KR20110050327A - Ｔｈｄ 프라이머 타겟 검출 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer)의 5’-cleavage and 3’-extension 반응을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물 내 타겟 핵산서열의 검출방법 및 키트에 관한 것이다. 본 발명은 타겟 핵산 서열에 상보적인 염기서열의 합성뿐 만 아니라 타겟 핵산 서열을 검출 할 수 있는 시그널을 제공하는 이중적 기능을 갖는 THD 프라이머를 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 THD 프라이머를 실시간 PCR에서 사용하는 경우, 프라이머로서 역방향 프라이머의 연장 반응과 동반되어 타겟 핵산 서열을 증폭할 뿐만 아니라, 기존의 방식과 같은 추가적인 표지된 프로브 없이 본 발명의 THD 프라이머에 대한 5’to 3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형 의존성 핵산 중합효소의 5’-절단 반응에 의해 타겟 핵산 서열의 검출 시그널을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 THD 프라이머와 역방향 프라이머만을 사용하더라도 타겟 핵산 서열의 증폭 및 타겟 핵산 서열의 실시간 검출이라는 목적을 달성할 수 있다.
타겟, 서열, 검출, 프라이머, 실시간, 연장반응, 절단반응

Description

ＴＨＤ 프라이머 타겟 검출{ＴＨＤ Primer Target Detection}
본 발명은 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer)를 이용한 타겟 핵산서열의 검출에 관한 것이다.
타겟 핵산을 검출하기 위한 대부분의 기술들은 타겟 핵산 증폭 과정을 포함하고 있다. 핵산 증폭은 분자 생물학 분야에서 이용되는 필수적인 과정이고, 이에 다양한 증폭 방법이 제시되었다. 예를 들어, Miller, H. I. 등 (WO 89/06700)은, 프로모터/프라이머 서열을 타깃 단일가닥 DNA("ssDNA")에 혼성화 시킨 다음, 상기 서열의 많은 RNA 카피를 전사하는 과정을 포함하는 핵산서열 증폭 방법을 개시하고 있다. 다른 공지의 핵산 증폭 방법들은 전사 증폭 시스템을 포함한다(Kwoh, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:1173(1989); 및 Gingeras T.R. et al., WO 88/10315).
중합효소 연쇄반응(이하,“PCR"이라 한다)으로 공지된 가장 많이 이용되는 핵산 증폭 방법은 이중가닥 DNA의 변성, DNA 주형에로의 올리고뉴클레오타이드 프 라이머의 어닐링 및 DNA 중합효소에 의한 프라이머 연장의 반복된 사이클 과정을 포함한다(Mullis 등, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호; Saiki et al., (1985) Science 230, 1350-1354).
PCR-관련 기술들은 생물학과 의학의 연구 분야에서 다양한 응용과 방법에 널리 이용되고 있으며, 예컨대, 타겟 서열의 검출, 역전사 효소 PCR (RT-PCR), 분별 디스플레이 (Differential Display) PCR (DD-PCR), 공지 또는 미지의 유전자의 클로닝, cDNA 말단의 고속 증폭(RACE), DNA 시퀀싱 및 PCR-관여 게놈 분석(McPherson and Moller, 2000)이 있다.
핵산 증폭은 상술한 바와 같이 널리 이용되고 있기 때문에, 핵산 증폭 방법을 개선하려는 연구들이 많이 이루어지고 있다.
이러한 연구들 중에서, Real-time PCR은 실시간으로 증폭산물을 측정하고 cross-contamination을 감소시키며, 보다 정확한 정량적 분석을 가능하게 한다는 측면에서 크게 주목을 받고 있다. Real-time PCR 방법들 중에서 현재 가장 많이 이용되고 있는 TaqMan probe법은 프로브의 한 쪽 끝에 리포터 분자를 붙이고 다른 한 끝에는 퀀처 분자를 붙여, PCR이 진행될 때 리포터 분자가 퀀처 분자와 떨어지면서 발산되는 고유의 형광을 검출하는 방식이다. Real-time PCR에 관한 종래 특허문헌으로는, U.S. Pat. Nos. 5,210,015, 5,538,848 및 6,326,145가 있다.
그러나 TaqMan probe 방식은 TaqMan probe의 비특이적 결합에 의한 false positives가 발생되는 문제점이 있다.
한편, Self-quenching fluorescence probe 방식(U.S. Pat. No. 5,723,591)은 형광 리포터와 퀀처가 표지된 Self-quenching fluorescence probe가 단일가닥 상태 일 때는 퀀칭이 되어, 형광이 검출이 되지 않지만, Self-quenching fluorescence probe가 주형 DNA에 결합만 하면, 주형과 이중가닥이 되면서, 형광 리포터분자가 퀀처 분자에 의하여 탈형광 (unquench) 되지 않아 형광이 검출된다. 즉, Self-quenching fluorescence probe가 단일가닥 상태인지 혹은 이중가닥 상태인지 유무에 따라, 형광이 검출이 되기 때문에, 특이적-결합 또는 비-특이적 결합 상관없이, 주형에 결합만 하면 형광이 검출이 되기 때문에 비특이적 결합에 의한 false positives가 발생한다.
상술한 기술들은 타겟 핵산서열을 검출하는 데 있어서, 나름대로의 장점을 가지고 있지만, 의미 있는 형광 시그널을 얻는 데 상당한 시간 및 시약이 소요되는 문제점이 있다. 또한, 얻어진 형광 시그널 또한 백그라운드 발생 문제에서 자유롭지 못하며, 이에 타겟 핵산서열의 정확도를 개선하여야 하는 기술적 과제가 아직까지 남아 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 종래의 타겟 핵산서열 검출 기술들의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력하였다. 본 발명자들은 프로빙 및 프라이밍 이중 기능을 하는 신규한 개념의 올리고뉴클레오타이드를 디자인하고 이 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 타겟 핵산서열 검출을 위한 다양한 프로토콜을 만들었다. 그 결과, 본 발명자들에 의해 만들어진 타겟 핵산서열 검출 방법들이 타겟 핵산서열의 검출, 특히 실시간 검출에서 우수한 performance를 나타내며 또한 타겟 핵산서열을 나타내는 시그널을 보다 신속하면서도 강하게 발생시킨다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 THD primer의 5’-cleavage and 3’-extension 반응을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물 내 타겟 핵산서열의 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 THD primer의 5’-cleavage and 3’-extension 반응을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물 내 타겟 핵산서열의 검출을 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 실시예, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 THD primer의 5’-cleavage and 3’-extension 반응을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물 내 타겟 핵산서열의 검출방법을 제공한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer)와 혼성화시키는 단계로서, 상기 THD primer는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며;
(b) 상기 혼성화 결과물을 primer의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 THD primer의 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며; 및
(c) 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
본 발명자들은 종래의 타겟 핵산서열 검출 기술들의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력하였다. 본 발명자들은 프로빙 및 프라이밍 이중 기능을 하는 신규한 개념의 올리고뉴클레오타이드를 디자인하고 이 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 타겟 핵산서열 검출을 위한 다양한 프로토콜을 만들었다. 그 결과, 본 발명자들에 의해 만들어진 타겟 핵산서열 검출 방법들이 타겟 핵산서열의 검출, 특히 실시간 검출에서 우수한 performance를 나타내며 또한 타겟 핵산서열을 나타내는 시 그널을 보다 신속하면서도 강하게 발생시킨다는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 타겟 핵산서열에 혼성화된 올리고뉴클레오타이드의 연장반응 조건 하에서 5’to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키면, 그의 3‘-말단이 연장되고 또한 그의 5‘-말단 부위가 절단됨을 발견하였고 상기 올리고뉴클레오타이드에 적절한 시그널링 시스템을 결합시키면 타겟 핵산서열의 검출을 위한 효율적인 새로운 프로토콜들을 만들 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 타겟 핵산서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드는 타겟 핵산서열에 혼성화 되면서 타겟 핵산 서열에 상보적인 염기서열의 합성뿐 만 아니라 타겟 핵산 서열을 검출 할 수 있는 시그널을 제공하는 이중적 기능을 한다.
