JP2004533256A - ウイルス検出方法、ウイルス検出用プライマー、及びスクリーニングキット - Google Patents
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Abstract
自己プロービング型アンプリコンを用いたリアルタイムＰＣＲに基づいた、ヒトパピローマウイルスなどのウイルスの新規な検出及び型判定方法を開示する。
本発明の方法は、（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程（該自己プロービング型アンプリコンは、（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有するとともに該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、（ｉｉｉ）ウイルスシグナリングシステムであって、前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能な信号を発生することによって前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が前記検出可能信号によって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する）と、（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能信号が発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記ウイルスプローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程と、からなる。この方法は、迅速、簡単かつ特異的で高感度であり、細胞当たりのウイルス負荷を推定することが可能である。細胞系、生検材料、及び子宮頚部の細胞ブラシ試料について１００以上のＨＰＶ型判定反応を行った結果では、現在用いられているＨＰＶの検出及び型判定法と比較した場合のκ値は０．８９である。本発明の方法はＳＶ４０などの他のウイルスに適用することも可能である。
本発明の方法は、（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程（該自己プロービング型アンプリコンは、（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有するとともに該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、（ｉｉｉ）ウイルスシグナリングシステムであって、前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能な信号を発生することによって前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が前記検出可能信号によって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する）と、（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能信号が発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記ウイルスプローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程と、からなる。この方法は、迅速、簡単かつ特異的で高感度であり、細胞当たりのウイルス負荷を推定することが可能である。細胞系、生検材料、及び子宮頚部の細胞ブラシ試料について１００以上のＨＰＶ型判定反応を行った結果では、現在用いられているＨＰＶの検出及び型判定法と比較した場合のκ値は０．８９である。本発明の方法はＳＶ４０などの他のウイルスに適用することも可能である。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス、殊にヒトパピローマウイルスやＳＶ４０などの哺乳動物において発癌との関連が指摘されるウイルスの検出、型判定、及びキャラクタリゼーションを行うための改良法、ならびに本方法において使用するプライマー及びプローブに関するものである。本発明は更に診断キットならびに当該キットを利用したスクリーニング法に関するものである。
【０００２】
発癌性との関連が指摘される各種のウイルスが存在し、このため臨床試料中のこうしたウイルスの存在を特定する必要があるが、同様に重要な点として、細胞当りのウイルス負荷や、感染生物（最も重要なものはヒトである）におけるウイルスの組み込み状態を正確に判定することがある。したがって、感染ウイルスの型、ウイルス負荷（細胞当り、すなわち細胞当りのウイルスのコピー数、またはウイルスゲノム：ヒトゲノムの比）、ならびにウイルスの組み込み状態（ウイルスＤＮＡが細胞のサイトゾル中で「遊離」しているかホストのゲノムに組み込まれているか）を判定するための手段が与えられることが、こうした因子によって患者の診断についての重要な知見が得られることから望まれている。
【０００３】
こうした点について、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及びＳＶ４０の２つのウイルスカテゴリーを例に先ず説明する。
【０００４】
子宮頚癌は世界的に女性における癌死の頻度では第２位に位置するものである。子宮頚癌の発生率は子宮頚部スクリーニングプログラムによって低減したものの、侵襲性子宮頚癌の５０％は従来の細胞診断法を用いてスクリーニングを行った女性で発生している。近年、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の特定のサブセットの子宮頚癌への関与が指摘されており、これらの癌の９９％以上においてＨＰＶのＤＮＡが存在することが示されている。ＨＰＶでは現在８４種類の型が知られているが、このうち約３０種が生殖管に感染する。このことから、現在の細胞診断的スクリーニングレジメの補助手段または代替手段として、ＨＰＶの検出及び型判定を行う方法が検討されている。こうした手法の成否が、臨床的に応用可能な迅速、高信頼度、高感度、かつ特異的なＨＰＶの検出法の開発にかかっていることは云うまでもない。
【０００５】
現在、ＨＰＶの検出及び型判定を行う主な手法として８つの方法が知られているが、そのいずれも用途に応じた長短を有するものである。それらを表１にまとめたが、いずれも臨床及び研究の両側面において最適な方法とはいいがたいことが理解される。こうした技術の背景として、臨床試料中のＨＰＶ ＤＮＡの検出法では最も高感度なものとしてＰＣＲ法が導入された。しかしながら、遺伝子型の異なるＨＰＶ間ではヌクレオチドレベルでの相違が顕著であることから、ＨＰＶのすべての遺伝子型を検出することが可能な簡単かつ汎用性の高いＰＣＲテストの開発は困難であった。こうした状況にも関わらず、各種のＨＰＶ ＰＣＲ法が開発され、主として粘膜型のＨＰＶ遺伝子型を広範に検出することが可能となった。
【０００６】
【表１】
【０００７】
ＨＰＶの遺伝子は早期（Ｅ）と晩期（Ｌ）遺伝子からなり、機能的に幾つかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に区分される。すなわち早期遺伝子として、ウイルス複製に係るもの（Ｅ１）、転写の調節に係るもの（Ｅ２）、細胞質タンパク質をコードするもの（Ｅ４）、及び悪性形質転換に係るもの（Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、また晩期遺伝子としてカプシドタンパク質をコードするもの（Ｌ１、Ｌ２）である。
【０００８】
共通配列プライマーであるＧＰ５とＧＰ６の組合わせは、もともとＨＰＶ−６、−１１、−１６、−１８、−３１、及び−３３からの配列情報に基づいてＨＰＶ Ｌ１領域から選択されたものであるが、ミスマッチを許容する条件下で少なくとも２７種類の粘膜型ＨＰＶ遺伝子型の標的ＤＮＡを増幅することが知られている。共通配列プライマーＧＰ５（５’−ＴＴＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＣ−３’）及びＧＰ６（３’−ＡＣＴ ＡＡＡ ＴＧＴ ＣＡＡ ＡＴＡ ＡＡＡ ＡＧ−５’）（Snijders et al., J. Gen. Virol. 71 173-181 (1990)）は、広範囲のＨＰＶ遺伝子型でＬ１オープンリーディングフレームの１４０〜１５０ｂｐの領域にわたる部分であり、共通配列プライマー介在型ＰＣＲで使用されてきた。この方法（ＧＰ−ＰＣＲ）の強みは、オランダにおいて細胞形態学的にＰａｐＩＶ（上皮内癌）及びＰａｐＶ（癌）として分類される頚管擦過細胞の１００％にＨＰＶ ＤＮＡが検出されたことで更に実証されている。このことは、オランダではすべての生殖管高危険型ＨＰＶをこのアッセイで検出可能なことを示唆するものである。
【０００９】
しかしながら、日常的な診断にＧＰ−ＰＣＲを用いる場合、臨床試料の数が少ない場合には、結果が不明瞭となることが示された。これは低強度のＧＰ−ＰＣＲシグナルに同時に増幅された細胞ＤＮＡの比較的高強度のバックグラウンドが重なるためである。その後、プライマーの長さを大きくすることによってより効率的な増幅が行われることが示されたことから、ＧＰ５及びＧＰ６プライマーを３’末端を高度に保存された配列として延長することが行われた。こうしたＧＰ５＋及びＧＰ６＋プライマーのＰＣＲにおける使用を、異なるＨＰＶウイルス型の長いクローンＤＮＡについてもともとのＧＰ５及びＧＰ６を用いてＰＣＲを行った場合と比較を行った結果、これらの延長された共通配列プライマーの感度は大幅に向上していることが分かった。
【００１０】
ＰＣＲに基づくＨＰＶ検出及び型判定を容易にするため、比色分析型マイクロタイタープレートを用いたハイブリダイゼーションアッセイが開発された。この方法はＧＰ−ＰＣＲにおいて１種類のビオチン化プライマー（ｂｉｏ−ＧＰ６＋）を使用するものである。ビオチン化されたＰＣＲ産物をストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート上に固定、変性した後、ジゴキシゲニン標識（ＤＩＧ−）したＨＰＶ特異的内部オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。ＤＩＧ標識されたハイブリッドは酵素免疫法（ＥＩＡ）によって検出する。この方法の発展形として、ＤＩＧ標識したＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブの２種類のカクテルとＥＩＡを用いることによって、共通配列プライマーＧＰ５＋／ｂｉｏＧＰ６＋によるＰＣＲを行った後に１４種の高危険型（１６、１８、３１、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６及び６８型）及び６種の低危険型（６、１１、４０、４２、４３及び４４型）ＨＰＶを群特異的に検出する方法を開発する試みがなされてきた。以下この方法をＰＣＲ−ＥＩＡと称することとする。このような高危険／低危険（ＨＲ／ＬＲ）ＨＰＶ ＰＣＲ−ＥＩＡの感度は、ＨＰＶの型に応じてＨＰＶコピー数で１０〜２００コピーの範囲である。
【００１１】
ＨＰＶ ＤＮＡに対する蛍光プローブアッセイには、増幅されたＤＮＡに結合する遺伝子型特異的プローブを用いて、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３及び−３５型のＤＮＡのＬ１オープンリーディングフレームの一部をＰＣＲ増幅することに基づいたものがある。ＴａｑＭａｎアッセイでは、各プローブを３’末端でブロックすることでポリメラーゼによる伸長を阻止する。プライマー伸長反応においてＴａｑポリメラーゼが結合プローブと接触すると、ポリメラーゼの５’→３’方向のエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解され、３’末端側のクエンチャーから５’末端側のフルオロフォアが遊離する。これによりレポーターが発する蛍光量が増大するが、この蛍光量は過剰量のプローブの存在下で、増幅前に試料中に存在するＨＰＶ ＤＮＡの量に直接関係している。「分子ビーコン」はヘアピンループ構造を有するプローブであり、このヘアピンループ構造はフルオロフォアとクエンチャーを近接状態で保持しているが、プローブが標的に特異的に結合するとヘアピンループが開いて蛍光信号が発生する。
【００１２】
一般に、ＨＰＶ ＤＮＡは子宮頚部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）病変ではエピソーム型として存在し、侵襲性癌ではウイルスＤＮＡは主としてホストゲノムに組み込まれている。子宮頚癌の多くではＨＰＶゲノムはホスト細胞の染色体に組み込まれ、ウイルスの配列と細胞の配列を含んだｍＲＮＡに転写される。これに対し、早期の前癌病変ではＨＰＶゲノムはエピソームの状態のままであり、これから生ずる転写産物はウイルスの配列のみを有している。したがって、組み込まれた状態のＨＰＶゲノムから生じたＨＰＶ転写産物が検出されることによって、憎悪の危険性が高いＣＩＮ病変ならびに侵襲性癌が具体的に示されるものと考えられる。
【００１３】
ＨＰＶ ＤＮＡが細胞の染色体に組み込まれる際、通常Ｅ２のＯＲＦの一部が失われ、Ｅ６及びＥ７のｍＲＮＡの発現の抑制が解除される。生じたＥ６及びＥ７タンパク質によって一部の癌遺伝子が活性化され、かつ／または、ホストの腫瘍抑制遺伝子産物（ｐ５３、ｐＲＢ）が不活性化されることによって細胞増殖が制御不能となり悪性形質転換が起きる。
【００１４】
したがってＨＰＶ ＤＮＡの組み込みは子宮頚癌の発癌過程における重要な遺伝子変化と考えられ、組み込みのレベルが決定可能であることは診断上重要な意味を持つと考えられる。このため一部の検出方法では、早期遺伝子、特にＥ１／Ｅ２及びＥ６／Ｅ７の阻害の特定、定量化に主眼をおいている。これらの方法は、マルチプレックスＰＣＲ（各配列に対するプライマーが同じ反応に含まれる）や組み込まれた状態のウイルスゲノム及びエピソームとして存在するウイルスゲノムから生じるＨＰＶのｍＲＮＡの区別を可能とするＲＴ−ＰＣＲなどの方法を用いて行われてきた。
【００１５】
したがって従来知られていた方法では複数の技術及び／またはプローブを用いてＨＰＶ型及び組み込み状態を検出する必要があったが、これは時間がかかり、遅く、一般に臨床用途には不向きである。更に、これらの方法のいずれも、細胞当りのウイルスのコピー数を与えるものではないことから、ウイルス負荷の決定において充分といえるものではない。これらのシステムではウイルスのコピー数と細胞のコピー数を定量化するのに異なる方法が用いられており、したがって２つのものは厳密には同等ではない。β−グロブリンやゲノムＤＮＡの他のハウスキーピング遺伝子についてのアッセイを行う従来の方法は、細胞当りではなく、１マイクログラムの細胞ＤＮＡ当りのウイルスＤＮＡコピー数の範囲を与えるものでしかない。ハウスキーピング遺伝子の他の用途はＰＣＲのコントロールとしてか、またはＰＣＲの検出限界を決定するためのものであり、ウイルス負荷に関する情報を与えるためのものではなかった。
【００１６】
ＨＰＶによって引き起こされる別の疾患として再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）がある。この疾患は喉頭では最も普通に見られる良性腫瘍であり、充分な治療法の確立されていない深刻な病態であって約２〜７％が悪性形質転換する。ＲＲＰはＨＰＶ−６及びＨＰＶ−１１の２種類のＨＰウイルスによって引き起こされるが、これらのウイルスは正常な学齢児童の５０％以上において中咽頭に検出されることからホスト側の因子の重要性は明らかである。
【００１７】
ＨＰＶの感染は若年発症型ＲＲＰでは産道の通過時に、成年発症型ＲＲＰでは口−性器の接触によって媒介されると考えられている。この疾患を有する患者では明らかな免疫不全は見られない。
【００１８】
癌、特に中皮腫（胸部及び肺内層の中皮細胞の癌）に関連があるとされているウイルスの別の例として、Ｓｉｍｉａｎ猿で最初に発見されたことに因んで命名されたサル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）がある。このウイルスは初期のポリオワクチンの夾雑物として発見され、かつては人体には無害であると考えられていたが、実験動物で腫瘍を引き起こすことが確認され、以来、骨肉腫、脳下垂体、甲状腺、脳及び神経系の腫瘍（例、グリア芽細胞腫、星状細胞腫、脳室上衣腫、及び脈絡叢乳頭腫）との関連が指摘されている。細胞当り１コピーのＳＶ４０によって細胞がトランスフォームしうると考えられることから、現在ではＳＶ４０はＨＰＶよりも腫瘍形成性が高いと考えられている。それにもかかわらず、ＳＶ４０が関与する中皮腫は成長に２０〜４０年を要するが、その悪性度は極めて高く、患者は約１８ヶ月で死に至り、米国のみで毎年約３０００人が生命を落としている。
【００１９】
ＳＶ４０の高い腫瘍形成性は、このウイルスが極少量の「ラージＴ抗原」を産生し、これがｐ５３及びＲｂ調節経路の双方を同時に遮断することによるものとされている。これに対し、ＨＰＶでは両経路を遮断するのに２種類の物質（Ｅ６及びＥ７）を産生しなければならない。ＳＶ４０はまたＤＮＡの再編成によって染色体を傷害する。したがってＳＶ４０についてもこれを正確に検出、型判定、定量化（細胞当りのウイルス負荷、及び組み込み状態）することが可能な方法が求められている。
【００２０】
脳室上衣腫、及び脈絡叢乳頭腫におけるＳＶ４０様配列の検出にもともと用いられていたＰＣＲ法が、現在ではヒト胸膜中皮腫におけるＳＶ４０の存在を確認するための重要な方法として当該分野の大多数の研究者によって用いられている。この方法では、腫瘍試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡの質とその中に何らかのＳＶ４０ ＤＮＡ様配列が存在するかを確認するように設計されたプライマーによってこのＤＮＡをＰＣＲ増幅することを行う。
【００２１】
最も頻繁に用いられるプライマー（ＳＶ＝順方向、３／ＳＶ＝逆方向）は、ラージＴ抗原のＲｂ、ｐ１０７、及びＲｂ２／ｐ１３０結合ドメインをコードする配列を増幅するように設計されたものである。異なる研究者によるこの方法を用いたＳＶ４０の検出率は、０％〜１００％の範囲で異なるが（Jasani et al., Fron in Biosci 6 e12-22(2001)）、これはＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅、及び生成物の検出方法の効率が異なることに少なくとも一部よるものである。
【００２２】
ウイルス負荷の検出についても、ＰＣＲ反応１回当りのＳＶ４０ゲノムのコピー数は１〜１００コピーの範囲で異なる結果が得られ、この範囲の下限が、すべての場合において、ＰＣＲ反応１回当りではなく、細胞当りのウイルスコピー数を含んでいるか否かは不明である。ＳＶ４０のＴ抗原配列を標的としたプローブに基づいたサザンブロットを行うことによって感度が向上することが示された。また複数の研究者により、複数のプライマーのセットを用いてゲノムの異なる部分のゲノム配列ならびに配列に固有な変異が特定された。こうした研究にもかかわらず、ヒト組織で検出されたＳＶ４０ＤＮＡが真にＳＶ４０に由来するものであるかについては疑義が残り、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の援助を受けた９つの研究機関が関わった共同研究を組織する必要が生じた。
【００２３】
こうした事情を鑑み、本発明は以下「自己プロービング型アンプリコンを用いたウイルス評価法」（"Viral Evaluation using Self-Probing Amplicons"（ＶＥＳＰＡ））と称するウイルス型判定のための新規な方法を提供するものである。ＶＥＳＰＡは自己プロービング型のアンプリコンプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲに基づく方法である。自己プロービング型のアンプリコンプライマーについてはウィトコム等によって述べられている（Whitcombe et al, Nat Biotechnol 17 804-7 (1999)）。
【００２４】
自己プロービング型アンプリコンプライマーは特異的プローブ配列であり、プローブの５’末端及び３’末端部分に存在する相補的なステム配列によってヘアピンループ形状に保持されたプローブ配列である。ループの５’末端に結合させられたフルオロフォア（６−カルボキシフルオレセインなど）が３’末端に結合した部分（メチルレッドなど）によって消光される。このヘアピンループはＰＣＲストッパーまたはブロッカーを介してプライマーの５’末端に結合される。ＰＣＲ増幅反応でプライマーが伸長されると、特異的なプローブ配列は同じＤＮＡ鎖上の相補的部分と結合することが可能となる。このハイブリダイゼーションによってヘアピンループが開環するために、蛍光が消光されなくなってシグナルが増大する。プライマー上のＰＣＲストッパーによってプローブまでの読み取りは防止されるので、ヘアピンループは特異的な標的配列の非存在下でも開環する。プローブまでの読み取りが起こった場合には、プライマー二量体やミスプライミングなどによる非特異的ＰＣＲ産物が検出されることになる。
【００２５】
すなわち、本明細書で用いる「自己プロービング型アンプリコン」なる用語は、上記の記載またはウィトコム（Whitcombe (1999)前出）に述べられるように、プライマー要素、プローブ要素、及びシグナリング要素（上述のフルオロフォア／クエンチャーシステムか別のシステムが用いられる）からなる分子を指すものである。すなわち、従来使用されてきた「分子ビーコン」やＴａｑＭａｎプローブと異なり、自己プロービング型アンプリコンシステムでは別個のプローブを必要としない。自己プロービング型アンプリコンは一分子的に動作し、「分子ビーコン」及びＴａｑＭａｎによる二分子プロービングと比較して単純性及び信号対雑音比の両面から見て利点を有する。更にこうした自己プロービング型アンプリコンを、プローブがミスマッチを有する標的とは解離しているが、相補的な標的とは結合したままとなっている温度における蛍光をモニタリングすることによって突然変異または対立遺伝子の区別を可能とするように改変することが可能である。これは、ウィトコム（Whitcombe）等によって述べられる自己プロービング型アンプリコンによる対立遺伝子の区別とは異なっているが、これはウィトコム等はＡＲＭＳシステムを採用しており、これによって部位が特定されるのは多型部位上のプライマーの部位であってプローブではないためである。
【００２６】
ＶＥＳＰＡ法は、迅速、高特異的、高感度、再現可能な検出を簡単に行え、ウイルス負荷を測定できる可能性を有することからウイルス検出に適している。本発明の方法については既に試験が行われており、異なる細胞系、子宮頚管擦過細胞試料、及び腫瘍生検試料を含む１０８検体の試料について型判定の結果を得るとともに、１６検体の臨床的に定義される試料について細胞当りのウイルス負荷の予備データを得ている。これに関しては実施例において後述する。
【００２７】
更に、従来の最先端のウイルス検出法及び型判定法であるＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（商標）及びＰＣＲ−ＥＩＡの双方と比較して、ＶＥＳＰＡはともなう労力が小さく、かつより迅速に結果が得られるようである。細胞系におけるＶＥＳＰＡの感度は、食品医薬品局（米国ＦＤＡ）によってＨＰＶのスクリーニングにおける使用が認可されているＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（商標）（ダイジーン・コーポレーション（Ｄｉｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）メリーランド州、シルバースプリング所在）に関してダイジーン社によって報告されている結果（５０００コピー）と比較して最低でも２桁高い。ＶＥＳＰＡは、ゲノムＤＮＡの低バックグラウンドノイズに対して濃縮コントロールターゲットを用いて検出限界を算出するＰＣＲ−ＥＩＡ（ウイルスコピー数が１〜１００の範囲）などのこれまでに開示されている他のＨＰＶ検出法と同等の感度を有する。発癌の直接的リスクとなる正確なウイルスコピー数の閾値については議論の余地があるところであるが（またＨＰＶの型や患者によっても異なりうるが）、ＶＥＳＰＡによる検出下限よりもはるかに高い値であると考えられる。
【００２８】
子宮頚管試料において効率的なＤＮＡ増幅を阻害する阻害物質（例、ヘモグロビン）の存在が以前から報告されている。発明者等は標準的なクロロフォルム抽出法に基づいたＤＮＡ精製法を用い、ＶＥＳＰＡによって生ずるシグナルを増大させることによって、通常ＰＣＲ−ＥＩＡとともに用いられる凍結融解法によって精製した場合には弱陽性しか示さない子宮頚部スミア試料中のＨＰＶの検出が可能であることを実証した。ＶＥＳＰＡは型特異的な方法であり、試料を単に「低危険」及び「高危険」ＨＰＶ型に分類するだけのＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）と比較して好ましい。発明者等の研究によれば、ＶＥＳＰＡを用いて可能なＨＰＶの型判定は、最も確立されたＨＰＶの型判定法であるＰＣＲ−ＥＩＡ（κ＝０．８９）を用いて得られたデータとの相関性が高い。
【００２９】
ＳＶ４０の場合に見られるような、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲでしばしば生ずる偽陽性を防止するため、極めて低いウイルスコピー数の検出を目的とした高感度の第１回目の増幅と特異性の高い第２回目の増幅を行うアッセイを行うことが可能である。この第１回目の増幅で用いるプライマー部位は公知の既に確立されたプライマー部位に基づいたものでよい。ＳＶ４０では、各アッセイが同等となるようにプライマー及びプローブはいずれも各ウイルスのラージＴ抗原部位を標的としたものであることが好ましい。第２段階では自己プロービング型アンプリコンプライマーとリアルタイムＰＣＲを用いることによって増幅と検出を同時に行う。
