、 2本鎖核酸試料 を標的核酸と して用いて本発明に係る検出ターゲッ ト構造を 作出する場合には、 核酸プローブとの反応時に、 標的核酸に 対して相補的な核酸が遊離した 1 本鎖核酸と してハイ プ リ ダ ィゼーシ ョ ン溶液中に存在 しないこ と が望ま しいこ と が明 ら かになつた。 従って、 標的核酸である 2本鎖の両方の鎖が当 該ハイプリ ダイゼーシ ョ ン時には 2本鎖と なる よ う のに、 プ ライ マー力 S '添加される こ と が望ま しい。

実施例 7

本実施例では、 上述 した図 1 1 に示す第 1 0 の例および図 1 2 に示す第 1 1 の例のよ う に酵素によ り 1 本鎖核酸部分を 形成する方法に従って、 検出ターゲッ ト構造を製造した。 こ の検出ターゲッ ト構造によ り標的ヌ ク レオチ ド配列を検出 し た結果と、 従来法によ り 作成した検出ターゲッ ト構造を用レ、 て標的ヌ ク レオチ ド配列を検出 した結果を比較した。 標的核 酸と してイネゲノ ムを用い、 標的ヌク レオチ ド配列を含むィ ネゲノ ム P C R増幅断片の存否判定を、 核酸プローブを固定 化した基体を用いて行った。

ま'ず、 精米からイネゲノ ム D N Aを抽出 し調整した。 この イネゲノ ム D N Aを以下の 4つのプライマーを用いて、 これ らのプライマーによ って挟まれる領域を P C Rによって増幅 した。 使用 したプライマーの配列は以下の通 り である ； プライマー ；

配列番号 2 0 tacCTGGTTGATGTATACAGATCTGGTT

配列番号 2 1 ATCCCTCGATCCCTCtagCATTAT

配列番号 2 2 TACCTGGTTGATGTAtacAGATCTGGTT

配列番号 2 3 atcCCTCGATCCCTCTAGCATTAT

こ こで、 これらの配列、 配列番号 2 0 、 配列番号 2 1 、 配列 番号 2 2 および配列番号 2 3 において小文字表記した塩基は その 3 ， 側に存在する フォス フォジエステル結合部分にホス ホロチォエー ト修飾が施されている。

当該增幅産物に、 T 7 G e n e 6 E x o n u c 1 e a s e と添付バッファーを添加し、 至適条件下で完全消化を行 つた。 反応後、 酵素反応液に 1 / 9 量の 2 0 x S S C緩衝液 1 Z 9量の 1 0 mM E D T A溶液を添加 し、 予め用意 して おいた核酸プローブ固定化チップに対 して添加し、 3 5 。Cで 1 時間ハイ プリ ダイゼーシ ヨ ンを行った。 こ こで使用 した核 酸プローブ固定化チップは、 5 ， 末端にチオール基を導入す る こ と によ り 、 基板に具備される金電極上に固定化された配 列番号 2 4、 配列番号 2 5 および配列番号 2 6 によ.り 示され る核酸を各々核酸プローブと して含む。

核酸プローブ ；

配列番号 2 4 TACCTGGTTGATGTA

配列'番号 2 5 ATCCCTCGATCCCTC

配列番号 2 6 ACAACGCCTCCGATG (対照用） また、 このハイプリ ダイゼーショ ン反応を行な う 際には、 対照実験と して P C R産物に T7 Gene6 Exonuc lease 処理を 行っていないも の、 ホスホロチォエー ト修飾を行っていない プライ マーで P C R増幅を行った も の、 T 7 G e 11 e 6 E o n u c 1 e a s e 処理を行った も の、 従来法であ る

「部分二重鎖 D N Aを利用 した D N A検出方法」 （特開平 1 1 - 3 3 2 5 6 6 )の方法に従って作出 した標的構造につい ても同様にハイ ブリ ダイゼーショ ンを行った。 ハイプリ ダイ ゼーシヨ ン後、 0 . 2 X S S Cで 1 5 分間洗浄を行い、 最後 に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した。

その結果、 P C R産物に T 7 G e n e 6 E x o n u c

1 e a s e 処理を行っていない場合、 およびホスホロチォェ ー ト修飾を行わないプライマーで P C R増幅し T 7 G e n e 6 E x o n u c l e a s e 処理を行った場合、 P C Rを プライマー配列番号 ₂ 0 と配列番号 2 3 の組み合わせで行つ て T 7 G e 11 e 6 E o n u c 1 e a s e で処理した場 合においては、 ハイ ブリ ダィゼーショ ンが生じたこ と を示す 結果は得られなかった。 また、 「部分二重鎖 D N Aを利用 し た D N A検出方法」 (特開平 1 1 - 3 3 2 5 6 6 )に従って作 出 した標的では、 ある程度の信号が得られる もののバック グ ラ ウン ドの信号が大き く な り S /N = 1.2 程度であった。 こ れに対し、 当該 P C Rを、 プライマー配列番号 2 0 と配列番 号 2 1 の組み合わせで行った場合では核酸プローブ配列番号

