CN103276056B - 一种利用单双链复合体解析真菌菌群结构的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种真菌菌群结构的解析方法，更具体涉及一种利用单双链复合体解析真菌菌群结构的方法。所述方法的步骤如下：提取样品中微生物总基因组DNA；基于18SrDNA片段构建单双链复合体并进行DGGE或TGGE分析；割胶回收单双链复合体并将其扩增为完整双链；对扩增到的完整双链进行测序并将测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索；最后根据相似性得分判断对应真菌的种属。本发明解决了DGGE和TGGE这两项技术应用于真菌菌群结构解析研究中的主要不足，可以在保证分离效果的同时得到更多的序列信息用于分子鉴定，因此将会获得更加精准的真菌菌群结构信息。本发明提出的单双链复合体策略，具有简便、快捷和重现性好的优点。

Description

一种利用单双链复合体解析真菌菌群结构的方法

技术领域

本发明涉及一种真菌菌群结构的解析方法，更具体涉及一种利用单双链复合体解析真菌菌群结构的方法。

背景技术

DGGE（变性梯度凝胶电泳）和TGGE（温度梯度凝胶电泳）是两种基于DNA片段序列差异的电泳技术，目前已经成为微生物菌群多样性研究的重要手段。这两种技术可以分离长度相同但序列不同的DNA片段，DNA片段的分离是依靠双链DNA在含有化学变性剂梯度（DGGE）或者温度梯度（TGGE）的凝胶当中泳动时具有不同的解链行为来实现的。各种类的微生物都拥有其特有的rDNA序列，这些序列可以作为它们的标识，并且均可以通过DGGE或TGGE进行分离。因此这两项技术通常和rDNA分子鉴定技术相结合用于将微生物菌群多样性信息转化为微生物菌群结构信息。与微生物学传统研究手段相比，这两项微生物分子生态学技术最大的特点在于它们是一种不基于培养的方法——它们是以样品的总DNA（或RNA）出发进行研究的，因此能检测到生态体系中大量的不可培养微生物菌群。同时这两项技术还具有可靠性强、重现性高、方便快捷等优点。目前这两项技术被广泛应用于土壤、活性污泥、植物根际、动物肠道、湖泊等各种环境的微生物生态解析中。

上述两项技术虽然是微生物生态研究中解析菌群多样性的重要手段，但是这些技术也存在着难以分析长片段（>500bp）的不足，这对于菌群结构信息的准确获取是十分不利的。具体来说，DGGE和TGGE对200-500bp的rDNA片段具有较好的分离效果，超过500bp则分辨率都会显著下降——这样就会影响到菌群多样性的解析。虽然小于500bp的短片段有利于DGGE和TGGE的分离，但是这样的片段却无法满足之后分子鉴定的需要。因为这样的片段（200-500bp）携带的序列信息有限，对于真菌种属而言，即使是500bp也只占到作为常用的分子鉴定标准之一——18S rDNA全长的1/4左右，所以往往无法对其进行精准的分子鉴定。综上可知，无法通过用于DGGE和TGGE分离的真菌rDNA片段上携带的有限序列信息对其真正代表的真菌种属进行精准的分子鉴定，这是这两项技术在真菌菌群结构研究当中的主要不足。

针对上述不足，目前通常采取和rDNA近全长克隆文库相结合的研究策略。首先提取样品微生物总基因组DNA，扩增其rDNA近全长片段：然后一方面以rDNA近全长片段为模板，采用巢式PCR扩增其可变区；另外一方面克隆rDNA近全长片段，以阳性克隆子为对象，采用菌落PCR扩增其可变区。通过两种方式获得的可变区进行DGGE或TGGE分析，挑选和巢式PCR扩增的可变区条带位置一致的克隆子进行rDNA近全长序列测定。将测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索，以判定对应菌株的种属。这样rDNA可变区只负责微生态菌群多样性解析，而由其全长序列进行微生物种属鉴定，因此该方法可以在不影响菌群多样性解析的前提下提供较为精准的菌群结构信息。但是这种方式将大大增加工作量和实验耗费，此外克隆文库的结果和DGGE（TGGE）的结果存在匹配性的问题，如有时筛选不到对应于DGGE（TGGE）上条带的克隆子，有时出现了DGGE（TGGE）上未曾出现的条带的克隆子。因此，最简便最直接的做法是充分利用DGGE和TGGE的分离原理，从DNA片段本身出发构建特殊构造的片段，使其在保证电泳分离效果的前提下携带更多的序列信息。

