CN108603193B - 分裂循环和tape扩增 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于定量检测核酸样品中的序列的方法和组合物。该方法通常涉及将核酸样品分配到离散反应室中的大量混合物分区中。另一方面，在标记扩增子引物延伸(TAPE)反应中分析分配的样品。在TAPE反应中，使用一对5＇‑加尾扩增引物，一个5＇‑加尾正向引物和一个5＇‑加尾反向引物扩增靶序列。在另一方面，本发明提供了对核酸样品中的野生型和突变型靶核酸片段的频率进行定量的方法。

Description

分裂循环和TAPE扩增

相关申请的交叉引用

本申请要求于2015年12月30日提交的美国临时专利申请号62/273,210的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

定量检测核酸样品中的靶序列(例如，等位基因，多态性等)可用于多种背景。例如，稀有靶序列的检测可用于早期，良性或恶性肿瘤检测或监测；产前诊断，如无创胎儿诊断；检测病毒或细菌感染；环境监测等。在某些情况下，为了在高度丰富的非靶序列的背景下检测低丰度的靶序列，这种检测需要高灵敏度，准确度和精确度水平。

发明内容

本文描述了用于定量检测核酸样品中的序列的方法和组合物。该方法通常涉及将核酸样品划分到离散反应室(例如孔，通道，液滴等)中的大量混合物分区(partition)中。在一个方面，在分裂循环测定中分析划分(partitioned)的样品，其中在一组初始核酸扩增循环中使用具有相对低的退火温度的一对等位基因特异性扩增引物将高温引物结合位点附加到靶序列中。一组初始核酸扩增循环包括低温退火步骤。在随后的核酸扩增循环中，与高温引物结合位点杂交的一对侧翼扩增引物提供高保真度和高度特异性扩增。一组后续核酸扩增循环包括较高温度退火步骤。

在另一个方面，在分裂循环测定中分析划分的样品，其中在一组初始核酸扩增循环中使用具有相对高的退火温度的一对等位基因特异性扩增引物将低温引物结合位点附加到靶序列中。一组初始核酸扩增循环包括相对高温退火步骤。在随后的核酸扩增循环中，与低温引物结合位点杂交的一对侧翼扩增引物提供高保真度和高度特异性扩增。一组后续核酸扩增循环包括相对较低温度退火步骤。

另一方面，在标记扩增子引物延伸(TAPE)反应中分析划分的样品。在TAPE反应中，使用一对5＇末端扩增引物，一个5＇-加尾正向引物和一个5＇-加尾反向引物扩增靶序列。5＇-加尾正向和反向引物的尾互为反向互补物。因此扩增反应产生掺入标签的扩增子(即，标记的扩增子)。得到的标记的扩增子具有互为反向互补物的3＇末端，因此可用作引物。因此，反应自我产生引物，防止扩增反应期间引物耗尽。在一些实施方式中，TAPE引物可以用于进一步包括被配置为与扩增子标签杂交的侧翼引物的分裂循环测定中。

另一方面，本发明提供多个混合物分区，这些单独的混合物分区包含：i)突变特异性5＇-加尾引物对，其中突变特异性5＇-加尾引物对与靶DNA模板分子杂交并特异性扩增靶DNA模板分子，该靶DNA模板分子来自包含突变靶序列的核酸样品，如果存在，其中突变特异性5＇-加尾引物对的引物包含：a)长度为至少10个核苷酸且小于30个核苷酸的3＇杂交区域，其与突变靶序列特异性杂交；和b)长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的突变特异性5＇尾区，其不与核酸样品中的任何核酸片段杂交；ii)野生型特异性5＇-加尾引物对，其中野生型特异性5＇-加尾引物对杂交并特异性扩增包含野生型靶序列(如果存在)的靶DNA模板分子，其中野生型特异性5＇-加尾引物对的引物包含：a)与野生型靶序列特异性杂交的长度为至少10个核苷酸且小于30个核苷酸的3＇杂交区域；和b)长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的野生型特异性5＇尾区，其不与核酸样品中的任何核酸片段杂交，其中野生型特异性5＇尾区是与突变特异性5＇尾区不同的序列；和iii)突变特异性侧翼引物对，其中所述突变特异性侧翼引物对杂交并特异性扩增包含突变特异性5＇-加尾引物对的5＇尾区的扩增子(如果存在)；iv)野生型特异性侧翼引物对，其中野生型特异性侧翼引物对杂交并特异性扩增包含野生型特异性5′-加尾引物对的5′尾区的扩增子(如果存在)；和v)热稳定聚合酶，其中所述多个混合物分区的至少约1-10个混合物分区含有包含野生型或突变型靶序列的靶DNA模板分子；并且所述多个混合物分区的至少约3-10个混合物分区不包含靶DNA模板分子。

另一方面，本发明提供了用于定量核酸样品中野生型和突变型靶核酸片段的频率的方法，所述方法包括：A)形成前述权利要求中任一项所述的多个混合物分区；B)在适合通过聚合酶链式反应扩增靶DNA模板分子的热循环条件下孵育混合物分区，其中热循环条件包括第一组温度循环和第二组温度循环，其中第二组温度循环包括比第一组温度循环的退火温度高或低至少5℃的退火温度；C)检测混合物分区中扩增的靶DNA模板的存在或不存在，其中所述检测包括，由此确定：i)包含由野生型靶序列组成的扩增的靶DNA模板的野生型混合物分区的数量；ii)包含由突变型靶序列组成的扩增的靶DNA模板的突变型混合物分区的数量；和iii)包含扩增的靶DNA的双阳性混合物分区的数量，该扩增的靶DNA包含突变型和野生型靶序列；和D)根据野生型，突变型和双阳性混合物分区的数量确定核酸样品中野生型和突变型靶核酸片段的频率。

另一方面，本发明提供了用于进行标记的扩增子引物延伸(TAPE)核酸扩增反应的反应混合物，所述混合物包含：i)来自核酸样品的靶DNA模板分子，其中所述靶DNA模板分子包含靶序列；ii)正向引物，其包含：a)长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的3′杂交区域，其被配置为与靶DNA模板分子的靶序列特异性杂交并在核酸扩增反应中产生第一引物延伸产物；和b)长度为至少10个核苷酸的5′尾区，其与靶DNA模板分子的靶序列不互补；iii)反向引物，其包含：a)长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的3′杂交区域，其被配置为与第一引物延伸产物特异性杂交并在核酸扩增反应中产生第二引物延伸产物；和b)长度为至少10个核苷酸的5′尾区，其与靶DNA模板分子的靶序列不互补，其中反向引物的5′尾区是正向引物的5′尾区的反向互补物；和iv)热稳定聚合酶。

另一方面，本发明提供多个混合物分区，这些单独的混合物分区包含任何一种前述反应混合物。

另一方面，本发明提供了用于进行标记扩增子引物延伸(TAPE)核酸扩增反应的方法，所述方法包括：i)形成前述反应混合物中的任何一种或前述多个反应混合物中的任何一种；ii)将正向引物与靶DNA模板分子的靶序列杂交；iii)用聚合酶延伸杂交的正向引物，由此产生第一引物延伸产物；iv)将反向引物与第一引物延伸产物杂交；v)用聚合酶延伸杂交的反向引物，由此产生第二引物延伸产物；vi)将正向引物与第二引物延伸产物杂交；v)用聚合酶延伸与第二引物延伸产物杂交的正向引物，由此产生第三引物延伸产物，其中第二和第三引物延伸产物形成第一双链扩增子，其中第一双链扩增子包含具有3′和5′末端的两个互补链，其中3′末端互为反向互补物，并且5′末端互为反向互补物。

另一方面，本发明提供了用于进行标记扩增子引物延伸(TAPE)核酸扩增反应的方法，所述方法包括：i)形成前述反应混合物中的任何一种；ii)进行杂交：a)使突变特异性正向引物与靶DNA模板分子的突变靶序列(如果存在)杂交；和b)使野生型特异性正向引物与靶DNA模板分子的野生型靶序列杂交；iii)用聚合酶延伸杂交的正向引物，从而产生突变第一引物延伸产物，如果存在突变的靶序列，和野生型第一引物延伸产物；iv)进行杂交：a)使突变特异性反向引物与突变第一引物延伸产物(如果存在)杂交；和b)使野生型特异性反向引物与野生型第一引物延伸产物杂交；v)用聚合酶延伸杂交的反向引物，从而产生突变的第二引物延伸产物，如果存在突变的靶序列，以及野生型第二引物延伸产物；vi)将正向引物与第二引物延伸产物(如果存在)杂交；v)用聚合酶延伸与第二引物延伸产物杂交的正向引物，由此产生突变的第三引物延伸产物，如果突变型靶序列存在，和野生型第三引物延伸产物，其中：如果存在突变型靶序列，则第二和第三突变型引物延伸产物形成突变型双链扩增子，其中突变型双链扩增子包含具有3′和5′末端的两条互补链，其中3′末端互为反向互补物，5′末端互为反向互补物；并且所述第二和第三野生型引物延伸产物形成野生型双链扩增子，其中所述野生型双链扩增子包含具有3′和5′末端的两条互补链，其中所述第一野生型双链扩增产物的3′末端互为反向互补物，并且所述第一野生型双链扩增子的5′末端互为反向互补物。

另一方面，本发明提供了一种用于定量稀有突变检测的方法，所述方法包括：i)提供前述多个混合物分区中的任何一个；ii)进行分裂循环测定，TAPE测定或其组合以分别检测多个混合物分区中的野生型和突变型靶DNA模板分子，从而检测对突变体的存在呈阳性但不对野生型靶DNA模板的存在呈阳性的混合物分区的数量，对野生型的存在呈阳性但不对突变型靶DNA模板的存在呈阳性的混合物分区的数量，对突变型和野生型靶DNA模板的存在都呈阳性的混合物分区的数量，以及对突变型和野生型靶DNA模板的存在呈阴性的混合物分区的数量；和iii)从单阳性，双阳性和阴性混合物分区的数量确定核酸样品中突变序列的频率。

附图说明

图1：说明用于进行等位基因特异性分裂循环测定以同时检测突变型和野生型靶序列的示例性引物和探针。在该实施方式中，该测定使用突变特异性5′-加尾正向引物(突变特异性F1)，5′-加尾反向引物(突变特异性R1)，荧光标记的侧翼正向引物(突变特异性侧翼F1)，侧翼反向引物(突变特异性侧翼R1)和接收寡核苷酸(突变特异性接收物(Mutant-specific sink))，以扩增和检测突变靶序列。该测定还使用野生型特异性5′-加尾正向引物(野生型特异性F2)，5′-加尾反向引物(野生型特异性R2)，荧光标记的侧翼正向引物(野生型特异性侧翼F2)，侧翼反向引物(野生型特异性侧翼R2)和接收寡核苷酸(野生型特异性接收物(Wild-type specific sink))，以扩增和检测野生型靶序列。FAM和HEX指可差异检测的荧光素衍生物。IABkFQ是指爱荷华黑(Iowa Black)荧光团淬灭剂。在该实施方式中，侧翼引物具有比5＇-加尾引物更高的退火温度，并且分裂循环测定将包括具有退火温度的第一组温度循环和具有高于第二组的退火温度的第二组温度循环。在一些实施方式中，可以另外或替代核酸探针使用不同的探针化学物质，例如水解探针或嵌入染料。

