SK163298A3 - Methods and compositions useful for inhibition of 'alpha'v'beta'5 mediated angiogenesis - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa vo všeobecnosti týka oblasti medicíny a špecificky sa týka spôsobov inhibície a_vps-sprostredkovanej angiogenézy a kompozitov vhodných na inhibíciu a_vp₅-sprostredkovanej angiogenézy tkanív s použitím antagonistov vitronektínového receptora α_νβ₅.

Doterajší stav techniky

Integríny sú triedou bunkových receptorov, ktoré sú známe tým, že viažu proteíny extracelulárneho matrixu, a teda sprostredkujú interakcie bunka-bunka a bunka-extracelulárny matrix, ktoré sa vo všeobecnosti označujú ako adhézne javy. Avšak napriek tomu, že mnohé integríny a ich príslušné ligandy sa v literatúre už opísali, biologická funkcia mnohých integrínov zostáva nejasná. Integrínové receptory tvoria skupinu (rodinu) proteínov, ktoré sa vyznačujú podobnými štrukturálnymi vlastnosťami a predstavujú nekovalentné heterodimérne glykoproteínové komplexy tvorené a a β podjednotkami.

Vitronektínový receptor, ktorý dostal názov podľa svojej pôvodnej vlastnosti prednostne viazať vitronektín, teraz označuje tri rôzne integríny, označené ako α_νβι, α_νβ3 a α_νβδ· Horton, Int. J. Exp. Pathol., 71:741-759 (1990). α_νβι viaže fibronektín a vitronektín. α_νβ₃ viaže veľmi rôznorodé ligandy, vrátane fibrínu, fibrinogénu, laminínu, trombospondínu, vitronektínu, von Willebrandovho faktoru, osteospontínu a kostného sialoproteínu I. α_νβ₅ viaže vitronektín. Špecifické úlohy, ktoré tieto tri integríny majú pri adhézii buniek v mnohých bunkových interakciách v tkanivách, sa stále skúmajú. Avšak je zrejmé, že existujú odlišné integríny s odlišnými biologickými funkciami, ako i odlišné integríny a podjednotky s podobnými biologickými špecifičnosťami.

31116/H

Pre mnohé integríny je dôležitým rozpoznávacím miestom tripeptidová sekvencia arginín-glycín-kyselina asparágová (RGD), ktorá sa nachádza na ligande. RGD sa našla vo všetkých vyššie spomenutých ligandoch vitronektínových receptorových integrínov. Toto RGD rozpoznávacie miesto sa môže napodobniť polypeptidmi („peptidmi,,), ktoré obsahujú RGD sekvenciu, a takéto RGD peptidy sú známymi inhibítormi funkcie integrínov. Je však dôležité poznamenať, že sekvencia a štruktúra RGD peptidu sa môže meniť tak, aby sa zmenila špecifičnosť inhibície a ovplyvňovali sa špecifické integríny.

Práce o RGD rozpoznávacom mieste zahŕňajú napríklad Pierschbacher a kol., Náture, 309:30-33 (1984) a Pierschbacher a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:5985-5988 (1984). Rôzne RGD polypeptidy s rôznou integrínovou špecifitou taktiež opísali Grant a kol., Celí, 58:933-943 (1989), Cheresh, a kol., Celí, 58:945-953 (1989), Aumailley a kol., FEBS Letts., 291:50-54 (1991) a Pfaff a kol., J. Biol. Chem., 269:20233-20238 (1994) a v USA patentoch číslo 4517 686, 4 578 079, 4 589 881, 4 614 517, 4 661 111, 4 792 525, 4 683 291, 4 879 237, 4 988 621, 5 041 380 a 5 061 693.

Angiogenéza, nazývaná taktiež neovaskularizácia, je proces vaskularizácie tkaniva, ktorý zahrňuje rast novo vyvinutých krvných ciev dovnútra tkaniva. Tento proces je sprostredkovaný infiltráciou endoteliálnych buniek a buniek hladkého svalstva. Predpokladá sa, že tento proces postupuje ľubovoľnou z nasledujúcich troch ciest:

1) Cievy môžu vyklíčiť z už existujúcich ciev;

2) Vývin ciev de novo sa môže začať z prekurzorových buniek (vaskulogenéza); alebo

3) Existujúce malé cievy môžu zväčšiť svoj priemer. Blood a kol., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990).

Je známe, že vaskulárne endoteliálne bunky obsahujú aspoň päť RGDzávislých integrínov, vrátane vitronektínového receptora (α_νβ₃ alebo a_vps), receptorov pre kolagén Typ I a IV (αφι), laminínového receptora (α₂βι), fibronektín/laminín/kolagénového receptora (α₃βι) a fibronektínového receptora

31116/H (<χ₅βι)- Davis a kol., J. Celí. Biochem., 51:206-218 (1993). Je známe, že bunky hladkého svalstva obsahujú aspoň šesť RGD-závislých integrínov, vrátane αδβι, α_νβδ a α_νβ5·

Angiogenéza je dôležitým procesom neonatálneho rastu, ale je dôležitá taktiež pri hojení rán a vpatogenéze širokého spektra klinicky dôležitých ochorení, vrátane zápalu tkaniva, artritídy, psoriázy, rakoviny, diabetickej retinopatie, degenerácie žltej škvrny a iných neovaskuiárnych ochorení oka. Tieto klinické zmeny spojené s angiogenézou sa označujú ako angiogénne ochorenia. Folkman a kol., Science, 235:442-447 (1987). Angiogenéza sa zvyčajne nevyskytuje v dospelých alebo zrelých tkanivách, hoci sa vyskytuje pri hojení rán a pri rastovom cykle žltého telieska. Viď napríklad Moses a kol., Science, 248:1408-1410 (1990).

Účasť vitronektínového receptora α_νβδ v adhézii rôznych typov buniek, vrátane mikrovaskulárnych endoteliálnych buniek sa preukázala in vitro inhibíciou bunkovej adhézie monoklonálnymi protilátkami imunošpecifickými pre rôzne integrínové a a β podjednotky. Davis a kol., J. Celí. Biochem., 51:206-218 (1993). Navyše, Nicosia a kol., Am. J. Pathol., 138:829-833 (1991) opísali, že použitie RGD peptidu GRGDS inhibuje in vitro tvorbu „mikrociev,, z potkanej aorty kultivovanej v kolagénovom géli.

Avšak inhibícia tvorby „mikrociev,, in vitro v kolagénových gólových kultúrach nie je modelom na inhibíciu angiogenézy v tkanive, pretože sa nedokázalo, že štruktúry mikrociev sú zhodné s kapilárnymi výhonkami. Podobne tvorba mikrociev v kolagénovej gólovej kultúre nie je zhodná s neovaskulárnym rastom dovnútra intaktného tkaniva, akým je artritické tkanivo, nádorové tkanivo alebo choré tkanivo, kde je inhibícia angiogenézy žiaduca.

V poslednej dobe sa potvrdila úloha α_νβδ v angiogenéze. Viď Brooks a kol., Science, 264:569-571 (1994). Ukázalo sa, že integrín sa exprimuje v krvných cievach v ľudskom poranenom granulačnom tkanive, avšak nie v normálnej pokožke. Monoklonálne protilátky proti α_νβδ receptora inhibovali angiogenézu indukovanú rastovými faktormi (cytokínmi), a to fibroblastovým

31116/H rastovým faktorom (bFGF) a faktorom nekrotizujúcim tumory-α (TNF-a), ako i melanómovými fragmentmi. Avšak antagonisty inhibovali iba nové, a nie už predtým existujúce cievy. Navyše sa ukázalo, že špecifické lineárne a cyklické peptidy obsahujúce RGD inhibovali neovaskularizáciu.

Navrhlo sa, že inhibícia angiogenézy by bola vhodnou terapiou na obmedzenie rastu nádorov. Inhibícia angiogenézy sa navrhla 1) inhibíciou uvoľňovania „angiogénnych molekúl,, ako je bFGF (fibroblastový rastový faktor), (2) neutralizáciou angiogénnych molekúl, napríklad použitím anti-bFGF protilátok a (3) inhibíciou odpovede endoteliálnych buniek na angiogénne stimuly. Práve naposledy menovaná stratégia sa stretla so značným ohlasom, pričom Folkman a kol., Cancer Biology, 3:89-96 (1992) opísali niekoľko inhibítorov endoteliálnej bunkovej odpovede, vrátane kolagenázového inhibítora, inhibítorov obnovy bazálnej membrány, angiostatických steroidov, inhibítorov angiogenézy získaných z húb, doštičkového faktoru 4, trombospondínu, liekov proti artritíde ako je D-penicilamín a tiomalát zlata, analógov vitamínu D3, alfa interferónu a podobných inhibítorov, ktoré by sa mohli použiť na inhibíciu angiogenézy. Ďalšie navrhované inhibítory angiogenézy sa opísali v prácach Blood a kol., Biochim. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990), Moses a kol., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber a kol., Lab. Invest., 59:44-51 (1988) a USA patenty číslo 5 092 885, 5 112 946, 5 192 744 a 5 202 352.

Avšak kým sa nepredložil tento vynález, úloha integrínu α_νβ₅ v angiogenéze sa v predbežných literárnych odkazoch nenavrhla ani nezistila, a ani sa neopísali žiadne inhibítory angiogenézy zamerané na inhibíciu α_νβδ. Navyše v žiadnych literárnych odkazoch, okrem predkladaného vynálezu, sa neopisuje účasť integrínu v neovaskularizácii, a to najmä v neovaskularizácii indukovanej rastovými faktormi, ako je rastový faktor vaskulárnych endotélií (VEGF), transformujúci rastový faktor-α (TGF-a) a epidermálny rastový faktor (EGF).

Hoci je počet rastových faktorov zúčastňujúcich sa kontroly angiogenézy obmedzený, existujú rozličné úrovne kontroly procesu konverzie pokojového

31116/H stavu na neovaskulárny stav. Viď D’Amore, Investigative Ophtal. Visual. Sci., 35:3974-3979 (1994). Kým niektoré rastové faktory zúčastňujúce sa angiogenézy sú regulované na úrovni syntézy, iné sú regulované stavom ich aktivácie. K týmto bunkovým dejom dochádza vtedy, keď pokojová cieva podlieha neovaskularizácii následkom poranenia alebo ischémie.

Predpokladá sa, že hlavným mediátorom angiogenézy v primárnych nádorových a ischemických očných ochoreniach je najmä VEGF. Prehľadnú prácu publikoval Folkman, Náture Medicíne, 1:27-31 (1995). VEGF je homodimér s veľkosťou 46 kilodaltonov (kDa), ktorý je angiogénnym (Ferrara a koi., Endocrin. Rev., 13:18-32 (1992)) a vazopermeabilným faktorom (Senger a koi., Cancer Res., 46:5629-5632 (1986)), ktorý je špecifický pre endoteliálne bunky, a ktorý sa viaže na vysokoafinitné membránové receptory s tyrozínkinázovou aktivitou (Jakeman a koi., J. Clin. Invest., 89:244-253 (1992)).

V poslednej dobe sa ukázalo, že aktivácia receptorových proteinkináz podporuje od integrínu závislú bunkovú migráciu na proteínoch extracelulámeho matrixu. Najmä Klemke a koi., J. Celí Biol., 127:859-866 (1994) preukázali účasť tyrozínkinázy EGF receptora (EGFR) pri podpore bunkovej motility, nie však adhézie ľudských pankreatických karcinómových FG buniek na vitronektín prostredníctvom <χ_νβ5 integrínu. Autori poskytli priame dôkazy o tom, že naviazanie EGF ligandu na EGFR aktivuje tyrozínkinázovú aktivitu EGFR, ktorá v konečnom dôsledku stimuluje od proteínkinázy C (PKC) závislú cestu vedúcu k indukcii bunkovej migrácie na vitronektínovom substráte, ktorá je závislá od α_νβ5. Za normálnych okolností nie sú tieto bunky schopné migrovať na tomto substráte. Takže zistenia, ktoré publikoval Klemke a koi. poskytujú dôkazy korelácie medzi prítomnosťou cytokínov, konkrétne EGF a integrínovou aktivitou pri bunkovej migrácii. Ukázalo sa, že aktivácia PKC je súčasťou regulácie angiogenézy v modelovom systéme kuracej chorioalantoickej membrány. Viď Tsopanoglou a koi., J. Vasc. Res., 30:202-208 (1993). Autori zistili špecifické aktivátory a inhibítory PKC, ktoré v prvom

31116/H prípade stimulujú a v druhom prípade inhibujú angiogenézu v tomto modelovom systéme.

Avšak ani Klemke a kol. ani Tsopanoglou a kol., ktorých výsledky sa uvádzajú vyššie, neopísali úlohu cytokínov a expresiu a/alebo aktiváciu α_νβδ integrínu v rozvoji angiogenézy za rôznych podmienok a chorobných stavov a jej inhibíciu a_vp₅-špecifickými antagonistami.

Najnovšie experimentálne dôkazy získané na opičom modeli očnej choroby ukázali, že retinálna ischémia indukovaná oklúziou retinálnej vény spôsobila rýchle zvýšenie koncentrácie VEGF v komorách oka. Toto zvýšenie sa časovo prekrývalo s pozorovanou neovaskularizáciou dúhovky tak, ako to opísali Miller a kol., Am. J. Path., 145:574-584 (1994). Ďalšie údaje sa získali na modelovom systéme proliferatívnej retinopatie, pričom sa indukovala hypoxia. Ukázalo sa, že hladina mediátorovej RNA pre VEGF sa pri relatívnej hypoxii zvyšuje v období 6-12 hodín, a zostala zvýšená až pokiaľ sa nevyvinula neovaskularizácia. Pri znižovaní tvorby nových krvných ciev dochádza k poklesu expresie VEGF tak, ako to opísali Pierce a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:905-909 (1995).

Takže súčasné údaje, tak ako sa dokumentovali na živočíšnych modeloch ischémie, poukázali na koreláciu medzi indukciou VEGF s indukciou ischémie, po ktorej nasleduje neovaskularizácia. Preukázala sa účasť VEGF, ako i ostatných rastových faktorov, aj pri iných stavoch a chorobných štádiách, ktoré zahrňujú neovaskularizáciu tak, ako to prehľadne opísal Folkman, Náture Medicíne, 1:27-31 (1995).

Folkman a kol. v tu citovanej práci sumarizujú taktiež súčasné klinické prístupy používané na kontrolu nežiaducej angiogenézy. V klinických štúdiách dostávali pacienti terapiu inhibítormi angiogenézy, vrátane doštičkového faktoru 4, derivátu fumagilinu, karboxyaminotriazolu a podobne. Avšak žiadne citácie alebo súčasné terapeutické literárne odkazy nedávali do vzájomného vzťahu expresiu α_νβ₅ a angiogenézu, a to najmä angiogenézu indukovanú VEGF. Takže v období pred predkladaným vynálezom nikto neopísal, ani nepoužil

31116/H terapeutický režim s antagonistami α_νβδ na kontrolu angiogenézy v tkanivách, v ktorých dochádza k angiogenéze v korelácii s prítomnosťou a aktiváciou α_νβ₅.

Preto okrem tu uvedených štúdií o α_νβ3, ako i štúdií vzťahu rastových faktorov k angiogenéze, nie sú si aplikanti vedomí žiadnych iných dôkazov, že angiogenéza by mohla byť inhibovaná v tkanivách s použitím inhibítorov bunkovej adhézie sprostredkovanej α_νβ5· Obzvlášť sa nikdy nedokázalo, že funkcia α_νβδ je nutná na angiogenézu v tkanive, a že α_νβδ antagonisty môžu inhibovať angiogenézu v tkanive, najmä pri očnej neovaskulárnej chorobe.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález dokazuje, že v tkanivách existuje okrem, dráhy, ktorá si vyžaduje α_νβ3, taktiež osobitná nová dráha angiogenézy závislá od α_νβ5. Takže vynález opisuje inhibítory α_νβδ, ktoré môžu inhibovať angiogenézu. Tento vynález ďalej opisuje, že aktivita sprostredkovaná α_νβδ, ktorá napomáha rozvoju angiogenézy koreluje s rastovým faktorom (cytokínom) aktivovanými tyrozínkinázami receptora rastového faktoru a proteínkinázou C (PKC). Medzi rastové faktory (cytokíny), ktoré fungujú týmto spôsobom patrí rastový faktor vaskulárnych endotélií (VEGF), transformujúci rastový faktor-α (TGF-a), epidermálny rastový faktor (EGF) a podobné rastové faktory.

Vynález preto opisuje také spôsoby inhibície angiogenézy v tkanive, ktoré zahrňujú podanie kompozitu do tohto tkaniva, pričom tento kompozit obsahuje angiogenézu inhibujúce množstvo α_νβδ antagonistu.

Tkanivo, ktoré sa má liečiť, je ktorékoľvek tkanivo, v ktorom je potrebná inhibícia angiogenézy, ako je chorobou postihnuté tkanivo, v ktorom sa vyskytuje neovaskularizácia. Typickým príkladom takéhoto tkaniva je očné tkanivo, v ktorom dochádza k neovaskularizácii, zapálené tkanivo, solídne nádory, metastázy, tkanivá podliehajúce restenóze a podobné tkanivá. V uprednostnených častiach je neovaskularizácia spojená s expresiou α_νβδ výsledkom pôsobenia rastových faktorov, VEGF, TGF-α a EGF.

31116/H

Obzvlášť uprednostnenými sú terapeutické spôsoby smerujúce k inhibícii vaskularizácie indukovanej VEGF v tkanivách ako je oko, kde sa angiogenéza prejavuje ochoreniami, vrátane diabetickej retinopatie (taktiež nazývanej proliferatívna diabetická retinopatia), s vekom súvisiacej degenerácie žltej škvrny, predpokladanej očnej histoplazmózy, retinopatie nedonosencov, retinopatie pri kosáčikovitej anémii a neovaskulárneho glaukómu. V ďalších uprednostnených častiach sú terapeutické spôsoby nasmerované k inhibícii angiogenézy, ktorá sa vyskytuje pri neovaskulárnych poruchách rohovky, ktoré zahrňujú transplantáciu rohovky, herpetickú keratitídu, luetickú keratitídu, pterygium, neovaskulárne zápalové zmeny v súvislosti s nosením kontaktných šošoviek (pannus) a podobne.

Antagonista a_vp5, ktorý je vhodný na použitie v predkladaných spôsoboch, je schopný viazať sa na α_νβδ a kompetitívne inhibovať schopnosť α_νβδ viazať prirodzený vitronektínový ligand. Antagonista prednostne vykazuje špecifitu pre α_νβ₅ v porovnaní s ostatnými integrínmi. V obzvlášť uprednostnenej časti antagonista α_νβ₅ inhibuje väzbu vitronektínu, alebo iných ligandov obsahujúcich RGD, na α_νβδ, ale v podstate neinhibuje väzbu vitronektínu na α_νβ₃ alebo αι^β₃. Uprednostneným antagonistom α_νβ₅ môže byť fúzny polypeptid, lineárny alebo cyklický polypeptid, derivatizovaný polypeptid, monoklonálna protilátka alebo jej funkčný fragment, alebo organická molekula, ktorá napodobňuje α_νβδ ligand, ktorá sa taktiež označuje ako organická mimetická látka, pričom všetky špecificky interagujú s α_νβ5·

Podanie α_νβ₅ antagonistov podľa tohto vynálezu zahrňuje vnútroočné, intravenózne, transdermálne, intrasynoviálne, intramuskulárne a perorálne podanie. V iných uprednostnených častiach je podanie zosúladené s chemoterapeutickým režimom kvôli kontrole tumorogenézy a karcinómových metastáz.

Prehľad obrázkov na výkresoch

V kresbách tvoriacich časť tohto podania:

31116/H

Obrázky 1A-1D zobrazujú inhibíciu cytokínom indukovanej králičej korneálnej angiogenézy pomocou antagonistov na báze protilátok proti a_v integrínu. V príklade 4 sa opisuje indukcia angiogenézy pôsobením bFGF alebo VEGF a výsledky liečby angiogenézy antagonistami na báze protilátok proti integrínu a_v, P1F6 (α_νβ₅) a LM609 (α_νβ₃). OD je pravé a OS ľavé oko experimentálneho králika. Veľké šípky naznačujú korneálnu angiogenézu s edémom, kým malé šípky poukazujú na normálne spojovkové cievy. Obrázky 1A a 1B zobrazujú indukciu angiogenézy s bFGF, kým obrázky 1C a 1D zobrazujú indukciu angiogenézy s VEGF. Obrázky 1A a 1C zobrazujú liečbu králičej rohovky s P1F6, kým obrázky 1B a 1D zobrazujú liečbu s LM609.

Obrázky 2A a 2B sú stĺpcové grafy ukazujúce priemernú neovaskulárnu plochu v mm² +/- štandardná chyba (n=8 pre každú z dvoch sérií) po indukcii s bFGF v prvom prípade, alebo s VEGF v druhom prípade, s následnou liečbou monoklonálnou protilátkou P1F6 alebo LM609. Diskusia k výsledkom sa nachádza v príklade 4.

