ES2709672T3

ES2709672T3 - Anticuerpos para OX-2/CD200 y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2709672T3
Application number: ES16163753T
Authority: ES
Inventors: Kathrine S Bowdish; Anke Kretz-Rommel; Jeremy P Springhorn; Dayang Wu; Susan Mcknight Faas
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-01-12
Filing date: 2007-01-11
Publication date: 2019-04-17
Anticipated expiration: 2027-01-11
Also published as: PL2463305T3; SI2463305T1; IL192668A; CA2636577A1; RU2013152730A; EP3101033B1; AU2007207764A1; WO2007084321A2; KR20140091765A; WO2007084321A3; MX2008009015A; US9000133B2; IL192668A0; DK2463305T3; US8075884B2; US20120148579A1; EP1984403A2; KR20080099262A; AU2007207764B2; SG10201400422QA

Abstract

Un anticuerpo anti-CD200, en el que el anticuerpo anti-CD200: (i) inhibe la interacción entre CD200 y CD200R; y (ii) comprende una región constante Fc variante que: (a) es una región constante Fc variante en la que las regiones CH1 y bisagra son de la IgG2 humana y las regiones CH2 y CH3 son de la IgG4 humana; (b) comprende una o ambas de: (A) una sustitución de fenilalanina por alanina en la posición 234 y (B) una sustitución de leucina por alanina en la posición 235 de acuerdo con el índice EU; (c) comprende una mutación K322A en el dominio CH2 de acuerdo con el índice EU; o (d) carece de una región bisagra.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos para OX-2/CD200 y usos de los mismos

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica las ventajas de la Solicitud Provisional de Estados Unidos n.° 60/758.426, presentada el 12 de enero de 2006, 60/759.085, presentada el 12 de enero de 2006 y 60/801.991, presentada el 18 de mayo de 2006.

Campo tecnico

La divulgacion se refiere a antagonistas de OX-2/CD200 (denominado CD200 en lo sucesivo en el presente documento) y a metodos para reducir o eliminar celulas que sobreexpresan CD200 en sujetos con cancer o enfermedad autoinmunitaria. Los metodos de terapia para el tratamiento de cancer proporcionan una combinacion de dos mecanismos. De forma mas espedfica, la presente divulgacion se refiere al tratamiento del cancer usando una terapia que: (1) interfiere con la interaccion entre CD200 y su receptor para bloquear la supresion inmunitaria estimulando de ese modo la erradicacion de las celulas cancerosas; y/o (2) elimina directamente las celulas cancerosas ya sea mediante (a) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo o citotoxicidad mediada por complemento o mediante (b) direccion de celulas usando una molecula de fusion que incluye una parte de direccion a CD200. La divulgacion tambien se refiere a un metodo para tratar trastornos autoinmunitarios con una terapia que aumenta la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo y/o citotoxicidad mediada por complemento de celulas inmunitarias positivas para CD200.

Antecedentes

Diversos mecanismos desempenan un papel en la respuesta del organismo a una patologfa, incluyendo el cancer. Por ejemplo, los linfocitos T CD4+ auxiliares desempenan un papel fundamental en una respuesta inmunitaria eficaz frente a diversos trastornos malignos proporcionando factores estimulatorios a celulas efectoras. Se cree que los linfocitos T citotoxicos son las celulas mas eficaces para eliminar las celulas cancerosas, y los linfocitos T auxiliares ceban los linfocitos T citotoxicos mediante la secrecion de citoquinas Th1 tales como IL-2 e IFN-y. En diversos trastornos malignos, se ha mostrado que los linfocitos T auxiliares tienen un fenotipo alterado en comparacion con celulas encontradas en individuos sanos. Una de las caractensticas importantes es la disminucion de la produccion de la citoquina Th1 y un desplazamiento a la produccion de citoquinas Th2. (Vease, por ejemplo, Kiani, et al., Haematologica 88: 754-761 (2003); Maggio, et al., Ann Oncol 13 Supl 1:52-56 (2002); Ito, et al., Cancer 85: 2359-2367 (1999); Podhorecka, et al., Leuk Res 26: 657-660 (2002); Tatsumi, et al., J Exp Med 196:619-628 (2002); Agarwal, et al., Immunol Invest 32: 17-30 (2003); Smyth, et al., Ann Surg Oncol 10: 455-462 (2003); Contasta, et al., Cancer Biother Radiopharm 18: 549-557 (2003); Lauerova, et al., Neoplasma 49: 159-166(2002)). Se ha demostrado que la inversion de ese desplazamiento de citoquina a un perfil de Th1 aumenta los efectos antitumorales de los linfocitos T. (Vease Winter, et al., Immunology 108: 409-419 (2003); Inagawa, et al., Anticancer Res 18: 3957-3964 (1998)).

Algunos mecanismos que subyacen a la capacidad de las celulas tumorales para conducir la expresion de citoquina de linfocitos T auxiliares de Th1 a Th2 incluyen la secrecion de citoquinas tales como IL-10 o TGF-p asf como la expresion de moleculas de superficie que interaction con celulas del sistema inmunitario . CD200, una molecula expresada en la superficie de celulas dendnticas que posee un alto grado de homologfa con respecto a moleculas de la familia genetica de inmunoglobulina, se ha visto implicada en la supresion inmunitaria (Gorczynski et al., Transplantation 65: 1106-1114 (1998)). Por ejemplo, se ha mostrado que algunas celulas que expresan CD200 pueden inhibir la estimulacion de la produccion de citoquina Th1.

Aunque las celulas inmunitarias pueden ayudar a atacar y eliminar celulas cancerosas, en ciertos casos, tales como en trastornos autoinmunitarios, alergias, y el rechazo de trasplante de tejido u organos, el sistema inmunitario puede ser la causa de enfermedad. En estos casos, para inhibir algunas reacciones inmunitarias daninas, se pueden administrar agentes inmunosupresores tales como corticoides y antagonistas de citoquinas a los pacientes. Sin embargo, estos agentes inmunosupresores generales pueden provocar efectos secundarios no deseados que incluyen toxicidad y reduccion de la resistencia a la infeccion. Por lo tanto, se necesitan algunos metodos alternativos, y quiza mas espedficos para tratar la autoinmunidad.

Se ha demostrado que varias terapias moduladas del sistema inmunitario, incluyendo terapias con anticuerpo, son satisfactorias en el tratamiento de ciertos canceres y trastornos autoinmunitarios. Sin embargo, existe una necesidad clrnica de terapias con anticuerpo adicionales para el tratamiento de tanto de cancer como de trastornos autoinmunitarios. Ademas, existe una necesidad relacionada de anticuerpos monoclonales de ser humano/raton humanizados otros monoclonales anticuerpos quimericos. En estudios bien publicitados, algunos pacientes a los que se les administraron anticuerpos monoclonales anti-TNF (factor de necrosis tumoral) de murino desarrollaron respuestas a anticuerpo anti-murino con respecto al anticuerpo administrado. (Exley A. R., et al., Lancet 335: 1275 1277 (1990)). Este tipo de respuesta inmunitaria al regimen de tratamiento, normalmente denominada respuesta a anticuerpo anti-raton humano (HAMA) (Mirick et al., Q J Nucl Med Mol Imaging 2004; 48: 251-7), disminuye la eficacia del tratamiento e incluso puede hacer que el tratamiento sea completamente ineficaz. Se ha mostrado que algunos anticuerpos monoclonales del ser humano/raton humanizados o quimericos disminuyen de forma significativa la respuesta a HAMA y aumentan la eficacia terapeutica de tratamientos con anticuerpo. Vease, por ejemplo, LoBuglio et al., P.N.A.S. 86: 4220-4224 (junio de 1989). Ademas, algunos anticuerpos en los que algunas funcionalidad es en particular se ven aumentadas reducidas pueden encontrar aplicaciones utiles en el entorno clmico.

Kretz-Rommel et al., (Journal of Immunotherapy, noviembre de 2004, Volumen 27, edicion 6 - pagina S46) desvela que CD200 esta sobreexpresado en un subconjunto de leucemias linfodticas cronicas y desempena un papel en la regulacion negativa de la respuesta inmunitaria de TH1.

El documento US 2005/129690 A1 desvela un metodo para tratar cancer usando una terapia que: 1) interfiere con la interaccion entre CD200 y su receptor para bloquear la supresion inmunitaria estimulando de ese modo la erradicacion de las celulas cancerosas; y 2) elimina directamente las celulas cancerosas ya sea mediante a) citotoxicidad celular mediada por complemento o dependiente de anticuerpo o b) mediante la direccion de celulas usando una molecula de fusion que incluye una parte de direccion a CD200.

El documento US 2002/168364 A1 desvela que la administracion de anticuerpos a CD200 inhibfa la supervivencia del injerto observada por lo general despues de la inmunizacion venosa portal previo al trasplante. Tambien se desvela que CD200 es responsable de la estimulacion de metastasis tumorales y la inhibicion de CD200 reduce el crecimiento de celulas tumorales.

Sumario

La presente divulgacion se refiere a agentes y metodos para modular la funcion de CD200. Algunos agentes que modulan la funcion de CD200 incluyen agente se modula en la actividad y/o expresion de CD200 y/o su receptor (CD200R).

De acuerdo con la presente invencion se proporciona un anticuerpo anti-CD200, en el que el anticuerpo anti-CD200:

(i) inhibe la interaccion entre CD200 y CD200R; y

(ii) comprende una region constante Fc variante que:

(a) es una region constante Fc variante en la que las regiones CH1 y bisagra son de la IgG2 humana y las regiones c H2 y CH3 son de la IgG4 humana;

(b) comprende una o ambas de: (A) una sustitucion de fenilalanina por alanina en la posicion 234 y (B) una sustitucion de leucina por alanina en la posicion 235 de acuerdo con el mdice EU;

(c) comprende una mutacion K322A en el dominio CH2 de acuerdo con el mdice EU;

o

(d) carece de una region bisagra.

Los anticuerpos, como se denominan en el presente documento, incluyen fragmentos de union a antfgeno, Fab, Fv, scFv, Fab' y F(ab')², anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos modificados por ingeniena (incluyendo anticuerpos quimericos, de una sola cadena, injertados con CDR, humanizados, totalmente humanos, y anticuerpos seleccionados de manera artificial), y anticuerpos sinteticos o semisinteticos.

En ciertos aspectos, la presente divulgacion se refiere a anticuerpos anti-CD200 quimericos, humanizados, humanos y desinmunizados y fragmentos de union a antfgeno de los mismos. En el presente documento se describe un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos un 90 % a una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID NOS: 7, 9, 11, y 20, o fragmentos de las mismas. Se incluye un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica o similar en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una secuencia de aminoacidos proporcionada en las SEQ ID NOS: 7, 9, 11, y 20, o fragmentos de las mismas (que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos que corresponden a las secuencias sin las secuencias lfder). El anticuerpo mencionado puede comprender adicionalmente una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica o similar en al menos aproximadamente 90 % a una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID NOS: 24, 26, 28, y 32, o fragmentos de las mismas. De forma analoga, la secuencia de aminoacidos mencionada anteriormente puede ser identica o similar en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una secuencia de aminoacidos proporcionada en las SEQ ID NOS: 24, 26, 28, y 32, incluyendo fragmentos de las mismas (que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos que corresponden a las secuencias sin las secuencias lfder).

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 7 y tambien comprende una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO: 24. Tambien estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden secuencias de aminoacidos que son identicas o similares en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una o mas secuencias de aminoacidos proporcionadas en las SEQ ID NOS: 7 y 24 o fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que corresponden a las secuencias que se establecen en las SEQ ID NOS: 7 y 24 sin las secuencias lfder. Por consiguiente, en el presente documento se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 6 (incluyendo fragmentos de las mismas y complementos de las mismas) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 23 (incluyendo fragmentos de las mismas y complementos de las mismas). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 6, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 23, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas. En el presente documento tambien se describen anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 6 o 23, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de la misma.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 9 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO: 26. En el presente documento tambien se describen anticuerpos anti-CD200 que comprenden secuencias de aminoacidos que son identicas o similares en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una o mas secuencias de aminoacidos proporcionadas en las SEQ ID NOS: 9 y 26 o fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que corresponden a las secuencias que se establecen en las SEQ ID NOS: 9 y 26 sin las secuencias lfder. Por consiguiente, en el presente documento se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 8 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 25 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 8, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 25, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma. En el presente documento tambien se describen anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 8 o 25, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO: 26. Tambien estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden secuencias de aminoacidos que son identicas o similares en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una o mas secuencias de aminoacidos proporcionadas en las SEQ ID NOS: 11 y 26 o fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que corresponden a las secuencias que se establecen en las SEQ ID NOS: 11 y 26 sin las secuencias lfder. Por consiguiente, en el presente documento se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 10 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 25 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 10, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 25, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de la misma. En el presente documento tambien se describen anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 10 o 25, que incluye fragmentos de las mismas y complemented de las mismas.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 11 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO: 28. Tambien estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden secuencias de aminoacidos que son identicas o similares en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una o mas secuencias de aminoacidos proporcionadas en las SEQ ID NOS: 11 y 28 o fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que corresponden a las secuencias que se establecen en las SEQ ID NOS: 11 y 28 sin las secuencias lfder. Por consiguiente, en el presente documento se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 10 (incluyendo fragmentos de las mismas y complementos de las mismas) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 10, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 27, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma. En el presente documento tambien se describen anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 10 o 27, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 20 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO: 32. Tambien estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden secuencias de aminoacidos que son identicas o similares en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una o mas secuencias de aminoacidos proporcionadas en las SEQ ID NOS: 20 y 32 o fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que corresponden a las secuencias que se establecen en las SEQ ID NOS: 20 y 32 sin las secuencias lfder. Por consiguiente, en el presente documento se describe un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 19 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 31 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 19, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 31, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma. Por lo tanto, estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa o similar en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 19 o 31, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas.

Los anticuerpos anti-CD200 de acuerdo con la presente invencion incluyen anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno con funcion(s) alterada o no efectora. Estan incluidos anticuerpos que comprenden una region constante o Fc alterada con disminucion de las funciones efectoras. En el presente documento tambien se describen anticuerpos con funciones alteradas o no efectoras debido a un aumento o disminucion de la afinidad de union, que pueden surgir de cambios en las regiones variables. Algunas funciones efectoras alteradas incluyen, por ejemplo, un aumento o disminucion de la capacidad para unirse a una o mas celulas receptoras de Fc (FcR) o efectoras, aumento o disminucion de la citotoxicidad dependiente de antfgeno (ADCC), y/o aumento o disminucion de la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). Algunos anticuerpos variantes incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos en los que la region constante o region Fc contiene una o mas inserciones, deleciones, y/o sustituciones de aminoacidos. La presente invencion proporciona anticuerpos variantes que comprenden una region constante en la que las regiones CH1 y bisagra derivan de la IgG2 humana y las regiones CH2 y CH3 derivan de la IgG4 humana. En el presente documento tambien se describen anticuerpos en los que la region constante o Fc presenta alteracion de la glicosilacion. Los anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno mencionados anteriormente (incluyendo anticuerpos de una sola cadena) pueden ser de murino, quimericos, humanizados, totalmente humanos, o desinmunizados; estan incluidos anticuerpos que comprenden armazones de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgA, IgD, o IgE. Ademas, los anticuerpos mencionados, incluyendo fragmentos y variantes de los mismos, pueden ser anticuerpos de bloqueo o de no bloqueo o fragmentos de los mismos.

La presente invencion proporciona anticuerpos anti-CD200 que presentan disminucion de la funcion efectora o ninguna. Los anticuerpos con disminucion de la funcion efectuara o ninguna pueden comprender una region Fc o constante variante o alterada, tal como, por ejemplo, una region constante con una o mas sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoacidos, o una region constante con uno o mas cambios en la glicosilacion. Una region constante variante incluye, por ejemplo, una region en la que uno o mas aminoacidos estan sustituidos con alanina, tal como en la mutacion de Ala-Ala descrita en el presente documento, o en la que uno o mas grupos de carbohidrato se cambia, anade, o retira. Una alteracion en el numero y/o posicion de los grupos carbohidrato se puede conseguir produciendo el anticuerpo mencionado en tipos de celulas en particular para las que algunas modificaciones despues de la traduccion se podnan reducir, estar ausentes o aumentar. En una realizacion, la funcion efectora de algunos anticuerpos anti-CD200 se elimina cambiando la region constante de IgG1 por un dominio de fusion de IgG2/4. Se pueden concebir otras formas para eliminar la funcion efectora tales como, por ejemplo, mutacion de los sitios conocidos porque interactuan con una FcR o insercion de un Peptido en la region bisagra, eliminando de ese modo sitios fundamentales requeridos para una interaccion de FcR.

En el presente documento se describen anticuerpos anti-CD200 con alteracion de las funciones efectora son ninguna funcion efectora que comprenden anticuerpos anti-CD200 con una o mas sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoacidos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-CD200 variante de este tipo presenta reduccion de la funcion efectora o ninguna. La region constante variante (de dicho anticuerpo variante) puede poseer una homologfa de al menos aproximadamente un 70 % con la region constante o Fc de la secuencia nativa y/o con una region constante o Fc del anticuerpo precursor o fragmento del mismo; la region constante o Fc variante tambien puede poseer una homologfa o similitud de al menos aproximadamente un 80 % con la misma; o una homologfa o similitud de al menos aproximadamente un 90 % con la misma o una homologfa o similitud de al menos aproximadamente un 95 % con la misma. Un anticuerpo variante puede comprender una construccion de G2/G4. Por consiguiente, en el presente documento se describe una region constante o Fc de un anticuerpo anti-CD200 con reduccion de la funcion efectora o ninguna, en la que dicha region constante comprende una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 13, l5, 18, 22, y fragmentos de las mismas. Tambien se describen regiones constantes variantes de un anticuerpo anti-CD200 en las que un anticuerpo comprende una secuencia de aminoacidos que es identica o similar en al menos aproximadamente 90 % a una secuencia de aminoacidos seleccionada entre las SEQ ID NOS: 13, 15, 18, 22, y fragmentos de las mismas. Tambien se describen anticuerpos que comprenden a una secuencia de aminoacidos que es identica o similar en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % a una secuencia de aminoacidos proporcionada en las SEQ ID NOS: 13, 15, 18, 22, y fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias sin las secuencias lfder. Ademas, se describe una region constante de un anticuerpo anti-CD200 con reduccion de la funcion efectora o ninguna y que comprende la construccion de G2/G4 que esta codificada por una secuencia de acidos nucleicos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 17, y 21, o fragmentos de las mismas y complementos de las mismas. En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 con reduccion de la funcion efectora o ninguna que esta codificado por un acido nucleico que comprende una secuencia de acidos nucleicos que es homologo o similar en al menos aproximadamente 80 % a una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 17, y 21, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas. En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 variante codificado por una secuencia de acidos nucleicos que comprende una secuencia que es homologa o similar en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % a una secuencia de acidos nucleicos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 17, y 21, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas. El acido nucleico que codifica un anticuerpo anti-CD200 variante puede comprender una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con una secuencia de acidos nucleicos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 12, 14, 16, 17, y 21, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas. Estan incluidos fragmentos de union antfgeno y anticuerpos tanto de bloqueo como de no bloqueo o fragmentos de los mismos.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 13 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO: 28. Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una o mas secuencias de aminoacidos que son identicas en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de aminoacidos proporcionada en las SEQ ID NOS: 13 y 28 o fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que corresponden a las secuencias que se establecen en las SEQ ID NOS: 13 y 28 sin las secuencias lfder. Por consiguiente, se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 12 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27 (incluyendo fragmentos de la misma y complements de la misma). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 12, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 27, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma. Por lo tanto, estan incluidos anticuerpos anti-CD20o que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 12 o 27, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de la misma.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 15 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO: 24. Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una o mas secuencias de aminoacidos proporcionadas en las SEQ ID NOS: 15 y 24 o fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que corresponden a la secuencias que se establecen en las SEQ ID NOS: 15 y 24 sin las secuencias lfder (por ejemplo, el fragmento de la SEQ ID NO: 15 que comienza en el aminoacido 20 o 21). Por consiguiente, se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 14 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 23 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 14, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 23, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma. Por lo tanto, estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 14 o 23, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 13 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos un 90 % a la SEQ ID NO: 28. Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una o mas secuencias de aminoacidos que son identicas en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de aminoacidos proporcionada en las SEQ ID NOS: 13 y 28 o fragmentos de las mismas. Los fragmentos incluyen, pero no se limitan a, secuencias que corresponden a las secuencias que se establecen en las SEQ ID NOS: 13 y 28 sin las secuencias lfder. Por consiguiente, se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 16 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 16, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 27, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma. Por lo tanto, estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 16 o 27, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 18 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO: 30. Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de aminoacidos proporcionada en las SEQ ID NOS: 18 y 30 o fragmentos de las mismas. Por consiguiente, se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 17 (incluyendo fragmentos de la misma y complemented de la misma) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 29 (incluyendo fragmentos de las mismas y complementos de las mismas). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 17, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos un 80 % con una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 29, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma. Por lo tanto, estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 17 o 29, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas.

En el presente documento tambien se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 22 y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en al menos aproximadamente un 90 % a la SEQ ID NO. 34: Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos que es identica en aproximadamente un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de aminoacidos proporcionada en las SEQ ID NOS: 22 y 34 o fragmentos de las mismas. Por consiguiente, se describe un anticuerpo anti-CD200 variante que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 21 (incluyendo fragmentos de las mismas y complementos de las mismas) y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acidos nucleicos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de acidos nucleicos de la SEQ ID NO: 33 (incluyendo fragmentos de la misma y complementos de la misma). Tambien esta incluido un anticuerpo anti-CD200 que comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 21, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma, y que tambien comprende una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en al menos aproximadamente un 80 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en la SEQ ID NO: 33, que incluye fragmentos de la misma y complementos de la misma. Por lo tanto, estan incluidos anticuerpos anti-CD200 que comprenden una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de acido acidos nucleicos que es homologa en aproximadamente un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o un 100 % a una secuencia de acidos nucleicos proporcionada en las SEQ ID NOS: 21 y 33, que incluye fragmentos de las mismas y complementos de las mismas.

Algunos anticuerpos anti-CD200 con alteracion de la funcion efectora tambien pueden presentar un aumento de la funcion efectora. Algunos aumentos de funciones efectoras incluyen, pero no se limitan a, aumento de la union a uno o mas receptores de Fc, aumento de la capacidad para provocar ADCc , y/o aumento de la capacidad para provocar CDC. Algunos anticuerpos anti-CD200 con aumento de la funcion efectora tambien pueden comprender una region Fc o constante variante como se describe en el presente documento. Los anticuerpos anti-CD200 mencionados anteriormente con alteracion de las funciones afectadas pueden ser adicionalmente anticuerpos de bloqueo o de no bloqueo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 con aumento de la funcion efectora se puede unir a CD200 pero puede no bloquear la interaccion de CD200:CD200R. Un anticuerpo de este tipo puede ser util cuando se dirige una funcion efectora (por ejemplo, ADCC o CDC) a una celula que expresa CD200. Como se ha mencionado anteriormente, los anticuerpos que se describen en el presente documento, incluyendo los anticuerpos anti-CD200 mencionados anteriormente con alteracion de la funcion(s) efectora, incluyen anticuerpos de murino, quimericos, humanizados, totalmente humanos y desinmunizados, todos en sus formas de bloqueo y de no bloqueo, y fragmentos de las mismas.

Tambien se describen metodos y composiciones para modular o reducir celulas positivas para CD200. Las celulas positivas para CD200 se pueden modular o reducir mediante la administracion a un sujeto de un antagonista de CD200.

Las celulas positivas para CD200 estan relacionadas con ciertos tipos de canceres y ciertas enfermedades autoinmunitarias. Por consiguiente, las celulas positivas para CD200 incluyen, pero no se limitan a, celulas inmunitarias (tales como, por ejemplo, linfocitos B y linfocitos T) y celulas cancerosas (tales como, por ejemplo, celulas cancerosas de canceres de celulas de ovario, piel, pulmon, renal, mama, prostata, neuroblastoma, linfoma, mieloma, leucemia, tiroides y plasmaticas ). Tambien estan incluidas celulas cancerosas de cualquier tejido u organo derivado de celulas de la cresta neuronal. Por lo tanto con el sujeto con necesidad de un metodo para modular o reducir celulas positivas para CD200 puede ser un paciente con cancer o enfermedad autoinmunitaria, o un paciente que ha recibido o que se espera que reciba un trasplante de organo.

En el presente documento se describen metodos y composiciones para tratar enfermedades autoinmunitarias. Las enfermedades autoinmunitarias que se pueden tratar con los metodos y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino (incluyendo colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), lupus sistemico eritematoso, esclerosis multiple, tiroiditis de Hashimoto, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes del tipo I, dermatomiositis, smdrome de Sjogren, lupus eritematoso, miastenia gravis, smdrome de Reiter, enfermedad de Grave, psoriasis, y enfermedades hemolfticas autoinmunitarias. En algunas realizaciones, a un paciente con una enfermedad autoinmunitaria se le proporciona un antagonista para CD200, y en ciertas realizaciones, el antagonista es un anticuerpo anti-CD200. El anticuerpo anti-CD200 puede comprender una region constante variante como se describe en el presente documento. Por consiguiente, el anticuerpo anti-CD200 puede presentar alteracion de la funcion(s) efectora, tal como, por ejemplo, aumento de la funcion(s) efectora. El anticuerpo mencionado puede presentar, por ejemplo, aumento de la union a uno o mas receptores de Fc. Ademas, el anticuerpo mencionado puede provocar un aumento de ADCC y/o CDC. El anticuerpo mencionado puede ser adicionalmente cualquiera de un anticuerpo de bloqueo o de no bloqueo o un fragmento del mismo y puede ser cualquiera de un anticuerpo murino, quimerico, humanizado, totalmente humano o desinmunizado un fragmento del mismo.