图2：说明用于进行等位基因特异性分裂循环测定以同时检测突变型和野生型靶序列的示例性引物和探针。在该实施方式中，该测定使用突变特异性5′-加尾正向引物(突变特异性F1)，5′-加尾反向引物(突变特异性R1)，侧翼正向引物(突变特异性侧翼F1)，侧翼反向引物(突变特异性侧翼R1)和探针(突变特异性探针)，以扩增和检测突变靶序列。该测定还使用野生型特异性5′-加尾正向引物(野生型特异性F2)，5′-加尾反向引物(野生型特异性R2)，侧翼正向引物(野生型特异性侧翼F2)，侧翼反向引物(野生型特异性侧翼R2)和探针(野生型特异性探针)，以扩增和检测野生型靶序列。FAM和HEX指可差异检测的荧光素衍生物。IABkFQ3’是指爱荷华黑荧光团淬灭剂。在该实施方式中，侧翼引物具有比5′-加尾引物更低的退火温度，并且分裂循环测定将包括具有退火温度的第一组温度循环和具有低于第二组的退火温度的第二组温度循环。在一些实施方式中，可以另外或替代核酸探针使用不同的探针化学物质，例如图1中的荧光标记的侧翼引物和短互补猝灭剂，或嵌入染料。

图3a-b：说明用于进行TAPE测定的示例性引物和扩增反应。a)在该实施方式中，该测定使用5′-加尾正向引物(F1)和5′-加尾反向引物(R1)来扩增靶序列。用HEX荧光团和黑洞猝灭剂(BHQ)标记的水解探针(野生型探针)用于检测扩增(例如步骤3)和扩增子(例如步骤4)。在步骤1中，引物F1与靶标双链DNA分子的靶链杂交，聚合酶反应延伸引物。在步骤2中，引物R1与延伸的F1引物杂交，并且聚合酶反应延伸引物。在步骤3中，引物F1与延伸的R1引物杂交，并且聚合酶反应延伸引物，由此产生具有互为反向互补物的3′末端的标记的双链扩增子。步骤4说明使用标记的扩增子的链作为引物来产生具有互为反向互补物的3′末端的第二标记的扩增子。第二标记的扩增子的链也可以用作引物，并且进一步的扩增循环可以产生具有互为反向互补物并且用作引物的3′末端的进一步标记的扩增子。在该实例中，反应混合物中的3′至5′外切核酸酶活性降解靶分子的3′末端，但3′至5′外切核酸酶活性不是本文所述的所有TAPE反应的必需要素。

b)在该实施方式中，该测定使用5′-加尾正向引物(F1)和5′-加尾反向引物(R1)来扩增靶序列。一个5′-加尾引物用荧光团(FAM)标记。该测定还包括与标记引物的5′末端互补以检测扩增的黑洞猝灭剂(BHQ)-标记的接收寡核苷酸(Sink)。在步骤1中，引物F1与靶标双链DNA分子的靶链杂交，聚合酶反应延伸引物。在步骤2中，引物R1与延伸的F1引物杂交，并且聚合酶反应延伸引物。在步骤3中，引物F1与延伸的R1引物杂交，并且聚合酶反应延伸引物，由此产生具有互为反向互补物的3′末端的标记的双链扩增子。步骤4说明使用标记的扩增子的链作为引物来产生具有互为反向互补物的3′末端的第二标记的扩增子。第二标记的扩增子的链也可以用作引物，并且进一步的扩增循环可以产生具有互为反向互补物并且用作引物的3′末端的进一步标记的扩增子。在该实例中，反应混合物中的3′至5′外切核酸酶活性降解靶分子的3′末端，但3′至5′外切核酸酶活性不是本文所述的所有TAPE反应的必需要素。

图4：显示使用常规液滴数字扩增方法(左)和分裂循环，TAPE或分裂循环和TAPE测定(右侧)的稀有突变检测测定的一般结果之间的比较。通道1表示来自突变特异性水解探针的检测信号。通道2表示来自野生型特异性水解探针的信号。在常规测定中，引物缺失和竞争导致双阳性液滴被渗透覆盖进入(smear into)仅野生型和/或突变(单阳性)检测区域，降低了测定的准确性。相比之下，本文描述的方法产生充分分离的单和双阳性区域。

图5：显示了使用本文所述的用于稀有突变检测的方法进行的分裂循环液滴数字PCR测定的示例性数据。(左)作为对照，使用采用Taqman检测以差异检测单核苷酸多态性的标准PCR扩增方案进行PIK3CA野生型和突变型E542K测定。通道1表示来自突变特异性水解探针的检测信号。通道2表示来自野生型特异性水解探针的信号。在常规测定中，引物缺失和竞争导致双阳性液滴被渗透覆盖进入仅野生型和/或突变(单阳性)检测区域，降低了测定的准确性。相比之下，本文描述的分裂循环方法产生充分分离的单和双阳性区域。

定义

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie，DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞和分子生物学词典》)，埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007)；Sambrook等，MOLECULARCLONING，A LABORATORY MANUAL(《分子克隆，实验室手册》)，冷泉港实验室出版社(冷泉港，纽约1989)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候，是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的，并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的以下定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语，不对本发明的范围构成限制。

如本文所用，关于引物，寡核苷酸，扩增子或靶序列，或者引物，寡核苷酸，扩增子或靶序列的区域的术语“互补物”或“互补”可包括维持引物，寡核苷酸，扩增子或靶序列或其区域的功能所需的反向互补物或反向互补性。

术语“扩增反应”指用于以线性或指数方式倍增核酸靶序列拷贝的各种体外方法。这类方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)；DNA连接酶链反应(参见美国专利号4,683,195和4,683,202，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR方案：方法和应用指南)(Innis等编，1990))(LCR)；基于QBeta RNA复制酶和基于RNA转录的扩增反应(例如，涉及T7、T3或SP6引导的RNA聚合)，例如转录扩增系统(TAS)，基于核酸序列的扩增(NSABA)，和自主维持序列复制(3SR)；等温扩增反应(例如，单引物等温扩增(SPIA))；以及本领域技术人员已知的其它方法。

“扩增”指将溶液置于足以扩增多核苷酸的条件下的步骤(如果反应的所有组分是完整的)。扩增反应的组分包括，例如，引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”一般是指靶核酸的“指数型”增长。然而，本文所用的“扩增”也可指核酸的选择靶序列数量的线性增长，如由循环测序或线性扩增所得。

术语“扩增反应混合物”指包含用于扩增靶核酸的各种试剂的水性溶液。这些试剂包括酶、水性缓冲剂、盐、扩增引物、靶核酸和三磷酸核苷。扩增反应混合物还可包含稳定剂和其它添加剂以优化效率和特异性。根据上下文，混合物还可以是完整或不完整的扩增反应混合物。

“聚合酶链式反应”或“PCR”是指靶双链DNA的特定区段或子序列得以几何级数式扩增的一种方法。PCR是本领域技术人员所熟知的；参见例如，美国专利号4,683,195和4,683,202；和《PCR方案：方法和应用指南》，Innis等编，1990。示例性PCR反应条件一般包括两步或三步循环。两步循环具有变性步骤，之后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，之后是杂交步骤，之后是独立的延伸步骤。

“引物”指与靶核酸上的序列杂交并且用作核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以是各种长度的并且通常长度小于50个核苷酸，例如长度为12-30个核苷酸。可基于本领域技术人员已知的原理设计用于PCR的引物的长度和序列，参见例如Innis等(同上)。引物可以是DNA、RNA或DNA部分与RNA部分的嵌合体。在一些情况中，引物可包括一个或多个带修饰或非天然的核苷碱基。在一些情况中，引物被标记。引物“对”，“引物对”，“正向和反向引物对”等是指第一和第二引物，其中一个引物是“正向”引物并且第二引物是“反向”引物，其设置成与靶序列杂交并在PCR扩增条件下扩增靶序列。

核酸或其部分与另一核酸“杂交”的某些条件使得生理缓冲液(例如，pH6-9，25-150mM盐酸盐)中限定温度下的非特异性杂交最少。在一些情况中，核酸或其部分与一组靶核酸之间共有的保守序列杂交。在一些情况中，如果包括与超过一个核苷酸伴侣互补的“通用”核苷酸在内有至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个连续的互补核苷酸，引物或其部分能杂交至引物结合位点。或者，如果在至少约12、13、14、15、16、17或18个连续的互补核苷酸中有不到1或2个互补错配，则引物或其部分能杂交至引物结合位点。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度是室温。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度高于室温。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度是至少约37、40、42、45、50、55、60、65、70或75℃。在一些实施方式中，发生特异性杂交的限定温度是37、40、42、45、50、55、60、65、70或75℃。

“模板”指包含待扩增，侧接一对引物杂交位点，或与引物杂交位点相邻的多核苷酸的多核苷酸序列。因此，“靶模板”包含毗邻引物的至少一个杂交位点的靶多核苷酸序列。“靶DNA模板”包含靶DNA多核苷酸序列。在一些情况中，“靶模板”包含侧接有供于“正向”引物和“反向”引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。靶模板分子，例如靶DNA模板分子，可以包含突变序列或野生型序列。多个靶DNA模板分子可以包含多个野生型序列，多个突变序列或其组合。

本文所用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链、或更高度聚集的杂交基序及其任意化学修饰。修饰包括但不限于，提供整合入其它电荷、极化性、氢键、静电相互作用、与核酸配体碱基或核酸配体整体的连接点和作用点的化学基团的那些修饰。这类修饰包括但不限于，肽核酸(PNA)、磷酸二酯基团修饰(例如，硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺处的修饰、4-硫尿核苷的取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶的取代、骨架修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合如异碱基(isobases)、异胞苷和异胍(isoguanidine)等。核酸也可包含非天然碱基，如硝基吲哚。修饰还可包括3′和5′修饰，包括但不限于用荧光团(例如，量子点或荧光有机染料)或其他部分加帽。

“探针”是指通过与靶核酸的子序列互补的碱基配对结合的寡核苷酸。本领域技术人员将理解，根据杂交条件的严格性，探针通常基本上会结合与探针序列缺乏完全互补性的靶序列。探针通常直接标记(例如用同位素或荧光部分)或间接标记如用地高辛或生物素标记。在某些情况下，探针是可检测标记的引物。通过测定探针和/或其可检测标记的存在或不存在，可以检测靶标的存在或不存在。在一些情况下，探针结合与探针完全互补的靶序列，但不结合与靶序列有单个核苷酸或更多核苷酸不同的靶标。