따라서, 상기 올리고뉴클레오타이드는 “타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer)”로 명명되며, 이에 본 발명의 방법은 "THD primer Target Detection Assay"로 명명된다.
본 발명에 따르면, 우선 상기 타겟 핵산서열을 THD primer와 혼성화시킨다.
본 명세서에서 용어 “타겟 핵산서열” 또는 “타겟 핵산”은 최종적으로 검출하고자 하는 서열을 의미하며, 특정 증폭 조건 및 혼성화 조건에서 본 발명의 프라이머와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드 (dNTPs)와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적 합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 명세서 용어 “혼성화(hybridization)" 는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
용어“어닐링”과 “혼성화”는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
본 명세서에서 사용된 용어 “블록킹 프로브(probe)"는 프로브의 3‘-말단이 블로킹되어 연장될 수 없는 프로브를 의미한다.
본 명세서에서 용어 “THD primer"는 타겟 핵산서열에 혼성화 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산서열에 상보적인 서열을 형성하며 그의 5‘-말단 부위가 절단되는 프라이머를 의미한다.
본 발명에서 이용되는 THD primer는 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 검출가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있는 표지 부위를 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적 (perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.
THD primer의 표지 부위는 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의해 절단되는 부위이다. THD primer의 표지 부위는 바람직하게는 5‘-말단 부위에 위치해 있다. 예를 들어, THD primer의 5‘-말단으로부터 최대 5 뉴클레오타이드 이격된 위치까지 표지 부위로 할 수 있다. 가장 바람직하게는, 상기 표지 부위는 THD primer의 5‘-말단에 위치해 있다. 표지 부위에 결합된 검출가능한 시그널 발생 표지는 표지 부위의 어떤 site에도 결합할 수 있으며, 예를 들어 5‘-말단 또는 5‘-말단으로부터 1-5 뉴클레오타이드 이격되어 위치할 수 있다. 가장 바람직하게는, 검출가능한 시그널 발생 표지는 THD 프라이머의 5‘-말단에 위치한다. 표지 부위는 표지, 하나의 표지가 결합된 하나의 뉴클레오타이드, 여러 개의 표지가 결합된 뉴클레오타이드들, 또는 하나의 표지가 결합된 하나의 뉴클레오타이드와 표지가 결합되지 않은 여러 개의 뉴클레오타이드로 construction 할 수 있다.
검출가능한 시그널을 발생시키는 표지의 종류는 매우 다양하다. 대부분의 표지는 하나의 표지 분자 또는 원자로 이루어져 있으나, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지인 경우에는 형광 리포터 분자 및 퀀처 분자의 페어로 이루어져 있다. 하나의 표지 분자 또는 원자로 이루어진 표지의 경우에는 상술한 바와 같이 표지 부위에 위치한다. 그러나 FRET 표지인 경우에는 시그널링 페어 중 형광 리포터 분자가 표지 부위에 위치한 경우, 상기 리포터 분자로부터 나오는 형광을 퀀칭하는 퀀처 분자는 상기 위치의 3’-방향 쪽에 위치한다. 이 경우, 퀀처 분자는 표지 부위에 있을 수도 있고 표지 부위의 3’-방향 쪽에 위치할 수도 있다. 반대로, 퀀처 분자가 표지 부위에 위치한 경우 형광 리포터 분자는 상기 위치의 3’-방향 쪽에 위치한다. 즉, FRET 표지를 이용하는 경우, 시그널링 페어의 두 분자 중 적어도 한 분자는 표지 부위에 위치하여야 하며, 다른 분자는 이 분자의 3’-방향 쪽에 이격되어 위치한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, THD 프라이머는 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자가 결합되어 있으며, 5’-cleavage 반응에 의해 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 상기 THD primer로부터 해리되어 상기 리포터 분자의 형광이 탈소멸(unquenched) 되며 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생되어 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는 시그널을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 chemical, enzymatic, radioactive, magnetic, fluorescent, luminescent, chemiluminescent 또는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지이다.
화학표지의 예는 바이오틴을 포함한다. 바이오틴과 스트렙타비딘(또는 아비딘) 사이의 결합 특이성을 이용하여 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 얻을 수 있다.
효소표지의 예는 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P450을 포함한다. 이 경우, 상기 효소표지에 대한 기질을 이용하여 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 얻을 수 있다. 예를 들어, 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진), HYR(p-phenylenediamine-HCl and pyrocatechol), TMB(tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-페닐렌디아민(OPD) 및 나프톨/파이로닌, 글루코스 옥시다아제와 t-NBT(nitroblue tetrazolium) 및 m-PMS(phenzaine methosulfate)과 같은 기질이 이용될 수 있다.
방사능 표지의 예는 C14, I125, P32 및 S35을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 표지는 FRET 표지이다. FRET 표지는 리포터 분자 및 퀀처 분자를 포함한다. 상기 리포터 분자 및 퀀처 분자는 모두 형광성 물질이다. 본 발명에 이용될 수 있는 형광성 리포터 분자 및 퀀처 분자는 당업계에 공지되어 있는 어떠한 것도 이용할 수 있으며, 그 예는 다음과 같다(괄호의 숫자는 나노미터 단위로 표시한 발광 최대 파장이다):
Cy2™ (506), YO-PRO™-1 (509), YOYO™-1 (509), Calcein (517), FITC (518), FluorX™ (519), Alexa™ (520), Rhodamine 110 (520), 5-FAM (522), Oregon Green™ 500 (522), Oregon Green™ 488 (524), RiboGreen™ (525), Rhodamine Green™ (527), Rhodamine 123 (529), Magnesium Green™ (531), Calcium Green™ (533), TO-PRO™-1 (533), TOTO1 (533), JOE (548), BODIPY530/550 (550), Dil (565), BODIPY TMR (568), BODIPY558/568 (568), BODIPY564/570 (570), Cy3™ (570), Alexa™ 546 (570), TRITC (572), Magnesium Orange™ (575), Phycoerythrin R&B (575), Rhodamine Phalloidin (575), Calcium Orange™ (576), Pyronin Y (580), Rhodamine B (580), TAMRA (582), Rhodamine Red™ (590), Cy3.5™ (596), ROX (608), Calcium Crimson™ (615), Alexa™ 594 (615), Texas Red(615), Nile Red (628), YO-PRO™-3 (631), YOYO™-3 (631), R-phycocyanin (642), C-Phycocyanin (648), TO-PRO™-3 (660), TOTO3 (660), DiD DilC(5) (665), Cy5™ (670), Thiadicarbocyanine (671) 및 Cy5.5 (694).
또한, 자체 형광 없이 광범위한 파장 또는 특정 범위의 파장을 퀀칭할 수 있는 블랙 퀀처가 퀀처 분자로 사용될 수 있다.
적합한 리포터-퀀처 pairs는 많은 문헌에 개시되어 있다: Pesce et al., editors, FLUORESCENCE SPECTROSCOPY (Marcel Dekker, New York, 1971); White et al., FLUORESCENCE ANALYSIS: A PRACTICAL APPROACH (Marcel Dekker, New York, 1970); Berlman, HANDBOOK OF FLUORESCENCE SPECTRA OF AROMATIC MOLECULES, 2nd EDITION (Academic Press, New York, 1971); Griffiths, COLOUR AND CONSTITUTION OF ORGANIC MOLECULES (Academic Press, New York, 1976); Bishop, editor, INDICATORS (Pergamon Press, Oxford, 1972); Haugland, HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS (Molecular Probes, Eugene, 1992); Pringsheim, FLUORESCENCE AND PHOSPHORESCENCE (Interscience Publishers, New York, 1949); Haugland, R. P., HANDBOOK OF FLUORESCENT PROBES AND RESEARCH CHEMICALS, Sixth Edition, Molecular Probes, Eugene, Oreg., 1996; U.S. Pat. Nos. 3,996,345 and 4,351,760.