Los canceres para los que se pueden usar los metodos desvelados incluyen, pero no se limitan a, melanoma, cancer de ovario, cancer renal, neuroblastoma, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de prostata, linfoma, mieloma, leucemia, y cancer de celulas plasmaticas. Tambien estan incluidos algunos canceres derivados de celulas de la cresta neuronal y cualquier cancer que exprese CD200. En determinadas realizaciones, la presente divulgacion proporciona un metodo para tratar trastornos malignos hematologicos, tales como, por ejemplo, leucemias, incluyendo, leucemia linfocftica cronica.

En el presente documento se describe una terapia para cancer de acuerdo con la presente divulgacion que comprende (1) administrar un anticuerpo anti-CD200 o antagonista que interfiera con la interaccion entre CD200 and su receptor para bloquear la supresion inmunitaria, estimulando de ese modo la erradicacion de las celulas cancerosas; y/o (2) administrar una molecula de fusion que incluye una parte de direccion a CD-200 para eliminar directamente las celulas cancerosas. Como alternativa, el anticuerpo elimina directamente las celulas cancerosas a traves de citotoxicidad celular mediada por complemento y/o dependiente de anticuerpo. La funcion efectora del anticuerpo anti-CD200 se puede alterar. De acuerdo con la presente invencion, el anticuerpo anti-CD200 puede contener una region constante variante o alterada para la que la funcion efectora se disminuye o se elimina; un anticuerpo de este tipo puede ser util para los metodos que se han descrito anteriormente en (1) y (2), por ejemplo.

En el presente documento se describen moleculas de fusion en las que un anticuerpo anti-CD200 o fragmento de union antfgeno se une a una segunda molecula. La molecula de fusion mencionada puede comprender, por ejemplo, una molecula pequena, polipeptido, peptidomimetico, polipeptido heterodclico, un agente quimioterapeutico, un agente inmunomodulador, un resto de direccion, o una construccion de acido nucleico (por ejemplo, construccion antisentido, ARNi, o de direccion genetica). La divulgacion tambien incluye fragmentos de union de antfgeno a CD200 en la que el fragmento se fusiona o de otro modo se une a un polipeptido, dominio de protema, protema en suero, albumina, PEG (polietilenglicol), o cualquier otra molecula que aumentara la semivida del fragmento mencionado in vivo. Los fragmentos de union antfgeno mencionados incluyen Fab, Fv, fragmentos de una sola cadena o scFv, Fab', y F(ab')², por ejemplo.

En el presente documento tambien se describen metodos que usan anticuerpos anti-CD200 para determinar el estado de expresion de CD200 de una muestra de celula o tejido obtenida de un paciente. Algunos metodos de este tipo incluyen, pero no se limitan a, tincion inmunohistoqmmica de muestras de tejido y analisis de citometna de flujo de celulas tenidas con CD200 de un paciente. El paciente puede ser un paciente con cancer, por ejemplo.

De acuerdo con los metodos y composiciones descritos en el presente documento, la divulgacion tambien se refiere a metodos para tratar a un paciente de trasplante o aloinjerto. Un anticuerpo anti-CD200 u otro antagonista de CD200 de la presente divulgacion se pueden administrar a un paciente antes de un procedimiento de trasplante o aloinjerto o despues del procedimiento para disminuir o eliminar celulas inmunitarias positivas para CD200 que podnan reducir la aceptacion del paciente del organo o tejido trasplantado. Un anticuerpo anti-CD200 con aumento de la funcion efectora se puede proporcionar a un paciente de trasplante.

En el presente documento se describen metodos para terapias de combinacion que comprenden terapia anti-CD200. Por ejemplo, a un paciente que recibe una primera terapia que comprende un antagonista de CD200 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 descrito en el presente documento) tambien se puede proporcionar una segunda terapia. El antagonista de CD200 se puede proporcionar de forma simultanea con la segunda terapia. Como alternativa, el antagonista de CD200 se puede proporcionar antes o despues de la segunda terapia. Algunas segundas terapias incluyen, pero no se limitan a, agentes quimioterapeuticos, radioterapia, vacunas, antibioticos, agentes antivirales y terapias inmunomoduladoras.

En el presente documento tambien se describen metodos para controlar la evolucion de un tratamiento terapeutico. El metodo implica la administracion de una terapia (por ejemplo, una terapia inmunomoduladora, una terapia quimioterapeutica, etc.) y determinar los niveles de CD200 en un sujeto, al menos dos veces, para determinar la eficacia de la terapia. Otros metodos para determinar la eficacia de una terapia incluyen, pero no se limitan a, deteccion de celulas cancerosas, recuento linfocitario total, tamano del bazo, hngado, y/o ganglios linfaticos, numero de linfocitos T reguladores, perfiles de citoquina intracelular o en suero, o secrecion de citoquinas por linfocitos T o B tal como se mide con ELISPOT - un sistema de ensayo que permite la deteccion de citoquinas u otras moleculas secretadas en una base por celula.

De acuerdo con las composiciones y metodos establecidos en el presente documento tambien se describe cualquier composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo anti-CD200. Estan incluidos anticuerpos anti-CD200 quimericos, humanizados, humanos y desinmunizados y fragmentos de union al antigeno, incluyendo anticuerpos de una sola cadena. Tambien estan incluidos anticuerpos anti-CD200 variantes de murino, quimericos, humanizados, humanos y desinmunizados y fragmentos de union a antfgeno con alteracion de la funcion(s) efectora como se describe en el presente documento. Los anticuerpos y anticuerpos variantes mencionados anteriormente pueden ser cualquiera de anticuerpos de bloqueo o de no bloqueo o fragmentos de union a antfgeno.

Los pacientes para los que es util una terapia anti-CD200, o los pacientes que esperan recibir una terapia que comprende una terapia con antagonista de CD200 (incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200), se pueden identificar sistematicamente para ciertos tratamientos y procedimientos recibidos previamente o para el estado medico actual. Por ejemplo, se puede hacer una identificacion sistematica previa de las pacientes hembra para embarazo y acuerdo de anticoncepcion, dado que CD200 desempena un papel importante en la proteccion frente al aborto. Por consiguiente, los pacientes que reciben una terapia de este tipo pueden estar de acuerdo con la practica de uno o mas metodos anticonceptivos. El paciente mencionado puede estar de acuerdo en el uso de uno o mas metodos anticonceptivos durante un periodo de tiempo designado para comenzar la terapia mencionada y/o para la duracion de la terapia mencionada. Las pacientes hembra pueden recibir consejo en referencia a los riesgos con respecto a la exposicion del feto o a una terapia anti-CD200 de este tipo. Se puede esperar que tales pacientes firmen formularios de consentimiento informado antes de un tratamiento de este tipo. Los medicos que aconsejan a los pacientes con respecto a una terapia anti-CD200 pueden requerir que tales pacientes usen dispositivos o formulaciones anticonceptivos antes de la administracion de la terapia con anti-CD200 (vease, por ejemplo, el documento de patente US 6.908.432 y patentes relacionadas). Se puede hacer una identificacion sistematica de los pacientes para identificar pacientes que han recibido previamente cirugfa cerebral y/o radioterapia en el cerebro; la terapia anti-CD200 no se podna prescribir a pacientes de este tipo.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 proporciona la secuencia de acidos nucleicos para el cebador C7mhHF (SEQ ID NO: 1) usado en la generacion de la construccion de G2/G4.

La Figura 2 proporciona la secuencia de acidos nucleicos para el cebador Rev Age Pri (SEQ ID NO: 2) usado en la generacion de la construccion de G2/G4.

La Figura 3 proporciona la secuencia de acidos nucleicos para el cebador C2aB7 rev (SEQ ID NO: 3) usado en la generacion de la construccion de G2/G4.

La Figura 4 proporciona la secuencia de acidos nucleicos para el cebador lacpri (SEQ ID NO: 4) usado en la generacion de la construccion de G2/G4.

La Figura 5 proporciona la secuencia de acidos nucleicos para LeadVHpAX (SEQ ID NO: 5).

Las Figuras 6A-F representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo chC2aB7-hG1 (SEQ ID NOS: 6, 7, 23, 24, 37, y 38). La Figura 6C muestra la SEQ ID NO: 37 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 7 (secuencia de aminoacidos). La SEQ ID NO: 7 como se muestra en el esquema es contigua pero se representa con una secuencia de nucleotidos correspondiente que incluye intrones. La Figura 6F muestra la SEQ ID NO: 38 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 24 (secuencia de aminoacidos).

Las Figuras 7A-F representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo hB7V4V1-hG1(SEQ ID NOS: 8, 9, 25, 26, 39, y 40). La Figura 7C muestra la SEQ ID NO: 39 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 9 (secuencia de aminoacidos). La Figura 7F muestra la SEQ ID NO: 40 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 26 (secuencia de aminoacidos).

Las Figuras 8A-F representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo hB7V3V1-hG1 (SEQ ID NOS: 10, 11,25, 26, 40, y 41). La Figura 8C muestra la SEQ ID NO: 41 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 11 (secuencia de aminoacidos). La Figura 8F muestra la SEQ ID NO: 41 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 26 (secuencia de aminoacidos).

Las Figuras 9A-F representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo hB7V3V2-hG1 (SEQ ID NOS: 10, 11,27, 28, 41, y 42). La Figura 9C muestra la SEQ ID NO: 41 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 11 (secuencia de aminoacidos). La Figura 9F muestra la SEQ ID NO: 42 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 28 (secuencia de aminoacidos).

Las Figuras 10A-F representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo hB7V3V2-hG2G4 (SEQ ID NOS: 12, 13, 27, 28, 42, y 43). La Figura 10C muestra la SEQ ID NO: 43 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 13 (secuencia de aminoacidos). La SEQ ID NO: 13 como se muestra en el esquema es contigua pero se representa con una secuencia de nucleotidos correspondiente que incluye intrones. La Figura 10F muestra la SEQ ID NO: 42 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 28 (secuencia de aminoacidos).

Las Figuras 11A-F representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo chC2aB7-hG2G4 (SEQ ID NOS: 14, 15, 23, 24, 44, 45, 46, y 47). La Figura 11C muestra la SEQ ID NO: 44 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 45 (secuencia de aminoacidos). La SEQ ID NO: 45 corresponde a los aminoacidos 1-337 de la SEQ ID NO: 15. Como se muestra en el esquema, la SEQ ID NO: 45 es contigua pero se representa con una secuencia de nucleotidos correspondiente que incluye intrones. La Figura 11F muestra la SEQ ID NO: 46 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 47 (secuencia de aminoacidos).

Las Figuras 12A-F representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo hB7V3V2-cG2G4 (SEQ ID NOS: 13, 16, 27, 28, 48, y 49). La Figura 12C muestra la SEQ ID NO: 48 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 13 (secuencia de aminoacidos). La Figura 12F muestra la SEQ ID NO: 49 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 28 (secuencia de aminoacidos).

Las Figuras 13A-D representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo chC7-hG2G4 (SEQ ID NOS: 17, 18, 29, y 30).

Las Figuras 14A-F representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo D1B5-hG1 (SEQ ID NOS: 19, 20, 31, 32, 50, y 51). La Figura 14C muestra la SEQ ID NO: 50 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 20 (secuencia de aminoacidos). La SEQ ID NO: 20 como se muestra en el esquema es contigua pero se representa con una secuencia de nucleotidos correspondiente que incluye intrones. La Figura 14F muestra la SEQ ID NO: 51 (secuencia de acidos nucleicos) y la SEQ ID NO: 32 (secuencia de aminoacidos).

Las Figuras 15A-D representan las secuencias de aminoacidos y secuencias de nucleotidos para las cadenas pesada y ligera del anticuerpo G2G463L1D (SEQ ID NOS: 21, 22, 33, y 34).

La Figura 16 proporciona la secuencia de acidos nucleicos para el cebador directo para clonacion de ADNc de CD200 (SEQ ID NO: 35).

La Figura 17 proporciona la secuencia de acidos nucleicos para el cebador inverso para clonacion de ADNc de CD200 (SEQ ID NO: 36).

La Figura 18 muestra los efectos de la administracion de anticuerpos CD200 humanizados en el modelo RAJI-CD200/PBL. Los anticuerpos anti-CD200 humanizados dieron como resultado una inhibicion del crecimiento tumoral. La Figura 19 demuestran los efectos de la administracion de anticuerpos CD200 humanizados con y sin funcion efectora en el modelo animal Namalwa_CD200. Los anticuerpos sin funcion efectora presentaban eficacia en la inhibicion del crecimiento tumoral.

La Figura 20 es una tabla que muestra el nivel de expresion de CD200 en muestras de pacientes con leucemia linfodtica cronica (CLL) en comparacion con muestras normales.

La Figura 21 representa los niveles relativos de expresion de CD200 detectados en lmeas de celulas cancerosas. La Figura 22 muestra el nivel de expresion de antfgeno de CD200 en muestras de cancer de ovario humano con respecto al nivel de expresion detectado en linfocitos de sangre periferica humana (PBL).

La Figura 23 muestra el nivel de expresion de antfgeno de CD200 en muestras de pacientes con melanoma humano con respecto al nivel de expresion detectado en PBL.

La Figura 24 muestra tincion inmunohistoqmmica de CD200 de muestras de paciente con melanoma.

La Figura 25 demuestra los efectos del anticuerpo anti-CD200 en la produccion de citoquinas. Los niveles de produccion de IL-2 en ensayos de poblacion de celulas mixtas se midieron en ausencia y presencia de anticuerpo CD200. El anticuerpo usado es un anticuerpo anti-CD200 quimerico sin funcion efectora.

La Figura 26 muestra los efectos de la administracion de anticuerpos anti-CD200, con o sin funcion efectora, en el modelo Namalwa/PBL en el que los tumores no expresan CD200.

La Figura 27 muestra analisis de citometna de flujo de expresion de CD200 en linfocitos T activados. Los linfocitos CD3+ se activaron con mOKT3, se cosecharon, se lavaron y se sometieron a tincion con los anticuerpos conjugados indicados espedficos para CD25, CD200, CD5, CD4 y CD8 humanos. Las celulas se lavaron y se analizaron para inmunofluorescencia en un citometro de flujo FacsCaliber usando el software CellQuest.

La Figura 28 demuestran los efectos de anticuerpos anti-CD200 en ADCC de linfocitos T activados. Los linfocitos T CD3+ humanos se estimularon con 10 pg/ml de mOKT3 inmovilizado (revestidos en placa) durante 72 h. A continuacion, los linfocitos T se cromaron para su uso como dianas y se incubaron con linfocitos CD56+ (NK) autologos purificados como celulas receptoras. Las celulas se coincubaron durante 4 horas a 37 °C en proporciones de celula efectora:diana a 25:1 (A) o 10:1 (B) en presencia o ausencia de un anticuerpo anti-CD200 humanizado capaz de mediar la funcion efectora (V3V2-G1) o modificado por ingeniena para carecer de funcion efectora (V3V2-G2G4). Los datos se representan como porcentaje de lisis espedfica. El anticuerpo anti-CD200 aumento la ADCC de linfocitos T activados, mientras que el anticuerpo anti-CD200 sin funcion efectora fracasaba al inducir la ADCC.

La Figura 29 es una tabla que muestra el nivel de expresion de CD200 en celulas plasmaticas.

Descripcion detallada de realizaciones preferentes

I. ANTAGONISTAS DE CD200

CD200 es una glicoprotema transmembrana de tipo I altamente conservada expresada en diversos tipos celulares incluyendo celulas del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, y celulas dendnticas (Barclay et al., TRENDS Immunol. 2002: 23)) asf como ciertas celulas cancerosas como se muestra en el presente documento. La protema interactua con su receptor CD200R en celulas mieloides y subpoblaciones de linfocitos T (Wright et al., J. Immunol. 2003 (171): 3034-3046 y Wright et al., Immunity 2000 (13): 233-242); la interaccion de CD200:CD200R proporciona una senal inmunomoduladora a celulas e induce inmunosupresion incluyendo tolerancia inmunitaria asociada con apoptosis (Rosenblum et al., 2004 Blood (103): 2691-2698). Por lo tanto, los agentes que interfieren con la funcion o actividad de CD200 y/o su receptor pueden inhibir o revertir los efectos inmunosupresores de la interaccion de CD200:CD200R. Ademas, algunos agentes que se unen de forma espedfica a CD200 (pero que pueden inhibir o no la interaccion de CD200:CD200R) pueden desencadenar sucesos cadena abajo que revierten o anulan los efectos de CD200.

En el presente documento se describen antagonistas de CD200. Como se usa en el presente documento, el termino antagonista incluye cualquier agente que es capaz de inhibir la actividad, funcion y/o la expresion de CD200 o su receptor. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos, anticuerpos, moleculas pequenas, aptameros, espiegelmeros, inhibidores de acido nucleico bloqueados (LNA), inhibidores de acido nucleico peptfdicos (PNA), construcciones de acido nucleico (por ejemplo, construcciones de direccion genetica, construcciones antisentido, construcciones de ARN de interferencia (ARNi), etc.) y peptidomimeticos. De acuerdo con la presente invencion el antagonista es un anticuerpo. De acuerdo con la presente invencion el antagonista interrumpe la interaccion de CD200 y CD200R. Los antagonistas de CD200 pueden ser capaces de disminuir los efectos inmunosupresores de CD200 o son capaces de dirigir las celulas que expresan CD200 para disminucion o eliminacion.

Los antagonistas de CD200 pueden ser polipeptidos. Se pueden hacer construcciones de algunos polipeptidos usando diferentes tecnicas que son conocidas por los expertos en la materia. Los polipeptidos se pueden obtener mediante smtesis qmmica. Los polipeptidos pueden ser construcciones de anticuerpo a partir de un fragmento o varios fragmentos de uno o mas anticuerpos. El polipeptido puede ser un anticuerpo anti-CD200 como se describe en el presente documento.

Los antagonistas de CD200 descritos en el presente documento pueden ser anticuerpos anti-CD200. Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpos" se refiere a anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a CD200 o CD200R. Estan incluidos Fab, Fv, scFv, Fab' y F(ab')², anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos modificados por ingeniena (incluyendo anticuerpos quimericos, de una sola cadena, injertados con CDR, humanizados, totalmente humanos, y anticuerpos seleccionados de manera artificial), y anticuerpos sinteticos o semisinteticos producidos usando tecnicas de presentacion de fagos o tecnicas alternativas. Tambien estan incluidos anticuerpos modificados por ingeniena o producidos en formas para contener regiones variantes o constantes alteradas o Fc con aumento o disminucion de la capacidad para unirse a una o mas celulas efectoras; tales anticuerpos variantes incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos en los que la region constante o Fc contiene alteracion de los patrones de glicosilacion. Algunos fragmentos pequenos, tales como Fv y scFv, poseen propiedades ventajosas para aplicaciones de diagnostico y terapeuticas teniendo en cuenta su tamano pequeno y consiguiente distribucion del tejido superior. Los anticuerpos con regiones modificadas por ingeniena o constantes variantes o Fc pueden ser utiles en la modulacion de funciones efectoras, tales como, por ejemplo, ADCC y CDC. Los anticuerpos de este tipo con regiones modificadas por ingeniena o constantes variantes o Fc pueden ser utiles en casos en los que CD200 se expresa en tejido normal, por ejemplo; en estos casos, los anticuerpos anti-CD200 variantes sin funcion efectora pueden provocar la respuesta terapeutica deseada a la vez que no danan el tejido normal. Ademas, anticuerpos con anticuerpos variantes, y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de bloqueo (es decir, los anticuerpos o fragmentos mencionados inhiben la interaccion de CD200 y CD200R) o de no bloqueo (es decir, los anticuerpos o fragmentos mencionados se unen a CD200 pero no bloquean su interaccion con CD200R).

Tambien se describen anticuerpos anti-CD200 que comprenden cadenas pesadas y ligeras como se proporciona en el presente documento, incluyendo cadenas pesadas y ligeras que son homologas o similares a las cadenas pesadas y/o ligeras proporcionadas en el presente documento. "Homologfa" o "identidad" o "similitud" se refieren a similitud de secuencias entre dos peptidos o entre dos moleculas de acido nucleico. Cada una de homologfa e identidad se puede determinar por comparacion de una posicion en cada secuencia que se puede alinear con fines de comparacion. Cuando una posicion equivalente en las secuencias comparadas esta ocupada por la misma base o aminoacido, entonces las moleculas son identicas en esa posicion; cuando el sitio equivalente esta ocupado por el mismo resto de aminoacido o uno similar (por ejemplo, de naturaleza esterica y/o electronica similar), entonces las moleculas se pueden denominar homologas (similares) en esa posicion. La expresion como un porcentaje de homologfa/similitud o identidad se refiere a una funcion del numero de aminoacidos identicos o similares en posiciones compartidas por las secuencias comparadas. El termino "homologfa" describe una comparacion de similitudes de secuencias con base matematica que se usa para identificar genes o protemas con funciones o motivos similares. Como se usa en el presente documento, "identidad" se refiere al porcentaje de restos de nucleotidos o aminoacidos identicos en posiciones correspondientes en dos o mas secuencias cuando las secuencias se alinean para maximizar el emparejamiento de secuencias, es decir, teniendo en cuenta huecos e inserciones. Por lo tanto, se disenan metodos para determinar la identidad para dar el mayor emparejamiento entre las secuencias sometidas a ensayo (vease Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 10731988, Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990) y Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)) y BLAST X (BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Una secuencia que esta "sin relacionar" o "no es homologa" comparte una identidad inferior a un 40 %, aunque preferentemente inferior a un 25 % de identidad con una secuencia de la presente divulgacion. Al comparar las dos secuencias, la ausencia de restos (aminoacidos o acidos nucleicos) o presencia de restos extra tambien disminuye la identidad y homologfa/similitud.

En consecuencia, la divulgacion se refiere a anticuerpos, como se describe en el presente documento, sin las secuencias lfder. Por lo tanto, los anticuerpos de la divulgacion pueden comprender cadenas pesadas y ligeras (como se describe en el presente documento) en las que la secuencia lfder esta ausente o esta sustituida con una secuencia lfder diferente. Si para producir anticuerpos de la presente divulgacion se usan celulas hospedadoras, las secuencias lfder apropiadas se pueden seleccionar por lo tanto de acuerdo con la celula hospedadora usada en particular.

Los anticuerpos se pueden producir con metodos bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD200 monoclonales se pueden generar usando celulas positivas para CD200, polipeptido de CD200, o un fragmento de polipeptido de CD200, como un inmunogeno, aumentando de este modo una respuesta inmunitaria en animales a partir de los que se pueden aislar celulas que producen anticuerpo y a su vez anticuerpos monoclonales. La secuencia de anticuerpos de este tipo se puede determinar y los anticuerpos o valientes de los mismos se pueden producir con tecnicas recombinantes. Algunas tecnicas recombinantes se pueden usar para producir anticuerpos quimericos, injertados con CDR, humanizados y totalmente humanos basandose en la secuencia de los anticuerpos monoclonales asf como polipeptidos capaces de unirse a CD200.

Ademas, algunos anticuerpos derivados de bibliotecas recombinantes ("anticuerpos de fago") se pueden seleccionar usando celulas positivas para CD200, o polipeptidos derivados de las mismas, como cebo para aislar los anticuerpos o polipeptidos sobre la base de final de especificidad de diana. La produccion y aislamiento de anticuerpos anti-CD200 no humanos y quimericos esta bien dentro del alcance del experto en la materia.

La tecnologfa de ADN recombinante se usa para mejorar los anticuerpos producidos en celulas no humanas. Por lo tanto, se pueden construir anticuerpos quimericos para disminuir la inmunogenicidad de los mismos en aplicaciones de diagnostico o terapeuticas. Ademas, la inmunogenicidad se puede minimizar humanizando los anticuerpos mediante injerto de CDR y, opcionalmente, modificacion del armazon. Vease, el documento de Patente de Estados Unidos n.° 5.225.539.

Los anticuerpos se pueden obtener a partir de suero animal o, en el caso de anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, se pueden producir en cultivo celular. Se puede usar tecnologfa del ADN recombinante para producir los anticuerpos de acuerdo con procedimientos establecidos, incluyendo procedimientos en cultivo de celulas bacterianas o preferentemente cultivo de celulas de mairnfero. El sistema de cultivo celular seleccionado se secreta preferentemente el producto de anticuerpo.

En el presente documento se describe un proceso para la produccion de un anticuerpo desvelado en el presente documento que incluye cultivar una celula hospedadora, por ejemplo una celula de E. coli o de m ai^ero, que se ha transformado con un vector hfbrido. El vector incluye uno o mas casetes de expresion que contienen un promotor unido de forma operativa a una primera secuencia de ADN que codifica un peptido senal unido en el marco de lectura apropiado a una segunda secuencia de ADN que codifica la protema del anticuerpo. A continuacion, la protema del anticuerpo se recoge y se afsla. Opcionalmente, el casete de expresion puede incluir a un promotor unido de forma operativa a secuencias de ADN policistronico, por ejemplo bicistronico, que codifican protemas de anticuerpo cada una capaz de unirse de forma operativa a un peptido senal en el marco de lectura apropiado.

La multiplicacion de celulas de hibridoma o celulas de hospedador m a i^e ro in vitro se realiza en medios de cultivo adecuados, que incluyen los medios de cultivo convencionales habituales (tales como, por ejemplo Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) o medio RPMI 1640), repuesto opcionalmente con un suero de mam^era (por ejemplo suero bovino fetal), o elementos traza y suplementos de mantenimiento del crecimiento (por ejemplo celulas alimentadoras tales como celulas de exudado peritoneal de raton normal, celulas de bazo, macrofagos de medula osea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, y lipoprotema de baja densidad, acido oleico, o similares). La multiplicacion de celulas hospedadoras que son celulas bacterianas o celulas de levadura se realiza del mismo modo en medio de cultivo adecuado conocido en la tecnica. Por ejemplo, para bacterias, algunos medios de cultivo adecuados incluyen medio LE, NZCYM, NZYM, NZM, Caldo de cultivo Terrific, SOB, SOC, 2 x YT, o Medio Mmimo M9. Para la levadura, algunos medios de cultivo adecuados incluyen medio YPD, YEPD, Medio Mmimo, o Medio de Abstinencia Mmimo Completo.