“接收寡核苷酸(sink oligonucleotide)”是指与用光致发光体可检测地标记的探针或引物互补的短寡核苷酸。接收寡核苷酸用能量转移伴侣标记，所述能量转移伴侣在与其杂交时猝灭互补的可检测标记的探针或引物的可检测信号。检测来自发光荧光团的未经淬灭的信号的存在或不存在分别指示靶核酸的存在或不存在。淬灭可以通过接收寡核苷酸的降解或以其他方式破坏接收寡核苷酸与可检测标记的引物之间的杂交复合物来减少或消除。

本文所用术语“划分”或“划分的”指将样品分为多个部分或多个“分区(partition)”。分区可以是固体或流体。在一些实施方式中，分区是固体分区，例如微通道。在一些实施方式中，分区是流体分区，例如液滴。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是不互溶的流体(如水和油)的混合物，或乳液。在一些实施方式中，流体分区(如液滴)是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在其它实施方式中，液体分区是与相邻水性液滴在物理或化学上分开的水性液滴，使得一个液滴的内容物不会扩散到相邻液滴中。

“聚合酶”是指能进行模板引导的多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)合成的酶。该术语同时包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于分离或衍生自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、滨海嗜热球菌(Thermococcuslitoralis)和海栖热袍菌(Thermotoga maritime)的DNA聚合酶或其修饰版本。市售可得的聚合酶的其他示例包括但不限于：克列诺片段(新英格兰生物实验室公司、Taq DNA聚合酶(凯杰公司(QIAGEN))、9°N^TM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Deep Vent^TM DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、Manta DNA聚合酶(酶学公司)、Bst DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)、和phi29 DNA聚合酶(新英格兰生物实验室公司)。

聚合酶包括DNA-依赖聚合酶和RNA-依赖聚合酶，如逆转录酶。已知至少5个DNA-依赖DNA聚合酶家族，虽然大多数落入A、B和C家族。其它类型DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。相似地，RNA聚合酶通常包括真核RNA聚合酶I、II和III，和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA依赖性和RNA依赖性的。

术语“标记物”、“可检测标记物”、“可检测部分”和类似术语指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，可用的标签包括荧光染料(荧光团)、发光剂、电子密度试剂、酶(例如，ELISA中常用)、生物素、地高辛、³²P和其它同位素、半抗原、以及可被检测的蛋白质(例如通过将放射性标签整合至肽中或用于检测与肽特异性反应的抗体)。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(例如，特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。可以采用本领域已知的用于将标记物偶联到需要的试剂的任何方法，例如，使用如下文献中所述的方法：Hermanson，《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)1996，圣迭戈的学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)。

发明详述

I.综述

本文描述了用于对来自样品的核酸进行分裂循环(split-cycle)和标记扩增子引物延伸(TAPE)扩增的方法和组合物。分裂循环和TAPE方法不是相互排斥的。因此，本文描述了用于在核酸扩增反应或多个核酸扩增反应中进行分裂循环和TAPE扩增的方法和组合物。

该方法和组合物可以例如在核酸扩增反应中减少突变型和野生型靶模板之间对于引物的竞争。所述方法和组合物可以另外或替代地通过例如原位产生额外的引物来减少或消除核酸扩增反应中的引物消耗。在一些情况下，本文所述的方法和组合物可以通过降低扩增反应中由聚合酶产生的突变的数量来降低定量核酸扩增的错误率。

在一些情况下，本文所述的方法和组合物涉及对划分的核酸样品中多个不同靶模板的定量分析(例如，突变和野生型靶序列的二维分析)。在这种情况下，本文所述的方法和组合物可以例如在单阳性和双阳性分区之间提供增加的分离，从而允许更容易的阈值化并降低分析的错误率。

II.组合物

本文描述了用于进行核酸扩增反应的组合物。

a.分裂循环组合物

在一个方面，组合物是用于进行分裂循环扩增反应的引物或引物组。进行分裂循环扩增反应的引物包括但不限于5＇加尾引物和侧翼引物。5＇-加尾引物通常用于正向和反向5＇-加尾引物对以扩增靶标模板的居间靶序列。5＇-加尾引物包括3＇杂交区域，其与靶序列特异性杂交并在聚合酶介导的引物延伸反应中用作引物。正向和反向5＇加尾引物的3＇杂交区域通常被配置为与靶模板的相反链杂交，使得3′末端朝向彼此。如此，引物可用于扩增靶模板并产生一对反向互补引物延伸产物，即扩增子。

这种扩增反应的引物延伸产物和扩增子包括靶序列和5′-加尾引物的5′尾序列。可以选择5′加尾引物的5′-尾区，相应的引物延伸产物和用5′-加尾引物扩增得到的扩增子作为侧翼引物的引物结合位点。在一些情况下，与分析的核酸样品的寡核苷酸序列相比，选择5′-尾区以包含一对独特的或基本独特的序列。例如，如果核酸样品是来自人对象的核酸样品，则与人基因组序列相比，可以选择独特的5′-尾区。

在一些情况下，5′-加尾引物对(即，正向5′-加尾引物和相应的反向5′-加尾引物)的5′-加尾引物的5′-尾区可以互为反向互补物。在这种情况下，5′-加尾引物可以支持标记扩增子引物延伸(TAPE)。在TAPE反应中，5′-加尾引物产生具有3′末端的扩增子，其在随后的扩增循环中用作引物。本文进一步描述用于TAPE的组合物和方法。

侧翼引物通常以成对的正向和反向侧翼引物采用以杂交至引物延伸产物以及通过用正向和反向5′-加尾引物对扩增靶模板产生的扩增子的5′-尾区。侧翼引物被配置为与5′加尾引物延伸产物靶模板的相反链杂交，使得3′末端朝向彼此。因此，分裂循环扩增包括第一组扩增循环，其中5′-加尾正向和反向引物与靶模板杂交并延伸以产生5′-加尾引物延伸产物和扩增子，以及第二组扩增循环，其中侧翼引物与5′-加尾引物延伸产物杂交并延伸以产生扩增子。

i.用于分裂循环王扩增的5’-加尾引物

在一些实施方式中，与侧翼引物退火至第一组扩增循环的产物相比，5′-加尾正向和5′-加尾反向引物在相对低的温度下退火至靶DNA模板。由于退火温度在第二组扩增循环中升高，所以其中5′-加尾引物的退火温度低于侧翼引物的退火温度的分裂循环扩增被称为分裂循环上扩增(up amplification)。在一些情况下，退火温度的这种差异可以提供对在给定的循环中反应中是否主要进行5′-加尾引物的延伸或侧翼引物的延伸的控制。例如，如下文进一步详细解释的，在具有相对低温度退火和任选的引物延伸阶段的第一组扩增循环期间，可以有利于5′-加尾引物延伸。类似地，在具有较高温度退火的第二组扩增循环，以及任选的引物延伸阶段期间，可以有利于侧翼引物延伸。

因此，5′-加尾引物的杂交区域可以比侧翼引物的杂交区域短。在一些实施方式中，5′-加尾引物的杂交区域长度为至少约8个核苷酸。在某些情况下，5′-加尾引物的杂交区域的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸。在一些情况下，5＇-加尾引物的杂交区域的长度为约8至约45，约9至约40，约8至约35，约8至约30，约9至约30，约10至约30，约11至约25，约12至约25或约15至约25个核苷酸。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域的长度为约8至约15，约9至约15，约10至约15，约12至约15，约8至约20，约9至约20，约10至约20，约12至约20或约15至约20个核苷酸。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域的长度为约8至约25，约9至约25，约10至约25，约12至约25，约15至约25，约18至约25，约8至约30，约9至约30，约10至约30，约12至约30，约15至约30，约18至约30或约20至约30个核苷酸。

另外或备选地，与分裂循环反应中的侧翼引物相比，5′-加尾引物的杂交区域可具有较低的G-C含量，或被修饰以表现出降低的退火温度。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域具有比分裂循环反应中侧翼引物的最低杂交温度低至少1℃的退火温度。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域具有的退火温度比分裂循环反应中侧翼引物的最低杂交温度低，约，至少，或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域具有比分裂循环反应中侧翼引物的最低杂交温度低约1℃至约45℃，约2℃至约35℃，约3℃至约30℃，约5℃至约20℃，约5℃至约15℃或约5℃至约10℃的退火温度。

在一些实施方式中，5′-加尾引物的杂交区域具有小于约75℃的退火温度。在一些实施方式中，5＇-加尾引物的杂交区域具有约30℃至约75℃，约35℃至约70℃，约40℃至约65℃，约45℃至约60℃，或约45℃至约55℃的退火温度。在一些实施方式中，5′-加尾引物的杂交区域具有等于或至少或约或至少约35、40、45、50、55、60或65℃的退火温度(例如，并且小于约75℃)。

5＇-加尾引物的5′-尾区可以被配置成为相应的侧翼引物提供引物结合位点，该侧翼引物具有比5加尾引物至靶DNA模板的退火温度更高的退火温度。另外或可选地，5′-尾区可以具有比3′杂交区域更长的核苷酸长度。在一些实施方式中，5′-加尾引物的5′-尾区长度为至少约10个核苷酸。在一些情况下，5′加尾引物的5′-尾区的长度等于，约为，至少，或至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸。在一些情况下，5′-加尾引物的5′-尾区的长度为约10至约45，约11至约40，约12至约35，约10至约30，约11至约30，约12至约30，或约15至约30个核苷酸。在一些情况下，5′-加尾引物的5′-尾区的长度为约12至约25，约15至约25，约20至约25，约12至约30，约15至约15约30，约20至约30，或约25至约30个核苷酸。另外或可选地，与杂交区相比，5′-加尾引物的5′-尾区可以具有更高的G-C含量。例如，5′-尾区可以比杂交区域多或至少多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个G或C核苷酸。作为另一个实例，与杂交区域相比，5′-尾区可多约1至约3，约1至约5，约1至约10，约2至约3，约2至约5，或约2至约10个G或C核苷酸。

ii.用于分裂循环下扩增的5，-加尾引物

在一些实施方式中，与侧翼引物退火至第一组扩增循环的产物相比，5′-加尾正向和5′-加尾反向引物在相对高的温度下退火至靶DNA模板。由于退火温度在第二组扩增循环中降低，所以其中5′-加尾引物的退火温度高于侧翼引物的退火温度的分裂循环扩增被称为分裂循环下扩增(down amplification)。在一些情况下，退火温度的这种差异可以对在给定的循环中反应中是否主要进行5′-加尾引物的延伸或侧翼引物的延伸的控制。例如，如下文进一步详细解释的，在具有相对高温度退火和任选的引物延伸阶段的第一组扩增循环期间，可以有利于5′-加尾引物延伸。类似地，在第二组扩增循环期间可以有利于侧翼引物延伸，其中5′-加尾引物被耗尽并且使用相对低温退火和任选的引物延伸阶段。

因此，5′-加尾引物的杂交区域可以比侧翼引物的杂交区域长。在一些实施方式中，5′-加尾引物的杂交区域长度为至少约10个核苷酸。在一些情况下，5′加尾引物的杂交区域的长度等于，约为，至少，或至少约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域为约12至约45，约15至约40，约18至约35，约20至约30，约25至约30，约15至约30，约18至约25，约20至约25或约15至约25个核苷酸。