发明内容

为了克服上述两项技术在真菌菌群结构研究当中的主要不足，本发明提供了一种利用基于18S rDNA的单双链复合体解析真菌菌群结构的方法，可以在保证分离效果的同时得到更多的序列信息用于分子鉴定，因此将会获得更加精准的真菌菌群结构信息。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

提取样品中微生物总基因组DNA；基于18S rDNA片段构建单双链复合体并进行DGGE或TGGE分析；割胶回收单双链复合体并将其扩增为完整双链；对扩增到的完整双链进行测序并将测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索；最后根据相似性得分判断对应真菌的种属。

    所述单双链复合体的制备步骤为：首先用磷酸化的引物扩增出大于1000bp的18S rDNA长双链片段；其次用Lambda核酸外切酶处理长双链片段，得到未被磷酸化的单链；最后以该单链为模板，采用单个引物进行一步延伸得到单双链复合体。

    用于DGGE 或TGGE分析时，单双链复合体的双链区不超过500bp。

本发明的单双链复合体用于真菌菌群结构研究的原理：

单双链复合体由一个双链区和一个单链区组成（如图1所示），其双链区长度控制在200-500bp之间，它决定了单双链复合体在DGGE或TGGE上的分离。当单双链复合体进入凝胶时，由于处于高温（一般为60℃左右）和一定浓度变性剂（DGGE）或者高温梯度（TGGE）环境中，因此其单链区将保持松散形式，则各单双链复合体的分离将主要取决于各自双链区的解链行为差异，而其单链区基本不会影响分离效果。在DGGE或TGGE结束后，割胶回收单双链复合体，再将其扩增成完整的双链。这样就可以在基本保持DGGE或TGGE分辨率的前提下，获得更多的序列信息用于后续真菌菌群的种属鉴定。

单双链复合体的构建方法及步骤：

采用Lambda Exonuclease酶切法制备单链，再以单链为模板构建单双链复合体。Lambda Exonuclease（Lambda核酸外切酶，Fermentas公司产品）可以选择性地识别双链DNA的5’磷酸化链，并从5’磷酸化末端开始一个核苷酸一个核苷酸切除，最后剩下非磷酸化的互补链。单双链复合体的制备包括三个步骤：首先用磷酸化引物扩增出大于1000bp的18S rDNA长双链片段；其次用Lambda核酸外切酶处理一条链被磷酸化的长双链片段，得到未被磷酸化的那条单链；最后以该单链为模板，采用结合位点在片段内部的引物进行一步延伸得到单双链复合体。

单双链复合体的验证方法：

    采用Exonuclease I（核酸外切酶I，Takara公司产品）对单双链复合体进行验证。Exonuclease I可以特异性地切割单链DNA片段，则单双链复合体经Exonuclease I酶切，其单链区域将被切除，完全酶切后将仅剩双链区域。因此可以利用常规的凝胶电泳对酶切产物进行分析。

本发明的有益效果是，采用基于18S rDNA的单双链复合体进行DGGE或TGGE分析可以在保证电泳分离效果的同时获得更多的序列信息，这样就可以在保证真菌菌群多样性良好解析的同时提供更加精准的菌群结构信息。准确获知样品中微生物种属信息是微生物生态研究中最基本也是最重要的一环，本发明解决了DGGE和TGGE 这两项技术应用于真菌菌群结构解析研究中的主要不足，使得这些技术能够更加有效地用于这一领域的研究当中，对整个研究领域具有较大的开拓性意义。本发明提出的单双链复合体策略相比于与rDNA近全长序列克隆文库结合的策略，具有简便、快捷和重现性好的优点。