La produccion in vitro proporciona preparaciones de anticuerpos relativamente puras y permite ampliacion de la produccion para dar grandes cantidades de los anticuerpos deseados. En la tecnica se conocen algunas tecnicas para celulas cultivo de bacterianas, levadura, planta, o mam^era e incluyen cultivo en suspension homogeneo (por ejemplo en un reactor de desplazamiento aereo o en un reactor de agitacion continua), y cultivo de celulas inmovilizadas o atrapadas (por ejemplo en fibras huecas, microcapsulas, en microperlas de agarosa o cartuchos de ceramica).

Tambien se pueden obtener grandes cantidades de anticuerpos deseados mediante multiplicacion de celulas de m a i^e ro in vivo. Para este fin, las celulas de hibridoma que producen los anticuerpos deseados se inyectan en mairnferos histocompatibles para causar el crecimiento de tumores que producen anticuerpos. Opcionalmente, los animales se ceban con un hidrocarburo, en especial aceites minerales tales como pristano (tetrametil-pentadecano), antes de la inyeccion. Despues de una a tres semanas, los anticuerpos se afslan a partir de los fluidos corporales de esos m ai^eras. Por ejemplo, las celulas de hibridoma obtenidas por fusion de celulas de mieloma adecuadas con celulas de bazo que producen anticuerpos de ratones Balb/c, o celulas transfectadas derivadas de la lmea Sp2/0 de celulas de hibridoma que produce los anticuerpos deseados se inyecta por via intraperitoneal en ratones Balb/c tratados previamente de forma opcional con pristano. Despues de una a dos semanas, se extrae fluido asdtico de los animales.

Las tecnicas mencionadas anteriormente y otras tecnicas se discuten por ejemplo, en Kohler y Milstein, (1975) Nature 256: 495-497; documento de patente de Estados Unidos n.° 4.376.110; Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor. Algunas tecnicas para la preparacion de moleculas de anticuerpo recombinante se describen en las referencias mencionadas anteriormente, y tambien en, por ejemplo el documento WO97/08320; documento de patente de Estados Unidos n.° 5.427,908; documento de patente de Estados Unidos n.° 5.508,717; Smith, 1985, Science, Vol. 225, pp 1315-1317; Parmley y Smith, 1988, Gene 73, pp 305-318; De La Cruz et al., 1988, Journal of Biological Chemistry, 263 pp 4318-4322; documento de patente de Estados Unidos n.° 5.403.484; documento de patente de Estados Unidos n.° 5223409; documento WO88/06630; documento WO92/15679; documento de patente de Estados Unidos n.° 5780279; documento de patente de Estados Unidos n.° 5571698; documento de patente de Estados Unidos n.° 6040136; Davis et al., 1999, Cancer Metastasis Rev., 18 (4): 421-5; Taylor, et al., Nucleic Acids Research 20 (1992): 6287-6295; Tomizuka et al., Proc. Natl. Academy of Sciences USA 97 (2) (2000): 722-727.

Los sobrenadantes del cultivo celular se identifican sistematicamente para los anticuerpos deseados, preferentemente mediante tincion con inmunofluorescencia de celulas positivas para CD200, mediante inmunotransferencia, con un inmunoensayo enzimatico, por ejemplo un ensayo de sandwich o un ensayo de aplicacion puntual, o un radioinmunoensayo.

Para aislamiento de los anticuerpos, las inmunoglobulinas en los sobrenadantes del cultivo o en el fluido asdtico se pueden concentrar, por ejemplo mediante precipitacion con sulfato de amonio, dialisis con respecto al material higroscopico tal como polietilenglicol, filtracion a traves de membranas selectivas o similares. Si fuera necesario y/o si se deseara, los anticuerpos se purifican con los metodos de cromatograffa habituales, por ejemplo filtracion en gel, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa sobre DEAE-celulosa y/o cromatograffa por (inmuno) afinidad, por ejemplo cromatograffa por afinidad con uno o mas polipeptidos de superficie derivados de una lmea de celulas positivas para CD200, o con Protema A o G.

En el presente documento tambien se describe un proceso para la preparacion de una lmea de celulas bacterianas que secretan anticuerpos dirigidos frente a CD200 en un m a i^e ro adecuado. Por ejemplo un conejo se inmuniza con muestras combinadas de tejido o celulas positivos para CD200 o polipeptidos de CD200 o fragmentos de los mismos. Se construye una biblioteca de presentacion de fagos producida a partir de conejo inmunizado y se selecciona para los anticuerpos deseados de acuerdo con metodos bien conocidos en la tecnica.

Tambien se desvelan algunas celulas de hibridoma que secretan los anticuerpos monoclonales. Las celulas de hibridoma preferentes son anticuerpos monoclonales secretados, geneticamente estables descritos en el presente documento de la especificidad deseada, y se pueden activar a partir de cultivos ultracongelados mediante descongelado y nueva clonacion.

En el presente documento tambien se describe un proceso para la preparacion de una lmea de celulas de hibridoma que secretan anticuerpos monoclonales frente a CD200. En ese proceso, un m a i^e ro adecuado, por ejemplo un raton Balb/c, se inmuniza con uno o mas polipeptidos o fragmentos antigenicos de CD200 o con uno o mas polipeptidos o fragmentos antigenicos derivados de una celula positiva para CD200, la propia celula positiva para CD200, o un vehffculo antigenico que contienen polipeptido purificado como se ha descrito. Las celulas que producen anticuerpos del m a i^e ro inmunizado se cultivan brevemente en cultivo o se fusionan con celulas de una lmea de celulas de mieloma adecuada. Las celulas tffbridas obtenidas en la fusion se clonan, y se seleccionan los clones celulares que secretan los anticuerpos deseados. Por ejemplo, las celulas de bazo de ratones Balb/c inmunizados con una lmea de celulas de Leucemia Linfodtica Cronica (CLL) positivas para CD200 se fusionan con celulas de la lmea de celulas de mieloma, PAI, o la lmea de celulas de mieloma Sp2/0-Ag 14. A continuacion, las celulas tffbridas obtenidas se identifican sistematicamente para secrecion de los anticuerpos deseados y las celulas de hibridoma positivas se clonan.

Es preferente un proceso para la preparacion de una lmea de celulas de hibridoma, caracterizado por que los ratones Balb/c se inmunizan mediante inyeccion por via subcutanea y/o por via intraperitoneal entre 106 y 107 celulas de una lmea de celulas positivas para CD200 varias veces, por ejemplo de cuatro a seis veces, durante varios meses, por ejemplo entre dos y cuatro meses. Las celulas de bazo de los ratones inmunizados se toman de dos a cuatro dfas despues de la ultima inyeccion y fusionan con celulas de la lmea de celulas de mieloma, PAI, en presencia de un promotor de fusion, preferentemente polietilenglicol. Preferentemente, las celulas de mieloma fusionan con un exceso de tres a veinte veces de celulas de bazo de los ratones inmunizados en una solucion que contiene de aproximadamente un 30 % a aproximadamente un 50 % de polietilenglicol de un peso molecular de aproximadamente 4000. Despues de la fusion, las celulas se expanden en medio de cultivo adecuado como se ha descrito anteriormente en el presente documento, se suplementan con un medio de seleccion, por ejemplo medio HAT, a intervalos regulares para evitar que las celulas de mieloma normales presentan un crecimiento excesivo con respecto a las celulas de hibridoma deseadas.

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden ser "quimericos". Los anticuerpos quimericos un y fragmentos de union a antfgeno de los mismos comprenden partes de dos o mas especies diferentes (por ejemplo, raton y ser humano). Los anticuerpos quimericos se pueden producir con regiones variables de raton de especificidad deseada con corte y empalme en segmentos geneticos de dominio constante humano (por ejemplo, documento de patente de Estados Unidos n.° 4.816.567). De este modo, los anticuerpos no humanos se pueden modificar para hacerlos mas adecuados para aplicacion clmica en seres humanos.

Los anticuerpos monoclonales de la presente divulgacion incluyen formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (es decir, raton). Los mAb humanizados o injertados con CDR son particularmente utiles como agentes terapeuticos para seres humanos porque no se eliminan de la circulacion tan rapidamente como los anticuerpos de raton y por lo general no provocan una reaccion inmunitaria adversa. Por lo general, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas restos de aminoacidos introducidos en el mismo de una fuente no humana. Estos restos de aminoacidos no humanos a menudo se denominan restos de "importacion", que por lo general se toman de un dominio variable de " importacion". Por lo general, en la tecnica se conoce en bien algunos metodos para preparar anticuerpos humanizados. Por ejemplo, la humanizacion se puede realizar esencialmente siguiendo el metodo de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verheoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), mediante la sustitucion de las CDR o secuencias de CDR de roedor para las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Vease tambien Staelens et al., 2006 Mol Immunol 43: 1243 1257. En realizaciones en particular, algunas formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, raton) son anticuerpos humanos (anticuerpo receptor) en las que en algunos restos de region hipervariable (CDR) del anticuerpo receptor intuyen con restos de region hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como un raton, rata, conejo, o primate no humano que tengan la especificidad, afinidad y capacidad de union deseadas. En algunos casos, algunos restos de la region marco conservada de la inmunoglobulina humana tambien se sustituyen con restos no humanos correspondientes (denominados "retromutaciones"). Ademas, se pueden usar bibliotecas de presentacion de fagos para variar los aminoacidos en posiciones elegidas dentro de la secuencia del anticuerpo. Las propiedades de un anticuerpo humanizado tambien se ven influidas por la eleccion del armazon humano. Ademas, los anticuerpos humanizados y quimericos se pueden modificar para que comprendan restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante para mejorar adicionalmente las propiedades del anticuerpo, tales como, por ejemplo, afinidad o funcion efectora.

En la divulgacion tambien se proporcionan anticuerpos totalmente humanos. La expresion "anticuerpo humano" incluye regiones variables y constantes (si estuvieran presentes) derivadas de secuencias de inmunoglobulina de germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoacidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de lmea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagenesis aleatoria fue espedfica del sitio in vitro o mediante mutacion somatica in vivo). Sin embargo, la expresion "anticuerpo humano" no incluye anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la lmea germinal humana o de otra especie de mairnfero, tal como un raton, se han injertado en las secuencias de armazon humano (es decir, anticuerpos humanizados). Los anticuerpos totalmente humanos o humanos se pueden derivar de ratones transgenicos que portan genes de anticuerpo humano (que portan los exones variables (V), de diversidad (D), de union (J), y constantes (C)) o de celulas humanas. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, despues de inmunizacion, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena (vease, por ejemplo, Jakobovits et al., PNAS; 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355: 258 (1992). La cepa de ratones transgenicos se puede modificar por ingeniena para quien contenga secuencias geneticas de genes de inmunoglobulina humana sin reordenar. Las secuencias humanas pueden codificar las cadenas tanto pesada como ligera de anticuerpos humanos y podnan funcionar de forma correcta en los ratones, que se someten a reordenamiento para proporcionar un amplio repertorio de anticuerpos similar al de los seres humanos. Los ratones transgenicos se pueden inmunizar con la protema diana (por ejemplo, CD200, fragmentos del mismo, o celulas que expresan CD200) para crear una matriz diversa de anticuerpos espedficos y ARN de codificacion. Los acidos nucleicos que codifican los componentes de la cadena de anticuerpo de tales anticuerpos se pueden clonar a continuacion a partir del animal en un vector de presentacion. Por lo general, se clonan algunas poblaciones separadas de acidos nucleicos que codifican secuencias de cadena pesada y ligera, y las poblaciones separadas se recombinan a continuacion con insercion en el vector, de modo que cualquier copiada del vector recibe una combinacion aleatoria de una cadena pesada y de una cadena ligera. El vector se disena para que exprese cadenas de anticuerpo de modo que se puedan ensamblar y presentar en la superficie externa de un paquete de presentacion que contiene el vector. Por ejemplo, las cadenas de anticuerpos se pueden expresar como protemas de fusion con una protema de revestimiento de fago de la superficie externa del fago. A partir de ese momento, los paquetes de presentacion se pueden identificar sistematicamente para presentacion de anticuerpos que se unen a una diana.

Ademas, algunos anticuerpos humanos se pueden derivar de bibliotecas de presentacion de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech 14: 309 (1996)). Se pueden crear bibliotecas de fagos sinteticas que usan combinaciones aleatorias de regiones en V de anticuerpo humano sintetico. Mediante la seleccion de anticuerpos totalmente humanos se pueden preparar antigenos en los que las regiones en V tienen una naturaleza muy similar a la humana. Veanse los documentos de patente de Estados Unidos n.° 6.794.132, 6.680.209, 4.634.666, y Ostberg et al., (1983), Hybridoma 2: 361-367.

Para la generacion de anticuerpos humanos, vease tambien Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188: 483-495 (1998). Algunos anticuerpos humanos se discuten adicionalmente y se describen en los documentos de patente de Estados Unidos n.° 5.939.598 y 6.673.986. Veanse tambien los documentos de patente de Estados Unidos n.° 6.114.598, 6.075.181, y 6.162.963, todos presentados el 5 de junio de 1995. Vease tambien el documento de patente de Estados Unidos n.° 6.150.584, presentado el 2 de octubre de 1996 y los documentos de patente de Estados Unidos n.° 6.713.610 y 6.657.103 asf como las solicitudes de patente de Estados Unidos n.°s 10/421.011 (US 2003-0229905 A1), 10/455.013 (US 2004-0010810 A1), 10/627.250 (US 2004 0093622 A1), 10/656.623 (US 2006-0040363 A1), 10/658.521 (US 2005-0054055 A1), 10/917.703 (US 2005-0076395 A1) y 10/978.297 (US 2005-0287630 A1). Vease tambien el documento PCT/US93/06926 presentado el 23 de julio de 1993, Patente Europea n.°, EP 0 463 151 B1, concesion publicada el 12 de junio de 1996, Solicitud de Patente Internacional n.°, documento WO 94/02602, publicado el 3 de febrero de 1994, Solicitud de Patente Internacional n.°, WO 96/34096, publicada el 31 de octubre de 1996, y documento WO 98/24893, publicado el 11 de junio de 1998.

En un enfoque alternativo, otros, incluyendo GenPharm International, Inc., han usado un enfoque de "minilocus". En el enfoque de minilocus, un locus de Ig exogeno se imita a traves de la inclusion de piezas (genes individuales) del locus de Ig. Por lo tanto, uno o mas genes de V^h, uno o mas genes de D^h, uno o mas genes de J^h, una region constante mu, y una segunda region constante (preferentemente una region constante gamma) se forman en una construccion para insercion en un animal. Este enfoque se describe en el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.545,807 to Surani et al., y los documentos de patente de Estados Unidos n.°s 5.545.806, 5.625.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016, 5.770.429, 5.789.650, y 5.814.318 cada uno de Lonberg y Kay, el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.591.669 de Krimpenfort y Berns, los documentos de patente de Estados Unidos n.°s 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 de Berns et al., y el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.643.763 de Choi y Dunn, y GenPharm International. Veanse tambien los documentos de patente de Estados Unidos n.°s 5.569.825, 5.877.397, 6.300.129, 5.874.299, 6.255.458, y 7.041.871. Veanse tambien la Patente Europea n.° 0546073 B1, las Solicitudes de Patente Internacional con n.°s WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884. Vease tambien Taylor et al., (1992 Nuc. Acids. Res., 20: 6287), Chen et al., (1993 Int. Immunol. 5: 647), Tuaillon et al., (1993 PNAS USA. 90: 3720-4), Choi et al., (1993 Nature Genetics 4: 117), Lonberg et al., (1994 Nature 368: 856-859), Taylor et al., (1994 International Immunology 6: 579 591), y Tuaillon et al., (1995 J Immunol. 154: 6453-65), Fishwild et al., (1996 Nature Biotechnology 14: 845), y Tuaillon et al., (2000 Eur J Immunol. 10: 2998-3005).

En el presente documento se describen anticuerpos anti-CD200 desinmunizados o fragmentos de union a antfgeno de los mismos. Los anticuerpos desinmunizados o fragmentos de union a antfgeno de los mismos se pueden modificar con el fin de hacer que el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo no sea inmunogenico, o sea menos inmunogenico, para una especie dada. La desinmunizacion se puede conseguir modificando el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo usando cualquiera de una diversidad de tecnicas conocidas por los expertos en la materia (vease por ejemplo, Publicaciones de PCT con n.°s WO 04/108158 y WO 00/34317). Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo se puede desinmunizados mediante la identificacion de epftopos de linfocitos T y/o epftopos de linfocitos B potenciales dentro de la secuencia de aminoacidos of del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo y retirando uno o mas de los epftopos de linfocitos T y/o los epftopos de linfocitos B potenciales del anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, por ejemplo, usando tecnicas recombinantes. El anticuerpo modificado o fragmento de union a antfgeno del mismo se puede producir a continuacion opcionalmente y someter a ensayo para identificar anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos que hayan retenido una o mas de las actividades biologicas deseadas, tales como, por ejemplo, afinidad de union, pero que tengan una reduccion de la inmunogenicidad. Algunos metodos para identificar epftopos de linfocitos T y/o epftopos de linfocitos B potenciales se pueden realizar usando tecnicas conocidas en la tecnica, tales como, por ejemplo, metodos informaticos (vease por ejemplo, Publicacion de PCT n.° WO 02/069232), tecnicas in vitro o in silico, y ensayos biologicos o metodos ffsicos (tales como, por ejemplo, determinacion de la union de peptidos o moleculas de MHC, determinacion de la union de complejos de peptido:MHC a los receptores de linfocitos T de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, someter a ensayo las partes de protema o oscuras de la misma usando animales transgenicos con las moleculas de MHC de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, o someter a ensayo con animales transgenicos reconstituidos con celulas del sistema inmunitario de las especies para recibir el anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo, etc.). En diversas realizaciones, los anticuerpos anti-CD200 deshumanizados descritos en el presente documento incluyen fragmentos de union a antfgeno deshumanizados, Fab, Fv scFv, Fab' y F(ab')², anticuerpos monoclonales, anticuerpos de murino, anticuerpos modificados por ingeniena (tales como, por ejemplo, anticuerpos quimericos, de una sola cadena, injertados con CDR, humanizados, totalmente humanos, y anticuerpos seleccionados de manera artificial), anticuerpos sinteticos y anticuerpos semisinteticos.

Se puede producir ADN recombinante que comprende una insercion que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos dirigidos a CD200 o una lrnea de celulas positivas para CD200. El termino ADN incluye ADN de una sola cadena de codificacion, ADN de doble cadena que consiste en dichos ADN de codificacion y de ADN complementarios al mismo, o estos ADN complementarios (una sola cadena) por s^ mismos.

Ademas, el ADN que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos dirigidos a CD200 o a la lmea de celulas positivas para CD200 puede ser ADN sintetizado por via enzimatica o por via qmmica que tiene la secuencia de ADN autentica que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o el dominio variable de cadena ligera, o un mutante del mismo. Un mutante del ADN autentico es un ADN que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos mencionados anteriormente en los que uno o mas aminoacidos se suprimen, insertan o intercambian con uno u otros aminoacidos mas. Preferentemente dicha modificacion o modificaciones estan fuera de las CDR del dominio variable de cadena pesada y/o del dominio variable de cadena ligera del anticuerpo en aplicaciones de optimizacion de la humanizacion y de la expresion. La expresion ADN mutante tambien incluye mutantes silenciosos en los que uno o mas nucleotidos estan reemplazados con otros nucleotidos con los nuevos codones que codifican el mismo aminoacido(s). La expresion secuencia mutante tambien incluye una secuencia degenerada. Algunas secuencias degeneradas estan degeneradas dentro del significado del codigo genetico en el que un numero ilimitado de nucleotidos se reemplazan con otros nucleotidos sin dar como resultado un cambio de la secuencia de aminoacidos codificada originalmente. Tales secuencias degeneradas pueden ser utiles debido a sus diferentes sitios de restriccion y/o frecuencia de codones en particular que son preferentes para el hospedador espedfico, en particular E. coli, para obtener una expresion optima del dominio variable de murino de cadena pesada y/o un dominio variable de murino de cadena ligera.

El termino mutante pretende incluir un mutante de ADN obtenido mediante mutagenesis in vitro del ADN autentico de acuerdo con metodos conocidos en la tecnica.

Para el ensamblaje de moleculas de inmunoglobulina tetramericas completas y la expresion de anticuerpos quimericos, las inserciones de ADN recombinante que codifican dominios variables de cadena pesada y ligera se fusionan con los correspondientes ADN que codifican dominios constantes de cadena pesada y ligera, a continuacion se transfieren en celulas hospedadoras apropiadas, por ejemplo despues de incorporacion en vectores tubridos.

Los ADN recombinantes incluyen una insercion que codifica un dominio variable de murino de cadena pesada de un anticuerpo dirigido a CD200 o una lmea de celulas positivas para CD200 fusionada con una IgG de dominio constante humano, por ejemplo y1, y2, y3 o y4; en realizaciones en particular se puede usar y1 o y4. Tambien se proporcionan los ADN recombinantes que incluyen una insercion que codifica un dominio variable de murino de cadena ligera de un anticuerpo dirigido a la lmea celular desvelada en el presente documento fusionado con un dominio constante humano k o A, preferentemente k.

En el presente documento se describen ADN que codifican un polipeptido recombinante en el que el dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera estan unidos mediante un grupo espaciador, que comprende opcionalmente una secuencia senal que facilita el procesamiento del anticuerpo en la celula hospedadora y/o una secuencia de ADN que codifica un peptido que facilita la purificacion del anticuerpo y/o un sitio de escision y/o un espaciador peptfdico y/o un agente. El ADN que codifica una gente pretende ser un ADN que codifica el agente util en aplicaciones de diagnostico o terapeuticas. Por lo tanto, algunas moleculas de agente que son toxinas o enzimas, especialmente enzimas capaces de catalizar la activacion de profarmacos, estan particularmente indicadas. El ADN que codifica un agente de este tipo tiene la secuencia de una enzima o toxina que codifica ADN de origen natural, o un mutante de las mismas, y se puede preparar con metodos bien conocidos en la tecnica.

Por consiguiente, anticuerpos monoclonales o fragmentos de union a antfgeno de la divulgacion pueden ser anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno desnudos que no estan conjugados con otros agentes, por ejemplo, un agente terapeutico o etiqueta detectable. Como alternativa, el anticuerpo monoclonal o fragmento de union antfgeno se puede conjugar con un agente tal como, por ejemplo, un agente citotoxicos, una molecula pequena, una hormona, una enzima, un factor de crecimiento, una citoquina, una ribozima, un peptidomimetico, un agente qmmico, un profarmaco, una molecula de acido nucleico que incluye secuencias de codificacion (tales como construcciones antisentido, ARNi, construcciones de direccion genetica, etc.), o una etiqueta detectable (por ejemplo, un agente de contraste de RMN o rayos X, molecula fluorescente, etc). Un polipeptido o fragmento de union a antfgeno anti-CD200 (por ejemplo, Fab, Fv, scFv de una sola cadena, Fab' y F(ab')²) se puede unir a una molecula que aumenta la semivida del polipeptido o fragmento de union antfgeno mencionado. Las moleculas que se pueden unir a dicho polipeptido o fragmento de union antfgeno anti-CD200 incluyen, pero no se limitan a, protemas de suero incluyendo albumina, polipeptidos, otras protemas u otros dominios de protema, y PEG.

Para la expresion de genes de cadena pesada y cadena ligera clonados en celulas de mairnfero estan disponibles varios sistemas de vector posibles. Una clase de vectores depende de la integracion de las secuencias geneticas deseadas en el genoma de la celula hospedadora. Algunas celulas que han integrado el ADN de forma estable se pueden seleccionar mediante introduccion de forma simultanea de genes de resistencia a farmacos tales como gpt de E. coli (Mulligan, R. C. y Berg, P., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 2072 (1981)) o Tn5 neo (Southern, P. J. y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1: 327 (1982)). El gen marcador seleccionable puede estar unido a las secuencias geneticas de ADN a expresar, o se puede introducir en la misma celula mediante cotransfeccion (Wigler, M. et al., Cell, 16: 77 (1979)). Una segunda clase de vectores usa elementos de ADN que confieren capacidades de replicacion de forma autonoma para un plasmido extracromosomico. Estos vectores se pueden derivar de virus de animal, tales como virus del papiloma bovino (Sarver, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79: 7147 (1982)), virus del polioma (Deans, R. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 1292 (1984)), o virus SV40 (Lusky, M. y Botchan, M., Nature, 293: 79 (1981)).

Dado que un ADNc de inmunoglobulina esta formado solamente por secuencias que representan el ARNm mas duro que codifica una protema de anticuerpo, algunos elementos de expresion genetica adicionales que regulan la transcripcion del gen y el procesamiento del ARN se requieren para la smtesis de ARNm de inmunoglobulina. Estos elementos pueden incluir senales de corte y empalme, promotores de transcripcion, incluyendo potenciadores de promotores inducibles, y senales de terminacion. Algunos vectores de expresion de ADNc que incorporan elementos de este tipo incluyen los que se describen en Okayama, H. y Berg, P., Mol. Cell Biol., 3: 280 (1983); Cepko, C. L. et al., Cell, 37: 1053 (1984); y Kaufman, R. J., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82: 689 (1985).

Un anticuerpo anti-CD200 puede ser un anticuerpo de bloqueo o de no bloqueo. Como se usa en el presente documento, un anticuerpo de bloqueo es uno que bloquea la interaccion entre CD200 y CD200R. Un anticuerpo de no bloqueo se une y/o interactua con CD200 pero no bloquea su interaccion con CD200R. Un anticuerpo anti-CD200 es cualquiera de un anticuerpo murino, quimerico, humanizado como humano o desinmunizados de bloqueo o de no bloqueo.