另外或备选地，与分裂循环反应中的侧翼引物相比，5′-加尾引物的杂交区域可具有较高的G-C含量，或被修饰以表现出升高的退火温度。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域具有比分裂循环反应中侧翼引物的最高杂交温度高至少1℃的退火温度。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域具有的退火温度比分裂循环反应中侧翼引物的最高杂交温度高，约，至少，或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域具有比分裂循环反应中侧翼引物的最高杂交温度高约1℃至约45℃，约2℃至约35℃，约3℃至约30℃，约5℃至约20℃，约5℃至约15℃或约5℃至约10℃的退火温度。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域具有比分裂循环反应中侧翼引物的最高杂交温度高约1℃至约5℃，约2℃至约5℃，约3℃至约5℃，约1℃至约10℃，约2℃至约10℃，约3℃至约10℃，或约5℃至约10℃的退火温度。在一些情况下，5′-加尾引物的杂交区域具有比分裂循环反应中侧翼引物的最高杂交温度高约10℃至约25℃，约10℃至约30℃，约10℃至约35℃，约15℃至约25℃，约15℃至约30℃，约15℃至约35℃，或约20℃至约30℃的退火温度。

在一些实施方式中，5′-加尾引物的杂交区域具有小于约75℃的退火温度。在一些实施方式中，5′-加尾引物的杂交区域具有大于约50℃(例如，大于约50℃且小于约75℃)的退火温度。在一些实施方式中，5′-加尾引物的杂交区域具有约45℃至约75℃，约50℃至约70℃，约55℃至约68℃，约55℃至约65℃，或约55℃至约60℃的退火温度。在一些实施方式中，5′-加尾引物的杂交区域具有等于，或约50、55、60、65、68、70、72或75℃的退火温度。

5′-加尾引物的5′-尾区可以被配置成为相应的侧翼引物提供引物结合位点，该侧接引物具有比5加尾引物的退火温度更低的退火温度。另外或可选地，5＇-尾区可以具有比3＇杂交区域更短的核苷酸长度。在一些实施方式中，5′-加尾引物的5′-尾区长度为至少约7个核苷酸。在一些情况下，5′加尾引物的5′-尾区的长度等于，约为，或至少约7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸。在一些情况下，5′-加尾引物的5′-尾区的长度为约7至约35，约8至约30，约9至约30，约7至约30，约8至约25，约9至约20，约7至约20，约8至约18，约9至约15或约8至约15个核苷酸。另外或可选地，与杂交区相比，5′-加尾引物的5′-尾区可以具有更低的G-C含量。例如，相比杂交区域，5′-尾区可以少或至少少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个G或C核苷酸。

在一些实施方式中，侧翼引物具有至少约45℃的退火温度。在一些实施方式中，侧翼引物具有约45℃至约80℃，约45℃至约75℃，约45℃至约65℃，约45℃至约60℃，或约45℃至约55℃的退火温度。在一些实施方式中，侧翼引物具有等于，或约45、50、55、60、65、70或75℃的退火温度。

侧翼引物的长度通常与相应的5＇加尾引物的5＇-尾区相同。然而，侧翼引物可以比5＇-尾区短，或者可以含有额外的核苷酸，可检测标记等。在一些实施方式中，侧翼引物长度为至少约8个核苷酸。在某些情况下，侧翼引物的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸。在一些情况下，侧翼引物的长度为约7至约15，约8至约15，约9至约25，约10至约45，约11至约40，约12至约35，约10至约30，约11至约30，约12至约30或约15至约30个核苷酸。

可以在一个或多个位置修饰侧翼引物以提高或降低退火温度。提高退火温度的合适修饰包括但不限于选自2′氟核苷，LNA(锁核酸)，ZNA(拉链(zip)核酸)和PNA(肽核酸)的一种或多种修饰。降低退火温度的合适修饰包括但不限于碱基和骨架修饰。改变相反碱基之间沃森-克里克相互作用的碱基修饰包括肌苷，黄嘌呤核苷，氧代-鸟嘌呤等。骨架修饰例如无环核苷类似物降低了解链温度而不影响沃森-克里克相互作用(Nielsen，P.，

L.H.和Wengel，J，无环的寡核苷酸的合成和评估(Synthesis and evaluation ofoligodeoxynucleotides containing acyclic))。已知用于降低退火温度的另一种骨架修饰可以被认为是无碱基位点(Hianik，T.等，含无碱基位点的DNA双链体：热稳定性和声波性质之间的相关性(DNA-duplexes containing abasic sites：correlation betweenthermostability and acoustic wave properties).Analyst 131，1161-1166(2006))或接头，其完全没有碱基与相反的链成对。

在一些实施方式中，一个或多个侧翼引物可包含可检测标记(例如荧光标记)。在一些情况下，其中一个或多个侧翼引物包括可检测荧光标记的分裂循环反应混合物还包括短寡核苷酸，其包含猝灭剂并且与荧光标记的侧翼引物反向互补。在一些情况下，这样的反应混合物包括具有链置换活性的热稳定聚合酶。在某些情况下，在荧光标记的侧翼引物，淬灭剂和链置换聚合酶存在下的扩增用扩增子介导的探针测定(AMP测定)进行。这样的测定在US2015/0148250中进一步描述，通过引用将其全部内容并入本文用于所有目的。在一些实施方式中，具有与其偶联的可检测标记的侧翼引物可用于分裂循环下扩增反应，其中在第二组扩增循环中降低退火温度。在一些实施方式中，具有与其偶联的可检测标记的侧翼引物可用于分裂循环上扩增反应，其中在第二组扩增循环中提高退火温度。

在一些实施方式中，与侧翼引物相比，在分裂循环扩增反应中以较低浓度提供5＇-加尾引物。较低浓度的5＇加尾引物可用于，例如，在早期扩增循环期间快速耗尽5＇-加尾引物，并确保后续扩增循环主要通过侧翼引物的杂交和延伸进行。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度小于侧翼引物浓度的约50％(即，小于约1/2)。如本文所用，涉及第一成对引物(例如，5′-加尾引物)为第二对引物(例如侧翼引物)的术语50％，半，一半或1/2是指第一对引物的数值浓度值是第二对引物浓度值的一半。因此，仅出于说明的目的，对于反应混合物中1uM的第一对引物，为反应混合物中第二对引物的1/2浓度，第二对引物将为2μM。本领域技术人员将会理解，本领域普通技术人员可以类似地计算和理解降低浓度或增加浓度的替代百分比或百分比范围。一般而言，引物对的单个引物彼此之间是等摩尔浓度的或约等摩尔浓度的。

因此，在一些实施方式中，5＇-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约0.0001％到至少约1/2(即，50％)。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约0.001％到至少约1/2(即，50％)。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约0.01％至不超过约1/2(即，50％)。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约0.1％至不超过约1/2(即，50％)。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约1％至不超过约1/2(即，50％)。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约5％至不超过约1/2(即，50％)。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约10％至不超过约1/2(即，50％)。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约15％至不超过约1/2(即，50％)。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物浓度的至少约20％至不超过约1/2(即，50％)。在一些情况下，5′-加尾引物的浓度是侧翼引物的浓度或者大约是侧翼引物的浓度。

在一些情况下，与相应的侧翼引物相比，5′-加尾引物的相对引物浓度(例如与相对退火温度相结合)可以提供对5′-加尾引物的延伸或侧翼引物的延伸是否在给定的循环中占主导地位进行的控制。例如，与高温退火侧翼引物相比，在分裂循环扩增反应中可以以更高的浓度提供低温退火5′-加尾引物。因此，具有低温退火阶段的扩增循环可主要延伸杂交的5′-加尾引物，即使侧翼引物可在此温度下退火，而高温退火循环可主要延伸杂交的侧翼引物，因为5′-加尾引物在较高的退火温度下的退火是不利的。

因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度比侧翼引物浓度高至少约2倍到至少约10000倍。因此，在一些实施方式中，5′-加尾引物的浓度比侧翼引物浓度高至少约2倍到不超过约10000倍。在一些情况下，5′-加尾引物的浓度比侧翼引物浓度高或比侧翼引物浓度高约5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、或1000倍。在一些情况下，5＇-加尾引物浓度比侧翼引物的浓度高至少约2倍至不超过约1000倍，至少约2倍至不超过约500倍，至少约2倍至不超过约100倍，至少约2倍至不超过约50倍，至少约2倍至不超过约10倍，或者至少约2倍至不超过5倍。

类似地，与低温退火侧翼引物相比，在分裂循环扩增反应中可以以更低的浓度提供高温退火5′-加尾引物。因此，具有高温退火阶段的初始扩增循环可以主要延伸和耗尽杂交的5＇-加尾引物，而随后的低温退火循环可以主要延伸杂交的侧翼引物，因为加尾引物被耗尽。

因此，在一些实施方式中，侧翼引物的浓度比5′-加尾引物浓度高至少约2倍到至少约10000倍。因此，在一些实施方式中，侧翼引物的浓度比5′-加尾引物浓度高至少约2倍到不超过约10000倍。在一些情况下，侧翼引物的浓度比5′-加尾引物浓度高或比5′-加尾引物浓度高约5倍、10倍、15倍、20倍、30倍、50倍、75倍、100倍、250倍、500倍、或1000倍。

分裂循环扩增反应的总引物浓度可以为约1nM至约1μM，约5nM至约900nM，约10nM至约750nM，约15nM至约600nM，约20nM至约500nM，约25nM至约400nM，约50nM至约300nM，约75nM至约250nM或约100nM至约200nM。在一些情况下，分裂循环扩增反应中的总引物浓度为或约为25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、350、400或500nM。

分裂循环扩增组合物和方法，例如本文所述的那些，可以通过例如降低由于错误引发或聚合酶介导的核苷酸错误掺入错误引起的变异来增加核酸扩增测定的灵敏度。例如，在其中5＇-加尾引物的3′杂交区域与非靶序列高度相似的靶模板序列杂交的扩增反应中，其中5′-加尾引物延伸占主导地位的早期扩增循环，可以显示出对非靶模板的5加尾引物的明显错误引发。类似地，在聚合酶介导的核苷酸错误掺入杂交期间，5′-加尾引物与靶位点的杂交可以产生非靶标突变引物延伸产物，其不能有效地或无法通过额外轮次的5′-加尾引物介导的扩增而被扩增。相反，随后的扩增循环(其中侧翼引物的延伸占主导地位)可以高度抵抗错误引发和/或错误掺入误差，因为侧翼引物结合位点可以显着不同于样品中的任何其他序列。

通过限制错误引发和/或错误掺入对少数早期扩增循环的影响，该测定可以表现出提高的灵敏度。由于错误引发或聚合酶核苷酸错误掺入导致的这种错误在例如变体分析期间是显著的，例如在靶和非靶之间的差异是单个核苷酸的情况下(例如SNP分析)。这些错误引发或聚合酶核苷酸错误掺入错误也可能在两个或更多个靶模板由少量核苷酸不同而引起的多通道测定中显著。例如，在分别检测突变和靶模板的测定中，将错误引发和/或错误掺入的影响限制到少数早期扩增循环可能是有益的。