【００３０】
検出や型判定に加え、ＶＥＳＰＡではウイルス負荷を推定することが可能である（存在するウイルスの全体量ではなく、細胞当りの）。細胞当りのウイルス負荷は患者の診断において重要な決定因子であることの証左が多く示されている。実際、例えばいわゆる「高危険」型が高危険度であるのは、その悪性転換タンパク質の発癌性が高いためではなく、単にこれらのウイルスの増殖がより効率的であり、免疫応答を凌駕することによるものである可能性がある。
【００３１】
ウイルスのスクリーニングにおけるＶＥＳＰＡの使用の可能性を広げるため、本発明ではテール付加した共通配列プライマーと組み合わせて使用するための変性した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ウイルス自己プロービング型アンプリコンの混合物を更に提供する。テール付加プライマーの使用により、１種類の自己プロービング型アンプリコンによって多くの異なるウイルス増幅産物を認識することを可能とするコンセンサス部位を導入することが可能である。理論的にはこのプライマーの組合わせによって４０以上の異なるＨＰＶの型を検出することが可能である。
【００３２】
ジャコブ等（Jacobs et al., J Clin Microbiol 35, 791-5 (1997)）によって述べられるＰＣＲ−ＥＩＡ法では、ウイルスＤＮＡを従来技術であるコンセンサスプライマー（ＧＰ５＋／ＧＰ６＋）を用いて増幅した後、電気泳動を行ったアガロースゲルをエチジウムブロマイド染色によって分析する。増幅産物が観察されれば、型特異的プローブを用いたＥＬＩＳＡによって型判定する。しかし実際には、アガロースゲル電気泳動の感度は増幅が不十分なＤＮＡを検出できるほどには充分に高くないため、すべての試料はＥＬＩＳＡによって型判定が行われる。ＶＥＳＰＡによれば予備的な型判定段階での感度が高くなることによってこの問題を回避することができる。テール付加プライマーの考え方は公知のものであるが、テールをプライマー部位として、またこのプライマーを自己プロービング型アンプリコンのプローブ結合部位として利用するという考え方は新規なものである。
【００３３】
したがってヒトパピローマウイルスやＳＶ４０の感染などのウイルスのキャラクタリゼーションを行うための本発明の方法は、現時点で利用可能な方法と比較した場合に、より迅速（＜１時間）、より特異的（塩基１個での区別が可能）、かつより少ない手間（一段階）で行うことが可能であり、また多くの方法と異なり、細胞当りのウイルス負荷の推定が可能である。本方法はまたウイルスの組み込み状態を調べるために使用することも可能である。特に重要な点としては、本発明の方法ではテール付加プライマーを用いることにより複数のウイルス型の決定が可能な点である。
【００３４】
本発明を図面を参照しながら以下に説明する。
【００３５】
したがって本発明は、１以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる哺乳動物などの動物から得られる試料中の哺乳動物ウイルスを含む動物ウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有するとともに該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）ウイルスシグナリングシステムであって、前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能な信号を発生することによって前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が前記検出可能信号によって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能信号が発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記ウイルスプローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程と、からなる方法を提供するものである。（この方法は図８及び９に概略的に示されている。）
本発明においては、核酸配列がＤＮＡ配列であるような方法が特に好ましい。
【００３６】
細胞当たりのウイルス負荷を求めるうえで特に有効であるよう、本方法は細胞のハウスキーピング遺伝子のＤＮＡを検出するように設計された自己プロービング型アンプリコンを用いて行われることが好ましい。本発明で用いる「細胞ハウスキーピング」または「ハウスキーピング」遺伝子とは、細胞中に安定的に存在することから試料中における細胞の存在を示すベースラインの指標とするのに適当な遺伝子のことである。
【００３７】
したがって本発明は更に、１以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる試料中のウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が該検出可能シグナルによって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記プローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程と、
（ＩＩＩＡ）前記試料から得られたハウスキーピング核酸配列を自己プロービング型アンプリコン（「ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）前記ハウスキーピング核酸配列とハイブリダイズ可能なハウスキーピングプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてハウスキーピングプライマー伸長産物を生成するハウスキーピングプライマーと、
（ｉｉ）ハウスキーピングプローブであって、前記プローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ハウスキーピングプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なハウスキーピングプローブと、
（ｉｉｉ）前記ハウスキーピングプローブ配列が前記ハウスキーピングプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ハウスキーピング核酸配列の有無が前記検出可能シグナルによって示されるハウスキーピングシグナリングシステムと、を有する；と
（ＩＩＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＶ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＩＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＶ）前記ハウスキーピング核酸配列から前記ハウスキーピングプライマー伸長産物を分離し、前記ハウスキーピングプローブをハウスキーピングプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記ハウスキーピングシグナリングシステムを監視する工程と、からなる方法を提供するものである。
【００３８】
ハウスキーピング遺伝子として適当なものとしては、β−グロブリン、アクチン、トロポミオシン、及びグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）が挙げられる。好ましくはハウスキーピング遺伝子はβ−グロブリンである。β−グロブリンは本発明による細胞当たりのウイルス負荷分析におけるヒトゲノムＤＮＡの参照遺伝子として特に好適である。
【００３９】
好ましくは、細胞当たりのウイルス負荷は、「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」がハイブリダイズする際に発生するシグナルと、「ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコン」がハイブリダイズする際に発生するシグナルを比較することによって求めることが可能である。例えば、細胞当たりのウイルス負荷は単に２つのシグナルの比として定量化することが可能である（図４及び５を参照）。
【００４０】
同じ実験でウイルスの型と細胞当たりのウイルス負荷の両方を都合よく求めるため、複数のシグナリングシステムを用いることで、ウイルスの型及びハウスキーピング遺伝子の存在をこれらのシグナルによって区別して識別することが可能である。また、（Ｉ）及び（ＩＩ）並びに（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）工程を別個の実験でそれぞれ行うことも可能である。
【００４１】
本発明の方法において好適なシグナリングシステムとしては、自己プロービング型アンプリコンが更に６−カルボキシフルオレセイン／メチルレッドなどのフルオロフォア／クエンチャーの組合わせからなる場合のように、蛍光に基づいたシステムが挙げられるが、他のシグナリングシステムを用いることも可能である。
【００４２】
増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行うことが好ましいが、本方法は別の増幅法が使用できるように適宜改変することが可能である。より好ましくはＰＣＲは「リアルタイム」にて行われる。したがって、アンプリコンの検出はリアルタイムＰＣＲ装置、特にｉサイクラー（バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、英国）を用いて行われることが好ましい。
【００４３】
自己プロービング型アンプリコンは当該技術分野では公知の任意の適当な方法によって、プローブがプライマー増幅条件下で増幅されないように改変することが可能である。例えば、自己プロービング型アンプリコンのプローブ要素までの読み取りを防止するため、プライマー要素はヘキセチルグリコール（ＨＥＧ）などの増幅ブロッカーまたはストッパーを更に含むことが好ましい。
【００４４】
標的核酸配列からのプライマー伸長産物の分離は当該技術分野における標準的方法によって行うことが可能である。好ましくは分離工程（ＩＩ）及び／または（ＩＶ）は熱変性によって行われる。
【００４５】
標的ウイルス核酸配列は動物、特に哺乳動物、特にヒトにおける疾患や臨床的状態と関連するウイルスの存在を示すことができるものであることが好ましい。特にウイルスがヒトＨＰＶである場合が好ましい。好ましくはウイルスはＨＰＶの６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、４０、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６及び６８型の１以上から選択される。
【００４６】
こうした場合、自己プロービング型アンプリコンはそれぞれＳｃ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、５１、及びＳｃ５６と名付けられた自己プロービング型ウイルスアンプリコンに対応した、配列番号１〜９より選択される配列を有するものであることが好ましい。ここでＳｃＸとは、自己プロービングＨＰＶのｘ型という意味である（後述の実施例１の表２を参照）。特に好ましいのは、プローブが上記に述べた配列、すなわち配列番号２１〜２９より選択される配列を有するプローブ要素である場合である（図１及び３を参照）。
２１ ATAAAGAGTACATGCGT
２２ CAGATTATAAGGAATACATGC
２３ AGTACCTACGACATGGG
２４ AGCAGTATAGCAGACATG
２５ GAGTATTTAAGACATGGTG
２６ CTTTATGCACACAAGAAC
２７ AATATACCAGGCACGTG
２８ GCAATATATTAGGCATGGG
２９ TCAGTACCTTAGACATGTG
プライマーは上記に述べた配列、すなわちＧＰ６＋及び配列番号３２〜４０から選択される配列を有するプライマー要素であることが好ましい。
【００４７】
配列番号３２ GAAAAATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３３ GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC
配列番号３４ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
配列番号３５ GAAAAATAAACTGCAAATCATATTC
配列番号３６ GAAATATAAATTGTAAATCAAATTC
配列番号３７ GAAAAACAAACTGTAGATCATATTC
配列番号３８ GAAATATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３９ AAAAATAAATTGCAATTCATACTC
配列番号４０ GAAAAACAAATTGTAACCCATATTC
好ましくはウイルスはＳＶ４０または一般的で相同性の高いＪＣ及びＢＫウイルスである。その場合、自己プロービング型アンプリコンは後述の実施例６の表８に列記したものから選択される配列を有するものであることが好ましい。表中、Ｓｃｘは自己プロービング型のＳＶ４０、ＪＣまたはＢＫウイルス（ｘ）のアンプリコンを表す。これらの配列は、ポリオーマウイルスを高信頼度で検出することが可能な、当該技術分野における他の方法によって得られる結果と直接比較が可能であることが知られている部位を特異的に標的とするものである。好ましい順方向プライマーは表８に示したようなＰ１プライマーである。
【００４８】
特にＨＰＶ（ＶＥＳＰＡ−ＨＰＶ）に適用される本発明の方法では、ＰＣＲ増幅反応は明細書中で定義されるＧＰ５＋リバースプライマーを用いて行うことが好ましい。ＧＰ５＋はＨＰＶの２０種の最も一般的な型を増幅することが可能な既知の変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーであるが、他の変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを代わりに使用することも可能である。ＶＥＳＰＡ−ＳＶ４０を行ううえで特に好ましいのは、表８に詳しく示すような、Ｐ２またはＰ３プライマーの逆方向プライマーとしての使用である。こうした方法として好ましいものとして、１以上の増幅工程がネスト（ｎｅｓｔｅｄ)ＰＣＲを用いて行われる方法がある。
【００４９】
ウイルス負荷（細胞当たりの）の判定に使用するうえで好ましい自己プロービング型アンプリコンが、後述の実施例２の表３にＳｃＢＧ（配列番号１１）として示されている。特に好ましいのはこうした自己プロービング型アンプリコンのプローブ要素が配列番号３１である場合である。
３１ ATGGTGTCTGTTTGAG
更により好ましくは、「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」には、試料細胞のゲノム中のウイルスゲノムの組み込み状態を判定するためにＨＰＶのＥ１、Ｅ２、Ｅ６及び／またはＥ７遺伝子の変化の検出を可能とするものが挙げられる。組み込み状態は２つの異なる評価方法を用いて測定することが可能である。
【００５０】
（ｉ）線形のウイルスＤＮＡに対する環状ウイルスＤＮＡの比、及び、
（ｉｉ）細胞形質転換タンパク質に対する細胞周期を調節するウイルスタンパク質の比。
【００５１】
これらの方法のうち第１の方法（ｉ）を図１１に示した（パーク等（Park et al., Gynecol Oncol 65(1) 121-9 (1997)））。本発明の方法を用いて、環状のウイルスＤＮＡの量について各試料を評価する。この評価は、ウイルスＤＮＡの予測される開裂点の手前（Ｅ１タンパク質の中央）でウイルスＤＮＡと結合するように設計された自己プロービング型アンプリコンと、予測されるウイルス開裂点の後（Ｅ６または好ましくはＥ７タンパク質の内部）でウイルスＤＮＡと結合するように設計された逆方向プライマーを使用することで行うことが可能である。この評価は環状のウイルスＤＮＡの量を反映したものである。この結果を上述の本発明の方法によって求めた全ウイルスＤＮＡ量と比較して環状のウイルスＤＮＡのパーセンテージを求めることが可能である。
【００５２】
これらの方法のうちの第２の方法（ｉｉ）は、ウイルスＤＮＡのホストゲノムへの組み込みの際、ウイルスＤＮＡの複製及びタンパク質への翻訳の調節に因るウイルスＤＮＡの部分が切り出されることを利用したものである。これによって発癌の原因となることが知られるタンパク質が制御不能状態で複製されることとなる。したがって、形質転換タンパク質（Ｅ６及びＥ７）に対する調節タンパク質（Ｅ１及びＥ２）の比を定量的に測定することによって、その試料が悪性形質転換を起こそうとしている患者から得られたものである確率の評価を行うことが可能となる。
【００５３】
したがって本発明は更に、１以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる試料中のウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が該検出可能シグナルによって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記ウイルスプローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程とからなる方法において、
「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」がＨＰＶのＥ１、Ｅ２、Ｅ６、及び／またはＥ７遺伝子の検出、定量、または評価を可能とするように構成されていることを特徴とする方法を提供するものである。
【００５４】
したがって本発明は更に、後述の実施例４の表６中で定義されるこうした「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」すなわち、Ｓｃ１６−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１６−Ｅ２、Ｓｃ１６−Ｅ６、Ｓｃ１８−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１８−Ｅ２及びＳｃ１８−Ｅ６（それぞれ配列番号１１〜１７）を提供するものである。本発明は更に、それぞれ配列番号４１〜４６及び４７〜５２に相当する、これらの配列のそれぞれのプローブ部分とこれらの配列の新規なプライマー部分とを有する配列を提供するものである。
配列番号４１ GCAAAGAGTAATCATTA Sc16-E1midプローブ
配列番号４２ TTGTCATATAGACATATCATTTTCAT Sc16-E2プローブ
配列番号４３ CGAATGTCTACATATCATGGC Sc16 E6プローブ
配列番号４４ TCGGTGTCTCCATGTTG Sc18 E1midプローブ
配列番号４５ TACATTGTCATGGTCTATGAT Sc18-E2プローブ
配列番号４６ CTGGAATGCTATATCATG Sc18-E6プローブ
配列番号４７ CAGAATGGATACAAAGACAAACAGT Sc16-E1midプライマー
配列番号４８ CAACGTTTAAATGTGTGTCAGGA Sc16-E2プライマー
配列番号４９ AAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC Sc16 E6プライマー
配列番号５０ AGTAATGGGAGACACACCTGAGT Sc18 E1midプライマー
配列番号５１ GCAGACACCGAAGGAAACCC Sc18-E2プライマー
配列番号５２ ACCCAGAAAGTTACCACAGTTAT Sc18-E6プライマー
本発明の方法では、標的が１以上のウイルスから得られた１以上の核酸配列からなるか、かつ／または、ウイルスプライマー要素が標的に対してある程度の変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を示すことによりウイルスプライマーが標的の核酸配列のそれぞれと完全に相補的とはなっておらず、多くの異なる「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」を用いて試料を多数回テストする必要が避けられるので都合がよい。
【００５５】
しかしながら、スクリーニングを目的とした場合、予備的なアッセイを行って試料中にいずれかのウイルスまたはウイルスのカテゴリーが存在するか否かを最初に確定させておくことがより好都合な場合もある。このアッセイの結果がポジティブであった場合には、本発明の方法によって可能となる特定の型の判定及び定量化アッセイを行う。こうした予備アッセイでは、上記に述べたものなど、ウイルス検出のための従来知られているいずれの方法を用いることも可能であるが、予備アッセイは、ウイルスのプライマー伸長産物にテール付加プライマーを最初に組み込む本発明の方法を用いることが好ましい。テールは例えばＰＣＲ条件下で複数のウイルスやＨＰＶなどのウイルス型のウイルス核酸配列を増幅することが可能な核酸配列を有する。これは自己プロービング型アンプリコンにテール付加プライマーの概念が適用された最初の例であると考えられている。
【００５６】
したがって本発明は、以下の工程：
（０）（Ａ）前記試料から得た標的ウイルス核酸配列を「テール付加プライマー」と接触させる工程；該テール付加プライマーは、
（ｉ）前記ウイルス核酸配列のコンセンサス配列に相補的な核酸配列（「コンセンサスプライマー配列」）を有するプライマー領域であって、該コンセンサス配列にハイブリダイズ可能であるとともにプライマー増幅条件下で該コンセンサス配列を増幅してテール付加プライマー伸長産物を生成するプライマー領域と、
（ｉｉ）本方法（「デザイナー」配列）のいずれの成分中にも存在せず、またいずれの成分によっても調製されない固有の配列を有するテール領域とからなる；と、
（０）（Ｂ）前記「デザイナー」配列が前記プライマー伸長産物に組み込まれるように前記プライマー増幅条件下で少なくとも２回の増幅反応を行う工程と、を更に含む方法であって、
「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」のプライマー要素は「デザイナー」配列に結合可能であり、ウイルス自己プロービング型アンプリコンのプローブ要素は前記コンセンサスプライマー配列に対して相補的であることを特徴とする方法を提供するものである。
【００５７】
したがって本発明の好適な一方法では、１回の反応ですべての型のＨＰＶについて試験を行うために、固有の自己プロービング型アンプリコンの標的部位を増幅（プライマー伸長）産物に導入する。従来のコンセンサスプライマー（例えば一般的なＨＰＶの２０種類の型すべてを増幅できるもの）に固有の「デザイナーテール」を付加することによってこの目的を達成することができる。本発明における使用に好適なテール付加プライマーの一例を実施例５の表７に示した（配列番号１８）。また本発明における使用に適当な変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）自己プロービング型アンプリコンを２例、実施例５の表７に示した（配列番号１９及び２０）。これらの配列は更に適当なプライマー及びプローブ要素を含んでいる（図６及び７参照）。
【００５８】
したがって本発明は更に、これらの配列の新規なテール部分（配列番号１０）を提供するものである。これらの配列のプローブ部分は既知のＧＰ６＋配列に結合するように設計されている。
配列番号１０：ATGTGGAAACATGCATGG 配列番号１８のＧＰ６＋テール
特に好ましいのは本発明の方法をスクリーニングプログラムの一部として使用し、本発明の自己プロービング型アンプリコンがこうしたスクリーニングプログラムでの使用を目的として構成される場合である。
【００５９】
したがって本発明は更に：
（ａ）ウイルス感染が疑われる患者のスクリーニングを行うためのスクリーニング法であって、
（ｉ）前記患者から核酸配列の試料を得る工程と、
（ｉｉ）上記に記載の本発明の方法を前記試料に行う工程とを含み、これにより前記ウイルスシグナリングシステムからの検出可能シグナルが検出されればウイルス感染があったことが示され、ウイルスシグナリングシステムからの検出可能シグナルが検出されなければウイルス感染がなかったことが示される方法と、
（ｂ）更に特定のウイルス型の有無が示されることを特徴とする（ａ）に記載のスクリーニング法と、
（ｃ）ウイルスが存在する場合、更に細胞当たりのウイルス負荷（ウイルスが存在しない場合にはゼロ）が示されることを特徴とする（ａ）または（ｂ）に記載のスクリーニング法と、
（ｄ）ウイルスが存在する場合、ウイルスの組み込み状態が更に示されることを特徴とする（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のスクリーニング法と、
（ｅ）子宮頚癌、再発性呼吸器乳頭腫症やヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の患者における存在に関連した別の状態に関してスクリーニングを行うように適合されていることを特徴とする（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のスクリーニング法と、
（ｆ）胸部及び肺の癌を含む中皮腫；骨肉腫、脳下垂体、甲状腺、脳及び神経系の腫瘍（例、グリア芽細胞腫、星状細胞腫、脳室上衣腫、及び脈絡叢乳頭腫）、ＳＶ４０、ＪＫ及び／またはＢＫウイルスに関連した他の状態の１以上のスクリーニングを行うように適合されていることを特徴とする（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のスクリーニング法とを提供するものである。
【００６０】
本発明の方法はＤＮＡに対して行われることが好ましいが、当業者には周知の方法によってＲＮＡに対して行われるように改変することも可能である。その場合、市販の逆転写酵素の任意のものを用いて先ずＲＮＡをＤＮＡに転写してから上記に述べた方法を行う。