II. ANTAGONISTAS DE CD200 CON FUNCIONES EFECTORAS ALTERADAS

Los antagonistas de CD200 se pueden alterar para provocar un aumento o disminucion de los efectos con respecto al antagonista original o precursor. Por ejemplo, un antagonista que se une a CD200 puede provocar funciones secundarias despues de union a CD200 y, en algunos casos, inhibir la interaccion de CD200:CD200R. Por ejemplo, un antagonista puede contener sitios de union adicionales para otros ligandos, incluyendo receptores o protemas extracelulares. La union a estos otros ligandos puede desencadenar otros sucesos, tales como la atraccion o reclutamiento de otras celulas y la activacion de diversos sucesos que incluyen muerte celular. En el presente documento se describen antagonistas de CD200 que provocan una alteracion de las funciones secundarias (o funciones efectoras como se denominan en lo sucesivo). El antagonista de CD200 con funcion(s) secundaria o efectora alteradas puede presentar aumento, disminucion, o ninguna funcion(s) secundaria o efectora, y ademas pueden bloquear o no la interaccion de CD200:CD200R. El antagonista de CD200 con funcion(s) secundaria o efectora alterada puede ser un anticuerpo anti-CD200.

A) FUNCIONES EFECTORAS

La interaccion de anticuerpos y complejos de anticuerpo-antfgeno con celulas del sistema inmunitario afecta a una diversidad de respuestas, denominadas en el presente documento funciones efectoras. Algunas funciones efectoras a modo de ejemplo incluyen union a receptor de Fc, fagocitosis, regulacion negativa de receptores de superficie celular (por ejemplo receptor de linfocitos B; BCR), etc. Otras funciones efectoras incluyen ADCC, mediante la que los anticuerpos se unen a receptores de Fc en linfocitos citoltticos naturales (NK) o macrofagos que conducen a la muerte celular, y CDC, que es muerte celular inducida a traves de activacion de la cascada del complemento (revisado en Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997); Ward y Ghetie, Therapeutic Immunol. 2: 77-94 (1995); y Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). Las funciones efectoras de este tipo por lo general requieren que la region Fc se combine con un dominio de union (por ejemplo un dominio variable de anticuerpo) y se pueden evaluar usando diversos ensayos como se desvela en el presente documento, por ejemplo.

Varias funciones efectoras de anticuerpo, incluyendo ADCC, estan mediadas por receptores de Fc (FcR), que se unen a la region Fc de un anticuerpo. En la ADCC, los linfocitos NK o macrofagos se unen a la region Fc del complejo de anticuerpo y estimulan la lisis de la celula diana. La reticulacion de los FcR en linfocitos NK desencadena citotoxicidad mediada por perforina/granzima, entraste en macrofagos, esta reticulacion estimula la liberacion de mediadores tales como oxido mtrico (NO), TNF-a, y especies reactivas del oxfgeno. Para celulas diana positivas para CD200, un anticuerpo anti-CD200 se une a la celula diana y la region Fc dirige la funcion efectora a la celula diana. La afinidad de un anticuerpo para un FcR en particular, y por lo tanto la actividad efectora mediada por el anticuerpo, se puede modular mediante la alteracion de la secuencia de aminoacidos y/o modificaciones despues de la traduccion de la region de Fc y/o constante del anticuerpo.

Los FcR se definen por su especificidad hacia isotipos de inmunoglobulina; los receptores de Fc para anticuerpos de IgG se denominan FcyR, FcsR para lgE, FcaR para IgA y asf sucesivamente. Se han identificado tres subclases de FcyR: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16). Dado que cada subclase de FcyR esta codificada por dos o tres genes, y un corte y empalme de ARN alternativo conduce a multiples transcripciones, existe una amplia diversidad de isoformas de FcyR. Los tres genes que codifican la subclase FcyRI (FcyRIA, FcyRIB y FcyRIC) estan agrupados en la region 1q21.1 de del grupo de tratamiento del cromosoma 1; los genes que codifican las isoformas de FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB y FcyRIIC) y los dos genes que codifican FcyRIII (FcyRIIIA y FcyRIIIB) estan agrupados en la region 1q22. Estos subtipos de FcR diferentes se expresan en diferentes tipos de celulas (revisado en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)). Por ejemplo, en seres humanos, FcyRIIIB se encuentra solamente en neutrofilos, mientras que FcyRIIIA se encuentra en macrofagos, monocitos, linfocitos citolfticos naturales (NK), y una su poblacion de linfocitos T. En particular, FcyRIIIA es el unico FcR presente en linfocitos NK, uno de los tipos de celulas implicadas en ADCC.

FcyRI, FcyRII y FcyRIII son receptores de la super familia de inmunoglobulina (IgSF); FcyRI tiene tres dominios de IgSF en su dominio extracelular, mientras que FcyRII y FcyRIII tienen solamente dos dominios de IgSF en sus dominios extracelulares. Otro tipo de receptor de Fc es el receptor de Fc neonatal (FcRn). El FcRn es estructuralmente similar al complejo de histocompatibilidad principal (MHC) y consiste en una cadena a unidad de forma no covalente a la microglobulina p2.

Previamente se han formado mapas del sitio de union en anticuerpos humanos y murinos para FcyR para la denominada "region bisagra inferior" que consiste en los restos 233-239 (numeracion con el mdice EU tal como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Woof et al., Molec. Immunol. 23: 319-330 (1986); Duncan et al., Nature 332: 563 (1988); Canfield y Morrison, J. Exp. Med. 173: 1483-1491 (1991); Chappel et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 9036-9040 (1991). De los restos 233-239, se han mencionado P238 y S239 como posiblemente implicados en la union.

Otras areas mencionadas anteriormente implicadas posiblemente en la union a FcyR son: G316-K338 (IgG humana) para FcyRI humano (solamente mediante comparacion de secuencias; no se evaluaron mutantes de sustitucion) (Woof et al., Molec Immunol. 23: 319-330 (1986)); K274-R301 (IgG1 humana) para FcyRIII humano (basado en peptidos) (Sarmay et al., Molec. Immunol. 21: 43-51 (1984)); Y407-R416 (IgG humana) para FcyRIII humano (basado en peptidos) (Gergely et al., Biochem. Soc. Trans. 12: 739-743 (1984)); asf como N297 y E318 (IgG2b murina) para FcyRII de murino (Lund et al., Molec. Immunol., 29: 53-59 (1992)).

Las celulas efectoras humanas son leucocitos que expresan uno o mas FcR y realizan funciones efectoras. En determinadas realizaciones, las celulas se expresan al menos FcyRIII y realizan funcion efectora de ADCC. Algunos ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), linfocitos citolfticos naturales (NK), monocitos, linfocitos T citotoxicos y neutrofilos. Algunas celulas efectoras se pueden aislar a partir de una fuente nativa de la misma, por ejemplo de sangre o de las PBMC.

En CDC, el complejo de anticuerpo-antfgeno se une a complemento, dando como resultado la activacion de la cascada de complemento y generacion del complejo de ataque a la membrana. La activacion de la ruta de complemento clasica comienza con la union del primer componente del sistema del complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que se unen con su antfgeno relacionado; por lo tanto, la activacion de la cascada de complemento esta regulada en parte por la afinidad de union de la inmunoglobulina a la protema C1q. C1q y dos serina proteasas, C1r y C1s, forman el complejo C1, el primer componente de la ruta de CDC. C1q es una molecula hexavalente con un peso molecular de aproximadamente 460.000 y una estructura en la que seis "tallos" colagenosos estan conectados a seis regiones de cabeza globular. Burton y Woof, Advances in Immunol. 51: 1-84 (1992). Para activar la cascada de complemento, es necesario que C1q se una a al menos dos moleculas de IgG1, IgG2, o IgG3, pero solamente a una molecula de IgM, unida a la diana antigenica (Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995) p. 80). Para evaluar la activacion del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Se ha propuesto que diversos restos de la molecula de IgG estan implicados en la union a C1q incluyendo los restos Glu318, Lys320 y Lys322 en el dominio CH2, el resto 331 del aminoacido situado a su vez en proximidad a la misma hebra beta, los restos Lys235 y Gly237 situados en la region bisagra inferior, y los restos 231 a 238 situados en la region N-terminal del dominio CH2 (vease por ejemplo, Xu et al., J. Immunol. 150: 152A (Resumen) (1993), WO94/29351; Tao et al, J. Exp. Med., 178: 661-667 (1993); Brekke et al., Eur. J. Immunol, 24: 2542-47 (1994); Burton et al; Nature, 288: 338-344 (1980); Duncan y Winter, Nature 332: 738-40 (1988); el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.648.260, y el documento de patente de Estados Unidos n.° 5.624.821). Se ha propuesto adicionalmente que la capacidad de IgG para unirse a C1q y activar la cascada de complemento tambien depende de la presencia, ausencia o modificacion del resto de carbohidrato colocado entre los dos dominios CH2 (que normalmente esta anclado en Asn297) (Ward y Ghetie, Therapeutic Immunology 2: 77-94 (1995). Uno o mas de estos restos se pueden modificar, sustituir o retirar o uno o mas restos de aminoacidos se pueden insertar para aumentar o disminuir la actividad de CDC de los anticuerpos anti-CD200 proporcionados en el presente documento.

B) ANTICUERPOS ANTI-CD200 CON FUNCION(S) EFECTORA MODULADA

Algunas funciones efectoras que implican la region constante del anticuerpo espedfico de diana se pueden modular mediante la alteracion de propiedades de la region constante o Fc. Algunas funciones efectoras alteradas incluyen, por ejemplo, una modulacion en una o mas de las siguientes actividades: ADCC, CDC, apoptosis, union a uno o mas receptores de Fc, y respuestas proinflamatorias. Modulacion se refiere a un aumento, disminucion o eliminacion de una actividad en comparacion con la actividad de un segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo con funcion efectora. El segundo anticuerpo puede ser un anticuerpo modificado por ingeniena o un anticuerpo de origen natural y se puede denominar anticuerpo no variante, nativo, o precursor. La modulacion puede incluir situaciones en las que una actividad se anula o esta completamente ausente. Ademas, en algunos casos, un anticuerpo no variante puede presentar una actividad de la funcion efectora similar o equivalente a la actividad de los anticuerpos chC2aB7-hG1 o los anticuerpos hB7V3V2-hG1 desvelados en el presente documento. De forma analoga, una region constante o de Fc funcional o no variante puede poseer una funcion efectora de un dominio constante o de Fc nativo; en algunos casos, la region constante o Fc de chC2aB7-hG1 o hB7V3V2-hG1 puede representar los dominios no variantes. Para los presentes fines, chC2aB7-hG1 y hB7V3V2-hG1 son los patrones frente a los que se comparan las actividades de otros anticuerpos, con hB7V3V2-hGl siendo el patron preferente.

Un variante de polipeptido con afinidad de union a FcR alterada y/o actividad de ADCC y/o actividad de CDC alterada es un polipeptido que presenta un aumento o disminucion de la actividad de la union a FcR y/o actividad de ADCC y/o actividad de CDC en comparacion con el polipeptido nativo o precursor o con un polipeptido que comprende una region de Fc o constante de secuencia nativa. Un variante de polipeptido que presenta un aumento de la union a un FcR se une a al menos un FcR con una afinidad mas elevada que el polipeptido precursor. Un variante de polipeptido que presenta disminucion de la union a un FcR se une a al menos un FcR con una afinidad menor que un polipeptido precursor. Las variantes de este tipo que presentan disminucion de la union a un FcR pueden poseer una union escasa o poco apreciable a un FcR, por ejemplo, una union de un 0-20 % al FcR en comparacion con el nivel de union de una region constante o de Fc de inmunoglobulina de secuencia nativa con respecto al FcR. De forma analoga una variante de polipeptido representa alteracion de la actividad de ADCC y/o CDC puede presentar aumento o disminucion de la actividad de ADCc y/o CDC en comparacion con el polipeptido nativo o precursor. Una variante de polipeptido que presentara una reduccion de ADCC y/o CDC puede presentar reduccion o no de la actividad de ADCC y/o CDC como se muestra en el presente documento por ejemplo. El polipeptido precursor o nativo y su variante pueden ser anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno. El anticuerpo o el fragmento de union al antfgeno mencionado, se pueden unir a CD200 y pueden bloquear o no la interaccion de CD200:CD200R.

Una region de Fc o constante de secuencia nativa comprende una secuencia de aminoacidos identica a la secuencia de aminoacidos de una region de cadena de Fc o constante encontrada en la naturaleza. Una region de Fc o constante variante o alterada comprende una secuencia de aminoacidos que se diferencia de la de una region de cadena pesada de secuencia nativa en virtud de al menos una modificacion, insercion o delecion de aminoacido, por ejemplo. La region constante variante Walter puede tener al menos una sustitucion, insercion y/o delecion de aminoacidos en comparacion con una region constante de secuencia nativa o en comparacion con la region constante de un polipeptido precursor, por ejemplo de aproximadamente una a aproximadamente cien sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoacidos en una region constante de secuencia nativa o en la region constante del polipeptido precursor.

En el presente documento se describe una region constante variante o alterada que posee una homologfa o identidad (similitud) de al menos aproximadamente un 70 % con una region constante de secuencia nativa y/o con una region constante de un polipeptido precursor, y en algunos casos, una homologfa identidad con la misma de al menos aproximadamente un 75 % y en otros casos una homologfa identidad con la misma de al menos aproximadamente un 80 %, y en otros casos una homologfa identidad con la misma de al menos aproximadamente un 85 %, 90 % o un 95 %. La region constante variante o alterada tambien puede contener una o mas deleciones o inserciones de aminoacidos. Ademas, la region constante variante puede contener una o mas sustituciones, deleciones o inserciones de aminoacidos que da como resultado amino una alteracion de las modificaciones despues de la traduccion, incluyendo, por ejemplo, un patron de glicosilacion alterado.

Algunos anticuerpos anti-CD200 variantes como se desvela en el presente documento se pueden codificar con una secuencia de acidos nucleicos que codifica un polipeptido con una o mas inserciones, deleciones o sustituciones de aminoacidos con respecto to the secuencia del polipeptido nativo o precursor. Ademas, algunos anticuerpos variantes se pueden codificar con secuencias de acidos nucleicos que se hibridan en condiciones rigurosas con una secuencia de acidos nucleicos que codifica un anticuerpo anti-CD200 variante. Se puede usar una diversidad de condiciones para detectar la hibridacion, y la rigurosidad se determina principalmente mediante la etapa de lavado en el ensayo de hibridacion. Por lo general las temperaturas elevadas y las concentraciones de sal bajas proporcionan alta rigurosidad, mientras que las temperaturas bajas y las concentraciones de sal elevadas proporcionan una rigurosidad baja. La hibridacion de baja rigurosidad se consigue lavando, por ejemplo, en SSC a aproximadamente 2,0 x a 50 °C, y la alta rigurosidad se consigue con aproximadamente SSC 0,2 x a 50 °C.

Algunos anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos con funciones efectoras alteradas o sin funciones efectoras se pueden generar mediante ingeniena o produciendo anticuerpos con regiones de Fc, o de cadena pesada constantes variantes; se puede usar tecnologfa del ADN recombinante y/o condiciones de cultivo y expresion celular para producir anticuerpos con funcion y/o actividad alteradas. Por ejemplo, la tecnologfa del ADN recombinante se pueden usar para modificar por ingeniena una o mas sustituciones, deleciones o inserciones de aminoacidos en regiones (tales como, por ejemplo, regiones de Fc o constantes) que influyen en la funcion del anticuerpo incluyendo las funciones efectoras. Como alternativa, se pueden conseguir cambios en modificaciones despues de la traduccion, tales como, por ejemplo patrones de glicosilacion, manipulando las condiciones de cultivo y expresion celular en las que se produce el anticuerpo.

En el presente documento se describen anticuerpos anti-CD200 con funciones efectoras alteradas que comprenden una o mas sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoacidos. Un anticuerpo anti-CD200 variante de este tipo puede presentar una reduccion de la funcion efectora o ninguna. En realizaciones en particular, un anticuerpo valiente comprende una construccion de G2/G4 en lugar del dominio G1 (veanse las Figuras 10, 11, 12, 13, y 15, por ejemplo).

Ademas de intercambiar el dominio G1 con una construccion de G2/G4 como se presenta en el presente documento, se pueden producir anticuerpos anti-CD200 con reduccion de la funcion efectora mediante introduccion de otros tipos de cambios en la secuencia de aminoacidos de ciertas regiones del anticuerpo. Algunos cambios de este tipo en la secuencia de aminoacidos incluyen, pero no se limitan a, la mutacion Ala-Ala descrita en Bluestone et al., (vease el documento WO 94/28027 y WO 98/47531; vease tambien Xu et al., 2000 Cell Immunol 200; 16-26). Por lo tanto, se describen anticuerpos anti-CD200 con mutaciones dentro de la region constante que incluyen la mutacion Ala-Ala que se puede usar para reducir o anular la funcion efectora. La region constante de un anticuerpo anti-CD200 puede comprender una mutacion para una alanina en la posicion 234 o una mutacion para una alanina en la posicion 235. Ademas, la region constante puede contener una doble mutacion: una mutacion para una alanina en la posicion 234 y una segunda mutacion para una alanina en la posicion 235. El anticuerpo anti-CD200 puede comprender un armazon de IgG4, en el que la mutacion Ala-Ala podna describir una mutacion(s) de fenilalanina a alanina en la posicion 234 y/o una mutacion de leucina a alanina en la posicion 235. El anticuerpo anti-CD200 puede comprender un armazon de IgG1, en el que la mutacion Ala-Ala podna describir una mutacion(s) de leucina a alanina en la posicion 234 y/o una mutacion de leucina a alanina en la posicion 235. Un anticuerpo anti-CD200 puede, como alternativa o adicionalmente, portar otras mutaciones, que incluyen la mutacion puntual K322A en el dominio CH2 (Hezareh et al., 2001 J Virol. 75: 12161-8). Un anticuerpo con dicha mutacion(s) en la region constante puede ser ademas un anticuerpo de bloqueo o de no bloqueo.

Algunos cambios dentro de la region bisagra tambien influyen en las funciones efectoras. Por ejemplo, la delecion de la region bisagra puede reducir la afinidad hacia receptores de Fc y puede reducir la activacion del complemento (Klein et al., 1981 PNAS USA 78: 524-528). Por lo tanto, la presente divulgacion tambien se refiere a anticuerpos con alteraciones en la region bisagra.

Los anticuerpos anti-CD200 se pueden modificar para aumentar o inhibir la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC). La actividad de CDC modulada se puede conseguir mediante introduccion de una o mas sustituciones, inserciones o deleciones de aminoacidos en una region de Fc del anticuerpo (vease, por ejemplo, el documento de patente de Estados Unidos n.° 6.194.551). Como alternativa o adicionalmente, se puede introducir resto(s) de cistema en la region de Fc, permitiendo de ese modo la formacion de enlaces disulfuro intercadena en esta region. El anticuerpo homodimerico generado de este modo puede a aumentar o reducir la capacidad de internalizacion y/o aumentar o disminuir la eliminacion celular mediada por complemento. Vease Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992), documento WO99/51642, Duncan y Winter Nature 322: 738-40 (1988); documento de patente de Estados Unidos n.° 5.648.260; documento de patente de Estados Unidos n.° 5.624.821; y el documento WO94/29351. Tambien se pueden preparar anticuerpos homodimericos con aumento de la actividad antitumoral usando agentes de reticulacion heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cancer Research 53: 2560-2565 (1993). Como alternativa, un anticuerpo que tiene regiones dobles de Fc se puede modificar por ingeniena y por lo tanto puede presentar aumento de lisis de complemento y capacidades de ADCC. Vease Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).

Otro medio potencial para modular la funcion efectora de anticuerpos incluye cambios en la glicosilacion. Este tema lo ha revisado recientemente Raju quien resume la importancia propuesta de los oligosacaridos encontrados en las IgG humanas con su grado de funcion efectora (Raju, TS. BioProcess International April 2003. 44-53). De acuerdo con Wright y Morrison, la microheterogeneidad de algunos oligosacaridos de IgG humana puede influir en las funciones biologicas tales como CDC y ADCC, uniendose a diversos receptores de Fc, y uniendose a la protema C1q (Wright A. y Morrison SL. TIBTECH 1997, 15 26-32). Esta bien documentado que algunos patrones de glicosilacion de anticuerpos pueden diferenciarse dependiendo de las condiciones de produccion de celulas y las condiciones de cultivo celular (Raju, TS. BioProcess International April 2003. 44-53). Tales diferencias pueden conducir a cambios tanto en la funcion efectora como en la farmacocinetica (Israel et al., Immunology. 1996; 89 (4): 573-578; Newkirk et al., P. Clin. Exp. 1996; 106 (2): 259-64). Las diferencias en la funcion efectora se pueden relacionar con la capacidad de las IgG para unirse a los receptores de Fcy (FcyR) en las celulas efectoras. Shields, et al., han mostrado que la IgG, con variantes en la secuencia de aminoacidos que presentan un aumento de la union a FcyR, pueden presentar hasta un 100 % de aumento de ADCC usando celulas efectoras humanas (Shields et al., J Biol Chem. 2001 276 (9): 6591-604). Aunque estas variantes incluyen algunos cambios en los aminoacidos no encontrados en la superficie de contacto de union, tanto la naturaleza del componente de azucar asf como su patron estructural tambien pueden contribuir a las diferencias. Ademas, la presencia o ausencia de fucosa en el componente oligosacarido de una IgG puede aumentar la union y la ADCC (Shields et al., J Biol Chem. 2002; 277 (30): 26733-40). Una IgG que carece de un carbohidrato fucosilado unido a Asn297 presentaba una union de receptor normal al receptor Fcy. Por el contrario, la union al receptor FcyRIIA aumento en un 50 % que iba acompanada por un aumento de ADCC, especialmente a concentraciones de anticuerpos mas bajas.

El trabajo de Shinkawa, et al., demostro que un anticuerpo para el receptor de IL-5 humano producido en un hibridoma de rata mostraba una ADCC mas elevada en mas de un 50 % cuando se comparaba con el anticuerpo producido en celulas de ovario de hamster chino (CHO) (Shinkawa et al., J Biol Chem. 2003278 (5): 3466-73). La composicion del monosacarido y la formacion de perfiles de oligosacaridos mostraban que la IgG producida por hibridoma de rata presenta un contenido menor de fucosa que la protema producida por CHO. Los autores llegaron a la conclusion de que la carencia de fucosilacion de una IgG1 tiene un papel fundamental en el aumento de la actividad de ADCC.

Umana, et al., siguieron un enfoque diferente que cambiaba el patron de glicosilacion de chCE7, un anticuerpo quimerico anti-neuroblastoma de IgG1 (Umana et al., Nat Biotechnol. 1999 Feb; 17 (2): 176-80). Usando tetraciclina, estos regularon la actividad de una enzima glicosiltransferasa (GnnII) que biseca oligosacaridos que se han visto implicados en la actividad de ADCC. La actividad de ADCC del anticuerpo precursor era apenas superior a la del nivel de fondo. La medida de la actividad de ADCC del chCE7 producido a diferentes niveles de tetraciclina presentaba un intervalo optimo de expresion de GnTIH para la actividad maxima de ADCC in vitro de chCE7. Esta actividad se correlaciono con el nivel de oligosacarido complejo bisecado, asociado con la region constante constant. Las variantes recien optimizadas presentaban una actividad de ADCC sustancial. De forma analoga, Wright y Morrison produjeron anticuerpos en una lmea de celulas CHO deficientes en glicosilacion (1994 J Exp Med 180: 1087-1096) y mostraron que los anticuerpos producidos en esta lmea celular eran incapaces de citolisis mediada por complemento. Por lo tanto, dado que las alteraciones conocidas que influyen en la funcion efectora incluyen modificaciones en el patron de glicosilacion o un cambio en el numero de restos glicosilados, la presente divulgacion se refiere a un anticuerpo CD200 en el que la glicosilacion esta alterada para aumentar o disminuir la funcion(s) efectora incluyendo ADCC y CDC. La glicosilacion alterada incluye una disminucion o aumento en el numero de restos glicosilados asf como un cambio en el patron o ubicacion de restos glicosilados.

Ademas, existen otros enfoques para la alteracion de la funcion efectora de anticuerpos. Por ejemplo, las celulas que producen anticuerpos pueden ser hipermutagenicas, generando de ese modo anticuerpos con restos de nucleotidos y polipeptidos alterados de forma aleatoria a traves de toda una molecula de anticuerpo (vease el documento WO 2005/011735). Algunas celulas hospedadoras hipermutagenicas incluyen celulas deficientes en reparacion de emparejamiento de ADN. Los anticuerpos producidos de esta manera pueden ser menos antigenicos y/o pueden tener propiedades farmacocineticas beneficiosas. Ademas, los anticuerpos de este tipo se pueden seleccionar para propiedades tales como aumento o disminucion de la funcion(s) efectora.

Se entiende adicionalmente que la funcion efectora puede variar de acuerdo con la afinidad de union del anticuerpo. Por ejemplo, algunos anticuerpos con afinidad elevada pueden ser mas eficaces en la activacion del sistema del complemento en comparacion con anticuerpos con una afinidad relativamente menor (Marzocchi-Machado et al., 1999 Immunol Invest 28: 89-101). Por consiguiente, un anticuerpo se puede alterar de modo que la afinidad de union hacia su antfgeno se reduce (por ejemplo, cambiando las regiones variables del anticuerpo con metodos tales como sustitucion, adicion o delecion de uno o mas restos de aminoacidos). Un anticuerpo anti-CD200 con afinidad de union reducida puede presentar funciones efectoras reducidas, incluyendo, por ejemplo, ADCC y/o CDC reducidas.