본 발명에서 리포터 및 퀀처로 이루어진 signalling system에서, 리포터는 FRET(fluorescence resonance energy transfer)의 donor를 포괄하는 의미를 가지며, 퀀처는 FRET의 acceptor를 포괄하는 의미를 갖는다.
예컨대, 상기 리포터 분자는 플루오레세인 색소 (fluorescein dyes)로부터 선택되며, 상기 퀀처 분자는 로다민 색소 (rhodamine dyes)로부터 선택된다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 검출 가능한 시그널 발생 표지는 FRET 표지이고 상기 FRET 표지의 형광 리포터 분자는 5‘-말단 부위에 위치하고 퀀처 분자는 상기 위치의 3’-방향쪽에 위치한다. Alternatively, 검출 가능한 시그널 발생 표지는 FRET 표지이고 상기 FRET 표지의 퀀처 분자는 5‘-말단 부위에 위치하고 형광 리포터 분자는 상기 위치의 3’-방향쪽에 위치한다.
본 발명의 방법은 크게 5가지 방식으로 실시될 수 있다:
첫 번째 방식은, THD primer만을 이용하여 연장반응을 실시한다.
두 번째 방식은, 프라이머로서의 THD primer 및 역방향 프라이머를 이용하여 연장반응을 실시한다.
세 번째 방식은, THD primer 및 상기 THD primer에 대하여 업스트림에 혼성화 되며 THD primer와 동일한 방향성(orientation)을 가지는 업스트림 프라이머를 이용하여 연장반응을 실시한다.
네 번째 방식은, THD primer, 상기 THD primer에 대하여 업스트림에 혼성화 되며 THD primer와 동일한 방향성(orientation)을 가지는 업스트림 프라이머 및 상기 THD primer에 대하여 다운스트림에 혼성화 되며 THD primer와 반대의 방향성을 가지는 역방향 프라이머를 이용하여 연장반응을 실시한다.
다섯 번째 방식은, THD primer, 상기 THD primer에 대하여 다운스트림에 혼성화 되며 THD primer와 동일한 방향성을 가지고 3‘-말단이 블록킹된 블록킹 프로브, 및 상기 THD primer에 대하여 다운스트림에 혼성화 되며 THD primer와 반대의 방향성을 가지는 역방향 프라이머를 이용하여 연장반응을 실시한다.
상술한 각각의 방식을 상세히 설명하면 다음과 같다:
1. THD primer 를 이용한 THD primer Target Detection Assay
첫 번째 방식에 따르면, 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer를 연장하는 과정에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 THD primer의 표지 부위에서 5’ to 3’절단반응이 발생되어 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 발생된다.
바람직하게는, THD primer를 이용한 THD primer Target Detection Assay에서 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 증폭시킨다. 이러한 반응 사이클을 통하여 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer의 표지부위가 계속적으로 절단되고 이로부터 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 증폭된다.
보다 바람직하게는, 반복 사이클 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함한다. 보다 더 바람직하게는, THD primer를 이용한 THD primer Target Detection Assay는 다음 단계를 포함한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer)와 혼성화시키는 단계로서, 상기 THD primer는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며;
(b) 상기 혼성화 결과물을 primer의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 THD primer의 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며; 및
(b') 상기 단계 (b)에 존재하는 이합체 (duplex)를 변성시키는 단계;
(b'') 상기 단계 (a)-(b')을 최소 2회 반복하는 단계;
(c) 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며, 상기 검출된 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
첫 번째 방식에 따르면, 단지 THD primer의 표지부위에서의 절단반응에 의해 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 얻거나 또는 증폭할 수 있다.
2. 정방향 프라이머로서의 THD primer 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay
두 번째 방식에 따르면, THD primer를 정방향 프라이머로 이용하고 추가적으로 역방향 프라이머을 이용하여 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer 및 역방향 프라이머을 연장하고, 이 과정에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 THD primer 및/또는 역방향 프라이머에서 5’ to 3’절단반응이 발생되어 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 발생된다.
바람직하게는, THD primer 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay에서 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 증폭시킨다. 이러한 반응 사이클을 통하여 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer 및/또는 역방향 프라이머의 표지부위가 계속적으로 절단되고 이로부터 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 증폭된다.
또한, 정방향 프라이머인 THD primer와 역방향 프라이머가 모두 존재하는 조건에서 반복이 이루어지기 때문에, 타겟 핵산서열도 동시에 증폭된다. 보다 바람직하게는, 반복 사이클 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함한다. 보다 더 바람직하게는, THD primer 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay는 다음 단계를 포함한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer) 및 상기 THD 프라이머와 쌍을 이루어 상기 타겟 핵산서열을 증폭하는 역방향 프라이머와 혼성화시키는 단계로서, 상기 THD primer는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며; 상기 역방향 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(b) 상기 혼성화 결과물을 primer의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, (i) 상기 주형-의존성 핵산 중합효소의 중합활성에 의해 상기 THD primer 및 역방향 프라이머의 3 ’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 (ii) 상기 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의해 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며;
(c) 상기 단계 (b)에 존재하는 이합체 (duplex)를 변성시키는 단계;
(d) 상기 단계 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널 및 타겟 핵산서열을 증폭시키는 단계; 및
(e) 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 역방향 프라이머는 검출 가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있다(보다 바람직하게는 역방향 프라이머의 5‘-말단에). THD 프라이머 및 역방향 프라이머 모두 표지가 결합되어 있는 경우에는 보다 높은 시그널을 얻을 수 있다.
3. THD primer 및 업스트림 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay
세 번째 방식에 따르면, THD primer를 정방향 프라이머로 이용하고 추가적으로 THD primer와 동일한 방향성을 가지는 업스트림 프라이머를 이용하여 타겟 핵산 서열에 혼성화 된 THD primer 및 업스트림 프라이머를 연장하고, 이 과정에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 THD primer 및/또는 업스트림 프라이머에서 5’ to 3’절단반응이 발생되어 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 발생된다.
바람직하게는, THD primer 및 업스트림 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay에서 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 증폭시킨다. 이러한 반응 사이클을 통하여 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer 및/또는 업스트림 프라이머의 표지부위가 계속적으로 절단되고 이로부터 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 증폭된다. 보다 바람직하게는, 반복 사이클 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함한다. 보다 더 바람직하게는, THD primer 및 업스트림 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay는 다음 단계를 포함한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer) 및 THD primer와 동일한 방향성을 가지는 업스트림 프라이머와 혼성화시키는 단계로서, 상기 THD primer는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며; 상기 업스트림 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며
(b) 상기 혼성화 결과물을 primer의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 THD primer의 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며; 및
(b') 상기 단계 (b)에 존재하는 이합체 (duplex)를 변성시키는 단계;
(b'') 상기 단계 (a)-(b')을 최소 2회 반복하는 단계;
(c) 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며, 상기 검출된 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
세 번째 방식에 따르면, THD primer 및/또는 업스트림 프라이머의 표지부위에서의 절단반응에 의해 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 얻거나 또는 증폭할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 업스트림 프라이머는 검출 가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있다(보다 바람직하게는 업스트림 프라이머의 5‘-말단에). THD 프라이머 및 업스트림 프라이머 모두 표지가 결합되어 있는 경우에는 보다 높은 시그널을 얻을 수 있다.