【００６１】
本発明はまた、本発明の方法で使用するための診断キットであって、本発明のウイルス自己プロービング型アンプリコン、ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコン、またはテール付加プライマーの１以上を含むキットを提供するものである。特に好ましいのは、細胞当たりのウイルス負荷を決定するための本発明の方法での使用に適当なキットであって、少なくとも１種類のハウスキーピング自己プロービング型アンプリコンと場合に応じてテール付加プライマーを含む、少なくとも２種類、好ましくは４種類以上の自己プロービング型アンプリコンからなるものである。やはり好ましいものとして、ＨＰＶのＥ１、Ｅ２、Ｅ６及びＥ７遺伝子の少なくとも１つを標的とした少なくとも１種類の自己プロービング型アンプリコンからなるキットがある。
【００６２】
これらの自己プロービング型アンプリコンの多くはそれ自体新規かつ進歩的なものである。したがって本発明は更に、
（ａ）（ｉ）配列番号１〜９（Ｓｃ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、５１及び５６）と、
（ｉｉ）配列番号１１（ＳｃＢＧ）と、
（ｉｉｉ）配列番号１２〜１７（Ｓｃ１６−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１６−Ｅ２、Ｓｃ１６Ｅ６、Ｓｃ１８Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１８−Ｅ２，Ｓｃ１８−Ｅ６）と、
（ｉｖ）配列番号１８〜２０（テール付加プライマー）と、
（ｖ）下記表８に示される配列（ＳＶ４０、ＪＣ、またはＢＫの判定に用いられる自己プロービング型アンプリコン）とを含む、本明細書中に記載の新規な自己プロービング型アンプリコンと、
（ｂ）（ｉ）配列番号２１〜２９（（Ｓｃ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、５１及び５６）のプローブ要素）と、
（ｉｉ）配列番号３１（ＳｃＢＧのプローブ要素）と、
（ｉｉｉ）配列番号４１〜４６：
配列番号４１ GCAAAGAGTAATCATTA Sc16-E1midプローブ
配列番号４２ TTGTCATATAGACATATCATTTTCAT Sc16-E2プローブ
配列番号４３ CGAATGTCTACATATCATGGC Sc16 E6プローブ
配列番号４４ TCGGTGTCTCCATGTTG Sc18 E1midプローブ
配列番号４５ TACATTGTCATGGTCTATGAT Sc18-E2プローブ
配列番号４６ CTGGAATGCTATATCATG Sc18-E6プローブ
と、
（ｉｖ）配列番号１９及び２０（テール付加プライマー）のプローブ要素である配列番号５９及び６０：
配列番号５９ GAAGAATATGATTTACA
配列番号６０ GAGGAATATGATTTACA
と、
（ｖ）表８に列記した配列（ＳＶ４０、ＢＫ及びＪＣの自己プロービング型アンプリコン）のプローブ要素である配列番号５３〜５５：
配列番号５３ ACCCCAAGGACTTTCCT
配列番号５４ CCTATGGAACAGATGAATG
配列番号５５ ACCCTAAAGACTTTCCC
と、を含む（ａ）の新規なプローブ要素と、
（ｃ）（ｉ）配列番号３２〜４０（それぞれＳｃ６、１１、１８、３１、３３、３９、５１、及び５６のプライマー要素）：
配列番号３２ GAAAAATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３３ GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC
配列番号３４ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
配列番号３５ GAAAAATAAACTGCAAATCATATTC
配列番号３６ GAAATATAAATTGTAAATCAAATTC
配列番号３７ GAAAAACAAACTGTAGATCATATTC
配列番号３８ GAAATATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３９ AAAAATAAATTGCAATTCATACTC
配列番号４０ GAAAAACAAATTGTAACCCATATTC
と、
（ｉｉｉ）配列番号４７〜５２、特にＥ１ ｍｉｄプライマー配列（配列番号４７〜５０）：
配列番号４７ CAGAATGGATACAAAGACAAACAGT Sc16-E1midプライマー
配列番号４８ CAACGTTTAAATGTGTGTCAGGA Sc16-E2プライマー
配列番号４９ AAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC Sc16 E6プライマー
配列番号５０ AGTAATGGGAGACACACCTGAGT Sc18E1midプライマー
配列番号５１ GCAGACACCGAAGGAAACCC Sc18-E2プライマー
配列番号５２ ACCCAGAAAGTTACCACAGTTAT Sc18-E6プライマー
と、
（ｉｖ）配列番号１９及び２０（テール付加プライマー）のプライマー要素である配列番号６１：
配列番号６１ GTGGAAACATGCATGGCGAC
と、
（ｖ）表８に列記した配列（ＳＶ４０、ＢＫ及びＪＣの自己プロービング型アンプリコン）のプライマー要素である配列番号５６〜５８：
配列番号５６ AGCATGACTCAAAAAACTTAGCAATTCT
配列番号５７ TTCTCATTAAATGTATTCCACCAGGATT
配列番号５８ AGCTTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCA
と、を含む（ａ）の新規なプライマー要素と、
（ｄ）配列番号１０：ATGTGGAAACATGCATGG ＧＰ６＋テールプライマーのテール配列
とを提供するものである。
【００６３】
更に本発明は、上記に述べた方法またはキットの調製における、プローブやプライマー要素を含むこうした自己プロービング型アンプリコンの使用法を提供するものである。
【００６４】
次に本発明を以下の実施例によって説明する。
実施例１ ＶＥＳＰＡを用いたウイルス検出法
一般的材料及び方法
細胞系
ＨｅＬａ、Ｃａｓｋｉ、及びＳｉＨａ細胞系はスティーブ・マン博士（Dr. Steve Man, ユニバーシティ・オブ・ウェールズ、カレッジ・オブ・メディシン、カーディフ、英国）から提供されたものを使用した。これらはＡＴＣＣから入手可能である（American Type Culture Collection, http://www.atcc.org/）。
臨床試料
患者は、ランダウ病院（Llandough Hospital, カーディフ、英国）における通常の膣鏡検査から、または西アフリカでのＭＲＣ野外調査の一部として見出されたものである。すべての患者からインフォームドコンセントによりＨＰＶについてスミアを分析する同意を得たが、その方法は秘した。円錐状の細胞ブラシを用いて子宮頚部の試料を採取し、０．５ｍｌのダイジーン製輸送用培地に入れて輸送した（ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ）、米国メリーランド州、シルバースプリング所在）。英国内で採取された試料は処理を行う前に最大２４時間、４℃で保存した。ガンビアで採取された試料は液体窒素中に凍結保存し、１ヶ月以内に処理を行った。ユニバーシティ・ホスピタル・オブ・ウェールズ（The University Hospital of Wales、カーディフ、英国）及びランダウ病院（Llandough Hospital, ペナース、英国）において、インフォームドコンセントにより、再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）及び子宮頚癌に対する治療を行っている患者から生検試料を採取した。
ＤＮＡ精製
６４０μｌの細胞核溶解バッファ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ エチレンジアミンテトラアセテート ｐＨ８．０、１０％ドデシル硫酸ナトリウム）、１００μｌの６Ｍ ＮａＣｌ、及び７４０μｌのクロロフォルム中に細胞を再懸濁して細胞系からＤＮＡを精製した。この溶液をよく混合し、遠心して上層を抽出した。
１ｍｌの９５％エタノールを加えてＤＮＡを沈降させ、遠心してペレットを得た。このペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、ロータリーエバポレータで乾燥し、５００μｌの脱イオン水に再懸濁した。ジャコブ等（Jacobs et al., J Clin Microbiol 35, 791-5 (1997)）によって述べられる凍結融解法の簡単な改良（試験管の壁に細胞ブラシを押しつけ、凍結時間を２時間から２４時間と長くした）によって、子宮頚部から細胞ブラシで得た試料よりＤＮＡを抽出した。細胞ブラシ試料から得た上皮細胞を遠心してペレットとし、１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、−７０℃で２４時間凍結した。１００μｌを融解し、１０分間沸騰させ、氷冷し、微量遠心機で３分間１３，０００ｒｐｍで遠心し、上清を捨て、保存した。上記方法の改良法を用いて生検試料からＤＮＡを抽出した。改良法では、沸騰に先立って、１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（シグマ社、英国）を含む１ｍｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で１時間、５６℃で試料をインキュベートした。
【００６５】
ＰＣＲ−ＥＩＡ−比較方法
ジャコブ等（前出）によって述べられる方法にしたがってＰＣＲ−ＥＩＡを行った。
ＶＥＳＰＡ法
プライマーの設計
表２にこの研究で用いた１０種の自己プロービング型アンプリコンプライマーの配列を示した。プライマーはすべてオズウェル・リサーチ・プロダクツ（Oswel Research Products, サザンプトン ＳＯ１６ ７ＰＸ、英国）によって合成されたものである。
【００６６】
自己プロービング型アンプリコンプライマーはすべて２重ＨＰＬＣによって精製した。スタンダードプライマーはゲル濾過により精製した。これらのプライマーはＨＰＶ Ｌ１遺伝子を検出するように設計されたものである。プライマーの位置はウイルスの型間で異なったが、約６６００〜６７５０ｂｐの間に位置していた。
【００６７】
各自己プロービング型アンプリコンの順方向プライマー配列は型特異的であり、ジャコブ等（前出）によって述べられるＧＰ６＋プライマーと同じ配列位置に位置するものである。自己プロービング型アンプリコンプローブ配列は２０種の一般的なＨＰＶの型（ＨＰＶ−６，１１，１６，１８，３１，３３，３９，４０，４２，４３，４４，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６及び６８）（http://hpv-web.lanl.gov）のＬ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を並べることによって設計した。ジャコブ等（前出）のＧＰ６＋プライマー結合部位の隣接領域で最も配列の変化が大きい領域をプローブの標的結合部位として選択した。これらのプライマーのプローブ配列を７０種の一般的なパピローマウイルス配列に対して確認を行ったが大きな相同性は認められなかった。ＳＣ１６プライマー要素は既知のＧＰ６＋配列からなる。逆方向のプライマー標的配列はジャコブ等（前出）のＧＰ５＋配列である。
【００６８】
【表２】
【００６９】
プライマーの確認−参照細胞系でのＶＥＳＰＡ
ＨＰＶ ＤＮＡを組み込まれた状態で有する参照細胞系を用いてＨＰＶ１６及び１８プライマーを特異性について調べた。Ｃａｓｋｉ細胞系は細胞当り６０〜６００コピーのＨＰＶ−１６のＯＲＦを含み、ＨｅＬａ細胞系は１０〜５０コピーのＨＰＶ−１８のＬ１ＯＲＦを含んでいた。
【００７０】
図１ａは、Ｓｃ１６自己プロービング型アンプリコンプライマー（ＨＰＶ−１６ＤＮＡの検出用に設計されたもの）と、ＨＰＶ−１６ポジティブであるＣａｓｋｉ細胞系から抽出されたＤＮＡ、ＨＰＶ−１８ポジティブであるＨｅＬａ細胞系から抽出されたＤＮＡ、及びネガティブコントロール（ＤＮＡを含まない）を用いて行ったＰＣＲ反応の結果を示したものである。Ｃａｓｋｉ ＤＮＡを含むＨＰＶ−１６でのみ有意な蛍光の増大が検出された。
【００７１】
図１ｂは、Ｓｃ１６の代わりにＳｃ１８自己プロービング型アンプリコンプライマーを用いて同様な実験を行った結果である。ＨＰＶ−１８ポジティブであるＨｅＬａ細胞系においてのみ著明な蛍光が検出された。次にこれらのプライマーを用いて、予めＰＣＲ−ＥＩＡによって型判定を行った臨床試料中のＨＰＶ−１６及び−１８の検出を行った（図２ｃ及び図２ｄ 下記参照）。
【００７２】
ＶＥＳＰＡによるＨＰＶの検出
０．５μＭの自己プロービング型アンプリコンプライマー、及び０．５μＭのジャコブ等（前出）によって述べられるＧＰ５＋逆方向プライマーを用いて１μｌのＤＮＡ溶液のＰＣＲ増幅を行った。全反応容量は１０μｌであった。反応はライトサイクラー（Light Cycler, バイオ／ジーン社（Bio/Gene）、キンボルトン、ケンブリッジシャー州、ＰＥ１８ ０ＮＪ、またはロシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics Ltd）、ベルレーン、ルイス、イーストサセックス州、ＢＮ７ １ＬＧ）を用いて行い次のサイクルパラメータで１００サイクル行った：９６℃−１秒、４０℃−５秒、７２℃−１秒。反応条件は以下のとおり。２００μＭ ｄＮＴＰｓ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．９）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、ウシ血清アルブミン ２５０ｎｇ／μｌ、及び０．５Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（アドバンスド・バイオテクノロジーズ社（Advanced Biotechnologies）、エプソム、サリー州、英国）。蛍光は４０℃で第１チャンネル（５３０ｎｍ）で検出した。
【００７３】
コントロールＰＣＲ反応は、１μｌのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（バイオ／ジーン社（Bio/Gene）、キンボルトン、ケンブリッジシャー州、ＰＥ１８ ０ＮＪ）を加えた以外は上記と同様にして行った。自己プロービング型アンプリコンのコントロール反応（ネガティブコントロール）にはＤＮＡの代わりに１μｌ Ｈ２Ｏを加えたものを用いた。
【００７４】
次いでＨＰＶ−６、−１１、−３１、−３３、−３９、−５１、及び−５６型の検出を可能とすべくＶＥＳＰＡ法の拡張を行った。これらのＨＰＶ型を含んだ細胞系は市販されていないため、実施例３に関して下記表５に示されるように、ＰＣＲ−ＥＩＡを用いて予めテストした臨床試料を用いてプライマーの特異性を確認した。図２（ａ〜ｈ）は、ＨＰＶ−６、−１１、−１６、−１８、−３１、−３３、−３９、及び−５１の型判定反応のポジティブな結果をそれぞれ示したものである。
【００７５】
実施例２−ＶＥＳＰＡを用いたウイルス負荷の決定
自己プロービング型アンプリコンによるＰＣＲの理論上の利点として、ウイルス負荷が決定できる点がある。図３は、ＳｉＨａ細胞系の連続希釈液を用いて行ったＳｃ１６の型判定反応の結果である（細胞当り１〜２コピーのＨＰＶ−１６）。細胞当りのＨＰＶコピー数が５０，０００〜５００である連続希釈液は明確に区別が可能であり、ＨＰＶ−１６のＤＮＡを１コピーだけ含む試料でもＨＰＶ−１６のシグナルはポジティブであった。
【００７６】
細胞当りのウイルス負荷を決定することが可能な方法の確立を検討すべく、（ヒト）β−グロブリンＤＮＡ（ＳｃＢＧ、表３中の配列番号：１１）を検出するプライマーを設計した。
【００７７】
【表３】
【００７８】
図４は、ＨＰＶ−１６について上記で用いたものと同様のＳｉＨａ細胞の連続希釈液に対して、ヒトβ−グロブリン遺伝子を検出するように設計された自己プロービング型アンプリコンを用いて行った実験結果を示したものである。ここでもやはりシグナルは１個の細胞までポジティブを示し、細胞当りコピー数が５０以上であれば定量的な検出が可能である。図５は、Ｓｃ１６及びＳｃＢＧによって発生する蛍光比を標的ＤＮＡの細胞当りのウイルスコピー数の対数に対してプロットしたものである。細胞当たりコピー数を、２つの異なる希釈度間の比を計算することにより、一定のコピー数を含む細胞系から計算することが可能である。例えば、細胞５０００個に対するＳｃ１６のＦｍａｘ値を細胞１００個に対するＳｃＢＧのＦｍａｘ値で割ることによって細胞当たりのコピー数が５０である概念上の細胞系に対する値（５０００／１００）を求めることが可能である。
【００７９】
病気のグレードを細胞学によって判定した。Ｓｃ１６のＦｍａｘをＳｃＢＧのＦｍａｘで割ることによってＶＬ比（ウイルス負荷）をＲＳＵ（相対自己プロービング型アンプリコン単位）で求めた。図５に示したスタンダード曲線を用いて細胞当たりのウイルスコピー数を推定した。
【００８０】
【表４】
【００８１】
表４は、このウイルス負荷判定法を、ＰＣＲ−ＥＩＡによって予めＨＰＶ−１６ポジティブであると判定された（ジャコブ等（前出）による）１６検体の臨床試料に対して適用した結果を示したものである。これらの実験から得られる最も注目すべき知見は、細胞学的所見が正常である４検体の子宮頚部スミアでは、ＶＥＳＰＡを用いた場合にウイルス負荷が低く、ウイルス負荷が低かった唯一の他の試料（ただし顕著な異形成が見られた）はＨＰＶ−６とＨＰＶ−３９に同時感染している点である。表４に示したウイルス負荷の予備データによれば、子宮頚管部の異形成の存在はウイルス負荷と相関している可能性が示唆される。
【００８２】
実施例３−ＶＥＳＰＡとＰＣＲ−ＥＩＡとの比較
臨床での子宮頚部スメアからのＨＰＶ型判定におけるＶＥＳＰＡの有用性について試験を行うため、自己プロービング型アンプリコンプライマーを用いて、予めＰＣＲ−ＥＩＡによってＨＰＶ型判定された（ジャコブ等（前出）による）１０８検体の試料をテストした。２方法を直接比較するため、ジャコブ等（前出）によって述べられる凍結融解法を用いてＤＮＡ抽出を行った。この方法は自己プロービング型アンプリコンプライマーを用いたＰＣＲ増幅に用いるには最適ではない。この研究で効率のよくない凍結融解によるＤＮＡ抽出法を用いたのは、この方法がＰＣＲ−ＥＩＡに適したものであり、同じＤＮＡ試料を用いてＰＣＲ−ＥＩＡとＶＥＳＰＡの比較を行うことを望んだためである。これらの実験結果を表５に示す。
【００８３】
選択されたポジティブな試料の型は後で直接配列を決定して確認を行った（データは示さず）。ＶＥＳＰＡとＰＣＲ−ＥＩＡの全体の一致度は９４％であり、κ値は０．８９と両者の良好な一致を示した。実際、ジャコブ等（前出）により述べられるように、異なる参照検査室によって同一の試料にＰＣＲ−ＥＩＡを行った場合、同様な一致度が見られた。１０８検体の試料のうち、ＨＰＶ−１６の５例、ＨＰＶ−１８の１例がＶＥＳＰＡによって検出されなかった。偽陽性は見られなかった。
【００８４】
ＶＥＳＰＡとＰＣＲ−ＥＩＡとの間で見られた小数の残りの不一致例については幾つかの説明が考えられる。第１に、ＰＣＲ−ＥＩＡによる結果が偽陽性である可能性である。複数の異なる検査室でＰＣＲ−ＥＩＡの比較を行った研究から、この方法ではしばしば偽陽性を生じやすいことが示されている。結果が不一致であった６検体の試料のうち４検体が細胞学的所見は正常であったことはこのことを支持するものである。残りの２検体のうち、一方はグレードの低い病変であり、他方は臨床データのないものであった。第２に、試料がＨＰＶについてポジティブであるがプローブ結合部位内に多型を有するＨＰＶの同型変異体を含んでいる可能性である。自己プロービング型アンプリコンプローブが１個の塩基変化に基づいて配列を区別するのに対して、ＰＣＲ−ＥＩＡプローブは配列の変化に対する許容度が高い。このことは６検体の不一致試料のうち５検体がプローブ結合部位内の変異がより大きいと考えられる西アフリカの検体から得られたことと関連しているかもしれない。
【００８５】
【表５】
κ値はアーミテージ等による記載（Armitage et al., Statistical Methods in Medical Research, Third Edition (Oxford; Blackwell Scientific Publications)）に基づいて計算した。
実施例４−組み込み状態を検出するためのＶＥＳＰＡ−Ｅ６／Ｅ７：Ｅ１／Ｅ２
ＨＰＶ組み込み状態の評価を行うために設計された自己プロービング型アンプリコンの配列を表６に示した。これらの配列は上記の実施例に述べられた方法に基づいて使用した。組み込み状態は上記に述べた方法で測定した。
【００８６】
【表６】
【００８７】
実施例５−変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＨＰＶ検出のためのテール付加プライマーを用いたＶＥＳＰＡ
好適な一方法として図６に示されるような、下記の工程からなる方法が挙げられる。
１．「デザイナーテール」を有するプライマーを用いてウイルスＤＮＡ（存在する場合）を増幅する。標準的な逆方向プライマーも使用する。
２．標準的反応におけるのと同様に増幅が進行する。
３．第１回目の増幅の後、「デザイナー」配列は相補的配列を有さない。
４．第２回目の増幅の後、「デザイナー」配列を組み込み、各ラウンドで増幅する。
５．別の反応で、「デザイナー」配列を標的としたプライマーとコンセンサスプライマーを検出するためのプローブとからなる自己プロービング型アンプリコンを用いてこの増幅を検出することが可能である。プライマー二量体による許容し得ないバックグラウンド蛍光の発生を防止するため、ウイルスＤＮＡと若干の重複部分を有する２種類の自己プロービング型アンプリコンの使用が必要な場合もある。
【００８８】
前述の実施例で述べた方法と類似の方法によって、次のテール付加プライマーを用いて変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＨＰＶを検出した（表７）。
【００８９】
【表７】
【００９０】
表７によれば、変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）自己プロービング型アンプリコン混合物によってＨＰＶ−６、−１６及び−１８型が検出されることが分かる。ジャコブ等（前出）によって述べられる条件下で予め増幅した試料を用いて比較を行うことも可能である。興味深い点としてこれらの試料のうち２つのものはアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色後にほとんど視認できなかったが、このことはＶＥＳＰＡ法によって予想通りの感度の向上が実現されることを示すものである。
【００９１】
実施例６−ＳＶ４０へのＶＥＳＰＡの適用
ＤＮＡの抽出
ブロック間のコンタミネーションが生じないように留意しながら中皮腫のパラフィン包埋生検試料の５μＭの連続切片を１０枚切り出した。これら１０枚の切片を微量遠心機のチューブに入れ、キシレンで１０分間処理してパラフィンを除去した後、エタノールで２回洗浄してから乾燥した。２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む４００μｌの消化緩衝液を添加して５５℃にて一晩検体を消化した。この後、９５℃に１０分間加熱してプロテイナーゼＫを失活させた。得られた消化物をフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコールを用いてＤＮＡ抽出用に更に処理した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心、風乾した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０フィルター（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国マサチューセッツ州、ベッドフォード）を用いてＤＮＡの脱塩、濃縮を行った。得られた精製ＤＮＡを分光法により定量した。すべての試料がβ−グロブリン増幅についてポジティブの試験結果を示し（マグルトン−ハリス等（Muggleton-Harris et al.） Hum Reprod 10 183-92 (1995)）、ＰＣＲの有効性が示された。
【００９２】
プライマーの設計
各ウイルスの配列を並べることによってプライマーを設計した（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/）。ＳＶ４０ アクセッション番号Ｊ０２４００；ＪＣ アクセッション番号Ｊ０２２２６／７；ＢＫ アクセッション番号ＮＣ００１５３８。第１回目で増幅するため、従来から知られる確立されたプライマー部位を利用してラージＴ抗原遺伝子の全体を通じて複数のプライマーを設計した（表１参照）。第１回目の増幅段階では、多くの試料でかなりのＤＮＡの分解が見られることから、近接した標的部位を有する短いＤＮＡフラグメントを標的としたプライマーを使用することが好ましい。これらのプライマー部位間で最もホモロジーの小さい領域を標的として自己プロービング型アンプリコン及びプローブ結合部位を設計した。
【００９３】
【表８Ａ】
【００９４】
【表８Ｂ】
【００９５】
アッセイ条件
増幅反応はすべて、熟練した実験手腕にて、良好なフィルター端を用い、ポリオーマウイルスに曝露されたことのない実験室で行った。
【００９６】
第１回目の増幅反応（予備増幅）
ＳＶ４０、ＪＣ、及びＢＫについて試験を行うため、適当なプライマーの組を用いて各反応を３回セットアップした。
【００９７】
