PT951295E

PT951295E - COMPOSIÃES PARA UTILIZAÃO NA INIBIÃO DE ANGIOGéNESE MEDIADA POR ALFA-V-BETA3

Info

Publication number: PT951295E
Application number: PT97928698T
Authority: PT
Inventors: Peter Brooks; David A Cheresh
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 1996-05-31
Filing date: 1997-05-30
Publication date: 2010-07-29
Also published as: US6500924B1; RU2194528C2; RU2195312C2; AU3218397A; AU733303C; SK163298A3; SK163598A3; AU733303B2; JP2000516201A; CN1226172A; AU738782B2; AU3289397A

Description

DESCRIÇÃO

"COMPOSIÇÕES PARA UTILIZAÇÃO NA INIBIÇÃO DE ANGIOGÉNESE MEDIADA POR ALFA-V-BETA3"

Campo Técnico A presente invenção refere-se, em geral, ao campo da medicina e refere-se, especificamente, a composições para utilização na inibição de angiogénese de tecidos, utilizando antagonistas do receptor de vitronectina ανβ3.

Antecedentes

Sabe-se que as integrinas são uma classe de receptores celulares que se ligam a proteínas de matriz extracelular e, por conseguinte, medeiam as interacções célula-célula e célula-matriz extracelular, referidas, em geral, como eventos de adesão celular. Contudo, embora muitas integrinas e os ligandos que se ligam a uma integrina estejam descritos na literatura, a função biológica de muitas das integrinas permanece inapreensível. Os receptores de integrina constituem uma família de proteínas com características estruturais partilhadas de complexos glicoproteicos heterodiméricos não covalentes, formados por subunidades cx e β.

Sabe-se, agora, que o receptor de vitronectina, denominado pela sua característica original de se ligar de um modo preferido à vitronectina, se refere a três integrinas 1 diferentes, designadas ανβι, ανβ3 e ανβ5. Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759 (1990). Ο ανβι liga-se à fibronectina e vitronectina. Ο ανβ3 liga-se a uma grande variedade de ligandos, incluindo fibrina, fibrinogénio, laminina, trombospondina, vitronectina, factor de von Willebrand, osteopontina e sialoproteína óssea I. Ο ανβ5 liga-se à vitronectina. Os papéis específicos de adesão celular que estas três integrinas desempenham, nas muitas interacções celulares em tecidos, estão ainda sob investigação mas é nítido que existem diferentes integrinas com diferentes funções biológicas.

Um importante sítio de reconhecimento no ligando para muitas integrinas é a sequência tripeptídica arginina-glicina-ácido aspártico (RGD). A RGD encontra-se na totalidade dos ligandos identificados anteriormente para as integrinas do receptor de vitronectina. Este sítio de reconhecimento RGD pode ser mimetizado por polipéptidos ("péptidos") que contêm a sequência RGD e tais péptidos RGD são inibidores conhecidos da função de integrina. Contudo, é importante notar que, dependendo da sequência e estrutura do péptido RGD, a especificidade da inibição pode ser alterada para visar integrinas específicas.

Para discussões do sítio de reconhecimento de RGD, ver Pierschbacher et al., Nature, 309:30-33 (1984) e Pierschbacher et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 81: 5985-5988 (1984). Diversos polipéptidos RGD, de especificidade de integrina variável, também foram descritos por Grant et al., Cell, 58:933-943 (1989), Cheresh et al., Cell, 58:945-953 (1989), Aumailley et ai., FEBS Letts., 291:50-54 (1991) e Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994) e nas Patentes 2 dos Estados Unidos N° 4517686, 4578079, 4589881, 4614517, 4661111, 4792525, 4683291, 4879237, 4988621, 5041380 e 5061693. A angiogénese é um processo de vascularização de tecidos que envolve o crescimento de novos vasos sanguíneos desenvolvendo-se num tecido e também é referida como neovascularização. O processo é mediado pela infiltração de células endoteliais e células de músculo liso. Pensa-se que o processo prossiga em qualquer uma de três formas: os vasos podem germinar a partir de vasos preexistentes, o desenvolvimento de novo de vasos pode surgir a partir de células precursoras (vasculogénese) ou os pequenos vasos existentes podem aumentar em diâmetro. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990). Sabe-se que as células endoteliais vasculares contêm, pelo menos, cinco integrinas dependentes de RGD, incluindo o receptor de vitronectina (ανβ3 ou oívPs) , os receptores de colagénio Tipos I e IV (αιβι) , o receptor de laminina (0ί2βι), o receptor de f ibronectina/laminina/colagénio (ο(3βι) e o receptor de fibronectina (οίδβι). Davis et ai., J. Cell. Biochem., 51:206-218 (1993). Sabe-se que a célula de músculo liso contém, pelo menos, seis integrinas dependentes de RGD, incluindo α5βι, ανβ3 e ανβ5 ·

A angiogénese é um importante processo no crescimento neonatal mas também é importante na cicatrização e na patogénese de uma grande variedade de doenças clínicas, incluindo inflamação de tecidos, artrite, crescimento tumoral, retinopatia diabética, degenerescência macular por neovascularização de retina e estados semelhantes. As manifestações clínicas associadas com a angiogénese são referidas como doenças angiogénicas. Folkman et al., Science, 235:442-447 (1987). A angiogénese está, em geral, ausente em tecidos adultos ou 3 maduros, embora ocorra na cicatrização e no ciclo de crescimento do corpo lúteo. Ver, por exemplo, Moses et ai., Science, 248:1408-1410 (1990).

Foi proposto que a inibição de angiogénese seria uma terapia útil para restringir o crescimento tumoral. A inibição de angiogénese foi proposta por (1) inibição da libertação de "moléculas angiogénicas", tal como bFGF (factor de crescimento de fibroblastos básico), (2) neutralização de moléculas angiogénicas, tal como por utilização de anticorpos anti-pbFGF e (3) inibição de resposta de célula endotelial a estímulos angiogénicos. Esta última estratégia tem recebido atenção e Folkman et al., Câncer Biology, 3:89-96 (1992) descreveram diversos inibidores de resposta de célula endotelial, incluindo inibidor de colagenase, inibidores de regeneração de membrana basal, esteróides angiostáticos, inibidores de angiogénese derivados de fungos, factor plaquetário 4, trombospondina, fármacos artríticos, tais como D-penicilamina e tiomalato de ouro, análogos de vitamina D3, interferão alfa, e semelhantes que possam ser utilizados para inibirem a angiogénese. Para inibidores adicionais de angiogénese propostos, ver Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988) e Patentes dos Estados Unidos N° 5092885, 5112946, 5192744 e 5202352. Nenhum dos inibidores de angiogénese descritos nas referências anteriores é visado na inibição de Οίνβ3 .

Também foram descritos péptidos contendo RGD que inibem o receptor de vitronectina ανβ3. Aumailley et al., FEBS Letts., 291:50-54 (1991), Choi et al., J. Vasc. Surg., 19:125-134 (1994), Smith et al., J. Biol. Chem., 265:1226 7-122 71 (1990) e 4

Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994). Contudo, até à presente invenção, o papel da integrina ανβ3 na angiogénese nunca foi sugerido nem identificado.

Por exemplo, Hammes et ai., Nature Med., 2:529-53 (1996) confirmaram as conclusões da presente invenção. Especificamente, o artigo mostra que os péptidos cíclicos, incluindo o RGDfV cíclico, a estrutura e função do último dos quais foi anteriormente descrito nos pedidos de prioridade nos quais o presente pedido se baseia, inibiram a neovascularização retiniana num modelo de murganho de neovascularização retiniana induzida por hipoxia. Num estudo separado que também suporta a presente invenção, assim como os pedidos de prioridade, Luna et al., Lab. Invest., 75: 563-573 (1996) descreveram dois particulares péptidos cíclicos metilados contendo RGD que foram parcialmente eficazes na inibição da neovascularização retiniana no modelo de murganho de retinopatia isquémica induzida por oxigénio. Em contraste, os péptidos da presente invenção exibem inibição quase completa de neovascularização nos sistemas de modelos aqui descritos. A inibição da adesão celular in vitro, utilizando anticorpos monoclonais imunoespecíficos para diversas subunidades α ou β de integrina, implicou ανβ3 na adesão celular de uma variedade de tipos de células, incluindo células endoteliais microvasculares. Davis et al.r J. Cell. Biol., 51:206-218 (1993). Além disso, Nicosia et al., Am. J. Pathol., 138:829-833 (1991), descreveram a utilização do péptido RGD, GRGDS, para inibir in vitro a formação de "microvasos" a partir de aorta de rato cultivada em gel de colagénio. Contudo, a inibição da formação de "microvasos" in vitro em culturas de gel de colagénio não é um modelo para a inibição de angiogénese num 5 tecido, em virtude de não estar provado que as estruturas de microvasos sejam o mesmo que germinações capilares ou que a formação do microvaso em cultura de gel de colagénio seja o mesmo que crescimento neovascular até um tecido intacto, tais como tecido artrítico, tecido tumoral ou tecido de doença, onde a inibição de angiogénese é desejável.

Para que a angiogénese ocorra, as células endoteliais devem primeiro degradar e atravessar a membrana basal do vaso sanguíneo, num modo semelhante ao utilizado por células tumorais durante a invasão e formação de metástase. A requerente referiu, anteriormente, que a angiogénese depende da interacção entre integrinas vasculares e proteínas de matriz extracelular. Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994). Além disso, foi referido que a morte celular programada (apoptose) de células vasculares angiogénicas é iniciada pela interacção, que seria inibida por determinados antagonistas da integrina vascular ανβ3· Brooks et al., Cell, 79: 1157-1164 (1994). Mais recentemente, a requerente referiu que a ligação da metaloproteinase-2 de matriz (MMP-2) ao receptor de vitronectina (ανβ5) pode ser inibida utilizando antagonistas de ανβ5 e, desse modo, inibir a função enzimática da proteinase. Brooks et al., Cell, 85:683-693 (1996) .

Com excepção dos estudos aqui referidos, a Requerente desconhece qualquer outra demonstração de que a angiogénese possa ser inibida num tecido utilizando inibidores de adesão celular. Em particular, nunca foi anteriormente demonstrado por outros que a função de ανβ3 é requerida para angiogénese num tecido ou que os antagonistas de ανβ3 podem inibir a angiogénese num tecido. 6

Breve Descrição da Invenção A divulgação da presente invenção demonstra que a angiogénese num tecido requer a integrina ανβ3 e que os inibidores de ανβ3 podem inibir a angiogénese. A divulgação também demonstra que os antagonistas de outras integrinas, tais como 0ím^3 ou ανβι, não inibem a angiogénese, presumivelmente em virtude de estas outras integrinas não serem essenciais para que ocorra a angiogénese. A invenção, por conseguinte, descreve compostos para utilização na inibição de angiogénese mediada por ανβ3 num tecido. 0 tecido a ser tratado pode ser qualquer tecido no qual a inibição de angiogénese seja desejável, tal como tecido doente onde a neovascularização esteja a ocorrer. Tecidos exemplificativos incluem tecido inflamado, tumores sólidos, metástases, tecidos submetidos a restenose e tecidos semelhantes.

Um antagonista de ανβ3 para utilização na presente invenção é capaz de se ligar a ανβ3 e inibir competitivamente a capacidade de ανβ3 se ligar a um ligando natural. 0 antagonista de ανβ3 é um mimético orgânico de ανβ3, como definido na reivindicação 1.

Breve Descrição dos Desenhos

Nos desenhos, formando uma parte desta divulgação: 7

As Figuras 1A-1D ilustram a distribuição tecidular das subunidades de integrina, β3 e βι, em pele normal e em pele submetida a cicatrização, designado como tecido de granulação. A imuno-histoquimica com anticorpos para β3 e βι foi realizada como descrita no Exemplo 3A. As Figuras IA e 1B, respectivamente, ilustram a imunorreactividade de anti^3 em pele normal e tecido de granulação. As Figuras 1C e 1D, respectivamente, ilustram a imunorreactividade de anti-βΐ em pele normal e tecido de granulação.

As Figuras 2A-2D ilustram a distribuição tecidular do factor de von Willebrand e ligandos de laminina que, respectivamente, se ligam às subunidades de integrina β3 e βι em pele normal e em pele submetida a cicatrização, designado como tecido de granulação. A imuno-histoquimica com anticorpos para o factor de von Willebrand (anti-vWF) e laminina (anti-laminina) foi realizada como descrita no Exemplo 3B. As Figuras 2A e 2B, respectivamente, ilustram a imunorreactividade de anti-vWF em pele normal e tecido de granulação. As Figuras 2C e 2D, respectivamente, ilustram a imunorreactividade de anti-laminina em pele normal e tecido de granulação.

As Figuras 3A-3D ilustram a distribuição tecidular do receptor de integrina de vitronectina, ανβ3, em biopsias de tecido cancerígeno da bexiga, cancro do cólon, cancro da mama e cancro do pulmão, respectivamente. A imuno-histoquimica com o anticorpo LM609 contra ανβ3 foi realizada como descrita no Exemplo 3C. A Figura 4 ilustra uma microfotografia típica de uma CAM desta invenção desprovida de vasos sanguíneos, num embrião 8 de pinto, de 10 dias de idade, não tratado. A preparação é descrita no Exemplo 5B.

As Figuras 5A-5C ilustram a distribuição tecidular das integrinas βι e ανβ3 na preparação CAM desta invenção. A Figura 5A mostra a distribuição da subunidade βι numa preparação CAM de 10 dias de idade, não tratada, como detectada por imunorreactividade de imunofluorescência com CSAT, um anticorpo anti-βι. A Figura 5B mostra a distribuição do receptor ανβ3 numa preparação CAM de 10 dias de idade, não tratada, como detectada por imunorreactividade de imunofluorescência com LM609, um anticorpo anti-ot^3. A Figura 5C mostra a distribuição do receptor ανβ3 numa preparação CAM de 10 dias de idade, tratada com bFGF, como detectada por imunorreactividade de imunofluorescência com LM609, um anticorpo anti-o^3. Os tratamentos e resultados são descritos no Exemplo 5C. A Figura 6 ilustra a quantificação, num gráfico de barras, da expressão relativa de ανβ3 e βι em CAM de 10 dias de idade, não tratadas e tratadas com bFGF, como descrito no Exemplo 6A. A intensidade média de fluorescência é representada graficamente no eixo Y, com os perfis de integrina representados graficamente no eixo X.

As Figuras 7A-7C ilustram a aparência de uma CAM de 10 dias de idade não tratada, uma CAM tratada com bFGF e uma CAM tratada com TNFa, respectivamente, cujos processos e resultados são descritos no Exemplo 6A.

As Figuras 8A-8E ilustram o efeito do tratamento tópico de anticorpo sobre a angiogénese induzida com bFGF numa CAM de 9 10 dias, como descrito no Exemplo 7A1). A Figura 8A mostra uma preparação CAM não tratada que está desprovida de vasos sanguíneos. A Figura 8B mostra a infiltração de nova vasculatura para o interior de uma área anteriormente desprovida de vasculatura, induzida por tratamento de bFGF. As Figuras 8C, 8D e 8E, respectivamente, mostram os efeitos de anticorpos contra βι (anti-βι; CSAT) , ανβδ (anti-ot^s; P3G2) e ανβ3 (anti-oç^3; LM609).

As Figuras 9A-9C ilustram o efeito da injecção intravenosa do péptido sintético 66203 sobre a angiogénese induzida por tumores, como descrita no Exemplo 7E2) . A Figura 9A mostra a ausência de efeito inibidor do tratamento intravenoso com um péptido de controlo (tumor de péptido de controlo) sobre a angiogénese resultante de indução tumoral. A inibição de tal angiogénese por injecção intravenosa do péptido 66203 (tumor de RGD cíclico) é mostrada na Figura 9B. A ausência de efeitos inibidores ou citotoxicidade em vasos maduros preexistentes, após infusão intravenosa do péptido 66203, numa área adjacente à área de tumor tratada, é mostrada na Figura 9C (CAM adjacente a RGD cíclico).

As Figuras 10A-10C ilustram o efeito da aplicação intravenosa de anticorpos monoclonais para a angiogénese induzida por factor de crescimento, como descrita no Exemplo 7B1) . A Figura 10A mostra a angiogénese induzida por bFGF não exposta a tratamento de anticorpo (controlo) . Não resultou qualquer inibição de angiogénese quando uma preparação semelhante foi tratada com o anticorpo anti-a^5 P3G2, como mostrado na Figura 10B. A inibição de angiogénese resultou com o tratamento com o anticorpo anti-ct^3 LM609, como mostrado na Figura 10C. 10

As Figuras 11A-11C ilustram o efeito sobre a angiogénese embrionária após aplicação tópica de anticorpos anti-integrina, como descrito no Exemplo 7C. A angiogénese não foi inibida por tratamento de uma CAM de 6 dias com os anticorpos anti-βι e anti-o^s, respectivamente, mostrados nas Figuras 11A e 11B. Em contraste, o tratamento com o anticorpo anti-a^3 LM609 resultou na inibição da formação de vaso sanguíneo, como mostrado na Figura 11C. A Figura 12 ilustra a quantificação de um número de vasos entrando num tumor, numa preparação CAM, como descrita no Exemplo 7D1) . 0 gráfico mostra o número de vasos, como representado graficamente no eixo Y, resultante da aplicação tópica de CSAT (anti-βι), LM609 (anti-o^3) ou P3G2 (anti-oç^s) .

As Figuras 13A-13D ilustram uma comparação entre pesos húmidos de tumores, 7 dias após tratamento e pesos de tumores iniciais, como descrita no Exemplo 9Al)a. Cada barra representa a média ± S.E. de 5-10 tumores por grupo. Os tumores foram derivados de preparações CAM de melanoma humano (M21-L) (Figura 13A) , carcinoma pancreático (Fg) (Figura 13B), carcinoma do pulmão (UCLAP-3) (Figura 13C) e carcinoma laríngeo (HEp3) (Figura 13D) e tratados intravenosamente com PBS, CSAT (anti-βι) ou LM609 (anti-a^3) . Os gráficos mostram o peso de tumor, como representado graficamente no eixo Y, resultante da aplicação intravenosa de CSAT (anti-βι), LM609 (anti-ανβ3) ou PBS, como indicado no eixo X.

As Figuras 14A e 14B ilustram secções histológicas de tumores tratados com o P3G2 (anti-cx^s) (Figura 14A) e LM609 11 (anti-avp3) (Figura 14B) e coradas com hematoxilina e eosina, como descrito no Exemplo 9Al)b. Como mostrado na Figura 14A, os tumores tratados com anticorpo de controlo (P3G2) mostraram numerosas células tumorais viáveis e dividindo-se activamente, como indicado por figuras mitóticas (pontas de setas), assim como por múltiplos vasos sanguíneos (setas) em todo o estroma tumoral. Em contraste, foram detectadas poucas, se algumas, células tumorais ou vasos sanguíneos viáveis em tumores tratados com LM609 (anti-o^3) na Figura 14B.

As Figuras 15A-15E correspondem a tumores M21L tratados com péptidos, como descritos no Exemplo 9A2) e são como se segue: Figura 15A, péptido RAD cíclico de controlo (69601); Figura 15B, péptido RGD cíclico (66203); Figura 15C, tecido CAM adjacente retirado dos mesmos embriões tratados com péptido RGD cíclico (66203) e elevada ampliação (13x) de tumores tratados com o RAD de controlo (69601) na Figura 15D ou péptido RGD cíclico (66203) na Figura 15E. A Figura 15D representa vasos normais do tumor tratado com o péptido RAD de controlo (69601). A Figura 15E representa exemplos de vasos sanguíneos dissociados, de tumores tratados com o péptido RGD cíclico (66203) (setas).

As Figuras 16A-16E representam inibição de angiogénese por antagonistas de angiogénese no ensaio de modelo de olho de coelho in vivo, como descrito no Exemplo 10. As Figuras 16A e 16B representam a angiogénese do olho de coelho na presença de bFGF e mAb P1F6 (anti-av3s) . As Figuras 16C, 16D e 16E representam a inibição de angiogénese do olho de coelho na presença de bFGF e mAb LM609 (anti-a^3) . 12 A Figura 17 representa um fluxograma de como foi gerado o modelo de murganho guimérico murganho:humano in vivo, como descrito no Exemplo 11. Uma porção de pele de um murganho SCID foi substituída com prepúcio neonatal humano e deixada cicatrizar, durante 4 semanas. Após a cicatrização do enxerto, o prepúcio humano foi inoculado com células tumorais humanas. Durante o período de 4 semanas gue se seguiu, foi estabelecido um tumor mensurável que compreendeu um tumor humano com vasculatura humana crescendo a partir da pele humana para o interior do tumor humano. A Figura 18 ilustra a percentagem de células simples derivadas de CAM tratadas com mAb e tratadas com péptido e coradas com Apop Tag, como determinado por análise FACS e descrito no Exemplo 12. As barras a preto e pontilhadas representam células de embriões tratadas 24 horas e 48 horas antes do ensaio, respectivamente. Cada barra representa a média ± S.E. de três replicados. As CAM foram tratadas com mAb LM609 (anti-a^3) ou CSAT (anti-βι) ou PBS. As CAM também foram tratadas com o péptido cíclico 66203 (ciclo-RGDfV, indicado como Péptido 203) ou péptido cíclico de controlo 69601 (ciclo-RADfV, indicado como Péptido 601).

As Figuras 19A e 19B ilustram os resultados combinados de suspensões celulares simples de CAM de embriões tratadas com CSAT (anti-βι) (Figura 19A) ou LM609 (anti-o^3) (Figura 19B) , coradas com Apop Tag e iodeto de propídio e analisadas por FACS, como descrito no Exemplo 12C. O eixo Y representa a coloração de Apop Tag em número de células (Apoptose), o eixo X representa a coloração de iodeto de 13 propídio (teor de ADN) . A linha horizontal representa o canal negativo para a coloração de Apop Tag. Os painéis esquerdo e direito indicam células CAM de embriões tratados com CSAT (anti-βι) (Figura 19A) e LM609 (anti-avp3) (Figura 19B) , respectivamente. A análise de ciclo celular foi realizada por análise de, aproximadamente, 8000 eventos por condição.

As Figuras 20A-20C representam tecido CAM de embriões tratados com CSAT (anti-βι) e as Figuras 20D-20F representam tecido CAM de embriões tratados com LM609 (anti-ol·^) , preparados como descrito no Exemplo 12C. As Figuras 20A e 20D representam tecidos corados com Apop Tag e visualizados por fluorescência (FITC) sobreposta numa imagem D.I.C. As Figuras 20B e 20E representam os mesmos tecidos corados com mAb LM609 (anti-o^3) e visualizados por fluorescência (rodamina). As Figuras 20C e 20F representam imagens fundidas dos mesmos tecidos corados com Apop Tag ou LM609, onde a coloração de amarelo representa co-localização. A barra representa 15 e 50 pm nos painéis esquerdo e direito, respectivamente. A Figura 21 mostra o resultado de uma inibição de ensaio de conjugação celular com o péptido 85189, como descrito no Exemplo 4A. Os efeitos do antagonista peptidico foram avaliados numa gama de dosagens de 0,001 a 100 μΜ, como representada graficamente no eixo X. A conjugação celular é representada graficamente sobre o eixo Y, medida a uma densidade óptica (O.D.) de 600 nm. A conjugação celular foi medida em superfícies revestidas com vitronectina (linhas a tracejado) versus laminina (linhas sólidas). 14

As Figuras 22A e 22B mostram a sequência de ADNc consecutiva de MMP-2 de galinha, juntamente com a sequência de aminoácidos deduzida mostrada na segunda linha. A terceira e quarta linhas, respectivamente, mostram a sequência de aminoácidos deduzida de MMP-2 humana e de murganho, como descrita no Exemplo 4A. A sequência de ADNc de galinha é listada em SEQ ID N° 29, juntamente com a sequência de aminoácidos codificada que também é apresentada separadamente como SEQ ID N° 30. A numeração do primeiro nucleótido da região não traduzida 5' e a região codificando a sequência de proenzima mostrada na Figura 22A como um número negativo é, na realidade, apresentada como número 1 na Listagem de Sequências, fazendo com que a última pareça mais longa do que a figura; contudo, a sequência nucleotidica na figura é idêntica em comprimento e sequência àquela como apresentada na listagem, com a excepção da numeração. Consequentemente, as referências à posição nucleotidica para MMP-2 de galinha ou humana na descrição, tal como nos iniciadores para utilização na amplificação de fragmentos de MMP-2, são baseadas na posição nucleotidica, como indicado na figura e não como listado na Listagem de Sequências. A Figura 23 mostra os resultados, na forma de gráfico de barras, de um ensaio de ligação de receptor de fase sólida de MMP-2 iodada para ligação a ανβ3, com e sem a presença de inibidores, como além disso descrito no Exemplo 4B. Os dados são representados graficamente como CPM ligado no eixo Y contra os diversos potenciais inibidores e controlos. 15 A Figura 24 mostra a especificidade de composições de MMP-2 derivada de galinha para os receptores de integrina ανβ3 e oíhj^3, na presença de inibidores de MMP-2, como além disso descrito no Exemplo 4B. Os dados são apresentados como descrito na legenda na Figura 23. A Figura 25 mostra o efeito da proteína de fusão GST de MMP-2 de galinha (410-637) sobre a angiogénese induzida por bFGF, como descrito no Exemplo 7A3). As Figuras 25A-B e 25C-D, respectivamente, mostram os efeitos de controlo (uma proteína de fusão não contendo o fragmento de MMP-2) e de proteína de fusão GST de fragmento de MMP-2.

As Figuras 26 e 27 ilustram ambas, na forma de gráfico de barras, o índice de angiogénese (uma medição de pontos de ramificação) dos efeitos da proteína de fusão GST de MMP-2 de galinha (410-637) (marcada CTMMP-2) versus controlo (RAP-GST ou GST-RAP) sobre CAM tratadas com bFGF, como descrito no Exemplo 7A3). O índice angiogénico é representado graficamente no eixo Y contra os tratamentos separados no eixo X. e compostos bFGF, como ramificação os diversos CAM tratadas e compostos nos Exemplos A Figura 28 mostra os efeitos de péptidos orgânicos sobre a angiogénese induzida por medido pelo efeito sobre pontos de representados graficamente no eixo Y contra tratamentos no eixo X, incluindo apenas bFGF e com bFGF, com os péptidos 69601 ou 66203 orgânicos 96112, 96113 e 96229, como descrito 7B e 14. 16 A Figura 29 mostra graficamente a dose-resposta do péptido 85189 na inibição de angiogénese induzida por bFGF, como além disso descrita no Exemplo 7B2), onde o número de pontos de ramificação é representado graficamente no eixo Y contra a quantidade de péptido administrado ao embrião no eixo X. A Figura 30 mostra a actividade inibitória dos péptidos 66203 (marcado 203) e 85189 (marcado 189) em angiogénese induzida por bFGF no ensaio CAM, como descrito no Exemplo 7B2). Os controlos não incluíram qualquer péptido em CAM tratadas com bFGF e péptido 69601 (marcado 601). Os dados são representados graficamente como descrito na legenda para a Figura 27.

As Figuras 31A-L mostram o efeito de diversos tratamentos contra preparações CAM não tratadas ao longo de um período de tempo, começando às 24 horas e terminando às 72 horas, como além disso descrito no Exemplo 7B3) . As fotografias para as categorias marcadas não tratado, bFGF, bFGF + MAID (tratado com bFGF seguido de exposição a proteína de fusão GST de MMP-2(2-4) de galinha) e bFGF + controlo (tratamento de bFGF seguido de MMP-2 de galinha (10-1) são, respectivamente, mostradas nas Figuras 31A-C, 31D-F, 31G-I e 31J-L.

As Figuras 32, 33 e 34, respectivamente, mostram a redução em peso de tumor para os tumores UCLAP-3, M21-L e FgM após exposição intravenosa ao péptido de controlo 69601 e antagonista 85189, como além disso descrito no Exemplo 9A. Os dados são representados graficamente, com peso de tumor no eixo Y contra os tratamentos peptídicos no eixo X. 17 A Figura 35 ilustra o efeito dos péptidos e anticorpos sobre o crescimento de tumor de melanoma no modelo murganho:humano quimérico, como além disso descrito nos Exemplos 11B. Os péptidos avaliados incluíram controlo 69601 (marcado 601) e antagonista 85189 (marcado 189). O anticorpo testado foi LM609. O volume de tumor, em mm3, é representado graficamente no eixo Y contra os diversos tratamentos no eixo X.

As Figuras 36A e B, respectivamente, mostram o efeito do antagonista 85189 (marcado 189), em comparação com o péptido de controlo 69601 (marcado 601), sobre a redução do volume e peso húmido de tumores M21L numa gama de dosagens de 10, 50 e 250 pg/injecção, como além disso descrito no

Exemplo 11C.

As Figuras 37A e 37B mostram a eficácia do péptido antagonista 85189 (marcado 189, com uma linha sólida e círculos a cheio) contra o péptido de controlo 69601 (marcado 601, numa linha a tracejado e quadrados em branco) na inibição do volume de tumor de M21L no modelo murganho:humano com dois regimes de tratamento diferentes, como além disso descrito no Exemplo 11C. O volume de tumor, em mm3, é representado graficamente no eixo Y contra dias no eixo X.

As Figuras 38 até 42 ilustram esquematicamente as diversas sínteses químicas de antagonistas de molécula orgânica ανβ3, como além disso descrito no Exemplo 13.

As Figuras 43 e 44 mostram os efeitos de diversas moléculas orgânicas sobre a angiogénese induzida por bFGF num ensaio 18 CAM, como além disso descrito no Exemplo 14. Os pontos de ramificação são representados graficamente no eixo Y contra os diversos compostos utilizados, a 250 pg/mL no eixo X, na Figura 43 e 100 pg/mL na Figura 44.

Descrição Detalhada da Invenção A. Definições

Resíduo de Aminoácido: Um aminoácido formado após digestão química (hidrólise) de um polipéptido nas suas ligações peptídicas. Os resíduos de aminoácidos aqui descritos são, de um modo preferido, na forma isomérica "L". Contudo, os resíduos na forma isomérica "D" podem ser substituídos por qualquer resíduo de aminoácido L, desde que a propriedade funcional desejada seja retida pelo polipéptido. NH2 refere-se ao grupo amino livre presente na extremidade amino de um polipéptido. COOH refere-se ao grupo carboxilo livre presente na extremidade carboxilo de um polipéptido. De acordo com a nomenclatura polipeptídica padrão (descrita em J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) e adoptada em 37 CFR §1.822(b)(2)), as abreviaturas para os resíduos de aminoácidos são mostradas na seguinte Tabela de Correspondência:

TABELA DE CORRESPONDÊNCIA SÍMBOLO AMINOÁCIDO 1 Letra 3 Letras Y Tyr tirosina G Gly glicina 19 (continuação) SÍMBOLO AMINOÁCIDO 1 Letra 3 Letras F Phe fenilalanina M Met metionina A Ala alanina S Ser serina I lie isoleucina L Leu leucina T Thr treonina V Vai valina P Pro prolina K Lys lisina H His histidina Q Gin glutamina E Glu ácido glutâmico Z Glx Glu e/ou Gin W Trp triptofano R Arg arginina D Asp ácido aspártico N Asn asparagina B Asx Asn e/ou Asp C Cys cisteina X Xaa desconhecido/outro

Além disso, os seguintes têm os significados abaixo 20

BOC

DCCI

DMF OMe HOBt terc-butiloxicarbonilo

Diciclo-hexilcarbodiimida dimetilformamida metoxilo 1-hidroxibenzotriazole

Deve ser notado que todas as sequências de resíduos de aminoácidos são aqui representadas por fórmulas cuja orientação esquerda e direita é na direcção convencional de extremidade amino para extremidade carboxilo. Além disso, deve ser notado que um travessão no início ou fim de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácidos.

Polipéptido: refere-se a uma série linear de resíduos de aminoácidos ligados entre si por ligações peptídicas entre o grupo amino alfa e grupo carboxilo de resíduos de aminoácidos contíguos. Péptido: como aqui utilizado, refere-se a uma série linear não superior a cerca de 50 resíduos de aminoácidos ligados uns aos outros, como num polipéptido. Péptido cíclico: refere-se a um composto tendo uma estrutura de anel de heteroátomo que inclui várias ligações amida, como num péptido típico. O péptido cíclico pode ser um polipéptido linear ciclizado "cabeça com cauda", em que uma extremidade N do péptido linear formou uma ligação amida com o carboxilato terminal do péptido linear, ou pode conter uma 21 estrutura de anel, em que o polímero é homodético ou heterodético e compreende ligações amida e/ou outras ligações para fechar o anel, tais como pontes dissulfureto, tioésteres, tioamidas, guanidino e ligações semelhantes.

Proteína: refere-se a uma série linear superior a 50 resíduos de aminoácidos, ligados uns aos outros como num polipéptido.

Proteína de fusão: refere-se a um polipéptido contendo, pelo menos, dois domínios polipeptídicos diferentes, operativamente ligados por uma ligação peptídica típica ("fundida"), onde os dois domínios correspondem a péptidos não encontrados fundidos na natureza. Péptido sintético: refere-se a uma cadeia quimicamente produzida de resíduos de aminoácidos, ligados entre si por ligações peptídicas, que está isenta de proteínas de ocorrência natural e seus fragmentos. B. Considerações Gerais A presente invenção refere-se, em geral, à verificação de que a angiogénese é mediada pelo receptor específico de vitronectina ανβ3 e que a inibição da função de ανβ3 inibe a angiogénese. Esta verificação é importante em virtude do papel que a angiogénese desempenha numa variedade de processos de doença. Através da inibição de angiogénese, pode intervir-se na doença, melhorar os sintomas e, em alguns casos, curar a doença. 22

Se o crescimento de novos vasos sanguíneos for a causa ou contribuir para a patologia associada a uma doença, a inibição de angiogénese irá reduzir os efeitos deletérios da doença. Exemplos incluem artrite reumatóide, retinopatia diabética, doença inflamatória, restenose e semelhantes. Se o crescimento de novos vasos sanguíneos for requerido para suportar o crescimento de um tecido deletério, a inibição de angiogénese irá reduzir o fornecimento sanguíneo ao tecido e, desse modo, contribuir para a redução na massa de tecido com base nos requisitos de fornecimento sanguíneo. Exemplos incluem crescimento de tumores onde a neovascularização é um requisito contínuo, para que o tumor cresça além de alguns milímetros em espessura e para o estabelecimento de metástases de tumor sólido.

Os compostos para utilização de acordo com a presente invenção são eficazes, em parte, em virtude de a terapia ser altamente selectiva para a angiogénese e não outros processos biológicos. Como mostrado nos Exemplos, apenas o crescimento de novos vasos contém ανβ3 substancial e, por conseguinte, os métodos terapêuticos não afectam adversamente vasos maduros. Além disso, ο ανβ3 não está largamente distribuído em tecidos normais mas encontra-se, antes, selectivamente em novos vasos garantindo, desse modo, que a terapia pode ser selectivamente direccionada para o crescimento de novos vasos.