4. THD primer , 업스트림 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay
네 번째 방식에 따르면, THD primer를 정방향 프라이머로 이용하고 추가적으로 THD primer와 동일한 방향성을 가지는 업스트림 프라이머 및 THD primer에 대하여 다운스트림에 혼성화 되며 THD primer와 반대의 방향성을 가지는 역방향 프라이머를 이용하여 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer, 업스트림 프라이머 및 역방향 프라이머를 연장하고, 이 과정에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 THD primer, 업스트림 프라이머 및/또는 역방 프라이머에서 5’ to 3’절단반응이 발생되어 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 발생된다.
바람직하게는, THD primer, 업스트림 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay에서 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 증폭시킨다. 이러한 반응 사이클을 통하여 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer, 업스트림 프라이머 및/또는 역방향 프라이머의 표지부위가 계속적으로 절단되고 이로부터 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 증폭된다.
또한, 정방향 프라이머인 THD primer와 업스트림 프라이머 그리고 역방향 프라이머가 모두 존재하는 조건에서 반복이 이루어지기 때문에, 타겟 핵산서열도 동시에 증폭된다. 보다 바람직하게는, 반복 사이클 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함한다. 보다 더 바람직하게는, THD primer, 업스트림 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay는 다음 단계를 포함한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer), 업스트림 프라이머 및 상기 THD 프라이머와 쌍을 이루어 상기 타겟 핵산서열을 증폭하는 역방향 프라이머와 혼성화시키는 단계로서, 상기 THD primer는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며; 상기 역방향 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 업스트림 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
(b) 상기 혼성화 결과물을 primer의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, (i) 상기 주형-의존성 핵산 중합효소의 중합활성에 의해 상기 THD primer 및 역방향 프라이머의 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 (ii) 상기 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의해 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며;
(c) 상기 단계 (b)에 존재하는 이합체 (duplex)를 변성시키는 단계;
(d) 상기 단계 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널 및 타겟 핵산서열을 증폭시키는 단계; 및
(e) 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나 타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 업스트림 프라이머 및/또는 역방향 프라이머는 검출 가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있다(보다 바람직하게는 프라이머의 5‘-말단에). THD 프라이머, 업스트림 프라이머 및 역방향 프라이머 모두 표지가 결합되어 있는 경우에는 보다 높은 시그널을 얻을 수 있다.
5. THD primer , 블록킹 프로브 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay
다섯 번째 방식에 따르면, THD primer를 정방향 프라이머로 이용하고 추가적으로 THD primer와 동일한 방향성을 가지는 업스트림 프라이머 및 THD primer에 대하여 다운스트림에 혼성화 되며 THD primer와 동일한 방향성을 가지고 3‘-말단이 블록킹된 블록킹 프로브를 이용하여 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer 및 역방향 프라이머를 연장하고, 이 과정에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 THD primer, 블록킹 프로브 및/또는 역방 프라이머에서 5’ to 3’절단반응이 발생되어 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 발생된다.
바람직하게는, THD primer, 블록킹 프로브 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay에서 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 증폭시킨다. 이러한 반응 사이클을 통하여 타겟 핵산서열에 혼성화 된 THD primer, 블록킹 프로브 및/또는 역방향 프라이머의 표지부위가 계속적으로 절단되고 이로부터 타겟 핵산서열에 대한 시그널이 증 폭된다.
또한, 정방향 프라이머인 THD primer와 블록킹 프로브 그리고 역방향 프라이머가 모두 존재하는 조건에서 반복이 이루어지기 때문에, 타겟 핵산서열도 동시에 증폭된다. 보다 바람직하게는, 반복 사이클 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함한다. 보다 더 바람직하게는, THD primer, 블록킹 프로브 및 역방향 프라이머를 이용한 THD primer Target Detection Assay는 다음 단계를 포함한다:
(a) 상기 타겟 핵산서열을 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer), 블록킹 프로브 및 상기 THD 프라이머와 쌍을 이루어 상기 타겟 핵산서열을 증폭하는 역방향 프라이머와 혼성화시키는 단계로서, 상기 THD primer는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며; 상기 역방향 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 상기 블록킹 프로브는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하며;
(b) 상기 혼성화 결과물을 primer의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, (i) 상기 주형-의존성 핵산 중합효소의 중합활성에 의해 상기 THD primer 및 역방향 프라이머의 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 (ii) 상기 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의해 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5 ’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며;
(c) 상기 단계 (b)에 존재하는 이합체 (duplex)를 변성시키는 단계;
(d) 상기 단계 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널 및 타겟 핵산서열을 증폭시키는 단계; 및
(e) 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 블록킹 프로브 및/또는 역방향 프라이머는 검출 가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있다(보다 바람직하게는 프로브 또는 프라이머의 5‘-말단에). THD 프라이머, 블록킹 프로브 및 역방향 프라이머 모두 표지가 결합되어 있는 경우에는 보다 높은 시그널을 얻을 수 있다.
프로브의 3‘-말단의 블록킹은 DNA 중합효소에 의해 연장반응이 발생되는 억제하는 것으로서, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다.
본 발명에서 이용되는 THD primer는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조 또는 하기 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 갖는다:
5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다;
5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (Ⅱ)
상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서 열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’및 Z’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
본 명세서에서 용어 “이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO)”는 본 발명자들에 의해 처음 제시된 것이다(WO 2006/095981; Chun et al., Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping of CYP2C19 gene, Nucleic Acid Research, 35:6 e40(2007)). DPO는 혼성화 또는 어닐링이 분할구역에 의해 서로 분리된 5'-고 Tm 특이성 부위(또는 5'-제1차 프라이밍 부위) 및 3'-저 Tm 특이성 부위(또는 3'-제2차 프라이밍 부위)에 의해 이중적으로 결정되도록 하는 신규한 개념을 구현한 것으로, 매우 놀라운 특이성을 나타낸다(see WO 2006/095981; Kim et al., Direct detection of lamivudine-resistant hepatitis B virus mutants by multiplex PCR using dual-priming oligonucleotide primers, Journal of Virological Methods, 149:76-84(2008); Kim, et . al., Rapid detection and identification of 12 respiratory viruses using a dual priming oligonucleotide system-based multiplex PCR assay, Journal of Virological Methods, doi:10.1016/j.jviromet.2008.11.007(2008); Horii et . al., Use of dual priming oligonucleotide system to detect multiplex sexually transmitted pathogens in clinical specimens, Letters in Applied Microbiology, doi:10.111/j.1472-765X2009.02618x(2009))). 상술한 바와 같이, DPO는 서로 다른 어닐링 특성을 가지는 두 개의 프라이머 단편을 궁극적으로 갖게 된다: 초기의 안정된 혼성화를 초래하는 5'-제1차 프라이밍 부위; 및 타겟-특이적 연장반응을 결정하는 3'-제2차 프라이밍 부위. 이 DPO는 이중적으로 혼성화가 결정되기 때문에 크게 향상된 혼성화 특이성을 나타낼 수 있다.
이러한 DPO 구조를 갖는 프라이머를 이용하여 타겟 핵산서열을 증폭(특히, 멀티플렉스 증폭)하는 경우에는 위양성 또는 위음성 결과 없이 성공적으로 앰플리콘을 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 분할부위에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신, 디옥시 3-니트로피롤, 3-니트로피롤, 2'-OMe 3-니트로피롤, 2'-F 3-니트로피롤, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤, 디옥시 5-니트로피롤, 5-니트로인돌, 2'-OMe 5-니트로인돌, 2'-F 5-니트로인돌, 디옥시 4-니트로벤즈이미다졸, 4-니트로벤즈이미다졸, 디옥시 4-아미노벤즈이미다졸, 4-아미노벤즈이미다졸, 디옥시 네불라린, 2'-F 네불라린, 2'-F 4-니트로벤즈이미다졸, PNA-5-인트로인돌, PNA-네불라린, PNA-이노신, PNA-4-니트로벤즈이미다졸, PNA-3-니트로피롤, 모르포리노-5-니트로인돌, 모르포리노-네불라린, 모르포리노-이노신, 모르포리노-4-니트로벤즈이미다졸, 모르포리노-3-니트로피롤, 포스포라미데이트-5-니트로인돌, 포스포라미데이트-네불라린, 포스포라미데이트-이노신, 포스포라미데이트-4-니트로벤즈이미다졸, 포스포라미데이트-3-니트로피롤, 2'-0-메톡시에틸이노신, 2'-0-메톡시에틸 네불라린, 2'-0-메톡시에틸 5-니트로인돌, 2'-0-메톡시에틸 4-니트로-벤즈이미다졸, 2'-0-메톡시에틸 3-니트로피롤 및 상기 염기의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 분할구역에 위치하는 유니버설 염기는 디옥시이노신, 이노신, 1-(2'-디옥시-베타-D-리보푸라노실)-3-니트로피롤 또는 5-니트로인돌이고, 가장 바람직하게는 디옥시이노신이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할부위는 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드(바람직하게는 3-10, 보다 바람직하게는 3-7, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드)를 포함한다.