各反応で５μｌの各試料を次の条件下で予備増幅した；０．５μＭのＰ１及びＰ３（表８参照）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（アドバンスド・バイオテクノロジーズ社（Advanced Biotechnologies）、エプソム、サリー州、英国）、及び５μｌの１０ｘ反応緩衝液（バーキンエルマーゴールド社（Perkin-Elmer Gold））にて全反応容量５０μｌとした。
【００９８】
各試料は上記の条件下でＰ１−Ｐ２のプライマーの組を用いて（表８）ＳＶ４０の型判定を行った。
【００９９】
第２回目の増幅反応（アンプリコン検出）
第１回目の増幅反応に用いた実験室と物理的に隔離された（１００ｍ）実験室でアッセイをセットアップした。
【０１００】
２基の異なるリアルタイムＰＣＲ装置でアンプリコンの検出を行った。
【０１０１】
（ｉ）ライトサイクラー（Light Cycler, ロシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics Ltd）、ベルレーン、ルイス、イーストサセックス州、ＢＮ７ １ＬＧ）
（ｉｉ）ｉサイクラー（iCycler, バイオ−ラド・ラボラトリーズ社（Bio-Rad Laboratories）、バイオ−ラドハウス、メイランズアベニュー、ヘメル・ヘンプステッド、ハーフォードシャー州、ＨＰ２ ７ＴＤ）；
及び若干異なる条件下。
【０１０２】
ＤＮＡ（２μｌ ｉサイクラー）溶液の１μｌ量を０．５μＭのスコーピオンプライマー（表１参照）と０．５μＭのリバースプライマーを用いて１０μｌ（２０μｌ ｉサイクラー）の全反応容量中でＰＣＲ増幅した。反応条件は次のとおり：２００μＭのｄＮＴＰｓ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．９）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ウシ血清アルブミン２５０ｎｇ／μｌ、及び０．５Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ（アドバンスド・バイオテクノロジーズ社（Advanced Biotechnologies）、エプソム、サリー州、英国）。チャンネル１／５３０ｎｍ（フィルターセット４、ｉサイクラー）にて４０℃（４５℃、ｉサイクラー）で蛍光を検出した。自己プロービング型アンプリコンのコントロール反応（ネガティブコントロール）として、ＤＮＡの代わりにＨ２Ｏを含むものを用いた。プライマーはすべてオズウェル・リサーチ・プロダクツ（Oswel Research Products, サザンプトン ＳＯ１６ ７ＰＸ、英国）によって合成されたものである。
サイクリングパラメータ
【０１０３】
予備増幅
９４℃−１８０秒の後、９４℃−６０秒、５２℃−６０秒、及び７２℃−６０秒を３０サイクル、最後に７２℃−３００秒。
【０１０４】
アンプリコンの検出
（ｉ）ライトサイクラー。９６℃−１秒、４０℃−５秒、７２℃−１秒を１００サイクル。
（ｉｉ）ｉサイクラー。９５℃−１８０秒の後、９５℃−３０秒、４５℃−３０秒、７２℃−１５秒を４０サイクル。
【０１０５】
結果
図１０ａ〜１０ｃは、ＳＶ４０（ＳｃＳＶ４０）の検出用に設計された自己プロービング型アンプリコン、ＪＣウイルス（ＳｃＪＣ）の検出用に設計された自己プロービング型アンプリコン、及びＢＫウイルス（ＳｃＢＫ）の検出用に設計された自己プロービング型アンプリコンを、予め増幅した細胞系ＤＮＡ、中皮腫由来ＤＮＡ、及び水により、ライトサイクラーリアルタイム蛍光計中でチャレンジした結果を示したものである。特定の自己プロービング型アンプリコンが同種のウイルスと接触した場合にのみ蛍光の大幅な増大が見られる。非同種ウイルスによる蛍光のバックグラウンドレベルはＪＣウイルスによるチャレンジを行った場合にＳｃＢＫを除いたすべてのケースで低値に維持されている。
【０１０６】
図１０ｄ〜１０ｆは、ｉサイクラーリアルタイム蛍光計を用いて分析した同様の反応プロファイルを示したものである。図１０ｅ及び１０ｆでは試料によって生ずる反応プロファイルが見られない。蛍光は特定の自己プロービング型アンプリコンに同種のウイルスが提示された場合に強く、非同種のウイルスでは弱いが、この一連の実験では非同種ウイルスによるバックグラウンド蛍光は増大している。３種の自己プロービング型アンプリコンのすべて、及び２種のＳｃＳＶ４０標的アンプリコンを用い、２つの異なるアンプリコンの分析モードを用いて行った中皮腫ウイルスの型判定の結果を表９に示す。
【０１０７】
【表９Ａ】
【０１０８】
【表９Ｂ】
【０１０９】
【表９Ｃ】
【０１１０】
これらは、パラフィン包埋ブロックから得たアーカイブ化された７６検体の中皮腫のＤＮＡ試料について型判定を行った結果である。いくつか興味深い観察点が挙げられる。第１に、Ｐ１とＰ２（表８参照）の間の６５０ｂｐのアンプリコンを標的とした分析ではポジティブが１検体であるのに対し、Ｐ１とＰ３の間の２３０ｂｐのアンプリコンを標的とした分析ではポジティブは４４検体である。この観察結果は、パラフィン包埋ブロックからはしばしば短いＤＮＡ部分しか回収されないことに起因している可能性もあるが、これらの試料ではＳＶ４０のホストゲノムへの組み込みにともなってＤＮＡが欠失することを反映したものかもしれない。
【０１１１】
第２に、ＳＶ４０−ＶＥＳＰＡと確立された方法との比較によれば、観察されたポジティブの数が増加しており、感度の向上が示された点である。この比較結果は蛍光測定のモードに依存している。アンプリコンＰ１−Ｐ２（６５０ｂｐ）の分析ではＳＶ４０の検出率は１．３％であり、ライトサイクラーを使用してアンプリコンＰ１−Ｐ３（２３０ｂｐ）を分析した場合には５９％であり、ｉサイクラーを使用してアンプリコンＰ１−Ｐ３を分析した場合には７０％であった。すなわちｉサイクラーを用いて得られたデータはライトサイクラーによって得られるデータよりも２０％程度ポジティブが多い結果となっているが、ｉサイクラーを用いるとバックグラウンドの蛍光が増大する。ｉサイクラーの観察される感度の増加は長い反応時間（２時間と１時間）または大きな試料容量（２μｌと１μｌ）によるものである可能性がある。ｉサイクラーはスループットに関しても利点を有する（９６と３２）。ｉサイクラーを用いた場合にポジティブの試料は報告されず、ライトサイクラーを用いた場合ではネガティブは報告されなかった。これらの結果は、ライトサイクラーが特異的分析に適しているのに対して、ｉサイクラーは高感度の分析により適していることを示すものである。
【０１１２】
第３に、ＳｃＪＣでは偽陽性が１検体で認められ、これがコントロールのネガティブブランク反応で見られたことである。この観察はアッセイ感度の重要性を強調するものであり、またこの種のウイルス分析を解釈する際の厳正なアッセイ法及び注意の必要を強調するものである。この問題は英国製ポリオワクチンの検査を行っている検査機関で以前から見られた問題であり、コンタミネーションの原因については確証のある説明はなされていない。この偽陽性が５つの他のブランクを含む実験で見られ、それらのすべてが予想されたネガティブな結果を生じたことからこの偽陽性は例外的なケースと見られる。また、使用した実験室が以前にポリオーマウイルスに曝されていないことは、このブランクが２個のポジティブコントロールに接して配置された結果としてポジティブを示したことを示唆するものである。したがって試料のキャリーオーバーが原因である可能性がある。
【０１１３】
ＳＶ４０の検出率は最高で７０％であり、これまでに報告されている値の範囲内であるが上限に近い値となっている。ＪＣ及びＢＫウイルスは小児人口の６０％に見られ、成人の７０％以上がＪＣ及びＢＫ抗体を有していることが推定される。中枢神経系の腫瘍では３３％にＪＣウイルスが見られることが報告されている。ＪＣ及びＢＫの検出率はそれぞれ１９％及び１．４％であった。
【０１１４】
これらの試料におけるウイルス負荷の推定は、第１回目の増幅で反応が「律速条件」に達する場合があるネスト（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲの使用によって困難となっている。ＳＶ４０−ＶＥＳＰＡは１回の増幅で細胞系のＤＮＡの型判定を行うことが可能である（データは示さず）。このため、ネスト（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによるスクリーニングで強いポジティブを示した試料をヒトゲノムＤＮＡ用の内部標準を用いた１回のＰＣＲでウイルス負荷について再分析することが可能である。データにはＳｃＳＶ４０の蛍光が１．４〜２６．５の範囲であるＤＮＡ試料が示されており、ウイルスが由来する中皮生検試料中で広範囲のウイルス負荷が見られることと符合する。
【０１１５】
結論
図１０ａ〜１０ｆは、本発明によれば同種のウイルスに反応して強いシグナルを発生し、高濃度の相同性の高い非同種ウイルスから同種ウイルスを選別することが可能なアッセイが与えられることを示したものである。この記載の可能な例外は、ＳｃＢＫを予め増幅したＪＣウイルスでチャレンジした場合には顕著なバックグラウンド蛍光が観察される点である。ポジティブコントロールの値の約１０％程度であれば許容範囲ではあるが、ＪＣウイルスが偽陽性のＢＫウイルスとして判定される可能性がある。この観察結果は、すべての試料をＪＣウイルスについて型判定したところ、ＢＫについてポジティブであった１検体の試料はＪＣネガティブであったことから、現在の研究に影響するものではない。しかしながら、この方法を用いて得られたすべてのＢＫポジティブは解釈に注意を要し、ＪＣウイルスについて型判定することが望ましい。しかしながら、ＳｃＢＫのバックグラウンド蛍光は高濃度の予備増幅したＪＣ ＤＮＡの存在下でのみ観察される点は再び強調しておく価値があろう。
【０１１６】
したがってこの実験で得られる中心的な知見は以下の点である。
（ｉ）ＳＶ４０の検出率はプローブするアンプリコンの大きさに依存する。
（ｉｉ）ＳＶ４０の検出率はアンプリコン分析のモードに依存する。
（ｉｉｉ）アーカイブ化された中皮腫組織のＳＶ４０感染率は５８％〜７０％の範囲である。
【０１１７】
実施例７−ＲＲＰ関連ＨＰＶにおけるＶＥＳＰＡ
臨床試料
ウェールズ全体のすべての耳鼻咽喉科医及びイングランドで再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）の調査に積極的に携わっているすべての耳鼻咽喉科医に接触して患者を集めた。すべてのＲＲＰの症例は、生検試料における特徴的な組織学的変化及び／または２回よりも多い外科的介入を必要とする組織学的変化により確認することによって同定した。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。ユニバーシティ・ホスピタルズ・オブ・ウェールズ・カーディフ・アンド・シェフィールド（University Hospitals of Wales, Cardiff and Sheffield）において再発性呼吸器乳頭腫症の治療を行っている患者からインフォームドコンセントを得たうえで生検試料を採取した。
【０１１８】
疾患の重篤度
ダーケイ等（Derkay et al., Laryngoscope 108(6) 935-7 (1998)）によって概括されるパラメータを用いて臨床疾患のグレード付けを行った。この式は手術の数及び手術間の時間間隔の両者を説明するものである。
【０１１９】
ＤＮＡの精製
０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（シグマ社（Sigma）、英国）を含む１ｍｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で約１ｍｍ３の生検材料を、１時間、５６℃でインキュベートして生検試料からＤＮＡを抽出した。次いで１００μｌの等分量を取り、１０分間沸騰させ、５分間氷冷し、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心し（粒子状物質を除去するため）、新鮮な試験管に注いだ。
【０１２０】
ＰＣＲ ＥＩＡ
ＨＰＶの型を確認するため、実施例３に述べられるようにジャコブ等（前出）によるＰＣＲ−ＥＩＡ用の参照方法をすべての試料に行った。
【０１２１】
結果
表１０に示されるウイルス負荷は実施例２で述べたように計算した。概略述べると、同種のＨＰＶ−自己プロービング型アンプリコンを用いて発生する蛍光シグナルと、ヒトゲノムのβグロブリンハウスキーピング遺伝子の検出用に設計された自己プロービング型アンプリコンの蛍光シグナルとの比を計算した。
【０１２２】
高ウイルス負荷かつ穏和な症状（ＮＬ）及びその逆（ＤＮ）の患者の例が明らかに見られたものの、寛解状態の患者でウイルス負荷は最も低く、最も重篤な患者でウイルス負荷は最も高かった。この研究は、ＲＲＰにおける最も重要な診断マーカーはＨＰＶの型であることを示すものである。すなわち、ＨＰＶ−６は穏和な、ＨＰＶ−１１は進行性の疾患につながるものである。
【０１２３】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明の方法によるＨＰＶ−１６の検出に関する図。（図１ａ）ＨＰＶ−１６（Ｓｃ１６）に対して特異的な自己プロービング型アンプリコンプライマー、ポジティブコントロール（ＨＰＶ−１８に対するＨｅＬａ）、ネガティブコントロール（ＤＮＡなし）、及びＨＰＶ−１６に特異的な細胞系（Ｃａｓｋｉ）から抽出されたＤＮＡを用いたＨＰＶの型判定反応の結果を示す図。（図１ｂ）ＨＰＶ−１８（Ｓｃ１８）に対して特異的な自己プロービング型アンプリコンプライマー、ポジティブコントロール（ＨＰＶ−１６に対するＣａｓｋｉ）、ネガティブコントロール（ＤＮＡなし）、及びＨＰＶ−１８に感染した細胞系（ＨｅＬａ）から抽出されたＤＮＡを用いたＨＰＶの型判定反応の結果を示す図。
【図２】ＶＥＳＰＡによって得られるポジティブなトレースの例に関する図であって、ＰＣＲ−ＥＩＡによって予め型判定した臨床試料を用いたＨＰＶ型判定実験の結果を示す図。ＨＰＶ−６（Ｓｃ６）に対して特異的なプライマーを図２ａに、ＨＰＶ−１１（Ｓｃ１１）に対して特異的なプライマーを図２ｂに、ＨＰＶ−１６（Ｓｃ１６）に対して特異的なプライマーを図２ｃに、ＨＰＶ−１８（Ｓｃ１８）に対して特異的なプライマーを図２ｄに、ＨＰＶ−３１（Ｓｃ３１）に対して特異的なプライマーを図２ｅに、ＨＰＶ−３３（Ｓｃ３３）に対して特異的なプライマーを図２ｆに、ＨＰＶ−３９（Ｓｃ３９）に対して特異的なプライマーを図２ｇに、ＨＰＶ−５１（Ｓｃ５１）に対して特異的なプライマーを図２ｈに示した。
【図３】ＨＰＶ−１６に対するＶＥＳＰＡの定量的な性質を実証する図。Ｓｃ１６を用いたＨＰＶ−１６の連続希釈液が示されている。ＳｉＨａ細胞の連続希釈液は反応当たり細胞５００００個〜反応当たり細胞１個までを調製した。
【図４】ＳｃＢＧを用いたヒトβ−グロブリンに対するＶＥＳＰＡの定量的な性質を実証する図であって、図３と同様の連続希釈液が示されている。
【図５】ＶＥＳＰＡを用いたウイルス負荷の推定を示すグラフ。
【図６】ＶＥＳＰＡを用いたｄｅｇｅｎｅｒａｔｅなＨＰＶなどのウイルス検出法を示す模式図。
【図７】ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅな自己プロービング型アンプリコンの混合物がＨＰＶ−６、−１６、及び−１８型を検出する能力を実証する図。
【図８】自己プロービング型アンプリコンを用いたＨＰＶなどのウイルスの型判定法を示す概略図であって自己プロービング型アンプリコンを示した図。
【図９】自己プロービング型アンプリコンを用いたＨＰＶなどのウイルスの型判定法を示す概略図であって、ウイルスＤＮＡに対する自己プロービング型アンプリコンの伸長及び結合段階を示した図。
【図１０】ＳＶ４０にＶＥＳＰＡ法を適用して得られた結果に関する図。図１０ａ〜ｃはそれぞれＳｃＳＶ４０，ＳｃＪＣ、及びＳｃＢＫによって得られたライトサイクラー蛍光プロファイルである。各自己プロービング型アンプリコンを、予備増幅したＯｒｉ−３（ＳＶ４０）、Ｍａｄ１（ＪＣ）、Ｘ（ＢＫ）、及び試料ＤＮＡでチャレンジした結果を示してある。図１０ｄ〜ｆは同じ条件下で得られたｉサイクラー蛍光プロファイルである。
【図１１】本発明の方法を用いてウイルスの組み込み状態を判定するための方法を示した概略図。
【０００１】
本発明はウイルス、殊にヒトパピローマウイルスやＳＶ４０などの哺乳動物において発癌との関連が指摘されるウイルスの検出、型判定、及びキャラクタリゼーションを行うための改良法、ならびに本方法において使用するプライマー及びプローブに関するものである。本発明は更に診断キットならびに当該キットを利用したスクリーニング法に関するものである。
【０００２】
発癌性との関連が指摘される各種のウイルスが存在し、このため臨床試料中のこうしたウイルスの存在を特定する必要があるが、同様に重要な点として、細胞当りのウイルス負荷や、感染生物（最も重要なものはヒトである）におけるウイルスの組み込み状態を正確に判定することがある。したがって、感染ウイルスの型、ウイルス負荷（細胞当り、すなわち細胞当りのウイルスのコピー数、またはウイルスゲノム：ヒトゲノムの比）、ならびにウイルスの組み込み状態（ウイルスＤＮＡが細胞のサイトゾル中で「遊離」しているかホストのゲノムに組み込まれているか）を判定するための手段が与えられることが、こうした因子によって患者の診断についての重要な知見が得られることから望まれている。
【０００３】
こうした点について、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及びＳＶ４０の２つのウイルスカテゴリーを例に先ず説明する。
【０００４】
子宮頚癌は世界的に女性における癌死の頻度では第２位に位置するものである。子宮頚癌の発生率は子宮頚部スクリーニングプログラムによって低減したものの、侵襲性子宮頚癌の５０％は従来の細胞診断法を用いてスクリーニングを行った女性で発生している。近年、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の特定のサブセットの子宮頚癌への関与が指摘されており、これらの癌の９９％以上においてＨＰＶのＤＮＡが存在することが示されている。ＨＰＶでは現在８４種類の型が知られているが、このうち約３０種が生殖管に感染する。このことから、現在の細胞診断的スクリーニングレジメの補助手段または代替手段として、ＨＰＶの検出及び型判定を行う方法が検討されている。こうした手法の成否が、臨床的に応用可能な迅速、高信頼度、高感度、かつ特異的なＨＰＶの検出法の開発にかかっていることは云うまでもない。
【０００５】
現在、ＨＰＶの検出及び型判定を行う主な手法として８つの方法が知られているが、そのいずれも用途に応じた長短を有するものである。それらを表１にまとめたが、いずれも臨床及び研究の両側面において最適な方法とはいいがたいことが理解される。こうした技術の背景として、臨床試料中のＨＰＶ ＤＮＡの検出法では最も高感度なものとしてＰＣＲ法が導入された。しかしながら、遺伝子型の異なるＨＰＶ間ではヌクレオチドレベルでの相違が顕著であることから、ＨＰＶのすべての遺伝子型を検出することが可能な簡単かつ汎用性の高いＰＣＲテストの開発は困難であった。こうした状況にも関わらず、各種のＨＰＶ ＰＣＲ法が開発され、主として粘膜型のＨＰＶ遺伝子型を広範に検出することが可能となった。
【０００６】
【表１】
ＨＰＶの遺伝子は早期（Ｅ）と晩期（Ｌ）遺伝子からなり、機能的に幾つかのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に区分される。すなわち早期遺伝子として、ウイルス複製に係るもの（Ｅ１）、転写の調節に係るもの（Ｅ２）、細胞質タンパク質をコードするもの（Ｅ４）、及び悪性形質転換に係るもの（Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７）、また晩期遺伝子としてカプシドタンパク質をコードするもの（Ｌ１、Ｌ２）である。
【０００８】
共通配列プライマーであるＧＰ５とＧＰ６の組合わせは、もともとＨＰＶ−６、−１１、−１６、−１８、−３１、及び−３３からの配列情報に基づいてＨＰＶ Ｌ１領域から選択されたものであるが、ミスマッチを許容する条件下で少なくとも２７種類の粘膜型ＨＰＶ遺伝子型の標的ＤＮＡを増幅することが知られている。共通配列プライマーＧＰ５（５’−ＴＴＴ ＧＴＴ ＡＣＴ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＣ−３’）及びＧＰ６（３’−ＡＣＴ ＡＡＡ ＴＧＴ ＣＡＡ ＡＴＡ ＡＡＡ ＡＧ−５’）（Snijders et al., J. Gen. Virol. 71 173-181 (1990)）は、広範囲のＨＰＶ遺伝子型でＬ１オープンリーディングフレームの１４０〜１５０ｂｐの領域にわたる部分であり、共通配列プライマー介在型ＰＣＲで使用されてきた。この方法（ＧＰ−ＰＣＲ）の強みは、オランダにおいて細胞形態学的にＰａｐＩＶ（上皮内癌）及びＰａｐＶ（癌）として分類される頚管擦過細胞の１００％にＨＰＶ ＤＮＡが検出されたことで更に実証されている。このことは、オランダではすべての生殖管高危険型ＨＰＶをこのアッセイで検出可能なことを示唆するものである。
【０００９】
しかしながら、日常的な診断にＧＰ−ＰＣＲを用いる場合、臨床試料の数が少ない場合には、結果が不明瞭となることが示された。これは低強度のＧＰ−ＰＣＲシグナルに同時に増幅された細胞ＤＮＡの比較的高強度のバックグラウンドが重なるためである。その後、プライマーの長さを大きくすることによってより効率的な増幅が行われることが示されたことから、ＧＰ５及びＧＰ６プライマーを３’末端を高度に保存された配列として延長することが行われた。こうしたＧＰ５＋及びＧＰ６＋プライマーのＰＣＲにおける使用を、異なるＨＰＶウイルス型の長いクローンＤＮＡについてもともとのＧＰ５及びＧＰ６を用いてＰＣＲを行った場合と比較を行った結果、これらの延長された共通配列プライマーの感度は大幅に向上していることが分かった。
【００１０】
ＰＣＲに基づくＨＰＶ検出及び型判定を容易にするため、比色分析型マイクロタイタープレートを用いたハイブリダイゼーションアッセイが開発された。この方法はＧＰ−ＰＣＲにおいて１種類のビオチン化プライマー（ｂｉｏ−ＧＰ６＋）を使用するものである。ビオチン化されたＰＣＲ産物をストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート上に固定、変性した後、ジゴキシゲニン標識（ＤＩＧ−）したＨＰＶ特異的内部オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。ＤＩＧ標識されたハイブリッドは酵素免疫法（ＥＩＡ）によって検出する。この方法の発展形として、ＤＩＧ標識したＨＰＶ型特異的オリゴヌクレオチドプローブの２種類のカクテルとＥＩＡを用いることによって、共通配列プライマーＧＰ５＋／ｂｉｏＧＰ６＋によるＰＣＲを行った後に１４種の高危険型（１６、１８、３１、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６及び６８型）及び６種の低危険型（６、１１、４０、４２、４３及び４４型）ＨＰＶを群特異的に検出する方法を開発する試みがなされてきた。以下この方法をＰＣＲ−ＥＩＡと称することとする。このような高危険／低危険（ＨＲ／ＬＲ）ＨＰＶ ＰＣＲ−ＥＩＡの感度は、ＨＰＶの型に応じてＨＰＶコピー数で１０〜２００コピーの範囲である。
【００１１】
ＨＰＶ ＤＮＡに対する蛍光プローブアッセイには、増幅されたＤＮＡに結合する遺伝子型特異的プローブを用いて、ＨＰＶ−１６、−１８、−３１、−３３及び−３５型のＤＮＡのＬ１オープンリーディングフレームの一部をＰＣＲ増幅することに基づいたものがある。ＴａｑＭａｎアッセイでは、各プローブを３’末端でブロックすることでポリメラーゼによる伸長を阻止する。プライマー伸長反応においてＴａｑポリメラーゼが結合プローブと接触すると、ポリメラーゼの５’→３’方向のエキソヌクレアーゼ活性によってプローブが分解され、３’末端側のクエンチャーから５’末端側のフルオロフォアが遊離する。これによりレポーターが発する蛍光量が増大するが、この蛍光量は過剰量のプローブの存在下で、増幅前に試料中に存在するＨＰＶ ＤＮＡの量に直接関係している。「分子ビーコン」はヘアピンループ構造を有するプローブであり、このヘアピンループ構造はフルオロフォアとクエンチャーを近接状態で保持しているが、プローブが標的に特異的に結合するとヘアピンループが開いて蛍光信号が発生する。
【００１２】
一般に、ＨＰＶ ＤＮＡは子宮頚部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）病変ではエピソーム型として存在し、侵襲性癌ではウイルスＤＮＡは主としてホストゲノムに組み込まれている。子宮頚癌の多くではＨＰＶゲノムはホスト細胞の染色体に組み込まれ、ウイルスの配列と細胞の配列を含んだｍＲＮＡに転写される。これに対し、早期の前癌病変ではＨＰＶゲノムはエピソームの状態のままであり、これから生ずる転写産物はウイルスの配列のみを有している。したがって、組み込まれた状態のＨＰＶゲノムから生じたＨＰＶ転写産物が検出されることによって、憎悪の危険性が高いＣＩＮ病変ならびに侵襲性癌が具体的に示されるものと考えられる。
【００１３】
ＨＰＶ ＤＮＡが細胞の染色体に組み込まれる際、通常Ｅ２のＯＲＦの一部が失われ、Ｅ６及びＥ７のｍＲＮＡの発現の抑制が解除される。生じたＥ６及びＥ７タンパク質によって一部の癌遺伝子が活性化され、かつ／または、ホストの腫瘍抑制遺伝子産物（ｐ５３、ｐＲＢ）が不活性化されることによって細胞増殖が制御不能となり悪性形質転換が起きる。
【００１４】
したがってＨＰＶ ＤＮＡの組み込みは子宮頚癌の発癌過程における重要な遺伝子変化と考えられ、組み込みのレベルが決定可能であることは診断上重要な意味を持つと考えられる。このため一部の検出方法では、早期遺伝子、特にＥ１／Ｅ２及びＥ６／Ｅ７の阻害の特定、定量化に主眼をおいている。これらの方法は、マルチプレックスＰＣＲ（各配列に対するプライマーが同じ反応に含まれる）や組み込まれた状態のウイルスゲノム及びエピソームとして存在するウイルスゲノムから生じるＨＰＶのｍＲＮＡの区別を可能とするＲＴ−ＰＣＲなどの方法を用いて行われてきた。