III. METODOS PARA REDUCIR O ELIMINAR CELULAS QUE SOBREEXPRESAN CD200

En el presente documento se describen metodos para reducir celulas que expresan CD200 en sujeto mediante la administracion a sujeto de una terapia que comprende un antagonista de CD200. Como se ha mencionado anteriormente, CD200 se expresa en ciertas celulas inmunitarias; y como se demuestra en la presente divulgacion, CD200 tambien se expresa en ciertas celulas malignas. La expresion diversa de CD200 proporciona una via mediante la que dirigir las celulas cancerosas (es decir, celulas positivas para CD200) para terapia. De forma analoga, algunas celulas inmunitarias positivas para CD200 se pueden dirigir para la reduccion en metodos para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios.

CD200, a traves de su interaccion con CD200R en celulas mieloides, modula la inmunosupresion mediante su ministro de una senal de inhibicion para actividad y/o migracion mieloide. Los ratones con supresion genetica de CD200, por ejemplo, demuestran una respuesta inmunitaria mas activa despues de estfmulos inmunogenicos (Hoek et al., Science 2000), y las celulas que expresan CD200 provocan inmunosupresion mediante la induccion de un desplazamiento en el perfil de citoquina de celulas inmunitarias estimuladas (veanse los datos que se muestran en el presente documento). De forma espedfica, las celulas positivas para CD200 son capaces de inducir un desplazamiento de produccion de citoquina Th1 a Th2 en ensayos de poblacion de celulas mixtas. Aunque las celulas positivas para CD200 son capaces de suprimir la respuesta inmunitaria, las celulas cancerosas positivas para CD200, en consecuencia, pueden ser capaces de escapar del ataque de celulas inmunitarias. Sin embargo, la expresion de CD200 en la membrana de celulas cancerosas asf como celulas inmunitarias se puede aprovechar para dirigir estas celulas en terapia. Por ejemplo, un antagonista anti-CD200 se puede dirigir de forma espedfica a celulas positivas para CD200 e interrumpir la interaccion de CD200:CD200R, inhibiendo de ese modo la supresion inmunitaria, asf como algunas celulas diana positivas para CD200 con respecto a celulas efectoras inmunitarias. Las realizaciones de la presente divulgacion, por lo tanto, se refieren a metodos para dirigir celulas positivas para CD200 a la reduccion que comprende un antagonista que se une a CD200 y, en algunos casos, interrumpe la interaccion de CD200:CD200R.

En el presente documento se describen metodos para aumentar la respuesta inmunitaria. Algunos metodos de este tipo incluyen la administracion de una terapia que comprende un antagonista de CD200, y en realizaciones en particular con el antagonista es un anticuerpo anti-CD200 o fragmento de union a antfgeno como expone en el presente documento. Aunque no se desea quedar ligado por ningun mecanismo(s) en particular, un anticuerpo anti-CD200 de bloqueo, fragmento de union a antfgeno, polipeptido u otro antagonista puede eliminar las celulas positivas para CD200 mediante el bloqueo de la supresion inmunitaria, permitiendo de este modo que las celulas inmunitarias ataquen y eliminen las celulas positivas para CD200. Como alternativa o en combinacion con el mecanismo mencionado anteriormente, un anticuerpo anti-CD200 (ya sea de bloqueo o de no bloqueo) u otro antagonista puede reclutar celulas efectoras u otros ligandos (por ejemplo, componente de complemento) a la celula positiva para CD200 a la que se une el anticuerpo o antagonista y dirige en la celula positiva para CD200 para muerte celular mediada por efector.

En el presente documento se describen metodos para modular ADCC y/o CDC de celulas diana positivas para CD200 mediante la administracion de un anticuerpo anti-CD200 murino, quimerico, humanizado o humano a un sujeto con necesidad del mismo. La divulgacion se refiere a anticuerpos anti-CD200 variantes que provocan un aumento de ADCC y/o CDC y a anticuerpos anti-CD200 variantes que presentan una reduccion o no de la actividad de ADCC y/o CDC.

El anticuerpo anti-CD200 variante comprende una region variante o Fc alterada o constante, en el que la region Fc variante o constante presenta un aumento de la funcion efectora. La region variante mencionada de este tipo puede contener uno o mas sustituciones, inserciones o deleciones de aminoacidos. Como alternativa o adicionalmente, la region variante o Fc alterada o constante puede comprender modificaciones posteriores a la traduccion alteradas, incluyendo, por ejemplo, un patron de glicosilacion alterado. Un patron de glicosilacion alterado incluye un aumento o disminucion del numero de enlaces glicosfdicos y/o una modificacion en la posicion (es decir, numero de restos de aminoacidos) de uno o mas enlaces glicosfdicos.

En el presente documento tambien se describen metodos para disminuir o eliminar celulas CD200 positivas para que comprendan anticuerpos anti-CD200 variantes que presentan reduccion o no de la actividad de ADCC y/o CDC. El anticuerpo anti-CD200 variante puede comprender una region Fc variante o alterada o region constante, en el que la region Fc variante o constante presenta disminucion o no de la funcion efectora. La region Fc variante Walter o constante mencionada de este tipo puede contener una o mas sustituciones, inserciones o deleciones de aminoacido. Como alternativa o adicionalmente, la region Fc variante o constante puede comprender modificaciones despues de la traduccion alteradas, que incluyen, pero no se limitan a, un patron de glicosilacion alterado. Algunos ejemplos de patrones de glicosilacion alterados se han descrito anteriormente.

Un anticuerpo anti-CD200 murino, quimerico, humanizado, humano o desinmunizado se puede administrar a un paciente, que es un anticuerpo de no bloqueo. El anticuerpo anti-CD200 de no bloqueo puede ser una anticuerpo variante como se ha descrito anteriormente y en consecuencia puede presentar modulacion de la funcion(s) efectora. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 variante puede no bloquear la interaccion de CD200:CD200R y tambien puede comprender una region constante variante que provoca un aumento de la funcion efectora, tal como, por ejemplo, aumento de ADCC.

A) METODOS PARA TRATAR PACIENTES CON TRASTORNOS AUTOINMUNITARIOS

En el presente documento se describe el tratamiento de pacientes con trastornos autoinmunitarios con una terapia que comprenden antagonista de CD200. El antagonista puede ser un anticuerpo anti-CD200 o fragmento de union a antfgeno del mismo. El anticuerpo anti-CD200 o fragmento del mismo puede ser un anticuerpo anti-CD200 variante que presenta modulacion de la actividad efectora. Por ejemplo, el anticuerpo variante puede comprender una region constante variante o alterada capaz de provocar aumento o potenciacion de la funcion efectora, tal como, por ejemplo, ADCC. Ademas, el anticuerpo mencionado puede ser un anticuerpo de no bloqueo y puede ser un anticuerpo anti-CD200 murino, quimerico, humanizado, humano o desinmunizado. Por lo tanto, los metodos para tratar pacientes con trastornos autoinmunitarios pueden comprender cualquiera de los antagonistas y anticuerpos de CD200 como se establece en la presente divulgacion.

Los anticuerpos anti-CD200 o antagonistas de CD200 se pueden usar para disminuir cualquier tipo de celula que expresa CD200 en su superficie, incluyendo, por ejemplo, celulas inmunitarias tales como linfocitos T, linfocitos B, y celulas dendnticas. Los anticuerpos anti-CD20o pueden ser utiles para la destruccion dirigida de celulas inmunitarias implicadas en una respuesta inmunitaria lo deseaba, tal como, por ejemplo, respuestas inmunitarias asociadas con un trastorno autoinmunitario, trasplantes, alergias, o trastornos inflamatorios. Algunas enfermedades y trastornos autoinmunitarios a modo de ejemplo que se pueden tratar con los anticuerpos anti-CD200 proporcionados en el presente documento incluyen, por ejemplo, respuestas inflamatorias tales como enfermedades cutaneas inflamatorias que incluyen psoriasis y dermatitis (por ejemplo, dermatitis atopica); dermatomiositis; esclerodermia sistemica y esclerosis; respuestas asociadas con enfermedad inflamatoria del intestino (tal como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa); smdrome de distres respiratorio (incluyendo smdrome de distres respiratorio del adulto; ARDS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; colitis; glomerulonefritis; afecciones alergicas tales como eccema y asma y otras afecciones que implican infiltracion de linfocitos T y respuestas inflamatorias cronicas; aterosclerosis; deficiencia de adhesion leucocitaria; artritis reumatoide; lupus sistemico eritematoso (SLE); diabetes mellitus (por ejemplo, diabetes mellitus de tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina); esclerosis multiple; smdrome de Reynaud; tiroiditis autoinmunitaria; encefalomielitis alergica; smdrome de Sjogren; diabetes de inicio juvenil; y respuestas inmunitarias asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T encontradas por lo general en tuberculosis, sarcoidosis, polimiositis, granulomatosis y vasculitis; anemia perniciosa (enfermedad de Addison); enfermedades implican diapedesis leucocitaria; trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC); smdrome de lesion organica multiple; anemia hemolttica (que incluye, pero no se limita a crioglobinemia o anemia positiva de Coombs); miastenia gravis; enfermedades mediadas por el complejo de antfgeno-anticuerpo; enfermedad de la membrana basal antiglomerular; smdrome antifosfolip^dico; neuritis alergica; enfermedad de Graves; smdrome miastenico de Lambert-Eaton; penfigo bulloso; penfigo; poliendocrinopatias autoinmunitarias; enfermedad de Reiter; smdrome del hombre ngido; enfermedad de Bechet; arteritis de celulas gigantes; nefritis de complejo inmunitario; nefropatia de IgA; polineuropatias de IgM; purpura trombocitopenica inmunitaria (ITP) o trombocitopenia autoinmunitaria y enfermedades hemolfticas autoinmunitarias, tiroiditis de Hashimoto, etc.

De acuerdo con los metodos y composiciones que se describen en el presente documento, la divulgacion tambien se refiere a metodos para tratar a un paciente de trasplante o aloinjerto. Un anticuerpo anti-CD200 u otro antagonista de CD200 de la presente divulgacion se puede administrar a un paciente antes de un procedimiento de trasplante o aloinjerto o despues del procedimiento para disminuir o eliminar celulas inmunitarias positivas para CD200 que podnan reducir la aceptacion del organo o tejido trasplantado por parte del paciente. A un paciente de trasplante se le puede administrar un anticuerpo anti-CD200 con aumento de la funcion efectora. Ademas, un anticuerpo anti-CD200 es un anticuerpo de no bloqueo.

Las terapias que comprenden antagonistas o anticuerpos de CD200 se pueden administrar a pacientes en terapias de combinacion. Por consiguiente, la eliminacion dirigida de ciertas poblaciones de celulas inmunitarias para tratar o prevenir trastornos autoinmunitarios, aumentar o prolongar la supervivencia del trasplante, tratado prevenir alergias, o tratar o prevenir trastornos inflamatorios, se pueden administrar como parte de una terapia de combinacion. Por ejemplo, a un paciente que recibe una primera terapia que comprende un antagonista de CD200 (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 descrito en el presente documento) tambien se le puede proporcionar una segunda terapia. El antagonista de CD200 se puede administrar de forma simultanea con la segunda terapia. Como alternativa, el antagonista de CD200 se puede proporcionar antes o despues de la segunda terapia. Las segundas terapias incluyen, pero no se limitan a, agentes antiinflamatorios, agentes inmunosupresores, y/o agentes antiinfecciosos.

Algunas terapias de combinacion de la presente divulgacion incluyen, por ejemplo, un antagonista de CD200 como se describe en el presente documento administrado de forma simultanea o de forma secuencial en serie con esteroides, agentes antimalaria, aspirina, farmacos antiinflamatorios no esteroideos, agentes inmunosupresores, o farmacos citotoxicos. Estan incluidos corticosteroides (por ejemplo prednisona, dexametasona, y predisolona), metotrexatem, metilprednisolona, inmunosupresores macrolidos (por ejemplo sirolimus y tacrolimus), inhibidores mitoticos (por ejemplo azatioprina, ciclofosfamida, y metotrexato), metabolitos fungicos que inhiben la actividad de los linfocitos T (por ejemplo ciclosporina), micofenolato mofetilo, acetato de glatiramer, y agentes citotoxicos y que danan el ADN (por ejemplo clorambucilo). Para pacientes con trastornos autoinmunitarios y pacientes de aloinjerto o trasplante, la terapia anti-CD200 se puede combinar con tratamientos con anticuerpos que incluyen daclizumab, un anticuerpo monoclonal de IgG1 humana modificada por ingeniena genetica que se une de forma espedfica a la cadena a del receptor de interleuquina-2, asf como otros diversos anticuerpos que se dirigen a celulas inmunitarias u otras celulas. Las terapias de combinacion de este tipo pueden ser utiles en el tratamiento de diabetes de tipo 1, artritis reumatoide, lupus, y purpura trombocitopenica idiopatica, y otras indicaciones autoinmunitarias. La divulgacion tambien se refiere a terapias para trastornos autoinmunitarios y para pacientes de trasplante que comprenden un antagonista de CD200 (tal como, por ejemplo, los anticuerpos y variantes del mismo descritos en la presente divulgacion) conjugados con uno o mas agentes.

B) METODOS PARA TRATAR PACIENTES CON CANCER

En el presente documento se describe un metodo para tratar el cancer en el que se administra un agente que interrumpe o inhibe la interaccion de CD200 con su receptor a un sujeto. La interrupcion de la interaccion de CD200:CD200R posteriormente revierte o inhibe la supresion inmunitaria, aumentando de este modo la respuesta inmunitaria. Algunos posibles agentes para la interrupcion de la interaccion de CD200:CD200R incluyen, por ejemplo, moleculas pequenas, agentes qmmicos, polipeptidos, moleculas inorganicas, y compuestos organometalicos. La interaccion de CD200:CD200R tambien se pueden inhibir mediante la reduccion de la expresion de cualquiera de la protema de membrana o su receptor a traves de terapia antisentido, ARNi, o genetica. Ademas, un polipeptido espedfico para CD200 o CD200R, tal como un anticuerpo espedfico anti-CD200 o anti-CD200R o fragmentos de los mismos, puede inhibir los efectos inmunosupresores de la interaccion de CD200:CD200R.

Algunas celulas cancerosas que se pueden tratar con un antagonista de CD200 incluyen cualquier celula cancerosa que presente expresion de CD200 o regulacion positiva de CD200. Algunos canceres para los que se puede usar terapia anti-CD200 incluyen, por ejemplo, cancer de ovario, melanoma, mieloma, neuroblastoma, renal, mama, prostata, tumores malignos hematologicos (por ejemplo linfomas y leucemias), de celulas plasmaticas. Tambien se incluye cualquier celula cancerosa derivada de celulas de la cresta neuronal. El antagonista de CD200 de la invencion es un anticuerpo anti-CD200. Los anticuerpos de este tipo usados como agentes terapeuticos anticancer son capaces de interferir con la interaccion de CD200 y sus receptores. Esta interferencia puede bloquear el efecto de inmunosupresion de CD200. Al aumentar la respuesta inmunitaria de esta manera, los anticuerpos de este tipo pueden estimular la erradicacion de celulas cancerosas. Algunos anticuerpos anti-CD200 tambien se pueden dirigir a celulas cancerosas para muerte celular mediada por efector.

Un anticuerpo anti-CD200 variante que presenta modulacion de la actividad de ADCC y/o CDC se puede administrar a un sujeto con celulas cancerosas positivas para CD200. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CD200 variante usado en terapia para el cancer puede presentar aumento de la actividad efectora en comparacion con el anticuerpo precursor o nativo. De acuerdo con la presente invencion, el anticuerpo anti-CD200 variante presenta reduccion de la funcion efectora, incluyendo reduccion de ADCC, con respecto al anticuerpo nativo. El anticuerpo mencionado puede ser un anticuerpo murino, quimerico, humanizado, humano o desinmunizado. Algunos canceres para los que se puede usar el anticuerpo anti-CD200 variante en el tratamiento incluyen, pero no se limitan a, canceres de celulas de la cresta neuronal. Tambien estan incluidos cancer de celulas plasmaticas, cancer de ovario, cancer de piel, cancer de pulmon, cancer renal, cancer de mama, cancer de prostata, neuroblastoma, linfoma, mieloma, y leucemia.

Los presentes anticuerpos se pueden administrar como un agente terapeutico a pacientes con cancer, en especial, pero no limitados a, pacientes con CLL, cancer de celulas plasmaticas, cancer de ovario, cancer de piel, cancer de pulmon, cancer renal, cancer de mama, cancer de prostata, neuroblastoma, linfoma, mieloma, leucemia, y cualquier cancer derivado de celulas de la cresta neuronal. En el presente documento se describe una terapia para el cancer de acuerdo con la presente divulgacion que comprende (1) administrar un anticuerpo anti-CD200 o antagonista que interfiera con la interaccion entre CD²O⁰y su receptor para bloquear la supresion inmunitaria, estimulando de ese modo la erradicacion de las celulas cancerosas; y/o (2) administrar una molecula de fusion que incluye una parte de direccion a CD-200 para eliminar directamente las celulas cancerosas. Como alternativa, el anticuerpo elimina directamente las celulas cancerosas a traves de citotoxicidad celular mediada por complemento o dependiente de anticuerpo. Dado que CD200 tambien se expresa en celulas normales tales como celulas endoteliales, aunque a niveles menores que en las celulas cancerosas, tambien podna ser ventajoso administrar un anticuerpo anti-CD200 con una region constante modificada para reducir o eliminar ADCC o CDC para limitar el dano a las celulas normales. Por ejemplo, si la expresion de CD200 se regula de forma positiva en algunas celulas normales activadas (por ejemplo, linfocitos T activados), haciendo que tales celulas sean vulnerables a eliminacion por un anticuerpo anti-CD200 con funcion efectora, por lo tanto, podna ser ventajoso usar un anticuerpo anti-CD200 que careciera de funcion efectora para evitar la disminucion de estas celulas que ayudan en la destruccion de celulas cancerosas.

En una realizacion en particular, la funcion efectora de algunos anticuerpos anti-CD200 se elimina mediante el intercambio del dominio constante de IgG1 por un dominio de fusion de IgG2/4. Se pueden concebir otras formas de eliminar la funcion efectora tales como, por ejemplo, mutacion de sitios conocidos por que interaction con FcR o insercion de un peptido en la region bisagra, eliminando de ese modo sitios cnticos requeridos para interaccion con FcR. Algunos anticuerpos anti-CD200 variantes con reduccion de la funcion efectora o ninguna tambien incluyen variantes como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Los agentes mencionados anteriormente para la inhibicion o prevencion de la interaccion de CD200:CD200R se pueden usar en combinacion con otras terapias o con otros agentes. Otros agentes incluyen, pero no se limitan a, polipeptidos, moleculas pequenas, agentes qmmicos, metales, compuestos organometalicos, compuestos inorganicos, moleculas de acido nucleico, oligonucleotidos, aptameros, espiegelmeros, acidos nucleicos antisentido, inhibidores de acido nucleico bloqueados (LNA), inhibidores de acido nucleico peptfdicos (PNA), agentes inmunomoduladores, fragmentos de union a antfgeno, profarmacos, y compuestos peptidomimeticos.

En el presente documento tambien se describen tratamientos de combinacion que comprenden un antagonista de CD200 incluyendo los anticuerpos que se describen en el presente documento y compuestos inmunomoduladores, vacunas o quimioterapia. Algunos ejemplos ilustrativos de agentes inmunomoduladores adecuados que se pueden usar en terapias de combinacion de este tipo incluyen agentes que bloquean la regulacion negativa de linfocitos T o celulas de presentacion de antfgeno (por ejemplo, anticuerpos anti-CTLA4, anticuerpos anti-PD-LI, anticuerpos anti-PDL-2, anticuerpos anti-PD-1 y similares) o agentes que aumentan la coestimulacion positiva de los linfocitos T (por ejemplo, anticuerpos anti-CD4o o anticuerpos anti 4-1BB) o agentes que aumentan el rndice de linfocitos NK o actividad de los linfocitos T (por ejemplo, anticuerpos anti-CD200 solos o en combinacion con inhibidores tales como los IMiD, talidomida, o analogos de talidomida). Ademas, la terapia inmunomoduladora podna incluir vacunas para el cancer tales como celulas dendnticas cargadas con celulas tumorales, proternas, peptidos, ARN, o ADN derivado de celulas de este tipo, proternas de choque termico derivadas del paciente (hsp) o adyuvantes generales que estimulan el sistema inmunitario a diversos niveles tales como CpG, Luivac, Biostim, Ribominilo, Imudon, Bronchovaxom o cualquier otro compuesto otro adyuvante que activar receptores del sistema inmunitario innato (por ejemplo, agonista de receptor de tipo toll, anticuerpos anti-CTLA-4, etc.). Ademas, la terapia inmunomoduladora podna incluir tratamiento con citoquinas estables como IL-2, GM-CSF e IFN-gamma.

La eliminacion de los linfocitos T reguladores existentes con reactivos tales como anti-CD25, fludarabina, o ciclofosfamida se puede conseguir antes de comenzar con el tratamiento anti-CD200. Ademas, la eficacia terapeutica de algunas terapias mieloablativas seguido de trasplante de medula osea o transferencia adoptiva de linfocitos T reactivos con celulas CLL aumenta con la terapia anti-CD200. La eficacia del tratamiento anti-CD200 puede mejorar bloqueando los mecanismos de inmunosupresion con agentes tales como anticuerpos anti-PDL1 y/o 2, anticuerpos anti-IL-10, anticuerpos anti-IL-6, y similares. Ademas, podna ser ventajoso eliminar celulas dendnticas plasmacitoides, que se ha mostrado que son inmunosupresoras en el entorno del cancer. En estas divulgaciones en las que se pretende la administracion de un anticuerpo anti-CD200 para aumentar una respuesta inmunitaria mediante el bloqueo de la supresion inmunitaria, por ejemplo, tambien se puede usar un anticuerpo anti-CD200 variante que carezca de funcion efectora.

La terapia que aumenta la respuesta inmunitaria puede ser la administracion de un polipeptido que se une a CD200, solo o en combinacion con una de las terapias inmunomoduladoras mencionadas anteriormente. Por consiguiente, un antagonista de CD200 (incluyendo un anticuerpo anti-CD200 como se describe en el presente documento) se puede usar en combinacion con un anticuerpo monoclonal (por ejemplo, rituximab, trastuzumab, alemtuzumab, cetuximab, o bevacizumab), incluyendo un anticuerpo monoclonal conjugado (por ejemplo, gemtuzumab ozogamicina, ibritumomab tiuxetano, o tositumomab).

Ademas, la combinacion de la terapia anti-CD200 con agentes quimioterapeuticos podna ser particularmente util para reducir la carga tumoral global, para limitar la angiogenesis, para aumentar la accesibilidad tumoral, para aumentar la susceptibilidad a ADCC, para dar como resultado un aumento de la funcion inmunitaria al proporcionar mas antfgeno tumoral, o para aumentar la expresion del abstracto de linfocitos T, LIGHT. Cuando la terapia anti-CD200 se administra a un sujeto en combinacion con otro agente antineoplasico convencional, ya sea de manera simultanea o secuencial, se puede mostrar que la terapia anti-CD200 aumenta el efecto terapeutico de cualquier agente solo. Algunos computes farmaceuticos que se pueden usar para terapia antitumoral combinatoria incluyen, simplemente para ilustrar: aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, asparaginasa, bcg, bicalutamida, bleomicina, buserelina, busulfan, camptotecina, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucilo, cisplatino, cladribina, clodronato, colchicina, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorrubicina, dienestrol, dietilstilbestrol, docetaxel, doxorrubicina, epirrubicina, estradiol, estramustina, etoposido, exemestano, filgrastim, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximasterona, flutamida, gemcitabina, genistema, goserelina, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, imatinib, interferon, irinotecan, letrozol, leucovorina, leuprolida, levamisol, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalan, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, nilutamida, nocodazol, octreotido, oxaliplatino, paclitaxel, pamidronato, pentostatina, plicamicina, porffmero, procarbazina, raltitrexed, rituximab, estreptozocina, suramina, tamoxifeno, temozolomida, teniposido, testosterona, tioguanina, tiotepa, diclorhidrato de titanoceno, topotecan, trastuzumab, tretinoma, vinblastina, vincristina, vindesina, y vinorelbina.