바람직하게는, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위의 길이는 3'-제2차 프라이밍 부위보다 길다. 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이 를 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 5'-제1차 프라이밍 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 3'-제2차 프라이밍 부위는 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할 구역은 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.
본 명세서에서 용어 “변형 DPO(mDPO) 구조”는 DPO(dual priming primer) 구조에서 유래된다. mDPO의 상세한 설명은 상술한 DPO 구조를 인용하여 설명될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 분할부위는 유니버설 염기를 가지는 연속된 뉴클레오타이드(바람직하게는 3-10, 보다 바람직하게는 3-7, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드)를 포함한다.
바람직하게는, 상기 3'-제1차 혼성화 부위의 길이는 5'-제2차 혼성화 부위보다 길다. 상기 3'-제1차 혼성화 부위는 바람직하게는, 15-40 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 15-25 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는, 3-15 뉴클레오타이드의 길이를 가지며, 보다 바람직하게는 5-15 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 6-13 뉴클레오타이드 길이를 갖는다. 상기 분할 부위는 바람직하게는 3-10 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 4-8 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 5-7 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 3'-제1차 혼성화 부위는 40-80℃의 Tm을 가지며, 바람직하게는, 45-65℃의 Tm을 갖는다. 상기 5'-제2차 혼성화 부위는 바람직하게는 10-40℃의 Tm을 갖는다. 상기 분할부위는 바람직하게는 3-15℃의 Tm을 갖는다.
변형 DPO 구조는 상기 DPO 구조의 5'-제1차 혼성화 부위 및 3'-제2차 혼성화 부위가 서로 역전된 것으로서, 변형 DPO 구조에서 초기의 안정된 혼성화는 3'-제1차 혼성화 부위가 담당하고 추가적인 타겟-특이성의 결정은 5'-제2차 혼성화 부위가 담당하게 된다.
프로브 또는 프라이머를 이용하여 타겟 핵산서열을 검출하는 종래 기술에 따르면, 프로브가 가지고 있는 내재적인 한계 때문에 false signals를 완벽하게 제거할 수 없다. 그러나 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, DPO 및 mDPO 프라이머의 독특한 구조에 의해 타겟 핵산서열의 검출을 위양성 데이터 없이 실시할 수 있다.
본 발명에서 타겟 핵산서열을 검출하는 데 있어서 false signals 없이 실시할 수 있는 이유 중 하나는 프라이머가 가지고 있는 DPO 및 mDPO 구조에 의한 혼성화 특이성이다.
상술한 바와 같이, DPO 및 mDPO 구조를 가지는 프라이머의 intriguing design에 의해 타겟 핵산서열에 매우 특이적으로 혼성화 되어 검출 정확도를 크게 개선시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, THD primer는 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 업스트림 프라이머 또는 역방향 프라이머는 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조 또는 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 가지며, 보다 바람직하게는 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 갖는다.
상기 혼성화 과정에 이어, 혼성화 결과물을 프라이머의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, THD 프라이머가 연장되고 상기 THD primer의 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존성 핵산 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus , Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber , Thermus rubens, Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함하고, 가장 바람직하게는 Taq 중합효소이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 시그널 발생 과정에 이어, 단계 (b)의 반응 결과물을 변성시킨다. 변성 과정은 통상적으로 온도의 상승을 통해 실시된다. 이중 DNA 가닥을 변성시키는 온도 범위, 예컨대 80-97℃의 온도 범위에서 변성 과정을 실시한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 반복하여 시그널을 증폭시킬 수 있으며, 반복 회수는 특별하게 제한되지 않으며, 최소 2회, 바람직하게는 최소 5회, 보다 바람직하게는 최소 10회이다.
최종적으로, 시그널을 검출한다. 상기 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검출은 반복의 매 사이클마다 실시하여 실시간으로 시그널을 검출하여 실시한다. 반복이 종료된 후, 즉 엔드포인트에서 형광 시그널을 검출할 수 있으나, 바람직하게는 실시간으로 매 사이클마다 시그널을 검출하여, 검출의 정확도를 개선시킨다.
본 발명에서 이용되는 타겟 핵산서열은 특별하게 제한되지 않으며, DNA(gDNA 또는 cDNA) 또는 RNA 분자를 모두 포함한다.
mRNA가 타겟 핵산서열인 경우에는, 역전사 단계가 필요하며, 역전사 단계의 상세한 내용은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Noonan, K. F. et al., Nucleic Acids Res . 16:10366 (1988)에 개시되어 있다. 역전사 단계에서, mRNA의 폴리 A 테일에 혼성화되는 올리고뉴클레오타이드 dT 프라이머를 사용하거나, 랜덤 프라이머 혹은 타겟 특정적인 프라이머가 이용된다.
타겟 핵산은 예컨대, 원핵세포 핵산, 진핵세포(예컨대, 원생동물과 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 동물 및 포유동물과 인간을 포함하는 고등동물) 핵산, 바이러스(예컨대, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등) 핵산 또는 비로이드 핵산을 포함한다.
주형-의존성 핵산 중합효소의 5’to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 THD 프라이머가 절단되고 시그널이 발생하게 되며, 이 시그널은 당업계의 통상적인 방법을 이용하여 검출 또는 측정할 수 있다. 결국, 타겟 핵산서열의 존재를 나타내는 시그널을 검출할 수 있다.
본 발명의 장점이 잘 나타나는 경우는 2개 이상의 타겟 핵산서열을 동시에 검출하는 멀티플렉스 검출이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 최소 2종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 핵산서열을 포함하고, 상기 THD 프라이머는 최소 2종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 핵산서열이고 상기 THD primer는 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머이며, 상기 역방향 프라이머는 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 핵산서열이고 상기 THD primer는 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머이며, 상기 업스트림 프라이머는 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 핵산서열이고 상기 THD primer는 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머이며, 상기 업스트림 프라이머는 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머이고, 상기 역방향 프라이머는 최소 두 종(보다 바람직하게는, 최소 3종, 가장 바람직하게는 최소 5종)의 프라이머이다.
예를 들어, 하나의 반응 튜브에 5종의 THD 프라이머(각각의 다른 발광 파장을 갖는 형광 리포터 분자가 결합되어 있다), 5종의 역방향 프라이머 및/또는 업스트림 프라이머를 포함시키고 여기에 분석하고자 하는 핵산서열을 첨가하여 혼성화 시킨 경우, 본 발명의 과정에 의해 5종의 형광 시그널을 발생시켜, 5개의 타겟 핵산서열을 실시간으로 동시에 검출할 수 있다.
본 발명은 특정 뉴클레오타이드 변이를 검출하기 위한 유전자 분석(genetic analysis)에서도 잘 적용된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 서열이다.