Antes das verificações da presente invenção, não se sabia que a angiogénese, e quaisquer dos processos dependentes de angiogénese, poderia ser inibida in vivo pela utilização de reagentes definidos na reivindicação 1 que antagonizam a função biológica de ανβ3. 23 C. Métodos Para a Inibição de Angiogénese A invenção produz compostos, como definidos na reivindicação 1, para utilização num método para a inibição de angiogénese num tecido e, desse modo, eventos de inibição no tecido que dependem de angiogénese. Em geral, os compostos devem ser administrados ao tecido numa composição compreendendo uma quantidade inibidora de angiogénese do referido antagonista de 0(νβ3 ·

Como descrito anteriormente, a angiogénese inclui uma variedade de processos envolvendo a neovascularização de um tecido incluindo "germinação", vasculogénese ou alargamento de vasos, cuja totalidade dos processos de angiogénese é mediada e dependente da expressão de ανβ3. Com a excepção da cicatrização traumática, formação de corpo lúteo e embriogénese, pensa-se que a maioria dos processos de angiogénese está associada a processos de doença e, por conseguinte, a utilização dos presentes métodos terapêuticos é selectiva para a doença e não tem efeitos secundários deletérios.

Existe uma variedade de doenças nas quais se pensa que a angiogénese é importante, referidas como doenças angiogénicas, incluindo mas não limitadas a distúrbios inflamatórios, tais como inflamação imunitária e não imunitária, reumatismo articular crónico e psoríase, distúrbios associados a invasão inapropriada ou inoportuna de vasos, tais como retinopatia diabética, glaucoma neovascular, restenose, proliferação capilar em placas ateroscleróticas e osteoporose, e distúrbios associados a cancro, tais como tumores sólidos, metástases de tumores sólidos, angiofibromas, fibroplasia retrolenticular, hemangiomas, sarcoma de Kaposi e cancros semelhantes que requerem neovascularização para manter o crescimento tumoral.

Assim, os métodos que inibem a angiogénese num tecido doente melhoram os sintomas da doença e, dependendo da doença, podem contribuir para a cura da doença. Numa forma de realização, a invenção contempla os compostos como definidos na reivindicação 1, para utilização na inibição de angiogénese, per se, num tecido. A extensão de angiogénese num tecido e, por conseguinte, a extensão da inibição alcançada pelos presentes compostos pode ser avaliada por uma variedade de métodos, tal como são descritos nos Exemplos, para a detecção de estruturas de vasos imaturas e nascentes, imunopositivas para ανβ3, por imuno-histoquimica.

Como aqui se descreve, qualquer de uma variedade de tecidos ou órgãos constituídos por tecidos organizados, pode manter a angiogénese em estados de doença incluindo pele, músculo, intestino, tecido conjuntivo, articulações, ossos e tecidos semelhantes, nos quais os vasos sanguíneos podem invadir após estímulos angiogénicos.

Assim, numa forma de realização relacionada, um tecido a ser tratado é um tecido inflamado e a angiogénese a ser inibida é a angiogénese de tecido inflamado, onde existe neovascularização de tecido inflamado. Nesta classe, os compostos definidos na reivindicação 1 estão contemplados para utilização na inibição de angiogénese em tecidos artríticos, tal como num doente com reumatismo articular crónico, em tecidos imunitários ou não imunitários inflamados, em tecido psoriático e semelhantes. 25 0 doente a ser tratado de acordo com a presente invenção, nas suas muitas formas de realização é, de um modo desejável, um doente humano, embora deva ser compreendido que os princípios da invenção indicam que a invenção é eficaz em relação a todos os mamíferos, os quais se pretende que sejam incluídos no termo "doente". Neste contexto, um mamífero é entendido como incluindo qualquer espécie de mamífero na qual o tratamento de doenças associadas a angiogénese é desejável, particularmente espécies de mamíferos agrícolas e domésticas.

Noutra forma de realização relacionada, um tecido a ser tratado é um tecido retiniano de um doente com uma doença retiniana, tais como retinopatia diabética, degenerescência macular ou glaucoma neovascular e a angiogénese a ser inibida é a angiogénese de tecido retiniano, onde existe neovascularização de tecido retiniano.

Numa forma de realização relacionada adicional, um tecido a ser tratado é um tecido tumoral de um doente com um tumor sólido, metástases, um cancro da pele, um cancro da mama, um hemangioma ou angiofibroma e cancros semelhantes, e a angiogénese a ser inibida é a angiogénese de tecido tumoral, onde existe neovascularização de um tecido tumoral. Os tecidos tumorais sólidos tratáveis pelos presentes métodos incluem pulmão, pâncreas, mama, cólon, laríngeo, ovariano e tecidos semelhantes. A angiogénese de tecido tumoral exemplificativa e sua inibição, é descrita nos Exemplos. A inibição de angiogénese de tecido tumoral é uma forma de realização particularmente preferida, em virtude do importante papel que a neovascularização desempenha no crescimento tumoral. Na ausência de neovascularização de tecido tumoral, o tecido 26 tumoral não obtém os nutrientes requeridos, abranda em crescimento, cessa crescimento adicional, regride e, por fim, torna-se necrótico, resultando na morte do tumor.

Referido por outras palavras, a presente invenção produz compostos para utilização num método de inibição de neovascularização de tumor, através da inibição de angiogénese de tumor de acordo com os presentes métodos. Analogamente, a invenção produz compostos inibidores de angiogénese, para utilização na inibição de crescimento tumoral.

Os compostos também são particularmente eficazes contra a formação de metástases, em virtude (1) de a sua formação requerer a vascularização de um tumor primário, de modo que as células cancerígenas metastáticas possam sair do tumor primário e (2) o seu estabelecimento num local secundário requer neovascularização para manter o crescimento das metástases.

Numa forma de realização relacionada, a invenção contempla a prática dos compostos para utilização no método, em conjunto com outras terapias, tal como a quimioterapia convencional dirigida contra tumores sólidos e para controlo do estabelecimento de metástases. 0 inibidor de angiogénese é, de um modo típico, para ser administrado durante ou após quimioterapia, embora seja, preferido, para inibir a angiogénese após um regime de quimioterapia, nos momentos onde o tecido tumoral estará a responder ao assalto tóxico, através da indução da recuperação de angiogénese pelo fornecimento de um fornecimento sanguíneo e nutrientes ao tecido tumoral. Além disso, prefere-se que os compostos para utilização na inibição de angiogénese sejam administrados após cirurgia, onde os 27 tumores sólidos tenham sido removidos como uma profilaxia contra as metástases.

Desde que os compostos sejam para utilização na inibição da neovascularização de tumor, também podem ser para utilização na inibição do crescimento de tecido tumoral, inibição de formação de metástases tumorais e regressão de tumores estabelecidos. Os Exemplos demonstram a regressão de um tumor estabelecido, após uma única administração intravenosa de um antagonista de ανβ3 de acordo com esta invenção. A restenose é um processo de migração e proliferação de células do músculo liso (SMC) no local da angioplastia transluminal percutânea coronária que impede o sucesso da angioplastia. A migração e proliferação de SMC durante a restenose podem ser consideradas um processo de angiogénese que é inibido pelos presentes compostos. Por conseguinte, a invenção também contempla compostos para utilização na inibição da restenose por inibição de angiogénese num doente após processos de angioplastia. Para a inibição da restenose, o antagonista de ανβ3 é, de um modo típico, para ser administrado após o processo de angioplastia durante cerca de 2 a cerca de 28 dias e, de um modo mais típico, durante cerca dos primeiros 14 dias após o processo.

Os presentes compostos para utilização na inibição de angiogénese num tecido e, por conseguinte, também para tratamento de doenças relacionadas com a angiogénese, devem ser administrados a um tecido no qual a angiogénese esteja a ocorrer, ou esteja em risco de ocorrer, pelo que os compostos estão numa composição compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de ανβ3, capaz de 28 inibição da ligação de ανβ3 ao seu ligando natural. Assim, os compostos para utilização no método devem ser administrados a um doente numa quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição fisiologicamente tolerável contendo um antagonista de ανβ3·

As gamas de dosagem para a administração do antagonista de ανβ3 dependem da forma do antagonista e sua potência, como aqui além disso descrito, e são quantidades suficientemente grandes o para produzir o efeito desejado, no qual a angiogénese e os sintomas da doença mediados por angiogénese são melhorados. A dosagem não deve ser tão grande para causar efeitos secundários adversos, tais como síndromas de hiperviscosidade, edema pulmonar, insuficiência cardíaca congestiva e semelhantes. Em geral, a dosagem irá variar com a idade, estado, sexo e extensão da doença no doente e pode ser determinada por um especialista na técnica. A dosagem também pode ser ajustada pelo médico individual no caso de qualquer complicação.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade de antagonista de ανβ3 suficiente para produzir uma inibição mensurável de angiogénese no tecido sendo tratado, i. e., uma quantidade inibidora de angiogénese. A inibição de angiogénese pode ser medida in situ por imuno-histoquímica, como aqui se descreve, ou por outros métodos conhecidos do especialista na técnica.

Desde que o antagonista de ανβ3 possa assumir a forma de qualquer de cinco miméticos orgânicos diferentes, como definidos na reivindicação 1, deve ser entendido que a potência e, por conseguinte, uma expressão de uma quantidade "terapeuticamente eficaz" pode variar. Contudo, como mostrado pelos presentes métodos de ensaio, um especialista na técnica pode facilmente 29 avaliar a potência de um antagonista de ανβ3 para utilização de acordo com esta invenção. A potência de um antagonista de ανβ3 pode ser medida por uma variedade de meios, incluindo inibição de angiogénese no ensaio CAM, no ensaio de olho de coelho in vivo, no ensaio murganho:humano quimérico in vivo e através de medição da inibição de ligação de ligando natural a ανβ3, todos como aqui descritos, e ensaios semelhantes.

Um antagonista de ανβ3 preferido tem a capacidade de substancialmente inibir a ligação de um ligando natural, tal como fibrinogénio ou vitronectina a ανβ3 em solução a concentrações de antagonista inferiores a 0,5 micromolar (μΜ) , de um modo preferido, inferior a 0,1 μΜ e, de um modo mais preferido, inferior a 0.05 μΜ. Por "substancialmente" significa-se que é observada, pelo menos, uma redução de 50 por cento na ligação de fibrinogénio por inibição na presença do antagonista de ανβ3 e a inibição de 50% é aqui referida como um valor de IC5o.

Um antagonista de ανβ3 mais preferido exibe selectividade para ανβ3 em relação a outras integrinas. Assim, um antagonista de ανβ3 preferido substancialmente inibe a ligação de fibrinogénio a ανβ3 mas não inibe substancialmente a ligação de fibrinogénio a outra integrina, tais como ανβι, οίνβ5 ou am^· É particularmente preferido um antagonista de ανβ3 que exibe uma actividade de IC5o 10 vezes a 100 vezes inferior na inibição da ligação de fibrinogénio a ανβ3, em comparação com a actividade de IC5o na inibição da ligação de fibrinogénio a outra integrina. Ensaios exemplificativos para medição da actividade de IC50 na 30 inibição da ligaçao de fibrinogénio a uma integrina sao descritos nos Exemplos.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de ανβ3 é descrita como uma quantidade de polipéptido para que, quando administrada numa composição fisiologicamente tolerável, seja suficiente para alcançar uma concentração plasmática de cerca de 0,1 microgramas (pg) por mililitro (mL) a cerca de 200 pg/mL, de um modo preferido, de cerca de 1 pg/mL a cerca de 150 pg/mL. Com base num polipéptido tendo uma massa de cerca de 500 gramas por mole, a concentração plasmática preferida, em molaridade, é de cerca de 2 micromolar (pM) a cerca de 5 milimolar (mM) e, de um modo preferido, cerca de 100 pM a 1 mM de polipéptido antagonista. Apresentado de um modo diferente, a dosagem por peso corporal pode variar de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 300 mg/kg e, de um modo preferido, de cerca de 0,2 mg/kg a cerca de 200 mg/kg, em uma ou mais administrações de doses, diariamente, durante um ou vários dias. O termo "dose de unidade", quando utilizado em referência a uma composição terapêutica da presente invenção, refere-se a unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagem unitária para o indivíduo contendo, cada unidade, uma quantidade predeterminada de material activo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o diluente requerido; i. e., transportador ou veículo.

Numa forma de realização preferida, como mostrada nos Exemplos, o antagonista de ανβ3 deve ser administrado numa única dosagem, intravenosamente. 31

As composições devem ser administradas num modo compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade a ser administrada e momento dependem do indivíduo a ser tratado, capacidade do sistema do indivíduo para utilizar o ingrediente activo e grau de efeito terapêutico desejado. As quantidades exactas de ingrediente activo requeridas para serem administradas dependem do parecer do médico e são peculiares para cada indivíduo. Contudo, as gamas de dosagem adequadas para aplicação sistémica são aqui divulgadas e dependem da via de administração. Os regimes adequados para administração também são variáveis mas são tipificados por uma administração inicial, seguida de doses repetidas em intervalos de uma ou mais horas por uma injecção subsequente ou outra administração. Alternativamente, está contemplada a infusão intravenosa contínua, suficiente para manter as concentrações no sangue nas gamas especificadas para terapias in vivo.

Como demonstrado pelos presentes Exemplos, a inibição de angiogénese e regressão tumoral ocorre tão inicialmente como 7 dias após o contacto inicial com o antagonista. A exposição adicional ou prolongada ao antagonista é, de um modo preferido, durante 7 dias a 6 semanas, de um modo preferido, cerca de 14 a 28 dias.

Numa forma de realização relacionada, os Exemplos demonstram a relação entre inibição de ανβ3 e indução de apoptose nas células de neovasculatura contendo ανβ3· Assim, também são descritos compostos para utilização nos métodos para inibição de apoptose em neovasculatura de um tecido. Os compostos são utilizados substancialmente como aqui se descreve para inibição de angiogénese em todos os tecidos e condições descritas para o 32 efeito. A única diferença perceptível é a do momento do efeito, em que a apoptose é manifestada rapidamente, de um modo tipico cerca de 48 horas após contactar o antagonista, ao passo que a inibição de angiogénese e regressão tumoral é manifestada mais lentamente, como aqui se descreve. Esta diferença afecta o regime terapêutico em termos de tempo de administração e efeito desejado. De um modo tipico, a administração para apoptose de neovasculatura pode ser durante 24 horas a cerca de 4 semanas, embora sejam preferidas 48 horas a 7 dias. D. Composições Terapêuticas A presente invenção contempla composições terapêuticas úteis para a prática dos métodos terapêuticos aqui descritos. As composições terapêuticas para utilização de acordo com a presente invenção contêm um transportador fisiologicamente tolerável, juntamente com um antagonista de ανβ3, como aqui se descreve, ai dissolvido ou disperso como um ingrediente activo. Numa forma de realização preferida, a composição terapêutica de antagonista de ανβ3 não é imunogénica quando administrada a um doente mamífero ou humano para fins terapêuticos.

Como aqui utilizados, os termos "farmaceuticamente aceitável", "fisiologicamente tolerável" e suas variações gramaticais, na medida em que se referem a composições, transportadores, diluentes e reagentes, sao utilizados alternadamente e representam que os materiais sao capazes de administração a, ou sobre um mamífero sem a produção de efeitos fisiológicos indesejáveis, tais como náusea, tontura, desarranjo gástrico e semelhantes. 33 A preparação de uma composição farmacológica que contém ingredientes activos nela dissolvidos ou dispersos é bem compreendida na técnica e não necessita de estar limitada na formulação. De um modo típico, as composições são preparadas como injectáveis, como soluções ou suspensões líquidas, contudo, formas sólidas adequadas para solução, ou suspensões em líquido, antes da utilização também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsionada. 0 ingrediente activo pode ser misturado com excipientes que sejam farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo e em quantidades adequadas para utilização nos métodos terapêuticos aqui descritos. São excipientes adequados, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, ou semelhantes e as suas combinações. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes de tamponização de pH, e semelhantes, que melhoram a eficácia do ingrediente activo. A composição terapêutica da presente invenção pode incluir sais farmaceuticamente aceitáveis dos componentes nela contidos. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres do polipeptídeo) que são formados com sais inorgânicos, tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos, tais como acético, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio ou hidróxidos férricos e bases orgânicas, tais como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína e semelhantes. 34 São particularmente preferidos os sais de TFA e HC1, quando utilizados na preparação de antagonistas de ανβ3 polipeptídicos cíclicos. Sais representativos de péptidos são descritos nos Exemplos.

Os transportadores fisiologicamente toleráveis são bem conhecidos na técnica. São exemplificativos de transportadores líquidos soluções aquosas estéreis que não contêm materiais além disso aos ingredientes activos e água, ou contêm um tampão, tal como fosfato de sódio, a valor de pH fisiológico, solução salina fisiológica ou ambos, tal como solução salina tamponada com fosfatos. Ainda além disso, os transportadores aquosos podem conter mais de um sal de tamponização, assim como sais, tais como cloretos de sódio e potássio, dextrose, polietilenoglicol e outros solutos.

As composições líquidas também podem conter fases líquidas além disso e à exclusão de água. São exemplificativas de tais fases líquidas adicionais glicerina, óleos vegetais, tal como óleo de semente de algodoeiro e emulsões de água-óleo.

Uma composição terapêutica contém uma quantidade inibidora de angiogénese de um antagonista de ανβ3 da presente invenção, de um modo típico, formulado para conter uma quantidade de, pelo menos, 0,1 por cento em peso, de antagonista por peso de composição terapêutica total. Uma percentagem em peso, é uma razão em peso, de inibidor para composição total. Assim, por exemplo, 0,1 por cento em peso, é 0,1 grama de inibidor por 100 gramas de composição total. 35 Ε. Antagonistas de Integrina ανβ3 A presente invenção refere-se a determinados antagonistas de ανβ3, designados "miméticos", que possuem a capacidade para "mimetizar" um domínio de ligação no ligando de ανβ3 envolvido na interacção funcional do receptor e ligando e, desse modo, interferir com (i. e., inibir) a função normal, para utilização na inibição de angiogénese mediada por ανβ3 num tecido.

Um mimético desta invenção é uma molécula de base orgânica e, assim, é referido como mimético orgânico. As moléculas miméticas orgânicas que funcionam como antagonistas de ανβ3 ao serem um mimético para um ligando de ανβ3 são os Compostos 7, 9, 10, 12 e 14, como descritos no Exemplo 10. F. Métodos Para Ensaio de Antagonismo de ανβ3

Está disponível um determinado número de métodos para ensaio de antagonismo de ανβ3. O primeiro ensaio mede a inibição da ligação directa do ligando natural a ανβ3 e uma forma de realização preferida é descrita em detalhe nos Exemplos. De um modo típico, o ensaio mede o grau de inibição de ligação de um ligando natural, tal como fibrinogénio, a ανβ3 isolado na fase sólida por ELISA. O segundo ensaio mede a angiogénese na membrana corioalantóica de pinto (CAM) e é referido como o ensaio CAM. 0 ensaio CAM foi descrito em detalhe por outros e, além disso, foi utilizado para medir tanto a angiogénese como a neovascularização de tecidos tumorais. Ver Ausprunk et al., Am. 36 J. Pathol., 79:597-618 (1975) e Ossonski et al., Câncer Res., 40:2300-2309 (1980) . O ensaio CAM é um modelo de ensaio bem reconhecido para a angiogénese in vivo, em virtude de estar a ocorrer a neovascularização de tecido completo e vasos sanguíneos de embrião de pinto reais estarem a crescer para o interior da CAM ou para o interior do tecido crescido na CAM.

Como aqui demonstrado, o ensaio CAM ilustra a inibição de neovascularização com base na quantidade e extensão de crescimento de novos vasos. Além disso, é fácil monitorizar o crescimento de qualquer tecido transplantado para a CAM, tal como um tecido tumoral. Finalmente, o ensaio é particularmente útil em virtude de existir um controlo interno para toxicidade no sistema de ensaio. O embrião de pinto é exposto a qualquer reagente de teste e, por conseguinte, a saúde do embrião é uma indicação de toxicidade. O terceiro ensaio que mede a angiogénese é o modelo de olho de coelho in vivo e é referido como o ensaio de olho de coelho. O ensaio de olho de coelho foi descrito em detalhe por outros e, além disso, foi utilizado para medir a angiogénese e a neovascularização na presença de inibidores angiogénicos, tal como a talidomida. Ver D'Amato, et al., Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 91:4082-4085 (1994). O ensaio de olho de coelho é um reconhecido modelo de ensaio para a angiogénese in vivo, em virtude do processo de neovascularização, exemplificado por vasos sanguíneos de coelho crescendo a partir do arco da córnea para o interior da córnea, ser facilmente visualizado através da córnea naturalmente 37 transparente do olho. Além disso, a extensão e a quantidade de estimulação ou inibição de neovascularização ou regressão de neovascularização podem ser facilmente monitorizadas ao longo do tempo.

Finalmente, o coelho é exposto a qualquer reagente de teste e, por conseguinte, a saúde do coelho é uma indicação de toxicidade do reagente de teste. 0 quarto ensaio mede a angiogénese no modelo murganho:humano quimérico e é referido como o ensaio de murganho quimérico. 0 ensaio foi descrito em detalhe por outros e, além disso, foi aqui descrito para medir angiogénese, neovascularização e regressão de tecidos tumorais. Ver Yan, et al., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993). 0 ensaio de murganho quimérico é um modelo de ensaio útil para a angiogénese in vivo, em virtude de os enxertos de pele transplantada se assemelharem muito a pele humana normal histologicamente e estar a ocorrer a neovascularização de tecido completo, em que vasos sanguíneos humanos reais estão a crescer a partir da pele humana enxertada para o interior do tecido tumoral humano na superfície da pele humana enxertada. A origem da neovascularização para o interior do enxerto humano pode ser demonstrada por coloração imuno-histoquímica da neovasculatura, com marcadores de células endoteliais específicos humanos.

Como aqui demonstrado, o ensaio de murganho quimérico demonstra a regressão da neovascularização com base na quantidade e extensão da regressão do crescimento de novos vasos. Além disso, é fácil monitorizar os efeitos sobre o crescimento de qualquer tecido transplantado sobre a pele enxertada, tal como um tecido tumoral. Finalmente, o ensaio é 38 útil em virtude de existir um controlo interno para toxicidade no sistema de ensaio. 0 murganho quimérico é exposto a qualquer reagente de teste e, por conseguinte, a saúde do murganho é uma indicação de toxicidade. G. Artigo de Fabrico É também descrito um artigo de fabrico que é um recipiente marcado para produzir um antagonista de ανβ3 para utilização de acordo com a invenção. Um artigo de fabrico compreende material de embalagem e um agente farmacêutico contidos dentro do material de embalagem. 0 agente farmacêutico num artigo de fabrico é qualquer dos antagonistas de οίνβ3 para utilização de acordo com a presente invenção, formulado numa forma farmaceuticamente aceitável como aqui se descreve de acordo com as indicações divulgadas. 0 artigo de fabrico contém uma quantidade de agente farmacêutico suficiente para utilização no tratamento de um estado aqui indicado, em dosagens de unidade ou múltiplas. 0 material de embalagem compreende um rótulo que indica a utilização do agente farmacêutico nela contido, e. g., para tratamento de estados assistidos pela inibição de angiogénese e os estados semelhantes aqui divulgados. 0 rótulo pode além disso incluir instruções para utilização e informação relacionada, como pode ser requerido para comercialização. 0 material de embalagem pode incluir recipiente (s) para armazenamento do agente farmacêutico. 39

Como aqui utilizado, o termo material de embalagem refere-se a um material, tal como vidro, plástico, papel, papel de alumínio e semelhantes, capaz de manter dentro de meios fixos um agente farmacêutico. Assim, por exemplo, o material de embalagem pode ser frasquinhos de plástico ou vidro, invólucros laminados e recipientes semelhantes, utilizados para conterem uma composição farmacêutica incluindo o agente farmacêutico. 0 material de embalagem pode incluir um rótulo que é uma expressão tangível descrevendo o conteúdo do artigo de fabrico e a utilização do agente farmacêutico nele contido.

Exemplos

Os seguintes exemplos relativos a esta invenção são ilustrativos e não devem ser, certamente, interpretados como especificamente limitando a invenção. 1. Preparação de Péptidos Sintéticos (não faz parte da invenção) a. Processo de Síntese

Os polipéptidos lineares e cíclicos listados na Tabela 1 foram sintetizados utilizando técnicas de síntese de fase sólida padrão como, por exemplo, descritas por Merrifield, Adv. Enzymol., 32: 221-96, (1969) e Fields, G. B. e Noble, R. L.,

Int. J. Peptide Protein Res., 35: 161-214, (1990). 40

Dois gramas (g) de BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OMe (SEQ ID N° 1) foram primeiro dissolvidos em 60 mililitros (mL) de metanol aos quais foram adicionados 1,5 mL de solução de hidróxido de sódio a 2 N, para formar uma mistura. A mistura foi, depois, agitada durante 3 horas, a 20 graus C (20 °C). Após evaporação, o resíduo foi absorvido em água, acidificado para pH 3 com HC1 diluído e extraído com acetato de etilo. O extracto foi seco sobre Na2SC>4, evaporado de novo e o BOC-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID N° 2) resultante foi agitado, a 20 °C, durante 2 horas, com 20 mL de HC1 a 2 N em dioxano. A mistura resultante foi evaporada, para se obter H-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID N° 3) que foi subsequentemente dissolvido numa mistura de 1800 mL de diclorometano e 200 mL de dimetilformamida (DMF) , seguido de arrefecimento para 0 °C. A seguir, 0,5 g de diciclo-hexilcarbodiimida (DCCI), 0,3 g de 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) e 0,23 mL de N-metilmorfolina foram adicionados sucessivamente com agitação. A mistura resultante foi agitada durante 24 horas adicionais a 0 °C e, depois, a 20 °C, durante mais 48 horas. A solução foi concentrada e tratada com um permutador iónico de leito misto para libertar a mesma de sais. Após a resina resultante ser removida por filtração, a solução clarificada foi evaporada e o resíduo foi purificado por cromatografia, resultando na recuperação de ciclo(-Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (SEQ ID N° 4) . Os péptidos seguintes, listados na Tabela 1, utilizando abreviaturas de resíduos de aminoácidos de uma única letra e identificados por uma designação de número de péptido, foram obtidos de modo análogo: ciclo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID N° 5); ciclo(Arg-Ala-Asp-D-Phe-Val) (SEQ ID N° 6); ciclo(Arg-D-Ala-Asp-Phe-Val) (SEQ ID N° 9); ciclo (Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (SEQ ID N° 7); e ciclo 41 (Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) (a metilaçao é no azoto alfa-amino da ligação amida do resíduo de valina) (SEQ ID N° 15).

Um péptido designado como 66203, tendo uma sequência idêntica àquela do péptido 62184, apenas diferiu da última por conter o sal de HC1 em vez do sal de TFA presente em 62184. O mesmo é verdadeiro para os péptidos 69601 e 62185 e para 85189 e 121974. b. Processo de Síntese Alternativo

i. Síntese de ciclo-(Arq-Gly-Asp-DPhe-NmeVal). Sal de TFA 0 Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa é sintetizado utilizando processos de fase sólida de tipo Merrifield, por adição sequencial de NMeVal, DPhe, Asp(OBut), Gly e Fmoc-Arg(Mtr), num modo progressivo a resina de 4-hidroximetil-fenoximetil-poliestireno (resina de tipo Wang) (os métodos de tipo Merrifield usuais de síntese peptídica são aplicados como descritos em Houben-Weyl, l.c., Volume 15/11, Páginas 1 a 806 (1974) . A resina de poliestireno e precursores de resíduos de aminoácidos estão comercialmente disponíveis a partir das empresas químicas Aldrich, Sigma ou Fluka). Após conclusão da adição sequencial dos resíduos de aminoácidos, a resina é, depois, eliminada da cadeia peptídica utilizando uma mistura 1:1 de TFA/diclorometano que produz o produto Fmoc-Arg (Mtr ) -Gly-Asp (OBut ) -DPhe-NMeVal-OH . O grupo Fmoc é, depois, removido com uma mistura 1:1 de piperidina/DMF que produz o precursor em bruto Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH que é, depois, purificado por HPLC no modo usual. 42

Para a ciclização, uma solução de 0,6 g de Arg (Mtr) -Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-OH (sintetizado anteriormente) em 15 mL de DMF (dimetilformamida; Aldrich) é diluída com 85 mL de diclorometano (Aldrich) e são adicionados 50 mg de NaHC03. Após arrefecimento numa mistura de gelo seco/acetona, são adicionados 40 pL de difenilfosforilazida (Aldrich). Após repouso, à temperatura ambiente, durante 16 horas, a solução é concentrada. O concentrado é filtrado em gel (coluna Sephadex G10 em isopropanol/água 8:2) e, depois, purificado por HPLC no modo usual. O tratamento com TFA (ácido trifluoroacético)/H2O (98:2) produz ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal) x TFA que é, depois, purificado por HPLC no modo usual; RT = 19,5; FAB-MS (M+H): 589. ii. Síntese de "Sal Interno" O sal de TFA é removido do péptido cíclico anteriormente produzido através da suspensão do ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NmeVal) x TFA em água, seguida de evaporação sob vácuo, para a remover o TFA. O péptido cíclico formado é referido como um "sal interno" e é designado ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal). O termo "sal interno" é utilizado em virtude de o péptido cíclico conter dois resíduos contrariamente carregados que se contrabalançam intra-electronicamente entre si, para formar uma molécula globalmente não carregada. Um dos resíduos carregados contém uma unidade ácida e o outro resíduo carregado contém um grupo amino. Quando a unidade ácida e a unidade amino estão em proximidade imediata entre si, a unidade ácida pode ser desprotonada pela unidade amino que forma uma espécie carboxilato/sal de amónio com uma carga global neutra. 43 iii · Tratamento de HC1 para produzir ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x HC1 80 mg de ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) são dissolvidos em HC1 a 0,01 M, cinco a seis vezes, e liofilizados após cada operação de dissolução. A purificação subsequente por HPLC produz ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x HC1; FAB-MS (M+H): 589.

iv. Tratamento de ácido metanossulfónico para produzir ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x MeSQ3H 80 mg de ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) são dissolvidos em MeS03H (ácido metanossulfónico) a 0,01 M, cinco a seis vezes, e liofilizados após cada operação de dissolução. A purificação subsequente por HPLC produz ciclo-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x MeS03H; RT = 17,8; FAB-MS (M+H): 589. Métodos alternativos de ciclização incluem a derivatização as cadeias de grupos laterais de um precursor peptidico acíclico com grupos sulfidrilo e, quando expostas a condições de pH fisiológico ligeiramente superiores ao normal (pH 7,5), formam intramolecularmente ligações dissulfureto com outros grupos sulfidrilo presentes na molécula, para formar um péptido cíclico. Além disso, o grupo carboxilato da extremidade C de uma unidade peptídica acíclica pode ser colocada em reacção com uma unidade sulfidrilo livre, presente dentro da molécula para a produção de péptidos tioéster ciclizados.

Na inibição de ensaios de angiogénese, como descritos no Exemplo 7, onde os péptidos sintéticos foram utilizados, o 44 péptido 66203 em HC1 foi ligeiramente mais eficaz na inibição de angiogénese do que o péptido idêntico em TFA.

Tabela 1 Péptido Sequência de Aminoácidos SEQ ID N°

Designação 62181 ciclo(GrGDFV) 4 62184 (66203*) ciclo(RGDfV) 5 62185 (69601*) ciclo (RADfV) 6 62187 ciclo(RGDFv) 7 62880 YTAECKPQVTRGDVF 8 62186 ciclo(RaDFV) 9 62175 ciclo(ARGDfL) 10 62179 ciclo (GRGDfL) 11 62411 TRQVVCDLGNPM 12 62503 GVVRNNEALARL S 13 62502 TDVNGDGRHDL 14 121974 (85189*) ciclo (RGD-NH2Me-V) 15 112784 ciclo (RGEf-NH2Me-V) 16 hump-2 (410-631)** 17 huMMP-2 (439-631)** 18 huMMP-2 (439-512)** 19 huMMP-2 (439-546)** 20 huMMP-2 (510-631)** 21 huMMP-2 (543-631)** 22 chMMP-2 (410-637)*** 23 chMMP-2 (445-637)*** 24 45 Péptido (continuação)

Sequência de Aminoácidos SEQ ID N°

Designação (445-518)1 2 3 (445-552)3 (516-637)3 (549-637)3 25 26 27 28 chMMP-2 chMMP-2 chMMP-2 chMMP-2 46 1

Os péptidos designados com um asterisco são preparados em HC1 e são idênticos em sequência ao péptido designado na mesma linha; os péptidos sem um asterisco são preparados em TFA. As letras minúsculas indicam um aminoácido D; as letras maiúsculas indicam um aminoácido L. 2

As sequências de resíduos de aminoácidos de MMP-2 humana para péptidos sintéticos são indicadas pelas correspondentes posições de resíduos mostrados nas Figuras 22A e 22B. (MMP-2 refere-se a um membro da família das enzimas de metaloproteinases de matriz). As sequências de MMP-2 humana são listadas com os resíduos de cisteína naturais mas não são listadas com resíduos de cisteína manipulados, como descrito para os péptidos de fusão. Os resíduos de cisteína não naturais foram substituídos pelo resíduo de aminoácido natural nas posições de resíduos indicadas, para facilitar a solubilidade das proteínas de fusão sintéticas assim como expressas e para garantir o conveniente enrolamento para apresentação do sitio de ligação. 3 ** As sequências de resíduos de aminoácidos de MMP-2 de galinha para péptidos sintéticos são indicadas pelas correspondentes posições de resíduos mostrados nas Figuras 22A e 22B. As sequências de MMP-2 de galinha são listadas com os resíduos de cisteína naturais mas não com resíduos de cisteína (continuação) Péptido Sequência de Aminoácidos SEQ ID N°

Designação manipulados, como descrito para os péptidos de fusão como descrito anteriormente. 2. Anticorpos Monoclonais (nao faz parte da invenção) 0 anticorpo monoclonal LM609, segregado pelo hibridoma ATCC HB 9537, foi produzido utilizando métodos de hibridoma padrão por imunização com ανβ3 isolado adsorvido sobre esférulas Sepharose-lentil lectin. 0 ανβ3 tinha sido isolado de células de melanoma humano, designadas M21, e o anticorpo foi produzido como descrito por Cheresh et ai., J. Biol. Chem., 262:17703-17711 (1987). As células M21 foram proporcionadas pelo Dr. D. L. Morton (Universidade da Califórnia, em Los Angeles, CA) e cultivadas em culturas de suspensão, em meio de cultura RPMI 1640 contendo L-glutamina a 2 mM, sulfato de gentamicina a 50 mg/mL e soro de vitelo fetal a 10%.