因此，在一些实施方式中，本文所述的分裂循环反应混合物含有两组5′-加尾正向和反向引物对以及两组正向和反向侧翼引物对。例如，本文所述的分裂循环反应混合物可以包括与含有野生型序列的野生型靶DNA模板杂交的特异性5′加尾正向和反向引物对和与含有突变靶序列的靶DNA模板杂交的突变特异性5′加尾正向和反向引物对。这种反应混合物还含有两个对应组的侧翼正向和反向引物对。

在一些情况下，野生型靶序列和突变型靶序列之间的差异是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。因此，在一些情况下，野生型和突变特异性5＇加尾加正向引物的杂交区域的差异是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。类似地，在一些情况下，野生型和突变特异性5＇加尾反向引物的杂交区域的差异是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些情况下，野生型特异性和突变特异性5′-加尾正向引物和野生型特异性和突变特异性5′-加尾反向引物独立地相差或，相差约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。相反，通常选择5′-尾区和侧翼引物以使其彼此基本上不同，使得侧翼引物在扩增反应条件下不与非靶标尾区交叉杂交。

在某些情况下，从3′端开始计数，突变特异性5′-加尾引物在3′杂交区域的前5个核苷酸内含有一个区分性核苷酸，区分突变和野生型靶序列。例如，突变特异性5′-加尾引物可以含有一种区分性核苷酸，其是自3′起第一个核苷酸，自3′第二个核苷酸，自3′起第三个核苷酸，自3′起第四个核苷酸，或自3′起第五个核苷酸。在某些情况下，突变特异性5′-加尾引物含有多个区分性核苷酸。在某些情况下，区分性核苷酸是相邻的。在一些情况下，正向和反向5′-加尾引物各含有一个区分性核苷酸。

在一些实施方式中，用于进行分裂循环核酸扩增测定的反应混合物包含：热稳定聚合酶；前述靶标特异性正向和反向5′-加尾引物对中的任何一个或多个；以及前述靶标特异性正向和反向侧翼引物对中的任何一个或多个。在一些情况下，靶标特异性正向和反向5′-加尾引物对特异性杂交并扩增野生型核酸靶序列。在一些情况下，靶标特异性正向和反向5′-加尾引物对特异性杂交并扩增突变型核酸靶序列。在一些情况下，反应混合物包含突变特异性正向和反向5′-加尾引物对和野生型特异性正向和反向5′-加尾引物对。在一些情况下，反应混合物含有一个或多个特异性杂交并扩增一种或多种额外靶核酸的额外靶标特异性正向和反向5′-加尾引物对。含有多个正向和反向5′-加尾引物对的反应混合物可以含有相应数量的正向和反向侧翼引物对，其中每个侧翼引物对特异性扩增由相应的5′-加尾引物对产生的扩增子。

在一些实施方式中，用于进行分裂循环核酸扩增测定的反应混合物包含：i)靶标特异性正向5＇-加尾引物和靶标特异性反向5＇-加尾引物(即，靶标特异性5′-加尾引物对)，其中靶标特异性5＇-加尾引物对杂交并特异性扩增来自含有靶序列的核酸样品的靶DNA模板分子(如果存在的话)，并且其中靶标特异性5′引物对的引物包括：a)与突变靶序列特异性杂交的长度为至少10个核苷酸且长度小于30个核苷酸的3＇杂交区域；和b)长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的靶标特异性5＇尾区，其不与核酸样品中的任何核酸片段杂交。在一些情况下，反应混合物还包含：ii)一对正向和反向靶标特异性侧翼引物，其中靶标特异性侧翼引物杂交并特异性扩增含有靶标特异性5′-加尾引物对的5′-尾区的扩增子，如果存在。

分裂循环反应混合物可以进一步含有本领域已知的扩增试剂。这样的扩增试剂包括但不限于三磷酸核苷酸，二价阳离子，缓冲剂，盐，稳定剂和其他添加剂(例如甜菜碱，DMSO等)。在一些情况下，分裂循环反应混合物含有嵌入染料，例如EvaGreen。这样的嵌入染料可用于检测期望单通道检测的反应中的扩增。例如，在含有单组5′-加尾正向和反向引物以及单组相应侧翼引物的分裂循环扩增中，嵌入染料可区分含扩增子的反应混合物(指示存在靶DNA模板)和不含有大量扩增子的反应混合物(指示缺乏足够的靶DNA模板)。

或者，序列特异性探针可以存在于分裂循环反应混合物中。如上所述，序列特异性探针可用于单通道检测。序列特异性探针也可用于多通道检测。例如，在其中使用两个或更多个不同组的5′-加尾引物对和相应的侧翼引物对产生两个或更多个不同扩增子的分裂循环测定中，序列特异性探针可区分两个或更多个不同扩增子。示例性的序列特异性探针包括但不限于水解探针(例如TAQMAN)和分子信标(Molecular Beacons)。或者，如上所述，侧翼引物可以是可检测标记的序列特异性探针。在一些实施方式中，包含可检测地标记的侧翼引物的反应混合物还包括当与侧翼引物杂交时淬灭可检测标记的接收寡核苷酸。通过例如聚合酶介导的水解破坏侧翼引物：接收寡核苷酸杂交体产生指示靶核酸存在的可检测信号。

b.划分的分裂循环组合物

分裂循环扩增可以在多个混合物分区中的划分的核酸样品上进行。在一些实施方式中，准确定量样品中的靶模板分子需要通过划分核酸样品产生的多个混合物分区不被样品中靶模板分子的数量饱和。因此，本文描述了包含多个混合物分区的分裂循环组合物，其中单独的混合物分区通过划分核酸样品而产生，并且所述多个混合物分区包含不含靶模板分子(例如野生型或突变体)的混合物至少约1个分区。

在一些实施方式中，多个混合物分区包含不含模板分子(例如野生型或突变体)的约或至少约2-10或3-10个混合物分区。在一些实施方式中，多个混合物分区包含约10、20、30、40、50、60、100、1000、2000、3000、4000、5000、10000、15000个或更多不含模板分子的混合物分区。在一些实施方式中，约或至少约0.001％，0.005％，0.01％，0.05％，0.1％，1％，2％，3％，4％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％或90％的混合物分区不含模板分子。在一些实施方式中，约0.001％至约50％的混合物分区不含模板分子。在一些实施方式中，约0.005％至约25％的混合物分区不含模板分子。在一些实施方式中，约0.1％至约15％的混合物分区不含模板分子。在一些实施方式中，约1％至约10％的混合物分区不含模板分子。在一些实施方式中，约10％至约50％的混合物分区不含模板分子。

在一些实施方式中，靶模板分子以至少约0.000025个拷贝/分区的浓度存在于多个混合物分区中。在一些实施方式中，靶标模板分子以每个分区约0.000025至约50个拷贝，每个分区约0.0001至约50个拷贝，每个分区约0.0005至约50个拷贝，每个分区约0.001至40个拷贝，每个分区约0.005至约30个拷贝，每个分区约0.01至约20个拷贝，或每个分区约0.00005至约20个拷贝的浓度存在于多个混合物分区中。在一些实施方式中，靶模板分子以每个分区约0.025至约30个拷贝，每个分区约0.05至约30个拷贝，每个分区约0.01至约30个拷贝，每个分区约0.25至约30个拷贝，每个分区约0.025至约10个拷贝，每个分区约0.05至约10个拷贝，约0.01至约10，或每个分区约0.25至约10个拷贝的浓度存在于多个混合物分区中。在一些情况下，混合物中的靶DNA模板的平均浓度为或约为每个分区0.00025、0.0005、0.00075、0.001、0.0025、0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、12、13，14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50个拷贝。

在一些实施方式中，多个混合物分区包含一个或多个野生型靶模板分子。在一些实施方式中，多个混合物分区含有具有突变靶序列的靶模板分子。在一些实施方式中，所述多个混合物分区含有具有突变靶序列的至少一个靶模板分子和多个野生型靶模板分子。

在一些实施方式中，多个混合物分区中的至少一个含有野生型靶模板分子和突变型靶模板分子。在一些实施方式中，多个混合物分区中的约0.0001％或至少0.0001％含有野生型靶模板分子和突变型靶模板分子。在一些实施方式中，多个混合物分区中的约0.001％或至少0.001％含有野生型靶模板分子和突变型靶模板分子。在一些实施方式中，多个混合物分区中的约0.01％或至少0.01％含有野生型靶模板分子和突变型靶模板分子。在一些实施方式中，多个混合物分区中的约0.1％或至少0.1％含有野生型靶模板分子和突变型靶模板分子。在一些实施方式中，多个混合物分区中的约1％或至少1％含有野生型靶模板分子和突变型靶模板分子。在一些实施方式中，多个混合物分区中的约或至少约2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％含有野生型靶模板分子和突变型靶模板分子。

在一些实施方式中，多个混合物分区中的混合物分区的数量为至少约100。在一些实施方式中，多个混合物分区中的混合物分区的数量为约100至约10,000,000；约500到约10,000,000；约500至约200,000；从约500到约100,000；约500到约75,000；约1,000到约50,000；或约5,000至约20,000。在一些实施方式中，多个混合物分区中的混合物分区的数量为或约为500；750；1000；2000；3000；4000；5000；7500；5000；7500；10,000；15000；20,000；30,000；40,000；50000；75000；100,000；150000；200,000；500,000；1,000,000；5000000；或10,000,000。

c.标记扩增子引物延伸(TAPE)组合物

本文描述了用于进行标记扩增子引物延伸(TAPE)反应的组合物。一方面，该组合物是一组TAPE引物。TAPE引物是含有5′尾的PCR核酸扩增引物对，其中引物对的单个引物的5′尾互为反向互补物。在一些情况下，TAPE引物也是分裂循环5′-加尾引物。

TAPE正向和反向引物可以含有3′杂交区域，其被配置为与靶DNA模板分子的靶序列特异性杂交并在核酸扩增反应中产生第一引物延伸产物。在一些情况下，3′杂交区域的长度为至少约8个核苷酸。在某些情况下，TAPE引物的杂交区域的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸。在一些情况下，TAPE引物的杂交区域的长度为约8至约45，约9至约40，约8至约35，约8至约30，约9至约30，约10至约30，约11至约25，约12至约25或约15至约25个核苷酸。TAPE正向和反向引物可含有与靶DNA模板分子的靶序列不互补的5＇尾区。在一些情况下，5＇尾区的长度为至少约8个核苷酸。在某些情况下，TAPE引物的5’尾区的长度为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45个核苷酸。在一些情况下，TAPE引物的5’尾区的长度为约8至约45，约9至约40，约8至约35，约8至约30，约9至约30，约10至约30，约11至约25，约12至约25或约15至约25个核苷酸。