Obrázky 3A-3F fotograficky dokumentujú výsledky liečby antiintegrínovými protilátkami na preparáte kuracej CAM. Výsledky sú opísané v príklade 6A. Angiogenéza sa indukovala buď bFGF alebo VEGF s následným intravenóznym podaním fosforečnanového pufru (PBS) ako kontroly, alebo sa podali monoklonálne protilátky, P1F6 alebo ĽM609, opísané v legende k obrázku 1. CAM, na ktoré sa pôsobilo s bFGF sú zobrazené na obrázkoch 3A, 3C a 3E, kým CAMs na ktoré sa pôsobilo s VEGF sú zobrazené na obrázkoch 3B, 3D a 3F. Kontrolné CAMs, ktorým sa intravenózne podával PBS sú zobrazené na obrázkoch 3A a 3B. Protilátka P1F6 sa použila na liečbu CAMs, ktoré sú zobrazené na obrázkoch 3C a 3D, kým protilátka LM609 sa použila na liečbu CAMs, ktoré sú na obrázkoch 3E a 3F.

Obrázky 4A a 4B poskytujú zobrazenie kvantitatívnych výsledkov zobrazených na obrázkoch 3A-3F vo forme stĺpcového grafu. Index angiogenézy je nanesený na osi Y oproti kontrole alebo pôsobeniam protilátok. Obrázok 4A zobrazuje angiogenézu indukovanú bFGF a obrázok 4B

31116/H angiogenézu indukovanú VEGF. Diskusia k výsledkom sa nachádza v príklade 4.

Obrázky 5A-5F fotograficky dokumentujú výsledky liečby syntetickými peptidmi na preparáte kuracej CAM, tak ako sa opísalo v príklade 6. Angiogenéza sa indukovala buď bFGF, alebo VEGF, s následným intravenóznym podaním fosforečnanového pufru (PBS) ako kontroly, alebo podaním syntetického cyklického peptidu RGDfV (Sekvencia č. 4) alebo RADfV (Sekvencia č. 5). CAM, na ktoré sa pôsobilo s bFGF, sú zobrazené na obrázkoch 5A, 5C a 5E, kým CAM, na ktoré sa pôsobilo s VEGF, sú zobrazené na obrázkoch 5B, 5D a 5F. Kontrolné CAMs, ktorým sa intravenózne podalo PBS, sú zobrazené na obrázkoch 5A a 5B. Peptid RGDfV sa použil na liečbu CAMs, ktoré sú zobrazené na obrázkoch 5C a 5D, kým RADfV peptid sa použil na liečbu CAMs, ktoré sú na obrázkoch 5E a 5F.

Obrázky 6A a 6B zobrazujú vo forme stĺpcového grafu kvantitatívne výsledky zdokumentované na obrázkoch 5A-5F. Index angiogenézy je nanesený na osi Y oproti kontrole alebo pôsobeniam cyklických peptidov. Obrázok 6A zobrazuje angiogenézu indukovanú bFGF a obrázok 6B angiogenézu indukovanú VEGF. Diskusia k výsledkom sa nachádza v príklade 6.

Obrázky 7A-7E zobrazujú vplyvy antiintegrínových monoklonálnych protilátok a kalfostínu C na angiogenézu CAM indukovanú jednotlivými cytokínmi, bFGF, TNF-α, VEGF a TGF-α. Vyhodnocovalo sa taktiež PMA. Stanovenia a výsledky sú opísané v príklade 6. Výsledky sa zobrazili vo forme stĺpcových grafov, kde sa index angiogenézy naniesol na os Y a kontrola alebo inhibítory sú zobrazené na osi X. Obrázky 7A-7E postupne zobrazujú angiogenézu indukovanú bFGF, TNF-α, VEGF, TGF-a a PMA.

Obrázok 8 je stĺpcový graf zobrazujúci účinky liečby protilátkami na rast melanómového nádoru CS1, ktorý sa sledoval na CAM kuracieho embrya, pričom liečba sa vykonala tak, ako sa opísalo v príkladoch 5C a 6D. Hmotnosť nádorov v miligramoch (mg) sa naniesla na os Y oproti rôznym ovplyvneniam,

31116/H tak ako sú naznačené na osi X. CSAT je kontrolná protilátka špecifická pre βι podjednotku integrinu. LM609 a P1F6 sa opísali už predtým.

Obrázok 9 je stĺpcový graf zobrazujúci vplyvy kontroly v porovnaní s vplyvmi peptidového antagonistu α_νβ5, ktorý sa označil ako peptid 189 (Sekvencia č. 9), na rast melanómového nádoru, ktorý sa meral objemom nádoru v mm³ a zobrazil sa na osi Y. Stanovenia a výsledky sú opísané v príklade 8.

Obrázok 10 zobrazuje syntézu zlúčeniny 7 tak, ako sa opísalo v príklade 10A-G.

Obrázok 11 zobrazuje syntézu zlúčeniny 9 tak, ako sa opísalo v príklade 10A-C; H-l.

Obrázok 12 zobrazuje syntézu zlúčeniny 10 tak, ako sa opísalo v príklade 10 J.

Obrázok 13 zobrazuje syntézu zlúčeniny 12 a zlúčeniny 14 tak, ako sa opísalo v príklade 10 K-L a 10 M-N.

Obrázok 14 zobrazuje chemickú štruktúru zlúčeniny 15, zlúčeniny 16, zlúčeniny 17 a zlúčeniny 18. Podrobná syntéza spomínaných zlúčenín sa opisuje v príklade 10 O-R.

Obrázky 15A a 15B znázorňujú následné sekvencie cDNA kuracieho MMP-2 spolu s odvodenou aminokyselinovou sekvenciou zobrazenou v druhom riadku. Tretí riadok zobrazuje odvodenú aminokyselinovú sekvenciu ľudského MMP-2 a štvrtý riadok sekvenciu myšieho MMP-2 tak, ako sa opísalo v príklade 7. Kuracia cDNA sekvencia je v zozname ako sekvencia č. 23 spolu s kódovanou aminokyselinovou sekvenciou, ktorá je tak isto uvedená samostatne ako sekvencia Č. 24. Číslovanie prvého nukleotidu 5’ neprepisovanej oblasti a oblasti kódujúcej proenzým, zobrazené na obrázku 15A, v podobe záporného čísla, je v skutočnosti prezentované v Zozname sekvencií ako číslo 1, čo spôsobuje, že naposledy menovaná sekvencia sa javí byť dlhšou ako je na obrázku; avšak nukleotidová sekvencia na obrázku má rovnakú dĺžku a sekvenciu v porovnaní s nukleotidovou sekvenciou, ktorá je

31116/H uvedená v zozname, s výnimkou číslovania. Podobné odkazy na pozíciu nukleotidov kuracieho alebo ľudského MMP-2 v presnom opise, akým je opis primérov používaných pri amplifikácii MMP-2 fragmentov, sú založené na polohe nukleotidov tak, ako je označená na obrázku a nie tak, ako je uvedená v Zozname sekvencií.

Obrázok 16 zobrazuje sekvenciu aminokyselinových zvyškov zrelého ľudského MMP-2 proteínu s 631 zvyškami. Pozície aminokyselinových zvyškov fragmentov odvodených z ľudského MMP-2 zodpovedajú pozíciám na obrázku. Sekvencia aminokyselinových zvyškov je v zozname uvedená ako sekvencia č. 25.

Obrázok 17 znázorňuje vplyvy peptidov 85189 a jej vnútornej soli 121974 na angiogenézu indukovanú VEGF v CAM modeli tak, ako sa ďalej opisuje v príklade 6A. Vplyv sa porovnáva s neliečenými preparátmi (označenými ako NT) a preparátmi pod vplyvom kontrolného peptidu (označeného ako 69601). Vplyv na angiogenézu sa meral výpočtom počtu miest vetvenia tak, ako sa ďalej opisuje v príklade 6A.

Obrázky 18, 19, a 20 postupne zobrazujú redukciu hmotnosti nádoru UCLAP-3, M21-L a nádoru FgM následne po intravenóznom pôsobení kontrolného peptidu 69601 a antagonistu 85189 tak, ako sa ďalej opisuje v príklade 6D. Údaje o hmotnosti nádorov sú nanesené na os Y a ovplyvnenia jednotlivými peptidmi sú na osi X.

Obrázok 21 znázorňuje vplyv peptidov a protilátky na rast nádoru melanómu vchimerickom myšom: ľudskom modeli tak, ako sa ďalej opisuje v príklade 8. Medzi sledované peptidy patrí kontrolný peptid 69601 (označený ako 601) a antagonista 85189 (označený ako 189). Testovanou protilátkou bola protilátka LM609. Objem nádoru v mm³ sa nanášal na os Y, na osi X sa nachádzajú rôzne typy ovplyvnení.

Obrázky 22A a 22B zobrazujú vplyv antagonistu 85189 (označený ako 189) v porovnaní s kontrolným peptidom 69601 (označený ako 601) na

31116/H redukciu objemu a čerstvej hmotnosti M21L nádorov pri dávkovacom rozpätí 10, 50 a 250 pg/ínjekciu tak, ako sa ďalej opisuje v príklade 8.

Obrázky 23A a 23B zobrazujú účinnosť peptidového antagonistu 85189 (označený ako 189 špinou čiarou a plnými krúžkami) oproti kontrolnému peptidu 69601 (označený ako 601 s bodkovanou čiarou a prázdnymi štvorčekmi) pri inhibícii objemu nádoru M21L na myšom: ľudskom modeli s dvoma odlišnými režimami pôsobenia tak, ako sa ďalej opisuje v príklade 8. Objem nádoru v mm³ sa nanášal na os Y oproti dňom na osi X.

A) Definície

Aminokyselinový zvyšok·, aminokyselina vytvorená po chemickom štiepení (hydrolýze) polypeptidu v miestach jeho peptidových väzieb. Tu opísané aminokyselinové zvyšky sú prednostne v „L„ izomérnej forme. Avšak zvyšky v „D„ izomérnej forme môžu nahradiť ktorékoľvek L-aminokyselinové zvyšky, pokiaľ si polypeptid udržuje žiadanú funkčnú vlastnosť. NH₂ označuje voľnú aminoskupinu prítomnú na amino- konci polypeptidu. COOH označuje voľnú karboxylovú skupinu prítomnú na karboxy- konci polypeptidu. Dodržiava sa štandardné názvoslovie polypeptidov (opísané v J. Biol. Chem., 243:35523559 (1969) a prijaté na 37 CFR §1.822(b)(2)), pričom skratky pre aminokyselinové zvyšky sú uvedené v nasledujúcej prevodovej tabuľke:

311I6/H

Prevodová tabuľka

SYMBOL

1-písmenový

Y G F M A S I

L

T

V P K H Q E Z W R D N B C X

AMINOKYSELINA

3-písmenový
Tyr	tyrozín
Gly	glycín
Phe	fenylalanín
Met	metionín
Ala	alanín
Ser	serín
lle	izoleucín
Leu	leucín
Thr	treonín
Val	valín
Pro	prolín
Lys	lyzín
His	histidín
Gin	glutamín
Glu	kyselina glutámová
Glx	Glu a/alebo Gin
Trp	tryptofán
Arg	arginín
Asp	kyselina asparágová
Asn	asparagín
Asx	Asn a/alebo Asp
Cys	cysteín
Xaa	neznáma alebo iná

Okrem toho majú nasledujúce skratky nižšie uvedené významy: BOC ŕerc-ôuŕy/oxykarbonyl DCCI dicyklohexylkarbodiimid DMF dimetylformamid

3I116/H

OMe metoxyHOBt 1-hydroxybenzotriazol

Je potrebné si všimnúť, že všetky sekvencie aminokyselinových zvyškov sa tu zobrazujú vzorcami, ktorých ľavá a pravá orientácia je v zaužívanom smere amino- konca ku karboxy- koncu. Ďalej by sa malo poznamenať, že pomlčka na začiatku alebo na konci sekvencie aminokyselinových zvyškov indikuje peptidovú väzbu s ďalšou sekvenciou tvorenou jedným alebo viacerými aminokyselinovými zvyškami.

Polypeptid: Lineárna séria aminokyselinových zvyškov, ktoré sú navzájom spojené peptidovou väzbou medzi alfa-amino- skupinou a karboxyskupinou nasledujúceho aminokyselinového zvyšku.

Peptid: Lineárna séria nie viac ako 50 aminokyselinových zvyškov, ktoré sú navzájom spojené tak, ako je tomu v polypeptide.

Cyklický peptid: Označuje zlúčeninu, ktorá má kruhovú štruktúru s heteroatómom, ktorá zahrňuje niekoľko amidových väzieb tak, ako je tomu v typickom peptide. Cyklický peptid môže byť lineárnym peptidom, ktorý bol cyklizovaný podľa orientácie hlava-päta, v ktorom N-koniec lineárneho peptidu vytvoril amidovú väzbu s koncovým karboxylátom lineárneho peptidu, alebo môže obsahovať kruhovú štruktúru, v ktorej je polymér homodetný alebo heterodetný a zahrňuje amidové väzby a/alebo iné väzby potrebné na uzavretie kruhu, ako sú disulfidové mostíky, tioesterové, tioamidové, guanidínové a podobné väzby.

Proteín: Lineárna séria viac ako 50 aminokyselinových zvyškov, ktoré sú navzájom spojené tak, ako je tomu v polypeptide.

Fúzny proteín: Označuje polypeptid obsahujúci aspoň dve odlišné polypeptidové domény spojené („fúzované,,) typickou peptidovou väzbou, pričom tieto dve domény zodpovedajú peptidom, ktoré sa v prírode nenachádzajú navzájom spojené.

31116/H

Syntetický peptid: Chemicky vytvorený reťazec aminokyselinových zvyškov viazaných spolu peptidovými väzbami, pričom tento reťazec neobsahuje prirodzene sa vyskytujúce proteíny a ich fragmenty.

B) Všeobecné ustanovenia

Predkladaný vynález sa vo všeobecnosti týka objavu, že angiogenéza je sprostredkovaná špecifickým vitronektínovým receptorom α_νβδ, a že inhibícia funkcie α_νβδ inhibuje angiogenézu. Tento objav je dôležitý z dôvodu úlohy, ktorú angiogenéza hrá v rôznych chorobných procesoch. Inhibíciou angiogenézy je možné ovplyvniť chorobu, zlepšiť symptómy a v niektorých prípadoch chorobu vyliečiť.

Inhibícia angiogenézy bude znižovať zhubné vplyvy choroby v prípade, že rast nových krvných ciev je príčinou, alebo prispieva k patológii, ktorá je s chorobou spojená. Príklady zahrňujú reumatickú artritídu, diabetickú retinopatiu, zápalové ochorenia, restenózu a podobne. Tam, kde je rast zhubného tkaniva podmienený rastom nových krvných ciev, bude inhibícia angiogenézy znižovať zásobovanie tkaniva krvou, a tým prispeje k redukcii množstva tkaniva závislého od krvného zásobovania. Príklady zahrňujú rast novej krvnej cievy ako odpoveď na ischémiu, spôsobujúcu angiogenézu indukovanú rastovým faktorom, ďalej rast nádorov, kde je neovaskularizácia priebežnou požiadavkou na to, aby mohol nádor rásť viac ako do hrúbky niekoľkých milimetrov, ako i na to, aby sa založili solídne nádorové metastázy.

Spôsoby predkladaného vynálezu sú účinné z časti preto, že terapia je vysoko selektívna pre angiogenézu, a nie pre ostatné biologické procesy. Ako je zdokumentované v príkladoch uskutočnenia vynálezu, iba rast nových ciev je sprevádzaný značným množstvom α_νβ₅, a preto tieto terapeutické postupy neovplyvňujú nežiaducim spôsobom zrelé cievy.

Zistenie, že inhibícia samotného α_νβδ bude účinne inhibovať angiogenézu, umožňuje vývoj terapeutických kompozitov s potenciálne vysokou špecifitou, a preto i s relatívne nízkou toxicitou. Hoci tento vynález zverejňuje

31116/H použitie reagentov na báze peptidov, ktoré majú schopnosť inhibovať jeden alebo viacero integrínov, je možné navrhnúť iné reagenty, ktoré selektívnejšie inhibujú α_νβδ· Preto isté reagenty na báze peptidov nemajú vedľajší účinok inhibície iných biologických procesov než tých, ktoré sú sprostredkované α_νβ₅.

Napríklad podľa znalostí uvedených v súčasnej literatúre, je možné pripraviť monoklonálne protilátky, ktoré sú vysoko selektívne pre imunologickú reakciu s α_νβδ a nie α_νβι, α_νβ3 alebo αι^β3, a ktoré sú podobne selektívne vzhľadom k inhibícii α_νβ5 funkcie. Navyše sa môžu navrhnúť peptidy obsahujúce RGD tak, aby boli selektívne pre inhibíciu α_νβ₅, ako sa tu ďalej opisuje.

Pred zisteniami uverejnenými v predkladanom vynáleze nebolo známe, že angiogenéza, ako i ktorýkoľvek z procesov, ktoré sú od angiogenézy závislé, by sa mohla inhibovať in vivo s reagentmi, ktoré sú antagonistami biologickej funkcie α_νβ₅.

C) Spôsoby inhibície angiogenézy

Vynález zakotvuje spôsob inhibície angiogenézy v tkanive, ako aj spôsob inhibície dejov v tkanive, ktoré od angiogenézy závisia. Vo všeobecnosti tento spôsob spočíva v podávaní kompozitu do tohto tkaniva, pričom tento kompozit obsahuje také množstvo α_νβδ antagonistu, ktoré inhibuje angiogenézu.

Cieľové tkanivo, ktoré sa použilo pri testovaní spôsobov tohto vynálezu sa definuje ako tkanivo obsahujúce α_νβδ, ktoré je typické stanoviteľným množstvom integrínového receptora α_νβ5. Inými slovami tkanivo obsahujúce α_νβ5 sa definuje prítomnosťou receptorového komplexu α_νβδ v bunkových membránach. Takéto tkanivo zahrňuje bunky epiteliálneho a mezenchymálneho pôvodu. Prítomnosť tohto receptora sa môže stanoviť mnohorakými spôsobmi, vrátane imunoreaktivity receptora s protilátkami proti integrínovému receptora α_νβδ, pričom sa imunoreakcia dokazovala v tkanivách pomocou mikroskopie, imunoprecipitácie, stanoveniami kompetitívneho

31116/H viazania ligandu a podobnými technikami. Uprednostnené protilátky vhodné na dôkaz prítomnosti α_νβδ v tkanive sú opísané neskôr v príklade 1. Napríklad, rozmiestnenie α_νβδ v obličke, pokožke a očnom tkanive pomocou imunofluorescenčnej mikroskopie sa opisuje v príklade 2.

V rámci spôsobov tohto vynálezu je tkanivo obsahujúce α_νβδ taktiež charakterizované ako tkanivo, ktoré má známky angiogenézy. Ako sa už skôr opísalo, angiogenéza zahrňuje rôzne procesy, ktoré sa zúčastňujú neovaskularizácie tkaniva, vrátane „klíčenia,,, vaskulogenézy, alebo zväčšovania cievy, pričom všetky tieto procesy angiogenézy sú sprostredkované a taktiež závisia od expresie α_νβ5. Predpokladá sa, že s výnimkou hojenia traumatických rán, tvorby žltého telieska a embryogenézy, je väčšina procesov angiogenézy spojená s chorobnými procesmi, a preto je použitie predkladaných terapeutických spôsobov selektívne pre ochorenie a nemá zhubné vedľajšie účinky.

Existujú rôzne ochorenia, pri ktorých sa predpokladá dôležitosť angiogenézy, a tie sa označujú ako angiogénne ochorenia. Medzi ne patria okrem iných taktiež zápalové poruchy, ako sú imunitné a neimunitné zápaly, chronický artikulárny reumatizmus a psoriáza, poruchy spojené s neprimeranou alebo nevhodnou inváziou ciev, ako je restenóza, kapilárna proliferácia v aterosklerotických plagoch a osteoporóza, a s rakovinou spojené poruchy, ako sú solídne nádory, solídne nádorové metastázy, angiofibrómy, retrolentálna fibroplázia, Kaposiho sarkóm a podobné zhubné nádory, ktoré si vyžadujú neovaskularizáciu, kvôli podpore rastu nádoru.

Očné choroby, pre ktoré je neovaskularizácia typická, predstavujú obzvlášť uprednostňovaný cieľ pre terapiu. Očná neovaskularizácia je najbežnejšou patologickou zmenou pozorovanou v podstatnej väčšine očných chorôb a jej výsledkom je katastrofálna strata videnia. Rast nových krvných ciev z dovtedy existujúcich choroidálnych, retinálnych alebo paralimbálnych ciev môže viesť k edému, hemoragii alebo tvorbe fibrovaskulárnej membrány, výsledkom čoho je rozrušenie normálnych anatomických vzťahov v oku so sprievodnou stratou normálnych funkcií videnia.

31116/H

Medzi očné choroby, pre ktoré je angiogenéza typická, patria korneálne neovaskulárne poruchy, ktoré zahrňujú transplantáciu rohovky, herpetickú keratitídu, luetickú keratitídu, pterygium, neovaskulárne zápalové zmeny v súvislosti s nosením kontaktných šošoviek (pannus) a podobne. Medzi ďalšie očné choroby patrí taktiež diabetická retinopatia (DR), s vekom súvisiaca degenerácia žltej škvrny (ARMD), predpokladaná očná histoplazmóza (POHS), retinopatia nedonosencov (ROP), neovaskulárny glaukóm a podobne. Zatiaľ čo inhibícia angiogenézy by pri týchto chorobách nemusela uzdraviť nižšie ležiace tkanivá, preukázalo sa však, že by redukovala s videním súvisiacu morbiditu spojenú s týmito chorobami.