Demonstrou-se que o anticorpo monoclonal LM609 imunorreage especificamente com o complexo de ανβ3 e não imunorreage com a subunidade av, com a subunidade β3 ou com outras integrinas. 47 3. Caracterização da Distribuição Tecidular da Expressão de ®νβ3 A. Imunofluorescência com Anticorpos Anti-Receptor de Integrina

Durante a cicatrização, as membranas basais dos vasos sanguíneos expressam diversas proteínas adesivas, incluindo factor de von Willebrand, fibronectina e fibrina. Além disso, diversos membros da família das integrinas dos receptores de adesão são expressos na superfície de células de músculo liso e endoteliais cultivadas. Ver, Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84:6471 (1987); Janat et al. , J. Cell Physiol., 151:588 (1992); e Cheng et al., J. Cell Physiol., 139:275 (1989). Entre estas integrinas está ο ανβ3/· o receptor de célula endotelial para o factor de von Willebrand, fibrinogénio (fibrina) e fibronectina, como descrito por Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 84:6471 (1987).Esta integrina inicia uma via de sinalização dependente de cálcio, conduzindo a migração de célula endotelial e, por conseguinte, parece desempenhar um papel fundamental na biologia celular vascular, como descrito por Leavelsey et al., J. Cell Biol., 121:163 (1993).

Para investigar a expressão de ανβ3 durante a angiogénese, tecido de granulação de ferimento humano ou pele normal adjacente, foi obtido de doentes com consentimento, lavado com 1 mL de solução salina tamponada com fosfatos e embebido em meio O.T.C (Tissue Tek). Os tecidos embebidos foram rapidamente congelados em azoto líquido durante, aproximadamente, 30 a 45 segundos. Secções de seis míerones de espessura foram cortadas dos blocos congelados num micrótomo criostático, para subsequente coloração de imunoperoxidase com anticorpos 48 específicos para as integrinas β3 (ανβ3 ou 0(1^3) ou a subfamília βι de integrinas.

Os resultados da coloração de pele humana normal e tecido de granulação de ferimento são mostrados nas Figuras 1A-1D. Os anticorpos monoclonais AP3 e LM534, dirigidos para as integrinas β3 e βι, respectivamente, foram utilizados para análise imuno-histoquímica de secções congeladas. As experiências com tecido de quatro dadores humanos diferentes produziram resultados idênticos. As microfotografias são mostradas a ampliação de 300x. A integrina ανβ3 foi abundantemente expressa em vasos sanguíneos em tecido de granulação (Figura 1B) mas não foi detectável na derme e epitélio de pele normal do mesmo dador (Figura IA) . Em contraste, as integrinas βι foram abundantemente expressas em vasos sanguíneos e células do estroma em pele normal (Figura 1C) e tecido de granulação (Figura 1D) e, como anteriormente mostrado como descrito por Adams et al., Cell, 63:425 (1991), nas células basais dentro do epitélio. B. Imunofluorescência com Anticorpos Anti-Ligando

Secções adicionais da pele normal humana e tecidos de granulação preparadas anteriormente também foram examinadas para a presença dos ligandos para as integrinas β3 e βι, factor de von Willebrand e laminina, respectivamente. 0 factor de von Willebrand localizou-se nos vasos sanguíneos em pele normal (Figura 2A) e tecido de granulação (Figura 2B) , ao passo que a laminina se localizou em todos os vasos sanguíneos, assim como a 49 membrana basal epitelial em ambas as preparações tecidulares (Figuras 2C a 2D). C. Distribuição de Anticorpos Αηίί-ανβ3 em Tecido Cancerígeno

Além disso às análises anteriores, as biopsias de tecido cancerígeno de doentes humanos também foram examinadas para a presença e distribuição e ανβ3· Os tecidos foram preparados como descrito no Exemplo IA, com a excepção de que foram corados com o anticorpo monoclonal LM609, preparado no Exemplo 2, que é específico para o complexo do receptor de integrina ανβ3· Além disso, os tumores também foram preparados para análise histológica microscópica através de fixação de exemplos representativos de tumores em Bulins Fixative, durante 8 horas, e secções seriais cortadas e coradas com H&E.

Os resultados da coloração de imunoperoxidase de tecidos cancerígenos da bexiga, cólon, mama e do pulmão são mostrados nas Figuras 3A-3D, respectivamente. 0 ανβ3 é abundantemente expresso, apenas nos vasos sanguíneos presentes nas quatro biopsias de cancro analisadas e não em quaisquer outras células presentes no tecido.

Os resultados aqui descritos mostram, assim, que o receptor de integrina ανβ3 é selectivamente expresso em tipos específicos de tecidos, nomeadamente tecidos granulados, metastáticos e outros tecidos nos quais a angiogénese está a ocorrer e não tecido normal, onde a formação de novos vasos sanguíneos tenha parado. Estes tecidos, por conseguinte, proporcionam um alvo ideal para os aspectos terapêuticos desta invenção. 50 4. Identificação de Péptidos Sintéticos Específicos de ανβ3 Detectados por Inibição de Conjugação Celular e por um Ensaio de Ligação Ligando-Receptor (não faz parte da invenção) A. Inibição de Conjugação Celular

Como um meio para determinar a especificidade do receptor de integrina dos antagonistas desta invenção, os ensaios de inibição de conjugação celular foram realizados como se descreve abaixo.

Resumidamente, células de melanoma de hámster CS-1, desprovidas de expressão de ανβ3 e ανβ3, foram primeiro transfectadas com um plasmídeo para expressão da subunidade β3, como anteriormente descrito por Filardo et al., J. Cell Biol., 130: 441-450 (1995). A especificidade de potenciais antagonistas de ανβ3 foi determinada pela capacidade de bloqueio da ligação de células CS-1 expressando ανβ3 a placas revestidas com VN ou laminina. Como um exemplo de um típico ensaio, os poços foram primeiro revestidos com substrato a 10 pg/mL, de um dia para o outro. Após enxaguadela e bloqueio com BSA, desnaturada por aquecimento, a 1% em PBS, à temperatura ambiente, durante 30 minutos, o péptido 85189 (SEQ ID N° 15) numa gama de concentrações de 0,0001 μΜ a 100 μΜ, foi misturado separadamente com células CS-1 para aplicação aos poços com um número de células de 50000 células/poço. Após uma incubação de 10-15 minutos, a 37 °C, a solução contendo as células e péptidos foi descartada. O número de células conjugadas foi, depois, determinado após coloração com violeta de cristal a 1%. O violeta de cristal associado às células foi eluído pela adição de 100 microlitros (pL) de ácido acético a 10%. A adesão celular 51 foi quantificada através de medição da densidade óptica do violeta de cristal eluído, a um comprimento de onda de 600 nm. A Figura 21 mostra o resultado de um ensaio típico com um antagonista de ανβ3, aqui o péptido 85189. Não foi detectada qualquer inibição com o péptido em superfícies revestidas com laminina. Em contraste, foi obtida inibição completa de ligação em superfícies revestidas com VN, com uma concentração peptídica de 10 μΜ ou superior, como mostrado com a curva de dose-resposta.

Foram realizados ensaios semelhantes com proteínas de fusão contendo diversas regiões da proteína MMP-2. Os polipéptidos derivados de MMP-2 incluem regiões da extremidade C de MMP-2 activa na interacção de ligação com ανβ3 e, desse modo, capazes de inibição de activação de MMP-2 e actividades associadas. Estes polipéptidos são preparados como polipéptidos sintéticos, tendo uma sequência derivada do domínio C-terminal de MMP-2, como descrita no Exemplo 1, ou como proteínas de fusão incluindo a totalidade ou uma porção do domínio C-terminal de MMP-2, preparadas como descrito abaixo. As moléculas C-terminais de MMP-2 são apresentadas para sequências específicas de galinha e humana. O domínio C-terminal de MMP-2 derivada de galinha, também referido como o domínio hemopexina, imediatamente contíguo com a região de articulação, compreende os resíduos de aminoácidos 445-637 de MMP-2. A sequência completa nucleotídica e codificada de aminoácidos de MMP-2 de galinha é descrita abaixo. A sequência nucleotídica e codificada de aminoácidos de MMP-2 humana também é descrita abaixo. O domínio C-terminal na MMP-2 humana que corresponde à região de galinha de 445-637 começa no 52 resíduo de aminoácido 439 e termina com 631, em virtude de seis resíduos em falta da sequência humana, como mostrado nas Figuras 22A e 22B. Os péptidos sintéticos C-terminais derivados tanto de MMP-2 humana como de galinha para utilização na prática dos métodos desta invenção são listados na Tabela 1. As sequências de resíduos de aminoácidos dos péptidos sintéticos são as mesmas como aquelas geradas pelos equivalentes de proteínas de fusão recombinantes mas sem o componente de fusão de GST. As proteínas de fusão C-terminais de MMP-2 derivadas de galinha e humanas são preparadas como se descreve abaixo.

Uma proteína de fusão de MMP-2 é um polipéptido quimérico, tendo uma sequência do domínio C-terminal de MMP-2 ou uma sua porção fundida (operativamente ligada por ligação peptídica covalente) a uma proteína transportadora (fusão), tal como a glutationo sulfidrilo transferase (GST).

Para amplificar diversas regiões de MMP-2 de galinha e humana, foram concebidas sequências iniciadoras com base nas respectivas sequências de ADNc conhecidas de MMP-2 humana. A cadeia completa de topo da sequência nucleotídica de ADNc de MMP-2 de galinha não processada, também referida como progelatinase, é mostrada nas Figuras 22A e 22B, juntamente com a sequência de aminoácidos deduzida mostrada na segunda linha (Aimes et al., Biochem. J. , 300:729-736, 1994). A terceira e quarta linhas da figura mostram, respectivamente, a sequência de aminoácidos deduzida de MMP-2 humana (Collier et ai., J. Biol. Chem., 263:6579-6587 (1988)) e de murganho (Reponen et al., J.

Biol. Chem., 267:7856-7862 (1992)). Os resíduos idênticos são indicados por pontos, enquanto os resíduos diferindo são dados pela sua classificação IUPAC de uma letra. Os resíduos em falta são indicados por um travessão. A numeração dos resíduos de 53 aminoácidos inicia-se a partir do primeiro resíduo da proenzima, sendo proporcionados números negativos aos resíduos do péptido sinal. A sequência nucleotídica é numerada consequentemente. A putativa iniciação de tradução (ATG) é marcada com três pontas de setas para a frente e o sinal de terminação de tradução (TGA) é indicado por um asterisco. As sequências amino-terminais para a proenzima de galinha e enzima activa são contidas com losangos e pontas de setas simples. As sequências nucleotídicas e de resíduos de aminoácidos de progelatinase de galinha são listadas em conjunto como SEQ ID N° 29, enquanto a sequência de resíduos de aminoácidos codificada é listada separadamente como SEQ ID N° 30.

Os moldes para a geração de regiões amplificadas de MMP-2 de galinha foram um ADNc codificando o polipéptido MMP-2 de galinha maduro de comprimento completo, proporcionado pelo Dr. J. P. Quigley da State University of New York em Stoney Brook, Nova Iorque, ou um ADNc gerado a partir de um molde de ARN celular total, derivado por técnicas padrão, de uma amostra excisada de tecido de membrana corioalantóica de galinha. Para o último, o ADNc foi obtido com a transcritase reversa MuLV e um iniciador a jusante específico para os nucleótidos terminais 3', 5'ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3' (SEQ ID N° 31), cujas extremidades 5' e 3' eram, respectivamente, complementares aos nucleótidos 1932-1912 da sequência de MMP-2 de pinto publicada. A reacção de polimerização em cadeia de transcritase reversa (RT-PCR) foi realizada de acordo com as especificações do fabricante para o kit GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer) . O iniciador também foi manipulado para conter um sítio de restrição EcoRI interno. A partir de qualquer dos moldes de ADNc anteriormente descritos, um determinado número de regiões C-terminais de MMP-2 de galinha, tendo cada uma o resíduo de cisteína natural na 54 posição 637 na extremidade carboxilo, foi obtido por PCR com o iniciador 3' listado anteriormente (SEQ ID N° 31) emparelhado com um de um determinado número de iniciadores 5' listados abaixo. As regiões amplificadas codificaram as proteínas de fusão de MMP-2 seguintes, tendo sequências correspondendo às posições de resíduos de aminoácidos como mostradas nas Figuras 22A e 22B e também listadas em SEQ ID N° 30: 1) 203-637; 2) 274-637; 3) 292-637; 4) 410-637; 5) 445-637. Iniciadores a montante ou 5', para amplificação de cada uma das regiões nucleotídicas para codificação das proteínas de fusão de MMP-2 listadas anteriormente, foram concebidos para codificar os sítios de iniciação polipeptídicos a 3' de um sítio de restrição BamHI interno manipulado, i. e., introduzido por PCR, para permitir a ligação direccional a um dos vectores de expressão pGEX-ΙλΤ ou pGEX-3X. Os iniciadores 5' incluíram as sequências seguintes, cujas extremidades 5' e 3' correspondem às posições nucleotídicas 5' e 3' da sequência MMP-2 de galinha como mostrada na Figura 22A e 22B (os sítios da posição de iniciação de resíduos de aminoácidos também são indicados para cada iniciador): 1) Nucleótidos 599-619, codificando um sítio de iniciação 203 5'ATGGGATCCACTGCAAATTTC3' (SEQ ID N° 32); 2) Nucleótidos 809-830, codificando um sítio de iniciação 274 5'GCCGGATCCATGACCAGTGTA3' (SEQ ID N° 33); 3) Nucleótidos 863-883, codificando um sítio de iniciação 292 5'GTGGGATCCCTGAAGACTATG3' (SEQ ID N° 34); 4) Nucleótidos 1217-1237, codificando uma iniciação 410 5'AGGGGATCCTTAAGGGGATTC3' (SEQ ID N° 35); e 5) Nucleótidos 1325-1345, codificando um sítio de iniciação 445 5'CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3' (SEQ ID N° 36).

As regiões nucleotídicas indicadas do ADNc molde foram subsequentemente amplificadas durante 35 ciclos (temperatura de emparelhamento 55 °C) , de acordo com as instruções do 55 fabricante, para o Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim). Os produtos de PCR resultantes foram purificados em gel, digeridos com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI e repurifiçados antes de ligação ao vector pGEX-ΙλΤ ou pGEX-3X (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) gue tinham sido analogamente digeridos, assim como desfosforilados, antes da reacção de ligação. A escolha do plasmideo foi baseada na fase de leitura requerida do produto de amplificação. A estirpe de E. coli competente BSJ72 ou as células BL21 foram transformadas com as construções separadas por choque térmico. As colónias resultantes foram rastreadas para incorporação do respectivo plasmideo codificando a proteína de fusão MMP-2 por PCR, antes da sequenciação didesoxi de clones positivos, para verificar a integridade da sequência codificante introduzida. Além disso, a verificação de incorporação do plasmideo foi confirmada por expressão da proteína de fusão GST-MMP-2 de tamanho apropriado. A purificação de cada uma das proteínas de fusão GST-MMP-2 recombinantes foi realizada utilizando culturas induzidas por IPTG de fase log, essencialmente como descrito pelo fabricante para o GST Gene Fusion System (Pharmacia Biotech). Resumidamente, as bactérias recuperadas foram lisadas por sonicação e incubadas com detergente, antes de clarificação e imobilização da proteína recombinante em glutationo ligado a sepharose 4B (Pharmacia Biotech). Após lavagem extensa, as proteínas de fusão imobilizadas foram separadamente eluídas da matriz de afinidade com glutationo reduzido, a 10 mM, em Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0 e dialisadas extensamente contra PBS, para remover glutationo residual antes da utilização.

As tentativas anteriores para produzir proteínas de fusão entre os resíduos 445 e 637 de MMP-2 de galinha que apenas tinham um resíduo de cisterna codificado resultaram em produtos 56 insolúveis. Por conseguinte, para gerar proteínas de fusão de MMP-2 solúveis adicionais, derivadas da região C-terminal gue não incluiu um resíduo de cisteína terminal endógeno, como presente na proteína de fusão anteriormente descrita, as seguências nucleotídicas foram introduzidas nas regiões de MMP-2 amplificadas, para codificar um resíduo de cisteína, se necessário, dependendo da particular proteína de fusão. Um resíduo de cisteína está naturalmente presente na sequência de MMP-2 de galinha na posição 446 e na posição 637. Na sequência humana, estas posições correspondem, respectivamente, a 440 e 631. Por conseguinte, foram concebidas proteínas de fusão para conterem resíduos de cisteína terminais manipulados na extremidade amino ou carboxilo das sequências de MMP-2 de galinha de interesse, de forma a produzir para ligação de dissulfureto com a cisteína de ocorrência natural na outra extremidade, como requerido pela construção.

Os iniciadores oligonucleotídicos foram consequentemente concebidos para permitir a amplificação das regiões C-terminais de MMP-2 de galinha para expressão de proteínas de fusão MMP-2/GST solúveis. As regiões C-terminais de MMP-2 de galinha amplificadas incluíram aquelas para codificação das posições dos resíduos de aminoácidos 445-518, 445-552, 516-637 e 549-637.

Para proteínas de fusão contendo o resíduo 517, o resíduo de tirosina naturalmente codificado foi substituído por uma cisteína, para permitir para ligação de dissulfureto com qualquer cisteína na posição de resíduo 446 ou 637. Para proteínas de fusão contendo o resíduo 551, o resíduo de triptofano naturalmente codificado foi substituído por uma cisteína, para permitir a ligação de dissulfureto com qualquer cisteína naturalmente codificada na posição de resíduo 446 ou 637. 57

Resumidamente, a construção plasmídica pGEX-3X, codificando a proteína de fusão GST/MMP-2(410-637) recombinante preparada anteriormente, foi utilizada como um molde para amplificação de acordo com o protocolo do fabricante para o kit Expand High Fidelity PCR (Boehringer Mannheim), utilizando um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos cuja concepção se baseou na sequência de MMP-2 de galinha publicada (também mostrada nas Figuras 22A e 22B. Um iniciador a montante, concebido para codificar um sítio de iniciação da proteína MMP-2 de galinha na posição 445, a seguir a um sítio de restrição BamHI de endonuclease interno manipulado para inserção no vector de GST pGEX-3X, tinha a sequência nucleotídica (5'CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3' (SEQ ID N° 37)). As extremidades 5' e 3' do iniciador corresponderam, respectivamente, às posições 1325-1345 da sequência MMP-2 de galinha na figura. Outro iniciador a montante, concebido para codificar um sítio de iniciação da proteína MMP-2 de galinha na posição 516, a seguir a um sítio de restrição BamHI interno manipulado, para inserção no vector de GST pGEX-ΙλΤ e para codificar um resíduo de cisteína na posição 517, tinha a sequência nucleotídica (5'GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC3' (SEQ ID N° 38)). As extremidades 5' e 3' do iniciador corresponderam, respectivamente, às posições 1537-1562 da sequência MMP-2 de galinha. Um terceiro iniciador a montante, concebido para codificar um sítio de iniciação da proteína MMP-2 de galinha na posição 549, a seguir a um sítio de restrição EcoRI de endonuclease interno manipulado, para inserção no vector de GST pGEX-ΙλΤ e para codificar um resíduo de cisteína na posição 551, tinha a sequência nucleotídica (5'GCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG3' (SEQ ID N° 39)). As extremidades 5' e 3' do iniciador corresponderam, respectivamente, às posições 1639-1665 da sequência MMP-2 de galinha. 58

Estes iniciadores a montante foram separadamente utilizados com um dos seguintes iniciadores a jusante listados abaixo, para produzir as regiões anteriormente descritas a partir do domínio C-terminal de MMP-2 de galinha. Um primeiro iniciador a jusante (anti-sentido) , concebido para codificar um sítio de terminação da proteína MMP-2 de galinha na posição 518, para codificar um resíduo de cisteína na posição 517 e para conter um sítio de restrição EcoRI de endonuclease interno para inserção num vector de GST, tinha a sequência nucleotídica (5'GTAGAATTCCAGCACTCATTTCCTGC3' (SEQ ID N° 40)). As extremidades 5' e 3' do iniciador, escritas na direcção 5'-3', eram, respectivamente, complementares em parte às posições 1562-1537 da sequência de MMP-2 de galinha. Um segundo iniciador a jusante, concebido para codificar um sítio de terminação da proteína MMP-2 de galinha na posição 552, para codificar um resíduo de cisteína na posição 551 e para conter um sítio de restrição EcoRI de endonuclease interno para inserção num vector de GST, tinha a sequência nucleotídica (5'TCTGAATTCTGCCACAGTTGAAGG3' (SEQ ID N° 41)). As extremidades 5' e 3' do iniciador, escritas na direcção 5'-3', eram, respectivamente, complementares em parte às posições 1666-1643 da sequência de MMP-2 de galinha. Um terceiro iniciador a jusante, concebido para codificar um sítio de terminação da proteína MMP-2 de galinha na posição 637 e para conter um sítio de restrição EcoRI de endonuclease interno para inserção num vector de GST, tinha a sequência nucleotídica (5'ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3' (SEQ ID N° 42)). As extremidades 5' e 3' do iniciador, escritas na direcção 5'-3', eram, respectivamente, complementares em parte às posições 1932-1912 da sequência de MMP-2 de galinha. 59

As regiões do terminal carboxilo de MMP-2 de galinha ligadas pelos iniciadores a montante e jusante anteriores, utilizados em particulares combinações para produzir as proteínas de fusão contendo, pelo menos, um resíduo de cisteína manipulado como anteriormente descrito, foram separadamente amplificadas durante 30 ciclos com uma temperatura de emparelhamento de 55 °C, de acordo com as instruções do fabricante para o Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim). Os produtos de amplificação resultantes foram separadamente purificados, digeridos com as enzimas de restrição BamHI e ou EcoRI, conforme necessário, e repurifiçados antes de ligação ao vector de proteína de fusão de GST apropriado, pGEX-3X ou pGEX-ΙλΤ, como anteriormente indicado pela fase de leitura do iniciador oligonucleotídico a montante. Para ligação dos produtos de MMP-2 amplificados, os vectores foram analogamente digeridos, assim como desfosforilados, antes da reacção de ligação. Células competentes da estirpe BL21 de E. coli foram, depois, separadamente transformadas com as construções de vector contendo MMP-2 resultantes por choque térmico. As colónias resultantes foram, depois, rastreadas para incorporação do plasmídeo codificando a proteína de fusão apropriada por PCR e produção da proteína de fusão de GST de tamanho apropriado, antes da sequenciação didesoxi de clones positivos, para verificar a integridade da sequência codificante introduzida. A purificação de proteínas de fusão de GST recombinantes foi, depois, realizada utilizando culturas de fase log induzidas por IPTG, essencialmente como descrito anteriormente para a produção de outras proteínas de fusão GST-MMP-2.

Os resultados de inibição de ensaios de conjugação celular com diversas proteínas MMP-2 de galinha, assim como com outros péptidos indicam que a MMP-2 intacta, a proteína de fusão 60 CTMMP-2(2-4) dos resíduos 445-637 e o péptido 66203 (SEQ ID N° 5) mas não MMP-2 (1-445) e o péptido de controlo 69601 inibiram a adesão de células CS-1 expressando β3 a vitronectina mas não laminina e, desse modo, inibiram a ligação do receptor de vitronectina (ανβ3> a vitronectina através da interferência com a actividade de ligação de ανβ3 normal. Outras proteínas de fusão CTMMP-2 testadas, 7-1 dos resíduos 274-637, 10-1 dos resíduos 292-637 e 4-3 dos resíduos 274-400 tiveram menos efeito sobre a adesão celular em comparação com 2-4.

Além disso às proteínas de fusão de GST de MMP-2 de galinha anteriormente descritas, foram produzidas duas proteínas de fusão de GST de MMP-2 humana para a expressão das regiões de aminoácidos 203-631 e 439-631 do polipéptido de proenzima de MMP-2 madura humana. As regiões indicadas correspondem, respectivamente, às regiões de MMP-2 de galinha 203-637 e 445-637. As proteínas de fusão MMP-2-GST humanas foram produzidas por PCR, como anteriormente descrito para as proteínas de fusão MMP-2-GST de galinha, utilizando um molde de ADNc que codificava a fase de leitura aberta completa da MMP-2 humana, proporcionada pelo Dr. W. G. Stetler-Stevenson no National Câncer Institute, Bethesda, MD. As sequências iniciadoras 5' a montante foram concebidas com base na sequência anteriormente publicada de MMP-2 humana (Collier et al., J. Biol. Chem., 263: 6579-6587 (1988)) e para codificar um sítio de restrição EcoRI interno, introduzido para permitir a inserção dos produtos amplificados no vector de expressão apropriado.

Um iniciador a montante, concebido para codificar um sítio de iniciação da proteína MMP-2 humana na posição 203, a seguir a um sítio de restrição EcoRI de endonuclease interno manipulado, para inserção no vector de GST pGEX-ΙλΤ, tinha a sequência 61 nucleotídica (5'GATGAATTCTACTGCAAGTT3' (SEQ ID N° 43)). As extremidades 5' e 3' do iniciador corresponderam, respectivamente, às posições 685-704 da sequência da fase de leitura aberta de MMP-2 humana. Outro iniciador a montante, concebido para codificar um sitio de iniciação da proteína MMP-2 humana na posição 439, a seguir a um sitio de restrição EcoRI interno manipulado, para inserção no vector de GST pGEX-lÀT, tinha a sequência nucleotídica (5'CACTGAATTCATCTGCAAACA3' (SEQ ID N° 44)) . As extremidades 5' e 3' do iniciador corresponderam, respectivamente, às posições 1392 e 1412 da sequência da fase de leitura aberta de MMP-2 humana.

Cada um dos iniciadores anteriores foi utilizado separadamente com um iniciador a jusante, tendo extremidades 5' e 3', respectivamente, complementares às bases 1998 e 1978 da sequência de MMP-2 humana que terminam distais em relação à fase de leitura aberta de MMP-2 e dirigem a terminação de proteína a seguir ao resíduo de aminoácido 631. Os produtos amplificados produziram proteínas de fusão expressas, contendo os resíduos de aminoácidos da MMP-2 humana 203-631 (SEQ ID N° 45) e 439-631 (SEQ ID N° 18).

Os produtos de PCR resultantes foram purificados, digeridos com EcoRI e repurifiçados para ligação a um plasmídeo pGEX-lÀT que foi analogamente digerido e desfosforilado, antes da reacção de ligação. As células foram transformadas como anteriormente descrito.

Outras proteínas de fusão de MMP-2 humana contendo os resíduos de aminoácidos 410-631 (SEQ ID N° 17), 439-512 (SEQ ID N° 19), 439-546 (SEQ ID N° 20), 510-631 (SEQ ID N° 21) e 62 543-631 (SEQ ID N° 22) também são preparadas, como anteriormente descrito, para utilização nos métodos desta invenção. B. Ensaio de Ligaçao Ligando-Receptor

Os péptidos sintéticos preparados no Exemplo 1, juntamente com as proteínas de fusão de MMP-2 anteriormente descritas, foram além disso rastreados através da medição da sua capacidade para antagonizarem a actividade de ligação de receptor de ανβ3 e oínbP3 em ensaios de ligação de ligando-receptor purificados. 0 método para estes estudos de ligação foi descrito por Barbas et ai., Proc. Natl. Acad. Sei., USA. 90:10003-10007 (1993), Smith et al., J. Biol. Chem., 265:11008-11013 (1990) e Pfaff et al., J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994), cujas divulgações são por este meio incorporadas por referência. É aqui descrito um método de identificação de antagonistas num ensaio de ligação ligando-receptor, no qual o receptor é imobilizado a um suporte sólido e o ligando e antagonista são solúveis. É também descrito um ensaio de ligação ligando-receptor, no qual o ligando é imobilizado a um suporte sólido e o receptor e antagonistas são solúveis.

Resumidamente, integrinas purificadas seleccionadas foram separadamente imobilizadas em poços de microtitulação Titertek, a uma concentração de revestimento de 50 nanogramas (ng) por poço. A purificação dos receptores utilizados nos ensaios de ligação ligando-receptor é bem conhecida na técnica e é facilmente obtenível com métodos familiares ao especialista na técnica. Após incubação, durante 18 horas, a 4 °C, sítios de ligação não específica na placa foram bloqueados com 10 63 miligramas/mililitro (mg/mL) de albumina de soro bovino (BSA) em solução salina tamponada com Tris. Para estudos de inibição, diversas concentrações de péptidos seleccionados da Tabela 1 foram testadas para a capacidade de bloquear a ligação de I-vitronectina ou 125I-fibrinogénio aos receptores de integrina, ανβ3 e oínbP3. Embora estes ligandos exibam ligação óptima para uma particular integrina, vitronectina para ανβ3 e fibrinogénio para αIIbβ3, a inibição de estudos de ligação utilizando péptidos para bloquear a ligação de fibrinogénio a qualquer dos receptores, permitiu a determinação exacta da quantidade em micromoles (μΜ) de péptido necessária para inibir a metade do máximo a ligação de receptor a ligando. Os ligandos marcados radioactivamente foram utilizados a concentrações de 1 nM e a ligação foi desafiada separadamente com péptidos sintéticos não marcados.

Após uma incubação de três horas, o ligando livre foi removido por lavagem e o ligando ligado foi detectado por contagem gama. Os dados dos ensaios onde foram utilizados péptidos cíclicos seleccionados, listados na Tabela 1, para inibir a ligação de receptores e fibrinogénio marcado radioactivamente aos receptores ανβ3 e αιΐόβ3 separadamente imobilizados eram altamente reproduzíveis, com o erro entre pontos de dados, de um modo típico, abaixo de 11%. Os dados de IC50, em micromoles (IC50 μΜ) , são expressos como a média de pontos de dados em duplicado ± o desvio-padrão, como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2 Péptido N° 0ίνβ3 (IC5o, μΜ) 0ίι^β3 (leso, μΜ) 62181 1,96 ± 0,62 14,95 ± 7,84 62184 0,05 ± 0,001 0,525 ± 0,10 62185 0,885 ± 0,16 100 ± 0,001 62187 0,05 ± 0,001 0,26 ± 0,056 62186 57, 45 ± 7,84 100 ± 0,001 62175 1, 05 ± 0,07 0,63 ± 0,18 62179 0,395 ± 0,21 0,055 ± 0,007

Assim, os péptidos cíclicos contendo RGD ou derivatizados de RGD, 62181, 62184, 62185 e 62187, cada um tendo um resíduo de aminoácido D, exibiram inibição preferencial da ligação de fibrinogénio ao receptor ανβ3, como medida pela concentração inferior de péptido requerido para inibição a metade do máximo, em comparação com aquela para o receptor αι^β3· Em contraste, os outros péptidos cíclicos contendo RGD ou derivatizados de RGD, 62186, 62175 e 62179, ou não foram tão eficazes no bloqueio da ligação de fibrinogénio a ανβ3 ou exibiram inibição preferencial da ligação de fibrinogénio a οίι^β3, em comparação a ανβ3· Estes resultados são consistentes com aqueles recentemente publicados por Pfaff, et al., J. Biol. Chem., 269: 20233-20238 (1994), nos quais o péptido cíclico RGDFV (em que F indica um resíduo de aminoácido D) especificamente inibiu a ligação de fibrinogénio à integrina ανβ3 e não às integrinas οίι^β3 ou α5βι. Ensaios de inibição de ligação semelhantes foram realizados com péptidos linearizados tendo ou desprovidos de um motivo RGD, cujas sequências foram derivadas da subunidade α v do receptor, subunidade anb do receptor ou sequências de resíduos de aminoácidos do ligando de vitronectina. As sequências dos 65 péptidos lineares , 62880 (resíduos de aminoácidos 35-49 derivados de VN) , 62411 (resíduos de aminoácidos 676-687 derivados de ) ; 62503 (resíduos de aminoácidos 655-667 derivados de Oív) e 62502 (resíduos de aminoácidos 296-306 derivados de 0<nb) r são listadas na Tabela 1. Cada um destes péptidos foi utilizado em ensaios separados, para inibir a ligaçao de vitronectina (VN) ou fibrinogénio (FG) a 0ίι^β3 ou Οίνβ3 · Os dados de IC5o, em micromoles (IC5o μΜ) , de um ensaio individual para cada experiência são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3 Péptido N° IC5o de αιη>β3 (μΜ) IC5o de Οίνβ3 (μΜ) FG VN FG VN 62880 4,2 0,98 <0,1 0,5 62411 >100 >100 >100 >100 62503 >100 >100 >100 >100 62502 90 5 >100 >100

Os resultados de inibição dos ensaios de ligação de ligando a receptores de integrina seleccionados com péptidos linearizados mostram gue apenas o péptido 62880 foi eficaz na inibição da ligação a metade do máximo de FG ou VN a 3νβ3, como medida pela concentração inferior de péptido requerido para inibição a metade do máximo, em comparação com o receptor αι^β3. Nenhum dos outros péptidos linearizados foi eficaz a bloquear a ligação de ligando a ανβ3, embora o péptido 62502 fosse eficaz a bloquear a ligação de VN a αΙΙ3)β3. 66

Em outros ensaios de ligação de receptor de ligando realizados como anteriormente descrito, com a excepção de que a detecção de ligação ou sua inibição foi com ELISA e IgG de cabra conjugado a peroxidase anti-coelho, demonstrou-se que os ligandos VN, MMP-2 e fibronectina, a uma gama de 5-50 ng/poço e listados pela ordem de eficácia, se ligam ao ανβ3 imobilizado, ao passo que o colagénio não se ligou. Além disso, a capacidade de os péptidos inibirem a ligação de MMP-2 ou VN a ανβ3 imobilizado foi avaliada com os péptidos 69601 (SEQ ID N° 6) e 66203 (SEQ ID N° 5) . Apenas o péptido 66203 foi eficaz na inibição da ligação de qualquer dos substratos ao receptor ανβ3, ao passo que o péptido de controlo 69601 fracassou em ter um efeito com qualquer dos ligandos. A especificidade de ligação de MMP-2 a receptores de integrina foi confirmada com um ensaio de ligação de receptor de fase sólida, no qual se demonstrou que a MMP-2 iodada se liga a ανβ3 e não a 0ίι^β3 que tinha sido imobilizado numa fase sólida (300 cpm ligado versus, aproximadamente, 10 CPM ligado). A capacidade de um péptido ou proteína de fusão derivado de MMP-2 inibir a ligação específica de MMP-2 a ανβ3 foi demonstrada num ensaio comparável, cujos resultados são mostrados na Figura 23. A proteína de fusão GST-CTMMP-2(445-637) (também referida como CTMMP-2(2-4)), preparada como anteriormente descrito, marcada GST-MAID, inibiu a ligação de MMP-2 iodada a ανβ3, ao passo que o GST isolado não teve qualquer efeito com os níveis de CPM ligado comparáveis a poços não recebendo qualquer inibidor (marcados NT). A proteína de fusão de MMP-2, referida como CTMMP-2(274-637) , também referida como CTMMP-2(10-1) , fracassou na inibição da ligação de MMP-2 marcada a ανβ3· 67 A especificidade da interacção de receptor com antagonistas derivados de MMP-2 foi confirmada com ensaios de ligação e inibição de ligação de fase sólida. A CTMMP-2(2-4) , marcada na Figura 24 como [1251] GST2-4, ligou-se a ανβ3 e não a αιη>β3, ao passo que a CTMMP-2(10-1), marcada na Figura 24 como [1251] GST10-1, não se ligou a qualquer dos receptores no ensaio de fase sólida in vitro. Além disso, a ligação de GST2-4 marcada sofreu competição de GST2-4 não marcada.