附图说明

图1是单双链复合体示意图。

图2是单双链复合体的构建流程图，其中FR1、FF390、NS3和NS1是真菌研究常用的四个引物：FR1GC表示在FR1的5’端加了GC夹子，在图中用黑色小框表示；NS3p表示其5’端第一个碱基是经过磷酸化修饰的，磷酸化引物扩增的序列在图中用黑色的星号表示。

图3是单双链复合体的电泳验证结果，这里以红曲样品1为例进行展示。图中M泳道样品为Marker，ld表示长双链即引物FR1-NS1和FR1GC-NS3p的Nested-PCR产物，ls表示单链即ld经Lambda酶切的产物，Els为ls经Exonuclease I酶切的产物，FH表示单双链复合体即ls经FF390一步延伸的产物，E_FH为FH经Exonuclease I酶切的产物，sd表示短双链即FR1GC-FF390的扩增产物。

图4是单双链复合体和引物FR1GC-FF390扩增片段的DGGE图谱。其中A部分是单双链复合体的DGGE图谱，B部分是引物FR1GC-FF390扩增片段即短双链的DGGE图谱，放在一起便于分析和比较，引物FR1GC-FF390扩增片段对应于单双链复合体的双链区；FH1表示红曲样品1的单双链复合体，FH2表示红曲样品2的单双链复合体，sd1表示红曲样品1的短双链，sd2表示红曲样品2的短双链，FH2中的阿拉伯数字1、2、3、4、5表示割取的条带编号。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

本实施例以购自古田地区的两种红曲黄酒酿造用曲（红曲样品1和2）为对象，利用基于18S rDNA的单双链复合体的DGGE分析研究其真菌菌群结构。本实施例具体步骤及结果如下：

1、基因组DNA的提取

参照文献（Heng Zhu, Feng Qu and Li-Huang Zhu. Isolation of genomic DNAs from plants, fungi and bacteria using benzyl chloride. Nucleic Acids Research. 1993,21（2）:5279-5280.）采用氯化苄法提取红曲样品的基因组DNA。

2、单双链复合体的制备

单双链复合体的构建流程如图2所示，所采用的PCR体系见表1，所用到的引物及其PCR程序见表2。

表1实施例中采用的PCR体系

表2 实施例中采用的引物及其PCR程序

注：引物FR1-NS3的扩增程序同FR1GC-NS3p的一致。对于引物FR1GC序列，下划线部分表示的是GC夹子，除GC夹子外其序列同FR1是一样的，字母I表示次黄嘌呤核苷酸即肌苷；对于引物NS3p，其序列同引物NS3一致，p表示5’端第一个核苷酸经过磷酸化修饰。

制备流程主要包含三步：第I步是用FR1-NS1和FR1GC-NS3p进行Nested-PCR（巢式PCR）得到磷酸化的长双链；第II步是用Lambda酶处理该长双链，则其磷酸化链被切除，剩下未被磷酸化的那条链；第 III步是以第II步中的单链为模板，用FF390引物进行一步延伸即制得单双链复合体。

对于单双链复合体的构建，具体过程如下：

（1）在第I步中需要进行两轮PCR，首先用FR1-NS1引物扩增18S rDNA近全长序列（约长1650bp），然后将扩增产物用无菌水稀释1000倍，取1μL稀释液做为模板，采用FR1GC-NS3p进行第二轮扩增。

（2）在第II步中，Lambda Exonuclease酶切反应在PCR管中进行，体系为：44μL PCR产物+5μL 10×Lambda Exonuclease Buffer+1μL Lambda Exonuclease，总共50μL。体系先在37℃下保温1h用于酶切反应，再在80℃下维持10min使酶失活。