Estos compuestos antitumorales quimioterapeuticos se pueden clasificar por su mecanismo de accion en grupos, que incluyen, por ejemplo, las siguientes clases de agentes: antimetabolitos/agentes anticancer, tales como analogos de pirimidina (5-fluorouracilo, floxuridina, capecitabina, gemcitabina y citarabina) y analogos de purina, antagonistas de folato e inhibidores relacionados (mercaptopurina, tioguanina, pentostatina y 2-clorodesoxiadenosina (cladribina)); agentes antiproliferativos/antimitoticos que incluyen productos naturales tales como alcaloides de la vinca (vinblastina, vincristina, y vinorelbina), interruptores de microtubulos tales como taxano (paclitaxel, docetaxel), vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas y navelbina, epidipodofilotoxinas (etoposido, teniposido), agentes que danan el ADN (actinomicina, amsacrina, antraciclinas, bleomicina, busulfan, camptotecina, carboplatino, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, citoxano, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, hexametilmelaminaoxaliplatino, ifosfamida, melfalan, mecloretamina, mitomicina, mitoxantrona, nitrosourea, plicamicina, procarbazina, taxol, taxotere, teniposido, trietilenotiofosforamida y etoposido (VP16)); antibioticos tales como dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina, doxorrubicina (adriamicina), idarrubicina, antraciclinas, mitoxantrona, bleomicinas, plicamicina (mitramicina) y mitomicina; enzimas (L-asparaginasa que metabolica de manera sistemica la L-asparagina y priva a las celulas que no tienen la capacidad de sintetizar su propia asparagina); agentes antiplaquetarios; agentes de alquilacion antiproliferativos/antimitoticos tales como mostazas de nitrogeno (mecloretamina, ciclofosfamida y analogos, melfalan, clorambucilo), etileniminas y metilmelaminas (hexametilmelamina y tiotepa), sulfonatos de alquilo -busulfan, nitrosoureas (carmustina (BCNU) y analogos, estreptozocina), tracenos - dacarbazinina (DTIC); antimetabolitos antiproliferativos/antimitoticos tales como analogos del acido folico (metotrexato); complejos de coordinacion de platino (cisplatino, carboplatino), procarbazina, hidroxiurea, mitotano, aminoglutetimida; hormonas, analogos hormonales (estrogeno, tamoxifeno, goserelina, bicalutamida, nilutamida) y inhibidores de la aromatasa (letrozol, anastrozol); anticoagulantes (heparina, sales de heparina sintetica y otros inhibidores de trombina); agentes fibrinolfticos (tales como activador del plasminogeno tisular, estreptoquinasa y uroquinasa), aspirina, dipiridamol, ticlopidina, clopidogrel, abciximab; agentes antimigratorios; agentes antisecretores (breveldina); agentes inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimus (FK-506), sirolimus (rapamicina), azatioprina, micofenolato mofetilo); agentes inmunomoduladores (talidomida y analogos de la misma tales como lenalidomida (Revlimid, CC-5013) y CC-4047 (Actimid)), ciclofosfamida; compuestos antiangiogenicos (TNP-470, genistema) e inhibidores del factor de crecimiento (inhibidores del factor de crecimiento endoteliales vascular (VEGF), inhibidores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)); bloqueador de receptores de angiotensina; dadores de oxido mtrico; oligonucleotidos antisentido; anticuerpos (trastuzumab); inhibidores del ciclo celular e inductores de la diferenciacion (tretinoma); inhibidores de mTOR, inhibidores de la topoisomerasa (doxorrubicina (adriamicina), amsacrina, camptotecina, daunorrubicina, dactinomicina, eniposido, epirrubicina, etoposido, idarrubicina y mitoxantrona, topotecan, irinotecan), corticosteroides (cortisona, dexametasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisona, y prenisolona); inhibidores de quinasa de transduccion de senales del factor de crecimiento; inductores de disfuncion mitocondrial y activadores de caspasa; y interruptores de cromatina.

Algunos compuestos farmaceuticos que se pueden usar para terapia anti-angiogenesis combinatoria incluyen: (1) inhibidores de la liberacion de "moleculas angiogenicas", tales como bFGF (factor basico de crecimiento de fibroblastos); (2) neutralizadores de moleculas angiogenicas, tales como anticuerpos anti-pbFGF; y (3) inhibidores de la respuesta de celulas endoteliales a estfmulos angiogenicos, que incluyen inhibidor de la colagenasa, inhibidores de la renovacion de la membrana basal, esteroides angiostaticos, inhibidores de la angiogenesis derivados de hongos, factor 4 plaquetario, trombospondina, farmacos para la artritis tales como D-penicilamina y tiomalato de oro, analogos de vitamina D³, interferon alfa, y similares. Para inhibidores de angiogenesis propuestos adicionales, veanse Blood et al., Biochim. Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990), Moses et al., Science, 248: 1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59: 44-51 (1988), y documentos de patente de Estados Unidos n.° 5.092.885, 5.112.946, 5.192.744, 5.202.352, y 6.573.256. Ademas, existe una gran diversidad de compuestos que se pueden usar para inhibir la angiogenesis, por ejemplo, peptidos o agentes que bloquean la ruta de la angiogenesis mediada por VEGF, protema endostatina o derivados, fragmentos de union a lisina de angiostatina, melanina o compuestos que estimulan la melanina, fragmentos de plasminogeno (por ejemplo, Kringles 1-3 de plasminogeno), subunidades de troponina, antagonistas de la vitronectina avp³, peptidos derivados de la Saposina B, antibioticos o analogos (por ejemplo, tetraciclina, o neomicina), composiciones que contienen dienogest, compuestos que comprenden un nucleo inhibidor de MetAP-2 acoplado a un peptido, el compuesto EM-138, chalcona y sus analogos, e inhibidores de la naaladasa. Veanse, por ejemplo, los documentos de patente de Estados Unidos n.°s 6.395.718, 6.462.075, 6.465.431, 6.475.784, 6.482.802, 6.482.810, 6.500.431, 6.500.924, 6.518.298, 6.521.439, 6.525.019, 6.538.103, 6.544.758, 6.544.947, 6.548.477, 6.559.126, y 6.569.845.

Dependiendo de la naturaleza de la terapia de combinacion, la administracion del anticuerpo anti-CD200 puede continuar aunque la otra terapia se este administrando y/o a partir de ese momento. La administracion del anticuerpo se puede realizar en una sola dosis, o en multiples dosis. En algunos casos, la administracion del anticuerpo anti-CD200 comienza al menos varios dfas antes de la terapia convencional, aunque en otros casos, la administracion comienza inmediatamente antes o en el momento de la administracion de la terapia convencional. En algunos casos, el anticuerpo anti-CD200 se administrara despues de otras terapias, o se podna administrar de forma alternativa con otras terapias.

Los presentes anticuerpos se pueden usar para eliminar directamente o hacer ablacion de celulas cancerosas in vivo. La eliminacion dirigida implica la administracion de los anticuerpos (que ocasionalmente se fusionan con un farmaco citotoxico) a un sujeto que requiere un tratamiento de este tipo. Dado que los anticuerpos reconocen CD200 en las celulas cancerosas, se destruye cualquier celula de este tipo a la que se unen los anticuerpos. Cuando los anticuerpos se usan solos para eliminar o para hacer ablacion de celulas cancerosas, tal eliminacion o ablacion se puede realizar iniciando las funciones inmunitarias del hospedador endogeno, tales como CDC y/o ADCC. Los ensayos para determinar si un anticuerpo elimina las celulas de esta manera estan dentro del alcance de los expertos en la materia.

Los anticuerpos de la presente divulgacion se pueden usar para suministrar una diversidad de compuestos citotoxicos. Cualquier compuesto citotoxico se puede fusionar con los presentes anticuerpos. La fusion se debe conseguir de forma qmmica o de forma genetica (por ejemplo, mediante la expresion con una sola molecula, fusionada). El compuesto citotoxico puede ser un compuesto biologico, tal como un polipeptido, o una molecula pequena. Como observaran los expertos en la materia, para moleculas pequenas, se usa fusion qmmica, aunque para los compuestos biologicos, se puede usar cualquiera de fusion qmmica o genetica.

Algunos ejemplos no limitantes de compuestos citotoxicos incluyen farmacos terapeuticos, un compuesto que emite radiacion, moleculas de origen vegetal, fungico o bacteriano, protemas biologicas y mezclas de los mismos. Los farmacos citotoxicos pueden ser farmacos citotoxicos de accion por via intracelular, tales como emisores de radiacion de corto alcance, que incluyen, por ejemplo, emisores a de alta energfa, de corto alcance. Algunas toxinas enzimaticamente activas y fragmentos de las mismas se ejemplifican con el fragmento de toxina A de difteria, fragmentos activos de no union de toxina de difteria, exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sacrina, ciertas protemas de Aleurites fordii, ciertas protemas de Diantina, protemas de Phytolacca americana (PAP, PAPII y PAP-S), inhibidor de Morodica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogilina, restrictocina, fenomicina, y enomicina, por ejemplo. Algunos procedimientos para preparar polipeptidos enzimaticamente activos de las inmunotoxinas se describen en los documentos WO84/03508 y WO85/03508. Ciertos restos citotoxicos derivan de adriamicina, clorambucilo, daunomicina, metotrexato, neocarzinostatina y platino, por ejemplo.

Algunos procedimientos para conjugar los anticuerpos con los agentes citotoxicos se han descrito anteriormente que estan dentro del alcance de un experto en la materia.

Como alternativa, el anticuerpo se puede acoplar con emisores de radiacion de alta energfa, por ejemplo, un radioisotopo, tal como ¹³¹I, un emisor y, que, cuando se localiza en el sitio del tumor, da como resultado una eliminacion de celulas de varios diametros. Vease, por ejemplo, S. E. Order, "Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), pp 303-316 (Academic Press 1985). Otros radioisotopos adecuados incluyen emisores a, tales como ²¹²Bi, ²¹³Bi, y ²¹¹At, y emisores p, tales como 186Re e ⁹⁰Y.

Los presentes anticuerpos de union a CD200 pueden proporcionar el beneficio de bloquear la supresion inmunitaria en CLL mediante la direccion de las celulas de leucemia directamente a traves de CD200. De forma espedfica, la estimulacion del sistema inmunitario puede permitir la erradicacion de las celulas de CLL del bazo y de los ganglios linfaticos. Los solicitantes no tienen conocimiento de que se haya conseguido ninguna erradicacion satisfactoria de celulas CLL a partir de estos microentornos con agentes que simplemente se dirigen a los linfocitos B (tales como alemtuzumab). Por el contrario, los linfocitos T reactivos hacia CLL pueden tener un mejor acceso a estos organos que los anticuerpos. En otras realizaciones, la eliminacion celular directa se consigue mediante el etiquetado de las celulas de CLL con Abs anti-CD200.

De acuerdo con las composiciones y metodos de la presente divulgacion, la combinacion de eliminacion celular directa y conduccion de la respuesta inmunitaria hacia un perfil de Th1 proporciona un enfoque particularmente potente para el tratamiento del cancer. Por lo tanto, en el presente documento se describe un tratamiento para el cancer en el que un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que se une a CD200 y que tanto a) bloquea la interaccion entre CD200 y su receptor como que b) elimina directamente las celulas cancerosas que expresan CD200, se administra a un paciente con cancer. El mecanismo mediante el que las celulas cancerosas se eliminan puede incluir, pero no se limita a ADCC y/o CDC; fusion con una toxina; fusion con una radioetiqueta; fusion con un agente etiologico implicado en la eliminacion celular, tal como granzima B o perforina; fusion con un virus citotoxicos; fusion con una citoquina tal como TNF-a o IFN-a. Un tratamiento para el cancer tambien puede implicar la administracion de un anticuerpo que tanto a) bloquea la interaccion entre CD200 y su receptor como que b) aumenta la actividad de los linfocitos T o linfocitos NK citotoxicos con respecto al tumor. Tal potenciacion de la actividad de los linfocitos T o linfocitos NK citotoxicos, por ejemplo, se puede combinar mediante fusion del anticuerpo con citoquina sales como por ejemplo IL-2, IL-12, IL-18, lL-13, e IL-5. Ademas, una potenciacion de este tipo se puede conseguir mediante la administracion de un anticuerpo anti-CD200 en combinacion con inhibidores tales como los IMiD, talidomida, o analogos de talidomida.

El tratamiento del cancer puede implicar la administracion de un anticuerpo que tanto (1) bloquea la interaccion entre CD200 y su receptor como que (2) atrae a los linfocitos T a las celulas tumorales. La atraccion de los linfocitos T se puede conseguir fusionando el Ab con quimioquinas tales como MIG, IP-10, I-TAC, CCL21, CCL5 o LIGHT. Ademas, el tratamiento con agentes quimioterapeuticos puede dar como resultado la regulacion positiva deseada de LIGHT. La accion combinada del bloqueo de la supresion inmunitaria y la eliminacion directamente a traves de direccion de anticuerpos de las celulas tumorales es un enfoque unico que proporciona un aumento de la etica.

Los anticuerpos anti-CD200 tambien se pueden usar como una herramienta de diagnostico de acuerdo con la presente divulgacion. Las biopsias o muestras de tejido de celulas cancerosas se pueden someter a ensayo para expresion de CD200 antes del tratamiento para predecir la eficacia de la terapia anti-CD200, sola o en combinacion con otros agentes o metodos (tales como agentes quimioterapeuticos, radioterapia, terapia inmunomoduladora, etc.). Por ejemplo, usando sangre obtenida de pacientes con canceres hematopoyeticos, la expresion de CD200 se puede evaluar en celulas cancerosas mediante analisis de FACS usando anticuerpos anti-CD200 en combinacion con los marcadores de celulas cancerosas apropiados tales como, por ejemplo, CD38 y CD19 en celulas CLL. Los pacientes con niveles de CD200 de al menos 1,4 veces superiores a los niveles encontrados en los linfocitos B normales se pueden seleccionados para tratamiento con anticuerpos anti-CD200. Como otro ejemplo, algunas muestras de tejido de un paciente se pueden tenir con anticuerpo anti-CD200 para determinar la expresion de CD200 en las celulas malignas y normales del paciente.

En otro ejemplo del uso de los presentes anticuerpos anti-CD200 como una herramienta de diagnostico o de pronostico, se obtienen biopsias de pacientes con tumores malignos y la expresion de CD200 se determina mediante analisis de FACS usando anticuerpos anti-CD200 o mediante inmunohistoqmmica usando anti-CD200. Si la celula tumoral expresa CD200 a niveles que son al menos 1,4 veces mas elevados en comparacion con el correspondiente tejido normal, los pacientes con cancer se seleccionan para terapia inmunomoduladora (que incluye, pero no se limita a, una terapia que comprende terapia anti-CD200). Para celulas derivadas de cancer que normalmente no expresan CD200, cualquier CD200 detectable en biopsias de tejido indican la posible utilidad de la terapia anti-CD200. La terapia inmunomoduladora puede ser una terapia anti-CD200, pero tambien puede ser cualquier otra terapia que influya en el sistema inmunitario del paciente. Algunos ejemplos de terapias inmunomoduladoras adecuadas incluyen la administracion de agentes que bloquean la regulacion negativa de los linfocitos T cells o celulas de presentacion de antfgeno (por ejemplo, anti-CTLA4, anti-PD-L1, anti-PDL-2, anti-PD-1) o la administracion de agentes que aumentan la coestimulacion positiva de los linfocitos T (por ejemplo, anti-CD40 o anti 4-1BB). Ademas, la terapia inmunomoduladora podna ser vacunas para el cancer tales como peptidos heterodclicos o peptidos de celulas tumorales que generan linfocitos T citotoxicos o celulas dendnticas cargadas con celulas tumorales, o la administracion de agentes que aumentan el mdice de linfocitos NK o actividad de los linfocitos T (por ejemplo, anticuerpos anti-CD200 solos o en combinacion con inhibidores tales como los IMiD, talidomida o analogos de talidomida), o la administracion de agentes que suprimen los linfocitos T reguladores (por ejemplo anticuerpos anti-CD200 solos o en combinacion con ONTAK), o celulas dendnticas plasmacitoides. La combinacion con agentes que aumentan la migracion de linfocitos T o celulas dendnticas tambien es ventajosa, tal como, por ejemplo, cualquier agente que bloquee SPARC. Ademas, la terapia inmunomoduladora podna ser una vacuna para el cancer, tales como celulas dendnticas cargadas con celulas tumorales, ARN tumoral o ADN tumoral de exosomas derivados de paciente, protema tumoral o peptidos tumorales, protemas de choque termico derivadas del paciente (hsp), hsp cargadas con antfgenos tumorales o adyuvantes generales que estimulan el sistema inmunitario a diversos niveles tales como CpG, Luivac, Biostim, Ribominilo, Imudon, Bronchovaxom o cualquier otro compuesto que active los receptores del sistema inmunitario innato (por ejemplo, receptores de tipo toll). Ademas, la terapia podna incluir el tratamiento con citoquinas tales como IL-2, GM-CSF e IFN-gamma. Tambien se contempla la combinacion con agentes que restablecen la actividad comprometida de las celulas dendnticas en el entorno tumoral tales como por ejemplo inhibidores de la MAP quinasa.

Los anticuerpos descritos en el presente documento tambien se pueden usar para detectar celulas cancerosas in vivo. La deteccion in vivo se consigue mediante etiquetado del anticuerpo, administracion del anticuerpo etiquetado a un sujeto, y a continuacion formacion de imagenes del sujeto. Algunos ejemplos de etiquetas utiles para formacion de imagenes de diagnostico de acuerdo con la presente divulgacion son radioetiquetas tales como 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C, y 188Rh, etiquetas fluorescentes tales como fluorescema y rodamina, etiquetas activas para resonancia magnetica nuclear, isotopos de emision de positrones detectables con un escaner de tomograffa de emision de positrones ("PET"), agentes quimioluminiscentes tales como luciferina, y marcadores enzimaticos tales como peroxidasa o fosfatasa. Tambien se pueden usar algunos emisores de radiacion de corto alcance, tales como isotopos detectables con sondas de deteccion de corto alcance, tal como una sonda transrectal. El anticuerpo se puede etiquetar con reactivos de este tipo usando tecnicas conocidas en la tecnica. Por ejemplo, vease Wensel y Meares, Radioimmunoimaging y Radioimmunotherapy, Elsevier, N.Y. (1983) para tecnicas relacionadas con el radioetiquetado de anticuerpos. Vease tambien, D. Colcher et al., "Use of Monoclonal Antibodies as Radiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma Xenografts in Athymic Mice", Met. Enzymol. 121: 802 816 (1986).

Un anticuerpo radioetiquetado de acuerdo con la presente divulgacion se puede usar para ensayos de diagnostico in vitro. La actividad espedfica de un anticuerpo, parte de union del mismo, sonda o ligando depende de la semivida, la pureza isotopica de la etiqueta radiactiva, y como se incorpora la etiqueta en el agente biologico. En ensayos de inmunoensayo, cuanto mayor es la actividad espedfica, en general, mejor es la sensibilidad. Por lo general, en la tecnica se conocen algunos procedimientos para el etiquetado de anticuerpos con los isotopos radiactivos.

El anticuerpo radioetiquetado se puede administrar a un paciente cuando se localizan celulas cancerosas que portan el antfgeno con el que reacciona el anticuerpo, y se detecta o "se forman imagenes" in vivo usando tecnicas conocidas tales como barrido radionuclear usando por ejemplo, una camara gamma o tomograffa de emision. Vease por ejemplo, A. R. Bradwell et al., "Developments in Antibody Imaging", Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds.), pp. 65-85 (Academic Press 1985). Como alternativa, un escaner de tomograffa transaxial de emision de positrones, tal como el denominado Pet VI ubicado en el Brookhaven National Laboratory, se puede usar cuando la radioetiqueta emite positrones (por ejemplo, 11C, 18F, 15O, y 13N).

Algunos agentes biologicos etiquetados con fluoroforo y cromoforo se pueden preparar con restos convencionales conocidos en la tecnica. Dado que algunos anticuerpos y otras protemas absorben luz que tiene longitudes de onda de hasta aproximadamente 310 nm, se debenan seleccionar los restos fluorescentes para que tuvieran una absorcion sustancial en longitudes de onda superiores a 310 nm y preferentemente superiores a 400 nm. Una diversidad de agentes fluoroforos y cromoforos se describe en Stryer, Science, 162: 526 (1968) y Brand, L. et al., Annual Review of Biochemistry, 41: 843-868 (1972). Los anticuerpos se pueden etiquetar con grupos cromoforos fluorescentes mediante procedimientos convencionales tales como los que se desvelan en los documentos de patente de Estados Unidos n.°s 3.940.475, 4.289.747, y 4.376.110.

En el presente documento tambien se describen algunos metodos para controlar la evolucion y/o eficacia de un tratamiento terapeutico. El metodo implica la administracion de una terapia inmunomoduladora y determinar los niveles de CD200 en un sujeto, al menos dos veces, para determinar la eficacia de la terapia. Por ejemplo, los niveles de tratamiento previo de CD200 se pueden discernir y, despues de al menos una administracion de la terapia, los niveles de CD200 se pueden determinar de nuevo. Una disminucion de los niveles de CD200 es indicativa de un tratamiento eficaz. La medida de los niveles de CD200 puede ser usada por el experto como una directriz para aumentar la cantidad o la frecuencia de la dosificacion de la terapia. Por supuesto, se debena entender que los niveles de CD200 se pueden controlar directamente o, como alternativa, cualquier marcador que se correlacione con CD200 se puede controlar. Otros metodos para determinar la eficacia de esta terapia incluyen, pero no se limitan a, deteccion de celulas cancerosas, recuento linfocitario total, tamano del ganglio linfatico, numero de linfocitos T de regulacion, perfiles de citoquina en el suero o intracelulares, o secrecion de citoquina por linfocitos T o B tal como se mide con ELISPOT.

C. OTROS ANTAGONISTAS DE CD200

Los antagonistas y polipeptidos y/o anticuerpos de CD200 usados en la presente divulgacion estan especialmente indicados para aplicaciones de diagnostico y terapeuticas como se describe en el presente documento. Por consiguiente, algunos antagonistas CD200 y anticuerpos anti-CD200 y variantes de los mismos se pueden usar en terapias, que incluyen terapias de combinacion, en el diagnostico y pronostico de la enfermedad, asf como en el control de la evolucion de la enfermedad.

Tambien se describen algunos anticuerpos biespedficos. Los anticuerpos biespedficos son anticuerpos monoclonal es, preferentemente humanos o humanizados, que tienen especificidades de union para al menos dos antfgenos diferentes. En el presente caso, una de las especificidades de uniones para el antfgeno CD200 en una celula (tal como, por ejemplo, una celula cancerosa o celular inmunitaria), la otra es para cualquier otro antfgeno, y preferentemente para una protema o receptor de la superficie celular o subunidad receptora.

Algunos metodos para preparar anticuerpos biespedficos estan dentro del alcance de los expertos en la materia. De forma tradicional, la produccion recombinante de anticuerpos biespedficos se basa en la coexpresion de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de union deseadas (sitios de combinacion de anticuerpo-antigeno) se pueden fusionar con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusion se realiza preferentemente con un dominio constante de cadenas pesadas de inmunoglobulina, incluyendo al menos parte de las regiones bisagra, CH2, y CH3. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresion separados, y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Para detalles adicionales de metodos ilustrativos conocidos en la actualidad para generar anticuerpos biespedficos vease, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986); documento WO 96/27011; Brennan et al., Science 229: 81 (1985); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol. 148 (5): 1547-1553 (1992); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); y Gruber et al., J. Immunol. 152: 5368 (1994); y Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991). Los anticuerpos biespedficos tambien incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Algunos anticuerpos heteroconjugados se pueden preparar usando cualquier metodo de reticulacion conveniente. Algunos agentes de reticulacion adecuados se conocen bien en la tecnica, y se desvelan en el documento de patente de Estados Unidos n.° 4.676.980, junto con un numero de tecnicas de reticulacion.

Tambien se han descrito diversas tecnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespedfico directamente a partir de cultivo de celulas recombinantes. Por ejemplo, se han producido algunos anticuerpos biespedficos usando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Los peptidos de cremallera de leucina de las protemas Fos y Jun se pueden unir a las partes de Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusion genetica. Los homodfmeros de anticuerpo se pueden reducir a la region bisagra para formar monomeros y a continuacion se pueden volver a oxidar para formar los homodfmeros de anticuerpo. Este metodo tambien se puede usar para la produccion de homodfmeros de anticuerpo. La tecnologfa de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) a proporcionar un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespedfico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (V^h) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V^l) con un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios V^hy V^lde un fragmento se ven forzados a emparejarse con los dominios V^ly V^hcomplementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de union a antfgeno. Tambien se ha informado de otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespedfico con el uso de dfmeros de Fv de una sola cadena (scFv). Vease Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994). Como alternativa, los anticuerpos pueden ser "anticuerpos lineales" como se describe en Zapata et al., Protein Eng. 8 (10): 1057-1062 (1995). En resumen, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos de Fd en tandem (V^h-C^h1-V^h-C^h1) que forman un par de regiones de union a antfgeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespedficos o monoespedficos.

D. MODOS DE ADMINISTRACION Y FORMULACIONES

La via de administracion de anticuerpos de los anticuerpos de la presente divulgacion (ya sea el anticuerpo puro, un anticuerpo etiquetado, un anticuerpo fusionado con una toxina, etc.) esta de acuerdo con metodos conocidos, por ejemplo, inyeccion o infusion mediante las vfas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, subcutanea, intraocular, intraarterial, intratecal, inhalacion o intralesional, o mediante sistemas de liberacion sostenida. El anticuerpo se administra preferentemente de manera continua por infusion o mediante inyeccion de bolo. Los anticuerpos se pueden administrar de una manera local o sistemica.

Los presentes anticuerpos se pueden preparar en una mezcla con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Algunas tecnicas para formulacion y administracion de los compuestos de la presente solicitud se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, ultima edicion. Esta composicion terapeutica se puede administrar por via intravenosa o a traves de la nariz o pulmon, preferentemente en forma de un lfquido o aerosol de polvo (liofilizado). La composicion tambien se puede administrar por via parenteral o por via subcutanea si se desea. Cuando se administra por via sistemica, la composicion terapeutica debena ser esteril, sustancialmente sin pirogenos y en una solucion parenteral en que aceptable teniendo debidamente en cuenta el pH, isotonicidad, y estabilidad. Por ejemplo, una preparacion farmaceutica esta sustancialmente libre de materiales pirogenicos con el fin de que sea adecuada para administracion como un agente terapeutico para seres humanos. Los expertos en la materia conocen estas condiciones.

Algunas composiciones farmaceuticas adecuadas para su uso incluyen composiciones en las que uno o mas de los presentes anticuerpos estan contenidos en la cantidad eficaz para conseguir su finalidad pretendida. De forma mas espedfica, una cantidad terapeuticamente eficaz se refiere una cantidad de anticuerpo eficaz para prevenir, aliviar o mejorar smtomas de enfermedad por prolongar la supervivencia del sujeto que se esta tratando. La determinacion de una cantidad terapeuticamente eficaz esta bien dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la vista de la divulgacion detallada proporcionada en el presente documento. Las dosificaciones terapeuticamente eficaces se pueden determinar usando metodos in vitro e in vivo.

Aunque la divulgacion mencionada anteriormente se ha dirigido a anticuerpos, en algunas realizaciones se pueden usar polipeptidos derivados de tales anticuerpos de acuerdo con la presente divulgacion.