【００１５】
したがって従来知られていた方法では複数の技術及び／またはプローブを用いてＨＰＶ型及び組み込み状態を検出する必要があったが、これは時間がかかり、遅く、一般に臨床用途には不向きである。更に、これらの方法のいずれも、細胞当りのウイルスのコピー数を与えるものではないことから、ウイルス負荷の決定において充分といえるものではない。これらのシステムではウイルスのコピー数と細胞のコピー数を定量化するのに異なる方法が用いられており、したがって２つのものは厳密には同等ではない。β−グロブリンやゲノムＤＮＡの他のハウスキーピング遺伝子についてのアッセイを行う従来の方法は、細胞当りではなく、１マイクログラムの細胞ＤＮＡ当りのウイルスＤＮＡコピー数の範囲を与えるものでしかない。ハウスキーピング遺伝子の他の用途はＰＣＲのコントロールとしてか、またはＰＣＲの検出限界を決定するためのものであり、ウイルス負荷に関する情報を与えるためのものではなかった。
【００１６】
ＨＰＶによって引き起こされる別の疾患として再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）がある。この疾患は喉頭では最も普通に見られる良性腫瘍であり、充分な治療法の確立されていない深刻な病態であって約２〜７％が悪性形質転換する。ＲＲＰはＨＰＶ−６及びＨＰＶ−１１の２種類のＨＰウイルスによって引き起こされるが、これらのウイルスは正常な学齢児童の５０％以上において中咽頭に検出されることからホスト側の因子の重要性は明らかである。
【００１７】
ＨＰＶの感染は若年発症型ＲＲＰでは産道の通過時に、成年発症型ＲＲＰでは口−性器の接触によって媒介されると考えられている。この疾患を有する患者では明らかな免疫不全は見られない。
【００１８】
癌、特に中皮腫（胸部及び肺内層の中皮細胞の癌）に関連があるとされているウイルスの別の例として、Ｓｉｍｉａｎ猿で最初に発見されたことに因んで命名されたサル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）がある。このウイルスは初期のポリオワクチンの夾雑物として発見され、かつては人体には無害であると考えられていたが、実験動物で腫瘍を引き起こすことが確認され、以来、骨肉腫、脳下垂体、甲状腺、脳及び神経系の腫瘍（例、グリア芽細胞腫、星状細胞腫、脳室上衣腫、及び脈絡叢乳頭腫）との関連が指摘されている。細胞当り１コピーのＳＶ４０によって細胞がトランスフォームしうると考えられることから、現在ではＳＶ４０はＨＰＶよりも腫瘍形成性が高いと考えられている。それにもかかわらず、ＳＶ４０が関与する中皮腫は成長に２０〜４０年を要するが、その悪性度は極めて高く、患者は約１８ヶ月で死に至り、米国のみで毎年約３０００人が生命を落としている。
【００１９】
ＳＶ４０の高い腫瘍形成性は、このウイルスが極少量の「ラージＴ抗原」を産生し、これがｐ５３及びＲｂ調節経路の双方を同時に遮断することによるものとされている。これに対し、ＨＰＶでは両経路を遮断するのに２種類の物質（Ｅ６及びＥ７）を産生しなければならない。ＳＶ４０はまたＤＮＡの再編成によって染色体を傷害する。したがってＳＶ４０についてもこれを正確に検出、型判定、定量化（細胞当りのウイルス負荷、及び組み込み状態）することが可能な方法が求められている。
【００２０】
脳室上衣腫、及び脈絡叢乳頭腫におけるＳＶ４０様配列の検出にもともと用いられていたＰＣＲ法が、現在ではヒト胸膜中皮腫におけるＳＶ４０の存在を確認するための重要な方法として当該分野の大多数の研究者によって用いられている。この方法では、腫瘍試料からＤＮＡを抽出し、抽出されたＤＮＡの質とその中に何らかのＳＶ４０ ＤＮＡ様配列が存在するかを確認するように設計されたプライマーによってこのＤＮＡをＰＣＲ増幅することを行う。
【００２１】
最も頻繁に用いられるプライマー（ＳＶ＝順方向、３／ＳＶ＝逆方向）は、ラージＴ抗原のＲｂ、ｐ１０７、及びＲｂ２／ｐ１３０結合ドメインをコードする配列を増幅するように設計されたものである。異なる研究者によるこの方法を用いたＳＶ４０の検出率は、０％〜１００％の範囲で異なるが（Jasani et al., Fron in Biosci 6 e12-22(2001)）、これはＤＮＡ抽出、ＰＣＲ増幅、及び生成物の検出方法の効率が異なることに少なくとも一部よるものである。
【００２２】
ウイルス負荷の検出についても、ＰＣＲ反応１回当りのＳＶ４０ゲノムのコピー数は１〜１００コピーの範囲で異なる結果が得られ、この範囲の下限が、すべての場合において、ＰＣＲ反応１回当りではなく、細胞当りのウイルスコピー数を含んでいるか否かは不明である。ＳＶ４０のＴ抗原配列を標的としたプローブに基づいたサザンブロットを行うことによって感度が向上することが示された。また複数の研究者により、複数のプライマーのセットを用いてゲノムの異なる部分のゲノム配列ならびに配列に固有な変異が特定された。こうした研究にもかかわらず、ヒト組織で検出されたＳＶ４０ＤＮＡが真にＳＶ４０に由来するものであるかについては疑義が残り、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の援助を受けた９つの研究機関が関わった共同研究を組織する必要が生じた。
【００２３】
こうした事情を鑑み、本発明は以下「自己プロービング型アンプリコンを用いたウイルス評価法」（"Viral Evaluation using Self-Probing Amplicons"（ＶＥＳＰＡ））と称するウイルス型判定のための新規な方法を提供するものである。ＶＥＳＰＡは自己プロービング型のアンプリコンプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲに基づく方法である。自己プロービング型のアンプリコンプライマーについてはウィトコム等によって述べられている（Whitcombe et al, Nat Biotechnol 17 804-7 (1999)）。
【００２４】
自己プロービング型アンプリコンプライマーは特異的プローブ配列であり、プローブの５’末端及び３’末端部分に存在する相補的なステム配列によってヘアピンループ形状に保持されたプローブ配列である。ループの５’末端に結合させられたフルオロフォア（６−カルボキシフルオレセインなど）が３’末端に結合した部分（メチルレッドなど）によって消光される。このヘアピンループはＰＣＲストッパーまたはブロッカーを介してプライマーの５’末端に結合される。ＰＣＲ増幅反応でプライマーが伸長されると、特異的なプローブ配列は同じＤＮＡ鎖上の相補的部分と結合することが可能となる。このハイブリダイゼーションによってヘアピンループが開環するために、蛍光が消光されなくなってシグナルが増大する。プライマー上のＰＣＲストッパーによってプローブまでの読み取りは防止されるので、ヘアピンループは特異的な標的配列の非存在下でも開環する。プローブまでの読み取りが起こった場合には、プライマー二量体やミスプライミングなどによる非特異的ＰＣＲ産物が検出されることになる。
【００２５】
すなわち、本明細書で用いる「自己プロービング型アンプリコン」なる用語は、上記の記載またはウィトコム（Whitcombe (1999)前出）に述べられるように、プライマー要素、プローブ要素、及びシグナリング要素（上述のフルオロフォア／クエンチャーシステムか別のシステムが用いられる）からなる分子を指すものである。すなわち、従来使用されてきた「分子ビーコン」やＴａｑＭａｎプローブと異なり、自己プロービング型アンプリコンシステムでは別個のプローブを必要としない。自己プロービング型アンプリコンは一分子的に動作し、「分子ビーコン」及びＴａｑＭａｎによる二分子プロービングと比較して単純性及び信号対雑音比の両面から見て利点を有する。更にこうした自己プロービング型アンプリコンを、プローブがミスマッチを有する標的とは解離しているが、相補的な標的とは結合したままとなっている温度における蛍光をモニタリングすることによって突然変異または対立遺伝子の区別を可能とするように改変することが可能である。これは、ウィトコム（Whitcombe）等によって述べられる自己プロービング型アンプリコンによる対立遺伝子の区別とは異なっているが、これはウィトコム等はＡＲＭＳシステムを採用しており、これによって部位が特定されるのは多型部位上のプライマーの部位であってプローブではないためである。
【００２６】
ＶＥＳＰＡ法は、迅速、高特異的、高感度、再現可能な検出を簡単に行え、ウイルス負荷を測定できる可能性を有することからウイルス検出に適している。本発明の方法については既に試験が行われており、異なる細胞系、子宮頚管擦過細胞試料、及び腫瘍生検試料を含む１０８検体の試料について型判定の結果を得るとともに、１６検体の臨床的に定義される試料について細胞当りのウイルス負荷の予備データを得ている。これに関しては実施例において後述する。
【００２７】
更に、従来の最先端のウイルス検出法及び型判定法であるＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（商標）及びＰＣＲ−ＥＩＡの双方と比較して、ＶＥＳＰＡはともなう労力が小さく、かつより迅速に結果が得られるようである。細胞系におけるＶＥＳＰＡの感度は、食品医薬品局（米国ＦＤＡ）によってＨＰＶのスクリーニングにおける使用が認可されているＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ ＩＩ（商標）（ダイジーン・コーポレーション（Ｄｉｇｅｎｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）メリーランド州、シルバースプリング所在）に関してダイジーン社によって報告されている結果（５０００コピー）と比較して最低でも２桁高い。ＶＥＳＰＡは、ゲノムＤＮＡの低バックグラウンドノイズに対して濃縮コントロールターゲットを用いて検出限界を算出するＰＣＲ−ＥＩＡ（ウイルスコピー数が１〜１００の範囲）などのこれまでに開示されている他のＨＰＶ検出法と同等の感度を有する。発癌の直接的リスクとなる正確なウイルスコピー数の閾値については議論の余地があるところであるが（またＨＰＶの型や患者によっても異なりうるが）、ＶＥＳＰＡによる検出下限よりもはるかに高い値であると考えられる。
【００２８】
子宮頚管試料において効率的なＤＮＡ増幅を阻害する阻害物質（例、ヘモグロビン）の存在が以前から報告されている。発明者等は標準的なクロロフォルム抽出法に基づいたＤＮＡ精製法を用い、ＶＥＳＰＡによって生ずるシグナルを増大させることによって、通常ＰＣＲ−ＥＩＡとともに用いられる凍結融解法によって精製した場合には弱陽性しか示さない子宮頚部スミア試料中のＨＰＶの検出が可能であることを実証した。ＶＥＳＰＡは型特異的な方法であり、試料を単に「低危険」及び「高危険」ＨＰＶ型に分類するだけのＨｙｂｒｉｄ Ｃａｐｔｕｒｅ（商標）と比較して好ましい。発明者等の研究によれば、ＶＥＳＰＡを用いて可能なＨＰＶの型判定は、最も確立されたＨＰＶの型判定法であるＰＣＲ−ＥＩＡ（κ＝０．８９）を用いて得られたデータとの相関性が高い。
【００２９】
ＳＶ４０の場合に見られるような、ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲでしばしば生ずる偽陽性を防止するため、極めて低いウイルスコピー数の検出を目的とした高感度の第１回目の増幅と特異性の高い第２回目の増幅を行うアッセイを行うことが可能である。この第１回目の増幅で用いるプライマー部位は公知の既に確立されたプライマー部位に基づいたものでよい。ＳＶ４０では、各アッセイが同等となるようにプライマー及びプローブはいずれも各ウイルスのラージＴ抗原部位を標的としたものであることが好ましい。第２段階では自己プロービング型アンプリコンプライマーとリアルタイムＰＣＲを用いることによって増幅と検出を同時に行う。
【００３０】
検出や型判定に加え、ＶＥＳＰＡではウイルス負荷を推定することが可能である（存在するウイルスの全体量ではなく、細胞当りの）。細胞当りのウイルス負荷は患者の診断において重要な決定因子であることの証左が多く示されている。実際、例えばいわゆる「高危険」型が高危険度であるのは、その悪性転換タンパク質の発癌性が高いためではなく、単にこれらのウイルスの増殖がより効率的であり、免疫応答を凌駕することによるものである可能性がある。
【００３１】
ウイルスのスクリーニングにおけるＶＥＳＰＡの使用の可能性を広げるため、本発明ではテール付加した共通配列プライマーと組み合わせて使用するための変性した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ウイルス自己プロービング型アンプリコンの混合物を更に提供する。テール付加プライマーの使用により、１種類の自己プロービング型アンプリコンによって多くの異なるウイルス増幅産物を認識することを可能とするコンセンサス部位を導入することが可能である。理論的にはこのプライマーの組合わせによって４０以上の異なるＨＰＶの型を検出することが可能である。
【００３２】
ジャコブ等（Jacobs et al., J Clin Microbiol 35, 791-5 (1997)）によって述べられるＰＣＲ−ＥＩＡ法では、ウイルスＤＮＡを従来技術であるコンセンサスプライマー（ＧＰ５＋／ＧＰ６＋）を用いて増幅した後、電気泳動を行ったアガロースゲルをエチジウムブロマイド染色によって分析する。増幅産物が観察されれば、型特異的プローブを用いたＥＬＩＳＡによって型判定する。しかし実際には、アガロースゲル電気泳動の感度は増幅が不十分なＤＮＡを検出できるほどには充分に高くないため、すべての試料はＥＬＩＳＡによって型判定が行われる。ＶＥＳＰＡによれば予備的な型判定段階での感度が高くなることによってこの問題を回避することができる。テール付加プライマーの考え方は公知のものであるが、テールをプライマー部位として、またこのプライマーを自己プロービング型アンプリコンのプローブ結合部位として利用するという考え方は新規なものである。
【００３３】
したがってヒトパピローマウイルスやＳＶ４０の感染などのウイルスのキャラクタリゼーションを行うための本発明の方法は、現時点で利用可能な方法と比較した場合に、より迅速（＜１時間）、より特異的（塩基１個での区別が可能）、かつより少ない手間（一段階）で行うことが可能であり、また多くの方法と異なり、細胞当りのウイルス負荷の推定が可能である。本方法はまたウイルスの組み込み状態を調べるために使用することも可能である。特に重要な点としては、本発明の方法ではテール付加プライマーを用いることにより複数のウイルス型の決定が可能な点である。
【００３４】
本発明を図面を参照しながら以下に説明する。
【００３５】
したがって本発明は、１以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる哺乳動物などの動物から得られる試料中の哺乳動物ウイルスを含む動物ウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有するとともに該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）ウイルスシグナリングシステムであって、前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能な信号を発生することによって前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が前記検出可能信号によって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能信号が発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記ウイルスプローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程と、からなる方法を提供するものである。（この方法は図８及び９に概略的に示されている。）
本発明においては、核酸配列がＤＮＡ配列であるような方法が特に好ましい。
【００３６】
細胞当たりのウイルス負荷を求めるうえで特に有効であるよう、本方法は細胞のハウスキーピング遺伝子のＤＮＡを検出するように設計された自己プロービング型アンプリコンを用いて行われることが好ましい。本発明で用いる「細胞ハウスキーピング」または「ハウスキーピング」遺伝子とは、細胞中に安定的に存在することから試料中における細胞の存在を示すベースラインの指標とするのに適当な遺伝子のことである。
【００３７】
したがって本発明は更に、１以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる試料中のウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が該検出可能シグナルによって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記プローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程と、
（ＩＩＩＡ）前記試料から得られたハウスキーピング核酸配列を自己プロービング型アンプリコン（「ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）前記ハウスキーピング核酸配列とハイブリダイズ可能なハウスキーピングプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてハウスキーピングプライマー伸長産物を生成するハウスキーピングプライマーと、
（ｉｉ）ハウスキーピングプローブであって、前記プローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ハウスキーピングプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なハウスキーピングプローブと、
（ｉｉｉ）前記ハウスキーピングプローブ配列が前記ハウスキーピングプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ハウスキーピング核酸配列の有無が前記検出可能シグナルによって示されるハウスキーピングシグナリングシステムと、を有する；と
（ＩＩＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＶ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＩＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＶ）前記ハウスキーピング核酸配列から前記ハウスキーピングプライマー伸長産物を分離し、前記ハウスキーピングプローブをハウスキーピングプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記ハウスキーピングシグナリングシステムを監視する工程と、からなる方法を提供するものである。
【００３８】
ハウスキーピング遺伝子として適当なものとしては、β−グロブリン、アクチン、トロポミオシン、及びグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）が挙げられる。好ましくはハウスキーピング遺伝子はβ−グロブリンである。β−グロブリンは本発明による細胞当たりのウイルス負荷分析におけるヒトゲノムＤＮＡの参照遺伝子として特に好適である。
【００３９】
好ましくは、細胞当たりのウイルス負荷は、「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」がハイブリダイズする際に発生するシグナルと、「ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコン」がハイブリダイズする際に発生するシグナルを比較することによって求めることが可能である。例えば、細胞当たりのウイルス負荷は単に２つのシグナルの比として定量化することが可能である（図４及び５を参照）。
【００４０】
同じ実験でウイルスの型と細胞当たりのウイルス負荷の両方を都合よく求めるため、複数のシグナリングシステムを用いることで、ウイルスの型及びハウスキーピング遺伝子の存在をこれらのシグナルによって区別して識別することが可能である。また、（Ｉ）及び（ＩＩ）並びに（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）工程を別個の実験でそれぞれ行うことも可能である。
【００４１】
本発明の方法において好適なシグナリングシステムとしては、自己プロービング型アンプリコンが更に６−カルボキシフルオレセイン／メチルレッドなどのフルオロフォア／クエンチャーの組合わせからなる場合のように、蛍光に基づいたシステムが挙げられるが、他のシグナリングシステムを用いることも可能である。
【００４２】
増幅工程はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行うことが好ましいが、本方法は別の増幅法が使用できるように適宜改変することが可能である。より好ましくはＰＣＲは「リアルタイム」にて行われる。したがって、アンプリコンの検出はリアルタイムＰＣＲ装置、特にｉサイクラー（バイオ・ラド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories）、英国）を用いて行われることが好ましい。
【００４３】
自己プロービング型アンプリコンは当該技術分野では公知の任意の適当な方法によって、プローブがプライマー増幅条件下で増幅されないように改変することが可能である。例えば、自己プロービング型アンプリコンのプローブ要素までの読み取りを防止するため、プライマー要素はヘキセチルグリコール（ＨＥＧ）などの増幅ブロッカーまたはストッパーを更に含むことが好ましい。
【００４４】
標的核酸配列からのプライマー伸長産物の分離は当該技術分野における標準的方法によって行うことが可能である。好ましくは分離工程（ＩＩ）及び／または（ＩＶ）は熱変性によって行われる。
【００４５】
標的ウイルス核酸配列は動物、特に哺乳動物、特にヒトにおける疾患や臨床的状態と関連するウイルスの存在を示すことができるものであることが好ましい。特にウイルスがヒトＨＰＶである場合が好ましい。好ましくはウイルスはＨＰＶの６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、４０、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６及び６８型の１以上から選択される。
【００４６】
こうした場合、自己プロービング型アンプリコンはそれぞれＳｃ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、５１、及びＳｃ５６と名付けられた自己プロービング型ウイルスアンプリコンに対応した、配列番号１〜９より選択される配列を有するものであることが好ましい。ここでＳｃＸとは、自己プロービングＨＰＶのｘ型という意味である（後述の実施例１の表２を参照）。特に好ましいのは、プローブが上記に述べた配列、すなわち配列番号２１〜２９より選択される配列を有するプローブ要素である場合である（図１及び３を参照）。
２１ ATAAAGAGTACATGCGT
２２ CAGATTATAAGGAATACATGC
２３ AGTACCTACGACATGGG
２４ AGCAGTATAGCAGACATG
２５ GAGTATTTAAGACATGGTG
２６ CTTTATGCACACAAGAAC
２７ AATATACCAGGCACGTG
２８ GCAATATATTAGGCATGGG
２９ TCAGTACCTTAGACATGTG
プライマーは上記に述べた配列、すなわちＧＰ６＋及び配列番号３２〜４０から選択される配列を有するプライマー要素であることが好ましい。
【００４７】
配列番号３２ GAAAAATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３３ GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC
配列番号３４ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
配列番号３５ GAAAAATAAACTGCAAATCATATTC
配列番号３６ GAAATATAAATTGTAAATCAAATTC
配列番号３７ GAAAAACAAACTGTAGATCATATTC
配列番号３８ GAAATATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３９ AAAAATAAATTGCAATTCATACTC
配列番号４０ GAAAAACAAATTGTAACCCATATTC
好ましくはウイルスはＳＶ４０または一般的で相同性の高いＪＣ及びＢＫウイルスである。その場合、自己プロービング型アンプリコンは後述の実施例６の表８に列記したものから選択される配列を有するものであることが好ましい。表中、Ｓｃｘは自己プロービング型のＳＶ４０、ＪＣまたはＢＫウイルス（ｘ）のアンプリコンを表す。これらの配列は、ポリオーマウイルスを高信頼度で検出することが可能な、当該技術分野における他の方法によって得られる結果と直接比較が可能であることが知られている部位を特異的に標的とするものである。好ましい順方向プライマーは表８に示したようなＰ１プライマーである。
【００４８】
特にＨＰＶ（ＶＥＳＰＡ−ＨＰＶ）に適用される本発明の方法では、ＰＣＲ増幅反応は明細書中で定義されるＧＰ５＋リバースプライマーを用いて行うことが好ましい。ＧＰ５＋はＨＰＶの２０種の最も一般的な型を増幅することが可能な既知の変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーであるが、他の変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プライマーを代わりに使用することも可能である。ＶＥＳＰＡ−ＳＶ４０を行ううえで特に好ましいのは、表８に詳しく示すような、Ｐ２またはＰ３プライマーの逆方向プライマーとしての使用である。こうした方法として好ましいものとして、１以上の増幅工程がネスト（ｎｅｓｔｅｄ)ＰＣＲを用いて行われる方法がある。