2 4によ り 、 またプライマー配列番号 2 2 と配列番号 2 3 の 組み合わせで P C Rを行った場合では核酸プローブ配列番号 2 5 によ って特異的な信号が S /N > > 2 で得られた （図 1 7 ) 。 また、 配列番号 2 1 と配列番号 2 2 の組み合わせで P C Rを行った場合では、 配列番号 2 4 と配列番号 2 5 の両方 の核酸プローブと の特異的なハイ プ リ ダイゼーショ ンが S /

N > > 2 で行われたこ と を確認する こ とができた。 更に、 複 数の P C R断片が同時に存在するマルチプレ ッ ク ス P C R産 物についても実験を行った。 その結果、 本発明の方法によ り 検出ターゲッ ト構造を作出 した場合、 従来の方法に比べて高 い特異性が観察された。 以上の結果から、. 本発明の方法によ り 検出ターゲッ ト構造を作出する場合では、 従来に比べて経 済性および操作性が向上し、 且つ特異的、 効率的および Zま たは高感度に標的核酸を検出する こ と が可能と なる こ と が示 された。

実施例 8

マルチプ レ ッ ク ス P C Rによる増幅産物に対して本発明に 従 う 検出ターゲッ ト構造の製造方法を適用 し、 それによ り 得 られた産物をハイプリ ダイゼーショ ンによ る検出に使用 した 例を以下に説明する。

予め S N P型の判明 している ヒ トゲノ ム DNAを鎊型と し、 M x A遺伝子プロ モーター領域おょぴ M B L遺伝子コー ド領 域の う ちの S N P を含む領域を増幅するために、 プライマー 配列番号 1 7、 配列番号 3 、 配列番号 1 8 および配列番号 1 9 を用いてマルチプレック ス P C Rを行った。 反応後 P C R 産物に終濃度 0.4μ Μのプライマー （配列番号 8 ) と終濃度 0.4/ζ Μのス ト ッ ノ 一核酸と しての 3' リ ン酸化オ リ ゴ D N A (配列番号 2 ) と 、 各々終濃度 0.2 μ Μの 2種類のプライ マー （各々配列番号 1 7 または配列番号 1 9 を有す） と終濃 度 0 . O UZ /x l の P C R用酵素 P y r o b e s t D N A p o l y m e r a s e a k a r a ) 、 を添カ卩 して、 9 5 °C 5 分間、 6 6 °C 1 0分間で反応を行った。

こ こで使用 した夫々 のォ リ ゴ D N Aの配列は以下の通 り で める。

配列番号 1 7 ：

GTCCCATTTGTTCTCACTGC

配列番号 3 ：

CATGGTCCTCACCTTGGTGT

配列番号 1 8 ：

GAGCTAGGTTTCGTTTCTGC

配列番号 1 9 ：

CGCTAGTCTCCGCCACGAAC

配列番号 2 ：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

配列番号 8 ：

GCCGCCCTCAGCACAGGGTCTGTGAGTTTCATTTC

当該反応後、 酵素反応液に 1 Z 9量の 2 0 X S S C緩衝液、 1 / 9量の 1 0 m M E D T A溶液を添加 し、 これを予め用 意しておいた核酸プローブ固定化チップに対して添加 して、 3 5 °Cで 1 時間ハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ンを行った。 こ こで使 用 した核酸プローブ固定化チップは、 固定化核酸プローブと して、 予め 3 ' 末端にチオール基を導入され基板に具備され る金電極上に固定化された配列番号 4および配列番号 5 の核 酸と 、 予め 5 ' 末端にチオール基を導入され基板に具備され る金電極上に固定化された配列番号 9 および配列番号 1 0 の 核酸を具備する。 当該ハイ ブリ ダィゼーシ ヨ ンの後、 0 . 2 X S S C で 1 5分間洗浄を行い、 最後に、 へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した。 その結果、 対応する S N P を検出 する核酸プローブにおいてハイプリ ダイゼーショ ンの生じた こ と を示す特異的な電流信号が検出された。