본 명세서에서 용어 “뉴클레오타이드 변이(nucleotide variation)”는 동일 유전자에서 나타나는 다양한 대립유전자형(allele)을 의미한다. 즉, 용어 “뉴클 레오타이드 변이”는 야생형(wild) 및 변이형 (mutants)을 모두 포괄한다. 따라서 뉴클레오타이드 변이의 검출은, 지노타이핑 또는 대립유전자형의 검출로 표현될 수 있다.
뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 지놈에 있는 다양한 변이(예컨대, MTHFR(methylenetetrahydrofolate reductase) 유전자의 변이), 약제 내성 병원체의 뉴클레오타이드 변이 및 암 발생-관련 뉴클레오타이드의 변이를 포함한다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 검출될 수 있는 변이는 SNP(single nucleotide polymorphism), 결실, 삽입 및 트랜스로케이션 등 모든 변이를 포함한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 THD primer의 5’-cleavage and 3’-extension 반응을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물 내 타겟 핵산서열의 검출을 위한 키트를 제공한다:
(a) (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하는 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer); 및
(b) 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소,
wherein 상기 THD primer가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며 상기 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
본 발명의 타겟 핵산서열을 검출하기 위한 키트는 상술한 본 발명의 방법을 실시하기 위하여 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(1) 본 발명은 타겟 핵산 서열에 상보적인 염기서열의 합성뿐 만 아니라 타겟 핵산 서열을 검출 할 수 있는 시그널을 제공하는 이중적 기능을 갖는 THD 프라이머 (target hybridization and detection primer)를 사용하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 THD 프라이머는 5’to 3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형 의존성 핵산 중합효소에 의해 3’-연장 반응이 일어나므로 프라이머로서의 역할을 할 뿐 만아니라, 5’to 3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형 의존성 핵산 중합효소의 5’-절단 반응에 의해 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는 시그널을 제공할 수 있는 것을 특징으로 한다.
(2) 본 발명의 THD 프라이머를 실시간 PCR에서 사용하는 경우, 프라이머로서 역방향 프라이머의 연장 반응과 동반되어 타겟 핵산 서열을 증폭할 뿐만 아니라, 기존의 방식과 같은 추가적인 표지된 프로브 없이 본 발명의 THD 프라이머에 대한 5’to 3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형 의존성 핵산 중합효소의 5’-절단 반응에 의해 타겟 핵산 서열의 검출 시그널을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 THD 프라이머와 역방향 프라이머만을 사용하더라도 타겟 핵산 서열의 증폭 및 타겟 핵산 서열의 실시간 검출이라는 목적을 달성할 수 있다.
(3) 본 발명의 THD 프라이머가 5’to 3’뉴클레아제 활성을 갖는 주형 의존성 핵산 중합효소의 5’-절단 반응에 의해 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있는 시그널을 제공하는 기능을 함에 있어서, 본 발명의 THD 프라이머는 3’연장반응이 일어나므로 (i) THD 프라이머의 연장에 의하여 보다 안정적으로 타겟 핵산 서열과 혼성화 되는 이점, (ii) THD 프라이머의 안정적인 혼성화로 인하여 THD 프라이머의 절단 반응 효율을 높이는 이점을 얻을 수 있다.
(4) 본 발명의 THD 프라이머는 타겟 핵산 서열에 특이적으로 혼성화되는 DPO 또는 mDSO 형태를 가질 수 있으며, 이와 같은 형태의 THD 프라이머를 실시간 PCR에서 사용하는 경우 통상적인 형태의 프라이머 또는 프로브가 비 타겟 핵산 서열과 혼성화되어 발생될 수 있는 위양성 (false positive) 시그널을 획기적으로 제거할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하 는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: Design of primers and probes
본 발명의 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer)를 이용한 타겟 핵산서열 검출을 구현하기 위하여, 표 1과 같이 주형(template)과 프라이머를 제조한다. 역방향 프라이머는 DPO 구조를 가진다. 이중-표지된 THD 프라이머는 5’-말단에 6-FAM을 리포터로, 3’-방향 쪽에 Black Hole Quencher 1 (BHQ1)를 퀀처로 표지되었다.
명칭 타입 서열 (5' → 3') 서열번호
Template 주형 gccaataaaactaggaggaaatttaaatgttagaatttgaacaaggatttaatcatttagcgactttaaaggtcattggtgtaggtggtggcggtaacaacgccgtaaaccgaatgattgaccacggaatgaataatgttgaatttatcgctatcaacacagacggtcaagctttaaacttatctaaagctgaatctaaa SEQ ID NO:1
Staur_con_P 프라이머 [6-FAM]CATTCCG[BHQ1-dT]GGTCAATCATTCGGTT SEQ ID NO:2
Staur_ftsZ_F1 프라이머 TGTTAGAATTTGAACAAGGATTTAAIIIIITAGCGACTTT SEQ ID NO:3
BHQ1 : Quencher (Black Hole Quencher)
실시예 2: Signal generation by cleavage of THD primer at the various concentration of dNTPs
Template DNA 및 프라이머 준비
실시예 1에 의해 준비한 template(SEQ ID NO: 1) 및 이중-표지된 THD 프라이머(SEQ ID NO: 2)를 이용한다.
Cleavage of THD primer at the various concentration of dNTPs
이중-표지된 THD 프라이머의 연장 및 절단반응은 DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 2 pmole template (SEQ ID NO: 1), 5 pmole 이중-표지된 THD 프라이머 (SEQ ID NO: 2), 5 mM MgCl2, 2 U의 5’→3’뉴클레아제 활성을 보유한 Taq 중합효소를 포함한 시료 20 ㎕를 다양한 농도의 dNTPs (500uM, 200uM or 20uM) 혹은 dNTPs가 없는 조건하에서 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 ‘CFX96 Real-time Cycler, Bio-Rad사 제품)를 이용하여 수행한다. 이중-표지된 THD 프라이머 연장 및 절단반응은 95°C에서 10분 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 90초, 72°C에서 90초 반응과정을 40회 반복한다. 형광의 탐지는 매 사이클 마다 측정한다. 다양한 농도의 dNTPs 뿐만아니라 dNTPs 가 없는 반응에서도 형광 시그널의 강도 변화량이 매 사이클 마다 증가하는 결과를 얻었다(도4). 따라서 본 발명이 실시예로 구현될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: Real - time signal amplification and target amplification using the THD primer
Template DNA 및 프라이머 준비
폐혈증 (Sepsis)원인균인 Staphylococcus aureus를 감별하기 위하여 동정된 분리주로부터 박테리아 genomic DNA를 분리하여 주형으로 사용한다. 이중-표지된 THD 프라이머(SEQ ID NO: 2) 및 DPO 구조를 갖는 역방향 프라이머(SEQ ID NO: 3)를 이용한다.