【００４９】
ウイルス負荷（細胞当たりの）の判定に使用するうえで好ましい自己プロービング型アンプリコンが、後述の実施例２の表３にＳｃＢＧ（配列番号１１）として示されている。特に好ましいのはこうした自己プロービング型アンプリコンのプローブ要素が配列番号３１である場合である。
３１ ATGGTGTCTGTTTGAG
更により好ましくは、「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」には、試料細胞のゲノム中のウイルスゲノムの組み込み状態を判定するためにＨＰＶのＥ１、Ｅ２、Ｅ６及び／またはＥ７遺伝子の変化の検出を可能とするものが挙げられる。組み込み状態は２つの異なる評価方法を用いて測定することが可能である。
【００５０】
（ｉ）線形のウイルスＤＮＡに対する環状ウイルスＤＮＡの比、及び、
（ｉｉ）細胞形質転換タンパク質に対する細胞周期を調節するウイルスタンパク質の比。
【００５１】
これらの方法のうち第１の方法（ｉ）を図１１に示した（パーク等（Park et al., Gynecol Oncol 65(1) 121-9 (1997)））。本発明の方法を用いて、環状のウイルスＤＮＡの量について各試料を評価する。この評価は、ウイルスＤＮＡの予測される開裂点の手前（Ｅ１タンパク質の中央）でウイルスＤＮＡと結合するように設計された自己プロービング型アンプリコンと、予測されるウイルス開裂点の後（Ｅ６または好ましくはＥ７タンパク質の内部）でウイルスＤＮＡと結合するように設計された逆方向プライマーを使用することで行うことが可能である。この評価は環状のウイルスＤＮＡの量を反映したものである。この結果を上述の本発明の方法によって求めた全ウイルスＤＮＡ量と比較して環状のウイルスＤＮＡのパーセンテージを求めることが可能である。
【００５２】
これらの方法のうちの第２の方法（ｉｉ）は、ウイルスＤＮＡのホストゲノムへの組み込みの際、ウイルスＤＮＡの複製及びタンパク質への翻訳の調節に因るウイルスＤＮＡの部分が切り出されることを利用したものである。これによって発癌の原因となることが知られるタンパク質が制御不能状態で複製されることとなる。したがって、形質転換タンパク質（Ｅ６及びＥ７）に対する調節タンパク質（Ｅ１及びＥ２）の比を定量的に測定することによって、その試料が悪性形質転換を起こそうとしている患者から得られたものである確率の評価を行うことが可能となる。
【００５３】
したがって本発明は更に、１以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる試料中のウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が該検出可能シグナルによって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記ウイルスプローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程とからなる方法において、
「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」がＨＰＶのＥ１、Ｅ２、Ｅ６、及び／またはＥ７遺伝子の検出、定量、または評価を可能とするように構成されていることを特徴とする方法を提供するものである。
【００５４】
したがって本発明は更に、後述の実施例４の表６中で定義されるこうした「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」すなわち、Ｓｃ１６−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１６−Ｅ２、Ｓｃ１６−Ｅ６、Ｓｃ１８−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１８−Ｅ２及びＳｃ１８−Ｅ６（それぞれ配列番号１１〜１７）を提供するものである。本発明は更に、それぞれ配列番号４１〜４６及び４７〜５２に相当する、これらの配列のそれぞれのプローブ部分とこれらの配列の新規なプライマー部分とを有する配列を提供するものである。
配列番号４１ GCAAAGAGTAATCATTA Sc16-E1midプローブ
配列番号４２ TTGTCATATAGACATATCATTTTCAT Sc16-E2プローブ
配列番号４３ CGAATGTCTACATATCATGGC Sc16 E6プローブ
配列番号４４ TCGGTGTCTCCATGTTG Sc18 E1midプローブ
配列番号４５ TACATTGTCATGGTCTATGAT Sc18-E2プローブ
配列番号４６ CTGGAATGCTATATCATG Sc18-E6プローブ
配列番号４７ CAGAATGGATACAAAGACAAACAGT Sc16-E1midプライマー
配列番号４８ CAACGTTTAAATGTGTGTCAGGA Sc16-E2プライマー
配列番号４９ AAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC Sc16 E6プライマー
配列番号５０ AGTAATGGGAGACACACCTGAGT Sc18 E1midプライマー
配列番号５１ GCAGACACCGAAGGAAACCC Sc18-E2プライマー
配列番号５２ ACCCAGAAAGTTACCACAGTTAT Sc18-E6プライマー
本発明の方法では、標的が１以上のウイルスから得られた１以上の核酸配列からなるか、かつ／または、ウイルスプライマー要素が標的に対してある程度の変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を示すことによりウイルスプライマーが標的の核酸配列のそれぞれと完全に相補的とはなっておらず、多くの異なる「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」を用いて試料を多数回テストする必要が避けられるので都合がよい。
【００５５】
しかしながら、スクリーニングを目的とした場合、予備的なアッセイを行って試料中にいずれかのウイルスまたはウイルスのカテゴリーが存在するか否かを最初に確定させておくことがより好都合な場合もある。このアッセイの結果がポジティブであった場合には、本発明の方法によって可能となる特定の型の判定及び定量化アッセイを行う。こうした予備アッセイでは、上記に述べたものなど、ウイルス検出のための従来知られているいずれの方法を用いることも可能であるが、予備アッセイは、ウイルスのプライマー伸長産物にテール付加プライマーを最初に組み込む本発明の方法を用いることが好ましい。テールは例えばＰＣＲ条件下で複数のウイルスやＨＰＶなどのウイルス型のウイルス核酸配列を増幅することが可能な核酸配列を有する。これは自己プロービング型アンプリコンにテール付加プライマーの概念が適用された最初の例であると考えられている。
【００５６】
したがって本発明は、以下の工程：
（０）（Ａ）前記試料から得た標的ウイルス核酸配列を「テール付加プライマー」と接触させる工程；該テール付加プライマーは、
（ｉ）前記ウイルス核酸配列のコンセンサス配列に相補的な核酸配列（「コンセンサスプライマー配列」）を有するプライマー領域であって、該コンセンサス配列にハイブリダイズ可能であるとともにプライマー増幅条件下で該コンセンサス配列を増幅してテール付加プライマー伸長産物を生成するプライマー領域と、
（ｉｉ）本方法（「デザイナー」配列）のいずれの成分中にも存在せず、またいずれの成分によっても調製されない固有の配列を有するテール領域とからなる；と、
（０）（Ｂ）前記「デザイナー」配列が前記プライマー伸長産物に組み込まれるように前記プライマー増幅条件下で少なくとも２回の増幅反応を行う工程と、を更に含む方法であって、
「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」のプライマー要素は「デザイナー」配列に結合可能であり、ウイルス自己プロービング型アンプリコンのプローブ要素は前記コンセンサスプライマー配列に対して相補的であることを特徴とする方法を提供するものである。
【００５７】
したがって本発明の好適な一方法では、１回の反応ですべての型のＨＰＶについて試験を行うために、固有の自己プロービング型アンプリコンの標的部位を増幅（プライマー伸長）産物に導入する。従来のコンセンサスプライマー（例えば一般的なＨＰＶの２０種類の型すべてを増幅できるもの）に固有の「デザイナーテール」を付加することによってこの目的を達成することができる。本発明における使用に好適なテール付加プライマーの一例を実施例５の表７に示した（配列番号１８）。また本発明における使用に適当な変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）自己プロービング型アンプリコンを２例、実施例５の表７に示した（配列番号１９及び２０）。これらの配列は更に適当なプライマー及びプローブ要素を含んでいる（図６及び７参照）。
【００５８】
したがって本発明は更に、これらの配列の新規なテール部分（配列番号１０）を提供するものである。これらの配列のプローブ部分は既知のＧＰ６＋配列に結合するように設計されている。
配列番号１０：ATGTGGAAACATGCATGG 配列番号１８のＧＰ６＋テール
特に好ましいのは本発明の方法をスクリーニングプログラムの一部として使用し、本発明の自己プロービング型アンプリコンがこうしたスクリーニングプログラムでの使用を目的として構成される場合である。
【００５９】
したがって本発明は更に：
（ａ）ウイルス感染が疑われる患者のスクリーニングを行うためのスクリーニング法であって、
（ｉ）前記患者から核酸配列の試料を得る工程と、
（ｉｉ）上記に記載の本発明の方法を前記試料に行う工程とを含み、これにより前記ウイルスシグナリングシステムからの検出可能シグナルが検出されればウイルス感染があったことが示され、ウイルスシグナリングシステムからの検出可能シグナルが検出されなければウイルス感染がなかったことが示される方法と、
（ｂ）更に特定のウイルス型の有無が示されることを特徴とする（ａ）に記載のスクリーニング法と、
（ｃ）ウイルスが存在する場合、更に細胞当たりのウイルス負荷（ウイルスが存在しない場合にはゼロ）が示されることを特徴とする（ａ）または（ｂ）に記載のスクリーニング法と、
（ｄ）ウイルスが存在する場合、ウイルスの組み込み状態が更に示されることを特徴とする（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載のスクリーニング法と、
（ｅ）子宮頚癌、再発性呼吸器乳頭腫症やヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の患者における存在に関連した別の状態に関してスクリーニングを行うように適合されていることを特徴とする（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のスクリーニング法と、
（ｆ）胸部及び肺の癌を含む中皮腫；骨肉腫、脳下垂体、甲状腺、脳及び神経系の腫瘍（例、グリア芽細胞腫、星状細胞腫、脳室上衣腫、及び脈絡叢乳頭腫）、ＳＶ４０、ＪＫ及び／またはＢＫウイルスに関連した他の状態の１以上のスクリーニングを行うように適合されていることを特徴とする（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載のスクリーニング法とを提供するものである。
【００６０】
本発明の方法はＤＮＡに対して行われることが好ましいが、当業者には周知の方法によってＲＮＡに対して行われるように改変することも可能である。その場合、市販の逆転写酵素の任意のものを用いて先ずＲＮＡをＤＮＡに転写してから上記に述べた方法を行う。
【００６１】
本発明はまた、本発明の方法で使用するための診断キットであって、本発明のウイルス自己プロービング型アンプリコン、ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコン、またはテール付加プライマーの１以上を含むキットを提供するものである。特に好ましいのは、細胞当たりのウイルス負荷を決定するための本発明の方法での使用に適当なキットであって、少なくとも１種類のハウスキーピング自己プロービング型アンプリコンと場合に応じてテール付加プライマーを含む、少なくとも２種類、好ましくは４種類以上の自己プロービング型アンプリコンからなるものである。やはり好ましいものとして、ＨＰＶのＥ１、Ｅ２、Ｅ６及びＥ７遺伝子の少なくとも１つを標的とした少なくとも１種類の自己プロービング型アンプリコンからなるキットがある。
【００６２】
これらの自己プロービング型アンプリコンの多くはそれ自体新規かつ進歩的なものである。したがって本発明は更に、
（ａ）（ｉ）配列番号１〜９（Ｓｃ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、５１及び５６）と、
（ｉｉ）配列番号１１（ＳｃＢＧ）と、
（ｉｉｉ）配列番号１２〜１７（Ｓｃ１６−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１６−Ｅ２、Ｓｃ１６Ｅ６、Ｓｃ１８Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１８−Ｅ２，Ｓｃ１８−Ｅ６）と、
（ｉｖ）配列番号１８〜２０（テール付加プライマー）と、
（ｖ）下記表８に示される配列（ＳＶ４０、ＪＣ、またはＢＫの判定に用いられる自己プロービング型アンプリコン）とを含む、本明細書中に記載の新規な自己プロービング型アンプリコンと、
（ｂ）（ｉ）配列番号２１〜２９（（Ｓｃ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、５１及び５６）のプローブ要素）と、
（ｉｉ）配列番号３１（ＳｃＢＧのプローブ要素）と、
（ｉｉｉ）配列番号４１〜４６：
配列番号４１ GCAAAGAGTAATCATTA Sc16-E1midプローブ
配列番号４２ TTGTCATATAGACATATCATTTTCAT Sc16-E2プローブ
配列番号４３ CGAATGTCTACATATCATGGC Sc16 E6プローブ
配列番号４４ TCGGTGTCTCCATGTTG Sc18 E1midプローブ
配列番号４５ TACATTGTCATGGTCTATGAT Sc18-E2プローブ
配列番号４６ CTGGAATGCTATATCATG Sc18-E6プローブ
と、
（ｉｖ）配列番号１９及び２０（テール付加プライマー）のプローブ要素である配列番号５９及び６０：
配列番号５９ GAAGAATATGATTTACA
配列番号６０ GAGGAATATGATTTACA
と、
（ｖ）表８に列記した配列（ＳＶ４０、ＢＫ及びＪＣの自己プロービング型アンプリコン）のプローブ要素である配列番号５３〜５５：
配列番号５３ ACCCCAAGGACTTTCCT
配列番号５４ CCTATGGAACAGATGAATG
配列番号５５ ACCCTAAAGACTTTCCC
と、を含む（ａ）の新規なプローブ要素と、
（ｃ）（ｉ）配列番号３２〜４０（それぞれＳｃ６、１１、１８、３１、３３、３９、５１、及び５６のプライマー要素）：
配列番号３２ GAAAAATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３３ GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC
配列番号３４ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
配列番号３５ GAAAAATAAACTGCAAATCATATTC
配列番号３６ GAAATATAAATTGTAAATCAAATTC
配列番号３７ GAAAAACAAACTGTAGATCATATTC
配列番号３８ GAAATATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３９ AAAAATAAATTGCAATTCATACTC
配列番号４０ GAAAAACAAATTGTAACCCATATTC
と、
（ｉｉｉ）配列番号４７〜５２、特にＥ１ ｍｉｄプライマー配列（配列番号４７〜５０）：
配列番号４７ CAGAATGGATACAAAGACAAACAGT Sc16-E1midプライマー
配列番号４８ CAACGTTTAAATGTGTGTCAGGA Sc16-E2プライマー
配列番号４９ AAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC Sc16 E6プライマー
配列番号５０ AGTAATGGGAGACACACCTGAGT Sc18E1midプライマー
配列番号５１ GCAGACACCGAAGGAAACCC Sc18-E2プライマー
配列番号５２ ACCCAGAAAGTTACCACAGTTAT Sc18-E6プライマー
と、
（ｉｖ）配列番号１９及び２０（テール付加プライマー）のプライマー要素である配列番号６１：
配列番号６１ GTGGAAACATGCATGGCGAC
と、
（ｖ）表８に列記した配列（ＳＶ４０、ＢＫ及びＪＣの自己プロービング型アンプリコン）のプライマー要素である配列番号５６〜５８：
配列番号５６ AGCATGACTCAAAAAACTTAGCAATTCT
配列番号５７ TTCTCATTAAATGTATTCCACCAGGATT
配列番号５８ AGCTTGACTAAGAAACTGGTGTAGATCA
と、を含む（ａ）の新規なプライマー要素と、
（ｄ）配列番号１０：ATGTGGAAACATGCATGG ＧＰ６＋テールプライマーのテール配列
とを提供するものである。
【００６３】
更に本発明は、上記に述べた方法またはキットの調製における、プローブやプライマー要素を含むこうした自己プロービング型アンプリコンの使用法を提供するものである。
【００６４】
次に本発明を以下の実施例によって説明する。
実施例１ ＶＥＳＰＡを用いたウイルス検出法
一般的材料及び方法
細胞系
ＨｅＬａ、Ｃａｓｋｉ、及びＳｉＨａ細胞系はスティーブ・マン博士（Dr. Steve Man, ユニバーシティ・オブ・ウェールズ、カレッジ・オブ・メディシン、カーディフ、英国）から提供されたものを使用した。これらはＡＴＣＣから入手可能である（American Type Culture Collection, http://www.atcc.org/）。
臨床試料
患者は、ランダウ病院（Llandough Hospital, カーディフ、英国）における通常の膣鏡検査から、または西アフリカでのＭＲＣ野外調査の一部として見出されたものである。すべての患者からインフォームドコンセントによりＨＰＶについてスミアを分析する同意を得たが、その方法は秘した。円錐状の細胞ブラシを用いて子宮頚部の試料を採取し、０．５ｍｌのダイジーン製輸送用培地に入れて輸送した（ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ）、米国メリーランド州、シルバースプリング所在）。英国内で採取された試料は処理を行う前に最大２４時間、４℃で保存した。ガンビアで採取された試料は液体窒素中に凍結保存し、１ヶ月以内に処理を行った。ユニバーシティ・ホスピタル・オブ・ウェールズ（The University Hospital of Wales、カーディフ、英国）及びランダウ病院（Llandough Hospital, ペナース、英国）において、インフォームドコンセントにより、再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）及び子宮頚癌に対する治療を行っている患者から生検試料を採取した。
ＤＮＡ精製
６４０μｌの細胞核溶解バッファ（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ、０．４Ｍ ＮａＣｌ、２ｍＭ エチレンジアミンテトラアセテート ｐＨ８．０、１０％ドデシル硫酸ナトリウム）、１００μｌの６Ｍ ＮａＣｌ、及び７４０μｌのクロロフォルム中に細胞を再懸濁して細胞系からＤＮＡを精製した。この溶液をよく混合し、遠心して上層を抽出した。
１ｍｌの９５％エタノールを加えてＤＮＡを沈降させ、遠心してペレットを得た。このペレットを７０％エタノールで２回洗浄し、ロータリーエバポレータで乾燥し、５００μｌの脱イオン水に再懸濁した。ジャコブ等（Jacobs et al., J Clin Microbiol 35, 791-5 (1997)）によって述べられる凍結融解法の簡単な改良（試験管の壁に細胞ブラシを押しつけ、凍結時間を２時間から２４時間と長くした）によって、子宮頚部から細胞ブラシで得た試料よりＤＮＡを抽出した。細胞ブラシ試料から得た上皮細胞を遠心してペレットとし、１ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）に再懸濁し、−７０℃で２４時間凍結した。１００μｌを融解し、１０分間沸騰させ、氷冷し、微量遠心機で３分間１３，０００ｒｐｍで遠心し、上清を捨て、保存した。上記方法の改良法を用いて生検試料からＤＮＡを抽出した。改良法では、沸騰に先立って、１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（シグマ社、英国）を含む１ｍｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で１時間、５６℃で試料をインキュベートした。
【００６５】
ＰＣＲ−ＥＩＡ−比較方法
ジャコブ等（前出）によって述べられる方法にしたがってＰＣＲ−ＥＩＡを行った。
ＶＥＳＰＡ法
プライマーの設計
表２にこの研究で用いた１０種の自己プロービング型アンプリコンプライマーの配列を示した。プライマーはすべてオズウェル・リサーチ・プロダクツ（Oswel Research Products, サザンプトン ＳＯ１６ ７ＰＸ、英国）によって合成されたものである。
【００６６】
自己プロービング型アンプリコンプライマーはすべて２重ＨＰＬＣによって精製した。スタンダードプライマーはゲル濾過により精製した。これらのプライマーはＨＰＶ Ｌ１遺伝子を検出するように設計されたものである。プライマーの位置はウイルスの型間で異なったが、約６６００〜６７５０ｂｐの間に位置していた。
【００６７】
各自己プロービング型アンプリコンの順方向プライマー配列は型特異的であり、ジャコブ等（前出）によって述べられるＧＰ６＋プライマーと同じ配列位置に位置するものである。自己プロービング型アンプリコンプローブ配列は２０種の一般的なＨＰＶの型（ＨＰＶ−６，１１，１６，１８，３１，３３，３９，４０，４２，４３，４４，４５，５１，５２，５６，５８，５９，６６及び６８）（http://hpv-web.lanl.gov）のＬ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を並べることによって設計した。ジャコブ等（前出）のＧＰ６＋プライマー結合部位の隣接領域で最も配列の変化が大きい領域をプローブの標的結合部位として選択した。これらのプライマーのプローブ配列を７０種の一般的なパピローマウイルス配列に対して確認を行ったが大きな相同性は認められなかった。ＳＣ１６プライマー要素は既知のＧＰ６＋配列からなる。逆方向のプライマー標的配列はジャコブ等（前出）のＧＰ５＋配列である。
【００６８】
【表２】
プライマーの確認−参照細胞系でのＶＥＳＰＡ
ＨＰＶ ＤＮＡを組み込まれた状態で有する参照細胞系を用いてＨＰＶ１６及び１８プライマーを特異性について調べた。Ｃａｓｋｉ細胞系は細胞当り６０〜６００コピーのＨＰＶ−１６のＯＲＦを含み、ＨｅＬａ細胞系は１０〜５０コピーのＨＰＶ−１８のＬ１ＯＲＦを含んでいた。
【００７０】
図１ａは、Ｓｃ１６自己プロービング型アンプリコンプライマー（ＨＰＶ−１６ＤＮＡの検出用に設計されたもの）と、ＨＰＶ−１６ポジティブであるＣａｓｋｉ細胞系から抽出されたＤＮＡ、ＨＰＶ−１８ポジティブであるＨｅＬａ細胞系から抽出されたＤＮＡ、及びネガティブコントロール（ＤＮＡを含まない）を用いて行ったＰＣＲ反応の結果を示したものである。Ｃａｓｋｉ ＤＮＡを含むＨＰＶ−１６でのみ有意な蛍光の増大が検出された。
【００７１】
図１ｂは、Ｓｃ１６の代わりにＳｃ１８自己プロービング型アンプリコンプライマーを用いて同様な実験を行った結果である。ＨＰＶ−１８ポジティブであるＨｅＬａ細胞系においてのみ著明な蛍光が検出された。次にこれらのプライマーを用いて、予めＰＣＲ−ＥＩＡによって型判定を行った臨床試料中のＨＰＶ−１６及び−１８の検出を行った（図２ｃ及び図２ｄ 下記参照）。
【００７２】
ＶＥＳＰＡによるＨＰＶの検出
０．５μＭの自己プロービング型アンプリコンプライマー、及び０．５μＭのジャコブ等（前出）によって述べられるＧＰ５＋逆方向プライマーを用いて１μｌのＤＮＡ溶液のＰＣＲ増幅を行った。全反応容量は１０μｌであった。反応はライトサイクラー（Light Cycler, バイオ／ジーン社（Bio/Gene）、キンボルトン、ケンブリッジシャー州、ＰＥ１８ ０ＮＪ、またはロシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics Ltd）、ベルレーン、ルイス、イーストサセックス州、ＢＮ７ １ＬＧ）を用いて行い次のサイクルパラメータで１００サイクル行った：９６℃−１秒、４０℃−５秒、７２℃−１秒。反応条件は以下のとおり。２００μＭ ｄＮＴＰｓ、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．９）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．１％ Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、ウシ血清アルブミン ２５０ｎｇ／μｌ、及び０．５Ｕ／μｌ Ｔａｑポリメラーゼ（アドバンスド・バイオテクノロジーズ社（Advanced Biotechnologies）、エプソム、サリー州、英国）。蛍光は４０℃で第１チャンネル（５３０ｎｍ）で検出した。