以上の結果から、 本発明に従 う方法によ り 検出ターゲッ ト 構造を形成し、 それを標的ヌク レオチ ド配列の検出に用いる と 、 複数種の D N A断片混合液を試料と した場合であっても 高い特異性をもって標的ヌ ク レオチ ド配列の検出が可能であ る こ とが明 らかと なった。

実施例 9

本実施例では、 上述した図 9 に示す第 8 の例のよ う に、 1 本鎖核酸である標的核酸上に存在する 2 ケ所の標的ヌ ク レオ チ ド配列を同時に検出する こ と の出来る検出ターゲッ ト構造 を作成し、 これを用いたハイプリ ダィゼーショ ンによって標 的ヌ ク レオチ ド配列の検出を行った。

M B L遺伝子の配列であって、 S N P領域を両端に含む D N A領域と 同一の配列 （配列番号 2 7 ) を有する標的 1 本鎖 D N Aを標的核酸と した。 この標的核酸を合成し増幅して、 終濃度 1 0 ^{1 2}コ ピー/ m l 程度と なる よ う に調整した。 これ に、 '終濃度 0.4 ]\ のプラィマー配列番号 2 8 、 ス ト ッ パー 核酸と しての終濃度 0.4μ Μの 3， リ ン酸化オリ ゴ D N A配 列番号 2 、 およぴ終濃度 0 . 0 4 U / /z l の P C R用酵素 P y r o b e s t D N A p o l y m e r a s e 丄、 a k a r a ) を添加 し、 6 6 °C 1 0分間で反応を行った。 こ こ で 使用 したオリ ゴ D N Aの配列は以下の通り である。

配列番号 2 ：

GCCTAGACACCTGGCGTTGCTGCTGGAAGACTATAAAC

配列番号 2 8 ：

CCCATCTTTGCCTGGGAAGCCGTTGATGCC

当該反応後、 酵素反応液に 1 Z 9 量の 2 0 X S S C緩衝液 1 / 9 量の 1 0 mM E D T A溶液を添加した。 これを、 予 め 3 ' 末端にチオール基を導入し金電極上に固定化した配列 番号 4 を有する核酸プローブおよび配列番号 5 を有する核酸 プローブ、 並びに予め 5 ' 末端にチォール基を導入し金電極 上に固定化した配列番号 2 9 を有する核酸プローブおよび配 列番号 3 0 を有する核酸プローブに対して添加し、 3 5 °Cで 1 時間ハイ ブリ ダイゼーシ ョ ンを行なった。 ハイブリ ダイゼ ーシ ヨ ン後、 0 . 2 X S S Cで 1 5 分間洗浄を行い、 最後に へキス ト 3 3 2 5 8 の電流応答を測定した。

その結果、 対応する S N P を検出する核酸プローブに対し てハイプリ ダイゼーショ ンの生じたこ と を示す特異的な信号 が検出された。 また、 同様な設計によ り 図 1 0 に示す第 9 の 例のよ う な本発明に従 う方法によっても、 1 本鎖の標的核酸 上に 3 箇所以上の標的ヌク レオチ ド配列が存在する場合の検 出ダーグッ ト構造を作成した （図 1 0 ) 。 作成された検出タ ーゲッ ト構造を用いて当該 4箇所の標的核酸を検出 した と こ ろ、 特異的なハイブリ ダイゼーショ ンの得られたこ とが確認 された。

以上の結果から、 本発明に従 う方法によ って、 1 本鎖の標 的核酸上に存在する複数箇所の標的ヌ ク レオチ ド配列を同時 に検出する こ と が可能である。

また、 上述の実施例 1 から実施例 9 における検出ターゲッ ト構造の検出は、 金電極上での電流応答を利用 した電気化学 的検出方法によ り 行った例を示した。 しかしなが ら、 実施例 1 から実施例 9 の何れも、 製造した検出ターゲッ ト構造に対 して蛍光標識物質をそれ自身公知の方法によ り 付与し、 対応 する核酸プロ ーブを固定化 した基体に対して夫々反応させた 後で蛍光強度を測定する こ と によつても、 同様に検出を行 う こ と が可能であった。

以上詳述 したよ う に、 本発明に基づく 方法を用いる と、 標 的核酸設計の際の自 由度が得られる と共に標的核酸検出にお ける特異性、 効率性および感度が向上され、 且つ低費用およ びノまたは短時間で標的核酸構造を作出する こ とが可能にな る。

Claims

請 求 の 範 囲

1 . 標的ヌ ク レオチ ド配列を検出するために有用な検出タ ーゲッ ト構造の製造方法であって ：

標的核酸の 3 ' 端付近に位置する標的ヌ ク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側にある配列に対して相補的なプライマー と、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 前記標的核酸と を、 適切な伸長反応が得られる条件下で反応させる こ と を含 んでな り 、

それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み 前記 1本鎖核酸部分には前記標的ヌク レオチ ド配列が含まれ 前記 2本鎖核酸部分には少なく と も前記標的ヌ ク レオチ ド配 列を除く 領域の標的核酸と それに相補的な保護鎖が含まれる 検出ターゲッ ト構造を得る方法。

2 . 標的ヌ ク レオチ ド配列を検出するために有用な検出タ ーゲッ ト構造の製造方法であって ：

標的核酸の 5 ' 端付近に位置する標的ヌ ク レオチ ド配列の 3 ' 端よ り も 3 ' 側にある配列に対して相補的で、 且つ 3 ' 末端に伸長不可能な修飾を含むス ト ッパー核酸と 、 標的核酸 の 3 ' 端付近の配列に対して相補的なプライマー と、 ヌ ク レ ォチ ド伸長活性を有する酵素と、 前記標的核酸と を、 適切な 伸長反応が得られる条件下で反応させる こ と を含んでな り 、 それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み 前記 1 本鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前 記 ≤本鎖核酸部分には少な く と も標的ヌク レオチ ド配列を除 く 領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる検出タ ーゲッ ト構造を得る方法。

3 . 標的ヌ ク レオチ ド配列を検出するために有用な検出タ ーゲッ ト構造の製造方法であって ：

第 1 の標的核酸の 3 ' 端付近に位置する第 1 の標的ヌ ク レ ォチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側にある配列に対して相補的 な第 1 のプライマーと、 第 1 の標的核酸に相補的な第 2 の標 的核酸の 5 ' 端付近に位置する第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列 の 3 ' 端よ り も 3 ' 側にある配列に対 して相補的で、 且つ 3 ' 末端に伸長不可能な修飾を含むス ト ッパー核酸と、 第 2 の標的核酸の 3 ' 端付近の配列に対して相補的な第 2 のブラ イマ一と、 ヌク レオチ ド伸長活性を有する酵素と 、 第 1 およ び第 2 の標的核酸と を、 適切な伸長反応が得られる条件下で 反応させる こ と を含んでな り 、

それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み 前記 1 本鎮核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前 記 2本鎖核酸部分には少な く と も標的ヌ ク レオチ ド配列を除 く 領域の標的核酸と それに相補的な保護鎖が含まれる検出タ ーゲッ ト構造を得る方法。

4 · 標的ヌク レオチ ド配列を検出するために有用な検出タ ーゲッ ト構造の製造方法であって ：

標的核酸の 3 ' 端付近に位置する第 1 の標的ヌ ク レオチ ド 配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側にある配列に対して相補的な第 1 のプライマーと 、 前記標的核酸の 5 ' 端付近に位置する第 2 の標'的ヌ ク レオチ ド配列の 3 ' 端よ り も 3 ' 側にある配列に 対して相補的で、 且つ 3 ' 末端に伸長不可能な修飾を含むス ト ッパー核酸と 、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 前 記標的核酸と を、 適切な伸長反応が得られる条件下で反応さ せる こ と を含んでな り 、

それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み. 前記 1本鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前 記 2本鎖核酸部分には少な く と も標的ヌク レオチ ド配列を除 く 領域の標的核酸と それに相補的な保護鎖が含まれる検出タ 一ゲッ ト構造を得る方法。

5 . 標的ヌ ク レオチ ド配列を検出するために有用な検出タ ーゲッ ト構造の製造方法であって ：

3 ， 端付近の第 1 の標的ヌク レオチ ド配列と、 第 1 の標的 ヌ ク レオチ ド配列よ り も 5 ， 側に存在する第 2 の標的ヌ ク レ ォチ ド配列と、 第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列よ り も 5 ， 側に 存在する第 3 の標的ヌ ク レオチ ド配列と、 5 ， 端付近の第 4 の標的ヌ ク レオチ ド配列と を含む標的核酸における、 第 1、 第 2 および第 3 の標的ヌク レオチ ド配列の各々の 5 ， 端よ り も 5 ， 側に存在する夫々 の配列に対して相捕的な第 1 、 第 2 および第 3 のプライ マーと、 第 2 、 第 3 および第 4 の標的ヌ ク レオチ ド配列の 3 ' 端よ り も 3 ' 側に存在する夫々 の配列 に対して相補性を有し、 3 ' 末端に伸長不可能な修飾を含む 第 1 、 第 2 および第 3 のス ト ッパー核酸と、 ヌ ク レオチ ド伸 長活性を有する酵素と、 前記標的核酸と を、 適切な伸長反応 が得られる条件下で反応させる こ と を含んでな り 、