Napríklad 90% z 300 000 osôb, ktoré majú diabetes dlhšie ako 25 rokov, budú mať nejakú formu DR, čo je retináina choroba charakterizovaná priesakom a/alebo proliferáciou krvných ciev. Tridsať percent z týchto pacientov bude mať v skutočnosti naposledy menovanú komplikáciu, ktorá sa môže zlepšiť pomocou terapeutických spôsobov, ktoré sú opísané v tomto vynáleze. V prípade ARDM, 25% populácie vo veku nad 65 rokov, približne 630 000 osôb, bude mať istú formu choroby s očakávaním, že do roku 2030 viac ako 6,3 milióna jednotlivcov bude mať ARDM. V dôsledku toho schopnosť inhibovať angiogenézu spojenú s α_νβδ pomocou terapeutických kompozitov a spôsobov tohto vynálezu má veľkú hodnotu pre medicínu.

Takže spôsoby, ktoré vedú k inhibícii angiogenézy v chorých tkanivách zlepšujú symptómy ochorenia, a v závislosti od ochorenia, môžu prispievať k jej liečbe. V jednej svojej časti vynález hodnotí inhibíciu samotnej angiogenézy v tkanive. Rozsah angiogenézy v tkanive, a preto i rozsah inhibície dosiahnutý predkladanými spôsobmi, sa môže vyhodnocovať rozličnými metódami, ako sú imunohistochemické spôsoby detekcie vznikajúcich alebo nezrelých α_νβδimunopozitívnych cievnych štruktúr, ktoré sa opisujú v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Ako sa tu opisuje, ktorékoľvek z mnohých tkanív alebo orgánov pozostávajúcich z organizovaných tkanív, vrátane pokožky, svalu, čreva, spojivového tkaniva, kĺbov, kostí a podobných tkanív, môže pri chorobných

31116/H stavoch podporovať angiogenézu, pri ktorej môže dochádzať ku vnikaniu krvných ciev do týchto tkanív na základe angiogénnych stimulov.

i

Konkrétne spôsoby a kompozity α_νβ₅ antagonistov tohto vynálezu sú obzvlášť terapeuticky užitočné pre inhibíciu angiogenézy, ktorá sa indukovala rastovými faktormi, ktoré sú taktiež nazývané cytokíny. Pri fyziologických stavoch je angiogenéza vysoko regulovaná, a ako predtým publikoval Brooks a kol., Science, 264:569-571 (1994), ukázalo sa, že je aktivovaná špecifickými angiogénnymi molekulami, ako je fibroblastový rastový faktor (bFGF). Opísala sa taktiež negatívna regulácia angiogenézy. Angiogenéza je teda regulovaná dômyselnou rovnováhou medzi lokálnymi stimulátormi a inhibítormi. Viď D’Amore, Investigative Ophtal. Visual. Sci., 35:3974-3979 (1994).

Keď sa poruší fyziologická rovnováha stimulátorov a inhibítorov angiogenézy, ktoré za normálnych okolností prísne kontrolujú pokojovú kapilárnu vaskulatúru, k čomu dochádza pri istých chorobných stavoch, potom v endoteliálnych bunkách kapilár dochádza k indukcii delenia, migrácii a v konečnom dôsledku k diferenciácii a tvorbe nových krvných ciev.

Angiogenéza sa opisuje ako kaskádovitý proces, ktorý pozostáva zo skorých dejov, po ktorých nasledujú deje neskoré tak, ako to prehľadne opísal Leibovich „Role of Cytokines in the Process of Tumor Angiogenesis,,, v „Human Cytokines: Their Role in Disease and Therapy,,, Editori Aggarwal a Puri, kapitola 35, Blackwell Science, Inc, (1995). Skorým dejom predchádza prísun angiogénnych rastových faktorov a cytokínov, ktoré pochádzajú z extravaskulárneho zdroja. Skoré deje potom pokračujú v cieľovej mikrovaskulatúre prerušením medzibunkových spojení, indukciou expresie aktivačných antigénov endoteliálnych buniek, ako i proteolytického fenotypu, a iniciáciou migrácie endoteliálnych buniek orientovaným spôsobom. Neskoré deje sú typické autokrinnou a parakrinnou expresiou génov pre rastový faktor a cytokíny v bunkách, endoteliálnych bunkách, pericytoch a bunkách hladkého svalstva vyvíjajúceho sa kapilárneho púčika. Tieto bunky na druhej strane zase modulujú interakcie buniek s extracelulárnym matrixom, výsledkom čoho je tvorba nových funkčných kapilárnych výbežkov z existujúcich zrelých ciev.

31116/H

Tu a taktiež v kapitole Doterajší stav techniky sa uvádza, že v literárnych odkazoch sa opisuje spojenie medzi objavovaním sa rastových faktorov, vrátane tých, ktoré sú spojené s nárastom expresie α_νβ5, menovite VEGF, TGFα a EGF a expanziou nádorovej masy, ako i začiatkom angiogenézy pri proliferatívnych neovaskulárnych očných ochoreniach ľudí, ako aj experimentálnych zvierat.

Takže VEGF, EGF, TGF-α sa spolu s mnohými inými považujú za rastové faktory, ktoré sú typické svojimi schopnosťami stimulácie bunkového rastu. Rastové faktory sú proteíny, ktoré sú sekretované jednou bunkou, ktorá pôsobí na sekretorickú bunku, alebo na ďalšiu bunku. Ich schopnosť fungovať závisí od prítomnosti receptorov rastových faktorov, ktoré sú obyčajne transmembránovými proteínmi. Rastové faktory, ako je VEGF, sa vo všeobecnosti taktiež označujú ako cytokíny, ktoré sú definované ako bunkou sekretované polypeptidové hormóny, ktoré ovplyvňujú rast a metabolizmus buď tej istej bunky (autokrinné), alebo inej bunky (parakrinné). Pojem cytokíny sa neobmedzuje na molekuly produkované bunkami imunitného systému a modifikátormi biologickej odpovede toho istého systému. Takže pojem cytokín je širokou kategóriou, ktorej jednou podkategóriou, založenou na type biologickej odpovede, sú stimulačné rastové faktory alebo zosilňovače, ako sú VEGF, bFGF, EGF, TGF-α a podobne. Prehľadnú prácu zverejnil Aggarwal a kol., „Common and uncommon features of cytokines and cytokine receptors: An overview,,, v „Human cytokines,, Their role in disease and therapy,,, Editori Aggarwal a Puri, kapitola 1, Blackwell Science, Inc. (1995).

V predkladanom vynáleze sa na inhibíciu angiogenézy v tkanive uvažuje o použití a^s-špecifických antagonistov a nie antagonistov rastových faktorov, ako sú protilátky proti VEGF. V uprednostnených častiach vynálezu sa opisujú α_νβδ antagonisty vhodní na inhibíciu angiogenézy indukovanej rastovými faktormi, pri ktorej sa indukuje expresia α_νβδ integrínového receptora. Uprednostnenými rastovými faktormi sú v tejto súvislosti VEGF, EGF, TGF-α a podobne.

31116/H

Ako sa opísalo v kapitole Doterajší stav techniky, je známe, že oba rastové faktory EGF, ako i VEGF sa viažu k svojim bunkovým receptorom, ktoré fungujú ako tyrozínkinázy. Ďalej sa ukázalo, že aktivácia EGF receptora korelovala s aktiváciou proteínkinázy C, výsledkom čoho bola aktivácia α_νβ5, ktorá umožnila migráciu špecifických buniek na vitronektínovom substráte. Takže mechanizmus účinku medzi pôsobením cytokínov alebo rastových faktorov a koordinovanou odpoveďou v podobe expresie alebo aktivácie integrínov je komplexným biologickým procesom. Ako je zdokumentované v predkladanom vynáleze (viď príklad 6A), výsledkom pôsobenia cytokínu VEGF na model králičích očí, alebo na slepačí chorioalantoický model, bola angiogenéza potenciovaná α_νβδ, ktorá je závislá na aktivácii proteínkinázy C.

V obzvlášť uprednostnenej časti sa v predkladanom vynáleze uvažuje o použití antagonistov α_νβδ na inhibíciu angiogenézy v ktoromkoľvek tkanive, v ktorom došlo k indukcii angiogenézy pomocou VEGF. Ukázalo sa napríklad, že výsledkom ischémie sietnice je v rôznych živočíšnych modelových systémoch up-regulácia VEGF, ktorý sa vylučuje Mullerovými bunkami, a ktorého tvorba následne indukuje neovaskularizáciu tkanív v rámci oka. Viď Miller a kol., Am. J. Path., 145:574-584 (1994) a Pierce a kol., Proc. Natí Acad. Sci. USA, 92:905-909 (1995).

Takže v predkladanom vynáleze je tkanivom, ktoré sa bude liečiť tkanivo očnej sietnice pacienta s diabetickou retinopatiou, degeneráciou žltej škvrny, neovaskulárnym glaukómom alebo s podobnými ochoreniami, o ktorých sa pojednávalo vyššie a angiogenézou, ktorá sa bude inhibovať je angiogenéza tkaniva očnej sietnice, kde je prítomná neovaskularizácia tkaniva sietnice. Typické príklady tkanív, vrátane tkanív očnej sietnice pacientov s ochoreniami očnej neovaskularizácie, sa opísali vyššie ako i v Príkladoch uskutočnenia vynálezu. Typickým príkladom modelového systému na stanovenie vplyvov a_vPs antagonistov tohto vynálezu na liečbu angiogenézy sietnice je myší model retinálnej neovaskularizácie, ktorý sa opisuje v príklade 9.

V ďalšej príbuznej časti predkladaného vynálezu je tkanivom, ktoré sa bude liečiť, zapálené tkanivo a angiogenézou, ktorá sa bude inhibovať je

31116/H angiogenéza zapáleného tkaniva, kde dochádza k neovaskularizácii zapáleného tkaniva. V tejto časti sa posudzuje spôsob inhibície angiogenézy v artritických tkanivách, ako je tomu u pacientov s chronickým artikulárnym reumatizmom, v imunitných alebo neimunitných zapálených tkanivách, v psoriatickom tkanive a podobne.

Predpokladá sa, že cytokíny interleukín 1 a faktor nekrotizujúci tumory-a súvisia s reumatoidnou artritídou, pričom majú priamu úlohu pri deštrukcii kĺbov založenú na indukcii expresie adhezívnych molekúl na endoteliálnych bunkách a na uvoľnení enzýmov. Viď Arend a kol., Arthrítis & Rheumatism, 38:151-160 (1995). Navrhli sa terapeutické režimy jednak na blokovanie cytokínov pomocou cytokín-špecifických inhibítorov, ako i na cielené blokovanie molekúl bunkovej adhézie, ktoré sa za týchto podmienok exprimujú. Viď Haskard a kol., Celí Adhesion Comm., 2:235-238 (1994).

Takže inhibícia angiogenézy pri artritických stavoch pomocou zamerania terapie na účasť α_νβδ adhéznej molekuly je ďalšou uprednostnenou časťou tohto vynálezu tak, ako tomu bolo i pred týmto vynálezom.

V ďalšej príbuznej časti je tkanivom, ktoré sa bude liečiť, nádorové tkanivo pacienta so solídnym nádorom, metastázami, karcinómom kože, karcinómom prsníka, hemangiómom alebo angiofibrómom a podobným karcinómom a angiogenézou, ktorá sa bude inhibovať je angiogenéza nádorového tkaniva tam, kde dochádza k neovaskularizácii nádorového tkaniva. Medzi typické solídne nádorové tkanivá, ktoré je možné liečiť predkladanými spôsobmi patria pľúca, pankreas, prsia, hrubé črevo, laryngeálne, ováriové a podobné tkanivá.

Úloha komplexnej cytokínovej siete, ktorá existuje v solídnych ľudských nádoroch je predmetom prehľadu, ktorí publikovali Leek a kol., J. Leukocyte Biol., 56:423-435 (1994), ktorého zverejnenie je tu zahrnuté vo forme citácie. Predpokladá sa, že početné cytokíny vrátane VEGF, kyslých ako aj zásaditých FGF (bFGF), TGF-α a -β, EGF, TNF-α, doštičkového rastového faktoru pre endoteliálne bunky, angiogenínu, interferónov a a γ, interleukínov 1, 6 a 8 a

31116/H podobne, ovplyvňujú rôzne bunkové mechanizmy angiogenézy v malígnych tkanivách a bunkových líniách. Napríklad v poslednej dobe sa ukázalo, že VEGF, okrem svojej lokalizácie v rozličných druhoch nádorov, súvisí s angiogenézou pri karcinóme prsníka, ako to opísali Brown a kol., Human Path., 26:86-91 (1995).

Nádory, ktoré vylučujú rôzne cytokíny a týmto indukujú lokalizovanú angiogenézu ako odpoveď, konkrétne v predkladanom patente cytokíny VEGF, TGF-α a EGF a výsledná a_vp5-sprostredkovaná angiogenéza, sú identifikovateľné pomocou skríningu vzoriek nádorového tkaniva s anticytokínovými protilátkami. Takéto metódy sú známe tým, ktorí majú základné zručnosti v danej oblasti, buď s kultivovanými alebo pitvou získanými vzorkami nádorového tkaniva. Protilátky proti vyššie opísaným cytokínom sú komerčne dostupné od firiem Oncogene Science (Uniondale, NY) alebo Upstate Biotech Incorporated (Lake Placid, NY). Skúmanie vybraných nádorových tkanív týmito spôsobmi umožňuje stanovenie potenciálu inhibičnej aktivity angiogenézy pomocou α_νβδ antagonistov tohto vynálezu.

Typické príklady angiogenézy nádorových tkanív a ich inhibície sa opísali v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Inhibícia angiogenézy nádorových tkanív je ďalšou uprednostnenou časťou vynálezu, z dôvodu dôležitej úlohy, ktorú má neovaskularizácia pri raste nádoru. V prípade neprítomnosti neovaskularizácie nádorového tkaniva, toto nádorové tkanivo nedostáva požadované živiny, spomaľuje sa jeho rast, prestáva ďalší rast, podlieha regresii a v konečnom dôsledku sa stáva nekrotickým, výsledkom čoho je odumretie nádoru.

Inými slovami povedané, predkladaný vynález zakotvuje spôsob inhibície nádorovej neovaskularizácie pomocou inhibície angiogenézy nádoru podľa predložených spôsobov. Tento vynález teda poskytuje spôsob inhibície nádorového rastu používaním spôsobov, ktoré inhibujú angiogenézu.

Tieto spôsoby sú obzvlášť účinné proti tvorbe metastáz pretože (1) ich tvorba si vyžaduje vaskularizáciu primárneho nádoru tak, aby karcinómové

31116/H bunky budúcich metastáz mohli opustiť nádor a (2) ich založenie na sekundárnom mieste si vyžaduje neoyaskularizáciu na podporu rastu metastáz. V príbuznej časti vynálezu sa posudzuje používanie tohto spôsobu liečby v spojení s ostatnými terapiami, ako je bežná chemoterapia namierená voči solídnym nádorom a voči kontrole zakladania metastáz. Podávanie inhibítora angiogenézy sa typicky uskutočňuje počas alebo po chemoterapii, hoci sa uprednostňuje inhibovanie angiogenézy po režime chemoterapie v časoch, keď bude nádorové tkanivo odpovedať na toxické útoky indukciou angiogenézy, aby došlo k náprave prostredníctvom zásobovania nádorového tkaniva krvou a živinami. Navyše sa uprednostňuje liečba inhibítormi angiogenézy po chirurgickom zákroku, pri ktorom sa odstránili solídne nádory ako profylaxia proti tvorbe metastáz.

Doposiaľ sa predkladané spôsoby liečby týkali inhibície nádorovej neovaskularizácie, avšak tieto spôsoby sa môžu uplatniť pri inhibícii rastu nádorového tkaniva, inhibícii tvorby nádorových metastáz a regresii už založených nádorov. Pri poslednom menovanom použití sa znižovanie nádorovej hmoty posudzovalo na modeli králičích očí tak, ako sa jeho použitie opísalo v tomto vynáleze, alebo pomocou modelového systému tvoreného chimérickým myším: ľudským modelom, v ktorom sa pokožka myši s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (SCID) nahradila ľudskou novorodeneckou pokožkou tak, ako to opísali Yan a koľ, J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993), ktorého zverejnenie je tu zahrnuté vo forme citácie. Naposledy menovaný model predstavuje ďalší in vivo model na skúmanie angiogenézy a jej inhibície pomocou spôsobov liečby opísanými v tomto vynáleze. Typické výsledky s použitím králičieho nádorového modelu a α_νβδ antagonistov tohto vynálezu sa uvádzajú v príkladoch 5C a 6D, kým výsledky inhibície angiogenézy v SCID myšom modeli sa opisujú v príklade 8.

Restenóza je proces, pri ktorom dochádza k migrácii buniek hladkého svalstva (SMC) a ich proliferácii v mieste perkutánnej transluminárnej koronárnej angioplastiky, čo obmedzuje úspech angioplastiky. Migrácia a proliferácia SMC počas restenózy sa môže považovať za proces angiogenézy,

31116/H ktorý sa inhibuje predkladanými spôsobmi liečby. Preto tento vynález posudzuje taktiež inhibíciu restenózy inhibíciou angiogenézy podľa predkladaných spôsobov liečby pacienta po vykonaní angioplastiky. Z dôvodu inhibície restenózy sa obyčajne podáva α_νβδ antagonista po vykonaní angioplastiky od približne 2 po približne 28 dní a typickejšie u približne prvých 14 dní po vykonaní zákroku.

Vhodným pacientom, ktorý sa spomína v mnohých častiach predkladaného vynálezu, je človek, hoci je nutné pochopiť, že princípy tohto vynálezu naznačujú, že tento vynález je účinný vo vzťahu ku všetkým cicavcom, ktoré sa mienia zahrnúť pod pojem „pacient,,. V tejto súvislosti sa rozumie, že cicavec zahrňuje ktorýkoľvek druh cicavca, obzvlášť poľnohospodárske a domáce druhy cicavcov, v prípade ktorých sa liečba choroby zvažuje vzhľadom k spôsobom liečby podľa tohto vynálezu.

Predkladaný spôsob inhibície angiogenézy v tkanive, a teda i spôsob používania liečby pri ochoreniach odvodených od angiogenézy, zahrňuje dosiahnutie tkaniva, v ktorom sa angiogenéza vyskytuje, alebo je riziko, že sa tam angiogenéza bude vyskytovať, kompozitom, ktorý obsahuje terapeuticky účinné množstvo α_νβδ antagonistu schopného inhibovať väzbu α_νβδ k svojmu prirodzenému ligandu. Takže tento spôsob zahrňuje podanie pacientovi terapeuticky účinného množstva fyziologicky tolerovateľného kompozitu, obsahujúceho α_νβδ antagonistu podľa tohto vynálezu,.

Rozsahy dávok podávaného α_νβδ antagonistu závisia na forme antagonistu a na jeho účinnosti tak, ako sa tu ďalej opisuje, a sú to množstvá dostatočne veľké, aby sa dosiahol žiadúci efekt, a teda angiogenéza, ako i symptómy choroby sprostredkované angiogenézou sa zmenšia. Dávka by nemala byť taká veľká, aby zapríčinila nežiaduce vedľajšie účinky, ako sú syndrómy hyperviskozity, pľúcny edém, kongestívne zlyhanie srdca a podobne. Vo všeobecnosti sa bude dávka meniť s vekom, stavom, pohlavím a rozsahom ochorenia pacienta a môže ju stanoviť ten, ktorý má v danej oblasti skúsenosti.

31116/H

Dávka sa môže taktiež upraviť jednotlivým lekárom v prípade akejkoľvek komplikácie.

α_νβδ antagonista je molekula, ktorá blokuje alebo inhibuje fyziologické alebo farmakologické aktivity α_νβ₅ a to inhibíciou väzbovej aktivity receptora na svoj ligand, menovite vitronektín. Uprednostnenými α_νβ₅ antagonistami môžu byť monoklonálne protilátky, peptid alebo molekula na báze organickej zlúčeniny, ktorá napodobňuje α_νβδ ligand.

Terapeuticky účinné množstvo je množstvo α_νβδ antagonistu dostatočné na dosiahnutie merateľnej inhibície angiogenézy v tkanive, ktoré sa lieči, t.j. množstvo inhibujúce angiogenézu. Inhibícia angiogenézy sa môže merať in situ imunohistochemicky tak, ako sa tu opisuje, alebo inými metódami, ktoré sú známe tým, ktorí majú skúsenosti v danej oblasti.

Keďže α_νβδ antagonista môže byť vo forme organickej látky napodobňujúcej α_νβδ ligand, peptidu obsahujúceho RGD, anti-a^₅ monoklonálnej protilátky alebo jej fragmentu, alebo látky napodobňujúcej α_νβ₅ receptor, je nutné, aby sa pamätalo na to, že účinnosť, a tým pádom aj vyjadrenie „terapeuticky účinného,, množstva, sa môže meniť. Avšak ako ukazujú predkladané spôsoby stanovenia, tí, ktorí majú skúsenosti v danej oblasti môžu ľahko stanoviť účinnosť potenciálneho α_νβ₅ antagonistu podľa tohto vynálezu.