【００７３】
コントロールＰＣＲ反応は、１μｌのＳＹＢＲ Ｇｏｌｄ（バイオ／ジーン社（Bio/Gene）、キンボルトン、ケンブリッジシャー州、ＰＥ１８ ０ＮＪ）を加えた以外は上記と同様にして行った。自己プロービング型アンプリコンのコントロール反応（ネガティブコントロール）にはＤＮＡの代わりに１μｌ Ｈ２Ｏを加えたものを用いた。
【００７４】
次いでＨＰＶ−６、−１１、−３１、−３３、−３９、−５１、及び−５６型の検出を可能とすべくＶＥＳＰＡ法の拡張を行った。これらのＨＰＶ型を含んだ細胞系は市販されていないため、実施例３に関して下記表５に示されるように、ＰＣＲ−ＥＩＡを用いて予めテストした臨床試料を用いてプライマーの特異性を確認した。図２（ａ〜ｈ）は、ＨＰＶ−６、−１１、−１６、−１８、−３１、−３３、−３９、及び−５１の型判定反応のポジティブな結果をそれぞれ示したものである。
【００７５】
実施例２−ＶＥＳＰＡを用いたウイルス負荷の決定
自己プロービング型アンプリコンによるＰＣＲの理論上の利点として、ウイルス負荷が決定できる点がある。図３は、ＳｉＨａ細胞系の連続希釈液を用いて行ったＳｃ１６の型判定反応の結果である（細胞当り１〜２コピーのＨＰＶ−１６）。細胞当りのＨＰＶコピー数が５０，０００〜５００である連続希釈液は明確に区別が可能であり、ＨＰＶ−１６のＤＮＡを１コピーだけ含む試料でもＨＰＶ−１６のシグナルはポジティブであった。
【００７６】
細胞当りのウイルス負荷を決定することが可能な方法の確立を検討すべく、（ヒト）β−グロブリンＤＮＡ（ＳｃＢＧ、表３中の配列番号：１１）を検出するプライマーを設計した。
【００７７】
【表３】
図４は、ＨＰＶ−１６について上記で用いたものと同様のＳｉＨａ細胞の連続希釈液に対して、ヒトβ−グロブリン遺伝子を検出するように設計された自己プロービング型アンプリコンを用いて行った実験結果を示したものである。ここでもやはりシグナルは１個の細胞までポジティブを示し、細胞当りコピー数が５０以上であれば定量的な検出が可能である。図５は、Ｓｃ１６及びＳｃＢＧによって発生する蛍光比を標的ＤＮＡの細胞当りのウイルスコピー数の対数に対してプロットしたものである。細胞当たりコピー数を、２つの異なる希釈度間の比を計算することにより、一定のコピー数を含む細胞系から計算することが可能である。例えば、細胞５０００個に対するＳｃ１６のＦｍａｘ値を細胞１００個に対するＳｃＢＧのＦｍａｘ値で割ることによって細胞当たりのコピー数が５０である概念上の細胞系に対する値（５０００／１００）を求めることが可能である。
【００７９】
病気のグレードを細胞学によって判定した。Ｓｃ１６のＦｍａｘをＳｃＢＧのＦｍａｘで割ることによってＶＬ比（ウイルス負荷）をＲＳＵ（相対自己プロービング型アンプリコン単位）で求めた。図５に示したスタンダード曲線を用いて細胞当たりのウイルスコピー数を推定した。
【００８０】
【表４】
表４は、このウイルス負荷判定法を、ＰＣＲ−ＥＩＡによって予めＨＰＶ−１６ポジティブであると判定された（ジャコブ等（前出）による）１６検体の臨床試料に対して適用した結果を示したものである。これらの実験から得られる最も注目すべき知見は、細胞学的所見が正常である４検体の子宮頚部スミアでは、ＶＥＳＰＡを用いた場合にウイルス負荷が低く、ウイルス負荷が低かった唯一の他の試料（ただし顕著な異形成が見られた）はＨＰＶ−６とＨＰＶ−３９に同時感染している点である。表４に示したウイルス負荷の予備データによれば、子宮頚管部の異形成の存在はウイルス負荷と相関している可能性が示唆される。
【００８２】
実施例３−ＶＥＳＰＡとＰＣＲ−ＥＩＡとの比較
臨床での子宮頚部スメアからのＨＰＶ型判定におけるＶＥＳＰＡの有用性について試験を行うため、自己プロービング型アンプリコンプライマーを用いて、予めＰＣＲ−ＥＩＡによってＨＰＶ型判定された（ジャコブ等（前出）による）１０８検体の試料をテストした。２方法を直接比較するため、ジャコブ等（前出）によって述べられる凍結融解法を用いてＤＮＡ抽出を行った。この方法は自己プロービング型アンプリコンプライマーを用いたＰＣＲ増幅に用いるには最適ではない。この研究で効率のよくない凍結融解によるＤＮＡ抽出法を用いたのは、この方法がＰＣＲ−ＥＩＡに適したものであり、同じＤＮＡ試料を用いてＰＣＲ−ＥＩＡとＶＥＳＰＡの比較を行うことを望んだためである。これらの実験結果を表５に示す。
【００８３】
選択されたポジティブな試料の型は後で直接配列を決定して確認を行った（データは示さず）。ＶＥＳＰＡとＰＣＲ−ＥＩＡの全体の一致度は９４％であり、κ値は０．８９と両者の良好な一致を示した。実際、ジャコブ等（前出）により述べられるように、異なる参照検査室によって同一の試料にＰＣＲ−ＥＩＡを行った場合、同様な一致度が見られた。１０８検体の試料のうち、ＨＰＶ−１６の５例、ＨＰＶ−１８の１例がＶＥＳＰＡによって検出されなかった。偽陽性は見られなかった。
【００８４】
ＶＥＳＰＡとＰＣＲ−ＥＩＡとの間で見られた小数の残りの不一致例については幾つかの説明が考えられる。第１に、ＰＣＲ−ＥＩＡによる結果が偽陽性である可能性である。複数の異なる検査室でＰＣＲ−ＥＩＡの比較を行った研究から、この方法ではしばしば偽陽性を生じやすいことが示されている。結果が不一致であった６検体の試料のうち４検体が細胞学的所見は正常であったことはこのことを支持するものである。残りの２検体のうち、一方はグレードの低い病変であり、他方は臨床データのないものであった。第２に、試料がＨＰＶについてポジティブであるがプローブ結合部位内に多型を有するＨＰＶの同型変異体を含んでいる可能性である。自己プロービング型アンプリコンプローブが１個の塩基変化に基づいて配列を区別するのに対して、ＰＣＲ−ＥＩＡプローブは配列の変化に対する許容度が高い。このことは６検体の不一致試料のうち５検体がプローブ結合部位内の変異がより大きいと考えられる西アフリカの検体から得られたことと関連しているかもしれない。
【００８５】
【表５】
実施例４−組み込み状態を検出するためのＶＥＳＰＡ−Ｅ６／Ｅ７：Ｅ１／Ｅ２
ＨＰＶ組み込み状態の評価を行うために設計された自己プロービング型アンプリコンの配列を表６に示した。これらの配列は上記の実施例に述べられた方法に基づいて使用した。組み込み状態は上記に述べた方法で測定した。
【００８６】
【表６】
実施例５−変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＨＰＶ検出のためのテール付加プライマーを用いたＶＥＳＰＡ
好適な一方法として図６に示されるような、下記の工程からなる方法が挙げられる。
１．「デザイナーテール」を有するプライマーを用いてウイルスＤＮＡ（存在する場合）を増幅する。標準的な逆方向プライマーも使用する。
２．標準的反応におけるのと同様に増幅が進行する。
３．第１回目の増幅の後、「デザイナー」配列は相補的配列を有さない。
４．第２回目の増幅の後、「デザイナー」配列を組み込み、各ラウンドで増幅する。
５．別の反応で、「デザイナー」配列を標的としたプライマーとコンセンサスプライマーを検出するためのプローブとからなる自己プロービング型アンプリコンを用いてこの増幅を検出することが可能である。プライマー二量体による許容し得ないバックグラウンド蛍光の発生を防止するため、ウイルスＤＮＡと若干の重複部分を有する２種類の自己プロービング型アンプリコンの使用が必要な場合もある。
【００８８】
前述の実施例で述べた方法と類似の方法によって、次のテール付加プライマーを用いて変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ＨＰＶを検出した（表７）。
【００８９】
【表７】
表７によれば、変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）自己プロービング型アンプリコン混合物によってＨＰＶ−６、−１６及び−１８型が検出されることが分かる。ジャコブ等（前出）によって述べられる条件下で予め増幅した試料を用いて比較を行うことも可能である。興味深い点としてこれらの試料のうち２つのものはアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色後にほとんど視認できなかったが、このことはＶＥＳＰＡ法によって予想通りの感度の向上が実現されることを示すものである。
【００９１】
実施例６−ＳＶ４０へのＶＥＳＰＡの適用
ＤＮＡの抽出
ブロック間のコンタミネーションが生じないように留意しながら中皮腫のパラフィン包埋生検試料の５μＭの連続切片を１０枚切り出した。これら１０枚の切片を微量遠心機のチューブに入れ、キシレンで１０分間処理してパラフィンを除去した後、エタノールで２回洗浄してから乾燥した。２００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む４００μｌの消化緩衝液を添加して５５℃にて一晩検体を消化した。この後、９５℃に１０分間加熱してプロテイナーゼＫを失活させた。得られた消化物をフェノール／クロロフォルム／イソアミルアルコールを用いてＤＮＡ抽出用に更に処理した。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、遠心、風乾した。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０フィルター（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、米国マサチューセッツ州、ベッドフォード）を用いてＤＮＡの脱塩、濃縮を行った。得られた精製ＤＮＡを分光法により定量した。すべての試料がβ−グロブリン増幅についてポジティブの試験結果を示し（マグルトン−ハリス等（Muggleton-Harris et al.） Hum Reprod 10 183-92 (1995)）、ＰＣＲの有効性が示された。
【００９２】
プライマーの設計
各ウイルスの配列を並べることによってプライマーを設計した（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/）。ＳＶ４０ アクセッション番号Ｊ０２４００；ＪＣ アクセッション番号Ｊ０２２２６／７；ＢＫ アクセッション番号ＮＣ００１５３８。第１回目で増幅するため、従来から知られる確立されたプライマー部位を利用してラージＴ抗原遺伝子の全体を通じて複数のプライマーを設計した（表１参照）。第１回目の増幅段階では、多くの試料でかなりのＤＮＡの分解が見られることから、近接した標的部位を有する短いＤＮＡフラグメントを標的としたプライマーを使用することが好ましい。これらのプライマー部位間で最もホモロジーの小さい領域を標的として自己プロービング型アンプリコン及びプローブ結合部位を設計した。
【００９３】
【表８Ａ】
【表８Ｂ】
アッセイ条件
増幅反応はすべて、熟練した実験手腕にて、良好なフィルター端を用い、ポリオーマウイルスに曝露されたことのない実験室で行った。
【００９６】
第１回目の増幅反応（予備増幅）
ＳＶ４０、ＪＣ、及びＢＫについて試験を行うため、適当なプライマーの組を用いて各反応を３回セットアップした。
【００９７】
各反応で５μｌの各試料を次の条件下で予備増幅した；０．５μＭのＰ１及びＰ３（表８参照）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰｓ、１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼ（アドバンスド・バイオテクノロジーズ社（Advanced Biotechnologies）、エプソム、サリー州、英国）、及び５μｌの１０ｘ反応緩衝液（バーキンエルマーゴールド社（Perkin-Elmer Gold））にて全反応容量５０μｌとした。
【００９８】
各試料は上記の条件下でＰ１−Ｐ２のプライマーの組を用いて（表８）ＳＶ４０の型判定を行った。
【００９９】
第２回目の増幅反応（アンプリコン検出）
第１回目の増幅反応に用いた実験室と物理的に隔離された（１００ｍ）実験室でアッセイをセットアップした。
【０１００】
２基の異なるリアルタイムＰＣＲ装置でアンプリコンの検出を行った。
【０１０１】
（ｉ）ライトサイクラー（Light Cycler, ロシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics Ltd）、ベルレーン、ルイス、イーストサセックス州、ＢＮ７ １ＬＧ）
（ｉｉ）ｉサイクラー（iCycler, バイオ−ラド・ラボラトリーズ社（Bio-Rad Laboratories）、バイオ−ラドハウス、メイランズアベニュー、ヘメル・ヘンプステッド、ハーフォードシャー州、ＨＰ２ ７ＴＤ）；
及び若干異なる条件下。
【０１０２】
ＤＮＡ（２μｌ ｉサイクラー）溶液の１μｌ量を０．５μＭのスコーピオンプライマー（表１参照）と０．５μＭのリバースプライマーを用いて１０μｌ（２０μｌ ｉサイクラー）の全反応容量中でＰＣＲ増幅した。反応条件は次のとおり：２００μＭのｄＮＴＰｓ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．９）、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ウシ血清アルブミン２５０ｎｇ／μｌ、及び０．５Ｕ／μｌのＴａｑポリメラーゼ（アドバンスド・バイオテクノロジーズ社（Advanced Biotechnologies）、エプソム、サリー州、英国）。チャンネル１／５３０ｎｍ（フィルターセット４、ｉサイクラー）にて４０℃（４５℃、ｉサイクラー）で蛍光を検出した。自己プロービング型アンプリコンのコントロール反応（ネガティブコントロール）として、ＤＮＡの代わりにＨ２Ｏを含むものを用いた。プライマーはすべてオズウェル・リサーチ・プロダクツ（Oswel Research Products, サザンプトン ＳＯ１６ ７ＰＸ、英国）によって合成されたものである。
サイクリングパラメータ
【０１０３】
予備増幅
９４℃−１８０秒の後、９４℃−６０秒、５２℃−６０秒、及び７２℃−６０秒を３０サイクル、最後に７２℃−３００秒。
【０１０４】
アンプリコンの検出
（ｉ）ライトサイクラー。９６℃−１秒、４０℃−５秒、７２℃−１秒を１００サイクル。
（ｉｉ）ｉサイクラー。９５℃−１８０秒の後、９５℃−３０秒、４５℃−３０秒、７２℃−１５秒を４０サイクル。
【０１０５】
結果
図１０ａ〜１０ｃは、ＳＶ４０（ＳｃＳＶ４０）の検出用に設計された自己プロービング型アンプリコン、ＪＣウイルス（ＳｃＪＣ）の検出用に設計された自己プロービング型アンプリコン、及びＢＫウイルス（ＳｃＢＫ）の検出用に設計された自己プロービング型アンプリコンを、予め増幅した細胞系ＤＮＡ、中皮腫由来ＤＮＡ、及び水により、ライトサイクラーリアルタイム蛍光計中でチャレンジした結果を示したものである。特定の自己プロービング型アンプリコンが同種のウイルスと接触した場合にのみ蛍光の大幅な増大が見られる。非同種ウイルスによる蛍光のバックグラウンドレベルはＪＣウイルスによるチャレンジを行った場合にＳｃＢＫを除いたすべてのケースで低値に維持されている。
【０１０６】
図１０ｄ〜１０ｆは、ｉサイクラーリアルタイム蛍光計を用いて分析した同様の反応プロファイルを示したものである。図１０ｅ及び１０ｆでは試料によって生ずる反応プロファイルが見られない。蛍光は特定の自己プロービング型アンプリコンに同種のウイルスが提示された場合に強く、非同種のウイルスでは弱いが、この一連の実験では非同種ウイルスによるバックグラウンド蛍光は増大している。３種の自己プロービング型アンプリコンのすべて、及び２種のＳｃＳＶ４０標的アンプリコンを用い、２つの異なるアンプリコンの分析モードを用いて行った中皮腫ウイルスの型判定の結果を表９に示す。
【０１０７】
【表９Ａ】
【表９Ｂ】
【表９Ｃ】
これらは、パラフィン包埋ブロックから得たアーカイブ化された７６検体の中皮腫のＤＮＡ試料について型判定を行った結果である。いくつか興味深い観察点が挙げられる。第１に、Ｐ１とＰ２（表８参照）の間の６５０ｂｐのアンプリコンを標的とした分析ではポジティブが１検体であるのに対し、Ｐ１とＰ３の間の２３０ｂｐのアンプリコンを標的とした分析ではポジティブは４４検体である。この観察結果は、パラフィン包埋ブロックからはしばしば短いＤＮＡ部分しか回収されないことに起因している可能性もあるが、これらの試料ではＳＶ４０のホストゲノムへの組み込みにともなってＤＮＡが欠失することを反映したものかもしれない。
【０１１１】
第２に、ＳＶ４０−ＶＥＳＰＡと確立された方法との比較によれば、観察されたポジティブの数が増加しており、感度の向上が示された点である。この比較結果は蛍光測定のモードに依存している。アンプリコンＰ１−Ｐ２（６５０ｂｐ）の分析ではＳＶ４０の検出率は１．３％であり、ライトサイクラーを使用してアンプリコンＰ１−Ｐ３（２３０ｂｐ）を分析した場合には５９％であり、ｉサイクラーを使用してアンプリコンＰ１−Ｐ３を分析した場合には７０％であった。すなわちｉサイクラーを用いて得られたデータはライトサイクラーによって得られるデータよりも２０％程度ポジティブが多い結果となっているが、ｉサイクラーを用いるとバックグラウンドの蛍光が増大する。ｉサイクラーの観察される感度の増加は長い反応時間（２時間と１時間）または大きな試料容量（２μｌと１μｌ）によるものである可能性がある。ｉサイクラーはスループットに関しても利点を有する（９６と３２）。ｉサイクラーを用いた場合にポジティブの試料は報告されず、ライトサイクラーを用いた場合ではネガティブは報告されなかった。これらの結果は、ライトサイクラーが特異的分析に適しているのに対して、ｉサイクラーは高感度の分析により適していることを示すものである。
【０１１２】
第３に、ＳｃＪＣでは偽陽性が１検体で認められ、これがコントロールのネガティブブランク反応で見られたことである。この観察はアッセイ感度の重要性を強調するものであり、またこの種のウイルス分析を解釈する際の厳正なアッセイ法及び注意の必要を強調するものである。この問題は英国製ポリオワクチンの検査を行っている検査機関で以前から見られた問題であり、コンタミネーションの原因については確証のある説明はなされていない。この偽陽性が５つの他のブランクを含む実験で見られ、それらのすべてが予想されたネガティブな結果を生じたことからこの偽陽性は例外的なケースと見られる。また、使用した実験室が以前にポリオーマウイルスに曝されていないことは、このブランクが２個のポジティブコントロールに接して配置された結果としてポジティブを示したことを示唆するものである。したがって試料のキャリーオーバーが原因である可能性がある。
【０１１３】
ＳＶ４０の検出率は最高で７０％であり、これまでに報告されている値の範囲内であるが上限に近い値となっている。ＪＣ及びＢＫウイルスは小児人口の６０％に見られ、成人の７０％以上がＪＣ及びＢＫ抗体を有していることが推定される。中枢神経系の腫瘍では３３％にＪＣウイルスが見られることが報告されている。ＪＣ及びＢＫの検出率はそれぞれ１９％及び１．４％であった。
【０１１４】
これらの試料におけるウイルス負荷の推定は、第１回目の増幅で反応が「律速条件」に達する場合があるネスト（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲの使用によって困難となっている。ＳＶ４０−ＶＥＳＰＡは１回の増幅で細胞系のＤＮＡの型判定を行うことが可能である（データは示さず）。このため、ネスト（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによるスクリーニングで強いポジティブを示した試料をヒトゲノムＤＮＡ用の内部標準を用いた１回のＰＣＲでウイルス負荷について再分析することが可能である。データにはＳｃＳＶ４０の蛍光が１．４〜２６．５の範囲であるＤＮＡ試料が示されており、ウイルスが由来する中皮生検試料中で広範囲のウイルス負荷が見られることと符合する。
【０１１５】
結論
図１０ａ〜１０ｆは、本発明によれば同種のウイルスに反応して強いシグナルを発生し、高濃度の相同性の高い非同種ウイルスから同種ウイルスを選別することが可能なアッセイが与えられることを示したものである。この記載の可能な例外は、ＳｃＢＫを予め増幅したＪＣウイルスでチャレンジした場合には顕著なバックグラウンド蛍光が観察される点である。ポジティブコントロールの値の約１０％程度であれば許容範囲ではあるが、ＪＣウイルスが偽陽性のＢＫウイルスとして判定される可能性がある。この観察結果は、すべての試料をＪＣウイルスについて型判定したところ、ＢＫについてポジティブであった１検体の試料はＪＣネガティブであったことから、現在の研究に影響するものではない。しかしながら、この方法を用いて得られたすべてのＢＫポジティブは解釈に注意を要し、ＪＣウイルスについて型判定することが望ましい。しかしながら、ＳｃＢＫのバックグラウンド蛍光は高濃度の予備増幅したＪＣ ＤＮＡの存在下でのみ観察される点は再び強調しておく価値があろう。
【０１１６】
したがってこの実験で得られる中心的な知見は以下の点である。
（ｉ）ＳＶ４０の検出率はプローブするアンプリコンの大きさに依存する。
（ｉｉ）ＳＶ４０の検出率はアンプリコン分析のモードに依存する。
（ｉｉｉ）アーカイブ化された中皮腫組織のＳＶ４０感染率は５８％〜７０％の範囲である。
【０１１７】
実施例７−ＲＲＰ関連ＨＰＶにおけるＶＥＳＰＡ
臨床試料
ウェールズ全体のすべての耳鼻咽喉科医及びイングランドで再発性呼吸器乳頭腫症（ＲＲＰ）の調査に積極的に携わっているすべての耳鼻咽喉科医に接触して患者を集めた。すべてのＲＲＰの症例は、生検試料における特徴的な組織学的変化及び／または２回よりも多い外科的介入を必要とする組織学的変化により確認することによって同定した。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。ユニバーシティ・ホスピタルズ・オブ・ウェールズ・カーディフ・アンド・シェフィールド（University Hospitals of Wales, Cardiff and Sheffield）において再発性呼吸器乳頭腫症の治療を行っている患者からインフォームドコンセントを得たうえで生検試料を採取した。
【０１１８】
疾患の重篤度
ダーケイ等（Derkay et al., Laryngoscope 108(6) 935-7 (1998)）によって概括されるパラメータを用いて臨床疾患のグレード付けを行った。この式は手術の数及び手術間の時間間隔の両者を説明するものである。
【０１１９】
ＤＮＡの精製
０．５ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（シグマ社（Sigma）、英国）を含む１ｍｌの１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）中で約１ｍｍ３の生検材料を、１時間、５６℃でインキュベートして生検試料からＤＮＡを抽出した。次いで１００μｌの等分量を取り、１０分間沸騰させ、５分間氷冷し、１３，０００ｒｐｍで３分間遠心し（粒子状物質を除去するため）、新鮮な試験管に注いだ。
【０１２０】
ＰＣＲ ＥＩＡ
ＨＰＶの型を確認するため、実施例３に述べられるようにジャコブ等（前出）によるＰＣＲ−ＥＩＡ用の参照方法をすべての試料に行った。
【０１２１】
結果
表１０に示されるウイルス負荷は実施例２で述べたように計算した。概略述べると、同種のＨＰＶ−自己プロービング型アンプリコンを用いて発生する蛍光シグナルと、ヒトゲノムのβグロブリンハウスキーピング遺伝子の検出用に設計された自己プロービング型アンプリコンの蛍光シグナルとの比を計算した。
【０１２２】
高ウイルス負荷かつ穏和な症状（ＮＬ）及びその逆（ＤＮ）の患者の例が明らかに見られたものの、寛解状態の患者でウイルス負荷は最も低く、最も重篤な患者でウイルス負荷は最も高かった。この研究は、ＲＲＰにおける最も重要な診断マーカーはＨＰＶの型であることを示すものである。すなわち、ＨＰＶ−６は穏和な、ＨＰＶ−１１は進行性の疾患につながるものである。
【０１２３】
【表１０】
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】本発明の方法によるＨＰＶ−１６の検出に関する図。（図１ａ）ＨＰＶ−１６（Ｓｃ１６）に対して特異的な自己プロービング型アンプリコンプライマー、ポジティブコントロール（ＨＰＶ−１８に対するＨｅＬａ）、ネガティブコントロール（ＤＮＡなし）、及びＨＰＶ−１６に特異的な細胞系（Ｃａｓｋｉ）から抽出されたＤＮＡを用いたＨＰＶの型判定反応の結果を示す図。（図１ｂ）ＨＰＶ−１８（Ｓｃ１８）に対して特異的な自己プロービング型アンプリコンプライマー、ポジティブコントロール（ＨＰＶ−１６に対するＣａｓｋｉ）、ネガティブコントロール（ＤＮＡなし）、及びＨＰＶ−１８に感染した細胞系（ＨｅＬａ）から抽出されたＤＮＡを用いたＨＰＶの型判定反応の結果を示す図。
【図２】ＶＥＳＰＡによって得られるポジティブなトレースの例に関する図であって、ＰＣＲ−ＥＩＡによって予め型判定した臨床試料を用いたＨＰＶ型判定実験の結果を示す図。ＨＰＶ−６（Ｓｃ６）に対して特異的なプライマーを図２ａに、ＨＰＶ−１１（Ｓｃ１１）に対して特異的なプライマーを図２ｂに、ＨＰＶ−１６（Ｓｃ１６）に対して特異的なプライマーを図２ｃに、ＨＰＶ−１８（Ｓｃ１８）に対して特異的なプライマーを図２ｄに、ＨＰＶ−３１（Ｓｃ３１）に対して特異的なプライマーを図２ｅに、ＨＰＶ−３３（Ｓｃ３３）に対して特異的なプライマーを図２ｆに、ＨＰＶ−３９（Ｓｃ３９）に対して特異的なプライマーを図２ｇに、ＨＰＶ−５１（Ｓｃ５１）に対して特異的なプライマーを図２ｈに示した。
【図３】ＨＰＶ−１６に対するＶＥＳＰＡの定量的な性質を実証する図。Ｓｃ１６を用いたＨＰＶ−１６の連続希釈液が示されている。ＳｉＨａ細胞の連続希釈液は反応当たり細胞５００００個〜反応当たり細胞１個までを調製した。
【図４】ＳｃＢＧを用いたヒトβ−グロブリンに対するＶＥＳＰＡの定量的な性質を実証する図であって、図３と同様の連続希釈液が示されている。
【図５】ＶＥＳＰＡを用いたウイルス負荷の推定を示すグラフ。
【図６】ＶＥＳＰＡを用いたｄｅｇｅｎｅｒａｔｅなＨＰＶなどのウイルス検出法を示す模式図。