Ejemplos

MODELO DE RATON Y CONSTRUCCION DE CELULAS CD200+

Modelo de Raji/PBL

Los ratones NOD.CB17-Prkdc<scid> (Jackson Laboratory) se inyectaron con 200 |jl de RPMI que contema 4 x 106 celulas RAJI (ATCC) s.c. junto con 0, 1, 5 o 10 millones de PBL. Se incluyeron nueve o diez ratones por grupo. Los PBL se aislaron de 250 ml de sangre entera en un gradiente de Histopaque seguido de lisis de globulos rojos usando cloruro de amonio al 0,9 %. El crecimiento del tumor se controlo tres veces a la semana midiendo la longitud y el ancho con un calibrador. El volumen del tumor se calculo basandose en la longitud x ancho x ancho/2.

Las diferencias entre los grupos que se inyectaron con los PBL en comparacion con el grupo que recibio solamente celulas tumorales se analizaron por ensayo de t de Student para muestras no relacionadas de dos colas. Se observaron diferencias significativas en los grupos que recibieron 5 o 10 millones de PBL, pero no en el grupo que recibio 1 millon de PBL a partir del Dfa 32 en adelante.

Modelo de PBL de Namalwa

Los ratones NOD.CB17-Prkdc<scid> (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine) se inyectaron con 200 j l de RPMI que contema 4 x 106 de celulas de Namalwa (ATCC) s.c. junto con 0, 2 o 10 millones de PBL. Se incluyeron 9-10 ratones por grupo. Los PBL se aislaron de 250 ml de sangre completa en un gradiente de Histopaque seguido de insiste globulos rojos usando cloruro de amonio al 0,9 %. El crecimiento del tumor se controlo tres veces a la semana midiendo la longitud y el ancho con un calibrador. El volumen del tumor se calculo basandose en la longitud x ancho x ancho/2.

Creacion de lineas celulares estables que expresan CD200

Se generaron lineas de celulas Raji y Namalwa estables que expresan CD200 usando el Sistema de Expresion Lentiviral Virapower (Invitrogen, Carlsbad, CA). Un ADNc de CD200 se aislo de las celulas de CLL primarias por RT-PCR usando el cebador directo 5-GACAAGCTTGCAAGGATGGAGAGGCTGGTGA-3' (SEQ ID NO: 34) y el cebador inverso 5-GACGGATCCGCCCCTTTTCCTCCTGCTTTTCTC-3' (SEQ ID NO: 35). El producto de PCR se clono en el vector de entrada Gateway, pCR8/GW/TOPO-TA, y los planes individuales se secuencian. Los clones con la secuencia correcta se combinaron en la orientacion tanto en sentido como antisentido en los vectores lentivirales pLenti6/V5/DEST y pLenti6/UbC/V5/DEST usando tecnologfa Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA). La diferencia principal entre estos dos vectores es el promotor usado para conducir la expresion de CD200: pLenti6/V5/DEST contiene el promotor temprano inmediato de CMV humano, mientras que pLenti6/UbC/V5/DEST contiene el promotor de ubiquitina C humano.

Se produjeron soluciones de reserva lentivirales pseudotipadas para VSV-G, de alta titulacion mediante cotransfeccion transitoria de celulas 293-FT como lo recomienda el fabricante. Las celulas Raji o Namalwa se transdujeron mediante nueva suspension de 106 celulas en 1 ml de medio de crecimiento que contema 12 jg/m l de Polybrene y se anadio 1 ml de solucion de reserva lentiviral. Despues de incubar las celulas durante una noche a 37 °C, el medio que contema virus se retiro y se reemplazo con 4 ml de medio recien preparado. Dos dfas despues, las celulas infectadas se analizaron para expresion de CD200 mediante citometna de flujo. En todos los experimentos, > 70 %, las celulas eran CD200+, mientras que CD200 era indetectable en las lrneas de celulas precursoras y en celulas transducidas con los virus de control negativo (CD200 antisentido).

Para aislar lrneas de celulas clonales que sobreexpresan CD200, las celulas infectadas se seleccionaron con blasticidina durante 13 dfas. Las concentraciones de blasticidina usadas fueron 6 jg/m l para celulas Raji o 2 jg/m l para celulas Namalwa. A continuacion, los clones estables se aislaron limitando la dilucion de las celulas resistentes a blasticidina en placas de 96 pocillos. Los clones se identificaron sistematicamente en formato de 96 pocillos mediante citometna de flujo usando Mouse CD200 Anti-Humano de Raton conjugado con PE (clon MRC OX104, Serotec) y un FACSCalibur de BD equipado con un Muestreador de Alto Rendimiento. Despues de identificar sistematicamente un total de clones de 2000 Raji y 2000 Namalwa, esos clones con la expresion de CD200 mas elevada se expandieron para caracterizacion adicional usando tecnicas convencionales.

EJEMPLO 1

Eficacia de versiones humanizadas de C2aB7 en el modelo que RAJI_CD200/PBL

A) Para evaluar si las versiones humanizadas de C2aB7 detienen su eficacia en modelos tumorales in vivo, el C2aB7 quimerico (vease la publicacion de solicitud de patente de Estados Unidos con numero 2005/0129690) y 3 versiones humanizadas (C2aB7V4VI, C2aB7V3V1 y C2aB7V3V2) asf como el anticuerpo de control negativo alxn4100 se sometieron a ensayo en el modelo de RAJI-CD200/PBL. Las celulas RAJI transducidas con CD200 se inyectaron s.c. en ratones NOD.CB17-Prkdc<scid>, y la capacidad de los PBL para reducir el crecimiento tumoral en presencia o ausencia de anticuerpos C2aB7 quimericos o humanizados o se evaluo el anticuerpo de control alxn4100 (que no se une a celulas tumorales). Los anticuerpos a las concentraciones indicadas a continuacion se administraron inicialmente con las celulas tumorales, y a continuacion dos veces/semana por i.v. Se establecieron los siguientes grupos con 10 ratones cada uno:

Grupo 1: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c.

Grupo 2: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL

Grupo 3: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 5 mg/kg de C2aB7

Grupo 4: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 20 mg/kg de C2aB7V4V1

Grupo 5: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 5 mg/kg de C2aB7V4V1

Grupo 6: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 20 mg/kg de C2aB7V3V1

Grupo 7: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 5 mg/kg de C2aB7V3V1

Grupo 8: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 5 mg/kg de C2aB7V3V2

Grupo 9: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 20 mg/kg de alxn4100

La longitud y el ancho del tumor se midieron 3 veces a la semana, y el volumen del tumor se calculo con longitud del tumor*ancho*ancho/2. La Figura 18 muestra que, como se esperaba, la expresion de CD200 en las celulas tumorales evitaba que las celulas inmunitarias redujeran el crecimiento del tumor. Todas las versiones humanizadas de C2aB7 bloqueaban el crecimiento del tumor en hasta un 97 % a dosis de 20 mg/kg. El anticuerpo de control alxn4100 no inflma en el crecimiento tumoral. Estos datos demuestran que todos los anticuerpos humanizados son altamente eficaces en el bloqueo del crecimiento tumoral.

B) Evasion inmunitaria con CD200

Aunque el sistema inmunitario humano es capaz de aumentar una respuesta inmunitaria frente a muchos tipos de cancer, esa respuesta es insuficiente para erradicar el cancer en la mayona de los pacientes, debido posiblemente a la evasion inmunitaria a traves de la regulacion negativa del sistema inmunitario por el tumor. Los inventores identificaron que la molecula inmunosupresora CD200 estaba regulada de forma positiva 1,5-5,4 veces en celulas de leucemia linfodtica cronica (CLL) en todos los pacientes examinados (n = 80). Se sabe que la interaccion de CD200 con su receptor altera los perfiles de citoquina de Th1 a Th2 en reacciones linfodticas mixtas, y da como resultado la induccion de linfocitos T reguladores, que se cree que obstaculizan la inmunidad de los linfocitos T efectores espedficos de tumor. En el presente estudio, los inventores abordaron si la expresion de CD200 en celulas tumorales desempena un papel en la evasion inmunitaria, evitando de ese modo la eliminacion de celulas tumorales por el sistema inmunitario en un modelo de xenoinjerto de raton hu/SCID, y si el tratamiento con un anticuerpo anti-CD200 antagonista influye en el crecimiento del tumor en este modelo.

Las lmeas de celulas de linfoma no Hodgkin humano, RAJI y Namalwa, se transdujeron con CD200 humano y se inyectaron por via subcutanea junto con linfocitos de sangre periferica humana (PBMC) en ratones NOD/SClD. El crecimiento tumoral en ratones que recibieron celulas tumorales que expresan CD200 se comparo con el crecimiento tumoral en ratones que recibieron celulas tumorales que no expresaban CD200 en el tiempo. En experimentos posteriores, los ratones se trataron con anticuerpos anti-CD200 quimericos o humanizados (intervalo de dosis de 1 mg/kg de a 20 mg/kg) mediante inyeccion intravenosa. El tratamiento comenzo inmediatamente o 7 dfas despues de la inyeccion de celulas tumorales.

Las PBMC redujeron el crecimiento del tumor de RAJI o Namalwa en hasta un 75 % en ausencia de expresion de CD200. Por el contrario, el crecimiento de tumores de RAJI o Namalwa que expresaban CD200 a niveles comparables con CLL no se redujo con las PBMC. La administracion de anticuerpos anti-CD200 a 5 mg/kg dio como resultado una inhibicion del crecimiento tumoral casi completa (1/10 ratones desarrollaron un tumor pequeno) en el transcurso del estudio incluso cuando el tratamiento comenzaba 7 dfas despues de la inyeccion de celulas tumorales.

La presencia de CD200 humano en celulas tumorales inhibe la capacidad de los linfocitos humanos para erradicar las celulas tumorales. El tratamiento de tumores que expresan CD200 con anticuerpos anti-CD200 antagonistas inhibe el crecimiento tumoral, lo que indica el potencial para la terapia anti-CD200 como un enfoque prometedor para la CLL.

C) Eficacia de C2aB7G1 con respecto a construcciones de C2aB7G2/G4

Para evaluar si los anticuerpos anti-CD200 sin funcion efectora (construcciones de fusion de G2/G4 de C2aB7 como se describe a continuacion) son igualmente o mas eficaces que las construcciones de G1, se sometieron a ensayo las versiones G1 y G2/G4 asf como la version humanizada de C2aB7 (alxn5200) en el modelo de Raji_CD200/PBL. Las celulas RAJI transducidas con CD200 como se ha descrito anteriormente se inyectaron por s.c. en ratones NOD.CB17-Prkdc<scid>, y se evaluo la capacidad de los PBL para reducir el crecimiento tumoral en presencia o ausencia de anticuerpos c2aB7G1 anti-CD200 quimericos (c2aB7), c2aB7G2/G4 o las versiones humanizadas, hC2aB7V3V1G1 (V3V1), o hC2aB7V3V2G1 (V3V2), o anticuerpo de control alxn4100. Los anticuerpos a concentraciones indicadas a continuacion se administraron inicialmente con las celulas tumorales y a continuacion dos veces/semana por i.v. Se establecieron los siguientes grupos con 10 ratones cada uno:

Grupo 1: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c.

Grupo 2: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL

Grupo 3: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 20 mg/kg de hV3V2-G1

Grupo 4: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 5 mg/kg de alxn 5200

Grupo 5: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 2,5 mg/kg de alxn 5200

Grupo 6: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 1 mg/kg de alxn 5200

Grupo 7: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 20 mg/kg de chC2aB7G2/G4

Grupo 8: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 5 mg/kg de chC2aB7G2/G4

Grupo 9: 4 x 106 RAJI _CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 2,5 mg/kg de chC2aB7G2/G4

Grupo 10: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 1 mg/kg de chC2aB7G2/G4

Grupo 11: 4 x 106 RAJI_CD200 por s.c. 6 x 106 PBL 20 mg/kg de alxn4100

La longitud y el ancho del tumor se midieron tres veces a la semana, y el volumen del tumor se calculo con longitud del tumor*ancho*ancho/2. La Figura 19 muestra que, como se esperaba, la expresion de CD200 en las celulas tumorales evitaba que las celulas inmunitarias redujeran el crecimiento del tumor. Sin embargo, la adicion de anticuerpos anti-CD200 reducfa el volumen del tumor en hasta un 100 %. Aunque 20 mg/kg de C2aB7G1 daban como resultado el crecimiento de pequenos tumores en 6/10 ratones, solamente a 1 raton decrecieron tumores en el grupo tratado con 20 mg/kg de C2aB7G2/G4, lo que sugiere que la version de G2/G4 podna dar como resultado una eficacia mejor o al menos igual que la de la version G1. Todos los anticuerpos anti-CD200, incluyendo las versiones humanizadas, bloqueaban completamente el crecimiento del tumor a 5 mg/kg. El tratamiento con el anticuerpo de control no reducfa el crecimiento del tumor. Estos datos demuestran que la version de G2/G4 de C2aB7 es altamente eficaz en el bloqueo del crecimiento del tumor de tumores que expresan CD200. Estos datos confirman adicionalmente que las versiones humanizadas de C2aB7 son altamente eficaces en el bloqueo del crecimiento del tumor en este modelo.

D) Generacion de la construccion de G2/G4

Los plasmidos se alteraron en dos etapas, en primer lugar reemplazando la region de IgG1 de un sitio Age I en la region CH1 humana a traves del codon de parada a un sitio BamH I localizado despues de la senal poli A de SV40. C2aB7-6 y cC7 G2G4 (anticuerpo L-SIGN) se digirieron con Age I y BamH I, y C2aB7-6 se trato con ClP. Un fragmento de 10.315 pb de C2AB7-6 y un fragmento de 1752 pb de cC7 G2G4 se purificaron por electroforesis y extraccion en gel. Estos fragmentos se ligaron, se sometieron a electroporacion en XL1 Blue E. coli, y se sembraron en placas LB/carb/gluc. Las colonias se cultivaron en solucion y el ADN se aislo usando columnas de miniprep de Qiagen. La presencia del fragmento Age I/BamH I de IgG2G4, en oposicion al fragmento de IgG1, se determino mediante digestion con Pvu II que da como resultado la presencia de dos bandas de 267 y 1152 pb en oposicion a una banda de 1419 pb. El clon 21 se selecciono para su uso adicional.

El resto de la region CH1 desde el extremo de la region variable al sitio Age I se genero en un formato de IgG2/G4 by usando PCR de solapamiento. El fragmento de PCR que contema el comienzo de la region CH1 a traves del sitio Age I se habfa generado previamente en la produccion del plasmido cC7 G2G4. Los cebadores C7mhHF (TCCTCAGCCTCCACCAAGGGCC, SEQ ID NO: 1) y Rev Age Pri (GGGCGCCTGAGTTCCACGAC, SEQ ID NO: 2) se usaron en una reaccion de PCR con G2G4 63L1D como molde para generar un fragmento de 142 pb. Los cebadores C2aB7 rev (GGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAAACTGTGAGAGTGGTGC, SEQ ID NO: 3) y lacpri (GCTCCCGGCTCGTATGTTGTGT, SEQ ID NO: 4) se usaron con Fab C2aB7 como molde para generar la region variable de cadena pesada de murino (y material cadena arriba) en un fragmento de aproximadamente 1250 pb. Estos fragmentos se purificaron por electroforesis y extraccion en gel y se usaron en PCR de solapamiento con los cebadores Rev Age Pri (GGGCGCCTGAGTTCCACGAC, SEQ ID NO: 2) y LeadVHpAX (AT ATGAAAT AT CT GCTGCCGACCG, SEQ ID NO: 5) para generar un fragmento de 558 pb que se purifico en una columna de purificacion de PCR. Este fragmento de 558 pb y el clon 21 se digirieron con Xho I y Age I para generar un fragmento de 458 pb que se purifico por electroforesis y extraccion en gel. El clon 21 tambien se digirio con Xho I y Age I, se trato con CIP, y un fragmento de 11,6 kb se purifico por electroforesis y extraccion en gel. Estos fragmentos se ligarony se sometieron a electroporacion en XL1 Blue E. coli y se sembraron en placas LB/carb/gluc. Se observo que el clon C2aB7G2G4,11 presentaba los fragmentos de restriccion esperados cuando se digena con Pvu II.

La construccion final, C2AB7G2G4.11 se secuencio. Se descubrio que el codon de parada, TAA, de la cadena ligera se habfa mutado a la secuencia TCA de modo que una cantidad adicional de 6 aminoacidos se podnan anadir al extremo en la posicion carboxi terminal de la cadena ligera. Se encontro que estaba presente en el clon C2AB7-6 de la version de IgG1 que era el precursor para C2AB7G2G4.11. Los anticuerpos que contienen la construccion de G2G4 se representan en las Figs 10, 11, 12, 13, y 15.

EJEMPLO 2

Expresion de CD200 en celulas cancerosas

A. Determinacion de la regulacion positiva de CD200 en pacientes con CLL

Los linfocitos de 15 pacientes con CLL se tineron con anti-CD5 conjugado con FITC (e-bioscience), anti-CD19 conjugado con APC (e-bioscience) y anti-CD200 conjugado con PE (Serotec). Los linfocitos de donantes sanos que tineron en consecuencia. La expresion de CD200 en celulas CD5+CD19+ se determino. Como se muestra en la Fig. 20, aunque el nivel de expresion de CD200 variaba entre muestras de pacientes con CLL, todas las muestras de CLL presentaban niveles elevados (intervalo de 1,6-4 veces) de expresion de CD200 mas elevada en comparacion con la expresion de CD200 en linfocitos B normales. Los pacientes con CLL que presentaban niveles elevados de expresion de CD200 se seleccionan para tratamiento anti-CD200 de acuerdo con los metodos que se describen en el presente documento.

B. Analisis de FACS en lrneas de celulas de cancer

La expresion de CD200 se evaluo mediante analisis de FACS usando un panel de lineas de celulas NCI60 de pacientes con melanoma, pacientes con cancer de prostata, pacientes con glioblastoma, pacientes con astrocitoma, pacientes con neuroblastoma, pacientes con cancer de ovario, pacientes con cancer de pulmon y pacientes con cancer renal. El C2aB7 se etiqueto con Zenon-Alexa488 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). De medio millon a 1 millon de celulas se tineron con 1 |jg del anticuerpo etiquetado durante 20 min, seguido de un lavado con PBS. La tincion celular se evaluo usando un FACSCalibur (Becton Dickinson). La tincion de las celulas etiquetadas con anticuerpos se comparo con las muestras que permanedan sin etiquetar y se determino la proporcion de celulas tenidas/sin tenir. En la Fig. 21, una proporcion superior a 1 pero inferior a 2 se indica como /-, una proporcion entre 2 y 3 es , entre 3 y 10 es +, >10 es ++. Ninguna de las lrneas celulares sometidas a ensayo para glioblastoma, astrocitoma, cancer de prostata o pulmon expresaban CD200, y no se indican a continuacion. Cuatro de 5 lrneas de celulas de melanoma, 2/2 lrneas de celulas de cancer de ovario, 2/3 lrneas de celulas renales, 2/2 lrneas de celulas de neuroblastoma y 1/3 lrneas de celulas de cancer de mama sometidas a ensayo expresaban CD200 a niveles detectables en la superficie celular, lo que sugiere que algunos tumores solidos tambien podnan usar CD200 como un mecanismo de escape inmunitario.

C. RT-OPCR en muestras de pacientes

Para verificar si CD200 esta regulado de forma positiva no solamente en lrneas celulares, sino tambien en muestras de pacientes primarios, se realizaron RT-QPCR e inmunohistoqmmica (IHC) en muestras de pacientes primarios. Las muestras de ARNm de pacientes con cancer de ovario y melanoma se obtuvieron a partir de Cytomix. El ADNc se preparo y las muestras se diluyeron a 1:100 y 1:1000 en 10 ng/ml de ARNr de levadura. Las muestras se desarrollaron para QPCR con ensayo de CD200 de Hs00245978_ml como se proporciona por ABI. Para normalizacion de 18S, el ensayo de 18S (ABI) se desarrollo con muestras diluidas a 1:10.000. Cada dilucion se realizo por duplicado. Las muestras de paciente de con cancer ovario y melanoma, junto con muestras de paciente con CLL se normalizaron a 18S, a continuacion se determino el numero de veces de expresion con respecto a PBL normal. La Figura 22 muestra la expresion de CD200 en muestras de cancer de ovario. Parece que las muestras serosas/metastasicas serosas/papilares serosas tienen la expresion de CD200 mas elevada de aproximadamente 10 a 20 veces mas elevada que el PBL normal. La expresion de CD200 era relativamente baja en muestras de celulas endometrioides, mucinosas, y de celulas transparentes, todas a o por debajo de los niveles de expresion de ovarios normales (1-5 veces mas elevadas que el PBL normal). La Fig. 23 muestran los niveles de expresion de CD200 de varias muestras de metastasis de melanoma: yeyuno, intestino delgado, ganglio linfatico, pulmon, piel, y cerebro). Varias de estas muestras se emparejan como normal/tumor, indicado por el numero (-1 par o -2 par). Otras muestras adicionales sin normales emparejadas tambien se desarrollaron para comparacion. Las muestras de yeyuno mostraban niveles de expresion de CD200 significativamente mas elevados que el organo normal, con las nuestras metastaticas aproximadamente 4-7 veces mas elevadas que las de yeyuno normal.

D. Inmunohistoqmmica en muestras de paciente primario

IHC se realizo en 2 muestras de pacientes de melanoma congelado (LifeSpan). Los fragmentos D1B5 y C2aB7 de Fab se usaron para tincion. Un anticuerpo de IgG1 se uso como control de isotipo. La union de los anticuerpos primarios se detecto con un anticuerpo secundario anti-raton y cromogeno con DAB.

Como se muestra en la Figura 24, ambas muestras de melanoma sometidas a ensayo presentaban fuerte tincion de la membrana con los anticuerpos anti-CD200, pero ninguna tincion con el control de isotipo. El tejido de piel normal no presentaba tincion de CD200. Estos datos demuestran que CD200 no esta solamente regulado de forma positiva en lrneas de celulas de melanoma y de cancer de ovario, sino tambien en muestras de pacientes primarios.

E. Evasion inmunitaria de celulas de melanoma y de tumor de ovario a traves de regulacion positiva de la molecula inmunosupresora CD200

El escape inmunitario es una caractenstica fundamental de la evolucion del cancer. Los tumores se pueden escapar del sistema inmunitario mediante multiples mecanismos, cada uno una barrera significativa para inmunoterapia. La puesta en practica de formas nuevas y mas eficaces de inmunoterapia requerira la comprension de estos procesos asf como sus similitudes y diferencias a traves de los canceres. Los inventores identificaron anteriormente que la molecula CD200 inmunosupresora estaba regulada de forma positiva en celulas de leucemia linfodtica cronica. La presencia de CD200 regular de manera negativa la produccion de la citoquina Th1 requerida para una despues la ciclar a linfocitos T citotoxicos. Los inventores demostraron en modelos animales que la expresion de CD200 por celulas tumorales humanas evita que los linfocitos humanos rechacen el tumor, y el tratamiento con un anticuerpo anti-CD200 antagonista inhida el crecimiento tumoral. En este estudio, los inventores evaluaron si la regulacion de forma positiva de CD200 se encuentra en otros canceres, y si la expresion de CD200 en estas celulas influye en la respuesta inmunitaria.

Los niveles relativos de mensaje de CD200 se cuantificaron por RT-QPCR en muestras de pacientes con metastasis de adenocarcinoma de ovario (seroso/metastasico seroso/seroso papilar, endometrioide, mucinoso, celulas transparentes) y con metastasis de melanoma maligno.

La expresion de CD200 en la superficie celular se evaluo con IHC en dos muestras de tejido congelado de pacientes con melanoma y tres con carcinoma de ovario (seroso) en comparacion con piel normal y ovarios normales. La expresion de c D200 en la superficie de la celula de las lmeas de celulas SK-MEL-5, SK-MEL-24 y SK-MEL-28 de cancer melanoma y la lmea de celulas de cancer de ovario, OVCAR-3, se evaluo con analisis de FACS usando un anticuerpo anti-CD200 etiquetado con PE. El efecto de las lmeas de celulas de cancer que expresan CD200 en el perfil de citoquina mezclado en reacciones linfocitarias se evaluo mediante la adicion de celulas a un cultivo de celulas dendnticas derivadas de monocitos humanos con linfocitos T humanos alogeneicos. La produccion de citoquinas (IL-2 e IFN-y para Th1, IL4 e IL10 para Th2) se detecto en el sobrenadante mediante ELISA.

La PCR cuantitativa mostraba niveles de expresion de CD200 en muestras de adenocarcinoma de ovario seroso a un nivel hasta 20 veces mas elevado que el PBL normal, el igual a o hasta 4 veces mas elevado que en el ovario normal. La expresion de CD200 estaba a o por debajo de los niveles de ovario normal en muestras de adenocarcinoma de ovario endometrioide, mucinoso, y de celulas transparentes. En metastasis de melanoma maligno al yeyuno, pareda que los niveles de expresion de CD200 eran significativamente mas elevados que los de las muestras normales. En las metastasis de pulmon de melanoma maligno, 2/6 presentaban expresion de CD200 mas elevada que en las muestras normales.

IHC presentaba tincion de CD200 asociada con la membrana, espedfica, fuerte en celulas malignas de ambos pacientes con melanoma. La muestra de piel normal presentaba una tincion debil de celulas endoteliales. Entre tres pacientes con cancer de ovario, uno presentaba una tincion de CD200 fuerte, uno la presentaba moderadamente positiva, y una presentaba subconjuntos de celulas tumorales debilmente tenidas. En los tres casos, el estroma presentaba una tincion fuerte.

CD200 estaba altamente expresado en la superficie celular de las lmeas de celulas de cancer melanoma, SK-MEL-24 y SK-MEL-28, asf como en la lmea OVCAR-3 de celulas de cancer de ovario, y estaba expresado de forma moderada en la lmea de celulas de melanoma SK-MEL-5. La adicion de cualquiera de estas lmeas celulares a una reaccion linfocitaria mixta regulaba de manera negativa la produccion de citoquinas Th1, mientras que las lmeas de celulas que no expresaban CD200 no lo hadan. Lo que demuestra una correlacion directa. La inclusion de un anticuerpo anti-CD200 antagonista durante el cultivo anulaba el efecto.