Účinnosť α_νβδ antagonistu sa môže merať rozličnými spôsobmi vrátane inhibície angiogenézy v CAM stanovení, v in vivo modeli králičích očí, meraním inhibície väzby prirodzeného ligandu k α_νβ₅ tak, ako sa to tu všetko opisuje, ako i podobnými stanoveniami.

Uprednostnený α_νβδ antagonista má schopnosť v podstatnej miere inhibovať väzbu prirodzeného ligandu, ako je vitronektín, k α_νβδ v roztoku pri koncentráciách antagonistu menších ako 0,5 mikromólov na liter (μΜ), prednostne menej ako 0,1 μΜ a ešte viac sa uprednostňujú koncentrácie nižšie ako 0,05 μΜ. Pod pojmom „v podstatnej miere,, sa rozumie stav, keď sa

31116/H pozoruje aspoň 50 percentná redukcia viazania vitronektínu inhibíciou prítomného α_νβδ antagonistu a 50% inhibícia sa tu uvádza ako hodnota IC50.

Viac uprednostňovaný α_νβδ antagonista vykazuje selektívnosť pre α_νβδ v porovnaní s ostatnými integrínmi. Takže uprednostňovaný α_νβδ antagonista v podstatnej miere inhibuje väzbu k α_νβ5, ale v podstatnej miere neinhibuje väzbu vitronektínu k integrínu, ako je α_νβι, α_νβ3 alebo 0^3. Obzvlášť je uprednostnený α_νβδ antagonista, ktorý vykazuje 10-násobne až 100-násobne nižšiu IC₅₀ aktivitu pri inhibícii väzby vitronektínu k α_νβ₅ v porovnaní s IC₅₀ aktivitou pri inhibícii väzby vitronektínu k inému integrínu. Typické testy na meranie IC₅o aktivity pri inhibícii väzby vitronektínu k integrínu sa opisujú v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Terapeuticky účinné množstvo α_νβ₅ antagonistu tohto vynálezu vo forme monoklonálnej protilátky je obyčajne také množstvo, ktoré pri podaní vo fyziologicky tolerovateľnom kompozite je dostatočné na to, aby sa dosiahli plazmatické koncentrácie od okolo 0,01 pg/ml po približne 100 pg/ml, a obyčajne okolo 1-5 pg/ml. Inými slovami povedané dávka môže varírovať od okolo 0,1 mg/kg po približne 300 mg/kg, prednostne od okolo 0,2 mg/kg po približne 200 mg/kg, a najviac sa uprednostňuje dávka od okolo 0,5 mg/kg po približne 20 mg/kg v jednej alebo viacerých dávkach podaných počas dňa, u jedného alebo niekoľkých dní.

Keď sa antagonista nachádza vo forme fragmentu monoklonálnej protilátky, jeho množstvo sa môže ľahko upraviť v závislosti od hmotnosti fragmentu v porovnaní s hmotnosťou celej protilátky. Uprednostňovaná plazmatická koncentrácia v hodnotách molarity je od okolo 2 mikromólov na liter (μΜ) po približne 5 milimólov na liter (mM) a prednostne od okolo 100 μΜ po približne 1 mM antagonistu, ktorým je protilátka.

Terapeuticky účinné množstvo α_νβ5 antagonistu tohto vynálezu vo forme polypeptidu alebo inej malej molekuly s podobnou veľkosťou napodobňujúcou ligand, je obyčajne také množstvo polypeptidu, ktoré keď sa podá vo forme fyziologicky tolerovateľného kompozitu je dostatočné na to, aby sa dosiahli

31116/H plazmatické koncentrácie od okolo 0,1 mikrogramu (pg) na mililiter (ml) po približne 200 μg/ml, prednostne od okolo 1 μg/kg po približne 150 μg/kg. V prípade, že polypeptid má molekulovú hmotnosť okolo 500 g/mol, potom je uprednostňovaná plazmatická koncentrácia v hodnotách molarity od okolo 2 mikromolov na liter (μΜ) po približne 5 milimólov na liter (mM) a prednostne od okolo 100 μΜ po 1 mM antagonistu tvoreného polypeptidom. Inak povedané dávka vyjadrená na hmotnosť tela môže varírovať od okolo 0,1 mg/kg po približne 300 mg/kg, a prednostne od okolo 0,2 mg/kg po približne 200 mg/kg, v jednej alebo viacerých dávkach podaných počas dňa, počas jedného alebo niekoľkých dní.

Monoklonálne protilátky, polypeptidy alebo organické mimetické látky tohto vynálezu sa môžu podávať parenterálne injekciou alebo postupne infúziou. Hoci tkanivo, ktoré sa má liečiť, sa môže v tele väčšinou dosiahnuť pomocou systémového podania, a preto sa najčastejšie lieči intravenóznym podaním terapeutických kompozitov, v prípade, že je pravdepodobnosť, že cieľové tkanivo obsahuje cieľovú molekulu, sa zvažujú taktiež iné tkanivá a spôsoby podania. Takže monoklonálne protilátky, polypeptidy alebo organické mimetické látky tohto vynálezu sa môžu podávať vnútroočne, intravenózne, intraperitoneálne, intramuskulárne, subkutánne, intrakavitálne, transdermálne a môžu sa taktiež podávať peristaltickými prostriedkami.

Terapeutické kompozity obsahujúce α_νβ5 antagonistu tohto vynálezu sa tradične podávajú intravenózne, ako napríklad injekciou jednotkovej dávky. Keď sa pojem „jednotková dávka,, použije v súvislosti s terapeutickými kompozitmi predkladaného vynálezu, označuje fyzicky samostatné jednotky vhodné ako jednotkové dávky pre jedinca, pričom každá dávka obsahuje dopredu stanovené množstvo aktívneho materiálu vypočítaného tak, aby sa v spojení s nutným diluentom, t.j. nosičom alebo vehikulom, dosiahol želaný terapeutický efekt.

31116/H

V jednej uprednostnenej časti sa a_vps antagonista podáva vo forme jednej dávky intravenózne tak, ako sa opisuje v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Kompozity sa podávajú spôsobom, ktorý je v súlade s typom formulácie dávky a zároveň v terapeuticky účinnom množstve. Množstvo, ktoré sa má podať a časovanie podania závisí od jedinca, ktorý sa má liečiť, od schopnosti systému jedinca zužitkovať aktívnu zložku a od stupňa želaného terapeutického výsledku. Presné množstvá aktívnej zložky, ktorú je nutné podať, závisia od lekárovho zváženia a sú jedinečné pre každého jedinca. Avšak vhodné rozsahy dávok na systémové podanie sa tu zverejňujú a závisia od spôsobu podania. Navzájom sa líšia taktiež vhodné režimy podávania, avšak tieto sú typicky zložené z počiatočného podania a z následných opakovaných dávok vjednoalebo viachodinových intervaloch následného injekčného alebo iného podania. Alebo sa uvažuje o použití kontinuálnej intravenóznej infúzie, ktorá je dostatočná na udržanie plazmatických koncentrácií v rozsahoch stanovených na in vivo terapie.

D) Terapeutické kompozity

V predkladanom vynáleze sa hodnotia terapeutické kompozity vhodné na používanie v terapeutických spôsoboch, ktoré sa tu opisujú. Terapeutické kompozity predkladaného vynálezu obsahujú fyziologicky prijateľný nosič spolu s α_νβ5 antagonistom, ktorý je tu rozpustený alebo dispergovaný ako aktívna zložka tak, ako sa tu opisuje. Terapeutický kompozit obsahujúci α_νβδ antagonistu nie je v uprednostnenej časti ímunogénny, keď sa podáva cicavcovi alebo ľudskému pacientovi z terapeutických dôvodov.

Pojmy „farmaceutický prijateľný,,, „fyziologicky tolerovateľný,,, ktoré sa tu používajú, ako aj ich gramatické obmeny, označujú kompozity, nosiče, diluenty a reagenty, pričom sa používajú zameniteľné a označujú fakt, že materiál je možné podávať cicavcovi bez vzniku nežiaducich fyziologických účinkov, ako je zvracanie, závrate, bolesti žalúdka a podobne.

31116/H

Prípravok farmaceutického kompozitu obsahujúci aktívne zložky, ktoré sú v ňom rozpustené alebo dispergované, je veľmi dobre známy v danej oblasti a nemusí sa obmedzovať z dôvodu formulácie. Obyčajne sa takéto kompozity pripravujú ako injekčné formulácie v kvapalných roztokoch, alebo suspenziách, avšak môžu sa pripraviť taktiež tuhé formy vhodné na prípravu roztoku, alebo suspenzie, ktoré sa pred použitím zmiešajú s tekutinou. Prípravky môžu byť taktiež v emulzifikovanej forme.

Aktívna zložka sa môže zmiešať s prídavnými látkami, ktoré sú farmaceutický prijateľné a kompatibilné s aktívnou zložkou, v množstvách vhodných na použitie v terapeutických spôsoboch, ktoré sa tu opisujú. Vhodnými prídavnými látkami sú napríklad voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, etanol a podobné látky, ako i ich kombinácie. Navyše, ak je to potrebné, kompozit môže obsahovať malé množstvá pomocných látok, ako sú zvlhčovacie alebo emulgačné činidlá, pufrovacie činidlá a podobné aditíva, ktoré zvyšujú účinnosť aktívnej zložky.

Terapeutický kompozit predkladaného vynálezu môže zahrňovať farmaceutický prijateľné soli týchto zložiek. Farmaceutický prijateľné soli zahrňujú soli vznikajúce po pridaní kyseliny (vytvorené s voľnými aminoskupinami polypeptidu), a to s anorganickými kyselinami, ako je napríklad kyselina chlorovodíková alebo kyselina fosforečná, alebo s takými organickými kyselinami, ako je kyselina octová, vínna, mandľová a podobne. Soli vytvorené s voľnými karboxylovými skupinami sa môžu taktiež odvodiť z anorganických zásad, ako je napríklad hydroxid sodný, draselný, amónny, vápenatý alebo hydroxid železitý a z takých organických zásad, ako je izopropylamín, trimetylamín, 2-etylaminoetanol, histidín, prokaín a podobne.

Obzvlášť je uprednostňovaná HCI soľ, keď sa použije v prípravku obsahujúcom α_νβδ antagonistov na báze cyklických polypeptidov.

Fyziologicky tolerované nosiče sú v danej oblasti dobre známe. Typickými príkladmi tekutých nosičov sú sterilné vodné roztoky, ktoré neobsahujú žiaden materiál okrem aktívnych zložiek a vody, alebo obsahujú pufor, ako je fosforečnan sodný s hodnotou fyziologického pH, fyziologický

31116/H roztok alebo oba, ako je fosfátovým pufrom tlmený fyziologický roztok. Navyše môžu vodné nosiče obsahovať viac ako jednu tlmivú soľ, ako i soli ,ako je chlorid sodný a draselný, dextrózu, polyetylénglykol a iné.

Tekuté kompozity môžu okrem vody taktiež obsahovať iné tekuté fázy, pričom tieto tekuté fázy môžu byť prítomné taktiež namiesto vody. Typickým príkladom takýchto dodatočných tekutých fáz je glycerín, rastlinné oleje, ako je bavlníkový olej, a emulzie vody s olejom.

Terapeutický kompozit obsahuje angiogenézu inhibujúce množstvo α_νβδ antagonistu predkladaného vynálezu, ktorý je obyčajne formulovaný tak, aby obsahoval množstvo zodpovedajúce aspoň 0,1 hmotnostného percenta antagonistu z hmotnosti celkového terapeutického kompozitu. Hmotnostné percento je pomer hmotnosti inhibítora k hmotnosti celkového kompozitu. Takže, napríklad, 0,1 hmotnostného percenta predstavuje 0,1 gramu inhibítora na 100 g celkového kompozitu.

E) Antagonisty integrínu

Antagonisty α_νβδ sa používajú v predkladaných spôsoboch liečby na inhibíciu angiogenézy v tkanive a môžu mať odlišné podoby, ktoré zahrňujú zlúčeniny, ktoré interagujú s α_νβδ takým spôsobom, že sa narúšajú funkčné interakcie s prirodzenými ligandami α_νβδ. Typické príklady antagonistov zahrňujú analógy α_νβδ, alebo látky napodobňujúce α_νβ₅, ktoré sú odvodené od väzbového miesta pre Ugandy prítomného na α_νβ₅, ďalej mimetické látky prirodzeného Ugandu α_νβ₅, ktoré napodobňujú štrukturálnu oblasť, ktorá sa zúčastňuje väzbových interakcií c^s-ligand, ďalej polypeptidy, ktoré majú sekvenciu zodpovedajúcu funkčnej väzbovej doméne prirodzeného ligandu špecifického pre α_νβ5, obzvlášť tie, ktoré majú sekvenciu zodpovedajúcu doméne obsahujúcej RGD prirodzeného ligandu α_νβ₅, a nakoniec protilátky, ktoré reagujú buď s α_νβδ alebo s prirodzeným ligandom, pričom všetky vykazujú antagonistickú aktivitu tak, ako sa tu definuje.

31116/H

1) Polypeptidy

V jednej časti sa v patente hodnotia α_νβδ antagonisty vo forme polypeptidov. Polypeptidový (peptidový) α_νβ₅ antagonista môže mať sekvenčné vlastnosti buď prirodzeného ligandu α_νβ5, alebo samotného α_νβ5, v oblasti, ktorá sa zúčastňuje interakcie c^s-ligand a vykazuje aktivitu α_νβδ antagonistu, ako sa tu opisuje. Uprednostňovaný peptidový antagonista α_νβδ obsahuje RGD tripeptid a svojou sekvenciou zodpovedá tej oblasti prirodzeného ligandu, ktorá obsahuje RGD.

Uprednostňované polypeptidy obsahujúce RGD majú sekvenciu zodpovedajúcu sekvencii aminokyselinových zvyškov oblasti obsahujúcej RGD prirodzeného ligandu α_νβ5, akým je vitronektín, u ktorého je táto sekvencia dobre známa.

Obzvlášť uprednostňovaný peptidový α_νβ₅ antagonista prednostne inhibuje viazanie α_νβδ k jeho prirodzenému ligandu(om), v porovnaní s ostatnými integrínmi, ako sa opísalo vyššie. Tieto o^s-špecifické peptidy sú obzvlášť uprednostňované prinajmenšom kvôli tomu, že špecifičnosť pre α_νβ₅ redukuje výskyt nežiaducich vedľajších účinkov, ako je inhibícia iných integrínov. Identifikácia uprednostnených peptidových α_νβδ antagonistov, ktoré majú selektivitu pre α_νβ₅ sa môže ľahko vykonať v typickom stanovení inhibície viazania, akým je ELISA test opísaný v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Polypeptid predkladaného vynálezu je typický tým, že nezahrňuje viac ako 100 aminokyselinových zvyškov, prednostne nie viac ako približne 60 zvyškov, a ešte viac sa uprednostňujú polypeptidy s nie viac ako približne 30 zvyškami. Peptidy môžu byť lineárne alebo cyklické, avšak obzvlášť uprednostňovanými peptidmi sú cyklické peptidy. Uprednostňované peptidy sa opisujú v príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Keď je polypeptid väčší ako približne 100 zvyškov, obyčajne sa poskytuje vo forme fúzneho proteínu alebo proteínového fragmentu tak, ako sa tu opisuje.

31116/H

Malo by sa pochopiť, že predmetný polypeptid nemusí mať sekvenciu aminokyselinových zvyškov zhodnú s prirodzeným ligandom α_νβ₅, pokiaľ zahrňuje sekvenciu nevyhnutnú na zabránenie viazania α_νβδ Ugandu k α_νβδ, a pokiaľ by bol schopný fungovať ako α_νβδ antagonista v stanoveniach ako sú tie, ktoré sa tu opisujú.

Predmetný polypeptid zahrňuje akýkoľvek analóg, fragment alebo chemický derivát polypeptidu, ktorého sekvencia aminokyselinových zvyškov je tu zobrazená, pokiaľ je tento polypeptid α_νβδ antagonistom. Preto môže byť predkladaný polypeptid predmetom rôznych zmien, substitúcií, inzercií a delécií, pričom takéto zmeny zakotvujú isté výhody jeho používania. V tomto ohľade polypeptidový α_νβδ antagonista tohto vynálezu skôr zodpovedá sekvencii uvádzaného peptidu, než je identický so sekvenciou tohto peptidu, keďže predmetný peptid si zachová schopnosť fungovať ako α_νβδ antagonista v jednom alebo vo viacerých stanoveniach tak, ako sú tu definované, i keď sa v ňom urobí jedna alebo viacero zmien.

Takže polypeptid sa môže nachádzať v ktorejkoľvek z rôznych foriem peptidových derivátov, ktoré zahrňujú amidy, konjugáty s proteínmi, cyklické peptidy, polymerizované peptidy, analógy, fragmenty, chemicky modifikované peptidy a podobné deriváty.

Pojem „analóg,, zahrňuje akýkoľvek polypeptid so značne identickou sekvenciou aminokyselinových zvyškov s veľmi podobnou sekvenciou, ktorá je tu špecificky zobrazená, a v ktorej sa jeden alebo viacero zvyškov natrvalo nahradilo funkčne podobným zvyškom, pričom vykazujú aktivitu α_νβ₅ antagonistu tak, ako sa tu opisuje. Príklady trvalých substitúcií zahrňujú substitúciu jedného nepolárneho (hydrofóbneho) zvyšku ako je izoleucín, valín, leucín alebo metionín za iný, substitúciu jedného polárneho (hydrofilného) zvyšku za iný, ako je výmena medzi arginínom a lyzínom, glutamínom a asparagínom, medzi glycínom a serínom, substitúcia jedného zásaditého zvyšku ako je lyzín, arginín alebo histidín za iný, alebo substitúcia jedného kyslého zvyšku ako je kyselina asparágová alebo kyselina glutámová za iný.

31116/H

Slovné spojenie „trvalá substitúcia,, taktiež zahrňuje použitie chemicky derivatizovaného zvyšku namiesto nederivatizovaného zvyšku, za predpokladu, že takýto polypeptid vykazuje nevyhnutnú inhibičnú aktivitu.

Označenie „chemický derivát,, sa vzťahuje na predmetný polypeptid, ktorý má jeden alebo viacero zvyškov chemicky derivatizovaných reakciou vedľajšej funkčnej skupiny. Okrem derivatizácií vedľajšej skupiny, môže mať chemický derivát jednu alebo viacero modifikácií hlavného reťazca vrátane aamino- substitúcií ako je /V-metyl, /V-etyi, /V-propyl a podobne, a akarbonylových substitúcií ako je tioester, tioamid, guanidino- a podobne. Takéto derivatizované molekuly zahrňujú napríklad tie molekuly, v ktorých sa derivatizovali voľné aminoskupiny, čím sa vytvorili hydrochloridamíny, ptoluénsulfonylové skupiny, karbobenzoxy- skupiny, f-butylkarbonylové skupiny, chlóracetylové skupiny alebo formylové skupiny. Voľné karbonylové skupiny sa môžu derivatizovať za vzniku solí, metylesterov, etylesterov alebo iných typov esterov alebo hydrazínov. Voľné hydroxylové skupiny sa môžu derivatizovať za vzniku O-acylových alebo O-alkylových derivátov. Imidazolový dusík histidínu sa môže derivatizovať, čím sa vytvorí /V-im-benzylhistidín. Medzi chemické deriváty sú taktiež zahrnuté tie peptidy, ktoré obsahujú jednu, alebo viacero z prirodzene sa vyskytujúcich aminokyselinových derivátov dvadsiatych štandardných aminokyselín. Napríklad: 4-hydroxyprolín sa môže substituovať namiesto prolínu; 5-hydroxylyzín sa môže substituovať namiesto lyzínu; 3metylhistidín sa môže substituovať namiesto histidínu; homoserín sa môže substituovať namiesto serínu a ornitín sa môže substituovať namiesto lyzínu. Polypeptidy predkladaného vynálezu taktiež zahrňujú ktorýkoľvek polypeptid, ktorý má jednu alebo viacero adícií a/alebo delécií zvyškov v porovnaní so sekvenciou polypeptidu, ktorého sekvencia je tu zobrazená, pokiaľ vykazuje nevyhnutnú inhibičnú aktivitu.

Obzvlášť uprednostňovaným derivátom je cyklický peptid podľa vzorca cyklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal), v skratke c(RGDf-NMeV), v ktorom je aamino- skupina valínového zvyšku peptidu substituovaná /V-metylom a pri cyklizácii sa spojili primárne amino- a karboxy- konce peptidu.

31116/H

Pojem „fragment,, označuje ktorýkoľvek predmetný polypeptid, ktorý má sekvenciu aminokyselinových zvyškov kratšiu ako je sekvencia polypeptidu, ktorého sekvencia aminokyselinových zvyškov je tu zobrazená.