在某些情况下，从3′端开始计数，TAPE引物在3＇杂交区域的前5个核苷酸内含有一个区分性核苷酸，区分突变和野生型靶序列。例如，区分性核苷酸可以是自3＇起第一个核苷酸，自3′起第二个核苷酸，自3′起第三个核苷酸，自3′起第四个核苷酸，或自3′起第五个核苷酸。在一些情况下，TAPE引物含有多个区分性核苷酸。在某些情况下，多个区分性核苷酸是相邻的。在一些情况下，正向和反向TAPE引物各含有一个区分性核苷酸。

在一些实施方式中，正向和/或反向TAPE引物的5＇尾区含有限制性内切核酸酶切割位点。限制性内切核酸酶切割位点可用于切割在TAPE反应中产生的扩增子多联体。在一些情况下，正向和反向TAPE引物均含有限制性核酸内切酶切割位点。在一些情况下，正向和反向TAPE引物含有相同的限制性核酸内切酶切割位点。在一些情况下，正向和反向TAPE引物含有不同的限制性核酸内切酶切割位点。

在一些情况下，TAPE反应混合物还含有一对正向和反向侧翼引物，其特异性杂交并扩增含有TAPE引物的5＇尾区的扩增子。

在一些情况下，TAPE反应含有第一正向和反向TAPE引物对，其特异性杂交并扩增第一靶序列，和第二正向和反向TAPE引物对，其特异性杂交并扩增第二靶序列。在一些情况下，第一和第二靶序列分别是野生型和相应的突变靶序列。因此，第一TAPE引物对可以是野生型特异性TAPE引物对，其具有特异性杂交并扩增具有野生型靶序列的靶模板分子的3＇杂交区域。在一些情况下，第一TAPE引物对的正向和/或反向引物可以在与野生型靶DNA模板分子互补，而不与突变型靶DNA模板分子互补的3＇杂交区域中含有区分性核苷酸。

类似地，第二TAPE引物对可以是突变特异性TAPE引物对，其具有特异性杂交并扩增具有突变型靶序列的靶模板分子的3＇杂交区域。在一些情况下，第二TAPE引物对的正向和/或反向引物可以在与突变型靶DNA模板分子互补，而不与野生型靶DNA模板分子互补的3′杂交区域中含有区分性核苷酸。

在一些情况下，第一组正向和反向TAPE引物的5′尾不同于第二组正向和反向TAPE引物的5′尾。在一些情况下，TAPE反应混合物还含有第一对正向和反向侧翼引物，其特异性杂交并扩增含有第一组TAPE引物的5′尾区的扩增子。在一些情况下，TAPE反应混合物还含有第二对正向和反向侧翼引物，其特异性杂交并扩增含有第二组TAPE引物的5′尾区的扩增子。

TAPE反应可含有本文所述的前述核酸扩增反应组合物或混合物中的任何一种或多种，包括但不限于引物，探针，缓冲剂，盐，聚合酶等及其组合。TAPE反应可以在多个混合物分区中进行。因此，TAPE反应组合物可以包括但不限于本文所述前述分区分裂循环组合物中的任何一种或多种，包括但不限于含有突变型和野生型靶标的那些组合物，含有不含靶模板分子的1个或多个分区的那些组合物，含有确实含有靶模板分子的1个或多个分区的那些组合物，或包含含有野生型和靶标模板分子两者的1个或多个分区的那些组合物，以及它们的组合。

III.方法

a.分裂循环

本文描述了用于定量核酸样品中野生型和突变型靶核酸片段的绝对数量或频率的方法。在一些实施方式中，所述方法包括形成多个混合物分区，所述混合物分区包含一部分核酸样品，一个或多个前述5′-加尾引物对，一个或多个前述侧翼引物对和热稳定聚合酶。在某些情况下，混合物分区是乳液液滴。

该方法可以包括在热循环条件下孵育，适合通过聚合酶链式反应扩增靶DNA模板分子(如果存在的话)。在一些情况下，热循环条件包括第一组温度循环(例如，第一组变性，退火和延伸)和第二组温度循环(例如第一组变性，退火和延伸)，其中第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤高至少1℃。在一些情况下，第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤高1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃。在一些情况下，第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤高约1至约5℃，约1至约10℃，或约1至约15℃。在一些情况下，第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤高约2至约5℃，约2至约10℃，或约2至约15℃。在一些情况下，第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤高约5至约10℃，约5至约15℃，或约5至约20℃。

在一些情况下，热循环条件包括第一组温度循环(例如，第一组变性，退火和延伸)和第二组温度循环(例如第一组变性，退火和延伸)，其中第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤低至少1℃。在一些情况下，第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃。在一些情况下，第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤低约1至约5℃，约1至约10℃，或约1至约15℃。在一些情况下，第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤低约2至约5℃，约2至约10℃，或约2至约15℃。在一些情况下，第二组温度循环的退火步骤比第一组温度循环的退火步骤低约5至约10℃，约5至约15℃，或约5至约20℃。

在一些实施方式中，该方法包括检测混合物分区中是否存在扩增的靶DNA模板的步骤。由此，检测可以确定：i)含有具有野生型靶序列的扩增的靶DNA模板的单阳性野生型混合物分区的数量；ii)含有具有突变靶序列的扩增的靶DNA模板的单阳性突变混合物分区的数量；和iii)含有野生型和突变扩增的靶DNA的双阳性混合物分区的数量。在一些情况下，使用单阳性和双阳性分区的数量来确定核酸样品中野生型和突变型靶核酸片段的绝对量或频率。在一些情况下，阴性分区的数量，或所有分区的总数也用于计算核酸样品中野生型和突变型靶核酸片段的绝对数量或频率。检测可以检测嵌入染料的荧光，检测与侧翼引物偶联的荧光团的荧光(例如，用AMP测定法，参见US2015/0148250，通过引用将其全部纳入本文用于所有目的)，或者检测通过核酸水解探针的聚合酶介导的水解产生的荧光信号。

在一些实施方式中，第一组热循环条件是或至少包括单个变性，退火和延伸步骤。在一些情况下，第一组热循环条件包括约1至约20，约2至约15，或约2至约5个变性，退火和延伸循环。在一些实施方式中，第二组热循环条件是或包括至少5个变性，退火和延伸循环。在一些情况下，第二组热循环条件包括约5至约60，约10至约50，约15至约30，或约15至约25个变性，退火和延伸循环。在一些情况下，反应混合物中的侧翼引物具有与聚合酶的优化延伸温度相等或接近(例如，在约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃内)的退火温度，并且第二组温度循环中的退火和延伸同时进行。在一些情况下，反应混合物中的5′-加尾引物具有与聚合酶的优化延伸温度相等或接近(例如，在约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10℃内)的退火温度，并且第一组温度循环中的退火和延伸同时进行。

b.标记扩增子引物延伸(TAPE)

本文描述了用于进行TAPE反应的方法。在一个方面，该方法包括形成或提供前述反应混合物或多个混合物分区中的任何一个。反应混合物或混合物分区可以包括热稳定聚合酶和一对正向和反向TAPE引物，其具有互为反向互补物的5′尾。在一些实施方式中，反应混合物或多个混合物分区或其一部分含有靶DNA模板分子。

如果存在的话，可以使反应混合物或多个混合物分区经受适于进行正向TAPE引物的3＇杂交区域与靶模板分子的杂交(即退火)的条件。杂交的TAPE引物可以用聚合酶延伸产生第一引物延伸产物。第一引物延伸产物可以与反向TAPE引物杂交，然后用聚合酶延伸，由此产生第二引物延伸产物。正向TAPE引物的3′杂交区域可以与第二引物延伸产物杂交并延伸，由此产生第三引物延伸产物。第二和第三引物延伸产物一起形成具有互为反向互补物的3′末端和互为反向互补物的5′末端的第一双链扩增子。

该方法可以进一步包括使第一双链扩增子变性并使第一双链扩增子的3′末端彼此杂交。第一双链扩增子的两条链的杂交3′末端可以用聚合酶延伸以形成具有互为反向互补物的3′末端和互为反向互补的5′末端的第二双链扩增子。第二双链扩增子可以比第一大。该方法可以进一步包括：使第二双链扩增子变性；使第二双链扩增子的两条链的3′末端杂交；并且用聚合酶延伸第二双链扩增子的两条链的杂交3′末端以产生具有互为反向互补物的3′末端和互为反向互补物的5′末端的第三双链扩增子。第三双链扩增子可以比第二大。

双链扩增子的变性，退火和延伸可重复多次，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50次或更多次。在一些情况下，双链扩增子的变性，退火和延伸重复约1至约50，约2至约40，约5至约40，约10至约40，约15至约40，约20至约40，约5至约30，约10至约30，约15至约30，约20至约30，约5至约25，约10至约25，约15至约25，约5至约20，约10至约20或约15至约20个循环的变性，退火和延伸。在一些情况下，反应混合物中双链扩增子的反向互补3＇末端具有等于或接近(例如，在约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10℃内)聚合酶的最佳延伸温度的退火温度，并且退火和延伸同时进行。

在一些实施方式中，在TAPE反应的晚期循环中产生的大尺寸的扩增子导致沉淀。可利用沉淀来提供反应混合物或混合物分区中存在或不存在靶标模板分子的读出。例如，可以通过光学检测紫外或可见光波长下的浊度来检测沉淀。以下描述了用于检测的附加或替代方法。或者，双链扩增子可被切割以防止或减少沉淀或将扩增子减小至均一大小。

因此，在一些情况下，TAPE引物的5＇尾包含切割位点。切割位点可以是限制性内切核酸酶位点，尿嘧啶(例如可被尿嘧啶糖基化酶切割)或化学可切割的连接。通常，选择切割位点以使对反应混合物或混合物分区中存在的聚合酶的模板引导的DNA聚合酶活性的干扰最小化。在一些情况下，切割位点是在TAPE引物中的一个或多个的5′尾区中的二烷氧基硅烷，3′-(S)-硫代磷酸酯，5′-(S)-硫代磷酸酯，3′-(N)-氨基磷酸酯，5′-(N)氨基磷酸酯。在含有多对TAPE引物的反应混合物或混合物分区中，每个TAPE引物或TAPE引物对可在5′尾区中含有独立选自二烷氧基硅烷，3′-(S)-硫代磷酸酯，5′-(S)-硫代磷酸酯，3′-(N)-氨基磷酸酯，或5′-(N)氨基磷酸酯连接，限制性内切核酸酶切割位点，和尿嘧啶的切割位点。在一些实施方式中，反应混合物或混合物分区中的一些TAPE引物或引物对在5′尾含有切割位点，而另一些不含。

在5′尾区中含有切割位点的TAPE引物产生含有切割位点的扩增子。在一些实施方式中，TAPE反应方法包括切割扩增子的切割位点的步骤。切割可以在混合物分区或反应混合物中进行。在一些情况下，通过在最佳切割酶温度(例如37℃)下延长孵育(例如，5、10、15、30、45、60或90分钟)来进行切割。