Assim, o ensaio ligando-receptor aqui descrito pode ser utilizado para rastrear para péptidos sintéticos circulares ou linearizados que exibam especificidade selectiva para um particular receptor de integrina, especificamente ανβ3, como utilizados como antagonistas de receptores de vitronectina (ανβ3) na prática desta invenção. 5. Caracterização da Membrana Corioalantóica de Pinto Nao Tratada (CAM)

A. Preparação da CAM A angiogénese pode ser induzida na membrana corioalantóica de pinto (CAM) depois de a angiogénese embrionária normal ter resultado na formação de vasos sanguíneos maduros. Demonstrou-se que a angiogénese é induzida em resposta a citocinas específicas ou fragmentos tumorais, como descrito por Leibovich et al., Nature, 329:630 (1987) e Ausprunk et al. , Am. J. Pathol., 79:597 (1975) . As CAM foram preparadas a partir de embriões de pinto para indução subsequente de angiogénese e sua inibição, como descrito nos Exemplos 6 e 7, respectivamente. Embriões de pinto de dez dias de idade foram obtidos de Mclntyre Poultry 68 (Lakeside, CA) e incubados, a 37 °C, com 60% de humidade. Foi feito um pequeno orifício através da casca na extremidade do ovo directamente sobre o saco aéreo com a utilização de um berbequim de bricolagem (Dremel, Division of Emerson Electric Co. Racine WI). Um segundo orifício foi perfurado no lado largo do ovo numa região desprovida de vasos sanguíneos embrionários, determinada anteriormente através de observação do ovo. Foi aplicada pressão negativa ao orifício original que resultou no afastamento da CAM (membrana corioalantóica) da membrana da casca e criação de um falso saco aéreo sobre a CAM. Foi cortada uma janela quadrada, de 1,0 centímetros (cm) x 1,0 cm, através da casca sobre a CAM descaída com a utilização de um modelo de mó pequena (Dremel). A pequena janela permitiu o acesso directo à CAM subjacente. A preparação CAM resultante foi, depois, utilizada aos 6 dias de embriogénese, um estádio marcado por neovascularização activa, sem tratamento adicional à CAM reflectindo o modelo utilizado para avaliação dos efeitos sobre a neovascularização embrionária ou utilizada aos 10 dias de embriogénese, se a angiogénese tiver abrandado. A última preparação foi, assim, utilizada nesta invenção para a indução de angiogénese renovada, em resposta a tratamento de citocina ou contacto de tumor, como descrito no Exemplo 6.

B. Histologia da CAM

Para analisar a estrutura microscópica das CAM de embrião de pinto e/ou tumores humanos que foram resseccionados dos embriões de pinto, como descrito no Exemplo 8, as CAM e tumores foram preparados para seccionamento de congelação, como descrito no Exemplo 3A. Secções de seis mícrones (pm) de espessura foram 69 cortadas dos blocos congelados num micrótomo criostático para análise de imunofluorescência. A Figura 4 mostra uma microfotografia típica de uma área desprovida de vasos sanguíneos numa CAM de 10 dias de idade não tratada. Como a angiogénese no sistema CAM está a abrandar neste estádio de embriogénese, o sistema é útil nesta invenção para a estimulação de produção de nova vasculatura a partir de vasos existentes de áreas adjacentes para áreas da CAM actualmente desprovidas de quaisquer vasos. C. Perfil de_Integrina na CAM Detectada por

Imunofluorescência

Para examinar a distribuição tecidular de receptores de integrina presentes em tecidos CAM, secções congeladas de 6 pm de tecidos CAM, tanto de tecido tumoral como de embrião de pinto, foram fixas em acetona, durante 30 segundos e coradas por imunofluorescência com 10 microgramas/mililitro (pg/mL) de mAb CSAT, um anticorpo monoclonal específico para a subunidade βι de integrina, como descrito por Buck et al., J. Cell Biol., 107: 2351 (1988) e, assim, utilizado para controlos, ou LM609 como preparado no Exemplo 2. A coloração primária foi seguida de coloração com uma diluição 1:250 de anticorpo de cabra anti-murganho marcado com rodamina (Tago), para permitir a detecção do produto imunorreactivo primário. As secções foram, depois, analisadas com um microscópio composto de imunofluorescência Zeiss.

Os resultados da análise de imunofluorescência mostram que os vasos sanguíneos maduros presentes num embrião de pinto de 70 10 dias de idade não tratado expressaram a subunidade βι de integrina (Figura 5A) . Em contraste, numa secção em série do tecido mostrado na Figura 5A, não foi revelada qualquer imunorreactividade com LM609 (Figura 5B). Assim, a integrina ανβ3 detectada pelo anticorpo LM609 não estava a ser activamente expressa pelos vasos sanguíneos maduros presentes num embrião de pinto de 10 dias de idade não tratado. Como mostrado no modelo CAM e nos Exemplos seguintes, enquanto os vasos sanguíneos estão a ser submetidos a crescimento novo em embriogénese normal ou induzida por citocinas ou tumores, os vasos sanguíneos estão a expressar ανβ3· Contudo, após neovascularização activa, uma vez que os vasos tenham parado de se desenvolver, a expressão de ανβ3 diminui para níveis não detectáveis por análise de imunof luorescência. Esta regulação de expressão de ανβ3 em vasos sanguíneos submetidos a angiogénese, em contraposição com a ausência de expressão em vasos maduros, produz a capacidade única desta invenção para controlar e inibir a angiogénese, como mostrado nos Exemplos seguintes, utilizando o sistema de ensaio de angiogénese CAM.

Em outros perfis, a metaloproteinase MMP-2 e ανβ3 co-localizaram-se em células endoteliais submetidas a angiogénese três dias após indução de bFGF no modelo CAM de 10 dias de idade. A MMP-2 foi apenas minimamente expressa em vasos que não tinham o receptor ανβ3· Além disso, a MMP-2 co-localizou-se com ανβ3 em vasos sanguíneos angiogénicos associados a tumor M21-L in vivo (tumores resultando de injecção de células de melanoma humano M21-L na derme de enxertos de pele humana cultivados em murganhos SCID, como descrito no Exemplo 11), mas não com vasos sanguíneos não associados a tumor preexistentes. Resultados semelhantes da associação selectiva de MMP-2 e ανβ3 71 também foram obtidos contendo tumores de melanoma CS-1 exibindo ανβ3ηο modelo CAM mas não com células CS-1 desprovidas de ανβ3.

6. Ensaio de Angiogénese CAM A. Angiogénese Induzida por Factores de Crescimento

Demonstrou-se que a angiogénese é induzida por citocinas ou factores de crescimento, como referenciado no Exemplo 5A. Nas experiências aqui descritas, a angiogénese na preparação CAM descrita no Exemplo 5 foi induzida por factores de crescimento que foram topicamente aplicados sobre os vasos sanguíneos da CAM, como aqui descrito. A angiogénese foi induzida através da colocação de um disco de filtro Whatman, de 5 milímetros (mm) X 5 mm (Papel de filtro Whatman N° 1) saturado com Solução Salina Equilibrada de Hanks (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) ou HBSS contendo 150 nanogramas/mililitro (ng/mL) de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) recombinante (Genzyme, Cambridge, MA) na CAM de um embrião de pinto de 10 dias, numa região desprovida de vasos sanguíneos e as janelas foram mais tarde seladas com fita. Em outros ensaios, 125 ng/mL bFGF também foram eficazes na indução de crescimento de vasos sanguíneos. Para os ensaios onde a inibição de angiogénese foi avaliada com injecções intravenosas de antagonistas, a angiogénese foi primeiro induzida com 1-2 pg/mL de bFGF em meio de crescimento de fibroblastos. A angiogénese foi monitorizada por fotomicroscopia após 72 horas. As CAM foram imediatamente congeladas, e secções criostáticas de 6 pm foram fixas com acetona e coradas por 72 imunofluorescência, como descrito no Exemplo 5C, com 10 pg/mL de anticorpo monoclonal anti-βι CSAT ou LM609. A microfotografia de imunofluorescência na Figura 5C mostra expressão melhorada de ανβ3 durante a angiogénese induzida por bFGF na CAM de pinto, em contraste com a ausência de expressão de ανβ3 numa CAM de pinto não tratada, como mostrado na Figura 5B. Ο ανβ3 era facilmente detectável em muitos (75% a 80%) dos vasos nas CAM tratadas com bFGF. Além disso, a expressão da integrina βι não se alterou daquela verificada numa CAM não tratada, visto que ο βι também era facilmente detectável em vasos sanguíneos estimulados. A expressão relativa das integrinas ανβ3 e βι foi, depois, quantificada durante a angiogénese induzida por bFGF por análise de imagem confocal laser das secções criostáticas de CAM. As secções coradas foram, depois, analisadas com um microscópio confocal laser Zeiss. Vinte e cinco vasos corados com LM609 e 15 corados com CSAT (tamanho médio - 1200 mm2, gama de 350 a 3500 mm2) foram seleccionados de campos aleatórios e a fluorescência média de rodamina para cada vaso por área unitária foi medida em unidades arbitrárias por análise de imagem confocal laser. Os dados são expressos como a intensidade média de fluorescência em unidades arbitrárias de vasos ± erro-padrão (SE) .

Os resultados representados graficamente na Figura 6 mostram que a coloração de ανβ3 foi significativamente melhorada (quatro vezes superior) em CAM tratadas com bFGF, como determinado pelo Teste da Soma dos Números de Ordem de Wilcoxon (P<0,0001), ao passo que a coloração de βι não foi significativamente diferente com tratamento de bFGF. 73 0 ensaio CAM foi além disso utilizado para examinar o efeito de outro potente indutor de angiogénese, factor de necrose tumoral alfa (TNFa), sobre a expressão das integrinas βι e β3. Verificou-se que discos de filtro impregnados com bFGF ou TNFa e colocados em CAM provenientes de embriões de 10 dias promovem a angiogénese local após 72 horas.

Os resultados são mostrados nas microfotografias de CAM não tratadas (Figura 7A) , tratadas com bFGF (Figura 7B) ou tratadas com TNFa (Figura 7C). Os vasos sanguíneos são facilmente perceptíveis nas preparações tratadas tanto com bFGF como TNFa mas não estão presentes nas CAM não tratadas. Assim, a aplicação tópica de um factor de crescimento/citocina resultou na indução de angiogénese de vasos maduros numa área adjacente para a área originalmente desprovida de vasos sanguíneos. Em consideração dos vasos sanguíneos induzidos por bFGF e concomitante expressão de ανβ3, como mostrado na Figura 5C, o tratamento de TNFa resulta em actividades comparáveis.

Estas verificações indicam que tanto em humanos como pintos, os vasos sanguíneos envolvidos em angiogénese mostram expressão melhorada de ανβ3. Consistente com isto, a expressão de ανβ3 em células endoteliais cultivadas pode ser induzida por diversas citocinas in vitro, como descrito por Janat et al., J. Cell Physiol., 151:588 (1992); Enenstein et al., Exp. Cell Res., 203:499 (1992) e Swerlick et al., J. Invest. Derm., 99:715 (1993) . 0 efeito sobre a angiogénese induzida por factor de crescimento por inibidores peptídicos e de anticorpo é apresentado nos Exemplos 7A e 7B. 74 Β. Angiogénese Embrionária A preparação CAM para avaliação do efeito de inibidores de angiogénese sobre a formação natural de neovasculatura embrionária foi o embrião de pinto embrionário de 6 dias, como anteriormente descrito. Neste estádio do desenvolvimento, os vasos sanguíneos estão a ser submetidos a crescimento de novo e, assim, proporcionam um sistema útil para determinar se ο ανβ3 participa na angiogénese embrionária. 0 sistema CAM foi preparado como anteriormente descrito, com a excepção de que o ensaio foi realizado no dia embrionário 6, em vez de no dia 10. O efeito sobre a angiogénese embrionária por tratamento com anticorpos e péptidos desta invenção é apresentado no Exemplo 7C. C. Angiogénese Induzida por Tumores

Para investigar o papel de ανβ3 na angiogénese induzida por tumor, diversos fragmentos de melanoma e carcinoma humanos negativos para ανβ3 foram utilizados no ensaio CAM que foi anteriormente cultivado e isolado a partir da CAM de embrião de pinto de 17 dias, como descrito por Brooks et ai., J. Cell Biol., 122: 1351 (1993) e como aqui se descreve. Os fragmentos induziram extensa neovascularização na presença apenas de tampão. A angiogénese foi induzida no sistema de ensaio CAM por aposição directa de um fragmento tumoral na CAM. A preparação da CAM de embrião de pinto foi idêntica ao processo anteriormente descrito. Em vez de um disco de papel de filtro, um fragmento de 50 miligramas (mg) a 55 mg, de um de tumor de melanoma humano 75 M21-L, tumor de carcinoma do pulmão humano UCLAP-3, linha celular FG de carcinoma pancreático humano (Cheresh et al., Cell 58:945-953, 1989) ou linha celular HEp3 de carcinoma laringeo humano, sendo todos eles tumores negativos para ανβ3, foi colocado na CAM numa área originalmente desprovida de vasos sanguíneos. A linha celular de melanoma humano M21-L, linha celular de carcinoma do pulmão humano UCLAP-3, linha celular de carcinoma pancreático FG ou linha celular de carcinoma laringeo humano HEp3, todas negativas para ανβ3, foram utilizadas para cultivar os tumores humanos sólidos nas CAM de embriões de pinto. Uma suspensão celular simples de 8 x 106 células de M21-L, UCLAP-3 e FB ou 5 x 105 de HEp3 foi primeiro aplicada às CAM, num volume total de 30 pL de HBSS estéril. As janelas foram seladas com fita e os embriões foram incubados, durante 7 dias, para permitir o crescimento de lesões tumorais humanas. No fim de 7 dias, agora um embrião de 17 dias, os tumores foram resseccionados das CAM e expurgados de tecido CAM circundante. Os tumores foram cortados em fatias de fragmentos tumorais de 50 mg a 55 mg para utilização em ensaios de angiogénese ou crescimento tumoral. Os fragmentos tumorais foram colocados num novo conjunto de CAM de embrião de pinto de 10 dias, como descrito no Exemplo 6A, numa área desprovida de vasos sanguíneos.

Os tumores cultivados in vivo nas CAM de embrião de pinto foram corados para expressão de ανβ3 com o mAb LM609, como descrito no Exemplo 3A. Não foi observada coloração específica de células tumorais, indicando uma ausência de expressão de ανβ3· 76 tumorais de

Estas preparações tumorais de CAM foram, depois, subsequentemente tratadas como descrito nos Exemplos 7D e 7E, para medição dos efeitos de anticorpos e péptidos sobre a angiogénese induzida por tumor. As preparações tumorais de CAM também foram tratadas como descrito nos Exemplos 8, 9 e 12, para medição dos efeitos de anticorpos e péptidos sobre a regressão de tumores e apoptose de vasos sanguíneos angiogénicos e células vasculares.

7: Inibição de Angiogénese como Medida no Ensaio CAM A. Inibição de Angiogénese Induzida por Factor de Crescimento por Aplicação Tópica de Inibidores 1) Tratamento com Anticorpos Monoclonais (não faz parte da invenção)

Para determinar se ο ανβ3 desempenha um papel activo na angiogénese, discos de filtro saturados com bFGF ou TNFa foram colocados em CAM, depois, os anticorpos monoclonais (também referidos como mAb), LM609 (específico para ανβ3), CSAT (específico para βι) ou P3G2 ou também P1F6 (ambos específicos para ανβδ) foram adicionados à preparação. A angiogénese foi induzida em CAM de embriões de pinto de 10 dias por intermédio de discos de filtro saturados com bFGF. Os discos foram, depois, tratados com 50 mL de HBSS contendo 25 mg de mAb, num volume total de 25 pL, de HBSS estéril a 0, 24 e 48 horas. Às 72 horas, as CAM foram recolhidas e colocadas numa placa de petri de 35 mm e lavadas, uma vez, com 1 mL de solução salina tamponada com fosfatos. O lado de baixo do papel de filtro e tecido CAM foi, depois, analisado sob um microscópio 77 estéreo Olympus, com dois observadores num modo duplamente cego. A inibição de angiogénese foi considerada significativa quando as CAM exibiram redução de >50% na infiltração de vasos sanguíneos da CAM directamente sob o disco. As experiências foram repetidas quatro vezes por anticorpo, com 6 a 7 embriões por condição.

Os resultados dos efeitos do tratamento de mAb sobre a angiogénese induzida por bFGF são mostrados nas Figuras 8A-8B. Uma preparação CAM não tratada desprovida de vasos sanguíneos é mostrada na Figura 8A, para produzir uma comparação com a indução de vasos sanguíneos de bFGF mostrada na Figura 8B e efeitos nesta pelos mAb nas Figuras 8C-8E. Cerca de 75% destas CAM tratadas com o mAb LM609 exibiram >50% de inibição de angiogénese, como mostrado na Figura 8E, e muitas destas surgiram desprovidas de infiltração de vasos. Em contraste, o controlo de tampão (Figura 8A) e discos tratados com os mAb CSAT (Figura 8C) e P3G2 (Figura 8D) consistentemente mostraram extensa vascularização.

Idênticos resultados foram obtidos quando a angiogénese foi induzida com TNFa. Para examinar o efeito destes mesmos anticorpos sobre vasos sanguíneos maduros preexistentes, presentes a partir de desenvolvimento de vasos normais, adjacentes às áreas desprovidas de vasos, discos de filtro saturados com mAb foram colocados em regiões vascularizadas de CAM de embriões de 10 dias que não receberam aplicação tópica de citocina. Nenhum destes três mAb afectou vasos preexistentes, como avaliado por visualização sob um microscópio estéreo. Assim, o mAb LM609 inibiu selectivamente apenas o crescimento de novos vasos sanguíneos e não afectou os vasos sanguíneos maduros presentes em áreas adjacentes. Este mesmo efeito foi verificado 78 com a aplicação de péptidos sintéticos aplicados topicamente ou intravenosamente, como descrito nos Exemplos 7A2) e 7E2), respectivamente. 2) Tratamento com Péptidos Sintéticos (nao faz parte da invenção)

Os ensaios CAM também foram realizados com os péptidos sintéticos desta invenção, para determinar o efeito de péptidos cíclicos e linearizados sobre a angiogénese induzida por factor de crescimento. Os péptidos foram preparados como descrito no Exemplo 1 e 80 pg de péptidos foram apresentados num volume total de 25 pL de HBSS estéril. A solução peptídica foi aplicada à preparação CAM imediatamente e, depois, de novo às 24 e 48 hrs. Às 72 horas, o papel de filtro e tecido CAM circundante foram dissecados e visualizados como anteriormente descrito.

Resultados deste ensaio revelaram serem semelhantes àqueles mostrados nas Figuras 9A-9C, como descrito no Exemplo 7E2), onde os péptidos sintéticos foram intravenosamente injectados dentro de vasos sanguíneos induzidos por tumor. Aqui, com o péptido de controlo, 62186, os vasos sanguíneos induzidos por bFGF permaneceram não perturbados, como mostrado na Figura 9A. Em contraste, quando o péptido cíclico RGD, 62814, foi aplicado ao filtro, a formação de vasos sanguíneos foi inibida, deixando a área desprovida de nova vasculatura. Este efeito foi semelhante em aparência àquele mostrado na Figura 9B, como descrito no Exemplo 7E2) abaixo. Além disso, também como mostrado na Figura 9C para péptidos intravenosamente injectados, em áreas nas quais estavam presentes vasos sanguíneos maduros, embora distantes da colocação do filtro saturado com factor de crescimento, não foi 79 observado qualquer efeito com o tratamento tópico de péptidos sintéticos nestes vasos afastados. A actividade inibitória dos péptidos em angiogénese está, assim, limitada às áreas de angiogénese induzida por factores de crescimento e não afecta vasos maduros preexistentes adjacentes ou resulta em qualquer citotoxicidade prejudicial para a área circundante. São realizados ensaios semelhantes com os outros péptidos sintéticos preparados no Exemplo 1 e listados na Tabela 1. 3) Tratamento com Fragmentos Peptídicos de MMP-2 (nao faz parte da invenção)

Para demonstrar os efeitos biológicos de fragmentos peptídicos de MMP-2 na angiogénese, ensaios CAM foram realizados como anteriormente descrito, com a excepção de que a angiogénese foi induzida com discos de filtro saturados, durante 10 minutos, com bFGF a uma concentração de 1,0 pg/mL em HBS. Os discos foram, depois, posicionados na CAM numa área que era reduzida no número de vasos preexistentes. A proteína de fusão C-terminal CTMMP-2 (410-637) , preparada como anteriormente descrito, ou proteína de fusão associada a receptor GST de controlo (RAP) (1,5 pg em 30 pL de HBSS) foi aplicada, depois, topicamente ao disco de filtro uma vez por dia, durante um total de três dias. No fim do período de incubação, os embriões foram sacrificados e o disco de filtro e tecido CAM subjacente foram resseccionados e analisados para a angiogénese com um microscópio estéreo. A angiogénese foi quantificada por contagem do número de pontos de ramificação de vasos sanguíneos que ocorreram dentro das fronteiras dos discos de filtro. Os vasos sanguíneos ramificados 80 sao considerados como correspondendo principalmente a novos vasos sanguíneos em germinação angiogénica. A quantificação foi realizada num modo duplamente cego por, pelo menos, dois observadores independentes. Os resultados são expressos como o índice Angiogénico, onde o índice angiogénico é o número de pontos de ramificação (estimulados com bFGF) menos o número de pontos de ramificação (não estimulados de controlo) por disco de filtro. As experiências rotineiramente tiveram 6-10 embriões por condição.

Os resultados do ensaio de angiogénese CAM são mostrados nas Figuras 25A-D, 26 e 27. Na Figura 25, uma série de fotografias dividida em quatro figuras, Figuras 25A-D, ilustra a comparação de angiogénese inibida na presença da proteína de fusão CTMMP-2 (CTMMP-2(410-637) (Figuras 25C-D) e não inibida na presença de proteína de fusão de GST de controlo (Figuras 25A-B) . As Figuras 26 e 27 são gráficos de barras ilustrando o índice de angiogénese de ensaios de angiogénese CAM com CTMMP-2, a mesma proteína de fusão como anteriormente, em comparação com controlos (apenas bFGF ou proteína de fusão GST-RAP) . Na Figura 27 são mostrados os resultados de duas experiências separadas (N° 1 & N° 2) utilizando a proteína de fusão CTMMP-2(410-637).

Estes resultados, demonstrados em todas as três figuras, indicam que uma proteína de fusão CTMMP-2 ou polipéptido contendo um domínio C-terminal de MMP-2 é uma composição útil para inibição de angiogénese mediada por bFGF, por inibição de ®νβ3 · 81 Β. Inibição de Angiogénese Induzida por Factor de Crescimento por Aplicação Intravenosa de Inibidores 1) Tratamento com Anticorpos Monoclonais (nao faz parte da invenção) 0 efeito sobre a angiogénese induzida por factor de crescimento, com anticorpos monoclonais intravenosamente injectados dentro da preparação CAM, também foi avaliado para utilização nesta invenção. A preparação das CAM de embrião de pinto para injecções intravenosas foi essencialmente como descrita no Exemplo 7A, com algumas modificações. Durante os processos de observação, foram seleccionados vasos sanguíneos salientes e foram feitas marcas na casca do ovo, para indicar as suas posições. Os orifícios foram perfurados na casca e as CAM descaíram e papéis de filtro saturados com bFGF foram colocados nas CAM, como anteriormente descrito. As janelas foram seladas com fita estéril e os embriões foram recolocados na incubadora. Vinte e quatro horas mais tarde, uma segunda janela pequena foi cuidadosamente cortada no lado lateral da casca de ovo, directamente sobre os vasos sanguíneos salientes, anteriormente seleccionados. A casca de ovo exterior foi cuidadosamente removida, deixando as membranas embrionárias intactas. A membrana da casca foi tornada transparente com uma pequena gota de óleo mineral (Perkin-Elmer Corp, Norwalk, CT) que permitiu que os vasos sanguíneos fossem facilmente visualizados. mAb estéreis purificados, ou péptidos sintéticos, os últimos dos quais são descritos abaixo, foram inoculados directamente dentro dos vasos sanguíneos uma vez, com uma agulha de calibre 3 0 a uma dose de 200 pg de IgG por embrião, num volume total de 100 pL de PBS estéril. As janelas 82 foram seladas com fita e os embriões foram deixados a incubar até às 72 horas. Os discos de filtro e tecidos CAM circundantes foram analisados como descrito antes.

Para determinar a localização de mAb LM609 em tecidos CAM ou em tecidos tumorais, como aqui mostrado e nos Exemplos seguintes que foram anteriormente inoculados intravenosamente com LM609, as secções fixas foram bloqueadas com BSA a 2,5% em HBSS, durante 1 hora, à temperatura ambiente, seguido de coloração com uma diluição 1:250 de anticorpo secundário de cabra anti-murganho marcado com rodamina (Tago). As secções foram, depois, analisadas com um microscópio composto de imunofluorescência Zeiss.

Os resultados do tratamento intravenoso com anticorpo para a preparação CAM de vaso sanguíneo induzido com bFGF são mostrados nas Figuras 10A-10C. Na Figura 10A, é mostrada a angiogénese induzida como resultado de tratamento de bFGF. Não foi observada qualquer alteração para a presença de vasculatura induzida por bFGF com a exposição intravenosa ao mAb P3G2, um anticorpo anti-o^3, como mostrado na Figura 10B. Em contraste, o tratamento da preparação CAM de angiogénese induzida por bFGF com LM609, um anticorpo anti-avP3, resultou na completa inibição de crescimento de novos vasos dentro da área de filtro, como mostrado na Figura 10C. O efeito inibidor sobre a angiogénese é, assim, resultante da inibição da actividade de receptor de ανβ3 pelo anticorpo específico de anti-avP3 LM609 . Uma vez que o bloqueio do ανβ5 não inibe a formação de neovasculatura dentro do local do filtro das CAM, assim, ο ανβ5 não é essencial em comparação a ανβ3 para crescimento de novos vasos. 83 2) Tratamento com Péptidos Sintéticos (não faz parte da invenção)

Para as preparações CAM, nas quais a angiogénese foi induzida com bFGF a 1-2 pg/mL, como anteriormente descrito, os péptidos sintéticos 69601 (controlo) e 66203 (SEQ ID N° 5) foram separadamente injectados intravenosamente dentro de preparações CAM, 18 horas após indução de bFGF de angiogénese. As preparações foram mantidas durante 36-40 horas adicionais, depois das quais o número de pontos de ramificação foi determinado como anteriormente descrito.

Os resultados são mostrados na Figura 28, onde o péptido 66203 inibiu completamente a angiogénese induzida por bFGF, em contraste com a ausência de inibição com o péptido de controlo.

Em outros ensaios, o péptido 85189 (SEQ ID N° 15) foi avaliado para inibição de angiogénese induzida por bFGF no ensaio CAM, numa gama de dosagens de 10 pg/embrião a 300 pg/embrião. O ensaio foi realizado como anteriormente descrito. Os resultados são mostrados na Figura 29, onde a dose menos eficaz foi de 30 pg, com 100 e 300 pg inibindo quase completamente a angiogénese.

Em ensaios adicionais, o péptido 85189 foi comparado aos péptidos 69601 e 66203 para actividade anti-angiogénese. O ensaio foi realizado como anteriormente descrito, com a excepção de que foram utilizados 50 pg de péptido. Os resultados, representados graficamente na Figura 30, mostram que os péptidos 66203 (marcado 203) e 85189 (marcado 189) foram inibidores eficazes de angiogénese mediada por bFGF, em comparação com 84 controlos tratados com bFGF (marcado bFGF) e tratados com 69601 (marcado 601). A eficácia das diferentes formulações salinas do péptido 85189 também foi avaliada em ensaios CAM induzidos por bFGF semelhantes. Os péptidos foram utilizados a 100 pg/embrião. A mesma sequência peptídica em HC1 (péptido 85189) e em TFA (péptido 121974) inibiu a angiogénese induzida por bFGF, com o péptido formulado com HC1 sendo ligeiramente mais eficaz do que aquele em TFA (o respectivo número de pontos de ramificação para o péptido 85189 versus 121974 é de 30 versus 60) . As CAM não tratadas, marcadas como "sem citocina" tinham, aproximadamente, apenas metade de pontos de ramificação que aqueles verificados com o tratamento de bFGF, respectivamente 70 versus 190. O tratamento com o péptido de controlo 69601 não teve qualquer efeito sobre a inibição de angiogénese (230 pontos de ramificação).

Os outros péptidos sintéticos preparados no Exemplo 1 são separadamente injectados intravenosamente dentro dos vasos sanguíneos induzidos por factor de crescimento na preparação CAM, como anteriormente descrito. O efeito dos péptidos sobre a viabilidade dos vasos é analogamente avaliado. 3) Tratamento com Fragmento de MMP-2 (não faz parte da invenção)

Com o protocolo anteriormente descrito, também foi avaliado o efeito de proteínas de fusão de MMP-2, CTMMP-2(2-4), também referida como CTMMP-2(445-637) e CTMMP-2(10-1), também referida como CTMMP-2 (274-637) . O ensaio foi realizado como anteriormente 85 descrito, com a excepção de que foram administrados 50 pg de proteína de fusão aos embriões tratados com bFGF. O efeito do tratamento com proteína de fusão foi avaliado às 24 horas, 48 horas e 72 horas.

Os resultados são mostrados para estes períodos de tempo seleccionados nas Figuras 31A-L, onde a angiogénese foi fotograficamente avaliada sob condições de, sem tratamento, tratamento de bFGF, tratamento de bFGF seguido de CTMMP-2(2-4), marcado como bFGF + MAID (MAID = domínio de inibição de angiogénese MMP-2) e tratamento de bFGF seguido de CTMMP-2(10-1), marcado como bFGF + Controlo. A indução significativa de angiogénese após 48 e 72 horas a seguir a tratamento de bFGF foi quase completamente inibida apenas com exposição a CTMMP-2(2-4). A extensão de inibição com CTMMP-2(2-4) foi superior àquela verificada com CTMMP-2(10-1) que exibiu alguma actividade anti-angiogénese in vivo.

As outras composições de MMP-2, MMP-2 completa, fragmentos e proteínas de fusão, preparadas como anteriormente descrito, também são separadamente injectadas intravenosamente dentro dos vasos sanguíneos induzidos por factor de crescimento na preparação CAM, como anteriormente descrito. O efeito dos péptidos sobre a viabilidade dos vasos é analogamente avaliado. 86 C. Inibição de Angiogénese Embrionária por Aplicaçao Tópica 1) Tratamento com Anticorpos Monoclonais (nao faz parte da invenção)

Para determinar se ανβ3 participa na angiogénese embrionária, foi examinado o efeito de LM609 sobre o crescimento de novo de vasos sanguíneos em CAM em embriões de 6 dias, um estádio marcado por neovascularização activa, como descrito no Exemplo 5A. 0 ensaio CAM foi preparado como descrito no Exemplo 6C, com a subseguente aplicação tópica de discos saturados com mAb colocados em CAM de embriões de 6 dias de idade na ausência de citocinas. Após 3 dias, as CAM foram resseccionadas e fotografadas. Cada experiência incluiu 6 embriões por grupo e foi repetida 2 vezes. 0 anticorpo LM609 (Figura 11C), mas não CSAT (Figura 11A) ou P3G2 (Figura 11B), preveniu o crescimento vascular nestas condições; isto indica que ο ανβ3 desempenha um papel substancial na neovascularização embrionária que era independente de factores de crescimento adicionados para indução de angiogénese. 2) Tratamento com Péptidos Sintéticos (não faz parte da invenção)

Os péptidos sintéticos, preparados no Exemplo, 1 são separadamente adicionados à preparação CAM embrionária, preparada anteriormente e como descrito no Exemplo 5A2), por aplicação tópica à CAM ou aplicação intravenosa a vasos sanguíneos. 0 efeito dos péptidos sobre a viabilidade dos vasos é analogamente avaliado. 87 D. Inibição de Angiogénese Induzida por Tumor por Aplicação Tópica 1) Tratamento com Anticorpos Monoclonais (não faz parte da invenção)

Além disso aos ensaios de angiogénese anteriormente descritos, onde foram avaliados os efeitos de antagonistas de anti-oç^3, LM609 e diversos péptidos, sobre a angiogénese embrionária, também foi investigado o papel de ανβ3 na angiogénese induzida por tumor. Como indutor, foram utilizados fragmentos de melanoma M21-L humano negativos para ανβ3, anteriormente cultivados e isolados da CAM de um embrião de pinto de 17 dias. Os fragmentos foram preparados como descrito no Exemplo 6C.

Como anteriormente descrito no Exemplo 7A1), os mAb foram separadamente aplicados topicamente aos fragmentos tumorais, a uma concentração de 25 pg em 25 pL de HBSS e as janelas foram, depois, seladas com fita. Os mAb foram mais uma vez adicionados do mesmo modo, às 24 horas e 48 horas. Às 72 horas, os tumores e tecidos CAM circundantes foram analisados como anteriormente descrito no Exemplo 7A1).

Como descrito no Exemplo 6C, os tumores foram inicialmente derivados por transplante de células M21-L cultivadas, que não expressam a integrina ανβ3, como descrito por Felding-Habermann et al., J. Clin. Invest., 89:2018 (1992), sobre as CAM de embriões de pinto de 10 dias de idade. Estes fragmentos negativos para θίνβ 3 induziram extensa neovascularização na presença apenas de tampão ou mAb CSAT (anti-βι) ou P3G2 (anti-ανβ3) · Em contraste, o mAb LM609 (anti-oç^3) aboliu a infiltração 88 da maioria dos vasos para o interior da massa tumoral e CAM circundante.

Para quantificar o efeito dos mAb sobre a angiogénese induzida por tumor, os vasos sanguíneos entrando no tumor dentro do plano focal da CAM foram contados sob um microscópio estéreo por dois observadores, num modo duplamente cego. Cada barra de dados apresentada na Figura 12 representa o número médio de vasos ± SE de 12 CAM em cada grupo, representando experiências em duplicado.