Keď má polypeptid predkladaného vynálezu sekvenciu, ktorá je nie zhodná so sekvenciou prirodzeného α_νββ ligandu, je to najmä z toho dôvodu, že sa urobila jedna alebo viacero trvalých alebo meniteľných substitúcií, obyčajne však nie je substituovaných viac ako okolo 30 percent a prednostne nie viac ako 10 percent z počtu aminokyselinových zvyškov. Môžu sa pridať taktiež ďalšie zvyšky na ktoromkoľvek konci polypeptidu z dôvodu vytvorenia „linkeru,,, ktorým sa polypeptidy tohto vynálezu môžu kovalentne pripojiť k značke alebo k pevnej matrici, alebo k nosiču.

Značky, pevné matrice a nosiče, ktoré sa môžu použiť s polypeptidmi tohto vynálezu sa opisujú nižšie.

Aminokyselinové linkery majú zvyčajne aspoň jeden aminokyselinový zvyšok, ale môžu mať aj 40 alebo i viac zvyškov, častejšie od 1 po 10 zvyškov, ktoré však nevytvárajú epitopy α_νβδ ligandu. Typické aminokyselinové zvyšky používané pre linker sú tyrozín, cysteín, lyzín, kyselina glutámová a kyselina asparágová, alebo podobné aminokyseliny. Navyše, ak sa inak nešpecifikovalo, predmetný polypeptid sa môže od prirodzenej sekvencie α_νβδ ligandu líšiť tým, že sa sekvencia modifikuje acyláciou terminálnej NH₂ skupiny, napríklad acetyláciou alebo amidáciou tioglykolovou kyselinou, koncovou karboxylamidáciou, napr. amoniakom, metylamínom, a podobnými terminálnymi modifikátormi. Ako je dobre známe, koncové modifikácie sú užitočné, pretože znižujú náchylnosť k štiepeniu proteinázami, a preto slúžia na to, aby predĺžili polčas polypeptidov v roztoku, obzvlášť v biologických tekutinách, v ktorých sa môžu nachádzať proteázy. Z tohto hľadiska je užitočnou koncovou modifikáciou taktiež cyklizácia polypeptidu, ktorá je tiež obzvlášť uprednostnenou modifikáciou, pretože cyklizáciou sa vytvárajú stabilné štruktúry, a taktiež z hľadiska tu opísaných biologických aktivít pozorovaných u takýchto cyklických peptidov.

31116/H

Ktorýkoľvek peptid predkladaného vynálezu sa môže použiť vo forme farmaceutický prijateľnej soli. Vhodné kyseliny, ktoré sú schopné vytvárať soli s peptidmi predkladaného vynálezu zahrňujú anorganické kyseliny, ako je kyselina trifluóroctová (TFA), kyselina chlorovodíková (HCI), kyselina bromovodíková, kyselina chloristá, kyselina dusičná, kyselina tiokyanatá, kyselina sírová, kyselina metánsulfónová, kyselina octová, kyselina acetofosforečná, kyselina propiónová, kyselina glykolová, kyselina mliečna, kyselina pyrohroznová, kyselina šťaveľová, kyselina jablčná, kyselina jantárová, kyselina maleínová, kyselina fumárová, kyselina antranilová, kyselina škoricová, kyselina naftalénsulfónová, kyselina sulfanilová alebo podobné kyseliny. Obzvlášť sa uprednostňuje HCI soľ.

Vhodné zásady schopné vytvárať soli s peptidmi predkladaného vynálezu zahrňujú anorganické zásady ako je hydroxid sodný, hydroxid amónny, hydroxid draselný a podobne; a organické zásady ako je mono-, di- a trialkyl- a arylamíny (napríklad trietylamín, diizopropylamín, metylamín, dimetylamín a podobne) a príležitostne substituované etanolamíny (napríklad etanolamín, dietanolamín a podobne).

Navyše sa môže peptid tohto vynálezu pripraviť tak, ako sa opisuje v Príkladoch uskutočnenia vynálezu bez voľnej iónovej soli, kedy sa nabité kyslé a zásadité skupiny prítomné v bočných skupinách aminokyselín peptidu (napríklad Arg, Asp a podobne) zoskupujú a neutralizujú sa navzájom, čím vytvárajú „vnútornú soľ,, zlúčeniny.

Peptid predkladaného vynálezu, ktorý sa tu označuje taktiež ako predmetný polypeptid, sa môže syntetizovať ktorýmkoľvek z postupov známych tým, ktorí sú odborníkmi v oblasti polypeptidov, vrátane techník rekombinantnej DNA. Postupy syntetickej chémie, ako je napríklad Merrifieldov typ syntézy na nerozpustnom nosiči, sú uprednostnené z dôvodu čistoty, antigénovej špecifity, absencie nežiaducich vedľajších produktov, jednoduchosti výroby a podobne. Výborné zhrnutie mnohých postupov syntézy peptidov na nerozpustnom nosiči sa môže nájsť v prácach Steward a kol., „Solid phase peptide synthesis,,, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; Bodanszky a kol., „Peptide synthesis,,,

31116/H

John Wiley & Sons, 2. vydanie, 1976; J. Meienhofer, „Hormonal proteins and peptides,,, zv. 2, str. 46, Academic Press (New York), 1983; Merrifield, Adv. Enzymol., 32:221-296, 1969; Fields a kol., Int. J. Peptide Protein Pes., 35:161214, 1990; ako i v USA patente č. 4,244,946 a Schroder a kol., „The peptides,,, Zväzok 1, Academic Press (New York), 1965 opísali klasickú syntézu v roztoku, pričom každá z uvedených citácií je tu zahrnutá vo forme citácie. Vhodné ochranné skupiny použiteľné pri takejto syntéze sa opisujú vo vyššie uvedených textoch ako i vJ.F.W. McOmie „Protective groups in organic chemistry,,, Plénum Press, New York, 1973, ktorá je tu zahrnutá vo forme citácie.

Uvažované spôsoby syntézy na pevnom nosiči vo všeobecnosti zahrňujú postupnú adíciu jedného alebo viacerých aminokyselinových zvyškov alebo vhodne chránených aminokyselinových zvyškov k rastúcemu peptidovému reťazcu. Za normálnych okolností je buď amino- alebo karbonylová skupina prvého aminokyselinového zvyšku chránená vhodnou, selektívne odstrániteľnou ochrannou skupinou. Odlišná selektívne odstrániteľná ochranná skupina sa použije na aminokyseliny obsahujúce takú reaktívnu bočnú skupinu, ako má lyzín.

Pri použití syntézy na pevnom nosiči ako typického príkladu, sa chránená alebo derivatizovaná aminokyselina pripája k inertnému tuhému nosiču cez svoju nechránenú karboxylovú alebo amino- skupinu. Ochranná skupina amino- alebo karbonylovej skupiny sa potom selektívne odstráni a pridá sa nasledujúca aminokyselina v poradí, ktorá má voľnú (amino- alebo karbonylovú) skupinu vhodne chránenú, a táto potom reaguje za podmienok vhodných na vytvorenie amidovej väzby so zvyškom, ktorý sa už pripojil k pevnému nosiču. Ochranná skupina amino- alebo karbonylovej skupiny sa potom odstráni z tohto novo pridaného aminokyselinového zvyšku, a pridá sa nasledujúca aminokyselina (vhodne chránená) atď. Potom, čo sa všetky žiaduce aminokyseliny naviazali vo vhodnej sekvencii, pevný nosič a akékoľvek ochranné skupiny chrániace koncové a bočné skupiny sa odstránia postupne alebo zároveň, čím sa vytvorí konečný lineárny polypeptid.

31116/H

Výsledné lineárne polypeptidy pripravené napríklad tak, ako sa opísalo vyššie, sa môžu nechať zreagovať, čím sa vytvoria ich zodpovedajúce cyklické peptidy. Typický príklad spôsobu prípravy cyklického peptidu opísali Zimmer a koľ, Peptides 1992, str. 393-394, ESCOM Science Publishers, B.V., 1993. Zvyčajne sa t-butoxykarbonylom chránený metylester peptidu rozpustí v metanole a pridá sa roztok hydroxidu sodného a zmes sa nechá zreagovať pri 20°C (20C), aby sa hydrolyticky odstránila metylesterová ochranná skupina. Po odparení rozpúšťadla, sa t-butoxykarbonylom chránený peptid extrahuje etylacetátom z okysleného vodného rozpúšťadla, ŕ-butoxykarbonylová ochranná skupina sa potom odstráni v mierne kyslom prostredí v dioxáne, ktorý je ďalším rozpúšťadlom. Takto získaný nechránený lineárny peptid s voľným amino- a karbonylovým koncom sa premieňa na príslušný cyklický peptid reakciou rozriedeného roztoku lineárneho peptidu v zmesi dichlórmetánu a dimetylformamidu s dicyklohexylkarbodiimidom v prítomnosti 1hydroxybenzotriazolu a /V-metylmorfolínu. Výsledný cyklický peptid sa potom purifikoval chromatograficky.

Alternatívne spôsoby syntézy cyklických peptidov opísali Gurrath a kol., Eur. J. Biochem., 210:911-921 (1992) a sú opísané v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Navyše sa môže α_νβδ antagonista poskytnúť vo forme fúzneho proteínu. Fúzne proteíny sú proteíny vytvorené metódami rekombinantnej DNA tak, ako sa tu opisuje, v ktorých sa predmetný polypeptid exprimuje ako fúzia s druhým nosičovým proteínom ako je glutatiónsulfhydryltransferáza (GST) alebo iným dobre známym nosičom. Uprednostnené fúzne proteíny zahrňujú tu opísaný MMP-2 polypeptid. Príprava MMP-2 fúzneho proteínu sa opisuje v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Obzvlášť uprednostnené peptidy alebo deriváty peptidov vhodné na použitie v predkladaných spôsoboch liečby tkanív, ktoré vykazujú najmä angiogenézu spojenú s α_νβδ, sa opisujú v Príkladoch uskutočnenia vynálezu a zahrňujú polypeptidy zobrazené ako sekvencie č. 4, 6, 7, 8 a 9.

31116/H

Tak isto sú uprednostnenými tiež polypeptidy, ktoré sú odvodené od tu opísaného MMP-2, ktorého sekvencie sú zobrazené ako sekvencie č. 11-22.

2. Monoklonálne protilátky

V predkladanom vynáleze sa v jednej časti opisujú α_νβ₅ antagonisty vo forme monoklonálnych protilátok, ktoré reagujú s α_νβ₅ a inhibujú väzbu α_νβδ k svojmu prirodzenému ligandu tak, ako sa tu opisuje. Vynález taktiež opisuje bunkové línie, ktoré produkujú protilátky, spôsoby prípravy týchto bunkových línií a spôsoby produkcie monoklonálnych protilátok.

Monoklonálna protilátka tohto vynálezu zahrňuje molekulu protilátky, ktorá 1) reaguje s izolovaným α_νβ₅ a 2) inhibuje väzbu vitronektínu s α_νβδ. Uprednostňované monoklonálne protilátky, ktoré sa prednostne viažu k α_νβδ zahrňujú monoklonálnu protilátku, ktorá má imunoreakčné vlastnosti monoklonálnej protilátky P1F6 a monoklonálnej protilátky P5H9, ktoré sa opisujú v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Pojem „protilátka,, alebo „protilátková molekula,, sa tu používa v rôznych gramatických formách ako spoločné podstatné meno, ktoré opisuje populáciu imunoglobulínových molekúl a/alebo imunologický aktívne časti imunoglobulínových molekúl, to znamená molekúl, ktoré obsahujú väzbové miesto protilátky alebo paratop.

Termín „väzbové miesto protilátky,, predstavuje štrukturálnu časť molekuly protilátky, pozostávajúcu z variabilných a hypervariabilných oblastí ťažkého a ľahkého reťazca, ktoré špecificky viažu antigén.

Typickými príkladmi protilátok vhodných na použitie v predkladanom vynáleze sú intaktné imunoglobulínové molekuly, v podstate intaktné imunoglobulínové molekuly a tie časti imunoglobulínovej molekuly, ktoré obsahujú paratop, vrátane tých častí, ktoré sú v danej vednej oblasti známe ako Fab, Fab’, F(ab‘)₂ a F(v) a taktiež sa označujú ako fragmenty protilátky.

31116/H

V ďalšej uprednostnenej časti sa vo vynáleze posudzuje skrátená molekula imunoglobulínu pozostávajúca z Fab fragmentu odvodeného z monoklonálnej protilátky opísanej v tomto vynáleze. Fab fragment, ktorý neobsahuje Fc receptor, je rozpustný a poskytuje terapeutické výhody vyplývajúce z jeho sérového polčasu a diagnostické výhody v spôsoboch použitia rozpustného Fab fragmentu. Príprava rozpustného Fab fragmentu je v imunologickej vednej oblasti všeobecne známa a môže sa vykonať rôznymi spôsobmi.

Fab a F(ab‘)₂ časti (fragmenty) protilátok sa pripravia spôsobmi, ktoré sú veľmi dobre známe, napríklad proteolytickým štiepením v podstate intaktných protilátok enzýmami papaínom v prípade Fab a pepsínom v prípade F(ab‘)₂. Napríklad USA patent č. 4 342 566 pre Teofilopolousa a Dixona. Takisto dobre známe sú Fab’ časti protilátky, ktoré sa tvoria z F(ab‘)₂ častí následnou redukciou disulfidových väzieb viažucich časti dvoch ťažkých reťazcov, a to napríklad merkaptoetanolom, a následnou alkyláciou výsledného proteínmerkaptanu s reagentom ako je jódacetamid. Protilátka obsahujúca intaktné imunoglobulínové molekuly je uprednostnená a používa sa tu ako ilustračný príklad.

Slovné spojenie „monoklonálna protilátka,, v jej rôznych gramatických formách označuje populáciu molekúl protilátky, ktorá obsahuje iba jeden druh protilátkového väzbového miesta schopného imunologickej reakcie s jedinečným epitopom. Monoklonálna protilátka má v typickom prípade jedinú väzbovú aktivitu na ľubovoľný epitop s ktorým imunitné reaguje. Monoklonálna protilátka môže teda obsahovať molekulu protilátky, ktorá má početné protilátkové väzbové miesta, avšak každé je imunošpecifické na iný epitop, ako napríklad monoklonálna protilátka s dvojitou špecifitou.

Monoklonálna protilátka typicky pozostáva z protilátok produkovaných klonmi z jednej bunky nazývanými hybridómová bunka, ktorá sekretuje (produkuje) iba jeden druh molekuly protilátky. Hybridómová bunka sa vytvára fúziou bunky produkujúcej protilátky a bunky myelómu, alebo inej samostatne sa replikujúcej bunkovej línie. Prípravu takýchto protilátok prvýkrát opísali

31116/H

Kohler a Milstein, Náture, 256:495-497 (1975), tento opis sa tu nachádza vo forme citácie. Ďalšie metódy opísal Zola, Monoclonal antibodies: A manual of techniques, CRC Press, Inc. (1987). V supernatante línie hybridómovej bunky sa potom môže sledovať prítomnosť molekúl protilátok, ktoré imunitné reagujú s α_νβδ, a ktoré inhibujú väzbu α_νβδ k prirodzeným ligandom.

V krátkosti, na vytvorenie hybridómu, z ktorého sa produkujú monoklonálne protilátky, musí myelóm alebo iná samostatne sa replikujúca bunková línia splynúť s lymfocytmi získanými zo sleziny cicavca hyperimunizovaného s α_νβδ zdrojom.

Uprednostňuje sa, aby myelómová bunková línia použitá na prípravu hybridómu bola z toho istého druhu ako sú leukocyty. V typickom prípade je uprednostneným cicavcom myš, kmeň 129 GIX⁺. Myšie myelómy vhodné na použitie v predkladanom vynáleze zahrňujú bunkové línie P3X63-Ag8.653 a Sp2/0-Ag14, ktoré sú citlivé na hypoxantín, aminopterín a tymidín (HAT), a ktoré sú dostupné z American Type Culture Collection, Rockville, MD, pod označením CRL 1580 v prvom prípade a CRL 1581 v druhom prípade.

Fúzia buniek sleziny s myelómovými bunkami sa zvyčajne uskutočňuje za využitia polyetylénglykolu (PEG) 1500. Fúziou vzniknuté hybridy sa selektujú pomocou ich citlivosti voči HAT. Hybridómy produkujúce monoklonálnu protilátku tohto vynálezu sa identifikujú s použitím ELISA testu (enzýme linked immunosorbent assay), ktorého modifikácia sa opisuje v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Monoklonálna protilátka predkladaného vynálezu sa môže taktiež produkovať iniciáciou monoklonálnej hybridómovej kultúry zahrňujúcej výživné médium obsahujúce hybridom, ktorý sekretuje molekuly protilátok s vhodnou špecifitou. Kultúra sa udržuje v takých podmienkach a počas takého časového obdobia, ktoré je dostačujúce na sekréciu molekúl protilátok hybridómom do média. Médium obsahujúce protilátku sa pozbiera a molekuly protilátok sa môžu potom izolovať dobre známymi postupmi.

31116/H

Médiá vhodné na prípravu týchto kompozícií sú jednak dobre známe v tejto vednej oblasti a sú taktiež komerčne dostupné a zahrňujú syntetické kultivačné médiá, imbrédne myši a podobne. Typickým príkladom syntetického média je Dulbeccovo minimálne základné médium (DMEM; Dulbecco a kol., Virol., 8:396, 1959) doplnené s 4,5 g/l glukózy, 20 mM glutamínom a 20% zárodočným teľacím sérom. Typickým príkladom imbrédnych myší je kmeň Balb/c.

Dobre sú známe i iné spôsoby produkcie monoklonálnych protilátok, hybridómovej bunky alebo hybridómovej bunkovej kultúry. Viď napríklad spôsob izolácie monoklonálnych protilátok z imunologických postupov tak, ako ich opísali Sastry a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:5728-5732 (1989) a Huse a kol., Science, 246:1275-1281 (1989).

V tomto vynáleze sa taktiež posudzuje hybridómová bunka a kultúry obsahujúce hybridómovú bunku, ktoré produkujú monoklonálnu protilátku podľa tohto vynálezu. Obzvlášť uprednostnenou je hybridómová bunková línia, ktorá sekretuje monoklonálnu protilátku mAb P1F6 a mAb P5H9, príprava ktorých sa opisuje v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Vynález v jednej svojej časti posudzuje monoklonálnu protilátku, ktorá má imunologické reakčné vlastnosti ako mAb P1F6 alebo mAb P5H9.

Bez nadbytočných experimentov je možné stanoviť, či má monoklonálna protilátka tú istú (t.j. ekvivalentnú) špecifitu (imunologické reakčné vlastnosti) ako monoklonálna protilátka podľa tohto vynálezu tým, že sa zistí, či prvá monoklonálna protilátka zabráni naviazaniu druhej monoklonálnej protilátky k dopredu vybranej cieľovej molekule. Ak testovaná monoklonálna protilátka súťaží s monoklonálnou protilátkou predkladaného vynálezu, čo sa prejaví znížením viazania monoklonálnej protilátky predkladaného vynálezu v štandardnom kompetitívnom stanovení naväzovania k cieľovej molekule, ktorá sa nachádza na pevnom nosiči, potom je pravdepodobné, že tieto dve monoklonálne protilátky sa viažu k tomu istému, alebo blízko príbuznému epitopu.

31116/H

Ďalší spôsob stanovenia, či má monoklonálna protilátka špecifitu ako monoklonálne protilátky predkladaného vynálezu, spočíva v predinkubovaní monoklonálnej protilátky tohto vynálezu s cieľovou molekulou, s ktorou normálne reaguje a následným pridaním testovanej monoklonálnej protilátky, čím sa zistí, či došlo k inhibícii schopností testovanej monoklonálnej protilátky viazať sa k cieľovej molekule. Ak je väzba testovanej monoklonálnej protilátky inhibovaná, potom má pravdepodobne tú istú, alebo funkčne ekvivalentnú, epitopovú špecifitu ako monoklonálna protilátka predkladaného vynálezu.

Ďalším spôsobom ako stanoviť, či má monoklonálna protilátka špecifitu monoklonálnej protilátky predkladaného vynálezu spočíva v zistení aminokyselinovej sekvencie CDR oblastí študovaných protilátok. Molekuly protilátok, ktoré majú zhodné, alebo funkčne ekvivalentné sekvencie aminokyselinových zvyškov vo svojich CDR oblastiach, majú tú istú väzbovú špecifitu. Spôsoby sekvenovania polypeptidov sú v tomto vednom odbore známe.

Imunitná špecifičnosť protilátky, jej schopnosť viazať sa k cieľovej molekule, ako i sprievodná afinita protilátky kepitopu sú určené epitopom, s ktorým protilátka imunitné reaguje. Špecifičnosť epitopu je aspoň čiastočne určená sekvenciou aminokyselinových zvyškov variabilnej oblasti ťažkých reťazcov imunoglobulínu (protilátky) a čiastočne sekvenciou aminokyselinových zvyškov variabilnej oblasti ľahkého reťazca.

Použitie pojmu „má väzbovú špecifitu,, naznačuje, že ekvivalentné monoklonálne protilátky vykazujú rovnaké alebo podobné vlastnosti týkajúce sa imunitnej reaktivity (viazania) a súťažia o väzbu k dopredu vybranej cieľovej molekule.