【図７】ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅな自己プロービング型アンプリコンの混合物がＨＰＶ−６、−１６、及び−１８型を検出する能力を実証する図。
【図８】自己プロービング型アンプリコンを用いたＨＰＶなどのウイルスの型判定法を示す概略図であって自己プロービング型アンプリコンを示した図。
【図９】自己プロービング型アンプリコンを用いたＨＰＶなどのウイルスの型判定法を示す概略図であって、ウイルスＤＮＡに対する自己プロービング型アンプリコンの伸長及び結合段階を示した図。
【図１０】ＳＶ４０にＶＥＳＰＡ法を適用して得られた結果に関する図。図１０ａ〜ｃはそれぞれＳｃＳＶ４０，ＳｃＪＣ、及びＳｃＢＫによって得られたライトサイクラー蛍光プロファイルである。各自己プロービング型アンプリコンを、予備増幅したＯｒｉ−３（ＳＶ４０）、Ｍａｄ１（ＪＣ）、Ｘ（ＢＫ）、及び試料ＤＮＡでチャレンジした結果を示してある。図１０ｄ〜ｆは同じ条件下で得られたｉサイクラー蛍光プロファイルである。
【図１１】本発明の方法を用いてウイルスの組み込み状態を判定するための方法を示した概略図。
Claims (55)
- １以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる哺乳動物などの動物から得られる試料中の哺乳動物ウイルスを含む動物ウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有するとともに該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）ウイルスシグナリングシステムであって、前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能な信号を発生することによって前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が前記検出可能信号によって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能信号が発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記ウイルスプローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程と、からなる方法。 - １以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる試料中のウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が該検出可能シグナルによって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記プローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程と、
（ＩＩＩＡ）前記試料から得られたハウスキーピング核酸配列を自己プロービング型アンプリコン（「ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）前記ハウスキーピング核酸配列とハイブリダイズ可能なハウスキーピングプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてハウスキーピングプライマー伸長産物を生成するハウスキーピングプライマーと、
（ｉｉ）ハウスキーピングプローブであって、前記プローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ハウスキーピングプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なハウスキーピングプローブと、
（ｉｉｉ）前記ハウスキーピングプローブ配列が前記ハウスキーピングプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ハウスキーピング核酸配列の有無が前記検出可能シグナルによって示されるハウスキーピングシグナリングシステムと、を有する；と
（ＩＩＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＶ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＩＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＶ）前記ハウスキーピング核酸配列から前記ハウスキーピングプライマー伸長産物を分離し、前記ハウスキーピングプローブをハウスキーピングプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記ハウスキーピングシグナリングシステムを監視する工程と、からなる方法。 - 前記ウイルス自己プロービング型アンプリコンがハイブリダイズする際に発生するシグナルと、前記ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコンがハイブリダイズする際に発生するシグナルを比較する工程を更に含む、請求項２に記載の細胞当たりのウイルス負荷を決定する方法。
- 前記（Ｉ）工程と前記（ＩＩＩ）工程のシグナリングシステムが異なっていることにより、前記標的ウイルス核酸配列と前記標的ハウスキーピング核酸配列を独立かつ同時に検出することが可能である請求項２または３に記載の方法。
- １以上の標的ウイルス核酸配列を有することが疑われる試料中のウイルスの、
（ａ）検出、
（ｂ）型判定、
（ｃ）細胞当たりのウイルス負荷の決定、及び／または
（ｄ）組み込み状態の決定
の１以上を行うための方法であって、
（ＩＡ）前記試料を自己プロービング型アンプリコン（「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」）と接触させる工程；該自己プロービング型アンプリコンは、
（ｉ）少なくとも１個の標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズ可能なウイルスプライマーであって、プライマー増幅条件下で増幅されてウイルスプライマー伸長産物を生成するウイルスプライマーと、
（ｉｉ）ウイルスプローブであって、前記ウイルスプローブが前記プライマー増幅条件下で増幅しないように前記自己プロービング型アンプリコンが構成されているものとして、前記ウイルスプライマー伸長産物の標的配列に対して相補的な核酸配列を有して該標的配列にハイブリダイズ可能なウイルスプローブと、
（ｉｉｉ）前記ウイルスプローブ配列が前記ウイルスプライマー伸長産物にハイブリダイズする際に検出可能なシグナルを発生し、これにより前記試料中の標的ウイルス核酸配列の有無が該検出可能シグナルによって示されるウイルスシグナリングシステムと、を有する；と、
（ＩＢ）前記プライマー増幅条件下で、（ＩＩ）工程の後に前記検出可能シグナルが発生する程度に前記（ＩＡ）工程の産物を増幅する工程と、
（ＩＩ）前記標的ウイルス核酸配列から前記ウイルスプライマー伸長産物を分離し、前記ウイルスプローブを前記ウイルスプライマー伸長産物の前記標的配列にハイブリダイズさせ、前記シグナリングシステムを監視する工程とからなる方法において、
前記ウイルス自己プロービング型アンプリコンがＨＰＶのＥ１、Ｅ２、Ｅ６、及び／またはＥ７遺伝子の検出、定量、または評価を可能とするように構成されていることを特徴とする方法。 - 線形のウイルスＤＮＡを決定するためのウイルス自己プロービング型アンプリコンがハイブリダイズする際に発生するシグナルと、環状のウイルスＤＮＡを決定するためのウイルス自己プロービング型アンプリコンがハイブリダイズする際に発生するシグナルを比較する工程を更に含む、請求項１乃至５のいずれかに記載のウイルスの組み込み状態を決定する方法。
- ウイルスのＥ１及び／またはＥ２ ＤＮＡを決定するためのウイルス自己プロービング型アンプリコンがハイブリダイズする際に発生するシグナルと、ウイルスのＥ６及び／またはＥ７ ＤＮＡを決定するためのウイルス自己プロービング型アンプリコンがハイブリダイズする際に発生するシグナルを比較する工程を更に含む、請求項１乃至６のいずれかに記載のウイルスの組み込み状態を決定する方法。
- 前記標的ウイルス核酸配列は、１よりも多いウイルスまたはウイルスの型にそれぞれ固有の、１よりも多い核酸配列を有することを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルスプライマー要素は、前記標的に対してある程度の変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）を示すことにより、該ウイルスプライマーは標的の核酸の各配列に対して完全に相補的ではないことを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 前記ウイルスはヒトパピローマウイルスであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルスはＨＰＶ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、４０、４２、４３、４４、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６６及び６８型の１以上から選択される請求項１０に記載の方法。
- 前記自己プロービング型アンプリコンはＳｃ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、５１及びＳｃ５６と名付けられた自己プロービング型アンプリコンにそれぞれ対応した配列番号１〜９から選択される核酸配列からなることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
- 前記ウイルスプローブ要素は配列番号２１〜２９：
配列番号２１ ATAAAGAGTACATGCGT
配列番号２２ CAGATTATAAGGAATACATGC
配列番号２３ AGTACCTACGACATGGG
配列番号２４ AGCAGTATAGCAGACATG
配列番号２５ GAGTATTTAAGACATGGTG
配列番号２６ CTTTATGCACACAAGAAC
配列番号２７ AATATACCAGGCACGTG
配列番号２８ GCAATATATTAGGCATGGG
配列番号２９ TCAGTACCTTAGACATGTG
から選択される配列からなることを特徴とする請求項１０乃至１２のいずれかに記載の方法。 - 前記ウイルスプライマー要素はＧＰ６＋プライマー（Ｓｃ１６プライマー）及び配列番号３２〜４０：
配列番号３２ GAAAAATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３３ GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC
配列番号３４ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
配列番号３５ GAAAAATAAACTGCAAATCATATTC
配列番号３６ GAAATATAAATTGTAAATCAAATTC
配列番号３７ GAAAAACAAACTGTAGATCATATTC
配列番号３８ GAAATATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３９ AAAAATAAATTGCAATTCATACTC
配列番号４０ GAAAAACAAATTGTAACCCATATTC
から選択される配列からなることを特徴とする請求項１０〜１３のいずれかに記載の方法。 - 前記ウイルスは、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）、またはこれに類するＪＣ及びＢＫウイルスなどのウイルスであることを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載の方法。
- 前記自己プロービング型アンプリコンはそれぞれＳｃＳＶ４０、ＳｃＪＣ及びＳｃＢＫと名付けられたものに対応する自己プロービング型アンプリコンから選択される核酸配列であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
- 少なくとも１つの自己プロービング型アンプリコンが細胞のハウスキーピング遺伝子のＤＮＡを検出可能であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれかに記載の方法。
- 前記ハウスキーピング遺伝子は、β−グロブリン、アクチン、トロポミオシン、及びグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の方法。
- 前記ハウスキーピング遺伝子はβ−グロブリンであることを特徴とする請求項１７または１８に記載の方法。
- 前記自己プロービング型アンプリコンはＳｃＢＧ（配列番号１１）からなることを特徴とする請求項１７乃至１９のいずれかに記載の方法。
- 前記自己プロービング型アンプリコンのプローブ要素は配列番号３１：
配列番号３１ ATGGTGTCTGTTTGAG
からなることを特徴とする請求項１７乃至２０のいずれかに記載の方法。 - 少なくとも１つのウイルス自己プロービング型アンプリコンが、ＨＰＶのＥ１、Ｅ２、Ｅ６、及び／またはＥ７遺伝子の少なくとも１つの検出、定量、または評価を可能とするように構成されていることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも１つのウイルス自己プロービング型アンプリコンが、Ｓｃ１６−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１６−Ｅ２、Ｓｃ１６−Ｅ６、Ｓｃ１８−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１８−Ｅ２及びＳｃ１８−Ｅ６（それぞれ配列番号１２〜１７）から選択されることを特徴とする請求項１乃至２２に記載の方法。
- 前記プローブ要素が配列番号４１〜４６：
配列番号４１ GCAAAGAGTAATCATTA Sc16-E1midプローブ
配列番号４２ TTGTCATATAGACATATCATTTTCAT Sc16-E2プローブ
配列番号４３ CGAATGTCTACATATCATGGC Sc16 E6プローブ
配列番号４４ TCGGTGTCTCCATGTTG Sc18 E1midプローブ
配列番号４５ TACATTGTCATGGTCTATGAT Sc18-E2プローブ
配列番号４６ CTGGAATGCTATATCATG Sc18-E6プローブ
から選択されることを特徴とする請求項２２または２３に記載の方法。 - 前記プライマー要素は配列番号４７〜５２：
配列番号４７ CAGAATGGATACAAAGACAAACAGT Sc16-E1midプライマー
配列番号４８ CAACGTTTAAATGTGTGTCAGGA Sc16-E2プライマー
配列番号４９ AAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC Sc16 E6プライマー
配列番号５０ AGTAATGGGAGACACACCTGAGT Sc18 E1midプライマー
配列番号５１ GCAGACACCGAAGGAAACCC Sc18-E2プライマー
配列番号５２ ACCCAGAAAGTTACCACAGTTAT Sc18-E6プライマー
から選択されることを特徴とする請求項２２乃至２４のいずれかに記載の方法。 - 前記プライマー要素は配列番号４７及び５０：
CAGAATGGATACAAAGACAAACAGT Sc16-E1midプライマー
AGTAATGGGAGACACACCTGAGT Sc18 E1midプライマー
から選択されることを特徴とする請求項２２乃至２５のいずれかに記載の方法。 - 増幅工程で使用されるリバースプライマーはＥ６及び／またはＥ７を標的とするように構成されていることを特徴とする請求項２２乃至２６のいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルスプライマー伸長産物は、ＨＰＶを含む複数の型のウイルスのウイルス核酸配列を前記プライマー増幅条件下で増幅することが可能な核酸配列を有するテール付加プライマーから得られた「デザイナー配列」からなることを特徴とする請求項１乃至２７のいずれかに記載の方法。
- 以下の工程：
（０）（Ａ）前記試料から得た標的ウイルス核酸配列を「テール付加プライマー」と接触させる工程；該テール付加プライマーは、
（ｉ）前記ウイルス核酸配列のコンセンサス配列に相補的な核酸配列（「コンセンサスプライマー配列」）を有するプライマー領域であって、該コンセンサス配列にハイブリダイズ可能であるとともにプライマー増幅条件下で該コンセンサス配列を増幅してテール付加プライマー伸長産物を生成するプライマー領域と、
（ｉｉ）本方法（「デザイナー」配列）のいずれの成分中にも存在せず、またいずれの成分によっても調製されない固有の配列を有するテール領域とからなる；と、
（０）（Ｂ）前記「デザイナー」配列が前記プライマー伸長産物に組み込まれるように前記プライマー増幅条件下で少なくとも２回の増幅反応を行う工程と、を先に行うなどして更に含む方法であって、
前記「ウイルス自己プロービング型アンプリコン」のプライマー要素は「デザイナー」配列に結合可能であり、ウイルス自己プロービング型アンプリコンのプローブ要素は前記コンセンサスプライマー配列に対して相補的であることを特徴とする請求項１乃至２８のいずれかに記載の方法。 - 前記テール付加プライマーは配列番号１８からなることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
- 前記自己プロービング型アンプリコンは配列番号１９及び２０から選択されることを特徴とする請求項２９または３０に記載の方法。
- 前記デザイナーテール配列は配列番号１０：
配列番号１０：ATGTGGAAACATGCATGG
からなることを特徴とする請求項２９乃至３１のいずれかに記載の方法。 - 前記増幅工程の１以上が「リアルタイム」ＰＣＲを用いて行われることを特徴とする請求項１乃至３２のいずれかに記載の方法。
- 前記増幅工程の１以上がネスト（ｎｅｓｔｅｄ)ＰＣＲを用いて行われることを特徴とする請求項１乃至３３のいずれかに記載の方法。
- 増幅反応が上記に定義したようなＧＰ５＋リバースプライマーを用いて行われることを特徴とする請求項１乃至３４のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも１つのシグナリングシステムが蛍光に基づいたシステムであることを特徴とする請求項１乃至３５のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも１つのシグナリングシステムが、６−カルボキシフロオレセイン／メチルレッドなどのフルオロフォア／クエンチャーの組合わせからなることを特徴とする請求項１乃至３６のいずれかに記載の方法。
- ウイルス感染が疑われる患者のスクリーニングを行うためのスクリーニング法であって、
（ａ）前記患者から核酸配列の試料を得る工程と、
（ｂ）請求項１乃至３７のいずれかに記載の方法を前記試料に行う工程とを含み、これにより前記ウイルスシグナリングシステムからの検出可能シグナルが検出されればウイルス感染があったことが示され、ウイルスシグナリングシステムからの検出可能シグナルが検出されなければウイルス感染がなかったことが示される方法。 - 更に特定のウイルス型の有無が示されることを特徴とする請求項３８に記載のスクリーニング法。
- 更に細胞当たりのウイルス負荷が示されることを特徴とする請求項３８または３９に記載のスクリーニング法。
- ウイルスが存在する場合、ウイルスの組み込み状態が更に示されることを特徴とする請求項３８乃至４０のいずれかに記載のスクリーニング法。
- 子宮頚癌、再発性呼吸器乳頭腫症やヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の患者における存在に関連した別の状態に関してスクリーニングを行うように適合されていることを特徴とする請求項３８乃至４１のいずれかに記載のスクリーニング法。
- 胸部及び肺の癌を含む中皮腫；骨肉腫；グリア芽細胞腫、星状細胞腫、脳室上衣腫、及び脈絡叢乳頭腫を含む、脳下垂体、甲状腺、脳、及び神経学的腫瘍や、ＳＶ４０、ＪＫ及び／またはＢＫウイルスに関連した他の状態の１以上のスクリーニングを行うように適合されていることを特徴とする請求項３８乃至４１のいずれかに記載のスクリーニング法。
- 複数のウイルス型及びこれに関連した状態を検出／スクリーニングするための請求項１乃至４３のいずれかに記載の方法。
- 前記核酸配列はＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項１乃至４４のいずれかに記載の方法。
- 請求項１乃至４５のいずれかに記載の方法で使用するための診断キットであって、
（ａ）これらの方法で用いるための、（ａ）ウイルス自己プロービング型アンプリコン、ハウスキーピング自己プロービング型アンプリコン、またはテール付加プライマーの１以上と、
（ｂ）該方法を実行するためのインストラクションとからなる診断キット。 - 少なくとも２種類の自己プロービング型アンプリコンを含む、細胞当たりのウイルス負荷を推定するための請求項４６に記載のキット。
- 少なくとも１種類のハウスキーピング自己プロービング型アンプリコンを含む請求項４６または４７に記載のキット。
- ウイルスが存在する場合にその組み込み状態の判定を可能とする少なくとも１種類の自己プロービング型アンプリコンを含む請求項４６乃至４８のいずれかに記載のキット。
- （ａ）プライマー要素と、（ｂ）プローブ要素とを含む核酸配列を有する自己プロービング型アンプリコンであって、プライマー要素は、
（ａ）配列番号３２〜４０（Ｓｃ６、１１、１８、３１、３３、３９、５１、及び５６のプライマー要素）：
配列番号３２ GAAAAATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３３ GAAAAATAAACTGTAAATCAAACTC
配列番号３４ GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC
配列番号３５ GAAAAATAAACTGCAAATCATATTC
配列番号３６ GAAATATAAATTGTAAATCAAATTC
配列番号３７ GAAAAACAAACTGTAGATCATATTC
配列番号３８ GAAATATAAATTGTAAATCATACTC
配列番号３９ AAAAATAAATTGCAATTCATACTC
配列番号４０ GAAAAACAAATTGTAACCCATATTC
（ｂ）配列番号４７〜５２：
配列番号４７ CAGAATGGATACAAAGACAAACAGT Sc16-E1midプライマー
配列番号４８ CAACGTTTAAATGTGTGTCAGGA Sc16-E2プライマー
配列番号４９ AAGTTACCACAGTTATGCACAGAGC Sc16 E6プライマー
配列番号５０ AGTAATGGGAGACACACCTGAGT Sc18E1midプライマー
配列番号５１ GCAGACACCGAAGGAAACCC Sc18-E2プライマー
配列番号５２ ACCCAGAAAGTTACCACAGTTAT Sc18-E6プライマー
（ｉｖ）配列番号１９及び２０（テール付加プライマー）のプライマー要素である配列番号６１：
配列番号６１ GTGGAAACATGCATGGCGAC
から選択された配列を有することを特徴とする自己プロービング型アンプリコン。 - （ａ）プライマー要素と、（ｂ）プローブ要素とを含む核酸配列を有する自己プロービング型アンプリコンであって、プローブ要素は、
（ｉ）配列番号２１〜２９（プライマー要素Ｓｃ６、１１、１８、３１、３３、３９、５１、及び５６のプローブ要素）、
（ｉｉ）配列番号３１（ＳｃＢＧのプローブ要素）、
（ｉｉｉ）配列番号４１〜４６：
配列番号４１ GCAAAGAGTAATCATTA Sc16-E1midプローブ
配列番号４２ TTGTCATATAGACATATCATTTTCAT Sc16-E2プローブ
配列番号４３ CGAATGTCTACATATCATGGC Sc16 E6プローブ
配列番号４４ TCGGTGTCTCCATGTTG Sc18 E1midプローブ
配列番号４５ TACATTGTCATGGTCTATGAT Sc18-E2プローブ
配列番号４６ CTGGAATGCTATATCATG Sc18-E6プローブ
（ｉｖ）配列番号１９及び２０（テール付加プライマー）のプローブ要素である配列番号５９及び６０：
配列番号５９ GAAGAATATGATTTACA
配列番号６０ GAGGAATATGATTTACA
から選択される配列を有することを特徴とする自己プロービング型アンプリコン。 - （ｉ）配列番号１〜９（Ｓｃ６、１１、１６、１８、３１、３３、３９、５１及び５６）；
（ｉｉ）配列番号１１（ＳｃＢＧ）；
（ｉｉｉ）配列番号１２〜１７（Ｓｃ１６−Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１６−Ｅ２、Ｓｃ１６Ｅ６、Ｓｃ１８Ｅ１ｍｉｄ、Ｓｃ１８−Ｅ２，Ｓｃ１８−Ｅ６）；
（ｉｖ）配列番号１８〜２０（テール付加プライマー）、及び
（ｖ）下記表８に示される配列（ＳＶ４０、ＪＣ、またはＢＫの判定に用いられる自己プロービング型アンプリコン）から選択される核酸配列を有する自己プロービング型アンプリコン。 - （ａ）プライマー部位を含むテール領域と、（ｂ）プローブ結合部位を含むプライマー領域とを有するｄｅｇｅｎｅｒａｔｅな自己プロービング型アンプリコン。
- テール領域が配列番号１０： ATGTGGAAACATGCATGG （ＧＰ６＋テール付加プライマーのテール配列）を有することを特徴とする請求項４２に記載の配列。
- 前記プローブ要素が前記ＧＰ６＋配列に結合するように構成されている請求項４２または４３に記載の配列。
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