Esta análise quantitativa revelou uma redução de três vezes no número de vasos entrando em tumores tratados com mAb LM609, em comparação com tumores tratados com tampão ou os outros mAb, P3G2 ou CSAT (P< 0, 0001), como determinado pelo Teste da Soma dos Números de Ordem de Wilcoxon. O facto de os tumores M21-L não expressarem ανβ3 indica que o mAb LM609 inibe a angiogénese ao afectar directamente vasos sanguíneos, em vez das células tumorais. Estes resultados correspondem com a distribuição histológica de ανβ3 em biopsias de tecido cancerígeno mostradas na Figura 3A-3D, onde a distribuição de ανβ3 estava limitada aos vasos sanguíneos no tumor e não às próprias células tumorais. 2) Tratamento com Péptidos Sintéticos (não faz parte da invenção)

Os péptidos sintéticos preparados no Exemplo 1, incluindo péptidos e proteínas de fusão derivados de MMP-2 são topicamente aplicados ao sistema de ensaio CAM angiogénico induzido por tumor, como anteriormente descrito. O efeito dos péptidos sobre a viabilidade dos vasos é analogamente avaliado. 89 Ε. Inibição de Angiogénese Induzida por Tumor por Aplicação

Intravenosa 1) Tratamento com Anticorpos Monoclonais (nao faz parte da invenção)

Os vasos sanguíneos induzidos por tumor, preparados como descrito no Exemplo 7E1), também foram tratados com mAb aplicados por injecção intravenosa. Os tumores foram colocados nas CAM, como descrito no Exemplo 7D1) e as janelas seladas com fita e, 24 horas mais tarde, 200 pg de mAb purificados foram inoculados uma vez intravenosamente em vasos sanguíneos de embrião de pinto, como descrito anteriormente. Os embriões de pinto foram, depois, deixados a incubar durante 7 dias. A extensão de angiogénese foi, depois, observada como descrito anteriormente. Como descrito no Exemplo 8 abaixo, após este período de tempo, os tumores foram resseccionados e analisados pelo seu peso, para determinar o efeito da exposição de anticorpo sobre o crescimento ou supressão tumoral. 2) Tratamento com Péptidos Sintéticos (não faz parte da invenção)

Os efeitos da exposição peptídica sobre a vasculatura induzida por tumor no sistema de ensaio CAM também foram avaliados. A preparação tumor-CAM foi utilizada como anteriormente descrito, com a excepção de que em vez de injecção intravenosa de um mAb, péptidos sintéticos preparados como descrito no Exemplo 1 e Exemplo 7A2) foram separadamente injectados intravenosamente dentro de vasos sanguíneos visíveis. 90

Os resultados de ensaios CAM com o péptido cíclico, 66203, contendo o sal de HC1 e o péptido de controlo, 62186, são mostrados nas Figuras 9A-9C. Na Figura 9A, o tratamento com o péptido de controlo não afectou os abundantes vasos sanguíneos grandes que foram induzidos pelo tratamento de tumor a crescer dentro de uma área originalmente desprovida de vasos sanguíneos da CAM. Em contraste, quando o péptido cíclico RGD 66203, um antagonista para ανβ3, foi aplicado ao filtro, a formação de vasos sanguíneos foi inibida, deixando a área desprovida de nova vasculatura, como mostrado na Figura 9B. O efeito inibidor do péptido contendo RGD foi específico e localizado, como evidenciado por uma ausência de quaisquer efeitos prejudiciais a vasos localizados adjacentes à colocação de tumor. Assim, na Figura 9C, quando os péptidos inibidores são intravenosamente injectados dentro do sistema de ensaio CAM, não foi observado qualquer efeito sobre os vasos maduros preexistentes presentes na CAM em áreas adjacentes, embora distantes da colocação do tumor. Os vasos preexistentes nesta localização não foram afectados pelo péptido inibidor que fluía dentro daqueles vasos, embora a geração de novos vasos a partir destes vasos preexistentes dentro da massa tumoral fosse inibida. Assim, demonstrou-se agora que os péptidos sintéticos, incluindo 66203 e 62184, mostrados anteriormente em ensaios ligando-receptor no Exemplo 4 como sendo antagonistas de ανβ3, inibem a angiogénese que está limitada a vasos submetidos a desenvolvimento e não a vasos maduros preexistentes. Além disso, a infusão intravenosa de péptidos não resulta em qualquer citotoxicidade prejudicial para a área circundante, como evidenciado pela vasculatura intacta na Figura 9C. 91 São realizados ensaios semelhantes com os outros péptidos sintéticos preparados no Exemplo 1 e listados na Tabela 1, juntamente com as composições de MMP-2 desta invenção. 3) Tratamento com Fragmentos de MMP-2 (nao faz parte da invenção)

Um tumor CS-1 (negativo para β3> foi preparado numa CAM como anteriormente descrito. Após 24 horas de crescimento tumoral, uma composição de fragmento de MMP-2, designada CTMMP-2(2-4) e preparada como descrito no Exemplo 4A, foi administrada intravenosamente, a 50 pg de fragmento, em 100 pL de PBS. Após 6 dias, o tumor foi avaliado para massa. Os tumores tratados com CTMMP-2(2-4) foram reduzidos na taxa de crescimento em cerca de 50%, quando comparados à taxa de crescimento de tumores de controlo, tratados com CTMMP-2(10-1) ou com controlo de PBS. Assim, os antagonistas de ανβ3 inibiram o crescimento tumoral. 8. Inibição de Crescimento de Tecido Tumoral Com Antagonistas de ανβ3 Como Medido no Ensaio CAM (não faz parte da invenção)

Como descrito no Exemplo 7E1), além disso à avaliação visual do efeito de antagonistas de anti-o^3 sobre a angiogénese induzida por factor de crescimento ou tumor, o efeito dos antagonistas também foi avaliado através de medição de quaisquer alterações à massa tumoral após exposição. Para esta análise, o sistema de ensaio CAM de angiogénese induzida por tumor foi preparado como descrito no Exemplo 6C e 7D. No fim do período de incubação de 7 dias, os tumores resultantes foram resseccionados 92 das CAM e expurgados de qualquer tecido CAM residual, lavados com 1 mL de solução salina tamponada com fosfatos e os pesos húmidos foram determinados para cada tumor.

Além disso, a preparação do tumor para análise histológica microscópica incluiu a fixação de exemplos representativos de tumores em Bulins Fixative, durante 8 horas e embebimento em parafina. Foram cortadas secções em série e coradas com hematoxilina e eosina (H&E) para análise microscópica. Gladson, et al., J. Clin. Invest., 88 : 1924 (1991). As secções foram fotografadas com um microscópio composto Olympus a 250x. A. Aplicação Tópica

Os resultados de pesos típicos de tumor de melanoma humano (M21L) resultantes de aplicação tópica de tampão de controlo (HBSS) , P3G2 (anti-o^s) ou LM609 (anti-o^3) são listados na Tabela 4. Foi avaliado um determinado número de embriões para cada tratamento, com o peso médio de tumor em miligramas (mg) de cada um sendo calculado juntamente com o SE da média, como mostrado no fundo da Tabela.

Tabela 4

Embrião N° Tratamento de mAb Peso de Tumor (mg) 1

HBSS 108 2 152 3 216 4 270 93 (continuação)

Embrião N° Tratamento de mAb Peso de Tumor (mg) 5 109 6 174 1 P3G2 134 2 144 3 408 4 157 5 198 6 102 7 124 8 99 1 LM6 0 9 24 2 135 3 17 4 27 5 35 6 68 7 48 8 59 Tratamento de mAb Peso Médio de Tumor (mg)

Controlo de HBSS 172 ± 26 P3G2 171 ± 36 LM609 52 ± 13 94

Exposição de uma massa tumoral de melanoma humano negativo para ανβ3 no sistema de ensaio CAM a LM609 causou a diminuição do peso médio de tumor não tratado de 172 mg ± 26 para 52 mg ± 13. 0 anticorpo P3G2 não teve qualquer efeito sobre a massa tumoral. Assim, o bloqueio do receptor ανβ3 pela aplicação tópica do anticorpo LM609 especifico de ανβ3 resultou numa regressão de massa tumoral, juntamente com uma inibição de angiogénese, como mostrado nos Exemplos anteriores. 0 diâmetro medido da massa tumoral resultante da exposição a P3G2 foi de, aproximadamente, 8 milímetros a 1 centímetro, em média. Em contraste, os tumores tratados com LM609 tinham, em média, 2 a 3 milímetros em diâmetro.

Secções congeladas destes tumores revelaram uma citoarquitectura tumoral intacta para o tumor exposto a P3G2, em contraste com uma ausência de estrutura celular organizada no tumor exposto a LM609 . A actividade do receptor ανβ3 é, por conseguinte, essencial para que um tumor negativo para ανβ3 mantenha a sua massa alimentada pelo desenvolvimento de neovasculatura expressando ανβ3. 0 bloqueio de ανβ3 com os antagonistas de ανβ3 desta invenção resulta na inibição de angiogénese no tumor resultando, em última análise, na diminuição de massa tumoral. B. Aplicação Intravenosa

Os resultados de pesos típicos de tumor de carcinoma (UCLAP-3), resultantes de aplicação intravenosa de tampão de controlo (PBS, solução salina tamponada com fosfatos), CSAT (anti-βι) ou LM609 (anti-o^3) são listados na Tabela 5. Foi avaliado um determinado número de embriões para cada tratamento, 95 com o peso médio de tumor de cada um sendo calculado juntamente com o SE da média, como mostrado no fundo da Tabela.

Tabela 5

Embrião N° Tratamento de mAb Peso de Tumor (mg) 1 PBS 101 2 80 3 67 4 90 1 CSAT 151 2 92 3 168 4 61 5 70 1 LM609 16 2 54 3 30 4 20 5 37 6 39 7 12 96

Tratamento de mAb Peso Médio de Tumor (mg) Controlo de PBS 85 ± 7

CSAT LM6 0 9 108 ± 22 30 ± 6 A exposição de uma massa tumoral de carcinoma humano negativo para ανβ3, no sistema de ensaio CAM, a LM609 causou a diminuição do peso médio de tumor não tratado de 85 mg ± 7 para 30 mg ± 6. O anticorpo CSAT não afectou significativamente o peso da massa tumoral. Assim, o bloqueio do receptor ανβ3 pela aplicação intravenosa do anticorpo LM609 especifico de ανβ3 resultou numa regressão de um carcinoma, da mesma forma que para a massa tumoral de melanoma anterior, juntamente com uma inibição de angiogénese, como mostrado nos Exemplos anteriores. Além disso, o crescimento tumoral de melanoma humano foi analogamente inibido por injecção intravenosa de LM609.

9. Regressão de Crescimento de Tecido Tumoral Com Antagonistas de ανβ3 Como Medido no Ensaio CAM

Para além disso avaliar os efeitos de antagonistas de ανβ3 sobre o crescimento e sobrevivência tumoral, fragmentos de melanoma humano e fragmentos de carcinomas do pulmão, pâncreas e laringe foram colocados em CAM de embriões de 10 dias de idade, como descrito no Exemplo 5A. 97 A. Aplicação Intravenosa 1) Tratamento com Anticorpos Monoclonais a. Tratamento com LM609 (Αηίί-ανβ3) e CSAT (Anti-βι) (não faz parte da invenção)

Vinte e quatro horas após a implantação de CAM com fragmentos de carcinoma de melanoma humano M21-L negativo para ανβ3, carcinoma pancreático FG, carcinoma do pulmão humano UCLAP-3 ou carcinoma HEp3 laringeo humano, os embriões foram injectados intravenosamente apenas com PBS ou uma única dose (300 pg/100 pL) de mAb LM609 (anti-o^3) ou CSAT (anti^3) . Os tumores foram deixados propagar-se durante seis dias adicionais. No fim do período de incubação, os tumores foram cuidadosamente resseccionados e expurgados de tecido CAM circundante. As ressecções tumorais foram realizadas por dois investigadores independentes, removendo apenas a massa tumoral sólida facilmente definível. Os tumores tinham margens bem definidas, assim, a fina membrana semitransparente (CAM), que é facilmente distinguível da massa tumoral sólida, foi removida sem perturbar a própria massa tumoral. Os tumores resseccionados foram pesados e examinados morfologicamente e histologicamente.

Como mostrado na Figura 13, foram determinados os pesos húmidos tumorais ao fim de 7 dias e comparados com pesos tumorais iniciais antes dos tratamentos. Cada barra representa a média ± S.E. de 5-10 tumores por grupo. O mAb LM6 0 9 inibiu o crescimento tumoral significativamente (p <0,001) em comparação com controlos em todos os tumores testados. Os tumores tratados com PBS ou CSAT proliferaram em todos os casos. Em contraste, o mAb LM609 preveniu não apenas o crescimento destes tumores mas induziu extensa regressão na maioria dos casos. Facto 98 importante, estas células tumorais não expressam a integrina ανβ3, demonstrando que a inibição de crescimento se deveu aos efeitos anti-angiogénicos deste anticorpo sobre a neovasculatura, em vez de sobre as células tumorais directamente. b. Tratamento com LM609 (Αηίί-ανβ3) e P3G2 (Αηίί-ανβ5) (não faz parte da invenção)

Os fragmentos tumorais de melanoma humano M21-L (50 mg) foram implantados nas CAM de embriões de 10 dias de idade, como descrito no Exemplo 5A. Vinte e quatro horas mais tarde, os embriões foram injectados intravenosamente apenas com PBS ou uma única dose (300 pg/100 pL) de mAb LM609 (anti-oc^3) ou P3G2 (anti-oc^s) . Os tumores foram deixados propagar-se, como descrito no Exemplo 9Al)a anterior e foram examinados morfologicamente e histologicamente, como aqui se descreve.

Exemplos representativos de tumores M21-L tratados com os mAb P3G2 (anti-oc^s) ou LM609 (anti-cx^3) foram examinados morfologicamente. Os tumores tratados com P3G2 eram grandes (8 mm em diâmetro) e bem vascularizados, ao passo que aqueles tratados com o mAb LM6 0 9 eram muito mais pequenos (3 mm em diâmetro) e não tinham vasos sanguíneos detectáveis.

Os tumores foram ainda examinados pela preparação de secções histológicas e coloração com hematoxilina e eosina, como descrito no Exemplo 9Al)a. Como mostrado na Figura 14 (painel superior), os tumores tratados com o mAb P3G2 (anti-ot^3) mostraram numerosas células tumorais viáveis e dividindo-se activamente, como indicado por figuras mitóticas (pontas de setas), assim como por múltiplos vasos sanguíneos (setas) em 99 todo o estroma tumoral. Em contraste, foram detectadas poucas, se algumas, células tumorais ou vasos sanguíneos viáveis em tumores tratados com o mAb LM609 (anti-oç^3) (Figura 14, painel inferior). Estes resultados demonstram que os antagonistas da integrina οίνβ 3 inibem a angiogénese induzida por tumor, conduzindo à paragem de crescimento e regressão de uma variedade de tumores humanos in vivo. É importante salientar que os embriões examinados após sete dias de crescimento tumoral (dia embrionário 17) pareciam normais após examinação grosseira se foram ou não tratados com um antagonista de ανβ3. Estas verificações indicam que os antagonistas desta integrina não parecem tóxicos para os embriões em desenvolvimento. 2) Tratamento Com Péptidos Sintéticos (não faz parte da invenção)

Os fragmentos tumorais de melanoma humano M21-L (50 mg) foram implantados nas CAM de embriões de 10 dias de idade, como descrito no Exemplo 5A. Vinte e quatro horas mais tarde, os embriões receberam uma única injecção intravenosa de 300 pg/100 pL, de ciclo-RADfV (69601) e ou ciclo-RGDfV (66203). Após um total de 72 horas, os tumores foram removidos, examinados morfologicamente e fotografados com um microscópio estéreo, como descrito no Exemplo 9A1).

Os painéis mostrados nas Figuras 15A até 15E correspondem como se segue: Figura 15A, amostras em duplicado tratadas com o péptido ciclo-RADfV (69601); Figura 15B, amostras em duplicado tratadas com o péptido ciclo-RGDfV (66203); Figura 15C, tecido CAM adjacente retirado dos mesmos embriões tratados com o péptido ciclo-RGDfV (66203) e Figuras 15D e 15E, elevada 100 ampliação (13x) de tumores tratados com péptidos. A Figura 15D representa vasos sanguíneos normais de tumor tratado com péptido de controlo (69601) . A Figura 15E representa exemplos de vasos sanguíneos dissociados, de tumores tratados com o péptido ciclo-RGDfV (66203) (setas).

Os resultados ilustram que apenas o péptido 66203, em contraste com o péptido de controlo 69601, inibiu a formação de vasos e, além disso, que os vasos no tecido CAM adjacente ao tumor não foram afectados.

Foram realizados ensaios de regressão tumoral adicionais com o péptido reactivo para ανβ3 85189 (SEQ ID N° 15) contra 69601 como controlo. Os ensaios foram realizadas como anteriormente descrito, com a excepção de que foram intravenosamente injectados 100 pg de péptido dentro da CAM, 18 horas pós-implantação. Após mais 48 horas, os tumores foram, depois, resseccionados e foram obtidos pesos húmidos.

As Figuras 32, 33 e 34, respectivamente, mostram a redução em peso de tumor para os tumores UCLAP-3, M21-L e FgM após exposição intravenosa ao péptido 85189, em contraste com a ausência de efeito com PBS ou péptido 69601. 10. Regressão de Crescimento de Tecido Tumoral Com Antagonistas de ανβ3 como Medido por Ensaio de Modelo de Olho de Coelho In vivo O efeito de antagonistas de anti-ot^3 sobre a angiogénese induzida por factor de crescimento pode ser observado em estruturas naturalmente transparentes, como exemplificado pela 101 córnea do olho. Novos vasos sanguíneos crescem a partir do arco da córnea, que tem um fornecimento sanguíneo rico, em direcção ao centro da córnea que, normalmente, não tem um fornecimento sanguíneo. Os estimuladores de angiogénese, tal como o bFGF, quando aplicados à córnea induzem o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir do arco da córnea. Os antagonistas de angiogénese, aplicados à córnea, inibem o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir do arco da córnea. Assim, a córnea é submetida a angiogénese através de uma invasão de células endoteliais a partir do arco da córnea para o interior do tecido córneo duro compacto de colagénio que é facilmente visível. 0 ensaio de modelo de olho de coelho produz, por conseguinte, um modelo in vivo para a observação directa de estimulação e inibição de angiogénese, após a implantação de compostos directamente dentro da córnea do olho. A. Ensaio de Modelo de Olho de Coelho In Vivo 1) Angiogénese Induzida por Factores de Crescimento A angiogénese foi induzida no ensaio de modelo de olho de coelho in vivo com o factor de crescimento bFGF e é descrita nas secções seguintes. a. Preparaçao de Peletes Hydron Contendo Factor de Crescimento e Anticorpos Monoclonais

Os peletes de polímero Hydron contendo factor de crescimento e mAb foram preparados como descrito por D'Amato, et ai., Proc. Natl. Acid. Sei., USA, 91:4082-4085 (1994). Os 102 peletes individuais continham 650 ng do factor de crescimento bFGF ligado a sucralfato (Carafet, Marion Merrell Dow Corporation), para estabilizar o bFGF e garantir a sua libertação lenta para o interior do tecido circundante. Além disso, foram preparados peletes hydron que continham, 40 pg do mAb LM609 (anti-a^3) ou mAb P1F6 (anti-a^5) em PBS. Os peletes foram moldados em hastes de Teflon especialmente preparadas que têm um núcleo de 2,5 mm perfurado dentro das suas superfícies. Aproximadamente 12 pL de material de moldagem foram colocados dentro de cada haste e polimerizados, de um dia para o outro, numa cobertura estéril. Os peletes foram, depois, esterilizados por irradiação ultravioleta. b. Tratamento com Anticorpos Monoclonais (não faz parte da invenção)

Cada experiência consistiu em três coelhos em que um olho recebeu um pelete compreendendo bFGF e LM609 e o outro olho recebeu um pelete compreendendo bFGF e um mAb de murganho P1F6 (anti-a^5) . A utilização da testagem de olhos aos pares para comparar LM609 (anti-avp3) a outro mAb e controlos de PBS produz um meio para testagem rigoroso, para demonstrar diferenças significativas entre os mAb testados. O mAb P1F6 imunorreage com a integrina ανβ5 que se encontra na superfície de células endoteliais vasculares mas presumivelmente não está envolvida na angiogénese. Para determinar se o mAb P1F6 estava envolvido na angiogénese, foram preparados peletes contendo apenas este mAb e ensaiados como se descreve abaixo, para confirmar que o mAb não induziu a angiogénese. 103

Todos os mAb testados foram purificados de fluido ascitico utilizando cromatografia de coluna de afinidade de Proteína A Sepharose CL-4B, de acordo com métodos bem conhecidos. A imunoglobulina eluída foi, depois, dialisada contra PBS e tratada com Detoxi-gel (Pierce Chemicals) para remover endotoxina. Demonstrou-se que a endotoxina é um potente estimulante angiogénico e inflamatório. Os mAb foram, por conseguinte, testados para a presença de endotoxina com o Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay (Bio-Whittaker) e apenas aqueles mAb sem endotoxina detectável foram utilizados no ensaio de modelo de olho de coelho.

Um pelete hydron, compreendendo bFGF e mAb LM609 (anti-avP3) ou P1F6 (anti-avPs) , foi inserido numa bolsa corneana formada no olho de coelhos. 0 pelete hydron também continha sucralfato para estabilizar o bFGF durante o ensaio. Peletes individuais foram implantados dentro de "bolsas" cirurgicamente criadas formadas no estroma médio da córnea de coelhos. 0 processo cirúrgico foi realizado sob técnica estéril, utilizando um microscópio de operação Wild, modelo M691, equipado com um separador de feixe ao qual estava montada uma câmara para registo fotográfico de córneas individuais. Foi criada uma "bolsa" de 3 mm por 5 mm no estroma corneano, através da realização de uma incisão de 3 mm até metade da espessura corneana com uma lâmina Beaver 69. 0 estroma foi dissecado perifericamente utilizando uma espátula de íris e o pelete foi implantado, com a sua margem periférica a 2 mm do limbo.

Durante os 14 dias seguintes, bFGF e mAb difundiram do pelete implantado para o interior do tecido circundante e, desse modo, efectuaram a angiogénese a partir do arco da córnea. 104

Os resultados representativos de cada tratamento são representados nas Figuras 16A até 16E. A quantidade de vasos presente é quantificada e descrita em termos de horas de relógio que são definidas como se segue. 0 olho é dividido em 12 secções iguais no mesmo modo que um relógio está dividido em horas. "Uma hora de relógio de vasos" refere-se àquela quantidade de vasos que preenche uma área do olho equivalente a uma hora num relógio. Os cinco coelhos que receberam apenas bFGF exibiram angiogénese florida, na qual novos vasos sanguíneos tinham crescido a partir do arco da córnea em direcção ao centro da córnea que, normalmente, não tem vasos sanguíneos. Um destes coelhos tinha apenas 1 hora de relógio de vasos para o pelete. Dois dos coelhos que receberam tanto bFGF como mAb LM609 não tinham absolutamente nenhuma angiogénese detectável até 14 dias após cirurgia. Um destes coelhos tinha 3 focos de vasos hemorrágicos e em gemulação até ao dia 14. Dois dos coelhos que receberam bFGF e mAb P3G2 (anti-oív3s) mostraram extensa vascularização, na qual novos vasos sanguíneos tinham crescido a partir do arco da córnea para o interior da córnea. Um destes coelhos tinha apenas 1 a 2 horas de vasos para o pelete.

Como evidenciado no ensaio de modelo de olho de coelho, não foi observado qualquer efeito angiogénico sobre vasos paralímbicos normais na presença do factor de crescimento bFGF em coelhos que receberam o mAb LM609 (anti-avP3) . Em contraste, foi observade angiogénese em vasos paralímbicos na presença do factor de crescimento bFGF em coelhos que receberam o mAb P3G2 (anti-avp5) . A inibição completa de angiogénese corneana por mAb LM609 é substancialmente superior a qualquer reagente anti-angiogénico anteriormente referido. 105 c. Tratamento com Polipéptidos (não faz parte da invenção)

Cada experiência consistiu em oito coelhos nos quais um olho recebeu um pelete compreendendo 100 nanogramas (ng) de bFGF e o outro olho recebeu um pelete compreendendo 1 micrograma (pg) de VEGF. Os peletes foram inseridos dentro da bolsa corneana como anteriormente descrito e as citocinas subsequentemente estimularam o crescimento de novos vasos sanguíneos para o interior da córnea. Os péptidos foram administrados subcutaneamente (s. q.) em 1 mL de PBS, a uma dosagem inicial de 50 pg por kg de coelho no dia da inserção de pelete e, a seguir, diariamente, s. q., foram proporcionadas dosagens a 20 pg/kg. Após 7 dias, as córneas foram avaliadas como anteriormente descrito.

Os coelhos recebendo o péptido de controlo 69601 mostraram crescimento substancial de vasos sanguíneos corneanos aos 7 dias, em olhos estimulados com vFGF e VEGF. Os coelhos recebendo o péptido 85189 mostraram menos de 50% da quantidade de crescimento de vasos sanguíneos corneanos em comparação com controlos em olhos estimulados com vFGF e quase 100% de inibição em olhos estimulados com VEGF. 106 11. Regressão In vivo de Crescimento de Tecido Tumoral Com 0^νβ3

Antagonistas Como Medidos por Ensaio Murganho:Humano Quimérico

Um modelo murganho:humano quimérico in vivo foi produzido através de substituição de uma porção de pele de um murganho SCID com prepúcio neonatal humano (Figura 17). Após o estabelecimento do enxerto de pele, o prepúcio humano foi inoculado com células de carcinoma. Após o estabelecimento de um tumor mensurável, mAb LM609 (anti-cxvp3) ou PBS foram injectados na veia da cauda do murganho. Após um período de 2-3 semanas, o tumor foi excisado e analisado em peso e histologia. A. Ensaio Murganho:Humano Quimérico In vivo 0 modelo murganho:humano quimérico in vivo é preparado essencialmente como descrito em Yan, et al., J. Clin. Invest., 91: 986-996 (1993). Resumidamente, uma área quadrada de 2 cm2 de pele foi cirurgicamente removida de um murganho SCID (6-8 semanas de idade) e substituída com um prepúcio humano. 0 murganho foi anestesiado e o pêlo removido de uma area de 5 cm de cada lado da região abdominal lateral por corte. Dois leitos de enxerto circulares de 2 cm2 foram preparados por remoção de espessura completa de pele até à fáscia. Enxertos de pele humana de espessura completa do mesmo tamanho derivados de prepúcio neonatal humano foram colocados sobre os leitos de ferimento e suturados no lugar devido. 0 enxerto foi coberto com um Penso Rápido que foi suturado à pele. Também foi aplicada fita de tecido microporoso, para cobrir o ferimento. 107

Foi utilizada a linha celular de melanoma humano M21-L ou linha celular de carcinoma da mama MDA 23.1 (ATCC HTB 26; negativa para ανβ3 por imunorreactividade de secções de tecido com o mAb LM609), para formar os tumores humanos sólidos nos enxertos de pele humana nos murganhos SCID. Uma suspensão celular simples de 5 x 106 células de M21-L ou MDA 23.1 foi injectada intradermicamente dentro do enxerto de pele humana. Os murganhos foram, depois, observados durante 2 a 4 semanas, para permitir o crescimento de tumores humanos mensuráveis. B. Aplicação Intravenosa 1) Tratamento Com Anticorpos Monoclonais (não faz parte da invenção)

Após o crescimento de tumores mensuráveis, murganhos SCID, que tinham sido injectados com células tumorais M21L, foram injectados intravenosamente dentro da veia da cauda com 250 pg de mAb LM609 (anti-avP3) ou PBS, duas vezes por semana, durante 2 a 3 semanas. Após este tempo, os tumores foram resseccionados da pele e expurgados de tecido circundante. Foram avaliados vários murganhos para cada tratamento, com o peso médio de tumor de cada tratamento sendo calculado e mostrado no fundo da Tabela 6. 108

Tabela 6 Número de Tumor M21L Tratamento Peso de Tumor (mg) 1 PBS 158 2 192 3 216 4 227 5 LM6 0 9 195 6 42 7 82 8 48 9 37 10 100 11 172 PBS 198 LM6 0 9 113 A exposição da massa tumoral de carcinoma humano negativo para ανβ3 de M21L no sistema de ensaio murganho:humano quimérico a LM609 (anti-o^3) causou a diminuição do peso médio de tumor tratado com PBS de 198 mg para 113.

Exemplos representativos de tumores M21-L tratados com o mAb LM609 (anti-o^3) e PBS foram examinados morfologicamente. Os tumores tratados com PBS eram grandes (8 a 10 mm em diâmetro) e bem vascularizados, ao passo que aqueles tratados com o mAb LM609 (anti-oívP3) eram muito mais pequenos (3 a 4 mm em diâmetro) e não tinham vasos sanguíneos detectáveis. 109

Em outras experiências com células tumorais de melanoma M21-L no sistema de ensaio murganho:humano quimérico, a resposta com mAB LM609 era comparável com a resposta obtida com o péptido sintético 85189 (SEQ ID N° 15) em comparação com o péptido sintético de controlo 69601 (SEQ ID N° 6). Os ensaios foram realizados como anteriormente descrito. Os resultados, mostrados na Figura 35, demonstram que o péptido sintético 85189 reduziu o volume de tumor para abaixo de 25 mm3 em comparação com o péptido de controlo, onde o volume de tumor foi de, aproximadamente, 360 mm3. O mAB LM609 também reduziu significativamente o volume de tumor para, aproximadamente, 60 mm3.

Os tumores formados em enxertos de pele que tinham sido injectados com células MDA 23.1 eram detectáveis e mensuráveis. A examinação morfológica dos tumores estabelecidos revelou que a neovascularização a partir do tecido humano enxertado para o interior das células tumorais MDA 23.1 tinha ocorrido.

Assim, o bloqueio do receptor ανβ3 pela aplicação intravenosa de anticorpo e péptidos LM609 específicos de ανβ3 resultou numa regressão de um carcinoma neste sistema de modelo do mesmo modo que os sistemas de modelo de CAM e olho de coelho, como descrito nos Exemplos 9 e 10, respectivamente. 2) Tratamento com Péptidos Sintéticos (não faz parte da invenção)

Num processo semelhante àquele anteriormente descrito para anticorpos monoclonais, antagonistas peptídicos de ανβ3 foram injectados intravenosamente dentro da veia da cauda de murganhos SCID tendo tumores M21-L mensuráveis. Numa análise preliminar, 110 foi realizada uma curva dose-resposta para os péptidos 69601 (controlo) e 85189 (teste) injectados numa gama de concentrações de 10 a 250 pg/mL. Foi determinado o volume e peso médios de tumores resseccionados após tratamento, com os resultados mostrados, respectivamente, nas Figuras 36A e 36B. O péptido 85189 foi eficaz na inibição de crescimento tumoral de M21-L na gama concentrações testada, em comparação com tratamento com péptido de controlo, com a dosagem mais eficaz sendo de 250 pg/mL.

Para analisar a eficácia de tratamento do péptido 85189 ao longo de um período de tempo, foram avaliados dois regimes de tratamento no mesmo modelo de tumor de SCID. Num ensaio, o tratamento com o péptido 85189 ou 69601 foi iniciado no dia 6, com o dia 0 sendo o dia de injecção de tumor M21-L de 3 X 106 células subcutaneamente na pele de murganho, com injecções intraperitoneais de 250 pg/mL de péptido 85189 ou controlo 69601, de dois em dois dias, até ao dia 29. O outro ensaio foi realizado de modo idêntico, com a excepção de que o tratamento foi iniciado no dia 20. No fim dos ensaios, os tumores foram resseccionados e o volume médio de tumor, em mm3, foi determinado. Os dados foram representados graficamente como este valor +/- o erro-padrão da média.

Os resultados destes ensaios, respectivamente mostrados nas Figuras 37A e 37B, indicam que o péptido 85189 mas não o 69601 inibiu o crescimento tumoral vários dias após o início do tratamento, dependendo do regime de tratamento particular. Assim, o péptido 85189 é um antagonista de ανβ3 eficaz tanto de angiogénese como, assim, do crescimento tumoral. 111 12. Estimulação de Células Vasculares a Entrarem no Ciclo

Celular e Serem Submetidas a Apoptose na Presença de Antagonistas da Integrina ανβ3, como Medido no Ensaio CAM 0 processo angiogénico claramente depende da capacidade de citocinas, tais como bFGF e VEGF, estimularem a proliferação celular vascular. Mignatti et ai., J. Cell. Biochem., 471:201 (1991); Takeshita et ai., J. Clin. Invest., 93:662 (1994); e

Koyama et ai., J. Cell. Physiol., 158:1 (1994). Contudo, também é evidente que os eventos de sinalização podem regular a diferenciação destas células vasculares em vasos sanguíneos maduros. Assim, é concebível que a interferência com sinais relacionados com o crescimento ou diferenciação de células vasculares submetidas a crescimento novo ou angiogénese pode resultar na perturbação de angiogénese.

Foi demonstrado que os eventos de ligação de integrina participam na proliferação celular, assim como na apoptose ou morte celular programada in vitro. Schwartz, Câncer Res., 51:1503 (1993); Meredith et ai., Mol. Biol. Cell., 4:953 (1993);

Frisch et ai., J. Cell Biol., 124:619 (1994); e Ruoslahti et ai., Cell, 77:477 (1994). Uma examinação minuciosa dos efeitos dos antagonistas de ανβ3 sobre a angiogénese revela a presença de vasos sanguíneos descontínuos e dissociados associados a tumor. Por conseguinte, é possível que a perda de continuidade de vaso sanguíneo possa dever-se a necrose ou apoptose selectivas de células vasculares.

Para explorar esta possibilidade, as CAM foram examinadas após indução de angiogénese com o factor de crescimento bFGF e tratamento com o mAb e péptidos cíclicos desta invenção. 112 A. Tratamento com Anticorpos Monoclonais (nao faz parte da invenção) A apoptose pode ser detectada por uma variedade de métodos que incluem a examinação directa de ADN isolado de tecido, para detectar fragmentação do ADN e a detecção de 3ΌΗ em tecido intacto com um anticorpo que especificamente detecta grupos 3ΌΗ livres de ADN fragmentado.

1) Análise de Fragmentaçao de ADN A angiogénese foi induzida pela colocação de discos de filtro saturados com bFGF nas CAM de embriões de 10 dias de idade, como descrito nos Exemplos 6A. A análise imuno-histológica de CAM com LM609 (anti-o^3) revelou um pico de expressão de ανβ3 em vasos sanguíneos, 12 a 24 horas após iniciação de angiogénese com bFGF. Assim, 24 horas após estimulação com bFGF, os embriões foram inoculados intravenosamente com 100 pL de apenas PBS ou PBS contendo 300 pg de mAb CSAT (anti-βι) ou LM609 (anti-a^3) .