Monoklonálne protilátky ľudského pôvodu poskytujú osobitné výhody oproti myším monoklonálnym protilátkam, obzvlášť preto, že sa môžu terapeuticky použiť na ľudí. Konkrétne, ľudské protilátky sa neodstraňujú z obehu tak rýchlo ako „cudzie,, antigény. Navyše ľudské protilátky neaktivujú imunitný systém tým istým spôsobom ako cudzie antigény a cudzie protilátky. Spôsoby prípravy protilátok „ľudského pôvodu,, sú vo všeobecnosti dobre

31116/H známe v tejto vednej oblasti a môžu sa ľahko použiť na prípravu protilátok predkladaného vynálezu.

Takže vo vynáleze sa v jednej časti posudzuje monoklonálna protilátka tohto vynálezu, ktorá získava ľudský pôvod štiepením, čím sa zavádzajú zložky ľudského imunitného systému bez podstatného zasahovania do schopnosti protilátky viazať antigén.

3) ayfc-špecifické mimetické látky

Predkladaný vynález dokumentuje, že α_νβδ antagonisty sa vo všeobecnosti môžu použiť v predkladanom vynáleze, pričom títo antagonisty môžu zahrňovať polypeptidy, protilátky a iné molekuly označené ako „mimetické látky,,, ktoré majú schopnosť zasahovať do funkcie α_νβ5. Obzvlášť sú preferovaní antagonisty, ktorí špecificky zasahujú do α_νβδ funkcie, a pri tom nezasahujú do funkcie ostatných integrínov.

V tejto súvislosti sa chápe, že rôznorodé reagenty môžu byť vhodné na použitie v predkladaných spôsoboch, pokiaľ tieto reagenty majú nevyhnutnú biologickú aktivitu. Tieto reagenty sa vo všeobecnosti označujú ako mimetické látky, pretože majú schopnosť napodobniť α_νβ₅ ligand, ktorý sa zúčastňuje funkčnej interakcie receptora a ligandu, čím blokujú väzbovú doménu ligandu v receptore a takto zasahujú do jeho normálnej funkcie (t.j. inhibujú ju). V alternatívnej časti môže α_νβδ antagonista napodobňovať skôr receptor ako jeho ligand.

Mimetickou látkou je akákoľvek molekula, ktorá vykazuje vyššie opísané vlastnosti, okrem molekuly protilátky alebo peptidu, ktorý je odvodený z ligandu. Môže to byť syntetický peptid, analóg alebo derivát peptidu, zlúčenina, ktorá má tvar ako väzbové miesto vyššie opísanej väzbovej domény, a ktorú predstavuje organická mimetické molekula alebo iná molekula.

Uprednostnenou mimetickou látkou tohto vynálezu je organická molekula, a preto sa označuje ako organická mimetické látka. Obzvlášť

31116/H uprednostnenými organickými mimetickými molekulami, ktoré fungujú ako α_νβ₅ antagonisty tým, že napodobňujú ligand α_νβ5, sú zlúčeniny 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 a 18 tak, ako sa opisuje v príklade 10.

Návrh α_νβδ napodobňujúcej mimetickej látky sa môže vykonať ktorýmkoľvek z početných spôsobov štrukturálnej analýzy, známych v tejto vednej oblasti, ktoré sú určené pre cielený návrh liečivých látok, vrátane molekulového modelovania, dvojrozmernej nukleárnej magnetickej rezonancie (2-D NMR), rôntgenovej kryštalografie, náhodného skúmania databáz peptidov, peptidových analógov alebo iných chemických polymérov alebo zlúčenín, ako i podobných metodík určených na cielený návrh liečivých látok.

Z hľadiska rozsiahlych štrukturálnych dôkazov uvedených v predkladanej špecifikácii sa ukazuje, že α_νβδ antagonistom môže byť fúzny polypeptid (napr. fúzny polypeptid MMP-2), malý polypeptid, cyklický peptid, derivatizovaný peptid, organická mimetická molekula, alebo monoklonálna protilátka. Molekuly týchto α_νβδ antagonistov predstavujú výrazne odlišné chemické štruktúry, ktoré majú spoločnú vlastnosť spočívajúcu v selektívnej inhibícii α_νβ₅, pričom štruktúra predmetného α_νβδ antagonistu vhodného pre predkladané spôsoby sa nemusí obmedzovať na spomenuté molekuly, ale zahrňuje akúkoľvek α_νβ₅ mimetickú látku tak, ako sa tu definuje.

F) Spôsoby identifikácie ayfe antagonistov

Vynález taktiež opisuje spôsoby identifikácie potenciálnych α_νβδ antagonistov vhodných na použitie podľa predkladaných spôsobov. Pri týchto spôsoboch stanovenia sa u potenciálnych molekúl hodnotí ich schopnosť inhibovať väzbu α_νβδ k prirodzeným ligandom a ďalej sa hodnotí ich schopnosť inhibície angiogenézy v tkanive.

V prvom stanovení sa angiogenéza meria na modeli kuracej chorioalantoickej membrány (CAM), ktorý sa označuje ako CAM test. CAM test detailne opísali iní a odvtedy sa používa na meranie angiogenézy a

31116/H neovaskularizácie v nádorových tkanivách. Napríklad práce Ausprunk a kol., Am. J. Pathol., 79:597-618 (1975) a Ossonski a kol., Cancer Res., 40:23002309 (1980).

CAM test je dobre známy model stanovenia angiogenézy in vivo, pretože pri ňom dochádza k neovaskularizácii celého tkaniva. Vlastné krvné cievy kuracieho embrya prerastajú do CAM alebo do tkaniva, ktoré rastie na CAM.

Ako sa tu dokazuje, CAM test dokumentuje inhibíciu neovaskularizácie na základe množstva a rozsahu rastu nových ciev. Ďalej je ľahké sledovať rast akéhokoľvek tkaniva, ktoré sa transplantovalo na CAM, akým je napríklad nádorové tkanivo. A nakoniec test je obzvlášť vhodný preto, že má vnútornú kontrolu toxicity v testovacom systéme. Kuracie embryo sa vystavuje pôsobeniu ľubovoľného testovaného reagentu. Zdravotný stav embrya je teda indikátorom toxicity.

Druhé stanovenie, ktorým sa meria angiogenéza, je in vivo model králičích očí, ktorý sa označuje ako test králičích očí. Test králičích očí detailne opísali iní a odvtedy sa používa na meranie angiogenézy a neovaskularizácie v prítomnosti inhibítorov angiogenézy, ako je talidomid. D’Amato a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4082-4085 (1994).

Test králičích očí je dobre známy model stanovenia angiogenézy in vivo, pretože proces neovaskularizácie, ku ktorému dochádza v prípade králičích krvných ciev rastúcich z okraja rohovky dovnútra rohovky, sa cez prirodzene priehľadnú rohovku oka ľahko pozoruje. Navyše sa v časovej závislosti môže ľahko sledovať rozsah, ako aj množstvo stimulácie alebo inhibície neovaskularizácie alebo taktiež regresie neovaskularizácie.

V konečnom dôsledku sa králik vystavuje ľubovoľnému testovanému reagentu a zdravotný stav králika je teda indikátorom toxicity testovaného reagentu.

Tretím stanovením sa meria inhibícia priameho viazania prirodzeného ligandu, vitronektínu, k α_νβδ a táto uprednostnená časť patentu je podrobne opísaná v Príkladoch uskutočnenia vynálezu. Týmto stanovením sa zvyčajne

31116/H meria stupeň inhibície priameho viazania prirodzeného ligandu, vitronektínu, k α_νβδ na pevnom nosiči pomocou ELISA testu, pričom táto inhibícia sa deje c^s-špecifickou inhibíciou.

Takže toto stanovenie sa môže použiť na identifikáciu zlúčenín, ktoré vykazujú špecifitu pre α_νβδ a neinhibujú väzbu prirodzených ligandov k iným integrínom. Stanovenie špecifity sa vykonáva tak, že sa sledujú dva paralelné ELISA testy, kde sa v oddelených testovacích komôrkach sleduje schopnosť α_νβδ, ako i ostatných integrínov, viazať prirodzený ligand a u potenciálne aktívnej zlúčeniny sa sleduje schopnosť inhibovať viazanie vybraných ligandov na jednotlivé integríny. Uprednostnené postupy stanovenia sa opisujú v Príkladoch uskutočnenia vynálezu.

G) Priemyselný výrobok

Vynález taktiež uvažuje s priemyselným výrobkom, ktorým je označený kontajner poskytujúci α_νβδ antagonistu tohto vynálezu. Priemyselný výrobok zahrňuje obalový materiál a farmaceutické činidlo, ktoré sa nachádza vnútri obalového materiálu.

Farmaceutickým činidlom vyrábaného produktu je ktorýkoľvek α_νβδ antagonista predkladaného vynálezu formulovaný do farmaceutický prijateľnej formy tak, ako sa tu opisuje podľa zverejnených indikácií. Vyrábaný produkt obsahuje také množstvo farmaceutického činidla, ktoré je dostatočné na liečbu stavu, ktorý sa tu opísal, buď v jednej alebo niekoľkých dávkach.

Súčasťou obalového materiálu je označenie, ktoré udáva použitie farmaceutického činidla, ktoré je tam obsiahnuté, napr. na liečbu stavov, ktoré sa zlepšujú inhibíciou angiogenézy, a podobných stavov, ktoré sa tu opísali. Označenie môže ďalej zahrňovať návod na použitie a príbuzné informácie, v prípade že si to bude vyžadovať marketing. Obalový materiál môže zahrňovať nádobku(y) na uskladnenie farmaceutického činidla.

31116/H

Termín obalový materiál, ktorý sa tu používa, označuje materiál ako je sklo, umelá hmota, papier, fólia a podobne, ktorý je schopný zachovať stabilitu farmaceutického činidla. Takže napríklad, obalovým materiálom môžu byť plastické alebo sklené liekovky, laminované vrecká a podobné kontajnery používané na farmaceutický kompozit obsahujúci farmaceutické činidlo.

V uprednostnených častiach obalový materiál obsahuje oznámenie, na ktorom je konkrétny opis obsahu vyrábaného produktu a použitie farmaceutického činidla, ktoré sa tam nachádza.

31116/H

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady týkajúce sa tohto vynálezu sú názornými príkladmi a nemali by sa samozrejme považovať za príklady špecificky limitujúce vynález. Navyše, také variácie vynálezu, ktoré sú známe teraz, alebo sa vyvinú neskôr, a ktoré budú v rámci vedomostí osoby zručnej v danej oblasti, sa majú považovať za variácie spadajúce do rámca predkladaného vynálezu, na ktorý sa tu uplatňuje nárok.

Príklad 1

Príprava a^s-špecifických protilátok

Monoklonálne protilátky P1F6 a P5H9 sa produkovali s použitím štandardných hybridómových spôsobov imunizáciou RBF/DnJ myší s pľúcnymi karcinómovými bunkami A549 tak, ako to opísali vo svojej práci Wayner a koľ, J. Celí Biol., 113:919-929 (1991), ktorá sa tu zverejňuje vo forme citácie. Z imunizovaných myší sa odobrali sleziny a vykonala sa fúzia s Ns-1/FOX-NY myelómovými bunkami. Hybridómy, ktoré produkovali protilátku proti vitronektínovým receptorom karcinómových buniek sa vyhľadávali pomocou špecifickej inhibície adhézie UCLA-P3 k povrchom s naviazaným vitronektínom tak, ako to opísali Wayner a kol. a klonovali sa pri hraničnom riedení na vrstvách tymocytov.

Ukázalo sa, že obe monoklonálne protilátky, tak P1F6, ako i P5H9, špecificky imunitné reagujú s α_νβδ komplexom a zároveň nereagujú s a_v podjednotkou, s βδ podjednotkou alebo s ostatnými integrínmi. Monoklonálna protilátka P1F6 je komerčne dostupná z Gibco BRL (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) a P5H9 monoklonálna protilátka je dostupná od Dr. E. Waynera z Fred Hutchinson Cancer Research Inštitúte, Seattle, WA.

Iné α_νβδ monoklonálne protilátky vhodné na použitie v tomto vynáleze sa odvodzujú a charakterizujú podobne, ako sa tu opísalo. Navyše, α_νβδ monoklonálne protilátky sa tvoria fúziou slezín izolovaných z myší, ktoré sa

31116/H imunizovali s α_νβδ receptorom buď v neprečistenej alebo v purifikovanej forme. Purifikácia α_νβδ je dobre známy postup pre osobu so základnými zručnosťami v oblasti biológie integrínov a opísali ju taktiež Smith a koľ, J. Biol. Chem., 265:11008-11013 (1990), pričom táto práca sa tu zverejňuje vo forme citácie. Po purifikácii sa izolovaný receptor upravuje ako imunogén pre imunizáciu myší, ako sa opisuje v časti E2 a pripravuje sa v podstate tak, ako to opísali Kohler a Milstein, Náture, 256:495-497 (1975), pričom táto práca sa tu zverejňuje vo forme citácie. Schopnosť reagovať s imunogénom sa hľadá vo výsledných hybridómových klonoch, ktoré sa potom charakterizujú tak, ako sa opisuje v nasledujúcich príkladoch uskutočnenia vynálezu.

Príklad 2

Charakterizovanie špecifity anti-g^s monoklonálnych protilátok a ich použitie na mapovanie lokálnej expresie ctyfe v tkanive

A) Špecifičnosť voči vitronektínu

Wayner a koľ, J. Celí Biol., 113:919-929 (1991) dokázali, že monoklonálna protilátka P5H9 pripravená v príklade 1, blokuje pripojenie nádorových buniek UCLA-P3 k vitronektínu, zatiaľ čo neovplyvňuje bunkové pripojenie ku kolagénu alebo fibronektínu. Ukázalo sa, že tieto bunky obsahujú iba α_νβ₅ vitronektínový receptor, ale neobsahujú receptor s α_νβ3 špecifitou, pričom imunoprecipitáciou pri neredukujúcich podmienkach sa získal heterodimér pozostávajúci z a reťazca (160 kD) a β reťazca (95 kD). Taktiež sa ukázalo, že α_νβδ receptor, detegovaný pomocou P5H9, sprostredkuje adhéziu melanómových buniek M21 a nádorových buniek H2981 k vitronektínu. Monoklonálna protilátka P1F6 má taký istý imunoreaktívny profil.

B) Imunofluorescencia s protilátkami proti integrínovému receptora

Počas hojenia rany exprimujú bazálne membrány krvných ciev niekoľko adhezívnych proteínov vrátane von Willebrandovho faktoru, fibronektínu a

31116/H fibrínu. Okrem toho sa na povrchu buniek hladkého svalstva a endoteliálnych buniek exprimuje niekoľko členov z integrínovej rodiny adhéznych receptorov. Napríklad práce Cheresh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6471 (1987); Janat a kol., J. Celí Physiol., 151:588 (1992); a Cheng a kol., J. Celí Physiol., 139:275 (1989).

Pasqualini a kol., J. Celí Sci., 105:101-111 (1993) okrem štruktúry a funkcie β₅ podjednotky integrínu opísali rozmiestnenie tejto podjednotky v tkanive mapovaním pomocou iných monoklonálnych protilátok proti βδ, pričom táto práca sa tu zverejňuje vo forme citácie.

Vyššie opísané monoklonálne protilátky špecifické proti β₅, ktoré sú podobné protilátkam opísaným v príklade 1 sa sekretovali bunkami hybridómov, ktoré sa pripravili s použitím slezinových buniek myší, ktoré sa imunizovali s bunkovou líniou A549 ľudského karcinómu pľúc. Hybridómy sa vyberali pomocou pozitívneho povrchového značenia buniek A549 so supernatantom hybridómovej kultúry a s imunoprecipitáciou α_νβ₅ komplexov z povrchovo značených A549 extraktov. Monoklonálne protilátky sa potom použili na mapovanie tkanivového rozmiestnenia β₅ podjednotky v normálnom ľudskom týmuse, pokožke a obličke. Štyri mikróny hrubé rezy sa rezali zo zmrazeného tkaniva na kryomikrotóme a následne sa značili komplexom streptavidín-biotínimunoperoxidáza prítomnom na protilátkach špecifických pre β₅ integríny tak, ako to opísali v citácii Pasqualini a kol.

Značenie týmusových rezov ukázalo rozmiestnenie β₅ na krvných cievach, Hassalových telieskach, na bunkách kortikálnej a medulárnej stromy a na bazálnych membránach. Rezy pokožkou ukázali rozmiestnenie β₅ na bazálnej vrstve epidermis a na stenách niektorých kožných krvných ciev a rezy obličkou poukázali na značenie glomerulárnych oblastí, juxtaglomerulárneho aparátu, proximálnych stočených kanálikov a zberných kanálikov. Takže distribúcia βδ je heterogénna, spojená s rôznymi bunkovými typmi, a čo je dôležitejšie, zahrňuje i kapilárne endoteliálne bunky, ktorých značenie bolo zhodné so značením kultivovaných endoteliálnych buniek umbilikálnej cievy.

31116/H

C) Imunofluorecsencia ľudského retinálneho tkaniva pacientov s očným ochorením pomocou protilátok proti integrínovému receptora

Očná neovaskularizácia je najbežnejšou patologickou zmenou pozorovanou u drvivej väčšiny očných ochorení, ktoré vyústia do katastrofickej straty zraku. Rast nových krvných ciev z dovtedy existujúcich ciev cievovky, sietnice alebo z paralimbálnych ciev, môže viesť k edému, hemorágii alebo k tvorbe fibrovaskulárnej membrány, výsledkom čoho je porušenie normálnych anatomických vzťahov v oku a následná strata normálnej funkcie videnia.

Za fyziologických podmienok je angiogenéza vysoko regulovaným procesom a ukázalo sa, že je aktivovaná špecifickými angiogénnymi cytokínmi, ako je rastový faktor bázických fibroblastov (bFGF) a faktor nekrotizujúci tumory-α (TNF-a). Ako opísali Brooks a kol., Science, 264:569-571 (1994) monoklonálne protilátky proti a_vp3 blokujú angiogenézu indukovanú bFGF, ako aj TNF-α v modelových systémoch, ako je napríklad CAM model. Ako sa opisuje v príkladoch 4-6 monoklonálne protilátky proti α_νβδ blokujú samostatnú cestu angiogenézy, a to špecificky tú, ktorá je indukovaná rastovým faktorom vaskulárnych endotélií (VEGF), transformujúcim rastovým faktorom-α (TGF-a) a epidermálnym rastovým faktorom (EGF).

Takže, ako sa tu opisuje v súvislosti s predkladaným vynálezom, dve cesty angiogenézy sú definované odlišnými integrínmi α_νβ3 a α_νβδ. Kvôli skúmaniu expresie a úlohy týchto integrínov pri očnom ochorení ľudí, sa získali epiretinálne neovaskulárne membrány a subretinálne neovaskulárne membrány spolu pri vitrektómii z pacientov s proliferatívnou diabetickou retinopatiou (PDR). Títo pacienti sa sledovali klinicky a vybrali sa na histologické zhodnotenie na základe prítomnosti aktívnej, proliferatívnej neovaskulárnej choroby zdokumentovanej klinickými skúškami a fluoresceínovou oftalmoangiografiou. Získané tkanivo sa okamžite zmrazilo v Tissue Tek kryokonzervátore a pripravili sa z neho rezy.

31116/H

Keď sa tkanivá týchto pacientov skúmali imunofluorescenciou, krvné cievy boli pozitívne na α_νβ3 integrín, ako sa zistilo imunoreaktivitou s myšou monoklonálnou protilátkou LM609. Rozmiestnenie integrínu sa javilo byť obmedzené na krvné cievy a prekrývalo sa so značením markera krvných ciev, von Willebrandovho faktora, ktorý sa zmapoval pomocou králičej protilátky proti tomuto faktoru. Imunoreaktívne miesta sa zviditeľnili buď anti-myším imunoglobulínom s konjugovaným rodamínom alebo anti-králičím imunoglobulínom s konjugovaným fluoresceínom, pričom použitie oboch z nich umožnilo súčasnú lokalizáciu integrínu a protilátok špecifických pre krvné cievy.

Vzorky získané z normálnych očí alebo od pacientov s atrofickými membránami bez aktívne proliferujúcich krvných ciev boli pri imunofluorescenčnej analýze negatívne na prítomnosť α_νβ₃ integrínu.

Paralelne sa v tých istých tkanivách imunohistochemicky analyzovala prítomnosť a rozmiestnenie α_νβδ s pomocou anti-a_vp₅ monoklonálnej protilátky P1F6, pripravenej v príklade 1. Značenie ukázalo, že α_νβδ sa nachádzal na krvných cievach, pričom jeho prítomnosť sa prekrývala s rozmiestnením von Willebrandovho faktora. Avšak tkanivo neobsahujúce cievy taktiež vykazovalo obmedzenú fluorescenciu sP1F6 protilátkou, čo naznačuje širšiu distribúciu α_νβ5, na rozdiel od α_νβ₃, ktorý bol obmedzený na krvné cievy.

Keď sa porovnalo imunofluorescenčné značenie membrán s pomocou protilátky LM609 pre α_νβ₃ a P1F6 pre α_νβ5, spôsob značenia stien krvných ciev bol prakticky identický, čo naznačuje, že oba receptory, α_νβ₃, ako aj α_νβ₅, sú umiestnené na povrchu novo vznikajúcich ľudských krvných ciev prítomných pri neovaskulárnej očnej chorobe, ako je diabetická retinopatia.