（3）在第III步中，一步延伸体系为：37.5μL Lambda Exonuclease酶切产物+5μL 10×PCR Buffer+4μL dNTPmix+3μL Primer FF390+0.5μL Taq酶。反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性2min，53℃退火3min，72℃延伸6min，只进行1次反应，72℃终延伸4min。

3、单双链复合体的验证

采用Exonuclease I对单双链复合体进行验证。酶切反应在PCR管中进行，体系为：16μL PCR产物+2μL 10×Exonuclease I Buffer+2μL酶，总共20μL。体系先在37℃下保温1.5h用于酶切反应，再在80℃下维持10min使酶失活。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳对酶切产物进行分析，凝胶浓度为5%，电泳电压为200V，时间为1h。红曲样品1的相关电泳结果如图3所示，其中包括单双链复合体制备过程中的三大步骤的产物的结果。泳道2样品为步骤I的产物，出现了单一的条带，长度约为1150bp，符合FR1GC-NS3p扩增片段的长度。泳道3样品是步骤II的产物为长单链，出现了一亮一暗两条条带，亮带迁移率很慢甚至比Marker中的2000bp条带还要慢，暗带同长双链位置是一致的。可以认定暗带是长双链，由于Lambda Exonuclease酶的不完全酶切而存留下来的；亮带是长单链，由于其存在空间结构，因此迁移率比长双链的要低。此外，经Exonuclease I酶切后即泳道4中的Els显示亮带消失，进一步证明了泳道3中的亮带为DNA单链；而酶切后暗带仍保留，进一步证明了其为DNA双链。泳道5样品是步骤III的产物也出现了一亮一暗两条条带，暗带和长双链位置是一致的，如前所述可知其为残存的长双链，而亮带应为所构建的单双链复合体。经Exonuclease I酶切后即泳道6中的E_FH显示原来的亮条带消失了，同时出现了一条新的条带，新出现的条带位置同短双链是一致的，由此进一步证明了泳道5中的亮带正是所期望构建的单双链复合体。单双链复合体经Exonuclease I酶切后，其单链部分被切除而双链部分不受影响，因此单双链复合体消失，留下了其双链部分。综上所述，基于18S rDNA片段的单双链复合体得到了成功构建，它是由约390bp（含GC夹子）的双链和由约750bp的单链构成的。

4、单双链复合体的DGGE分析

DGGE分析步骤参照文献（Muyzer G,Waal EC,Uitterlinden AG.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Appl.Environ.Microbiol,1993,59: 695-700.）进行。样品为红曲1和2的单双链复合体及短双链。图4的A部分是单双链复合体的DGGE图谱，条件为胶浓度为4%，变性剂梯度为20%-50%，缓冲液为1×TAE，控温为60℃，电压为160V，时间为18h；图4的B部分是引物FR1GC-FF390扩增片段即短双链的DGGE图谱，该片段对应于单双链复合体的双链区，DGGE条件为胶浓度为8%，变性剂梯度为20%-50%，缓冲液为1×TAE，控温为60℃，电压为65V，时间为12h。以红曲样品2为例进行分析，从图4的DGGE结果可以看出其单双链复合体样品一共出现了5条明亮和单一的条带，这些条带都得到了很好的分离。经过和长双链在相同条件下的DGGE结果比较发现，此时长双链早已跑出DGGE凝胶并不会影响菌群多样性的解析，由此可知图4的A部分条带确由单双链复合体形成的。而红曲样品2的短双链也是5条DGGE条带，并且和其单双链复合体的带型非常一致。红曲样品1也是如此，只不过其条带是4条。对于单双链复合体，目前所采用的DGGE条件是经过本发明优化的次优条件，理论上可以预见在某一最优条件下单双链复合体和短双链片段的DGGE带型应该是完全一致的。综上所述，红曲样品的单双链复合体的带型和其双链区的基本一致，分离效果也十分相近，由此可见单双链复合体的分离主要取决于其双链部分，符合理论分析结果。