A fragmentação de ADN foi detectada através de ressecção de tecido CAM directamente debaixo de discos de filtro saturados com bFGF, 24 ou 48 horas após inoculação intravenosa com mAb LM609 (anti-OG^3) , CSAT (anti-βι) ou PBS. Os tecidos CAM resseccionados foram lavados três vezes com PBS estéril e finamente triturados, ressuspenssos em colagenase bacteriana a 0,25% (Worthington Biochemical; Freehold, NJ) e incubados, durante 90 minutos, a 37 °C, com agitação em vórtice ocasional. O ADN foi extraído de um número igual de células CAM a partir de 113 suspensão celular simples, como anteriormente descrito. Bissonette, et al., Nature. 359:552 (1992). Resumidamente, um número igual de células CAM foi lisado em Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0, EDTA a 10 mM em Triton X-100 a 0,5% (v/v) (Sigma, St. Louis, MO). Os lisados celulares foram centrifugados a 16000 x g, durante 15 minutos, a 4 °C, para separar o ADN fragmentado solúvel do sedimento de cromatina intacto. O ADN fragmentado foi lavado, precipitado e analisado num gel de agarose a 1,2% (p/v). O ADN fragmentado solúvel foi isolado de um número igual de células CAM de cada tratamento, separado electroforeticamente num gel de agarose e visualizado por coloração com brometo de etidio. Não foi detectada qualquer diferença na quantidade relativa de fragmentação de ADN resultando dos três tratamentos diferentes, 24 horas após tratamento. Contudo, em 48 horas após tratamento com o mAb LM6 0 9 (anti-avP3) , foi observado um aumento significativo na fragmentação de ADN, quando comparado com embriões tratados com o mAb CSAT (anti-βι) ou apenas PBS. 2) Estimulação de Células Vasculares a Entrarem no Ciclo Celular

Para examinar experimentalmente o papel de ανβ3 nestes processos, células derivadas de CAM tratadas com ou sem bFGF foram coradas com iodeto de propídio e colocadas em imunorreacção com o mAb LM609 (anti-o^3) .

As CAM isoladas de embriões, 24 e 48 horas após tratamento com mAb LM609 (antί-ανβ3) , CSAT (anti-βι) ou PBS foram dissociadas em suspensões celulares simples através de incubação 114

com colagenase bacteriana, como anteriormente descrito. As células simples foram, depois, permeabilizadas e coradas com o kit Apop Tag Insitu Detection, de acordo com as instruções do fabricante (Oncor, Gaithersburg, MD) . 0 Apop Tag é um anticorpo que detecta especificamente grupos 3'OH livres de ADN fragmentado. A detecção de tais grupos 3 ΌΗ livres é um método estabelecido para a detecção de células apoptóticas. Gavrieli et al.r J. Cell Biol., 119: 493 (1992).

As células coradas com Apop Tag foram, depois, enxaguadas em Triton X-100 a 0,1% (v/v) em PBS e ressuspensas em tampão FACS contendo BSA a 0,5% (p/v) , azida de sódio a 0,02% (w/v) e RNase A a 200 pg/mL em PBS. As células foram incubadas durante 1,5 h, lavadas e analisadas por triagem celular de activação fluorescente. A fluorescência celular foi medida utilizando um citómetro de fluxo FACScan e os dados analisados como se descreve abaixo. A fluorescência celular foi medida com um citómetro de fluxo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . A dispersão lateral (SSC) e dispersão frontal (FSC) foram determinadas simultaneamente e todos os dados foram recolhidos com um computador Hewlet Packard (HP9000), equipado com software de pesquisa FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Os dados foram analisados com o software P.C Lysis, versão I (Becton

Dickinson, Mountain View, CA) . As portas de controlo negativas foram reguladas através da utilização de suspensões celulares, sem a adição de anticorpos primários do kit Apop Tag. Foi aplicada idêntica activação de porta a ambas as populações celulares, resultando na análise de, aproximadamente, 8000 células por tratamento celular diferente. 115 A percentagem de células simples derivadas de CAM tratadas com mAb e coradas com Apop Tag, como determinado por análise FACS, é mostrada na Figura 18. A barra preta representa células de embriões tratados 24 horas antes da análise. A barra pontilhada representa células de embriões tratados 48 horas antes da análise. Cada barra representa a média ± S.E. de três replicados.

Como mostrado na Figura 18, as CAM tratadas dois dias antes com o mAb LM609 (anti-o^3) mostraram um aumento de 3 a 4 vezes na coloração de Apop Tag, em comparação com CAM tratadas com apenas PBS ou CSAT (anti-βι) . B. Tratamento Com Péptidos Sintéticos (não faz parte da invenção)

Os ensaios CAM com angiogénese induzida por factor de crescimento, como descrito no Exemplo 6A, também foram realizados com os péptidos sintéticos desta invenção, para determinar o efeito de péptidos cíclicos sobre a apoptose. Os péptidos ciclo-RGDfV (66203) e ciclo-RADfV (69601) foram preparados como descrito no Exemplo 1. As soluções peptídicas ou PBS foram injectadas dentro da preparação CAM, a uma concentração de 300 pg/mL. Às 24 e 48 horas, o papel de filtro e tecido CAM circundante foram dissecados e corados com o Apop Tag, para detectar a apoptose, como anteriormente descrito no Exemplo 12A2).

Como mostrado na Figura 18, as CAM tratadas dois dias antes com o péptido 69203 (ciclo-RGDfV) mostraram um aumento de 3 a 4 vezes na coloração de Apop Tag, em comparação com CAM tratadas 116 com apenas PBS ou péptido cíclico de controlo 69601 (ciclo-RADfV). C. Efeito do Tratamento Com Anticorpos Monoclonais Sobre a Apoptose e Ciclo Celular (não faz parte da invenção)

As suspensões celulares simples também foram examinadas para o número de cópias de ADN cromossómico por coloração com iodeto de propídio, para determinar o efeito do tratamento com anticorpos monoclonais sobre o ciclo celular e para a apoptose por coloração com o Apop Tag.

As suspensões celulares simples de CAM tratadas 24 ou 48 horas antes como mAb LM609 (anti-avP3) ou CSAT (anti-βι) ou PBS foram preparadas como descrito no Exemplo 12A1).

Para a coloração de células com o Apop Tag, as suspensões celulares foram lavadas três vezes com tampão contendo BSA a 2,5% (p/v) e azida de sódio a 0,25% (p/v) em PBS. As células foram, depois, fixas em paraformaldeído a 1% (p/v) em PBS, durante 15 minutos, seguido de três lavagens, como anteriormente descrito. Para prevenir a ligação não específica, as suspensões celulares simples foram blogueadas com BSA a 5% (p/v) em PBS, de um dia para o outro, a 4 °C. As células foram, depois, lavadas como anteriormente, coradas com Apop Tag e a fluorescência celular medida com um FACScan, como anteriormente descrito no Exemplo 12A.

As células de cada estado experimental foram coradas com iodeto de propídio (Sigma, St. Louis, MO) a 10 pg/mL em PBS, durante 1 hora, lavadas duas vezes com PBS e analisadas para 117 características nucleares típicas de apoptose, incluindo condensação e segmentação de cromatina. A percentagem de células apoptóticas foi estimada por análise morfológica de células a partir de, pelo menos, 10 a 15 campos microscópicos aleatoriamente seleccionados.

Os resultados combinados de suspensões celulares simples de CAM de embriões tratados com CSAT (anti-βι) ou LM609 (anti-ανβ3) , coradas com Apop Tag e iodeto de propídio e analisadas por FACS são dados na Figura 19. O eixo Y representa a coloração de Apop Tag (Apoptose) , o eixo X representa a coloração de iodeto de propídio (teor de ADN). A linha horizontal representa o canal negativo para a coloração de Apop Tag. Os painéis esquerdo e direito indicam células CAM de embriões tratados com CSAT e LM609, respectivamente. A análise de ciclo celular foi realizada por análise de, aproximadamente, 8000 eventos por condição e os dados representados num gráfico topográfico.

As amostras de células simples coradas com o corante de ADN iodeto de propídio revelaram que 25-30% das células CAM tratadas com LM609 (anti-oç^3) , 48 horas após tratamento, mostraram evidências de condensação e/ou segmentação nuclear. Estes processos são característicos de células submetidas a apoptose. Isto está em contraste com CAM tratadas com CSAT (anti-βι) , onde 90-95% das células mostrou coloração nuclear normal.

Como mostrado na Figura 19, consistente com a indução de apoptose por LM609, foi observado um número significativo de células num pico contendo menos de uma cópia de ADN (AO) . Demonstrou-se anteriormente que este pico representa ADN fragmentado em células apoptóticas de estádio tardio. Telford et al., Cytometry, 13:137 (1992). Além disso, estas células AO 118 coram facilmente com Apop Tag, confirmando a capacidade deste reagente para detectar células apoptóticas. Contudo, além disso à coloração de células em AO, um número significativo de células contendo mais de uma cópia de ADN também corou com Apop Tag (Figura 19) . Estes resultados demonstram que o LM609 tem a capacidade para promover a apoptose entre as células vasculares que já entraram no ciclo celular. Em contraste, as células derivadas de CAM de controlo que tinham entrado no ciclo celular mostraram coloração mínima de Apop Tag, consistente com as poucas células apoptóticas detectadas em CAM tratadas com controlo.

Entre aquelas células nas CAM estimuladas com bFGF que tinham entrado no ciclo celular (fase S e G2/M), 70% mostraram coloração positiva com LM609 (anti-avp3) . Isto é comparado a 10% de coloração de LM609 observada entre células em ciclo a partir de CAM não tratadas com bFGF. Estas verificações indicam que após estimulação de bFGF, a maioria das células contendo ανβ3 mostra proliferação activa.

Consideradas em conjunto, estas verificações indicam que a injecção intravenosa de mAb LM609 ou antagonista de péptido cíclico de ανβ3 promove a apoptose dentro da CAM de pinto, após indução de angiogénese.

As CAM também foram examinadas histologicamente para expressão ανβ3 por imunorreactividade com LM609 e, para células que estavam submetidas a apoptose, por imunorreactividade com Apop Tag. Secções CAM resseccionadas de embriões tratados 48 horas antes com LM609 (anti-o^3) , CSAT (anti-βι) ou PBS preparados no Exemplo 5A foram lavadas, embebidas em OTC (Baxter) e imediatamente congeladas em azoto líquido. Secções de 119 seis mícrones foram cortadas de tecidos CAM, fixas em acetona, durante 30 segundos e armazenadas a -70 °C, até à sua utilização. As secções de tecido foram preparadas para coloração por uma breve enxaguadela em etanol (ETOH) a 70% (v/v), seguida de lavagem três vezes em PBS. A seguir, as secções foram bloqueadas com BSA a 5% (ρ/v) em PBS, durante 2 horas, seguido de incubação com 10 pg/mL de mAb LM609, durante 2 horas. As secções foram, depois, lavadas e incubadas com uma diluição 1:50 de IgG de cabra anti-murganho conjugado a rodamina (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), durante 2 horas. Finalmente, as mesmas secções foram lavadas e coradas com o Apop Tag, como descrito no Exemplo 12A2). As secções de tecido coradas foram montadas e analisadas por microscopia confocal imunofluorescente.

Na Figura 20, os painéis A até C representam tecido CAM de embriões tratados com CSAT (anti-βι) e os painéis D até F representam tecido CAM de embriões tratados com LM609 (anti-avP3) . Os painéis A e D representam tecidos corados com Apop Tag e visualizados por fluorescência (FITC) sobreposta numa imagem D.I.C. Os painéis B e E representam os mesmos tecidos corados com mAb LM609 (anti-avp3) e visualizados por fluorescência (rodamina). Os painéis A e F representam imagens fundidas dos mesmos tecidos corados tanto com Apop Tag como LM609, onde a coloração de amarelo representa co-localização. A barra representa 15 e 50 pm nos painéis esquerdo e direito, respectivamente.

Como mostrado na Figura 20 (A-C), após injecção intravenosa de CSAT ou controlo de PBS, a coloração com Apop Tag parecia mínima e aleatória, indicando um nível mínimo de apoptose dentro do tecido. Em contraste, as CAM de embriões anteriormente 120 tratados com LM609 ou péptido cíclico 203 mostraram uma maioria dos vasos corando intensamente com Apop Tag, ao passo que foi observada reactividade mínima entre células não vasculares circundantes (Figura 20 D-F) . Além disso, quando foram utilizados Apop Tag e LM609 para corar estes tecidos (19C e 19F), a co-localização significativa foi apenas observada entre estes marcadores em CAM derivadas de embriões tratados com antagonistas de ανβ3 (Figura 20F) . Estas verificações demonstram que após indução de angiogénese in vivo, os inibidores de integrina ανβ3 promovem selectivamente a apoptose de vasos sanguíneos contendo ανβ3.

Embora a angiogénese seja um processo complexo envolvendo muitos eventos biológicos moleculares e celulares, diversas linhas de evidência sugerem que a integrina celular vascular ανβ3 desempenha um papel relativamente tardio neste processo. Em primeiro lugar, a análise imuno-histológica revela que a expressão de ανβ3 em células vasculares alcançou um máximo 12-24 horas após a indução de angiogénese com bFGF. Em segundo lugar, os antagonistas de ανβ3 perturbam a angiogénese induzida por múltiplos activadores, sugerindo que este receptor está envolvido na via comum, talvez a jusante de todos os eventos de sinalização primários conduzindo a angiogénese. Em terceiro lugar, as CAM tratadas com mAb LM609 ou péptido cíclico não mostraram um aumento significativo na apoptose, como medido por marcadores de ADN 48 horas pós-tratamento com estes antagonistas. Finalmente, os antagonistas de ανβ3 promovem a apoptose de células vasculares que já tinham sido induzidas a entrarem no ciclo celular.

Os resultados aqui apresentados proporcionam a primeira evidência directa de que os eventos de ligação de integrina 121 podem regular a sobrevivência celular in vivo. Admite-se, por conseguinte, a hipótese de que assim que angiogénese começa, células vasculares individuais dividem-se e começam a mover-se em direcção à fonte angiogénica, após o que a ligação de ανβ3 produz um sinal permitindo a sobrevivência celular continuada que conduz à diferenciação e à formação de vasos sanguíneos maduros. Contudo, se a ligação de ανβ3 for impedida, então as células deixam de receber esta pista molecular e as células entram em apoptose por predefinição. Esta hipótese também preveria que, após a ocorrência da diferenciação, os vasos sanguíneos maduros já não requerem a sinalização de ανβ3 para sobrevivência e são, assim, refractários a antagonistas desta integrina.

Finalmente, os resultados aqui apresentados proporcionam evidência de que os antagonistas da integrina ανβ3 podem produzir uma poderosa abordagem terapêutica para o tratamento de neoplasia ou outras doenças caracterizadas por angiogénese. Em primeiro lugar, os antagonistas de ανβ3 dissociam vasos sanguíneos em formação recente, afectando a vasculatura preexistente. Em segundo lugar, estes antagonistas não tiveram qualquer efeito significativo sobre a viabilidade do embrião de pinto, sugerindo que eles não são tóxicos. Em terceiro lugar, a angiogénese foi significativamente bloqueada, independentemente dos estímulos angiogénicos. Finalmente, a administração sistémica de antagonistas de ανβ3 causa uma drástica regressão de diversos tumores humanos histologicamente distintos. 13. Preparação de Moléculas Orgânicas Antagonistas de ανβ3 122 A síntese de compostos antagonistas de ανβ3 orgânicos 7 (96112), 9 (99799), 10 (96229), 12 (112854), 14 (96113), 15 (79959)*, 16 (81218)*, 17 (87292)* e 18 (87293)* são descritos abaixo e também são mostrados nas figuras anotadas. Os antagonistas orgânicos também são referidos pelos números em parênteses. As moléculas orgânicas resultantes, referidas como miméticos orgânicos desta invenção como anteriormente definidos são, depois, utilizadas nos métodos para inibição de angiogénese mediada por ανβ3, como descrito no Exemplo 11. (não faz parte da invenção)

Para cada uma das sínteses descritas abaixo, as rotações ópticas foram medidas no espectrofotómetro UV Perkin-Elmer 241 e os espectros visíveis foram registados num espectrómetro Beckmann DU-70. Os espectros NMR de ΧΗ e 13C foram registados a 400 e 500 MHz no espectrómetro Bruker AMX-400 e AMX-500. Os espectros de massa de alta resolução (HRMS) foram registados num espectrómetro de massa VG ZAB-ZSE, sob condições de bombardeamento por átomos rápidos (FAB). A cromatografia de coluna foi efectuada com sílica gel de malha 70-230. A TLC preparativa foi efectuada no Art. 5744 Merck (0, 5 mm). Os pontos de fusão foram tomados num aparelho Thomas Hoover. 123 A. Composto 1: Ester benzílico de t-Boc-L-tirosina, como ilustrado na Figura 38

O

HO

O - BenziloO.

II o COMPOSTO 1 A uma solução de N-(terc-butoxicarbonilo)-L-tirosina(t-Boc-L-tirosina) (1,0 equivalentes; Aldrich) em cloreto de metileno a 0,10 Μ (M) foi adicionado diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) (1,5 equivalentes), a 25 °C e deixada a agitar, durante 1 hora. Em seguida, foram adicionados 1,5 equivalentes de álcool benzílico e a mistura foi agitada, durante 12 horas adicionais, a 25 °C. A mistura de reacção foi, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada duas vezes (2X) com água, uma vez (IX) com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel. Composto 1, éster benzílico de t-Boc-L-tirosina também pode ser comercialmente adquirido da Sigma. 124 Β. Composto 2: Éster benzílico do ácido (S)-3-(4-(4-

Bromobutiloxi)fenil-2-N-terc-butiloxicarbonil-propiónico,_como ilustrado na etapa i da Figura 38

COMPOSTO 2

Uma mistura de éster benzílico de t-Boc-L-tirosina (2 gramas, 5,38 mmol; sintetizado como anteriormente descrito), 1,4-dibromobutano (1,9 mL, 16,2 mmol; Aldrich), carbonato de potássio (5 g) e 18-coroa-6 (0,1 g; Aldrich), foi aquecida a 80 °C, durante 12 horas. Após arrefecimento, o precipitado foi removido por filtração e a mistura de reacção foi evaporada até à secura in vacuo. O produto em bruto foi, depois, purificado por cristalização utilizando hexano a 100% para produzir 2,5 g (92%) de Composto 2. C. Composto 3: Éster benzílico do ácido (S)-3-(4-(4- azidobutiloxi)fenil-2-N-terc-butiloxicarbonil-propiónico,_como ilustrado na etapa ii da Figura 38

O O- Benzilo O. .

JI l N, HN. COMPOSTO 3 125 0 Composto 2 (2,5 g, 4,9 mmol) foi agitado com azida de sódio (1,6 g, 25 mmol) em dimetilformamida (DMF) (20 mL) , a 25 °C, durante 12 horas. O solvente foi, depois, evaporado e o resíduo foi tratado com água (aprox. 10 mL) e extraído duas vezes com acetato de etilo. As camadas orgânicas foram combinadas, secas por meio de sulfato de magnésio e evaporadas para produzir 2,0 gramas (90%) de Composto 3 como um xarope incolor (FAB-MS: 469 (M+H+). D. Composto 4: Éster benzílico do ácido (S)-3-(4-(4-azidobutiloxi)fenil-2-amino-propiónico, como ilustrado na etapa iii da Figura 38

N 3'-·.

O

Benzilo COMPOSTO 4 0 Composto 3 (2,0 g (4,4 mmol)) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (TFA; 2 mL) e agitado, durante 3 horas, à temperatura ambiente. A evaporação in vacuo produziu 1,6 gramas (quantitativo) de Composto 4 como um xarope incolor que foi utilizado sem purificação adicional para a etapa seguinte. FAB-MS: 369 (M+H+) . 126 Éster benzílico do ácido (S)—3—(4—(4— E. Composto 5; azidobutiloxi) f enil-2-butilsulf onamido-propiónico,_co^o ilustrado na etapa iv da Figura 38

O

Jl j·. O- Benzilo N3,.

II Hl!. O s. COMPOSTO 5

Uma mistura de Composto 4 (1,6 g; 4,3 mmol) , cloreto de ácido butanossulfónico (0,84 mL; 6,6 mmol) e trietilamina (1,5 equivalentes) foram agitados em cloreto de metileno (20 mL) , durante 12 horas, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, evaporada e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, lavado com HC1 diluído, bicarbonato de sódio aquoso e água. Após evaporação até à secura, o produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica gel, tolueno/acetato de etilo 15:1) para produzir 1,4 gramas (67%) de Composto 5 como um sólido amorfo. 127 F . Composto 6; Ácido (S)-3-(4-(4-Aminobutiloxi)fenil-2-butilsulfonamido-propiónico, como ilustrado na etapa v da Figura 38

O

O COMPOSTO 6 0 Composto 5 (1,3 g (2,6 mmol) foi dissolvido em 20 mL de acetato de etilo/metanol/água 5/3/1 e 0,2 mL de ácido trifluoroacético (TFA) e hidrogenado sob hidrogénio (1 atmosfera; aparelho Parr Shaker) , a 25 °C, na presença de 100 mg de paládio (10% em carvão) . Após 3 horas, o catalisador foi eliminado por filtração e o solvente foi evaporado, para produzir o Composto 6 como um resíduo oleoso. Após liofilização da água, foi obtido 1,0 grama (quantitativo) de Composto 6 como um pó branco. FAB-MS: 3 73 (M+H+) . 128 G. Composto 7: Ácido (S)-3-(4-(4-guanidinobutiloxi)fenil-2-butilsulfonamido-propiónico, como ilustrado na etapa vi da Figura 38

O

COMPOSTO 7 0 Composto 6 (200 mg; 0,5 mmol), nitrato de 3,5-dimetilpirazol-l-carboxamidina (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) e trietilamina (0,15 mL, 1,0 mmol) em dimetilformamida (DMF; 5 mL) foram aquecidos a 60 °C, durante 12 horas. Após arrefecimento, o solvente foi evaporado in vacuo e o resíduo foi purificado por HPLC (Lichrocart RP-18, gradiente de acetonitrilo/água + TFA a 0,3%, 99:1 a 1:99), para produzir 50 mg (25%) de Composto 7 como um pó branco, amorfo, após liofilização. FAB-MS: 415 (M+H+) , p. f.: 70 °C. 129 Η. Composto 8: Ácido (S)-3-(4-(4-aminobutiloxi)fenil-2-Ν-terc-butiloxicarbonil-propiónico, como ilustrado na etapa iii da Figura 39

O , ·"' μ' Ί O - Benzilo H2N '· " HN _ O. ° ' lí í O 1 COMPOSTO 8 0 Composto 3 (0,5 g (1,07 mmol) foi dissolvido em 10 mL de acetato de etilo/metanol/água 5/3/1 e 0,1 mL de ácido trifluoroacético (TFA) e hidrogenado sob hidrogénio (1 atmosfera; aparelho Parr Shaker) a 25 °C, na presença de 30 mg de paládio (10% em carvão). Após 3 horas, o catalisador foi eliminado por filtração e o solvente foi evaporado, para produzir o Composto 8 como um residuo oleoso. Após liofilização da água, foram obtidos 370 miligramas (quantitativo) de Composto 8 como um pó branco. FAB-MS: 353 (M+H+) . 130 I. Composto 9: Ácido (S)-3-(4-(4-quanidinobutiloxi)fenil-2-N-terc-butiloxicarbonil-propiónico, como ilustrado na etapa iv da Figura 39

O

COMPOSTO 9 0 Composto 8 (200 mg; 0,5 mmol), nitrato de 3,5-dimetilpirazol-l-carboxamidina (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) e trietilamina (0,15 mL, 1,0 mmol) em dimetilformamida (DMF; 5 mL) foram aquecidos a 60 °C, durante 12 horas. Após arrefecimento, o solvente foi evaporado in vacuo e o resíduo foi purificado por HPLC (Lichrocart RP-18, gradiente de acetonitrilo/água + TFA a 0,3%, 99:1 a 1:99), para produzir 160 mg (90%) de Composto 9 como um pó branco, amorfo, após liofilização. FAB-MS: 395 (M+H+) . 131 j. Composto 10: Ácido (R)-3-(4-(4-guanidinobutiloxi)fenil-2-butilsulfonamido-propiónico, como ilustrado nas etapas i-vi da Figura 40

O

JJ

^ V" 0H

h2n NH II NH O' COMPOSTO 10 HN -° S, V N, · o A sequência de reacção idêntica para sintetizar o Composto 7 foi utilizada para preparar o análogo 10 de D-tirosina da qual foram obtidos 205 mg como um material amorfo branco, FAB-MS: 415 (M+H+) , como se segue, utilizando os Compostos intermediários 100-600, para formar o Composto 10: 1) Composto 100: Éster benzílico de t-Boc-D-tirosina, como ilustrado na Figura 40

O

HO

L O - Benzilo NH^ O.. COMPOSTO 100 A uma solução de N-(terc-butoxicarbonilo)D-tirosina (t-Boc-L-tirosina) (1,0 equivalentes; Aldrich) em cloreto de metileno a 0,10 M, foi adicionado diciclo-hexilcarbodiimida (DCC) (1,5 equivalentes), a 25 °C, e deixada a agitar, durante 132 1 hora. Em seguida, foram adicionados 1,5 equivalentes de álcool benzilico e a mistura foi agitada, durante 12 horas adicionais, a 25 °C. A mistura de reacção foi, depois, diluida com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel. 2) Composto 200: Éster benzilico do ácido (R)-3-(4-(4- bromobutil)fenil-2-N-terc-buciloxicarbonil-propiónico,_como ilustrado na etapa i da Figura 40

Br

O

NH

O U O - Benzilo.0 COMPOSTO 200

Uma mistura de éster benzilico de t-Boc-D-tirosina (2 gramas, 5,38 mmol; sintetizado como anteriormente descrito), 1,4-dibromobutano (1,9 mL, 16,2 mmol; Aldrich), carbonato de potássio (5 g) e 18-coroa-6 (0,1 g; Aldrich), foi aquecida a 80 °C, durante 12 horas. Após arrefecimento, o precipitado foi removido por filtração e a mistura de reacção foi evaporada até à secura in vacuo. 0 produto em bruto foi, depois, purificado por cristalização utilizando hexano a 100% para produzir 2,5 g (92%) de Composto 200. 133 3) Composto 300: Ester benzílico do ácido (R)-3-(4-(4- como azidobutiloxi)fenil-2-N-terc-butiloxicarbonil-propiónico ilustrado na etapa ii da Figura 40

O

- Benzilo J·· ^ HN ,0. ‘11

O COMPOSTO 300 0 Composto 200 (2,5 g, 4,9 mmol) foi agitado com azida de sódio (1,6 g, 25 mmol) em dimetilformamida (DMF) (20 mL) , a 25 °C, durante 12 horas. 0 solvente foi, depois, evaporado e o resíduo foi tratado com água (aprox. 10 mL) e extraído duas vezes com acetato de etilo. As camadas orgânicas foram combinadas, secas por meio de sulfato de magnésio e evaporadas para produzir 2,0 gramas (90%) de Composto 300 como um xarope incolor (FAB-MS: 469 (M+H+) . 4) Composto 400: Éster benzílico do ácido (R)-3-(4-(4-azidobutiloxi)fenil-2-amino-propiónico, como ilustrado na etapa iii da Figura 40

O

O - Benzilo COMPOSTO 400 0 Composto 300 (2, 0 g (4,4 mmol)) foi dissolvido em ácido trifluoroacético (TFA; 2 mL) e agitado, durante 3 horas, à 134 temperatura ambiente. A evaporação in vacuo produziu 1,6 gramas (quantitativo) de Composto 400 como um xarope incolor que foi utilizado sem purificação adicional para a etapa seguinte. FAB-MS: 369 (M+H+) 5) Composto 500: Éster benzílico do ácido (R)-3-(4-(4- azidobutiloxi) f enil-2-butilsulf onamido-propiónico,_como ilustrado na etapa iv da Figura 40

O .11

N 3--, O - Benzilo

HN -P s..

O COMPOSTO 500

Uma mistura de Composto 400 (1,6 g; 4,3 mmol), cloreto de ácido butanossulfónico (0,84 mL; 6,6 mmol) e trietilamina (1,5 equivalentes) foram agitados em cloreto de metileno (20 mL) , durante 12 horas, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, evaporada e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, lavado com HC1 diluído, bicarbonato de sódio aquoso e água. Após evaporação até à secura, o produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica gel, tolueno/acetato de etilo 15:1) para produzir 1,4 gramas (67%) de Composto 500 como um sólido amorfo. 135 6 ) Composto 600: Ácido (R)-3-(4-(4-aminobutiloxi)fenil-2-butilsulfonamino-propiónico, como ilustrado na etapa v da Figura 40

O H2N . .11.

COMPOSTO 600 O Composto 500 (1,3 g (2,6 mmol) foi dissolvido em 20 mL de acetato de etilo/metanol/água 5/3/1 e 0,2 mL de ácido trifluoroacético (TFA) e hidrogenado sob hidrogénio (1 atmosfera; aparelho Parr Shaker) , a 25 °C, na presença de 100 mg de paládio (10% em carvão) . Após 3 horas, o catalisador foi eliminado por filtração e o solvente foi evaporado, para produzir o Composto 600 como um resíduo oleoso. Após liofilização da água, foi obtido 1,0 grama (quantitativo) de Composto 600 como um pó branco. FAB-MS: 373 (M+H+) . 7) Composto 10: Ácido (R)-3-(4-(4-guanidinobutiloxi)fenil-2-butilsulfonamido-propiónico, como ilustrado na etapa vi da Figura 40 O Composto 600 (200 mg; 0,5 mmol), nitrato de 3,5-dimetilpirazol-l-carboxamidina (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) e trietilamina (0,15 mL, 1,0 mmol) em dimetilformamida (DMF; 5 mL) foram aquecidos a 60 °C, durante 12 horas. Após arrefecimento, o solvente foi evaporado in vacuo e o resíduo foi purificado por HPLC (Lichrocart RP-18, gradiente 136 de acetonitrilo/água + TFA a 0,3%, 99:1 a 1:99), para produzir 50 mg (25%) de Composto 10 como um pó branco, amorfo, após liofilização. FAB-MS: 415 (M+H+) , p. f.: 70 °C. K. Composto 11: Éster benzílico do ácido (S)-3-(4-(4- azidobutiloxi)fenil-2-(10-canforsulfonamido)-propiónico,_como ilustrado na Figura 4

Uma mistura de Composto 4 (1,0 g; 2,7 mmol), cloreto de ácido 10-canfossulfónico (6,6 mmol; Aldrich Chemical Company) e trietilamina (1,5 equivalentes) foram agitados em cloreto de metileno (20 mL) , durante 12 horas, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, evaporada e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, lavado com HC1 diluído, bicarbonato de sódio aquoso e água. Após evaporação até à secura, o produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica gel, tolueno/acetato de etilo 15:1) para produzir 1,4 gramas (67%) de Composto 11 como um sólido amorfo. 137 L . Composto 12; Ácido (S)-3-(4-(4-quanidinokutiloxi)fenil- 2- (10-canf orsulf onamido) -propiónico,_como__ilustrado_nas etapas i-ii da Figura 41

h2n nh

NH COMPOSTO 12 O Composto 12 foi obtido após hidrogenação e guanilaçao do Composto 11 de acordo com as condições seguintes:

Etapa i: 0 Composto 11 (1,3 g (2,6 mmol) foi dissolvido em 20 mL de acetato de et ilo/metanol/água 5/3/1 e 0,2 mL de ácido trifluoroacético (TFA) e hidrogenados sob hidrogénio (1 atmosfera; aparelho Parr Shaker), a 25 °C, na presença de 100 mg de paládio (10% em carvão) . Após 3 horas, o catalisador foi eliminado por filtração e o solvente foi evaporado, para produzir a amina intermediária como um resíduo oleoso. Após liofilização da água, foi obtido 1,0 grama (quantitativo) da amina intermediária como um pó branco, que prosseguiu como se segue:

Etapa ii: O composto de amina intermediário anteriormente formado (200 mg; 0,5 mmol), nitrato de 3,5-dimetilpirazol-1-carboxamidina (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) e trietilamina (0,15 mL, 1,0 mmol) em dimetilformamida (DMF; 5 mL) foram aquecidos a 60 °C, durante 12 horas. Após arrefecimento, o solvente foi 138 evaporado in vacuo e o resíduo foi purificado por HPLC (Lichrocart RP-18, gradiente de acetonitrilo/água + TFA a 0,3%, 99:1 a 1:99), para produzir 50 mg (25%) de Composto 12 como um pó branco, amorfo, após liofilização. FAB-MS: 509. 6 (M+H+) . M. Composto 13: Éster benzílico do ácido (S)—3—(4—(5— bromopentiloxi)fenil-2-N-terc-butiloxicarbonil-propiónico, como ilustrado na Figura 41

Benzilo COMPOSTO 13

RB

Uma mistura de éster benzílico de t-Boc-L-tirosina (4,5 gramas, 12,1 mmol; Composto 1 sintetizado como anteriormente descrito), 1,5-dibromopentano (5 mL, 36,7 mmol; Aldrich), carbonato de potássio (10 g) e 18-coroa-6 (0,25 g; Aldrich) , foi aquecida a 80 °C, durante 12 horas. Após arrefecimento, o precipitado foi removido por filtração e a mistura de reacção foi evaporada até à secura in vacuo. O produto em bruto foi, depois, purificado por cristalização utilizando hexano a 100% para produzir 5,35 g (85%) de Composto 13. 139 Ν. Composto 14; Ácido (S)-3-(4-(5-Guanidinopentiloxi)fenil-2-butilsulfonamido-propiónico, como ilustrado nas etapas i-v da Figura 41