Výsledky, ktoré sa tu opísali teda poukazujú na to, že α_νβ₅ integrínový receptor sa selektívne exprimuje v špecifických typoch tkaniva, v ktorých dochádza k angiogenéze tak, ako je to vidno na neovaskulárnych membránach pacientov, ktorí majú aktívnu, proliferatívnu neovaskulárnu chorobu. Preto tieto tkanivá, ako aj tkanivá, ktoré sa vystavili účinku jednotlivých rastových faktorov,

31116/H poskytujú ideálne ciele pre terapeutický aspekt tohto vynálezu, ako sa opisuje nižšie v príkladoch 4-6.

Príklad 3

Príprava syntetických peptidov

a) Postup syntézy

Cyklické polypeptidy používané pri aplikácii spôsobov podľa tohto vynálezu sa syntetizovali s použitím štandardného postupu syntézy na pevnom nosiči tak, ako to opísal napríklad Merrifíeld, Adv. Enzymol., 32:221-296 (1969) a Fields, G.B. a Noble, R.L., Int. J. Peptide Protein Res., 35:161-214 (1990).

gramy (g) BOC-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OMe (Sekvencia č. 1) sa najprv rozpustili v 60 mililitroch (ml) metanolu, do ktorého sa pridalo 1,5 ml 2 N roztoku hydroxidu sodného, čím sa vytvorila zmes. Táto zmes sa potom miešala magnetickým miešadlom 3 hodiny pri teplote 20 °C (20C). Po odparení sa zvyšok rozmiešal vo vode, okyslil sa na pH 3 zriedenou HCI a extrahoval sa etylacetátom. Extrakt sa sušil cez Na₂SO₄, opäť sa odparil a výsledný BOCArg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (Sekvencia č. 2) sa potom miešal magnetickým miešadlom 2 hodiny pri teplote 20 °C s 20 ml 2 N HCI v dioxáne. Výsledná zmes sa odparila, čím sa získal H-Arg-Gly-Asp-D-Phe-Val-OH (Sekvencia č. 3), ktorý sa následne rozpustil v zmesi 1800 ml dichlórmetánu a 200 ml dimetylformamidu (DMF) s následným ochladením na 0C. Potom sa na magnetickom miešadle postupne pridalo 0,5 g dicyklohexylkarbodiimidu (DCCI), 0,3 g 1-hydroxybenzotriazolu (HOBt) a 0,23 ml N-metylmorfolínu.

Výsledná zmes sa miešala na magnetickom miešadle ďalších 24 hodín pri teplote 0 °C a potom pri teplote 20 °C ďalších 48 hodín. Roztok sa skoncentroval a soli sa odstránili pôsobením ionexu zmiešaného typu (mixbed). Potom, čo sa ionex odstránil filtráciou, vyčírený roztok sa odparil a zvyšok sa purifikoval pomocou chromatografie, pričom sa získal cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-Val)(v jednopísmenovom kóde taktiež uvádzaný ako c-RGDfV) (sekvencia

31116/H

č. 4). Malé písmená v peptide označujú D formu aminokyseliny a nie L formu, ktorá sa označuje veľkými písmenami.

Cyklický peptid, ktorý sa použil ako kontrola, cyklo(Arg-Ala-Asp-D-PheVal)(v jednopísmenovom kóde taktiež uvádzaný ako c-RADfV) (sekvencia č. 5) sa pripravil tak, ako sa vyššie opísalo. Už skôr sa ukázalo, že cyklický peptid cRADfV (sekvencia č. 5) inhibuje väzbu fibrinogénu k integrínu <x_vp3 a neinhibuje väzbu fibrinogénu k integrínu anbp3 alebo αδβΊ (Pfaff, a kol., J. Biol. Chem., 269:20233-20238, 1994).

Iné peptidy, ktoré špecificky inhibujú väzbu prirodzených ligandov k α_νβ₅ sa pripravujú podobne a ich špecifičnosť a rozsah aktivity sa testuje tak, ako sa opisuje v nasledujúcich príkladoch. Patria medzi ne nasledujúce peptidy, ktoré sa získali analogickým spôsobom: cyklo(Gly-D-Arg-Gly-Asp-Phe-Val) (sekvencia č. 6) a cyklo(Arg-Gly-Asp-Phe-D-Val) (sekvencia č. 7). Peptidy so sekvenciou aminokyselinových zvyškov Tyr-Thr-Ala-Glu-Cys-Lys-Pro-GIn-ValThr-Arg-Gly-Asp-Val-Phe (sekvencia č. 8) a cyklo(Arg-Gly-Asp-D-Phe-NMeVal) (sekvencia č. 9) sa taktiež pripravili synteticky. V sekvencii č. 9 predpona „Me„ v MeVal označuje, že valín sa v pozícii 6 modifikoval metyláciou na alfa aminodusíku v amidovej väzbe valínového zvyšku.

b) Alternatívne postupy syntézy

i) Syntéza cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) vo forme TFA soli

Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal-ONa sa syntetizoval na pevnom nosiči pomocou postupu Merrifieldovho typu, a to postupným pridávaním NMeVal, DPhe, Asp(OBut), Gly a Fmoc-Arg(Mtr) k 4hydroxymetylfenoxymetyl-polystyrénovému nosiču (nosič typu Wang) (obvyklé spôsoby peptidovej syntézy Merrifieldovho typu sa aplikujú tak, ako sa opísalo v Houben-Weyl, 1.c., zv. 15/11, str. 1-806 (1974). Polystyrénový nosič ako i prekurzory aminokyselinových zvyškov sú komerčne dostupné od chemických firiem Aldrich, Sigma alebo Fluka). Po ukončení postupného pridávania aminokyselinových zvyškov sa nosič odstráni z peptidu zmesou

31116/H

TFA/dichlórmetán (1:1), čím sa získa produkt Fmoc-Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)DPhe-NMeVal-OH. Fmoc skupina sa potom odstráni zmesou piperidínu/DMF (1:1), Čím sa získa hrubá frakcia obsahujúca prekurzor Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)DPhe-NMeVal-OH, ktorý sa potom purifikuje obvyklým spôsobom pomocou HPLC.

Kvôli dosiahnutiu cyklizácie sa roztok 0,6 g Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)DPhe-NMeVal-OH (hore syntetizovaný) v 15 ml DMF (dimetylformamid; Aldrich) rozriedil s 85 ml dichlórmetánu (Aldrich) a pridalo sa 50 mg NaHCO₃. Po ochladení v zmesi suchý ľad/acetón sa pridalo 40 μΙ difenylfosforylazidu (Aldrich). Roztok sa nechal stáť pri laboratórnej teplote 16 hodín a potom sa skoncentroval. Koncentrát sa delil gólovou filtráciou (v zmesi izopropanol/voda 8:2 na kolóne Sephadex G10) a potom sa purifikoval pomocou HPLC obvyklým spôsobom. Pôsobením zmesou TFA (kyselina trifluóroctová)/H20 (98:2) sa získal cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x TFA, ktorý sa potom purifikoval pomocou HPLC obvyklým spôsobom; RT=19,5; FAB MS (M+H): 589.

ii) Syntéza „vnútornej soli„

TFA soľ sa z vyššie vytvoreného cyklického peptidu odstránila rozsuspendovaním cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x TFA vo vode a následným odparením vo vákuu, čím sa odstránila TFA. Vytvorený cyklický peptid sa označuje ako „vnútorná soľ,, a opisuje sa ako cyklo(Arg-Gly-AspDPhe-NMeVal). Pojem „vnútorná soľ,, sa používa preto, že cyklický peptid obsahuje dva opačne nabité zvyšky, ktoré sú si navzájom elektrickou protiváhou, čím sa celkovo vytvorí nenabitá molekula. Jeden z nabitých zvyškov obsahuje kyslú zložku a druhý nabitý zvyšok obsahuje zásaditú zložku. Keď je kyslá zložka a zásaditá zložka vzájomne v tesnej blízkosti, kyslej zložke môže odobrať protón amino- zložka, čím sa vytvorí karboxy/amóniová soľ s celkovým neutrálnym nábojom.

iii) Získanie cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x HCI pôsobením HCI

31116/H mg cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) sa rozpustilo v 0,01 M HCI päť až šesťkrát a po každom rozpustení sa roztok lyofilizoval. Následnou purifikáciou pomocou HPLC sa získal cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x HCI; FAB-MS (M+H): 589.

iv) Získanie cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) x MeSChH pôsobením kyseliny metánsulfónovej mg cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) sa rozpustilo v 0,01 M MeSOaH (kyselina metánsulfónová) päť až šesťkrát a po každom rozpustení sa roztok lyofilizoval. Následnou purifikáciou pomocou HPLC sa získal cyklo(Arg-Gly-AspDPhe-NMeVal) x MeSO₃H;’RT=17,8; FAB-MS (M+H): 589.

Alternatívne spôsoby cyklizácie zahrňujú derivatizáciu bočných reťazcov necyklického peptidového prekurzoru so sulfhydrylovými zložkami a po jeho vystavení pH hodnotám mierne vyšším, ako je fyziologické pH (7.5), vytvoria tieto zložky disulfidové väzby s inými sulfhydrylovými skupinami molekuly, čím sa vytvorí cyklický peptid. Navyše, C-koncová karboxy- skupina necyklického peptidového prekurzoru môže reagovať s voľnou sulfhydrylovou skupinou prítomnou v molekule, čím sa vytvoria tioestericky uzavreté cyklopeptidy.

31116/H

Tabuľka 1
Označenie peptidu	Aminokyselinová sekvencia	Sekver
62184 (66203*)	cyklo(RGDfV)	4
62185 (69601*)	cyklo(RADfV)	5
62181	cyklo(GrGDFV)	6
62187	cyklo(RGDFv)	7
62880	YTAECKPQVTRGDVF	8
121974 (85189*)	cyklo(RDGf-NMeV)	9
112784	cyklo(RDEf-NMeV)	10
huMMP-2 (410-631)**		11
huMMP-2 (439-631)**		12
huMMP-2 (439-512)**		13
huMMP-2 (439-546)**		14
huMMP-2 (510-631)**		15
huMMP-2 (543-631)**		16
chMMP-2 (410-637)***		17
chMMP-2 (445-637)***		18
chMMP-2 (445-518)***		19
chMMP-2 (445-552)***		20
chMMP-2 (516-637)***		21
chMMP-2 (549-637)***		22

* Peptidy označené hviezdičkou sa pripravili v HCI a ich sekvencia je zhodná s peptidom označenom v tom istom riadku; peptidy bez hviezdičky sa

31116/H pripravili v TFA. Malé písmená označujú D-aminokyselinu; veľké písmená označujú L-aminokyselinu.

** Sekvencie aminokyselinových zvyškov ľudského MMP-2 použité na syntetické peptidy sú označené pozíciami príslušných zvyškov, ako je to zobrazené na obrázkoch 15A a 15B a taktiež na obrázku 16. (MMP-2 označuje člena rodiny metaloproteinázových enzýmov matrixu). Ľudské MMP-2 sekvencie sú v zozname uvedené s prirodzenými cysteínovými zvyškami, ale neuvádzajú sa tam umelo vytvorené cysteínové zvyšky, ktoré sa opisujú v prípade fúznych peptidov. Neprirodzenými cysteínovými zvyškami sa nahradili prirodzené aminokyselinové zvyšky v naznačených polohách aminokyselinových zvyškov preto, aby sa umožnila rozpustnosť syntetických, ako i exprimovaných fúznych proteínov, a aby sa zabezpečilo správne poskladanie proteínu a tým i expozícia väzbového miesta.

*** Sekvencie aminokyselinových zvyškov kuracieho MMP-2 použité na syntetické peptidy sú označené pozíciami príslušných zvyškov, ako je zobrazené na obrázkoch 15A a 15B. Kuracie MMP-2 sekvencie sú v zozname uvedené s prirodzenými cysteínovými zvyškami, ale neuvádzajú sa tam umelo vytvorené cysteínové zvyšky, ktoré sa opisujú v prípade fúznych peptidov tak, ako sa to opísalo vyššie.

Príklad 4

Inhibícia angiogenézy indukovanej rastovým faktorom pomocou av0s antagonistov, ktorá sa merala in vivo testom na modeli králičích očí

Vplyv α_νβ₅ antagonistov na angiogenézu indukovanú rastovým faktorom sa môže sledovať na prirodzene priehľadných štruktúrach, ktorých typickým príkladom je rohovka oka. Nové krvné cievy rastú z okraja rohovky, ktorý má bohaté zásobovanie krvou, smerom do stredu rohovky, ktorý za normálnych okolností nemá krvné cievy. Stimulátory angiogenézy, ako sú VEGF a TGF-a, indukujú po aplikácii do rohovky rast nových krvných ciev z okraja rohovky. Antagonisty angiogenézy, ktorí sa aplikovali do rohovky inhibujú rast nových

31116/H krvných ciev z okraja rohovky. Takže v rohovke dochádza kangiogenéze prostredníctvom invázie endoteliálnych buniek z okraja rohovky do tuhého rohovkového tkaniva, vyplneného kolagénom, pričom sa tento jav dá ľahko pozorovať. Stanovenie pomocou modelu králičích očí preto poskytuje in vivo model na priame pozorovanie stimulácie a inhibície angiogenézy, ku ktorej dochádza po implantácii zlúčenín priamo do rohovky oka.

A) In vivo stanovenie na modeli králičích očí

1) Angiogenéza indukovaná rastovými faktormi

Angiogenéza sa in vivo indukovala rastovými faktormi na modeli králičích očí tak, ako sa opisuje v nasledujúcom texte.

a) Príprava hydronových peliet obsahujúcich rastový faktor a monoklonálne protilátky

Hydronové polymérové pelety, ktoré obsahujú rastový faktor a monoklonálne protilátky (mAbs) sa pripravili tak, ako to opísali D'Amato a kol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4082-4085 (1994). Jednotlivé pelety obsahovali 750 ng rastového faktoru (taktiež označovaného ako cytokín), konkrétne bFGF alebo VEGF, naviazaného k sukralfátu (karafátu) (Carafet, Marion Merell Dow Corporation, Cincinnati, OH) z dôvodu stabilizácie cytokínov a kvôli zaisteniu ich pomalého uvoľňovania do okolitého tkaniva. Okrem toho sa pripravili hydronové pelety, ktoré obsahovali buď 40 pg monoklonálnej protilátky P1F6 (anti-avps), alebo kontrolnú protilátku LM609 (anti-a_vp₃) v PBS.

Všetky testované mAbs sa purifikovali z ascitickej tekutiny pomocou afinitnej stĺpcovej chromatografie na Proteín-A Sepharose CL-4B podľa dobre známych metód. Eluovaný imunoglobulín sa potom dialyzoval proti PBS a pôsobilo sa naň s Detoxi-gélom (Pierce Chemicals, Rockford, IL) kvôli odstráneniu endotoxínu. Ukázalo sa, že endotoxín je účinným stimulátorom angiogenézy a zápalových procesov. Prítomnosť endotoxínu sa preto testovala

31116/H v monoklonálnych protilátkach pomocou testu Chromogenic Limulus Amebocyte Lysate Assay (BioWhittaker, Walkersville, MD) a v teste na modeli králičích očí sa použili iba tie mAbs, ktoré boli bez stanoviteľného množstva endotoxínu.

Pelety sa odlievali v špeciálnych pripravených teflónových prípravkoch, do povrchu ktorých sa vyryla 2,5 mm dutinka. Približne 12 μΙ odlievaného materiálu sa umiestnilo do každej dutinky a polymerizácia prebehla cez noc v sterilnom digestore. Pelety sa potom sterilizovali ultrafialovým žiarením.

Pre párové očné experimenty sa použila séria ôsmich zvierat, pričom každé zviera dostalo hydronový implantát obsahujúci vopred vybraný cytokín s vopred vybranou protilátkou alebo s kontrolným imunoglobulínom. Konkrétne u každého králika sa do jednej rohovky chirurgicky implantovala hydronová peleta obsahujúca bFGF alebo VEGF v spojení s mAb P1F6 a do druhej rohovky sa pridal bFGF alebo VEGF v spojení s mAb LM609. Jednotlivé pelety sa implantovali do chirurgicky vytvorených „vreciek,, v stredovej strome rohovky králikov. Chirurgická procedúra sa vykonala sterilným postupom s použitím operačného mikroskopu Wild, model M691, vybaveného deličom svetla s inštalovaným fotoaparátom, ktorý sa použil na fotografické zachytenie jednotlivých rohoviek. V strome rohovky sa vytvorilo „vrecko,, 3 mm krát 5 mm robením 3 mm zárezov do polovičky hrúbky rohovky so skalpelom 69 Beaver. Stróma sa oddelila periferálne s použitím dúhovkovej špachtle a peleta sa implantovala tak, že jej vonkajší okraj bol 2 mm od okraja rohovky.

Počas nasledujúcich 12 dní cytokíny a monoklonálne protilátky difundovali z implantovaných peliet do okolitého tkaniva a takto ovplyvňovali angiogenézu z okraja rohovky.

Ľavé a pravé rohovky sa označujú ako OS a OD. Rohovky sa potom pozorovali12 dní. Fotografie sa urobili na 10 pooperačný deň, kedy je neovaskularizácia maximálna.

Reprezentatívne fotografické výsledky vyššie uvedených pokusov so zmesami cytokín/mAb sú zobrazené na obrázkoch 1A-1D. Paralelná

31116/H kvantifikácia protilátkovej inhibície angiogenézy indukovanej cytokínom je zobrazená na obrázkoch 2A a 2B. Na obrázkoch 1A a 1D, na ktorých sú rohovky, ktoré sa vystavili účinku kombinácií bFGF/P1F6 (1 A) a VEGF/LM609 (1D) je nápadná cytokínom indukovaná angiogenéza s edémom, ktorý je označený veľkými šípkami. Takže α_νβδ protilátka P1F6 nebola účinná pri inhibícii bFGF indukovanej angiogenézy. Podobne α_νβ₃ protilátka LM609 nebola účinná pri inhibícii angiogenézy indukovanej VEGF.

Na druhej strane, keď sa v králičom modeli použili kombinácie cytokínu s protilátkou bFGF/LM609 a VEGF/P1F6, cytokínom indukovaná angiogenéza sa inhibovala protilátkami, ako je znázornené na obrázkoch 1B a 1C. Na týchto obrázkoch sa nachádzajú normálne spojivkové limbálne cievy označené malými šípkami, čo naznačuje účinnosť integrínových protilátok pri inhibícii jedného typu cytokínom indukovanej angiogenézy.

Kvantifikovali sa taktiež vplyvy imunoreaktivity špecifickej mAb s integrínom na vyššie spomínanú angiogenézu indukovanú cytokínom tak, ako je zobrazené na obrázkoch 2A a 2B. Angiogenéza sa stimulovala bFGF alebo VEGF, ako sa zobrazuje osobitne na obrázku 2A a 2B. Ovplyvnené oči sa fotografovali denne cez operačný mikroskop Wild vybavený fotoaparátom Nikon. Na snímky sa použil diapozitívny film Kodak Ektachrome 64T a obrázky sa spracovali pomocou obrazového denzitometru Model GS670 a konvertovali sa na počítačovú kvantifikáciu pomocou programu Molecular Analyst 1.1 od firmy Biorad. Stĺpcové grafy zobrazujú priemernú neovaskulárnu plochu +/štandardná chyba (n=8 pre každú z dvoch sérií) po vystavení účinku mAbs P1F6 alebo LM609.

Ako je zobrazené na obrázku 2A, LM609 redukovalo angiogenézu indukovanú bFGF o 86% (p<0,005, párový ŕ-test) v porovnaní s pôsobením P1F6 na párové oko toho istého zvieraťa. Keď sa na stimuláciu angiogenézy použil VEGF, ako je zobrazené na obrázku 2B, pozoroval sa opačný efekt, pričom P1F6 redukovala angiogenézu o 60% (p<0,03, párový ŕ-test) v porovnaní s okom ovplyvneným LM609, kde mala protilátka minimálny vplyv na angiogenézu indukovanú VEGF.

31116/H

Je preukazné, že účinkom konkrétnej protilátky sa ovplyvnili iba nové cytokínom indukované krvné cievy, zatiaľ čo už existujúce perilimbálne cievy neboli ovplyvnené žiadnou z protilátok, čo naznačuje, že pozorované vplyvy sú obmedzené na novo sa tvoriace cievy rohovky.

Podobné stanovenia sa vykonali so syntetickými peptidmi pripravenými v príklade 3, a ako sa opisuje nižšie, použili sa pri inhibícii cytokínom indukovanej angiogenézy, ktorá špecificky korelovala s expresiou α_νβδ.