在一些情况下，切割额外或备选地包括向反应混合物或混合物分区中引入切割试剂(例如酶或化学品)。例如，在一些情况中，可向分区和流体之间的界面施加电场以打破界面并使至少一部分的流体进入分区。作为另一个示例，一种或多种试剂可通过微流体技术导向微米或纳米尺寸孔中的分区中。用于向分区注射试剂的方法、组合物和装置包括但不限于WO/2010/0151776所述的那些。

TAPE扩增可以通过使用本领域已知的各种方法检测扩增子或消化的扩增子的存在来检测，以确定反应混合物或多个混合物分区中靶模板的存在或不存在。在一些情况下，TAPE反应扩增野生型和突变型靶模板分子，并且用差异标记的野生型特异性探针和突变特异性探针进行检测。探针可以是核酸水解探针，分子信标，蝎型探针等。

在一些情况下，TAPE反应扩增野生型和突变型靶模板分子，因为单个正向和反向TAPE引物对可以与野生型和突变型靶模板分子杂交并延伸以产生扩增子。在一些情况下，TAPE反应使用两对不同的正向和反向TAPE引物扩增野生型和突变型靶模板分子，一对特异性扩增野生型靶序列，一对特异性扩增突变型靶序列。在一些情况下，TAPE反应特异性扩增靶模板分子，并且可以使用序列特异性探针或非特异性检测试剂(例如嵌入染料)进行检测。在一些情况下，如果还存在野生型靶模板分子，TAPE反应特异性扩增突变型靶模板分子，并且可以用序列特异性探针或非特异性检测试剂(例如嵌入染料)进行检测。在一些情况下，序列特异性探针检测野生型和突变型靶标模板中相同扩增子的区域。

在一些情况下，TAPE反应还包括如上所述的侧翼引物。在这样的TAPE反应中，该方法可包括如上所述的分裂循环扩增方法和组合物。例如，TAPE扩增可以采用用于杂交和延伸所产生的双链扩增子的TAPE引物和链的第一组扩增条件，以及用于杂交和延伸侧翼引物的第二组扩增条件进行。在一些情况下，第二组扩增条件的引物退火温度高于第一组扩增条件的退火温度。在一些情况下，第二组扩增条件的引物退火温度低于第一组扩增条件的退火温度。在一些情况下，可检测地标记一个或多个侧翼引物。在一些情况下，可以使用扩增子介导的探针测定(AMP测定)进行这种TAPE反应中扩增的检测。这样的测定在US2015/0148250中进一步描述，通过引用将其全部内容并入本文用于所有目的。

在一些情况下，提供或产生多个混合物分区；并且进行分裂循环反应混合物，TAPE扩增反应或其组合以分别检测多个混合物分区中的野生型和突变型靶DNA模板分子，由此检测对于突变而非野生型靶DNA模板的存在呈阳性的混合物分区的数量，对于野生型而非突变型靶DNA模板的存在呈阳性的混合物分区的数量，对突变和野生型靶DNA模板两者的存在呈阳性的混合物分区的数量，以及对突变和野生型靶DNA模板的存在呈阴性的混合物分区的数量。该方法可以进一步包括从单阳性，双阳性和阴性混合物分区的数量确定核酸样品中突变序列的频率。

c.一般划分方法

可以对TAPE反应混合物，分裂循环反应混合物或其中进行TAPE和分裂循环方法或其元素的反应混合物进行该部分中描述的划分方法。

分区可包括多种类型的分区中的任一种，包括固体分区(如孔，反应腔，或管)和流体分区(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中，分区是液滴。在一些实施方式中，这些分区是微通道。划分样品的方法和组合物描述于，例如，公开的专利申请WO 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US 2011/0092376，其全部内容各自通过引用纳入本文。

在一些方面，选择分区的数量以确保少数，明显少数，几个，基本不存在或不存在分区含有多个靶模板分子，同时含有野生型和突变靶模板分子，或两者。在一些方面，选择分区的数量以确保定量数字扩增测定不饱和(即，仍然存在不具有任何模板分子的分区)。

确保适当分区所需的分区数量取决于许多因素，包括但不限于：(a)核酸样品中模板分子的数量；(b)划分方法；和(e)所需的统计显著性。含有模板分子的核酸样品的划分使得没有或几乎没有分区含有多个模板分子，通常需要在稀释条件下划分，产生大量不含任何模板分子的“空”分区。因此，在一些实施方式中，优选在产生大量含有多个靶模板分子的分区的条件下进行划分。一般而言，分区的数量为至少约500、1000、10000或20000、30000、50000或更多。在某些情况下，只有约3-10或至少约3-10个分区不含有任何靶模板分子。在这种情况下，相当数量的分区可以包含多个靶模板分子。在某些情况下，单个分区中的多个靶模板分子包括野生型和突变型靶模板分子。在某些情况下，单个分区中的多个靶模板分子都是野生型的。在某些情况下，单个分区中的多个靶模板分子都是突变型的。

在一些实施方式中，各试剂，如盐(例如，二价阳离子)、缓冲剂、酶(例如，切割酶)、底物、核苷酸、引物等在划分前(例如，与样品)混合在一起，随后划分样品。在一些情况中，试剂包括聚合酶并且在将试剂混合在一起之后不久划分样品，使得基本上全部、或大部分的聚合酶活性出现在划分之后。在其它情况中，在聚合酶缓慢或完全不进行的温度下混合试剂，然后划分样品，并且调节反应温度以使聚合酶反应进行。例如，可在冰上、小于5℃、或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、20-25、25-30或30-35℃或更高温度下合并试剂。一般而言，本领域技术人员会知晓如何选择温度，在该温度下，一种或多种聚合酶没有活性。在一些情况中，采用温度和时间的组合以避免划分之前的明显聚合酶活性。

在一些情况中，试剂可以使用一种或多种热启动聚合酶，例如热启动DNA-依赖性DNA聚合酶混合。因此，可将缓冲剂、盐、核苷酸、标记、引物、酶等混合并划分。随后，可通过加热分区混合物以激活这一种或多种宿主启动的聚合酶来引发聚合反应，包括多轮聚合和/或扩增。

另外，试剂可混合在一起，而没有一种或多种引发酶促反应(例如，聚合和/或扩增)所必需的试剂。混合物然后可被划分到一组第一分区混合物中，然后可通过融合这组第一分区混合物和提供必要试剂的一组第二分区混合物来提供一种或多种必要试剂。替代地，可向第一分区混合物中加入必要试剂，而不形成第二分区混合物。例如，必要试剂可分散到第一分区混合物油包水液滴的组中。作为另一个示例，缺失的试剂可加入含有所述第一分区混合物组的一组微通道中。

在一些实施方式中，试剂可混合在一起以形成反应混合物并被划分。随后，可向分区中加入一种或多种其它试剂。例如，可向分区中注射一种或多种试剂。在一些情况中，可向分区和流体之间的界面施加电场以打破界面并使至少一部分的流体进入分区。作为另一个示例，一种或多种试剂可通过微流体技术导向微米或纳米尺寸孔中的分区中。用于向分区注射试剂的方法、组合物和装置包括但不限于WO/2010/0151776所述的那些。可通过融合分区，注射，微流体或其他手段添加的试剂包括但不限于扩增试剂，检测试剂或其组合。例如，可向分区中加入DNA依赖性DNA聚合酶(和任选的一种或多种引物)以扩增分区中的靶模板核酸。

在一些实施方式中，液滴包含乳液组合物，即不互溶的流体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中，液滴是水性液滴，其被不互溶的运载体流体(如油)包围。在一些实施方式中，液滴是油性液滴，其被不互溶的运载体流体(如水性溶液)包围。在一些实施方式中，本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中，由样品生成的液滴中少于0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝，一种分散相从薄片中悬浮液产生的过程。在一些实施方式中，通过使油相流过包含一种或多种本文所述组合物的含水样品来形成液滴。

该油相可包含氟化基础油，其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中，该基础油包括以下一种或多种：HFE7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中，该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中，该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(Krytox-AS)、Krytox FSH的铵盐或Krytox FSH的吗啉代衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox-AS的浓度是约1.62％。KrytoxFSH的吗啉代衍生物的浓度可以是约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、2.0％、3.0％或4.0％(w/w)。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.8％。在一些实施方式中，Krytox FSH的吗啉代衍生物的浓度是约1.62％。

在一些实施方式中，该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘度或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和iH，1H，2H，2H-全氟癸醇。在一些实施方式中，1H，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.50％、1.75％、2.0％、2.25％、2.5％、2.75％或3.0％(w/w)的浓度。在一些实施方式中，iH，1H，2H，2H-全氟癸醇添加至约0.18％(w/w)的浓度。

在一些实施方式中，该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴，其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊；这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如，这类转化可发生在大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间，流体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。过量的连续相油可在加热前去除或留在原位。这些微胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。

在将液滴转化成微胶囊之后，这些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下。在一些实施方式中，这些微胶囊可用于储存或运输分区混合物。例如，可在一个位置处收集样品，划分到含有酶、缓冲剂和/或引物或其它探针的液滴中，任选地可进行一个或多个聚合反应，然后可加热该分区以进行微囊化，并且可储存或运输微胶囊用于进一步分析。

微胶囊分区可以抗聚结，特别是在高温下。因此，这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的分区数)下孵育。在一些实施方式中，可每毫升孵育超过100000、500000、1000000、1500000、2000000、2500000、5000000或10000000个分区。在一些实施方式中，孵育发生在单个孔中，例如微量滴定板的孔，此时各分区之间不具有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育期间发生反应所需的其他组分。

在一些实施方式中，含有一种或多种本文所述组合物的样品被分成至少500个分区，至少1000个分区，至少2000个分区，至少3000个分区，至少4000个分区，至少5000个分区，至少6000个分区，至少7000个分区，至少8000个分区，至少10,000个分区，至少15，000个分区，至少20,000个分区，至少30,000个分区，至少40,000个分区，至少50,000个分区，至少60,000个分区，至少70,000个分区，至少80,000个分区，至少90,000个分区，至少100,000个分区，至少200,000个分区，至少300,000个分区，至少400,000个分区，至少500,000个分区，至少600,000个分区，至少700,000个分区，至少800,000个分区，至少900,000个分区，至少1,000,000个分区，至少2,000,000个分区，至少3,000,000个分区，至少4,000,000个部分至少5,000,000个分区，至少10,000,000个分区，至少20,000,000个分区，至少30,000,000个分区，至少40,000,000个分区，至少50,000,000个分区，至少60,000,000个分区，至少70,000,000个分区，至少80,000,000个分区，至少90,000,000个分区，至少100,000,000个分区，至少150,000,000个分区或至少200,000,000个分区。

在一些实施方式中，将含有一种或多种本文所述组合物的样品划分到足够数量的分区中，使得全部，基本上全部或至少大部分分区具有不超过1个突变靶模板分子。

在一些实施方式中，生成的乳液液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如，在一些实施方式中，这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米或约1000微米。在一些实施方式中，生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米，或小于约25微米。在一些实施方式中，生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。