5、分子鉴定

由于红曲样品2的单双链复合体包括了所有带型，因此只对其条带（图4中编号1-5的条带）进行割胶回收，取1μL回收液做为模板以FR1-NS3为引物进行扩增。将扩增得到的长双链送上海生工生物工程公司进行序列测定，如表3所示。对于获得的序列，利用NCBI的BLAST程序在GenBank数据库中进行相似性搜索。在比对结果中，选择得分最高（可能不止一种）的所有种属信息。为了显示长片段序列在分子鉴定方面的优势，表3中也列出了短片段序列的分子鉴定结果用于比较分析。由于FR1GC-FF390扩增片段即为单双链复合体的短双链部分（图2），因此短双链片段的序列可以很容易地直接由长双链片段的序列获得。

表3长双链序列测定结果

表4 长双链片段序列和短双链片段序列的分子鉴定结果

注：表中“—“表示查无相应的中文种属名称。

长双链片段可以提供约1100pb（不含40bp的GC夹子）的序列，这比短双链约350bp（不含40bp的GC夹子）多得多。由表3可以发现长双链序列（除了条带4外）的分子鉴定结果只有一两种；而短双链的则较多，并且包括了长片段序列的结果。以条带5对应的长双链片段的分子鉴定结果为例具体说明，长双链序列将其鉴定为Monascus ruber或Monascus purpureus，相似度高达99%具有很高的可信度；而短双链片段虽然也有99%的相似度，但是其却有Monascus ruber、Monascus purpureus、Monascus fuliginosus和Monascus pilosus四种结果，其中包含了长片段序列的两种结果。其它条带的鉴定结果也出现一样的情形。此外对于条带4，即使是长片段序列，也出现了四种结果，而且其中两种只鉴定到了属这一水平，不过虽然如此，其结果还是比短片段序列的少。酵母是一个庞大的类群，可能需要更长的序列才能对其做更加精准的鉴定。由此可知，相比于短片段序列，长片段序列能够提供更加精准的分子鉴定结果，因此用于微生物生态研究时就能够提供更加精准的菌群结构信息。

综上可知，本实施例构建的单双链复合体在保证良好分离的前提下，以简便的方式获得了更多的序列（多出短双链区约750bp的序列）信息，从而使得分子鉴定结果更加精准，因此获得了更加精准的菌群结构信息。

虽然本发明效果以实施例践证，但其并非用以限定本发明，本发明的保护范围以权力要求书部分所界定的为准。 

<110>  福州大学

 

<120>  一种利用单双链复合体解析真菌菌群结构的方法

 

<160>  10   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gtagtcatat gcttgtctc  19

 

 

<210>  2

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (2)..(2)

<223>  n is i

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (17)..(17)

<223>  n is i

 

<400>  2

anccattcaa tcggtant   18

 

 

<210>  3

<211>  58

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (42)..(42)

<223>  n is i

 

<220>

<221>  misc_feature

<222>  (57)..(57)

<223>  n is i

 

<400>  3

cccccgccgc gcgcggcggg cggggcgggg gcacgggccg anccattcaa tcggtant   58

 

 

<210>  4

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

gcaagtctgg tgccagcagc c      21

 

 

<210>  5

<211>  18

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

cgataacgaa cgagacct   18

 

 

<210>  6

<211>  1113

<212>  DNA

<213>  Monascus ruber或Monascus purpureus

 