ぞれによって、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を'含み 前記 1 本鎖核酸部分には標的ヌク レオチ ド配列が含まれ、 前 記 2本鎖核酸部分には少な く と も標的ヌ ク レオチ ド配列を除 く 領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる検出タ ーゲッ ト構造を得る方法。

6 . 標的ヌク レオチ ド配列を検出するために有用な検出タ 一ゲッ ト構造の製造方法であって ：

( 1 ) 標的核酸の 3 ' 端付近に位置する標的ヌ ク レオチ ド 配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列、 およ ぴ前記標的ヌク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側の配列に 相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なく と も含 む第 1 のプライマーと ； 前記標的核酸の 5 ' 端付近の配列に 相同性を有し、 5 ' 端に核酸分解酵素耐性核酸を含む第 2 の プライマーと ； ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と ； 当該 標的核酸とその相補鎖からなる 2本鎖核酸と を、 適切な増幅 反応が得られる条件下で反応させる こ と と、

( 2 ) 前記 ( 1 ) の反応する こ と によ り 得られた増幅産物 を、 前記分解酵素非耐性核酸を分解でき る核酸分解酵素によ つて消化する こ と と を具備 し、

それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み、 前記 1本鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前 記 2本鎖核酸部分には少な く と も標的ヌク レオチ ド配列を除 く 領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる検出タ ーゲッ ト構造を得る方法。

7 . 標的ヌ ク レオチ ド配列を検出するために有用な検出タ ーゲッ ト構造の製造方法であって ：

( 1 ) 第 1 の標的核酸の 3 ' 端付近に位置する第 1 の標的 ヌ ク レオチ ド配列に相補的であ り 、 且つ核酸分解酵素非耐性 核酸から なる配列、 および第 1 の標的ヌ ク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ' 側の配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸 からなる配列を少な く と も含む第 1 のプライマーと、

第 2 の標的核酸の 3 ， 端付近に位置する第 2 の標的ヌ ク レ ォチ ド配列に相補的な核酸分解酵素非耐性核酸からなる配列 . およぴ第 2 の標的ヌ ク レオチ ド配列の 5 ' 端よ り も 5 ， 側の 配列に相補的な核酸分解酵素耐性核酸からなる配列を少なく と も含む第 2 のプライマーと、

ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素と、 当該第 1 の標的核 酸と第 2 の標的核酸からなる 2本鎖核酸と を、 適切な増幅反 応が得られる条件下で反応する こ と と、

( 2 ) 前記 （ 1 ) の反応する こ と によ り 得られた増幅産物 を、 核酸分解酵素によ り 消化する こ と と を含んでな り 、

それによつて、 1 本鎖核酸部分と 2本鎖核酸部分と を含み 前記 1 本鎖核酸部分には標的ヌ ク レオチ ド配列が含まれ、 前 記 2本鎖核酸部分には少なく と も標的ヌ ク レオチ ド配列を除 く領域の標的核酸とそれに相補的な保護鎖が含まれる前記検 出ターゲッ ト構造を得る方法。

8 . 標的ヌク レオチ ド配列を検出する方法であって ： • ( 1 ) 請求項 1 から 7 の何れか 1 項に記載の方法を用いる こ と によ り 、 サンプル中の標的核酸に基づいて検出ターゲッ ト構造を製造する こ と と、

{ 2 ) 前記 （ 1 ) で製造された検出ターゲッ ト構造に対し て、 前記標的ヌ ク レオチ ド配列に相補的な核酸プローブを、 適切なハイ プリ ダイゼーショ ンが得ら'れる条件下で反応させ る こ と と、

( 3 ) 前記 （ 2 ) の反応によ り 生じたハイ プリ ダイゼーシ ヨ ンを検出する こ と によ り 、 前記標的ヌ ク レオチ ド配列の存 在を検出する こ と と、

を具備する方法。

9 . 請求項 1 から 7 の何れか 1 項に記載の方法によ り 製造 された検出ターゲッ ト構造。

1 0 . 請求項 8 に記載の検出方法を行う ために、 プライマ 一、 ヌ ク レオチ ド伸長活性を有する酵素、 ス ト ッパー核酸、 核酸増幅用酵素、 核酸分解酵素および請求項 9 に記載の検出 ターゲッ ト構造からなる群よ り 選択された少な く と も 1 つの 構成要素を具備する標的ヌク レオチ ド配列検出用ア ツセィ キ ッ 卜 。