O

NH JL H2N NH

Ji i OH HN. ° O ' COMPOSTO 14 A sequência de reacção da etapa 5 de permuta de bromo-azida, clivagem de Boc, sulfonilação com cloreto de ácido butanossulfónico, hidrogenação e guanilação com DPFN foi efectuada identicamente aos processos anteriores, utilizando os Compostos intermediários 1-6, para formar o Composto 7 ou os processos utilizando os Compostos 100-600, para formar o Composto 10, como anteriormente divulgado. O Composto 14 foi obtido como um pó branco, FAB-MS: 429 (M+H+) . 140 Ο. Composto 15; 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-amino etil)fenoxi)metil-2-oxzolidinona, dicloridrato, como mostrado na Figura 42 1) Sínteses do material de partida 2-N-BOC-amino-3-(4-hidroxi-fenil)propionato para o Composto 15 h2n

li O

COOH '1 nh2 COMPOSTO 15 0 material de partida 2-N-BOC-amino-3-(4-hidroxifenil)propionato foi obtido por meio de esterificação de (D ou L) , N-(terc-butoxicarbonil)-L(D)-tirosina (t-Boc-L(D)-tirosina) (1,0 equivalentes; Sigma) em metanol a 0,10 M e HC1 a 1% diluído. A mistura de reacção foi agitada, a 25 °C, durante 12 horas e, depois, neutralizada por meio de carbonato de potássio e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 2-N-BOC-amino-3-(4-hidroxifenil)propionato. 141 2) Síntese do material de partida 3-p-N-BOC-amidinofenil-5-metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona para o Composto 15: processo de 3 etapas como se segue: p-amino-benzonitrilo (1,0 equivalentes; Aldrich) em cloreto de metileno (0,10 M) foi agitado com 2,3-epoxipropanol (1,0 equivalentes; Aldrich), durante 12 horas, a 25 °C. O solvente foi, em seguida, removido in vacuo e o 4-(2,3-di-hidroxipropilamino)benzonitrilo em bruto foi transportado para a etapa seguinte como se segue: 4-(2,3-di-hidroxipropilamino)benzonitrilo (1,0 equivalentes; como anteriormente descrito) em dimetilformamida (0,10 M) , a 25 °C, foi agitado com carbonato de dietilo (1,1 equivalentes; Aldrich) e terc-butilato de potássio (1,1 equivalentes; Aldrich), a 110 °C, durante 6 horas. Em seguida, a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 3-(4-cianofenil)-5-hidroximetil-2-oxazolidina e transportado para a etapa seguinte como se segue: 3-(4-cianofenil)-5-hidroximetil-2-oxazolidina (1,0 equivalentes; como anteriormente descrito) em cloreto de metileno (0,10 M) , a 25 °C, foi agitado com 1.1 equivalentes de sulfureto de hidrogénio, 1.1 equivalentes de iodeto de metilo e 1,1 equivalentes de acetato de amónio. A mistura de reacção foi agitada, durante 6 horas e, depois, diluída com acetato de etilo 142 (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter a amidina que foi transportada para a etapa seguinte como se segue: 1,0 equivalentes da amidina, sintetizada como anteriormente descrito, foram protegidos com 1,1 equivalentes de BOC-ON (2-(BOC-oxiimino)-2-fenilacetonitrilo; Aldrich) em cloreto de metileno (0,10 M) a 25 °C e agitados durante 6 horas. Em seguida, a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, esterificado em cloreto de metileno a 0,10 M e 1,1 equivalentes de cloreto de metanossulfonilo. A mistura de reacção foi agitada, a 0 °C, durante 6 horas e, depois, parada com água (5 equivalentes) e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona. 143 3) Ligação do intermediário 2-N-BOC-amino-3-(4-hidroxi- fenil) propionato_com_3-p-N-BOC-amidinof enil-5- metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona, para formar uma forma protegida do Composto 15, 3-(4-BOC-amidinofenil)-5-(4-(2- metoxicarbonil-2N-B0C-aminoetil)fenioxilmetil-2-oxazolidinona

Uma mistura de 1,9 gramas de 2-N-BOC-amino-3-(4-hidroxi-fenil)propionato (como anteriormente descrito), 20 mL de dimetilformamida (DMF) e NaH (1,0 equivalente), foi agitada durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após agitação, 1,8 gramas de 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi- metil-2-oxazolidinona (como anteriormente descrito) em 10 mL de dimetilformamida (DMF) foram adicionados e agitados de novo, durante 15 minutos, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter a forma protegida do Composto 15, 3-(4-BOC-amidinofenil)-5-(4-(2-metoxi-carbonil-2N-BOC-aminoetil)fenioxilmetil-2-oxazolidinona que foi transportado para a etapa seguinte. 4) Desprotecção da forma protegida do Composto 15, para formar o Composto 15; 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2- amino-etil)fenoxi)metil-2-oxazolidinona, dicloridrato, Figura 42 O tratamento da forma protegida do Composto 15, 3-(4-BOC- amidinof enil ) -5-(4-(2-metoxi-carbonil-2N-BOC- aminoetil)fenioxilmetil-2-oxazolidinona (1,0 equivalentes; sintetizado como anteriormente descrito), com 4 mL de NaOH a 144

2 N, durante 4 horas, à temperatura ambiente. A mistura foi, depois, seguida com 40 mL de solução de HC1 a 2 N em dioxano, adicionado gota a gota, a 0 °C a 25 °C, durante 3 horas. A mistura de reacção foi, depois, parada com bicarbonato de sódio (5 equivalentes) e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter o Composto 15: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-amino- etil)fenoxi)metil-2-oxazolidinona, dicloridrato; p. f. 165 °C (d) . p. Composto 16: 3-(4-amidinosenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N- butilsulf onilaminoetil) fenoxi) meti 1-2-oxazolidinona,_como mostrado na Figura X (anterior 14) 1) Síntese do material de partida 2-N-butilsulfonilamino-3-(4-hidroxi-fenil)propionato para o Composto 16

H2N

NH _U—Á N

COOH i NH —S02

O COMPOSTO 16 O material de partida 2-N-butilsulfonilamino-3-(4-hidroxi-f enil) propionato foi obtido por meio de esterif icação de ((D ou L) tirosina) (1,0 equivalentes; Sigma) em metanol a 0,10 M e HC1 145 a 1% diluído. A mistura de reacção foi agitada, a 25 °C, durante 12 horas e, depois, neutralizada por meio de carbonato de potássio e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, transportado como se segue:

Uma mistura de composto anterior (4,3 mmol), cloreto de ácido butanossulfónico (6,6 mmol) e trietilamina (1,5 equivalentes) foram agitados em cloreto de metileno (20 mL), durante 12 horas, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, evaporada e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, lavado com HC1 diluído, bicarbonato de sódio aquoso e água. Após evaporação até à secura, o produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica gel, tolueno/acetato de etilo 15:1) para produzir o composto do título. 2) Síntese do material de partida 3-p-N-BOC-amidinofenil-5-metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona para o Composto 16: processo de 3 etapas como se segue: p-amino-benzonitrilo (1,0 equivalentes; Aldrich) em cloreto de metileno (0,10 M) foi agitado com 2,3-epoxipropanol (1,0 equivalentes; Aldrich), durante 12 horas, a 25 °C. O solvente foi, em seguida, removido in vacuo e o 4-(2,3-di-hidroxipropilamino)benzonitrilo em bruto foi transportado para a etapa seguinte como se segue: 4-(2,3-di-hidroxipropilamino)benzonitrilo (1,0 equivalentes; como anteriormente descrito), em 146 dimetilformamida (0,10 M) , a 25 °C, foi agitado com carbonato de dietilo (1,1 equivalentes; Aldrich) e terc-butilato de potássio (1,1 equivalentes; Aldrich), a 110 °C, durante 6 horas. Em seguida, a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 3-(4-cianofenil)-5-hidroximetil-2-oxazolidina e transportado para a etapa seguinte como se segue: 3-(4-cianofenil)-5-hidroximetil-2-oxazolidina (1,0 equivalentes; como anteriormente descrito), em cloreto de metileno (0,10 M) , a 25 °C, foi agitado com 1.1 equivalentes de sulfureto de hidrogénio, 1.1 equivalentes de iodeto de metilo e 1,1 equivalentes de acetato de amónio. A mistura de reacção foi agitada, durante 6 horas e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter a amidina que foi transportada para a etapa seguinte como se segue: 1,0 equivalentes da amidina, sintetizada como anteriormente descrito, foram protegidos com 1,1 equivalentes de BOC-ON (2-(BOC-oxiimino)-2-fenilacetonitrilo; Aldrich) em cloreto de metileno (0,10 M) a 25 °C e agitados durante 6 horas. Em seguida, a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina 147 saturada e seca sobre sulfato de magnésio. 0 solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, esterificado em cloreto de metileno a 0,10 M e 1,1 equivalentes de cloreto de metanossulfonilo. A mistura de reacção foi agitada, a 0 °C, durante 6 horas e, depois, parada com água (5 equivalentes) e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi-meti1-2-oxazolidinona. 3) Ligação dos intermediários 2-N-butilsulfonilamino-3-(4- hidroxi-f enil) propionato_com_3-p-N-BOC-amidino-feni1-5- metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona, para formar a forma protegida do Composto 16. 3-(4-BOC-amidinofenil)-5-(4-(2- metoxicarbonil-2-N-butilsulfonilaminoetil)fenoixilmetil-2-oxazolidinona

Uma mistura de 1,9 gramas de 2-N-butilsulfonilamino-3-(4-hidroxi-fenil)propionato (como anteriormente descrito), 20 mL de dimetilformamida (DMF) e NaH (1,0 equivalente), foi agitada durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após agitação, 1,8 gramas de 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi-meti1-2-oxazolidinona (como anteriormente descrito) em 10 mL de dimetilformamida (DMF) foram adicionados e agitados de novo, durante 15 minutos, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto 148 em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de silica gel, para se obter a forma protegida do Composto 16, 3- (4-BOC-amidinofenil)-5-(4-(2-metoxi-carbonil-2-N- butilsulfonilaminoetil)-fenioxilmetil-2-oxazolidinona que foi transportado para a etapa seguinte. 4) Desprotecção da forma protegida do Composto 16, para formar o Composto 16: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N-butilsulfonilaminoetil)fenoxi)metil-2-oxazolidinona, Figura 42

Tratamento da forma protegida do Composto 16, 3-(4-BOC-amidinofenil)-5-(4-(2-metoxi-carbonil-2-N-butilsulfonilaminoetil)fenioxilmetil-2-oxazolidinona (1,0 equivalentes; sintetizado como anteriormente descrito), com 4 mL de NaOH a 2 N, durante 4 horas, à temperatura ambiente. A mistura foi, depois, seguida com 40 mL de solução de HC1 a 2 N em dioxano, adicionado, gota a gota, a 0 °C a 25 °C, durante 3 horas. A mistura de reacção foi, depois, parada com bicarbonato de sódio (5 equivalentes) e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter o Composto 16: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N- butilsulfonilaminoetil)fenoxi)meti1-2-oxazolidinona; p. f. 236-237 °C. 149 Q. Composto 17: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N- propil-sulfonilaminoetil)fenoxi)meti1-2-oxazolidinona,_como mostrado na Figura 42 1) Síntese do material de partida 2-N-propil-sulfonilamino-3-(4-hidroxi-fenil)propionato para o Composto 17:

h2n

COOH í NH—S02 COMPOSTO 17 0 material de partida 2-N-propil-sulfonilamino-3-(4- hidroxi-fenil)propionato foi obtido por meio de esterificação de ((D ou L) tirosina) (1,0 equivalentes; Sigma) em metanol a 0,10 M e HC1 a 1% diluído. A mistura de reacção foi agitada, a 25 °C, durante 12 horas e, depois, neutralizada por meio de carbonato de potássio e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, transportado como se segue:

Uma mistura de composto anterior (4,3 mmol), cloreto de ácido propilsulfónico (6,6 mmol) e trietilamina

(1,5 equivalentes) foram agitados em cloreto de metileno (20 mL), durante 12 horas, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, evaporada e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, lavado com HC1 diluído, 150 bicarbonato de sódio aquoso e água. Após evaporação até à secura, o produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (sílica gel, tolueno/acetato de etilo 15:1) para produzir o composto do título. 2) Síntese do material de partida 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona para o Composto 17: processo de 3 etapas como se seque: p-amino-benzonitrilo (1,0 equivalentes; Aldrich) em cloreto de metileno (0,10 M) foi agitado com 2,3-epoxipropanol (1,0 equivalentes; Aldrich), durante 12 horas, a 25 °C. O solvente foi, em seguida, removido in vacuo e o 4-(2,3-di-hidroxipropilamino)benzonitrilo em bruto foi transportado para a etapa seguinte como se segue: 4-(2,3-di-hidroxipropilamino)benzonitrilo (1,0 equivalentes; como anteriormente descrito), em dimetilformamida (0,10 M), a 25 °C, foi agitado com carbonato de dietilo (1,1 equivalentes; Aldrich) e terc-butilato de potássio (1,1 equivalentes; Aldrich), a 110 °C, durante 6 horas. Em seguida, a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 3-(4-cianofenil)-5-hidroximetil-2-oxazolidina e transportado para a etapa seguinte como se segue: 151 3-(4-cianofenil)-5-hidroximetil-2-oxazolidina (1,0 equivalentes; como anteriormente descrito), em cloreto de metileno (0,10 M) , a 25 °C, foi agitado com 1.1 equivalentes de sulfureto de hidrogénio, 1.1 equivalentes de iodeto de metilo e 1,1 equivalentes de acetato de amónio. A mistura de reacção foi agitada, durante 6 horas e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter a amidina que foi transportada para a etapa seguinte como se segue: 1,0 equivalentes da amidina, sintetizada como anteriormente descrito, foram protegidos com 1,1 equivalentes de BOC-ON (2-(BOC-oxiimino)-2-fenilacetonitrilo; Aldrich) em cloreto de metileno (0,10 M) a 25 °C e agitados durante 6 horas. Em seguida, a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, esterificado em cloreto de metileno a 0,10 M e 1,1 equivalentes de cloreto de metanossulfonilo. A mistura de reacção foi agitada, a 0 °C, durante 6 horas e, depois, parada com água (5 equivalentes) e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi-meti1-2-oxazolidinona. 152 3) Ligação dos intermediários 2-N-propil-sulfonilamino-3- (4-hidroxi-fenil)propionato_com_3-p-N-BOC-amidino-f enil-5- metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona, para formar a forma protegida do Composto 17 3-(4-BOC-amidinofenil)-5-(4-(2 metoxi-carbonil-2-N-propil-sulfonilaminoetil)-fenioxilmetil-2-oxazolidinona

Uma mistura de 1,9 gramas de 2-N-propil-sulfonilamino-3-(4-hidroxi-fenil)propionato (como anteriormente descrito), 20 mL de dimetilformamida (DMF) e NaH (1,0 equivalente), foi agitada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após agitação, 1,8 gramas de 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi- metil-2-oxazolidinona (como anteriormente descrito) em 10 mL de dimetilformamida (DMF) foram adicionados e agitados de novo, durante 15 minutos, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter a forma protegida do Composto 17, 3-(4-HOC-amidinofenil)-5-(4-(2-metoxi-carbonil-2-N-propil-sulfonilaminoetil)-fenioxilmetil-2-oxazolidinona que foi transportado para a etapa seguinte. 153 4) Desprotecção da forma protegida do Composto 17, para formar o Composto 17: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N- propilsulfonilaminoetil)fenoxi)metil-2-oxazolidinona, Figura 42

Tratamento da forma protegida do composto 17, 3-(4-BOC-

amidinofenil)-5-(4-(2-metoxi-carbonil-2-N-propilsulfonilaminoetil)fenioxilmetil-2-oxazolidinona (1,0 equivalentes; sintetizado como anteriormente descrito), com 4 mL de NaOH a 2 N, durante 4 horas, à temperatura ambiente. A

mistura foi, depois, seguida com 40 mL de solução de HC1 a 2 N em dioxano, adicionado gota a gota, a 0 °C a 25 °C, durante 3 horas. A mistura de reacção foi, depois, parada com bicarbonato de sódio (5 equivalentes) e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter o Composto 17: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N- propilsulfonilaminoetil)fenoxi)metil-2-oxazolidinona; p. f. 200 °C (d). 154 R. Composto 18: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N- etil-sulf onilaminoetil) fenoxi) meti 1-2-oxazolidinona,_como mostrado na Figura 42 1) Síntese do material de partida 2-N-etil-sulfonilamino-3-(4-hidroxi-fenil)propionato para o Composto 18:

H2N

/' INL

\ O o

COOH I NH —S02

O COMPOSTO 18 0 material de partida 2-N-etil-sulfonilamino-3-(4-hidroxi-f enil) propionato foi obtido por meio de esterif icação de ((D ou L) tirosina) (1,0 equivalentes; Sigma) em metanol a 0.10 M e HC1 a 1% diluído. A mistura de reacção foi agitada, a 25 °C, durante 12 horas e, depois, neutralizada por meio de carbonato de potássio e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, transportado como se segue:

Uma mistura de composto anterior (4,3 mmol), cloreto de ácido etilsulfónico (6,6 mmol; Aldrich) e trietilamina (1,5 equivalentes) foram agitados em cloreto de metileno (20 mL), durante 12 horas, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, evaporada e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo, lavado com HC1 diluído, bicarbonato de sódio aquoso e água. Após evaporação até à 155 secura, o produto em bruto foi purificado por cromatografia flash (silica gel, tolueno/acetato de etilo 15:1) para produzir o composto do titulo. 2) Síntese do material de partida 3-p-N-BOC-amidinofenil-5-metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona para o Composto 18: processo de 3 etapas como se seque: p-amino-benzonitrilo (1,0 equivalentes; Aldrich) em cloreto de metileno (0,10 M) foi agitado com 2,3-epoxipropanol (1,0 equivalentes; Aldrich), durante 12 horas, a 25 °C. O solvente foi, em seguida, removido in vacuo e o 4-(2,3-di-hidroxipropilamino)benzonitrilo em bruto foi transportado para a etapa seguinte como se segue: 4-(2,3-di-hidroxipropilamino)benzonitrilo (1,0 equivalentes; como anteriormente descrito), em dimetilformamida (0,10 M) , a 25 °C, foi agitado com carbonato de dietilo (1,1 equivalentes; Aldrich) e terc-butilato de potássio (1,1 equivalentes; Aldrich), a 110 °C, durante 6 horas. Em seguida, a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 3-(4-cianofenil)-5-hidroximetil-2-oxazolidina e transportado para a etapa seguinte como se segue: 3-(4-cianofenil)-5-hidroximetil-2-oxazolidina (1,0 equivalentes; como anteriormente descrito), em cloreto 156 de metileno (0,10 M) , a 25 °C, foi agitado com 1.1 equivalentes de sulfureto de hidrogénio, 1.1 equivalentes de iodeto de metilo e 1,1 equivalentes de acetato de amónio. A mistura de reacção foi agitada, durante 6 horas e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter a amidina que foi transportada para a etapa seguinte como se segue: 1.0 equivalentes da amidina, sintetizada como anteriormente descrito, foram protegidos com 1,1 equivalentes de BOC-ON (2-(BOC-oxiimino)-2-fenilacetonitrilo; Aldrich) em cloreto de metileno (0,10 M) a 25 °C e agitados durante 6 horas. Em seguida, a mistura de reacção foi diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, esterificado em cloreto de metileno a 0,10 M e 1.1 equivalentes de cloreto de metanossulfonilo. A mistura de reacção foi agitada, a 0 °C, durante 6 horas e, depois, parada com água (5 equivalentes) e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. 0 solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi-meti1-2-oxazolidinona. 157 3) Ligação dos intermediários 2-N-etil-sulfonilamino-3-(4- hidroxi-f enil) propionato_com_3-p-N-BOC-amidino-feni1-5- metanossulfoniloxi-metil-2-oxazolidinona, para formar a forma protegida do Composto 18. 3-(4-BOC-amidinofenil)-5-(4-(2-metoxi-carbonil-2-N-etil-sulfonilaminoetil)-fenioxilmetil-2-oxazolidinona

Uma mistura de 1,9 gramas de 2-N-etil-sulfonilamino-3-(4-hidroxi-fenil)propionato (como anteriormente descrito), 20 mL de dimetilformamida (DMF) e NaH (1,0 equivalente), foi agitada, durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após agitação, 1,8 gramas de 3-p-N-BOC-amidino-fenil-5-metanossulfoniloxi- metil-2-oxazolidinona (como anteriormente descrito) em 10 mL de dimetilformamida (DMF) foram adicionados e agitados de novo, durante 15 minutos, à temperatura ambiente. A mistura de reacção foi, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter a forma protegida do Composto 18, 3- (4-BOC-amidinofenil)-5-(4-(2-metoxi-carbonil-2-N-etil-sulfonilaminoetil)-fenioxilmetil-2-oxazolidinona que foi transportado para a etapa seguinte. 4) Desprotecção da forma protegida do Composto 18, para formar o Composto 18: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N- etilsulfonilaminoetil)fenoxi)metil-2-oxazolidinona, Figura 42

Tratamento da forma protegida do Composto 18, 3-(4-BOC- amidinof enil ) -5-(4-(2-metoxi-carbonil-2-N-etilsulfonilaminoetil)fenioxilmetil-2-oxazolidinona 158 (1,0 equivalentes; sintetizado como anteriormente descrito), com 4 mL de NaOH a 2 N, durante 4 horas, à temperatura ambiente. A mistura foi, depois, seguida com 40 mL de solução de HC1 a 2 N em dioxano, adicionado gota a gota, a 0 °C a 25 °C, durante 3 horas. A mistura de reacção foi, depois, parada com bicarbonato de sódio (5 equivalentes) e, depois, diluída com acetato de etilo (0,10 M) e lavada 2X com água, IX com solução salina saturada e seca sobre sulfato de magnésio. O solvente foi, depois, removido in vacuo e o produto em bruto foi, depois, purificado por cromatografia de coluna de sílica gel, para se obter o Composto 18: 3-(4-amidinofenil)-5-(4-(2-carboxi-2-N- etilsulfonilaminoetil)fenoxi)metil-2-oxazolidinona; p. f. 212 °C (d) . 14. Inibição de Angiogénese Induzida por Factor de Crescimento, como Medido no Ensaio CAM, por Aplicação Intravenosa de Miméticos Orgânicos de Ligando de ανβ3 O efeito sobre a angiogénese induzida por factor de crescimento com miméticos orgânicos de um ligando de ανβ3, injectado intravenosamente dentro da preparação CAM, também foi avaliado para utilização nesta invenção. A preparação CAM de 10 dias de idade foi utilizada como anteriormente descrito no Exemplo 5A. Vinte e quatro horas após ter sido iniciada a angiogénese induzida por bFGF, os miméticos orgânicos referidos como compostos 16 (81218), 17 (87292) e 18 (87293) foram separadamente injectados intravenosamente dentro da preparação CAM, num volume de 100 pL, a uma concentração de 1 mg/mL (100 pg/embrião) em 20% de tetraglicol-PBS a pH 7,0. Em ensaios paralelos, os compostos 159 7 (96112), 9 (99799), 10 (96229), 12 (112854) e 14 (96113) foram analogamente avaliados. Os efeitos dos miméticos orgânicos foram analisados 48 horas mais tarde, onde foi realizada a quantificação por contagem do número de pontos de ramificação de vasos sanguíneos na área do disco de filtro, numa abordagem duplamente cega.

Os resultados são mostrados, respectivamente, nas Figuras 43 e 44. Na Figura 43, os compostos 14 (96113), 10 (96229), 9 (99799) e 12 (112854), por ordem decrescente de inibição, foram eficazes na redução do número de pontos de ramificação de novos vasos sanguíneos, em comparação com a indução por bFGF de controlo e em comparação com o composto 7 (96112). Na Figura 44, os compostos 17 (87292) e 18 (87293) exibiram propriedades anti-angiogénicas, em comparação com controlo de bFGF não tratado e tratamento com o composto 16 (81218).

Num terceiro ensaio, os compostos orgânicos 7 (96112), 10 (96229) e 14 (96113) foram avaliados como inibidores de angiogénese induzida por bFGF, juntamente com os péptidos 69601 e 66203. Para este ensaio, 250 pg/mL dos compostos orgânicos foram administrados 18 horas após tratamento de bFGF, como descrito no Exemplo 7B. Os resultados são mostrados na

Figura 28 onde, como anteriormente, os compostos 14 (96113) e 10 (96229) inibiram quase completamente a formação de novos vasos sanguíneos induzidos por bFGF.

Assim, os Exemplos supramencionados demonstram que a integrina ανβ3 desempenha um papel chave na angiogénese induzida por uma variedade de estímulos e, como tal, ο ανβ3 é um alvo 160 terapêutico valioso com os antagonistas de ανβ3 desta invenção para doenças caracterizadas por neovascularização. A memória descritiva escrita anterior é considerada como sendo suficiente para permitir que um especialista na técnica pratique a invenção. A presente invenção não deve ser limitada em âmbito pela linha celular depositada, visto que a forma de realização depositada pretende ser uma simples ilustração de um aspecto da invenção e qualquer linha celular que seja funcionalmente equivalente está dentro do âmbito desta invenção. 0 depósito do material não constitui uma admissão de que a descrição escrita aqui contida é inadequada para possibilitar a prática de qualquer aspecto da invenção, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser interpretado como limitando o âmbito das reivindicações para a ilustração especifica que o mesmo representa. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE:

(A) NOME: THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE (B) RUA: 10550 North Torrey Pines Road (C) CIDADE: La Jolla (D) ESTADO: Califórnia

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 92037 (G) TELEFONE: (619) 784-2937 (H) TELEFAX: (619) 784-9399 161

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: MÉTODOS E COMPOSIÇÕES ÚTEIS PARA A INIBIÇÃO DE ANGIOGÉNESE (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 45 (iv) FORMA COMPUTORIZADA DE LEITURA: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: PC IBM compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln, Lançamento N° 1.0,

Versão N° 1.25 (v) DADOS DE PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DE PEDIDO: PCT/US 9 7/ (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 30-MAIO-1997 (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/210715 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 18-MAR-1994 (vi) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DE PEDIDO: US 08/366665 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 30-DEZ-1994 162 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador= BOC-GRGDFV- OMe/nota- "BOC significa o grupo protector N-terminal butiloxicarbonilo; OMe significa um éster metilico C-terminal; arginina na segunda posição". (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador- OMe/nota= "OMe significa o grupo protector C-terminal éster metilico". (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6 163 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador= D-Arg/nota= "Um prefixo "D" em D-Arg significa que a arginina na posição 2 é um aminoácido D". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 1:

Gly Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador= BOC/nota= "BOC significa o grupo de bloqueio N-terminal tercbutiloxicarbonilo". (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6 164

(D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador= OH/nota= "OH significa um ácido carboxilico C-terminal livre". (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador= D-Arg/nota= "Um prefixo "D" em D-Arg significa que a arginina na posição 2 é um aminoácido D". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 2:

Gly Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6

(D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador= H/nota= "H significa uma amina N-terminal livre". 165 (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6

(D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador= OH/nota= "OH significa um ácido carboxilico C-terminal livre". (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 1.. 6 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /marcador= D-Arg/nota= "Um prefixo "D" em D-Arg na posição 2, significa que a arginina é um aminoácido D". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 3:

Gly Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 2 um aminoácido (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Arg D". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 4:

Gly Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 um aminoácido (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Arg e D" . (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 5:

Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 167 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 4 um aminoácido (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Phe D" . (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 6:

Arg Ala Asp Phe Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno 168 (ix) CARACTERISTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Vai é um aminoácido D". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 7:

Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 8:

Tyr Thr Ala Glu Cys Lys Pro Gin Vai Thr Arg Gly Asp Vai Phe 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos 169 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 2 um aminoácido (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Ala D". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 9: Arg Ala Asp Phe Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 5 um aminoácido (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Phe D". 170 (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 1 Ala Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 5 um aminoácido (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Phe D". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 1

Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5 171 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 12 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 12:

Thr Arg Gin Vai Vai Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 13:

Gly Vai Vai Arg Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser 15 10 172 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 14

Thr Asp Vai Asn Gly Asp Gly Arg His Asp Leu 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: 173 (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Metilação é na extremidade amino (NH2) do resíduo de valina". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 15:

Arg Gly Asp Phe Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: circular (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOME/CHAVE: Péptido (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRA INFORMAÇÃO: /nota= "Metilação é na extremidade amino (NH2) do resíduo de valina". (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 16:

Arg Gly Glu Phe Vai 1 5 174 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 222 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 17:

Lys Gly Ile Gin Glu Leu Tyr Gly Ala Ser Pro Asp Ile Asp Leu Gly 15 10 15

Thr Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Uai Thr Pro Glu Ile Cys Lys 20 25 30

Gin Asp Ile Vai Phe Asp Gly Ile Ala Gin lie Arg Gly Glu Ile Phe 35 40 45

Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Vai Thr Pro Arg Asp Lys 50 55 60

Pro Met Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Glu Leu Pro Glu 65 70 75 80

Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys Ala Vai Phe 85 90 95

Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg 100 105 110 175

Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Vai Gin 115 120 125

Arg Vai Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr Ile 130 135 140

Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Vai Lys Lys Lys Met 145 150 155 160

Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro 165 170 175

Asp Asn Leu Asp Ala Vai Vai Asp Leu Gin Gly Gly Gly His Ser Tyr 180 185 190

Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin Ser Leu Lys 195 200 205

Ser Vai Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 210 215 220 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 193 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 18:

Ile Cys Lys Gin Asp Ile Vai Phe Asp Gly Ile Ala Gin Ile Arg Gly 15 10 15 176

Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Vai Thr Pro 20 25 30

Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Glu 35 AO 45

Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys 50 55 60

Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr 65 70 75 80

Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro 85 90 95

Asp Vai Gin Arg Vai Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys 100 105 110

Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Vai Lys 115 120 125

Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn 130 135 160

Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala Vai Vai Asp Leu Gin Gly Gly Gly 145 150 155 160

His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin 165 170 175

Ser Leu Lys Ser Vai Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly 180 185 190

Cys 177 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 19:

Ile Cys Lys Gin Asp Ile Vai Phe Asp Gly Ile Ala Gin lie Arg Gly 15 10 15

Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Vai Thr Pro 20 25 30

Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Glu 35 AO 45

Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys 50 55 60

Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 178 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 20:

Ile Cys Lys Gin Asp Ile Vai Phe Asp Gly Ile Ala Gin Ile Arg Gly 15 10 15

Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Vai Thr Pro 20 25 30

Arg Asp Lys Pro Met Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Glu 35 40 45

Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys 50 55 60

Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr 65 70 75 80

Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro 85 90 95

Asp Vai Gin Arg Vai Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 122 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 179 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 21:

Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Tyr Pro Lys 15 10 15

Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Vai Gin Arg Vai Asp Ala 20 25 30

Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp 35 AO 45

Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Vai Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe 50 55 60

Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp 65 70 75 80

Ala Vai Vai Asp Leu Gin Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly 85 90 95

Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin Ser Leu Lys Ser Vai Lys Phe 100 105 110

Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 89 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 180 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 22:

Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ala Gly Asp Lys 15 10 15

Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Vai Lys Lys Lys Met Asp Pro Gly Phe Pro 20 25 30

Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp Asn Leu Asp Ala 35 AO 45

Vai Vai Asp Leu Gin Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe Phe Lys Gly Ala 50 55 60

Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin Ser Leu Lys Ser Vai Lys Phe Gly 65 70 75 80

Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 85 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 228 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 23: 181

Lys Gly Ile Gin Glu Leu Tyr Glu Vai Ser Pro Asp Vai Glu Pro Gly 15 10 15

Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Arg Pro Thr Leu Gly Pro Vai 20 25 30

Thr Pro Glu Leu Cys Lys His Asp lie Vai Phe Asp Gly Vai Ala Gin 35 40 45

Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr 50 55 60

Vai Asn Pro Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe 65 70 75 80

Trp Pro Asp Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ser Pro Gin 85 90 95

Asp Glu Lys Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Vai Tyr Thr 100 105 110

Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly 115 120 125

Leu Pro Pro Asp Vai Gin Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly Arg 130 135 140

Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn 145 150 155 150

Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro Lys Phe Ile Ala Asp 165 170 175

Ser Trp Asn Gly Vai Pro Asp Asn Leu Asp Ala Vai Leu Gly Leu Thr 180 185 190

Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gin Tyr Tyr Leu Gin Met 195 200 205

Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Vai Lys Ile Gly Lys Ile Ser Ser Asp 210 215 220 182

Trp Leu Gly Cys 225 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 193 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 24:

Leu Cys Lys His Asp Ile Vai Phe Asp Gly Vai Ala Gin Ile Arg Gly 15 10 15

Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr Vai Asn Pro 20 25 30

Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Asp 35 40 45

Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ser Pro Gin Asp Glu Lys 50 55 60

Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Vai Tyr Thr Ala Ser Asn 65 70 75 80

Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro 85 90 95

Asp Vai Gin Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly Arg Asn Lys Lys 100 105 110 183

Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys 115 120 125

Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro Lys Phe Ile Ala Asp Ser Trp Asn 130 135 140

Gly Vai Pro Asp Asn Leu Asp Ala Vai Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly 145 150 155 160

Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gin Tyr Tyr Leu Gin Met Glu Asp Lys 165 170 175

Ser Leu Lys Ile Vai Lys Ile Gly Lys Ile Ser Ser Asp Trp Leu Gly 180 185 190

Cys (2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID N° 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 74 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 25:

Leu Cys Lys His Asp Ile Vai Phe Asp Gly Vai Ala Gin Ile Arg Gly 15 10 15 184

Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr Vai Asn Pro 20 25 30

Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Asp 35 40 45

Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ser Pro Gin Asp Glu Lys 50 55 60

Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 108 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 26:

Leu Cys Lys His Asp Ile Vai Phe Asp Gly Vai Ala Gin Ile Arg Gly 15 10 15

Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met Trp Arg Thr Vai Asn Pro 20 25 30

Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Asp 35 40 45

Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ser Pro Gin Asp Glu Lys 50 55 60 185

Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Vai Tyr Thr Ala Ser Asn 65 70 75 80

Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro 85 90 95

Asp Vai Gin Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn Trp Gly 100 105 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 122 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 27:

Glu Tyr Trp Vai Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys 15 10 15

Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Vai Gin Arg Ile Asp Ala 20 25 30

Ala Phe Asn Trp Gly Arg Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp 35 40 45

Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr 50 55 60

Pro Lys Phe Ile Ala Asp Ser Trp Asn Gly Vai Pro Asp Asn Leu Asp 65 70 75 80 186

Ala Vai Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp 85 90 95

Gin Tyr Tyr Leu Gin Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Vai Lys Ile 100 105 110

Gly Lys Ile Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 89 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 28:

Phe Asn Trp Gly Arg Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg 15 10 15

Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro 20 25 30

Lys Phe Ile Ala Asp Ser Trp Asn Gly Vai Pro Asp Asn Leu Asp Ala 35 40 45

Vai Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gin 50 55 60

Tyr Tyr Leu Gin Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Vai Lys Ile Gly 65 70 75 80 187

Lys Ile Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys 85 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2123 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 132.. 2123 60 120 170

(xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 29: AATTCCGGCA AAAGAGAAAA CGGTGCAGAG AGTTAAGATG TGCAGATAAG CAACTAGTGC