<400>  6

agccattcaa tcggtagtag cgacgggcgg tgtgtacaaa gggcagggac gtaatcggca     60

 

cgagctgatg actcgtgcct actaggcatt cctcgttgaa gagcaataat tgcaatgctc    120

 

tatccccagc acgacagggt ttaacaagat tacccaggcc tctcggccaa ggtgatgtac    180

 

tcgctggccc tgtcagtgta gcgcgcgtgc ggcccagaac atctaagggc gtcacagacc    240

 

tgttattgcc gcgcacttcc atcggctcga gccgatagtc cccttaagaa gccagcggcc    300

 

cgcaaatgcg gaccgggcta tttaagggcc gaggtctcgt tcgttatcgc aattaagcag    360

 

acaaatcact ccaccaacta ggaacggcca tgcaccacca tccaaaagat caagaaagag    420

 

ctctcaatct gccaatcctt attttgtctg gacctggtga gtttccccgt gttgagtcaa    480

 

attaagccgc aggctccacg ccttgtggtg cccttccgtc aatttcttta agtttcagcc    540

 

ttgcgaccat actcccccca gaacccaaaa actttgattt ctcgtaaggt gccgaacggg    600

 

tcatcataga aacccgtccg atccctagtc ggcatagttt atggttaaga ctacgacggt    660

 

atctgatcgt cttcgatccc ctaactttcg ttccctgatt aatgaaaaca tccttggcga    720

 

atgctttccc agtagttagt cttcagcaaa tccaagaatt tcacctctga cagctgaata    780

 

ctgacgcccc cgactatccc tattaatcat tacggcggtc ctagaaacca acaaaataga    840

 

accgcacgtc ctattctatt attccatgct aatgtattcg agcaaaggcc tgctttgaac    900

 

actctaattt tttcacagta aaagtcctgg ttccccccac agccagtgaa ggccatgagg    960

 

ttccccagag ggaaaggtcc ggccggacca gtactcgcga tgaggcggac cggccagcca   1020

 

gacccaaggt tcaactacga gctttttgac tgcaacaact ttaatatacg ctattggagc   1080

 

tggaattacc gcggctgctg gcaccagact tgc                                1113

 

 

<210>  7

<211>  1116

<212>  DNA

<213>  Saccharomonospora sp.

 

<400>  7

agccattcaa tcggtagtag cgacgggcgg tgtgtacaaa gggcagggac gtaatcaacg     60

 

caagctgatg acttgcgctt actaggaatt cctcgttgaa gagcaataat tacaatgctc    120

 

tatccccagc acgacggagt ttcacaagat ttcccagacc tctcggccaa ggttaatact    180

 

cgctggctcc gtcagtgtag cgcgcgtgcg gcccagaatg tctaagggca tcacagacct    240

 

gttattgcct caaacttcca tcgacttgaa atcgatagtc cctctaagaa gtgactatac    300

 

cagcaaaagc tagcagcacc atttagtagg ttaaggtctc gttcgttatc gcaattaagc    360

 

agacaaatca ctccaccaac taagaacggc catgcaccac cgcccacaaa atcaagaaag    420

 

agctctcaat ctgtcaatcc ttattgtgtc tggacctggt gagtttcccc gtgttgagtc    480

 

aaattaagcc gcaggctccg ctcctggtgg tgcccttccg tcaattcctt taagtttcag    540

 

ccttgcgacc atactccccc cagaacccaa agactttgat ttctcgtaag gtgccgagtg    600

 

cgtcaaaaaa agaacaacac ccgatcccta gtcggcatag tttatggtta agactacgac    660

 

ggtatctgat catcttcgat cccctaactt tcgttcttga ttaatgaaaa cgtccttggc    720

 

aaatgctttc gcagtagtta gtcttcagta gatctaagaa tttcacctct gacaactgaa    780

 

tactgatgcc cccgaccgtc cctattaacc attacgatgg tcctagaaac caacaaaata    840

 

gaaccataac gtcctattct attattccat gctaatatat tcgagcaaag ggcctgcttt    900

 

gaacactcta attttttcaa agtaaaagtc ctggttcgcc aaacaccaca agggcgaatg    960

 

attagccaga aggaaaggct cggttgggtc cagtactcgc caaaaaggcg gaccggccaa   1020

 

ccaagcccaa agttcaacta cgagcttttt aactgcaaca actttaatat acgctattgg   1080

 

agctggaatt accgcggctg ctggcaccag acttgc                             1116

 