Las celulas de melanoma y de tumor de ovario pueden regular de forma positiva a CD200, suprimiendo de este modo de forma potencial una respuesta inmunitaria eficaz. La terapia con un anti-CD200 antagonista podna permitir que el sistema inmunitario aumentara una respuesta citrato si cae eficaz frente a las celulas tumorales.

F. Efecto de lmeas de celulas de cancer, que expresan CD200 en perfiles de citoquina en reacciones linfocitarias mixtas

La capacidad de las celulas que sobreexpresan CD200 para desplazar la respuesta de las citoquinas a partir de una respuesta de TH1 (IL-2, IFN-y) a una respuesta de Th2 (IL-4, IL-10) se evaluo en una reaccion linfocitaria_mixta. Como una fuente de celulas que expresan CD200, se usaron cualquiera de celulas transfectadas con CD200 o celulas de lmeas de celulas de cancer positivas para CD200.

Las reacciones linfocitarias mixtas se desarrollaron en placas de 24 pocillos usando 250.000 celulas dendnticas maduradas a partir de monocitos perifericos humanos usando IL-4, GM-CSF e IFN-y y 1 x 106 celulas que responden. Las celulas que responden eran linfocitos enriquecidos con linfocitos T purificados a partir de sangre periferica usando Ficoll. Los linfocitos T se enriquecieron incubando las celulas durante 1 hora en Matraces de cultivo celular y tomando la fraccion de celulas no adherentes. 500.000 celulas de las lmeas de celulas de cancer melanoma, SK-MEL-1, SK-MEL-24, SK-MEL-28, la lmea de celulas de cancer de ovario OVCAR3 y la lmea de celulas de linfoma no Hodgkin Namalwa o celulas de CLL primaria como control positivo se anadieron a las celulas dendnticas en presencia o ausencia de 30 pg/ml de anticuerpo anti-CD200. Los sobrenadantes se recogieron despues de 48 y 68 horas y se analizaron para la presencia de toxinas.

Las citoquinas tales como IL-2, IFN-y, e IL-10 encontradas en el sobrenadante de cultivo tisular se cuantificaron usando ELISA. Los pares de anticuerpos de captura y deteccion emparejados para cada citoquina se obtuvieron en R+D Systems (Minneapolis, MN), y una curva patron para cada citoquina se produjo usando citoquina humana recombinante. El anticuerpo de captura anti-citoquina se revistio en la placa en p Bs a la concentracion optima. Despues de un periodo de incubacion de una noche, las placas se lavaron y se bloquearon durante 1 hora con PBS que contema BSA al 1 % y sacarosa al 5 %. Despues de 3 lavados con PBS que contema Tween al 0,05 %, los sobrenadantes se anadieron a funciones de dos veces o diez veces en PBS que contema BSA al 1 %. Las citoquinas capturadas se detectaron con el anticuerpo anti-citoquina biotinilado apropiado seguido de la adicion de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina y sustrato SigmaS. El desarrollo del color se evaluo con un lector de placas de ELISA (Molecular Devices).

Como se muestra en la Figura 25A, la presencia de lmeas celulares con expresion de CD200 elevada (MEL-24, MEL-28, OVCAR-3) dio como resultado la regulacion de forma negativa de las citoquinas es Th1 tales como IL-2 e IFN-y. Por el contrario, la adicion de MEL-1 (expresion de CD200 baja) o Namalwa (sin expresion de CD200) no influyan en el perfil de citoquina. La adicion del anticuerpo anti-CD200, hB7VH3VL2, a 50 |jg/ml restableda completamente la respuesta de Th1 (Figura 25B), lo que indica que el tratamiento de pacientes con melanoma o cancer de ovario con el anticuerpo anti-CD200 podna ser terapeuticamente beneficioso.

EJEMPLO 3

Eliminacion de linfocitos T activados por C2aB7-G1 y sus derivados

Para evaluar si el tratamiento anti-CD200 tiene un efecto en un modelo de cancer usando celulas tumorales que no expresan CD200, se inyectaron celulas Namalwa y PBL humanas en ratones NOD/SCID, y los ratones se trataron como se detalla a continuacion. En este modelo, CD200 solo esta presente en celulas inmunitarias que expresan CD200 de forma natural tal como linfocitos B y linfocitos auxiliares T foliculares.

Diseno del grupo

10 animales/grupo

Grupo 1: 4 x 106 Namalwa s.c.

Grupo 2: 4 x 106 Namalwa s.c. 8 x 106 PBL

Grupo 3: 4 x 106 Namalwa s.c. 8 x 106 PBL 20 mg/kg de hV3V2-G1

Grupo 4: 4 x 106 Namalwa s.c. 8 x 106 PBL 5 mg/kg de hV3V2-G1

Grupo 5: 4 x 106 Namalwa s.c. 8 x 106 PBL 2,5 mg/kg de hV3V2-G1

Grupo 6: 4 x 106 Namalwa s.c. 4 x 106 PBL

Grupo 7: 4 x 106 Namalwa s.c. 8 x 106 PBL 20 mg/kg de chC2aB7-G2G4

Grupo 8: 4 x 106 Namalwa s.c. 8 x 106 PBL 5 mg/kg de chC2aB7-G2G4

Grupo 9: 4 x 106 Namalwa s.c. 8 x 106 PBL 2,5 mg/kg de chC2aB7-G2G4

Grupo 10: 4 x 106 Namalwa s.c. 4 x 106 PBL 20 mg/kg de chC2aB7-G2G4

Grupo 11: 4 x 106 Namalwa s.c. 8 x 106 PBL 20 mg/kg de alxn4100

1/10° de la dosis estaba incluida en la mezcla de inyeccion. La dosificacion posterior fue 2x/semana por i.v. durante 3 semanas.

La longitud (L) y el ancho (A) del tumor se midieron 3 veces/semana y los volumenes del tumor se calcularon con L*A*A/2. La Figura 26 muestra que, como se ha establecido anteriormente, la inyeccion simultanea de PBL humanos con celulas Namalwa inhibe el crecimiento del tumor. No se observo efecto de chC2aB7-G2G4 en la inhibicion del crecimiento del tumor mediado por PBL. Por el contrario, la administracion de ALXN5200 (hB7VH3VL2-G1) bloqueaba la inhibicion del crecimiento del tumor mediado por PBL. En ausencia de CD200 en las celulas tumorales, parece que el tratamiento con anticuerpo anti-CD200 con un anticuerpo que media la funcion efectora tal como algunas construcciones de G1, se eliminan celulas receptoras fundamentales en la poblacion de PBL. Estos datos sugieren que la terapia para el cancer anti-CD200 es menos eficaz cuando se esta usando un anticuerpo con funcion efectora en comparacion con el uso del anticuerpo sin funcion efectora. Sin embargo, el tratamiento anti-CD200 usando una construccion con funcion efectora podna ser terapeuticamente beneficioso en situaciones en las que se desea la eliminacion de celulas inmunitarias tal como en el entorno de trasplantes o enfermedades autoinmunitarias.

EJEMPLO 4

Eliminacion de linfocitos T con hB7VH3VL2

Para evaluar si la incubacion de linfocitos T activados con anticuerpos anti-CD200 que contienen una region constante que media la funcion efectora (por ejemplo G1) da como resultado la eliminacion de los linfocitos T, los linfocitos T se activaron y se desarrollaron ensayos de eliminacion como se describe a continuacion.

A). Aislamiento de linfocitos T CD3+

Los linfocitos de sangre periferica humana (PBL) se obtuvieron a partir de voluntarios sanos normales mediante centrifugacion por gradiente de densidad de sangre heparinizada usando el Sistema Accuspin™. Se anadieron quince ml de Histopaque-1077 (Sigma, St. Louis, MO; n.° de cat H8889) se anadio a cada tubo Accuspin (Sigma, St. Louis, MO; n.° de cat A2055) que a continuacion se centrifugo a 1500 rpm durante 2 minutos de modo que se permitio que el Histopaque pasara a traves de la frita. Treinta ml de sangre completa se depositaron en capas sobre la frita y los tubos se centrifugaron durante 15 minutos a 2000 rpm a temperatura ambiente sin freno. La superficie de contacto de PBL se recogio y las celulas mononucleares se lavaron dos veces en PBS con suero bovino fetal inactivado con calor al 2 % (FBS) (Atlas Biologicals, Ft. Collins, CO; n.° de cat F-0500-D) con una centrifugacion de 1200 rpm durante 10 minutos. Los linfocitos T D3+ se aislaron mediante pasaje sobre una columna HTCC-5 (R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las celulas eluidas se lavaron, se hizo recuento y se volvieron a suspender en RPMI 1640 que contema suero de donante individual inactivado por calor al 5 %, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 mM y penicilina/estreptomicina.

B. Activacion con mOKT3 unido a placa

Los pocillos de placas de 12 pocillos (Falcon) se revistieron con un periodo de incubacion de una noche a 4 °C con 10 |jg/ml de mOKT3 (Orthoclone) diluido en PBS. El anticuerpo residual se retiro y las placas se aclararon minuciosamente con PBS. Los linfocitos T CD3+ purificados, aislados como se ha descrito anteriormente, se anadieron a las placas a una concentracion final de 2 x 106/pocillo en RPMI 1640 que contema suero de donante individual inactivado por calor al 5 %, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 mM y penicilina/estreptomicina. Las celulas se mantuvieron durante 72 horas a 37 °C en una incubadora unificada que contema CO²al 5 %.

C. Etiquetado con 51cromo de celulas diana CD3+ activadas con mOKT3

Al final del periodo de cultivo, las celulas CD3+ activadas con mOKT3 se cosecharon, se lavaron y se volvieron a suspender a 107 celulas/ml en RPMI 1640 sin suero. Las celulas se sometieron a cromo mediante la adicion de 125 jC i de 51Cromo (Perkin Elmer, Billerica, MA)/106 celulas durante 2 horas a 37 °C. Las celulas etiquetadas se cosecharon, se lavaron en RPMI que contema suero de donante individual inactivado por calor al 5 % y se volvieron a suspender a una concentracion final de 2 x 105 celulas/ml en el mismo medio.

D. Preparacion de linfocitos NK efectores autologos

Los linfocitos de sangre periferica humana (PBL) del mismo individuo se obtuvieron como se ha descrito anteriormente mediante centrifugacion por gradiente de densidad. La superficie de contacto de PBL se recogio y las celulas mononucleares se lavaron dos veces en PBS con suero bovino fetal inactivado con calor al 2 % (FBS) (Atlas Biologicals, Ft. Collins, CO; n.° de cat F-0500-D) con una centrifugacion de 1200 rpm durante 10 minutos. Las celulas CD56+ se aislaron mediante seleccion positiva sobre perlas magneticas conjugadas con anti-CD56 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA, n.° de cat 120-000-307) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las celulas eluidas se lavaron, se hizo recuento y se volveran a suspender a 1,3 x 106 celulas/ml en RPMI 1640 que contema suero de donante individual inactivado por calor al 5 %, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 mM y penicilina/estreptomicina. Las celulas se incubaron durante una noche a 37 °C en una incubadora unificada que contema CO²al 5 % a una concentracion final de 4 x 106 celulas/pocillo en 3 ml del mismo medio. Al final del periodo de cultivo, las celulas se cosecharon, se lavaron, se hizo recuento, y se volvieron a suspender en medio que contema RPMI sin suelo, L-glutamina 2 mM, Hepes 10 mM, 2 x 10'5 M 2- mercaptoetanol y penicilina/estreptomicina.

E. Ensayo de ADCC

Las celulas CD3+ diana activadas con mOKT3 etiquetadas con 51Cr preparadas como se ha descrito anteriormente se distribuyeron en pocillos de una placa de 96 pocillos a 104 celulas/pocillos en 50 jl. Las celulas efectoras CD56+ se cosecharon, se lavaron, se hizo recuento y se volvieron a suspender a cualquiera de 2,5 x 106 celulas/ml (para una proporcion de celula efectora:diana de 25:1) o 106 celulas/ml (para una proporcion de celula efectora: diana de 10:1) y se distribuyeron (100 jl/pocillo) a pocillos que conteman las celulas diana. Se anadieron diluciones de diez veces de anticuerpos anti-CD200 (V3V2-G1 o V3V2-G2/G4) a las celulas efectoras y dianas para concentraciones finales de 10, 1, 0,1 y 0,01 jg/ml. Los controles de ensayo incluyan los siguientes: 1) efectores y dianas en ausencia de anticuerpo (0 Ab); 2) celulas diana en ausencia de efectores (lisis espontanea) y 3) efectores y dianas incubados con Tween-80 al 0,2 % (liberacion maxima). Todas las condiciones de cultivo celular se realizaron por triplicado. Las celulas se incubaron a 37 °C durante 4 horas en una incubadora unificada que contema CO²al 5 %. Al final del periodo de cultivo, las placas se centrifugaron para sedimentar las celulas y 150 j l de sobrenadante celular se transfirio habfa desde centelleo ffsico recuento en un contador de centelleo gamma (Wallac). Los resultados se expresan como porcentaje de crisis espedfica de acuerdo con la siguiente formula:

(Recuentos medies per mintito de la muesti a (cpm) - lisis espontanea media) x 100

(lisis maxima media - lisis espontanea media)

F. Citometria de flujo

Cien |jl de suspensiones celulares (celulas CD3+ activadas con mOKT3 o linfocitos NK CD56+ purificados) preparados como se ha descrito anteriormente se distribuyeron a los pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Falcon, Franklin Lakes NJ; n.° de cat 353077). Las celulas se incubaron durante 30 minutos a 4 °C con las combinaciones indicadas de los siguientes: anticuerpos conjugados con isotiocianato de fluorescema (FITC), ficoeritrina (PE) , PerCP-Cy5.5, o aloficocianina (APC) (todos de Becton-Dickinson, San Jose, CA); CD25-FITC anti-humano (n.° de cat 555431); CD3-APC anti-humano (n.° de cat 555335); CD200-PE anti-humano (n.° de cat 552475); CD8-PerCP-Cy5.5 anti-humano (n.° de cat 341051); CD4-APC anti-humano (n.° de cat 555349); CD5-APC anti-humano (n.° de cat 555355) y CD56-APC anti-humano (n.° de cat 341025). Los controles de isotipo para cada anticuerpo etiquetado tambien se incluyeron. Despues de lavar las celulas dos veces con tampon FACS (centrifugacion de 1800 rpm durante 3 minutos), las celulas se volvieron a suspender en 300 j l de PBS (Mediatech, Herndon, VA; n.° de cat 21-031-CV) y se analizaron mediante citometna de flujo usando una maquina FacsCaliber y el software CellQuest (Becton Dickinson, San Jose, CA).

Como se muestra en la Figura 27, los linfocitos T activados muestran una expresion de CD200 elevada en su superficie. Los linfocitos T activados se eliminan de forma eficaz en presencia de VH3VL2-G1 pero no con VH3VL2-G2G4 cuando los linfocitos NK se usan como cedulas efectoras (Figura 28). Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-CD200 con funcion efectora pueden eliminar los linfocitos T activados. Un anticuerpo de este tipo podna tener un uso terapeutico en el entorno de trasplantes o para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

Ademas de los linfocitos T reguladores, se ha mostrado que las celulas dendnticas plasmacitoides desempenan un papel en la inmunoregulacion negativa en cancer humano (Wei S, Kryczek I, Zou L, Daniel B, Cheng P, Mottram P, Curiel T Lange A, Zou W Plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ regulatory T cells in human ovarian carcinoma. Cancer Res. 15 de junio de 2005; 65 (12): 5020-6). Por lo tanto, una combinacion de una terapia que elimina las celulas dendnticas plasmacitoides con terapia anti-CD200 podna ser ventajosa.

EJEMPLO 5

CD200 en celulas plasmaticas

Las celulas de medula osea de 10 pacientes con mieloma multiple y 3 donantes normales se prepararon pisando en primer lugar los globulos rojos usando cloruro de amonio. Las celulas se volvieron a suspender en tampon FACS y se etiquetaron con los siguientes cocteles de anticuerpo:

• Kappa-FITC/CD38-PE/CD138-PerCP-Cy5.5

• Lambda-FITC/CD38-PE/CD138-PerCP-Cy5. 5

• Control de Isotipo-FITC/CD38-PE

• CD200-FITC/CD38-PE

Los datos se recogieron usando un BD FACS Canto y se analizaron usando el software DiVA de BD. La expresion de CD200 en celulas brillantes CD38 (celulas plasmaticas) se analizo. Como se muestra en la Fig. 29, una parte de las celulas plasmaticas se expresa CD200 a densidad elevada en donantes normales. En pacientes con mieloma multiple, la mayona de las celulas plasmaticas expresan CD200.

En el entorno del mieloma multiple, al igual que CLL u otros canceres que expresan CD200, la expresion de CD200 por celulas tumorales podna evitar que el sistema inmunitario erradicar a las celulas tumorales. Posteriormente, la terapia anti-CD200 antagonista podna permitir que el sistema inmunitario eliminaran las celulas cancerosas. La terapia anti-CD200 de ablacion que se dirige a celulas plasmaticas podna ser terapeuticamente beneficiosa en el entorno autoinmunitario o de trasplante.

EJEMPLO 6

CD200 en virus

CD200 tambien se expresa en una serie de virus tales como virus M141R de mixoma o virus 8 del herpes humano. Al igual que la expresion de CD200 en celulas tumorales, CD200 en virus podna evitar que el sistema inmunitario eliminara de forma eficaz del virus. El tratamiento con un anticuerpo anti-CD200 antagonista podna ser terapeuticamente beneficioso en una infeccion con un virus que expresa CD200, permitiendo que el sistema inmunitario erradique el virus. Como alternativa, se podna usar un anticuerpo anti-CD200 de ablacion.

Se entendera que se pueden realizar diversas modificaciones en las realizaciones desveladas en el presente documento. Por ejemplo, , observaran los expertos en la materia, las secuencias espedficas descritas en el presente documento se pueden alterar ligeramente sin influir necesariamente de forma adversa en la funcionalidad del polipeptido, anticuerpo o fragmento de anticuerpo usado en la union a OX-2/CD200. Por ejemplo, frecuentemente se pueden realizar funciones de uno o multiples aminoacidos en la secuencia del anticuerpo sin destruir la funcionalidad del anticuerpo o fragmento. Por lo tanto, se debena entender que algunos polipeptidos o anticuerpos que tienen un grado de identidad superior a un 70 % con respecto a los anticuerpos espedficos descritos en el presente documento estan dentro del alcance de la presente divulgacion. En realizaciones particularmente utiles, se contemplan algunos anticuerpos que tienen una identidad superior a aproximadamente un 80 % con respecto a los anticuerpos espedficos descritos en el presente documento. En otras realizaciones utiles, se contemplan los anticuerpos que tienen una identidad superior a aproximadamente un 90 % con respecto a los anticuerpos espedficos descritos en el presente documento. Por lo tanto, la descripcion mencionada anteriormente no se debena interpretar como limitante, sino simplemente como ejemplos de realizaciones preferentes. Los expertos en la materia concebiran otras modificaciones dentro del alcance y espmtu de la presente divulgacion.

REFERENCIAS

1) Agarwal, et al., (2003). Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients with intraoral squamous cell carcinoma. Immunol Invest 32: 17-30.

2) Almasri, NM et al., (1992). Am J Hemato 140259-263.

3) Contasta, et al., (2003). Passage from normal mucosa to adenoma and colon cancer: alteration of normal sCD30 mechanisms regulating TH1/TH2 cell functions. Cancer Biother Radiopharm 18: 549-557.

4) Gorczynski, et al., (1998). Increased expression of the novel molecule OX-2 is involved in prolongation of murine renal allograft survival. Transplantation 65: 1106-1114.

5) Gorczynski, et al., (2001). Evidence of a role for CD200 in regulation of immune rejection of leukaemic tumour cells in C57BL/6 mice. Clin Exp Immunol 126: 220-229.

6) Hainsworth, JD (2000). Oncologist 2000; 5 (5): 376-84.

7) Inagawa, et al., (1998). Mechanisms by which agentes quimioterapeuticos augment the antitumor effects of tumor necrosis factor: involvement of the pattern shift of cytokines from Th2 to Th1 in tumor lesions. Anticancer Res 18: 3957 3964.

8) Ito, et al., (1999). Lung carcinoma: analysis of T helper type 1 and 2 cells and T cytotoxic type 1 and 2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry. Cancer 85: 2359-2367.

9) Kiani, et al., (2003). Normal intrinsic Th1/Th2 balance in patients with chronic phase chronic myeloid leukemia not treated with interferon-alpha or imatinib. Haematologica 88: 754-761.

10) Lauerova, et al., (2002). Malignant melanoma associates with Th1/Th2 imbalance that coincides with disease progression and immunotherapy response. Neoplasma 49: 159-166.

11) Maggio, et al., (2002). Chemokines, cytokines and their receptors in Hodgkin's lymphoma cell lines and tissues. Ann Oncol 13 Supl 1: 52-56.

12) Nilsson, K (1992). Burn Cell. 5 (1): 25-41.

13) Podhorecka, et al., (2002). T type 1/type 2 subsets balance in B-cell chronic lymphocytic leukemia-the three-color flow cytometry analysis. Leuk Res 26: 657-660.

14) Pu, QQ y Bezwoda, W (2000). Anticancer Res. 20 (4): 2569-78.

15) Smyth, et al., (2003). Renal cell carcinoma induces prostaglandin E2 and T-helper type 2 cytokine production in peripheral blood mononuclear cells. Ann Surg Oncol 10: 455-462.

16) Tatsumi, et al., (2002). Disease-associated bias in T helper type 1 (Th1)/Th2 CD4(+) T cell responses against m Ag E-6 in HLA-Dr B10401(+) patients with renal cell carcinoma or melanoma. J Exp Med 196: 619-628.

17) Walls A V et al., (1989). Int. J Cancer 44846-853.

18) Winter, et al., (2003). Tumour-induced polarization of tumour vaccine-draining lymph node T cells to a type 1 cytokine profile predicts inherent strong immunogenicity of the tumour and correlates with therapeutic efficacy in adoptive transfer studies. Immunology 108: 409-419.

19) Cameron, C. M., J. W. Barrett, L. Liu, A. R. Lucas, y G. McFadden. 2005. Myxoma virus M141R expresses a viral CD200 (vOX-2) that is responsible for down-regulation of macrophage and T-cell activation in vivo. J Virol 79: 6052.

20) Foster-Cuevas, M., G. J. Wright, M. J. Puklavec, M. H. Brown, y A. N. Barclay. 2004. Human herpesvirus 8 K14 protein mimics CD200 in down-regulating macrophage activation through CD200 receptor. J Virol 78: 7667.

21) Nicholas, J. 2003. Human herpesvirus-8-encoded signalling ligands and receptors. J Biomed Sci 10: 475.

22) Shiratori, I., M. Yamaguchi, M. Suzukawa, K. Yamamoto, L. L. Lanier, T. Saito, y H. Arase. 2005. Down- regulation of basophil function by human CD200 and human herpesvirus-8 CD200. J Immunol 175: 4441.

23) Voigt, S., G. R. Sandford, G. S. Hayward, y W. H. Burns. 2005. The English strain of rat cytomegalovirus (CMV) contains a novel captured CD200 (vOX2) gene and a spliced CC chemokine upstream from the major immediate-early region: further evidence for a separate evolutionary lineage from that of rat c Mv Maastricht. J Gen Virol 86: 263. 24) Zhang, J., J. Wang, C. Wood, D. Xu, y L. Zhang. 2005. Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus/human herpesvirus 8 replication and transcription activator regulates viral and cellular genes via interferon-stimulated response elements. J Virol 79: 5640.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo anti-CD200, en el que el anticuerpo anti-CD200:

(i) inhibe la interaccion entre CD200 y CD200R; y

(ii) comprende una region constante Fc variante que:

(c) comprende una mutacion K322A en el dominio CH2 de acuerdo con el mdice EU;

o

(d) carece de una region bisagra.

2. El anticuerpo anti-CD200 de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimerico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo desinmunizado o un anticuerpo humano.

3. El anticuerpo anti-CD200 de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el anticuerpo comprende:

I.

(a) un polipeptido de cadena ligera que comprende:

(i) los restos de aminoacidos 21 a 127 de la SEQ ID NO: 24; o

(ii) los restos de aminoacidos 21 a 234 de la SEQ ID NO: 24; y

(b) un polipeptido de cadena pesada que comprende:

(iii) los restos de aminoacidos 21 a 137 de la SEQ ID NO: 15; o

(iv) los restos de aminoacidos 21 a 463 de la SEQ ID NO: 15;

II.

(a) un polipeptido de cadena ligera que comprende:

(i) los restos de aminoacidos 21 a 127 de la SEQ ID NO: 32; o

(ii) los restos de aminoacidos 21 a 234 de la SEQ ID NO: 32; y

(b) un polipeptido de cadena pesada que comprende:

(iii) los restos de aminoacidos 21 a 142 de la SEQ ID NO: 20;

III.

(a) un polipeptido de cadena ligera que comprende:

(i) los restos de aminoacidos 23 a 129 de la SEQ ID NO: 28; o

(ii) los restos de aminoacidos 23 a 236 de la SEQ ID NO: 28; y

(b) un polipeptido de cadena pesada que comprende:

(iii) los restos de aminoacidos 20 a 136 de la SEQ ID NO: 13; o

(iv) los restos de aminoacidos 20 a 462 de la SEQ ID NO: 13; o

IV.

(a) un polipeptido de cadena pesada que comprende:

(i) los restos de aminoacidos 20 a 136 de la SEQ I D NO: 11; o

(ii) los restos de aminoacidos 20 a 136 de la SEQ ID NO: 9; y

(b) un polipeptido de cadena ligera que comprende los restos de aminoacidos 23 a 129 de la SEQ ID NO: 26.

4. El anticuerpo anti-CD200 de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la region constante Fc variante no tiene actividad de ADCC o de CDC.