Real - time signal amplification and target amplification
DNA 중합효소 완충용액[10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl], 5 pmole 이중-표지된 THD 프라이머(SEQ ID NO: 2), 5 pmole 역방향 프라이머(SEQ ID NO: 3), 200 uM dNTPs, 5 mM MgCl2, 2 U의 5’→3’뉴클레아제 기능을 보유한 Taq 중합효소 및 10 ng Staphylococcus aureus genomic DNA를 포함한 시료 20 ㎕를 실시간 증폭기 (Real-time PCR machine, 제품명 ‘Rotor-gene 6000 Real-time Cycler, CORBETT Research사 제품)를 이용하여 실시간 이중적 동시 시그널 증폭반응을 수행한다. 실시간 이중적 동시 시그널 증폭반응은 95°C에서 10분 반응시킨 후, 94°C에서 30초, 55°C에서 90초, 72°C에서 90초 반응과정을 40회 반복한다. 형광의 탐지는 매 사이클 마다 측정한다. 탐지된 형광의 강도 변화량이 매 사이클 마다 증가하는 결과를 얻었으며, 본 발명의 THD 프라이머를 이용하여 타겟 핵산서열이 검출되었다(도5). 따라서 본 발명이 실시예로 구현될 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 5‘ to 3' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소에 의한 이중-표지된 프라이머의 절단 및 연장반응을 보여주는 모식도이다. 이중-표지된 프라이머의 5’-말단 방향쪽에 리포터 분자가 위치하고 3‘- 방향쪽에 퀀처 분자가 위치할 수 있으며, 이와 반대로 이중-표지된 프라이머의 5’-말단 방향쪽에 퀀처 분자가, 3‘- 방향쪽에 리포터 분자가 위치 할 수 있다. 패널 A는 타겟 핵산서열과 이중-표지된 프라이머의 혼성화를 보여준다. 패널 B는 타겟 핵산서열과 혼성화된 이중-표지된 프라이머의 절단 및 연장을 보여준다. 주형-의존적 핵산 중합효소의 폴리머라아제 활성에 의해 이중-표지된 프라이머의 3’-말단에서 연장반응이 일어나며, 주형-의존적 핵산 중합효소의 5‘ to 3' 뉴클레아제 활성에 의해 이중-표지된 프라이머의 5’-말단 쪽에서는 프라이머의 절단 반응이 발생된다. 이로써 리포터 분자가 퀀처 분자로부터 분리되어 리포터 분자의 고유 형광이 발생되어 타겟 핵산서열의 검출이 가능하다.
도 2는 5‘ to 3' 뉴클레아제 활성을 갖는 주형-의존적 핵산 중합효소 및 이중-표지된 프라이머를 이용한 타겟 핵산서열 증폭이 없는 반응에서 시그널 증폭반응을 보여주는 모식도이다. 패널 A는 타겟 핵산서열과 이중-표지된 프라이머의 혼성화를 보여준다. 패널 B는 타겟 핵산서열과 혼성화된 이중-표지된 프라이머의 절단, 연장반응을 보여주며, 또한 변성,혼성화, 절단 및 연장반응을 반복함으로써 시그널이 증폭되는 반응을 보여준다.
도 3은 이중-표지된 프라이머를 이용한 타겟 핵산서열 증폭 반응에서 시그널 증폭 및 타겟 핵산서열의 증폭반응을 보여주는 모식도이다. 패널 A와 패널 B는 역방향 프라이머가 추가적으로 첨가되어 타겟 핵산서열이 증폭되는 반응을 제외하고는 도2와 동일한 반응이 일어난다.
도 4는 다양한 dNTPs 농도에서 이중-표지된 THD 프라이머를 이용한 실시간 시그널 증폭 반응으로써 본 발명의 일 실시예의 결과이다. Negative control로써 이용한 주형이 없는 반응(No. 1)에서는 타겟 핵산서열의 형광 시그널 증폭이 관찰되지 않았다. 이와 반면에 dNTPs가 없는 반응(No. 5) 뿐만 아니라 다양한 dNTPs 농도를 갖는 반응(No. 2 - 4)에서 타겟 핵산서열의 형광 시그널 증폭됨을 보여준다.
도 5는 이중-표지된 THD 프라이머를 이용하여 본 발명의 실시간 시그널 증폭 및 타겟 핵산서열의 증폭반응의 일 실시예의 결과이다. DPO 구조의 표지되지 않은 프라이머를 역방향 프라이머와 이중-표지된 THD 프라이머를 사용하였다. 대조군으로써 주형을 첨가하지 않은 반응에서는 실시간 시그널 증폭 및 타겟 핵산서열 증폭반응에서는 형광 시그널의 변화량이 관찰되지 않았다(No. 1). 이와 반면에 주형을 첨가한 반응에서는 실시간 시그널 증폭반응 및 타겟 핵산서열의 증폭으로 인한 형광 시그널의 증폭을 볼 수 있었다(No. 2).

Claims (54)

  1. 다음 단계를 포함하는 THD primer의 5’-cleavage and 3’-extension 반응을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물 내 타겟 핵산서열의 검출방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer)와 혼성화시키는 단계로서, 상기 THD primer는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며;
    (b) 상기 혼성화 결과물을 primer의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, 상기 THD primer의 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며; 및
    (c) 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 (i) 상기 THD primer 및 (ii) 상기 THD 프라이머와 쌍을 이루어 상기 타겟 핵산서열을 증폭하는 역방향 프라이머의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 (i) 상기 THD primer 및 (ii) 상기 THD primer에 대하여 업스트림에 혼성화 되며 THD primer와 동일한 방향성(orientation)을 가지는 업스트림 프라이머의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 단계 (a)는 (i) 상기 THD primer, (ii) 상기 THD primer에 대하여 업스트림에 혼성화 되며 THD primer와 동일한 방향성(orientation)을 가지는 업스트림 프라이머 및 (iii) 상기 THD primer에 대하여 다운스트림에 혼성화 되며 THD primer와 반대의 방향성을 가지는 는 역방향 프라이머의 존재 하에서 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (a)-(b) 또는 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 증폭시키는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 반복 사이클 사이에 변성 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 THD primer는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조 또는 하기 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
    상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성 이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다;
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (Ⅱ)
    상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’및 Z’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  8. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머 또는 역방향 프라이머는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조 또는 하기 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
    상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다;
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (Ⅱ)
    상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’및 Z’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머 또는 역방향 프라이머는 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 THD 프라이머의 표지 부위는 5‘-말단 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 검출가능한 시그널 발생 표지는 THD 프라이머의 5‘-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 chemical, enzymatic, radioactive, magnetic, fluorescent, luminescent, chemiluminescent 또는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 FRET 표지이고 상기 FRET 표지의 형광 리포터 분자는 5‘-말단 부위에 위치하고 퀀처 분자는 상기 위치의 3’-방향쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 FRET 표지이고 상 기 FRET 표지의 퀀처 분자는 5‘-말단 부위에 위치하고 형광 리포터 분자는 상기 위치의 3’-방향쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머 또는 역방향 프라이머는 검출 가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 THD primer는 최소 두 종의 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 4 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 THD primer는 최소 두 종의 프라이머이며, 상기 역방향 프라이머는 최소 두 종의 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 5 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 THD primer는 최소 두 종의 프라이머이며, 상기 업스트림 프라이머는 최소 두 종의 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 6 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 THD primer는 최소 두 종의 프라이머이며, 상기 업스트림 프라이머는 최소 두 종의 프라이머이고, 상기 역방향 프라이머는 최소 두 종의 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 다음 단계를 포함하는 THD primer의 5’-cleavage and 3’-extension 반응을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물 내 타겟 핵산서열의 검출방법:
    (a) 상기 타겟 핵산서열을 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer) 및 상기 THD 프라이머와 쌍을 이루어 상기 타겟 핵산서열을 증폭하는 역방향 프라이머와 혼성화시키는 단계로서, 상기 THD primer는 (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며; 상기 역방향 프라이머는 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
    (b) 상기 혼성화 결과물을 primer의 연장반응조건에서 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소와 접촉시키는 단계로서, (i) 상기 주형-의존성 핵산 중합효소의 중합활성에 의해 상기 THD primer 및 역방향 프라이머의 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 (ii) 상기 주형-의존성 핵산 중합효소의 5’ to 3’뉴클레아제 활성에 의해 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며;
    (c) 상기 단계 (b)에 존재하는 이합체 (duplex)를 변성시키는 단계;
    (d) 상기 단계 (a)-(c)를 최소 2회 반복하여 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널 및 타겟 핵산서열을 증폭시키는 단계; 및
    (e) 상기 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 검출하는 단계로서, 상기 시그널의 검출은 상기 반복의 매 사이클마다 실시되거나 또는 반복이 종료된 후 실시되며 상기 검출된 형광 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나 타낸다.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 THD primer는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조 또는 하기 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
    상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상 시킨다;
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (Ⅱ)
    상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’및 Z’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조 또는 하기 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리 고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법:
    5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
    상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다;
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (Ⅱ)
    상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’및 Z’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  25. 제 26 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 22 항에 있어서, 상기 THD 프라이머는 형광 리포터 분자 및 상기 형광 리포터 분자의 형광을 퀀칭할 수 있는 퀀처 분자가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하며, 상기 단계 (b)의 5’-cleavage 반응에 의해 형광 리포터 분자 또는 퀀처 분자가 상기 THD primer로부터 해리되어 상기 리포터 분자의 형광이 탈소 멸(unquenched) 되며 리포터 분자로부터 형광 시그널이 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 22 항에 있어서, 상기 THD 프라이머의 표지 부위는 5‘-말단 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 검출가능한 시그널 발생 표지는 THD 프라이머의 5‘-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 22 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 chemical, enzymatic, radioactive, magnetic, fluorescent, luminescent, chemiluminescent 또는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 FRET 표지이고 상기 FRET 표지의 형광 리포터 분자는 5‘-말단 부위에 위치하고 퀀처 분자는 상기 위치의 3’-방향쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 FRET 표지이고 상기 FRET 표지의 퀀처 분자는 5‘-말단 부위에 위치하고 형광 리포터 분자는 상기 위치의 3’-방향쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 22 항에 있어서, 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 DNA 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 22 항에 있어서, 상기 역방향 프라이머는 검출가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 22 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 THD primer는 최소 두 종의 프라이머, 상기 역방향 프라이머는 최소 두 종의 프라이머인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 22 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 다음을 포함하는 THD primer의 5’-cleavage and 3’-extension 반응을 이용한 DNA 또는 핵산 혼합물 내 타겟 핵산서열의 검출을 위한 키트:
    (a) (i) 상기 타겟 핵산서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열 및 (ii) 검출가능한 시그널 발생 표지(detectable signal generating label)가 결합되어 있는 표지 부위를 포함하는 타겟 혼성화 및 검출 프라이머(target hybridization and detection primer: THD primer); 및
    (b) 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소,
    wherein 상기 THD primer가 타겟 핵산서열에 혼성화 되는 경우, 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 3’-말단에서 3’-extension 반응이 발생되고 상기 표지 부위에서(at labeled portion) 5’-cleavage 반응이 발생되어 상기 시그널 발생 표지가 THD primer로부터 해리되고 타겟 핵산서열에 대한 시그널을 발생하며 상기 시그널은 DNA 또는 핵산 혼합물 내에 타겟 핵산서열이 존재함을 나타낸다.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 키트는 (i) 상기 THD primer 및 (ii) 상기 THD 프라이머와 쌍을 이루어 상기 타겟 핵산서열을 증폭하는 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  38. 제 36 항에 있어서, 상기 키트는 (i) 상기 THD primer 및 (ii) 상기 THD primer에 대하여 업스트림에 혼성화 되며 THD primer와 동일한 방향성(orientation)을 가지는 업스트림 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제 36 항에 있어서, 상기 키트는 (i) 상기 THD primer, (ii) 상기 THD primer에 대하여 업스트림에 혼성화 되며 THD primer와 동일한 방향성(orientation)을 가지는 업스트림 프라이머 및 (iii) 상기 THD primer에 대하여 다운스트림에 혼성화 되며 THD primer와 반대의 방향성을 가지는 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제 36 항에 있어서, 상기 THD primer는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리 고뉴클레오타이드(DPO) 구조 또는 하기 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 키트:
    5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
    상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다;
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (Ⅱ)
    상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이 고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’및 Z’은 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  41. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머 또는 역방향 프라이머는 하기 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조 또는 하기 일반식 Ⅱ의 변형 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(mDPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 키트:
    5’-Xp-Yq-Zr-3’ (I)
    상기 일반식에서, Xp는 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 5’-제1차 프라이밍 부위(5’-first priming portion)이고, Yq는 최소 세 개 이상의 유니버설 염기를 포함하는 분할 구역 (separation portion)이며, Zr은 혼성화되는 타깃 서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제2차 프라이밍 부위 (3’-second priming portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X, Y 및 Z는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제1차 프라이밍 부위의 Tm은 3’-제2차 프라이밍 부위의 Tm보다 높으며, 상기 분할 부위는 상기 세 구역 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제1차 프라이밍 부위가 3’-제2차 프라이밍 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 DPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제1차 프라이밍 부위와 3’-제2차 프라이밍 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다;
    5’-X’p-Y’q-Z’r-3’ (Ⅱ)
    상기 일반식에서, X’p는 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화서열을 가지는 5’-제2차 혼성화 부위(5’-second hybridization portion)이고, Y’q는 최소 세 개의 유니버설 염기를 포함하는 분할 부위(separation portion)이며, Z’r은 혼성화되는 타깃 핵산서열과 실질적으로 상보적인 혼성화 서열을 가지는 3’-제1차 혼성화 부위(3’-first hybridization portion)이고, p, q 및 r은 뉴클레오타이드의 개수를 나타내며, X’, Y’및 Z’은 디옥시리보뉴클레오 타이드 또는 리보뉴클레오타이드이고, 5’-제2차 혼성화 부위의 Tm은 3’-제1차 혼성화 부위의 Tm보다 낮으며, 상기 분할 부위는 상기 세 부위 중에서 가장 낮은 Tm을 가지고, 상기 분할 부위는 혼성화 특이성 측면에서 5’-제2차 혼성화 부위가 3’-제1차 혼성화 부위로부터 분할되도록 하며, 이러한 특이성 분할은 mDPO 전체 구조의 혼성화 특이성이 5’-제2차 혼성화 부위와 3’-제1차 혼성화 부위에 의해 이중적으로 결정도록 하고, 이는 결국 상기 올리고뉴클레오타이드 전체 구조의 혼성화 특이성을 향상시킨다.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머 또는 역방향 프라이머는 일반식 I의 이중 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(DPO) 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 키트.
  43. 제 36 항에 있어서, 상기 THD 프라이머의 표지 부위는 5‘-말단 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 키트.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 검출가능한 시그널 발생 표지는 THD 프라이머의 5‘-말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 키트.
  45. 제 36 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 chemical, enzymatic, radioactive, magnetic, fluorescent, luminescent, chemiluminescent 또는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지인 것을 특징으로 하는 키트.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 FRET 표지이고 상기 FRET 표지의 형광 리포터 분자는 5‘-말단 부위에 위치하고 퀀처 분자는 상기 위치의 3’-방향쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 키트.
  47. 제 45 항에 있어서, 상기 검출 가능한 시그널 발생 표지는 FRET 표지이고 상기 FRET 표지의 퀀처 분자는 5‘-말단 부위에 위치하고 형광 리포터 분자는 상기 위치의 3’-방향쪽에 위치하는 것을 특징으로 하는 키트.
  48. 제 36 항에 있어서, 상기 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 주형-의존성 핵산 중합효소는 5’ to 3’뉴클레아제 활성을 가지는 열안정성 DNA 중합효소인 것 을 특징으로 하는 키트.
  49. 제 37 항 내지 제 39 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 업스트림 프라이머 또는 역방향 프라이머는 검출가능한 시그널 발생 표지가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 키트.
  50. 제 36 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 키트는 최소 두 종의 THD primer를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  51. 제 37 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 키트는 최소 두 종의 THD primer 및 최소 두 종의 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  52. 제 38 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 키트는 최소 두 종의 THD primer 및 최소 두 종의 업스트림 프라이머를 포함하는 특징으로 하는 키트.
  53. 제 39 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 최소 두 종의 핵산서열이고 상기 키트는 최소 두 종의 THD primer, 최소 두 종의 업스트림 프라이머 및 최소 두 종의 역방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  54. 제 36 항에 있어서, 상기 타겟 핵산서열은 뉴클레오타이드 변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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