 

<210>  8

<211>  1134

<212>  DNA

<213>  Rhizopus oryzae

 

<400>  8

agccattcaa tcggtagtag cgacgggcgg tgtgtacaaa gggcagggac gtaatcaacg     60

 

caagctgatg acttgcgctt actaggaatt cctcgttgaa gagcaataat tacaatgctc    120

 

tatccccagc acgatgaagt ttcaaaagtt tacccagacc ttccggccaa ggttataaac    180

 

tcgctgactt catcagtgta gcgcgcgtgc ggcccagaac atctaagggc atcacagacc    240

 

tgttattgcc taaaacttcc ttcggctcga agccgatagt ctctctaaga agccagttaa    300

 

atattaaata taaaccaacc cgaaagagtt agcctgtcta attagcagaa taaggtctcg    360

 

ttcgttatcg gaattaacca gacaaatcac tccacgaact aagaacggcc atgcaccacc    420

 

acccatagag tctagaaaga gctttcaatc tgtcagtcct tactatgtct ggacctggtg    480

 

agtttccccg tgttgagtca aattaagccg caggctccac tcctggtggt gcccttccgt    540

 

caattccttt aagtttcagc cttgcgtccc atactccccc cagaacccaa aaacttcact    600

 

ttcgctaaga tgctgagcga gtcataataa acgcgcccaa tctctagtcg gcatagtttg    660

 

tggttaagac tacgacggta tctaatcgtc ttcgatccct taactttaga ccttgatcaa    720

 

tgaaaacgtc ccgggtcgaa tgctttcgca gtagtttgtc ttcggtcaat ccaagaattt    780

 

cacctccagc gaccaaatac aaatgcccct aaccgcttct attcatcatt actgaagtac    840

 

ctaaaccaac gaaaatagga ctaaagtcat atttcatttt tccatgctaa cacattcaag    900

 

cttaaaagcc tgctttaaac actctgattt gctcatggta attgtccaga aaaccctagc    960

 

cacgaggact aggagtcaat ggacatggag tctccggcag caatgagctt ggtcaatgaa   1020

 

gaccaggcca ctacgccggt aagactaaag tttgactacg gacgttttaa ctgcaacaac   1080

 

tttaatatac gctattggag ctggaattac cgcggctgct ggcaccagac ttgc         1134

 

 

<210>  9

<211>  1138

<212>  DNA

<213>  Mucor circinelloides或Rhizomucor variabilis

 

<400>  9

ggccattcaa tcggtagtag cgacgggcgg tatgtacaaa gggcagggac gtaatcaacg     60

 

cgagctgatg acttgccctt actaggaatt cctcgttgaa gagcaataat tacaatgctc    120

 

tatccccagc acggtgaagt ttcaaaagtt tacccgaacc ttccggctaa ggatataaac    180

 

tcgctgattt catcagtgta gcgcgcgtgc ggcccagaac atctaagggc atcacagacc    240

 

tgttattgcc taaaacttcc ttcggcttga agccgatagt ctctctaaga agccagatag    300

 

ataaatctat taatcaacta aaaagttgac ccgcctattt agcagaataa ggtctcgttc    360

 

gttatcggaa ttaaccagac aaatcactcc acgaactaag tacggccatg caccaccacc    420

 

catagaatct agaaagagct ttcaatctgt caatccttac tatgtctgga cctggtgagt    480

 

ttccccgtgt tgagtcaaat taagccgcag gctccactcc tggtggtgcc cttccgtcaa    540

 

ttcctttaag tttcagcctt gcgtcccata ctccccccag aacccaaaaa ctttactttc    600

 

gctaagatgc tgagctagtc ataataaaca tgcccaatct ctagtcggca tagtttgcgg    660

 

ttaagactac gacggtatct aatcgtctcc gatcccttaa ctttagacct tgatcaatga    720

 