ACTGTGCAGC CAAAGTAACT GACAGTCAGT CAGAGAAATC TTTTAAAGAG GATTGCAAAA ATATAGGCAG A ATG AAG ACT CAC AGT GTT TTT GGC TTC TTT TTT AAA GTA Met Lys Thr HLs Ser Vai Phe Gly Phe Phe Phe Lys Vai 15 10 CTA TTA ATC CAA GTG TAT CTT TTT AAC AAA ACT TTA GCT GCA CCG TCA Leu Leu Ile Gin Vai Tyr Leu Phe Asn Lys Thr Leu Ala Ala Pro Ser 15 20 25 188 218 266 266 CCA ATC ATT AAG TTC CCT GGA GAC AGC ACT CCA AAA ACA GAC AAA GAG Pro lie Ile Lys Phe Pro Gly Asp Ser Thr Pro Lys Thr Asp Lys Glu 30 35 40 45 CTA GCA GTG CAA TAC CTG AAT AAA TAT TAT GGA TGC CCA AAA GAC AAT Leu Ala Vai Gin Tyr Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly Cys Pro Lys Asp Asn 50 55 60 TGC AAC TTA TTT GTA TTG AAA GAT ACT TTG AAG AAA ATG CAG AAA TTT Cys Asn Leu Phe Vai Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gin Lys Phe 65 70 75 TTT GGG CTG CCT GAA ACA GGA GAT TTG GAT CAA AAC ACA ATT GAG ACA Phe Gly Leu Pro Glu Thr Gly Asp Leu Asp Gin Asn Thr lie Glu Thr 80 85 90 ATG AAG AAA CCC CGC TGT GGT AAC CCC GAT GTG CCC AAT TAC AAC TTC Met Lys Lys Pro Cys Gly Asn Pro Asp Vai Ala Asn Tyr Asn Phe 95 100 105 TTT CCA AGA AAG CCA AAA TGC GAA AAC AAT CAT ATA ACA TAC ACG ATT Phe Pro Arg Lys Pro Lys Trp Glu Lys Asn His Ile Thr Tyr Arg Ile 110 115 120 125 ATA GGC TAT ACC CCG GAT TTG GAT CCT GAG ACA GTA GAT GAT GCC TTT Ile Gly Tyr Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Vai Asp Asp Ala Phe 130 135 140 GCC CGA GCC TTT AAA GTC TGG AGT GAT GTC ACG CCA CTG AGA TTT AAC Ala Arg Ala Phe Lys Vai Trp Ser Asp Vai Thr Pro Leu Arg Phe Asn 145 150 155 CCA ATA AAT GAT GCA GAG GCA GAC ATT ATG ATT AAT TTT GCC CGA TGG Arg Ile Asn Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp 160 165 170 GAA CAT GGT GAT GGC TAT CCA TTT GAT GGC AAA GAT GGT CTC CTG GCT Glu His Gly Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala 175 180 185 314 362 410 458 506 554 602 650 189 698 CAC GCC TTT GCA CCG GGG CCA GGA ATT GGA GGA GAC TCC CAT TTT GAT 746 His Ala Phe Ala Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Ser His Phe Asp 190 195 200 205 GAT GAT GAA CTG TGG ACT CTT GGA GAA GGG CAA GTG GTT AGA GTA AAG 794 Asp Asp Glu Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gin Vai Vai Arg Vai Lys 210 215 220 TAT GGA AAT GCA GAT GGT GAA TAC TGC AAA TTT CCC TTC TGG TTC AAT 842 Tyr Gly Asn Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Trp Phe Asn 225 230 235 GGT AAG GAA TAC AAC AGC TGC ACA GAT GCA GGA CGT AAT GAT GGA TTC 890 Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Ala Gly Arg Asn Asp Gly Phe 240 245 250 CTC TGG TGT TCC ACA ACC AAA GAC TTT GAT GCA GAT GGC AAA TAT GGC 938 Leu Trp Cys Ser Thr Thr Lys Asp Phe Asp Ala Asp Gly Lys Tyr Gly 255 260 265 TTT TGT CCC CAT GAG TCA CTT TTT ACA ATG GGT GGC AAT GGT GAT GGA 986 Phe Cys Pro His Glu Ser Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Gly Asp Gly 270 275 280 285 CAG CCC TGC AAG TTT CCC TTT AAA TTT CAA GGC CAG TCC TAT GAC CAG 1034 Gin Pro Cys Lys Phe Pro Phe Lys Phe Gin Gly Gin Ser Tyr Asp Gin 290 295 300 TGT ACA ACA GAA GGC AGG ACA GAT GGA TAC AGA TGG TGT GGA ACC ACT 1082 Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr 305 310 315 GAA GAC TAT GAT AGA GAT AAC AAA TAC GGA TTC TGC CCA GAA ACT GCC 1130 Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala 320 325 330 ATG TCA ACA GTT GGT GGA AAT TCA GAA GGA GCT CCT TGT GTA TTC CCC 1178 Met Ser Thr Vai Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Vai Phe Pro 335 340 345 TTC ATC TTC CTT GGG AAT AAA TAC GAC TCC TGT ACA AGT GCA GGT CGC 1226 Phe lie Phe Leu Gly Asn Lys Tyr Asp Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg 350 355 360 365 190 ΑΑΤ GAT GGC AAG CTG TGG TGT GCT TCT ACC AGC AGC TAT GAT GAT GAC 1274 Asn Asp Gly Lys Leu Trp Cys Ala Ser Thr Ser Ser Tyr Asp Asp Asp 370 375 380 CCC AAG TGG GGC TTT TGT CCA GAT CAA GGA TAC AGT CTC TTC TTG GTT 1322 Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gin Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Vai 385 390 395 GCT GCC CAC GAA TTT GGC CAT GCG ATG GGA TTA GAG CAC TCC GAG GAC 1370 Ala Ala His Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Glu Asp 400 405 410 CCA GGA GCT CTC ATG GCC CCG ATC TAC ACC TAC ACC AAG AAC TTC CGC 1418 Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg 415 420 425 CTT TCT CAG GAT GAC ATT AAG GCG ATT CAG GAG CTA TAT GAA GTA TCA 1466 Leu Ser Gin Asp Asp Ile Lys Gly Ile Gin Glu Leu Tyr Glu Vai Ser 430 435 440 445 CCT GAT GTG GAA CCT GGA CCA GGG CCA GGA CCA GGG CCA GGA CCA CGT 1514 Pro Asp Vai Glu Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Arg 450 455 460 CCT ACC CTT GGA CCT GTC ACT CCA GAG CTC TGC AAG CAC GAC ATT GTA 1562 Pro Thr Leu Gly Pro Vai Thr Pro Glu Leu Cys Lys His Asp Ile Vai 465 470 475 TTT GAT GGA GTT GCA CAA ATT AGA GGA GAA ATA TTT TTC TTC AAA GAC 1610 Phe Asp Gly Vai Ala Gin Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp 480 485 490 AGA TTC ATG TGG AGG ACT GTA AAC CCT CGA CGA AAA CCC ACA GGT CCT 1658 Arg Phe Met Trp Arg Thr Vai Asn Pro Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro 495 500 505 CTT CTC GTT GCT ACA TTC TGG CCT GAT CTG CCA GAG AAA ATC GAT GCT 1706 Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Asp Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala 510 515 520 525 GTC TAC GAG TCC CCT CAG GAT GAG AAG GCT GTA TTT TTT GCA GGA AAT 1754 Vai Tyr Glu Ser Pro Gin Asp Glu Lys Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn 530 535 540 191 GAG TAC TGG GTT TAT ACA GCC AGC AAC CTG GAT AGG GGC TAT CCA AAG Glu Tyr Trp Vai Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys 545 550 555 AAA CTC ACC AGC CTG CGA CTA CCC CCT GAT GTG CAA CGC ATT GAT GCA Lys Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Vai Gin Arg Ile Asp Ala 560 565 570 GCC TTC AAC TGG GGC AGA AAC AAG AAG ACA TAT ATT TTC TCT GGA GAC Ala Phe Asn Trp Gly Arg Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp 575 580 585 AGA TAC TGG AAG TAC AAT GAA GAA AAG AAA AAA ATG GAG CTT GCA ACC Arg Tyr Trp Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr 590 595 600 605 CCA AAA TTC ATT GCG GAT TCT TGG AAT GGA GTT CCA GAT AAC CTC GAT Pro Lys Phe Ile Ala Asp Ser Trp Asn Gly Vai Pro Asp Asn Leu Asp 610 615 620 GCT GTC CTG GGT CTT ACT GAC AGC GGG TAC ACC TAT TTT TTC AAA GAC Ala Vai Leu Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp 625 630 635 CAG TAC TAT CTA CAA ATG GAA GAC AAG AGT TTG AAG ATT GTT AAA ATT Gin Tyr Tyr Leu Gin Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Vai Lys Ile 640 645 650 GGC AAG ATA AGT TCT GAC TGG TTG GGT TGC TG Gly Lys Ile Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys 655 660 1802 1850 1898 1946 1994 2042 2090 2123 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 663 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 192 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 30:

Met Lys Thr His Ser Vai Phe Gly Phe Phe Phe Lys Vai Leu Leu Ile 15 10 15

Gin Vai Tyr Leu Phe Asn Lys Thr Leu Ala Ala Pro Ser Pro Ile Ile 20 25 30

Lys Phe Pro Gly Asp Ser Thr Pro Lys Thr Asp Lys Glu Leu Ala Vai 35 AO 45

Gin Tyr Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly Cys Pro Lys Asp Asn Cys Asn Leu 50 55 60

Phe Vai Leu Lys Asp Thr Leu Lys Lys Met Gin Lys Phe Phe Gly Leu 65 70 75 80

Pro Glu Thr Gly Asp Leu Asp Gin Asn Thr Ile Glu Thr Met Lys Lys 85 90 95

Pro Arg Cys Gly Asn Pro Asp Vai Ala Asn Tyr Asn Phe Phe Pro Arg 100 105 110

Lys Pro Lys Trp Glu Lys Asn His Ile Thr Tyr Arg Ile Ile Gly Tyr 115 120 125

Thr Pro Asp Leu Asp Pro Glu Thr Vai Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala 130 135 140

Phe Lys Vai Trp Ser Asp Vai Thr Pro Leu Arg Phe Asn Arg Ile Asn 145 150 155 160

Asp Gly Glu Ala Asp Ile Met Ile Asn Phe Gly Arg Trp Glu His Gly 165 170 175

Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe 180 185 190 193

Ala Pro Gly Pro Gly Ile Gly Gly Asp Ser His Phe Asp Asp Asp Glu 195 200 205

Leu Trp Thr Leu Gly Glu Gly Gin Vai Vai Arg Vai Lys Tyr Gly Asn 210 215 220

Ala Asp Gly Glu Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Trp Phe Asn Gly Lys Glu 225 230 235 240

Tyr Asn Ser Cys Thr Asp Ala Gly Arg Asn Asp Gly Phe Leu Trp Cys 245 250 255

Ser Thr Thr Lys Asp Phe Asp Ala Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Cys Pro 260 265 270

His Glu Ser Leu Phe Thr Met Gly Gly Asn Gly Asp Gly Gin Pro Cys 275 280 285

Lys Phe Pro Phe Lys Phe Gin Gly Gin Ser Tyr Asp Gin Cys Thr Thr 290 295 300

Glu Gly Arg Thr Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr Glu Asp Tyr 305 310 315 320

Asp Arg Asp Lys Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala Met Ser Thr 325 330 335

Vai Gly Gly Asn Ser Glu Gly Ala Pro Cys Vai Phe Pro Phe Ile Phe 340 345 350

Leu Gly Asn Lys Tyr Asp Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg Asn Asp Gly 355 360 365

Lys Leu Trp Cys Ala Ser Thr Ser Ser Tyr Asp Asp Asp Arg Lys Trp 370 375 380

Gly Phe Cys Pro Asp Gin Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Vai Ala Ala His 385 390 395 400 194

Glu Phe Gly His Ala Met Gly Leu Glu His Ser Glu Asp Pro Gly Ala 405 410 415

Leu Met Ala Pro lie Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg Leu Ser Gin 420 425 430

Asp Asp Ile Lys Gly lie Gin Glu Leu Tyr Glu Vai Ser Pro Asp Vai 435 440 445

Glu Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Pro Arg Pro Thr Leu 450 455 460

Gly Pro Vai Thr Pro Glu Leu Cys Lys His Asp Ile Vai Phe Asp Gly 465 470 475 480

Vai Ala Gin Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe Phe Lys Asp Arg Phe Met 485 490 495

Trp Arg Thr Vai Asn Pro Arg Gly Lys Pro Thr Gly Pro Leu Leu Vai 500 505 510

Ala Thr Phe Trp Pro Asp Leu Pro Glu Lys Ile Asp Ala Vai Tyr Glu 515 520 525

Ser Pro Gin Asp Glu Lys Ala Vai Phe Phe Ala Gly Asn Glu Tyr Trp 530 535 540

Vai Tyr Thr Ala Ser Asn Leu Asp Arg Gly Tyr Pro Lys Lys Leu Thr 545 550 555 560

Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Vai Gin Arg Ile Asp Ala Ala Phe Asn 565 570 575

Trp Gly Arg Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe Ser Gly Asp Arg Tyr Trp 580 585 590

Lys Tyr Asn Glu Glu Lys Lys Lys Met Glu Leu Ala Thr Pro Lys Phe 595 600 605 195

Ile Ala Asp Ser Trp Asn Gly Vai Pro Asp Asn Leu Asp Ala Vai Leu 610 615 620

Gly Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Thr Tyr Phe Phe Lys Asp Gin Tyr Tyr 625 630 635 640

Leu Gin Met Glu Asp Lys Ser Leu Lys Ile Vai Lys Ile Gly Lys Ile 645 650 655

Ser Ser Asp Trp Leu Gly Cys 660 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 31: ATTGAATTCT TCTACAGTTC A 21 196 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 32 ATGGGATCCA CTGCAAATTT C 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 33 GCCGGATCCA TGACCAGTGT A 21 197 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 34 GTGGGATCCC TGAAGACTAT G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 35 AGGGGATCCT TAAGGGGATT C 21 198 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 36 CTCGGATCCT CTGCAAGCAC G 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 37 CTCGGATCCT CTGCAAGCAC G 21 199 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 38 GCAGGATCCG AGTGCTGGGT TTATAC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 39 GCAGAATTCA ACTGTGGCAG AAACAAG 27 200 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 40 GTAGAATTCC AGCACTCATT TCCTGC 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 41 TCTGAATTCT GCCACAGTTG AAGG 24 201 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 42: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 42 ATTGAATTCT TCTACAGTTC A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 43: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 43 GATGAATTCT ACTGCAAGTT 20 202 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ΑΝΤΙ-SENTIDO: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 44 CACTGAATTC ATCTGCAAAC A 21 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 429 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: C-terminal (xi) DESCRIÇÃO DE SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 45 203

Tyr Cys Lys Phe Pro Phe Leu Phe Asn Gly Lys Glu Tyr Asn Ser Cys 15 10 15

Thr Asp Thr Gly Arg Ser Asp Gly Phe Leu Trp Cys Ser Thr Thr Tyr 20 25 30

Asn Phe Glu Lys Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Cys Pro His Glu Ala Leu 35 40 45

Phe Thr Met Gly Gly Asn Ala Glu Gly Gin Pro Cys Lys Phe Pro Phe 50 55 60

Arg Phe Gin Gly Thr Ser Tyr Asp Ser Cys Thr Thr Glu Gly Arg Thr 65 70 75 80

Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Gly Thr Thr Glu Asp Tyr Asp Arg Asp Lys 85 90 95

Lys Tyr Gly Phe Cys Pro Glu Thr Ala Met Ser Thr Vai Gly Gly Asn 100 105 110

Ser Glu Gly Ala Pro Cys Vai Phe Pro Phe Thr Phe Leu Gly Asn Lys 115 120 125

Tyr Glu Ser Cys Thr Ser Ala Gly Arg Ser Asp Gly Lys Met Trp Cys 130 135 140 204

Ala Thr Thr ALa Asn Tyr Asp Asp Asp Arg Lys Trp Gly Phe Cys Pro 145 150 155 160

Asp Gin Gly Tyc Ser Leu Phe Leu Vai Ala Ala His Glu Phe Gly His 165 170 175

Ala Met Gly Leu Glu His Ser Gin Asp Pro Gly Ala Leu Met Ala Pro 180 185 190

Ile Tyr Thr Tyr Thr Lys Asn Phe Arg Leu Ser Gin Asp Asp lie Lys 195 200 205

Gly Ile Gin Glu Leu Tyr Gly Ala Ser Pro Asp Ile Asp Leu Gly Thr 210 215 220

Gly Pro Thr Pro Thr Leu Gly Pro Vai Thr Pro Glu Ile Cys Lys Gin 225 230 235 240

Asp Ile Vai Phe Asp Gly Ile Ala Gin Ile Arg Gly Glu Ile Phe Phe 245 250 255

Phe Lys Asp Arg Phe Ile Trp Arg Thr Vai Thr Pro Arg Asp Lys Pro 260 265 270

Mec Gly Pro Leu Leu Vai Ala Thr Phe Trp Pro Glu Leu Pro Glu Lys 275 280 285

Ile Asp Ala Vai Tyr Glu Ala Pro Gin Glu Glu Lys Ala Vai Phe Phe 290 295 300

Ala Gly Asn Glu Tyr Trp Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly 305 310 315 320

Tyr Pro Lys Pro Leu Thr Ser Leu Gly Leu Pro Pro Asp Vai Gin Arg 325 330 335

Vai Asp Ala Ala Phe Asn Trp Ser Lys Asn Lys Lys Thr Tyr Ile Phe 340 345 350 205

Ala Gly Asp Lys Phe Trp Arg Tyr Asn Glu Vai Lys Lys Lys Met Asp 355 360 365 Pro Gly Phe Pro Lys Leu Ile Ala Asp Ala Trp Asn Ala Ile Pro Asp 370 375 380 Asn Leu Asp Ala Vai Vai Asp Leu Gin Gly Gly Gly His Ser Tyr Phe 385 390 395 400

Phe Lys Gly Ala Tyr Tyr Leu Lys Leu Glu Asn Gin Ser Leu Lys Ser 405 410 415

Vai Lys Phe Gly Ser Ile Lys Ser Asp Trp Leu Gly Cys 420 *25

Lisboa, 23 de Julho de 2010 206

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Antagonista de ανβ3, para utilização na inibição de angiogénese mediada por ανβ3 num tecido, em que o referido antagonista é um composto mimético orgânico seleccionado de ácido (S)-3-(4-(4-guanidinobutiloxi)fenil-2-butilsulfonamido-propiónico, ácido (S)-3-(4-(4-guanidinobutiloxi)fenil-2-N-t-butiloxicarbonil-propiónico, ácido (R)-3-(4-(4-guanidinobutiloxi)fenil-2- butilsulfonamido-propiónico, ácido (S)-3-(4-(4-guanidinobutiloxi)fenil-2-(10- canforsulfonamido)-propiónico e ácido (S)-3-(4-(5-guanidinopentiloxi)fenil-2- butilsulfonamido-propiónico.

1, 4-DIBRCMOBUTANO,

CLORETO DE ÁCIDO BUTANOSSULFÓNICO

COMPOSTO 300

FIG. 40 43/46 Ο

1,4-DIBROMOBUTANO, CARBONATO DE POTÁSSIO, 18 COROA-6: 80 °C, 12h

FIG. 39 COMPOSTO 9 N 42/46

2 4/46 25/46 AATTCCGGCAAAAGAGAAAACGGTGCAGAGAGTTAAGATGTGCAGATAAGCAACTAGTGCACTGTGCAGCCAAAGTAACTGACAGTCAGTCAGAGflAATC -110 ο-=τ i—tooo r— ·—iOOO ·—iK>hOrA «—«Krsfs .—i i oojudco CH 00*01 ΟΓΛΚΪΝΛ CTOOlO O)0)0><7) 1 + + *· + i—1 ♦ + + CM ♦ + + + ♦ + + + ? «—ii-H »—i + + + + Lf\*^ f—i r-H + + + + t— CJ CJ >- m • «st «st <t o • · <t «xo · · <t — LU • · O CD «X o oz • • 1— Κ h~ tf • CD cjz o «st «SC f— • • Ι— O *— >- • · «c l·— >- · · tf CJ • « CD tf tf tf tf O • • <c CD CD —1 • Ι 1—U_ h“ «st «st • • «t ►— Ο • · h- 1—>-LUlU CJ t— CD —1 • · CJ tf l— tf h-Ο • • <t H- CJ —1 • tf h— tf h— εοσ CJ h- tf > • · h— A K T T CD <X <t D- • · CJ t— cj tf CD—J • • CJ CJ H* CD • CD h—>- tf h~ fr— • • CJ CD tf oc • · tf i— z: · · «st CD r— ♦ · CD CD f— tf }—O • • «t CJ 1— O • tf CD> «st tf CD • • <t «st 1— > • « Ι CD_1 t · CD <r CJ > • · CD H- Ο 1— SC CD • • <t K «ac • CD <σ CD CD «SC Uicaca CD «t CD > è · <r o>- · « CD «st f— O « « <c H- o tf tf l·— • • CD * «st CJ CD • CD o·—· H- CJ CD 2 • • CD CD tf CS • · H— «CO · * tf CD ►— LO v · CD tf «X tf cujog H- CD 1— O • CJ CJ tf «=C • • «st «t CD o • · J— CD> · · CD <t CD 3: • · CD CD h~ Η~ H-Q- • • «st O 1— LU • CD tf —J CD CJ «=C a. • • W— h- tf -U • · Ι tf tf · · CJ CJ CJ > • · h* tf Ο CJ CD—1 • • CJ 1— <C Q_ • CD <c> CD l·— CD iC • • CD CJ tf o • · h- tf ^ · ♦ CJ <t <C LJ CD cd H- CD CD • • ct «SC h- >- • CD CJ CD <t cx m • «SC «c 1— • · tf CDLU * · CD CD l— _L_ • _1 h- h— «r tf h—LC • • <=£. 1— CJ CD • CJ h“LL- CD h~ <t X • t 1— CD 1— — # · *— · · H— CJ CJ «a: • · CD CJ H- tf h-LL. • • CJ CJ H— O • tf 1—LL- «st H- 1— LU • • CD <t CD 2 « · \— oo · · H— h- «a: □r • · CD CD *— «t • • h- CD H— CD • H- CJLL CD tf CJ • • CJ CD CD • · l·— <h · · <t CJ «t • · CD ►— >— CJ CD O • • H— CJ 1— 3= • CJ O CD «X tf CJ • Λ CD «t tf Jj • · CD * · CJ *=C K- JL_ • · CJ «st CD tf cds: • • «C t— «t LQ ♦ CD h~LL_ «=t l·- CJ >- • • 1— <t Y— ca • · 1— <Q_ · · <t «« A CJ «ct • · CD «st CJ • • H— CJ CD 3 • CD CJ tf 1— ΈΖ • • CD CD 1— ca • · l·— l— — «=sC <c «a: l·— O • · l·- tf CD CJ • • «st ««C OC • CD H-CO «st <t CJ BC. • • CD CD 1— u_ • · CD CJCO>> tf O h— O • · CJ tf «st CD CD-J • • CD «=c O CD t CD CJX «=c *— o> • • CD CD V— ac • · tf UQ · · ►— «a: > • · CD l·— CJ tf h—h— • • CD 1— h— Ll_ • h— CD ♦ CJ t—ca • • CD H- 1— 0o • · o «st CD · ♦ tf «st a !— Φ · >— tf «=c CD ►—Q • • CD CJ 1— « CJ CD^ CD <c CJQ- • • «t <c CJ ca • · <c 1—0- · · CD CJ CD -lJ • · <t CJ <c CJ «ar:*: • • CJ «st f— • l·— A CDSZ CJ «=t t_)Z • • CD 1— CJ ca • · * H- CJLU · · <t <t 1— 3u • · «a: tf A «st >— CD—J • • <c CJ CD s: • CD «St H· h- 1—0 • • CJ 1— tf o • · CD CD^ * · l·- CD »— O • · «^ CD <t «st tf> * • CD «t f— • CD CJ «st H- H-O • • CD 1— tf o • · CD CD CD CD —J • · <£ CD CD 1— *—lu * • l·— J— CJ n • CD tf «=t H- CJQC • • h- «sC 1— » H- CJ*— · · J— CD h- O « · CD h— tf 1— «st—1 • • CJ «st <t «a: • «st H* «a: h- CJQ- « • CD CJ tf o « · tf tf Q- · · h— CJ CD 3- « · CD CD tf CJ UZ * • CJ CJ CD UJ • CD tf CJ «=t <X.^é • • CJ «a tf XI—1— < «=cco ♦ · «st CJ 1— • · CD CJ «St CJ OU • • «at CJ «=t LD • CJ CJ H· CD o^oca: «SC CD CD CD • · CD CDQ- · * 1— <c H- >- • « CD CD 1— CJ l·—2ZOOGO «=t «SC h- Q t CD í— CJ st οε • • J— <t CD Q_ • · tf tf tf ♦ · «=t »— CJ LD • · CD CJ O CJ^ ocauuuj <t CD >— ZIC :n CJ CD CD «a: «sCh* • • CD «=t tf tf • · tf H-tf CD CJ <c —· « · et CJ CD O • » «t t— tf « CD «st CD <c O LU • • «t h— l·— LU • ♦ tf tf _J <c <c h“ —· • · tf J— -st »— <tO- • • CD »— tf OC. • J— »— CJ ·—* • » <C CD CJ tf • · |— o >— CD DC • · CJ CJ |— CJ CJCJ • • «t CD CJ scoco CD H" <c CD <C1— é • <t tf CJ 2C + · FIG. 22A 26/46 hOOO COCVJCVJCSJ + + + + cjicOlOld r^cvjcsjcvj + + + + *HNISKo^oaoacn oorvjcvjcvj + + + + —*oooσ>κ\κ“\ mCT>KM^\fA •—«ί'ΛΚΝΝΛ chcOcoud ΟΓΛΝΛίΛ »—«+♦ + rv^fs*cnoacncn ·—1ΝΛΝΛΝ » «—iO^íO cnracNicNi cvj-=r-=r ^ •-H + + + + CD O CD CD a? 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400 29/46 CPM LIGADO LIGAÇÃO A ανβ3 300 200 100 1

o t— 3 cr LO O 2 1 C-> CS </) CL o GTS-MM FIG. 23

[125I]GST2—4 [125I]GST10-1 FIG. 24 30/46

FIG. 25A FIG. 25B

FIG. 25C FIG· 25D ÍNDICE ANGIOGÉNICO

ÍNDICE ANGIOGÉNICO (PONTOS DE RAMIFICAÇÃO) J Ji IO A 0) 0D 0 (0 0 0 0 0 0 o 0

/ T ε 32/46 150- 140- 130- PONTOS DE RAMIFICAÇÃO

bFGF 69601 66203 96112 96113 96229 PÉPTIDOS & COMPOSTOS ORGÂNICOS MERCK (250 pg/inL) FIG. 28 PONTOS DE RAMIFICAÇAO ÍNDICE MGIOGÉNICO (PONTOS DE RAMIFICAÇÃO)

34/46 bFGF 24hr Sem Tratamento

FIG. 3IA 48hr 72hr

FIG. 3IB FIG. 3IC

_i _ . _V . .· - ; . -- -·*--—: 1 ii—·^ FIG. 3ID FIG. 3IE FIG. 3IF 35/46 24 h 48 h 72 h bFGF + PEX bFGF + FHEX

FI6. 3IJ FIG. 3IK FIG. 3IL 36/46

FIG. 32

FIG. 33 37/46

FIG. 34 PBS 69601 85189 PÉPTIDOS MERCK (100 pg/EMBRIÃO)

400- VOLUME DE TUMOR (mm3)

PÉPTIDO 601 PÉPTIDO 189 Mab LM609 FIG. 35 PESO MÉDIO (mg) VOLUME MÉDIO (3mm)

2. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido tecido é um tumor sólido e o referido antagonista é para a indução de regressão de tecido tumoral sólido.

3 8/46 média +/- S.E.N. de volumes de tumor (mm3) -* N W A IA OOOOO 0 0 0 0 0 0

média +/- S.E.M. de volumes de tumor (mm3) -* N W £ ifl OOOOO oooooo || I | m 2 Q 0 »8 (0 λ (D α Λ Λ Λ Λ 0) fc ί G) 8 8 8 8 8 8 ' 8' \ § Η· Ρω (0 § Η' Η· # <0 40/46

O- BENZILO COMPOSTO 1 ΥΎ 1,4-DIBROMOBUTANO,

O- BENZILO nh2 TFA CLORETO DE ACIDO BUTANOSSULFÓNICO

COMPOSTO 4

0- BENZILO

COMPOSTO 5 H2,Pd/C

COMPOSTO 6 FIG. 3Θ

COMPOSTO 7 41/46

0—BENZILO NoNj, DMF

3. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido tecido é um tumor sólido submetido a neovascularização e o referido antagonista é para utilização na inibição do crescimento do referido tecido tumoral.

4. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido tecido é tecido inflamado no qual a neovascularização está a ocorrer. 1

5. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido tecido é tecido retiniano no qual a neovascularização está a ocorrer.

6. Antagonista de f como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido antagonista é para utilização no tratamento de restenose num tecido, em que ocorre a migraçao de célula do músculo liso após angioplastia.

7. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido antagonista é para utilização na redução de fornecimento sanguíneo a um tecido requerido para suportar crescimento novo do referido tecido.

8. Antagonista de ανβ3, como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido tecido é tecido humano.

9. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido tecido está inflamado e a referide angiogénese é angiogénese de tecido inflamado.

10. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 9, em que o referido tecido é artrítico.

11. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 10, em que o referido tecido artrítico está presente num mamífero com artrite reumatóide.

12. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido tecido é o tecido retiniano e a referide angiogénese é angiogénese retiniana. 2

13. Antagonista de ανβ3ί como reivindicado na reivindicação 12, em que o referido tecido retiniano está num doente com retinopatia diabética ou degeneração macular.

14. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1, em que o referido tecido é um tumor sólido ou uma metástase de tumor sólido e a referide angiogénese é angiogénese de tumor.

15. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 14, em que o referido tecido é um carcinoma.

16. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 15, em que o referido tumor sólido é um tumor de pulmão, pâncreas, mama, cólon, laringe ou ovário.

17. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 14, em que o referido antagonista é para ser administrado em conjunto com quimioterapia.

18. Antagonista de ανβ3, como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido antagonista é para ser administrado por via intravenosa, transdérmica, intra-sinovial, intramuscular ou oral.

19. Antagonista de ανβ3/ como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido antagonista é para ser administrado numa quantidade compreendendo desde cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 300 mg/kg. 3

20. Antagonista de ανβ3, como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido antagonista é para ser administrado numa única dose intravenosamente.

21. Antagonista de θίνβ 3 / como reivindicado em qualquer das reivindicações 1-7, em que o referido antagonista é para ser administrado numa ou mais doses diariamente, durante um ou mais dias.

22. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1 ou reivindicação 6, em que o referido antagonista é para ser administrado após angioplastia.

23. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 22, em que a referida angioplastia é a angioplastia coronária.

24. Antagonista de ανβ3, como reivindicado na reivindicação 1 ou reivindicação 6, em que o referido antagonista é para ser administrado a um doente em risco de restenose após angioplastia. Lisboa, 23 de Julho de 2010 4 1/46 Αηϋ·β3

Pele Normal FIG. 1A

Tecido de Granulação FIG. 1B Pele Normal FIG. 1C Tecido de Granulação FIG. 1D 2/46 Pele Normal Anti-vWF Anti-vWF

FIG. 2B 3/46

FIG. 2C

FIG. 2D 4/46

Cancro da Bexiga FIG. 3A

Cancro do CólonFIG. 3B 5/46

Cancro da Mama FIG. 3C

Cancro do PulmãoFIG. 3D 6/46 Controlo 6/46

FIG. 4 7/46 FIG. 5A Anti-βι Não Tratado

Anti-avp3 Não Tratado

FIG. 5B

imensidade mia de fukrescência

8 / 4 6 9/46 Controlo bFGF

FIG. 7B TNFcx

FIG. 7A FIG. 7C 10/46 10/46 FIG. 8A Controlo bFGF

FIG. 8B FIG. 8C Αηίΐ-β1 FIG. 8D ΑηΙΙ-ανβ5 FIG. 8E Anti-oc^3 11/46 FIG. 9C FIG. 9A FIG. 9B

Péptido de Controlo Tumoral RGD Cíclico Tumoral RGD Cíclico CAM Adjacente 12/46 FIG. 10B Anti-aVPs (P3G2) Fia 10c Anti-aVP3 (LM609) FIG. 10A Controlo

13/46 13/46 /

*

/

FIG. 11A Anti-βΐ FIG. 11B Αηίί-ανβ5 FIG. 11C Anti-avp3 nómero de vasos entrrndo no tumor N

T 15/46 PESO DE TCMDR (ma) PESO DE

P.B.S CSAT LM609 FIG. 13A 150

P.B.S CSAT LM609 150 T 125- I 100 jjj 75 § 50 8 25- ω Oj 0·· ?00 175. 150- s 125- 100- E3 75 a 50 s 25-

P.B.S CSAT LM609 FIG. 13B

P.B.S CSAT LM609 FIG. 13C FIG. 13D 16/46 FIG. 14A

Anti-aVp5 (P3G2)FIG. 14B

Anti-aVp3 (LM609) 17/46 FIQ. 15A FIG. 15B FIG. 15C

Péptido de Controlo Tumoral RGD Cíclico Tumoral RGD Cíclico CAM Adjacente

FIG. 15D FIG. 15E Péptido RGD Cíclico Péptido de Controlo 18/46 18/46 LM609 (Anti-avP3)

P1F6 (Anti-avp5) FIG. 16A FIG. 16C

FIG. 16D

FIG. 16B FIG. 16E 19/46 Transplantar Pele Humana Injecção de Célula Tumoral Humana

Crescimento Tumoral de 4 Semanas

20/46 % DE APOPTOSE

FIG. 18 21/46 21/46 CSAT (Anti-βΐ) Apoptose

Teor de ADN o) to o * cu tf

0 200 400 600 800 1000 Teor de ADN LM609 (Anti-aVp3) 104 103 102 101 10° FIG. 19 22/46

FIG. 20A

FIG. 20B

FIG. 20C 23/46

FIG. 20D

FIG. 20E

FIG. 20F CONJUGAÇÃO CELULAR (OD ® 600nm)

5 ETAPAS J Γ Η 2Ν^ ο

FIG. 41 44/46

COMPOSTO 15 ^COOH nh2

λ /

COMPOSTO 16

COOH NH-SO 2 NH =\ r^° ,M\ /h*

COMPOSTO 18 HG. 42 PONTOS DE RAMIFICAÇAO 45/46

bFGF 96112 96113 96229 99799 112854- COMPOSTOS ORGÂNICOS MERCK (250 pg/mL) FIG. 43 46/46 80 η 70 - PONTOS DE RAMIFICAÇAO 60 50 40 30 20 10 0

bFGF 81218

87292 87293 -COMPOSTOS MERCK (100 pg/EMBRIÃO)-

FIG.