在一些实施方式中，生成的混合物分区(例如，乳液液滴分区)在体积上基本均匀。例如，混合物分区体积(例如，液滴体积)的标准偏差可以低于约1皮升、5皮升、10皮升、100皮升、1nL或低于约10nL。在一些情况中，混合物分区体积(液滴体积)的标准偏差可低于平均液滴体积的约10-25％。在一些实施方式中，生成的混合物分区(例如，液滴)的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。

实施例

对样品进行PIK3CA突变测定以检测稀有突变。图1显示用于进行分裂循环上扩增的野生型和突变特异性引物的示例性引物设计。图2显示用于进行分裂循环下扩增的野生型和突变特异性引物的示例性引物设计。图3a-b显示用于进行TAPE测定的示例性引物设计和扩增反应方案。图4显示使用常规液滴数字扩增方法(左)和如本文所述的分裂循环，TAPE，或分裂循环和TAPE测定(右侧)稀有突变检测测定所预期的一般结果。在常规测定中，双阴性液滴(黑色)，单阳性突变液滴(蓝色)，双阳性液滴(存在于液滴中的突变型野生型模板)(棕色)和单阳性野生型液滴(绿色)彼此渗透覆盖(smear)，并且难以在两种不同类型的液滴之间接界的区域可靠区分。相反，对于分裂循环和/或TAPE测定，双阴性液滴(黑色)，单阳性突变液滴(蓝色)，双阳性液滴(存在于液滴中的突变型野生型模板)(棕色)，和单阳性野生型液滴(绿色)正交地定位以增加液滴之间的分离，增加可分配给特定类别的液滴的数量。

图5示出了使用常规液滴数字扩增方法(左)和分裂循环测定(右)进行的PIK3CA检测测定的结果。图5中所示的结果来自未优化的热循环方案的反应混合物。进一步的改进可以通过使用本领域已知的常规优化方法，并且鉴于在此描述的方法和组合物，优化第一组退火和延伸温度，第二组退火和延伸温度，以及5＇-加尾和侧翼引物浓度来获得。在常规测定中，双阴性液滴(黑色)，单阳性突变液滴(蓝色)，双阳性液滴(存在于液滴中的突变型野生型模板)(棕色)和单阳性野生型液滴(绿色)彼此渗透覆盖，并且难以在两种不同类型的液滴之间接界的区域进行可靠区分。相反，对于分裂循环测定，双阴性液滴(黑色)，单阳性突变液滴(蓝色)，双阳性液滴(存在于液滴中的突变型野生型模板)(棕色)，和单阳性野生型液滴(绿色)正交地设置以增加液滴之间的分离，增加可分配给特定类别的液滴的数量，从而提高了测定的准确性和灵敏度。

虽然通过阐述和举例的方式详细描述了上述发明以清晰理解，但本发明技术人员应理解可在所附权利要求书范围内实施某些改变和修改。通过引用将本文引用的所有专利、专利申请和其它公开文献包括GenBank登录号全文纳入本文用于所有目的。

Claims (40)

1.多个混合物分区，单个混合物分区包含：

i）突变特异性5'-加尾引物对，其中突变特异性5'-加尾引物对与靶DNA模板分子杂交并特异性扩增靶DNA模板分子，所述靶DNA模板分子来自包含如果存在的突变靶序列的核酸样品，其中所述突变特异性5'-加尾引物对的引物包含：

a）长度为至少10个核苷酸且小于30个核苷酸的3'杂交区域，其与突变靶序列特异性杂交；和

b）长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的突变特异性5'尾区，其不与核酸样品中的任何核酸片段杂交；

ii）野生型特异性5'-加尾引物对，其中野生型特异性5'-加尾引物对杂交并特异性扩增包含如果存在的野生型靶序列的靶DNA模板分子，其中所述野生型特异性5'-加尾引物对的引物包含：

a）长度为至少10个核苷酸且小于30个核苷酸的3'杂交区域，其与野生型靶序列特异性杂交；和

b）长度为至少10个核苷酸且不超过30个核苷酸的野生型特异性5'尾区，其不与核酸样品中的任何核酸片段杂交，其中野生型特异性5'尾区是与突变特异性5'尾区不同的序列；和

iii）突变特异性侧翼引物对，其中所述突变特异性侧翼引物对杂交并特异性扩增包含如果存在的突变特异性5'-加尾引物对的5'尾区的扩增子；

iv）野生型特异性侧翼引物对，其中所述野生型特异性侧翼引物对杂交并特异性扩增包含如果存在的野生型特异性5'-加尾引物对的5'尾区的扩增子；和

v）热稳定聚合酶，其中

所述多个混合物分区的至少1-10个混合物分区含有包含野生型或突变型靶序列的靶DNA模板分子；并且

所述多个混合物分区的至少3-10个混合物分区不包含靶DNA模板分子。

2.如权利要求1所述的多个混合物分区，其中所述混合物分区包含乳液液滴。

3.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述混合物分区包含核苷酸三磷酸酯、缓冲剂、和二价阳离子。

4.如权利要求3所述的多个混合物分区，其中所述热稳定聚合酶包含3’至5’外切核酸酶活性。

5.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述多个混合物分区中的至少10%并且不超过90％包含多个靶DNA模板分子。

6.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述混合物分区中的靶DNA模板的平均浓度为0.00005至20个拷贝/分区。

7.如权利要求6所述的多个混合物分区，其中所述混合物分区中的靶DNA模板的平均浓度为1至5个拷贝/分区。

8.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述混合物分区中的靶DNA模板中的至少一个包含突变靶序列。

9.如权利要求8所述的多个混合物分区，其中所述混合物分区中的靶DNA模板的至少0.005%并且不超过50%包含具有突变靶序列的靶DNA模板。

10.如权利要求8所述的多个混合物分区，其中所述混合物分区中的至少1%包含具有突变靶序列的靶DNA模板和具有野生型靶序列的靶DNA模板。

11.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述多个包括500至10,000,000个混合物分区。

12.如权利要求11所述的多个混合物分区，其中所述多个包括500至200,000个混合物分区。

13.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域分别具有至野生型和突变靶DNA模板分子的退火温度，所述温度比突变特异性和野生型特异性侧翼引物的退火温度低至少5℃。

14.如权利要求13所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域分别具有至野生型和突变靶DNA模板分子的退火温度，所述温度比突变特异性和野生型特异性侧翼引物的退火温度低5至20℃。

15.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域分别具有至野生型和突变靶DNA模板分子的退火温度，所述温度低于55℃。

16.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域的长度是12-18个核苷酸。

17.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型侧翼引物对的引物具有至分别含有野生型和突变靶序列的扩增子的退火温度，所述温度为至少45℃。

18.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的5’尾区的长度是15-25个核苷酸。

19.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述多个混合物分区包含1个野生型和突变型5’-加尾引物对/10000个野生型和突变型侧翼引物对至1个野生型和突变型5’-加尾引物对/2个野生型和突变型侧翼引物对。

20.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域分别具有至野生型和突变靶DNA模板分子的退火温度，所述温度比突变特异性和野生型特异性侧翼引物的退火温度高至少5℃。

21.如权利要求13所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域分别具有至野生型和突变靶DNA模板分子的退火温度，所述温度比突变特异性和野生型特异性侧翼引物的退火温度高5至20℃。

22.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域分别具有至野生型和突变靶DNA模板分子的退火温度，所述温度高于50℃。

23.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域分别具有至野生型和突变靶DNA模板分子的退火温度，所述温度高于55℃。

24.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的3’杂交区域的长度是12-18个核苷酸。

25.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型侧翼引物对的引物具有至分别含有野生型和突变靶序列的扩增子的退火温度，所述温度低于55℃。

26.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述野生型和突变型5’-加尾引物对的5’尾区的长度是8-15个核苷酸。

27.如权利要求1或2所述的多个混合物分区，其中所述多个混合物分区包含10000个野生型和突变型5’-加尾引物对/1个野生型和突变型侧翼引物对至2个野生型和突变型5’-加尾引物对/1个野生型和突变型侧翼引物对。

28.一种用于定量核酸样品中野生型和突变型靶核酸片段的频率的非诊断用途的方法，所述方法包括：

A）形成权利要求1-27中任一项所述的多个混合物分区；

B）在适于通过聚合酶链式反应扩增靶DNA模板分子的热循环条件下孵育所述混合物分区，其中所述热循环条件包括第一组温度循环和第二组温度循环，其中所述第二组温度循环包括比所述第一组温度循环的退火温度高或低至少5℃的退火温度；

C）检测混合物分区中扩增的靶DNA模板的存在或不存在，其中所述检测包括，由此确定：

i）包含由野生型靶序列组成的扩增的靶DNA模板的野生型混合物分区的数量；

ii）包含由突变型靶序列组成的扩增的靶DNA模板的突变型混合物分区的数量；和

iii）包含扩增的靶DNA的双阳性混合物分区的数量，所述扩增的靶DNA包含突变型和野生型靶序列；并且

D）根据野生型，突变型和双阳性混合物分区的数量确定核酸样品中野生型和突变型靶核酸片段的频率。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述第二组温度循环包括比所述第一组温度循环的退火温度高至少5℃的退火温度。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述第二组温度循环包括比所述第一组温度循环的退火温度低至少5℃的退火温度。

31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述第一循环条件包括2-15个循环。

32.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述第二循环条件包括10-50个循环。

33.一种用于定量稀有突变检测的非诊断用途的方法，所述方法包括：

i）提供权利要求1-27中任一项所述的多个混合物分区；

ii）进行分裂循环测定，TAPE测定或其组合以分别检测多个混合物分区中的野生型和突变靶DNA模板分子，从而检测对突变体的存在呈阳性但不对野生型靶DNA模板的存在呈阳性的混合物分区的数量，对野生型的存在呈阳性但不对突变型靶DNA模板的存在呈阳性的混合物分区的数量，对突变型和野生型靶DNA模板的存在都呈阳性的混合物分区的数量，以及对突变型和野生型靶DNA模板的存在呈阴性的混合物分区的数量；和

iii）从单阳性，双阳性和阴性混合物分区的数量确定核酸样品中突变序列的频率。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述多个混合物分区包含至少500个并且不超过10,000,000个混合物分区。

35.如权利要求33所述的方法，其中所述多个混合物分区包含至少500个并且不超过200,000个混合物分区。

36.如权利要求33所述的方法，其中：

所述多个混合物分区的至少1-10个混合物分区含有包含野生型或突变型靶序列的靶DNA模板分子；并且

所述多个混合物分区的至少3-10个混合物分区不包含靶DNA模板分子。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述多个混合物分区中的至少10%并且不超过90%包含多个靶DNA模板分子。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述混合物分区中的靶DNA模板的平均浓度是0.00005至20个拷贝/分区。

39.如权利要求36所述的方法，其中所述混合物分区中的靶DNA模板的平均浓度是1至5个拷贝/分区。

40.如权利要求36所述的方法，其中所述多个混合物分区中的至少1%并且不超过50%包含突变靶序列。

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