aaacgtcctg gatcaaatgc tttcgcagta gtttgtcttc ggtcaatcca agaatttcac    780

 

ctctagcgac caaacacaaa tgtccccaac cgtttctatt catcattact taagttcctg    840

 

aaccaacgaa atagggacta aagtcatatt tcattattcc atgctaacac attcaagctt    900

 

gaaagcctgc tttaaacact ctgatttgct catggtaatc atctggctag agactataaa    960

 

caaccgaagc tattcatagc ataaccagaa aaaaagtctc gataaaagcg agcctgatca   1020

 

atgaagacca ggccacctca tctaaagact aaaatttgac tacggacgtt ttaactgcaa   1080

 

caactttaat atacgctatt ggagctggaa ttaccgcggc tgctggcacc agacttgc     1138

 

 

<210>  10

<211>  1102

<212>  DNA

<213>  Rhizopus microsporus

 

<400>  10

gggcacaaca cagcaacaca agtatctcgc gagctgatga ctcgcgctta ctaggaattc     60

 

ctcgttgaag agcattatta caatgctcta tccccagcac gatgaagttt caaaagttta    120

 

cccagacctt ccggccaagg ttataaactc gctgacttca tcagtgtagc gcgcgtgcgg    180

 

cccagaacat ctaagggcat cacagacctg ttattgccta aaacttccct ctgcttcaag    240

 

cagatagtct ctctaagaac acagttaaat gataaacata aaccaacccg aaagagttag    300

 

cctgcgtaat tagcagaata aggtctcgtt cgttatcgga attaaccaga caaatcactc    360

 

cacgaactaa gaacggccat gcaccaccac ccatagaatc tagaaagagc tttcaatctg    420

 

tcaatcctta ctatgtctgg acctggtgag tttccccgtg ttgagtcaaa ttaagccgca    480

 

ggctccactc ctggtggtgc ccttccgtca attcctttaa gtttcagcct tgcgtcccat    540

 

actcccccca gaacccaaaa actttacttt cgctaagatg ctgagcgagt caaaagaaac    600

 

acgcccaatc tctagtcggc atagtttgtg gttaagacta cgacggtatc taatcgtctt    660

 

cgatccctta actttagacc ttgatcaatg aaaacgtcct gggtcaaatg ctttcgcagt    720

 

agtttgtctt cggccaatcc aagaatttca cctctagcgg ccaaatacaa atgcccccaa    780

 

ccgtttctat taatcattac tatagtacct aaaccaacga aaataggact aaagtcatat    840

 

ttcattattc catgctaaca cattcaagct taaaagcctg ctttaaacac tctgatttgc    900

 

tcatggtaat tgtccacaaa accctagcca cgaggactag gagccagcgg acgtggagtc    960

 

tccagcgaca gcgagcttga tcaatgaaga ccaggccacc gcgccggtaa gactaaagtt   1020

 

tgactacgga cgttttaact gcaacaactt taatatacgc tattggagct ggaattaccg   1080

 

cggctgctgg caccagactt gc                                            1102

 

 

Claims (1)

1.一种利用单双链复合体解析真菌菌群结构的方法，其特征在于：所述方法的步骤如下：提取样品中微生物总基因组DNA；基于18S rDNA片段构建单双链复合体并进行DGGE或TGGE分析；割胶回收单双链复合体并将其扩增为完整双链；对扩增到的完整双链进行测序并将测定的序列提交到NCBI上利用Blast在GeneBank数据库中进行相似性搜索；最后根据相似性得分判断对应真菌的种属；所述单双链复合体的制备步骤为：首先用磷酸化的引物扩增出大于1000bp的18S rDNA长双链片段；其次用Lambda核酸外切酶处理长双链片段，得到未被磷酸化的单链；最后以该单链为模板，采用单个引物进行一步延伸得到单双链复合体；用于DGGE 或TGGE分析时，单双链复合体的双链区不超过500bp。