Aby sa potvrdili tieto výsledky, ktoré naznačili, že angiogenéza indukovaná konkrétnym cytokínom bola ovplyvnená iba jedným typom antiintegrínovej protilátky, konkrétne, že α_νβ₅ integrínový receptor hrá úlohu pri angiogenéze indukovanej VEGF, hodnotil sa i ďalší neovaskulárny model kuracej chorioalantoickej membrány (CAM) s kombináciami cytokínov a integrínových protilátok tak, ako sa opisuje v nasledujúcom príklade.

b) Pôsobenie polypeptidmi

Každý experiment pozostával z ôsmich králikov, ktorým sa do jedného oka implantovala peleta obsahujúca 100 nanogramov (ng) bFGF a do druhého oka sa implantovala peleta obsahujúca 1 mikrogram (pg) VEGF. Pelety sa zasunuli do vrecka v rohovke, ako sa opísalo vyššie a cytokíny následne stimulovali rast nových krvných ciev do rohovky. Peptidy sa podali subkutánne (s.q.) v 1 ml PBS pri počiatočnej dávke 50 μς na kg králika na deň inzercie pelety, a následne sa podávali denné s.q. dávky 20 pg/kg. Po 7 dňoch sa rohovka vyhodnocovala tak, ako sa opísalo vyššie.

Králiky, ktoré dostávali kontrolný peptid 69601 vykázali výrazný rast rohovkových krvných ciev po 7 dňoch v oboch očiach stimulovaných bFGF, ako i VEGF. Králiky dostávajúce peptid 85189 vykazovali menej ako 50% z rastu rohovkových krvných ciev v bFGF stimulovaných očiach v porovnaní s kontrolou a takmer 100% inhibíciu vo očiach stimulovaných VEGF.

31116/H

Príklad 5

Angiogenéza v preparátoch kuracej chorioalantoickej membrány (CAM)

A) Charakterizácia neovplyvnených CAM

1) Príprava CAM

Angiogenéza sa v kuracej chorioalantoickej membráne (CAM) môže indukovať po normálnej embryonálnej angiogenéze, ktorá vyústila do tvorby zrelých krvných ciev. Ukázalo sa, že angiogenéza sa môže indukovať ako odpoveď na špecifické cytokíny alebo nádorové fragmenty tak, ako to opísali Leibovich a koľ, Náture, 329:630 (1987) a Ausprunk a koi., Am. J. Pathol., 79:597 (1975). CAM sa pripravili z kuracích embryí pre následnú indukciu angiogenézy a jej inhibíciu tak, ako sa opisuje nižšie v príklade 6 s použitím α_νβδ antagonistov tohto vynálezu.

Desaťdňové kuracie embryá sa získali z Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) a inkubovali sa pri 37 °C a 60% vlhkosti. Do škrupiny sa urobila malá dierka na konci vajca priamo nad vzduchovou bublinou pomocou malej vŕtačky (Dremel, Division of Emerson Electric Co., Racine, Wl). Druhá dierka sa vyvŕtala na širšom konci vajca v oblasti bez embryonálnych krvných ciev, ktorá sa predtým zistila presvietením vajca. Do prvej dierky sa zaviedol negatívny tlak, čo spôsobilo, že sa CAM (chorioalantoická membrána) oddelila od membrány škrupiny a vytvorila sa falošná vzduchová bublina nad CAM. Nad poklesnutou CAM sa do škrupiny vyrezalo štvorcové okno o rozmeroch 1,0 centimeter (cm) x 1,0 cm pomocou malej rezačky (Dremel). Malý otvor umožňoval priamy prístup k CAM ležiacej pod ním.

Výsledný CAM preparát sa potom použil na desiaty deň embryogenézy, keď sa angiogenéza ukončila. Preparát sa použil v tomto vynáleze na indukciu obnovenia angiogenézy ako odpovede na pôsobenie cytokínmi.

31116/H

2) Histológia CAM

Za účelom analýzy mikroskopickej štruktúry CAM kuracieho embrya sa zo zmrazených bločkov rezali na kryomikrotóme rezy hrubé šesť mikrónov (μιτι) na imunofluorescenčnú analýzu.

Na 10 dňovom neovplyvnenom CAM sa typicky nachádzala oblasť bez prítomnosti krvných ciev. Keďže v tomto štádiu embryogenézy je angiogenéza v CAM systéme ukončená, tento systém je v tomto vynáleze vhodný na stimulovanie tvorby novej vaskulatúry z existujúcich ciev z priľahlých oblastí do oblasti CAM, v ktorej sa cievy nenachádzajú, a to účinkom rôznych cytokínov.

CAM model a nasledujúce príklady poukazujú na to, že krvné cievy podliehajúce novému rastu v procese normálnej embryogenézy alebo po indukcii cytokínmi exprimujú α_νβ₃ a α_νβδ.

B) Angiogenéza indukovaná rastovými faktormi

Ukázalo sa, že angiogenézu je možné indukovať cytokínmi alebo rastovými faktormi tak, ako sa opísalo v príklade 4A na modeli králičích očí. Angiogenéza v preparátoch králičej rohovky (opísaná v príklade 4) sa taktiež indukovala rastovými faktormi, ktoré sa v experimentoch, ktoré sa tu opisujú, aplikovali povrchovo na krvné cievy CAM.

Angiogenéza sa indukovala umiestnením kúskov filtračného papiera Whatman (Whatman filter páper č. 1) s rozmermi 5 milimetrov (mm) x 5 mm na CAM z 10 dňového kuracieho embrya v oblasti bez krvných ciev, pričom tieto kúsky filtračného papiera boli saturované Hanks Balanced Sált Solution (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) alebo s HBSS, ktorý obsahoval vybrané cytokíny s vopred vybranou koncentráciou, teda s koncentráciou vhodnou na testovanie vplyvu cytokínov na angiogenézu. Následne sa otvor na škrupine zalepil páskou. Angiogenéza sa monitorovala fotomikroskopiou po 72 hodinách. CAM sa prudko zmrazili, kryostatom narezané 6 μιτι hrubé rezy sa fixovali acetónom a značili sa imunofluorescenčne tak, ako sa opísalo v príklade 2B a 2C,

31116/H s vybranými anti-integrínovými protilátkami v koncentrácii 10 pg/ml, vrátane tých, ktoré sú cielené proti α_νβ₅, ako sa opísalo v príklade 1.

Predchádzajúca práca autorov Brooks a kol., Science, 264:569-571 (1994) ukázala, že krvné cievy sú zreteľné na preparátoch, na ktoré sa pôsobilo bFGF a TNF-α, avšak nenachádzajú sa v neovplyvnených CAM. Autori taktiež ukázali, že expresia α_νβ3 sa zvýšila následne po angiogenéze indukovanej bFGF. Hoci sa expresia integrínu βι nezmenila v porovnaní s neovplyvneným CAM, βι sa ľahko detegoval taktiež na stimulovaných krvných cievach.

Tieto publikované zistenia naznačili, že ľudské, ako i kuracie krvné cievy podliehajúce angiogenéze vykazujú zvýšenú expresiu α_νβ3· V súhlase s týmto zistením sa expresia α_νβ3 na kultivovaných endoteliálnych bunkách indukovala rôznymi cytokínmi in vitro tak, ako to opísali Janat a kol., J. Celí Physiol., 151:588 (1992); Enenstein a kol., Exp. Celí Pes., 203:499 (1992) a Swerlick a kol., J. Invest. Derm., 99:715 (1993).

V rámci tohto vynálezu sa zistila samostatná, cytokínmi sprostredkovaná cesta stimulácie angiogenézy, ktorá je závislá od expresie a aktivácie odlišného adhezívneho integrínového receptora, α_νβδ· V príklade 6 sa opisuje výsledok ovplyvnenia CAM cytokínmi VEGF, TGF-α a EGF vo vzťahu k expresii α_νβ₅, k angiogenéze a jej inhibícii α_νβδ antagonistami tak, ako sa tu opísalo.

C) Angiogenéza indukovaná nádormi

Na zistenie úlohy α_νβδ v angiogenéze indukovanej nádorom sa v CAM teste použili rôzne ľudské melanómové a karcinómové fragmenty neobsahujúce ανβδ, ktoré sa predtým pestovali a izolovali z CAM 17 dňových kuracích embryí tak, ako to opísali Brooks a kol., J. Celí Biol., 122:1351 (1993) a ako sa tu opisuje.

Angiogenéza sa indukuje v CAM systéme priamou apoziciou nádorového fragmentu na CAM. Príprava CAM kuracieho embrya je identická s vyššie opísaným postupom. Namiesto kúskov filtračného papiera sa na CAM,

31116/H v oblasti pôvodne bez krvných ciev, umiestnil fragment jedného nádoru, ktorý neobsahoval α_νβδ a vážil 50 miligramov (mg) až 55 mg, a ktorý bol výsledkom rastu suspenzií nižšie opísaných bunkových línii.

Na rast solídnych ľudských nádorov na CAM kuracieho embrya sa použili bunkové línie rabdomyosarkómu, myeloidné (HL-60 alebo KG-1) a lymfoidné (T bunky - Jurkat, HPB/ALL, PEER; a rôzne línie B buniek) bunkové línie tak, ako ich opísali Pasqualini a kol., J. Celí Sci., 105:101-111 (1993). Suspenzia pochádzajúca z jednej bunky rôznych bunkových línií sa najprv aplikovala na CAM v celkovom objeme 30 μΙ sterilného HBSS. Otvory v škrupinách sa uzatvorili páskou a embryá sa inkubovali 7 dní, aby sa umožnil rast ľudských nádorových lézií. Na konci siedmeho dňa, teraz už 17 dňového embrya, sa nádory odobrali z CAM a okolité CAM tkanivo sa z nich odstránilo. Nádory sa narezali na 50 mg až 55 mg nádorové fragmenty vhodné na použitie v indukcii angiogenézy. Nádorové fragmenty sa umiestnili na novú sadu CAM 10 dňových kuracích embryí v mieste bez krvných ciev tak, ako sa opísalo v príklade 5A.

Na nádoroch, ktoré rástli in vivo na CAM kuracích embryí stopickou alebo intravenóznou aplikáciou a^₅-inďukujúcich cytokínov (VEGF, TGF-a alebo EGF), ako i bez nej, sa potom expresia α_νβδ značila s mAbs P1F6 alebo P5H9 tak, ako sa predtým opísalo.

Tieto nádorové preparáty CAM sa potom následne ovplyvňovali tak, ako sa opísalo v príkladoch 6C a 6D, pričom sa merali účinky protilátok a peptidov, vrátane C-koncových fragmentov MMP-2 na angiogenézu indukovanú nádorom.

V jednej časti vynálezu sa na CAM test použili melanómové bunky škrečka, CS-1, získané od Dr. Caroline Dámsky z University of Califomia v San Francisco tak, ako sa opísalo v prípade tvorby melanómových nádorov. Následne po prenesení približne 50 mg nádorových fragmentov CS-1 na CAM nového 10 dňového kuracieho embrya, sa jednotlivým preparátom podali intravenózne injekcie obsahujúce buď 100 gg alebo 300 μg protilátky P1F6, protilátky LM609 alebo kontrolnej protilátky CSAT (anti βι). Ako ďalšia kontrola

31116/H slúžil preparát, ktorý nebol nijako ovplyvnený. Výsledky sa analyzujú nižšie v príklade 6D.

Príklad 6

Meranie inhibície angiogenézy pomocou CAM testu

A) Inhibícia angiogenézy indukovanej rastovými faktormi pomocou intravenóznej aplikácie inhibítorov

Vplyv intravenózne podaných monoklonálnych protilátok na angiogenézu indukovanú rastovými faktormi v CAM preparátoch sa hodnotil ako in vivo modelový systém tohto vynálezu. Následne po aktívnej neovaskularizácii, keď sa cievy prestanú vyvíjať, klesá expresia α_νβδ na úroveň nestanoviteľnú imunofluorescenčnou analýzou. Práve protiklad medzi reguláciou expresie α_νβδ v krvných cievach podliehajúcich angiogenéze a absenciou tejto expresie v zrelých cievach zakotvuje jedinečnú schopnosť tohto vynálezu kontrolovať a inhibovať angiogenézu tak, ako sa to dokumentuje nižšie na modelovom CAM systéme stanovenia angiogenézy.

Príprava CAMs kuracích embryí na intravenózne injekčné podania bola v podstate taká, ako sa opísalo vyššie.

Angiogenéza sa najprv indukovala na 10 dňových kuracích embryách aplikáciou kúskov filtračného papiera saturovaného rastovými faktormi. Konkrétne v prvých testoch sa angiogenéza indukovala pôsobením bFGF alebo VEGF, pričom každý mal koncentráciu 150 ng/ml.

Pre aplikáciu rastových faktorov sa počas presvecovacích postupov vybrali prominentné krvné cievy a na škrupine vajca sa urobili značky, ktoré naznačujú ich polohy. Do škrupiny sa vyvŕtali dierky, CAM sa oddelili a rastovým faktorom nasýtené filtračné papieriky sa potom jednotlivo umiestnili na CAM tak, ako sa opísalo vyššie. Otvory sa uzatvorili sterilnou páskou a embryá sa umiestnili do inkubátora.

31116/H

O dvadsať štyri hodín neskôr sa opatrne vyrezal druhý malý otvor na bočnej strane škrupiny priamo nad prominentnými krvnými cievami, ktoré sa zvolili už predtým. Vonkajšia škrupina vajca sa opatrne odstránila, pričom ostali embryonálne membrány neporušené. Membrána pod škrupinou sa spriehľadnila pomocou malej kvapky minerálneho oleja (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT), čo umožnilo ľahkú vizualizáciu krvných ciev. Potom sa do krvných ciev na CAM, indukovaných rastovým faktorom, injekčné podal fyziologický roztok pufrovaný fosfátovým pufrom (PBS), 75 μg purifikovaných sterilných anti-integrínových protilátok alebo 75 μg syntetických peptidov (cyklický peptid RGDfV, sekvencia č. 4 a kontrolný cyklický peptid RADfV, sekvencia č. 5) v PBS. Otvory sa uzavreli páskou a embryá sa inkubovali do 72 hodín.

Kúsky filtračného papieru a reprezentatívne okolité tkanivá CAM sa odfotografovali v stereomikroskope (obrázky 3A-3F a obrázky 5A-5F) a určil sa priemerný angiometrický index +/- štandardná chyba pre 12 CAM z každého spôsobu ovplyvnenia (obrázky 4A-4B a obrázky 6A-6B). Angiogenéza sa zhodnotila v podobe skóre pre každé embryo analýzou počtu a rozsahu vetvenia krvných ciev v rámci oblasti prislúchajúcej každému papieriku dvojitým slepým spôsobom. Skóre bolo v rozsahu od 1 (nízke) po 4 (vysoké) a index angiogenézy sa stanovil odpočítaním pozadia s hodnotou 1 zo všetkých údajov.

Špecifičnosť integrínovou protilátkou sprostredkovanej inhibície angiogenézy, ktorá sa indukovala rastovým faktorom v CAM modeli, sa podobala inhibícii pozorovanej na modeli králičej rohovky, ktorý sa opísal vyššie. Ako vidno na obrázku 3A pre bFGF a na obrázku 3B pre VEGF, oba rastové faktory spôsobili angiogenézu v.kontrolnej CAM ovplyvnenej PBS. Pôsobenie avPs-špecifickou protilátkou, P1F6, však malo za následok inhibíciu angiogenézy indukovanej VEGF, ako vidno na obrázku 3D, zatiaľ čo v prípade angiogenézy indukovanej bFGF sa nezistila žiadna inhibícia (obrázok 3C). Na druhej strane však LM609, a_vp3-špecifická protilátka, inhibovala angiogenézu indukovanú bFGF (obrázok 3E), ale mala malý vplyv na angiogenézu indukovanú VEGF v CAM (obrázok 3F).

31116/H

Tieto výsledky sú taktiež zobrazené na stĺpcových grafoch na obrázku 4A pre CAMs ovplyvnené bFGF a na obrázku 4B pre CAMs ovplyvnené VEGF, pričom je znázornený index angiogenézy pre preparáty ovplyvnené LM609 alebo P1F6 a zároveň i kontrolné preparáty, ktoré neboli ovplyvnené žiadnymi protilátkami. Takže inhibícia angiogenézy indukovanej rastovým faktorom pomocou protilátok špecifických pre integrín je závislá od typu rastového faktoru.

Vystavenie účinkom peptidov obsahujúcich RGD podporujú hore uvedené výsledky. Výsledkom pôsobenia bFGF, ako i VEGF, v prítomnosti PBS bola angiogenéza v kontrolnej CAM, ako je zobrazené na obrázku 5A a 5B. Oproti tomu, cyklický peptidový antagonista RGDfV (Sekvencia č. 4), ktorý je cielený tak voči α_νβ3, ako i α_νβ5, potlačil angiogenézu indukovanú bFGF alebo VEGF. Cyklický peptid RADfV (sekvencia č. 5) neovplyvnil angiogenézu v CAM preparátoch, na ktoré sa pôsobilo bFGF, ani VEGF. Tieto výsledky sú zdokumentované taktiež na obrázkoch 6A a 6B, kde je angiogénny index CAM stimulovaných bFGF a VEGF znázornený na grafoch, na ktorých je zobrazený vplyv testovaných a kontrolných peptidov. Takže tieto výsledky spolu s výsledkami získanými na králičích rohovkách naznačujú, že bFGF a VEGF indukovaná angiogenéza závisí od odlišných avšak homológnych a_všpecifických integrínov ktoré sú však obidva inhibovateľné cyklickým peptidom RGDfV.

V ďalších testoch vykonaných na CAM modeli s angiogenézou indukovanou VEGF, sa jednotlivo intravenózne aplikovali 2 pg peptidu 85189 (sekvencia č.9) a jeho inertnej soli 121974 tak, ako sa už opísalo. Vplyv týchto peptidov sa porovnával s efektom kontrolného peptidu 69601 (sekvencia č. 5) a s neovplyvnenými preparátmi (označenými ako NT).

Vplyv týchto peptidov na angiogenézu indukovanú VEGF sa meral prostredníctvom určenia počtu vetvení krvných ciev. Takže angiogenéza, alebo jej neprítomnosť, sa kvantifikovala spočítavaním miest vetvenia krvných ciev, ktoré sa vyskytujú v rámci hraníc filtračných papierikov. Vetvené krvné cievy sa považujú najmä za cievy, ktoré zodpovedajú novým angiogénnym klíčiacim

31116/H krvným cievam. Kvantifikácia sa vykonala dvojito slepým spôsobom aspoň dvoma nezávislými pozorovateľmi. Výsledky sa vyjadrili v podobe angiogénneho indexu, pričom angiogénny index predstavuje počet miest vetvenia (po VEGF stimulácii) mínus počet miest vetvenia (nestimulovaná kontrola) na jeden filtračný papierik. Experimenty mali typicky 6-10 embryí ku každému spôsobu ovplyvnenia. Ako je zobrazené na obrázku 17, oba peptidy, 85189, ako i 121974, úplne inhibovali angiogenézu, čo je preukázané redukciou merateľných miest vetvenia pri porovnaní s neovplyvnenými preparátmi alebo preparátmi ovplyvnenými kontrolným peptidom.

Ďalšie podobné testy sa uskutočnili so syntetickými peptidmi pripravenými tak, ako sa opísalo v príklade 3, čím sa určili peptidy, ktoré vykazujú špecifitu k angiogenéze korelujúcej s α_νβ₅, a nie s α_νβ₃. Stanovenia sa uskutočnili taktiež s MMP-2 C-koncovými fragmentmi pripravenými tak, ako sa opísalo v príklade 3 a 7 a s organickými molekulami pripravenými tak, ako sa opísalo v príklade 10.

Špecifičnosť inhibície angiogenézy indukovanej rastovým faktorom pomocou integrínových protilátok sa potvrdila rozšírením analýz angiogenézy indukovanej rastovým faktorom o analýzy angiogenézy indukovanej faktorom nekrotizujúcim tumory-α (TNF-a), transformujúcim rastovým faktorom-α (TGFa) alebo forbolovým esterom, 4^-forbol-12-myristan-13-acetátom (PMA).

Hore uvedené rastové faktory (cytokíny), zahrňujúce bFGF a VEGF, sa aplikovali jednotlivo v koncentrácii 1,0 pg/ml na 10 dňový CAM model tak, ako sa predtým opísalo. PMA sa použil v koncentrácii 20 ng/ml.

Po 24 hodinách pôsobenia rastovým faktorom sa k CAM modelu jednotlivo pridali protilátky LM609 a P1F6, alebo inhibítor proteínkinázy C (PKC) kalfostín C, buď v jednej intravaskulárnej dávke tak, ako sa opísalo vyššie, alebo kontaktným podaním tak, ako sa opisuje v nasledujúcom príklade. Počas nasledujúceho 3 dňového obdobia sa pre intravaskulárne injekčné podania použili protilátky v koncentrácii 75 fíg na jedno embryo a kalfostín v dávke 100 nM.

31116/H

Na 13. deň, sa filtračné papieriky a pod nimi ležiace CAM tkanivo odobrali a angiogenéza sa analyzovala v stereomikroskope. Angiogenéza sa vyhodnotila v podobe skóre dvojitým slepým spôsobom analýzou počtu a rozsahu vetvenia krvných ciev v rámci oblasti ohraničenej papierikmi. Hodnoty skóre sa nachádzali v rozsahu od nízkych (1) po vysoké hodnoty (4). Index angiogenézy sa stanovil odpočítaním pozadia s hodnotou 1 od všetkých zistených údajov. Experimenty sa zopakovali 2-4 krát s 5-6 embryami pre každú variantu pokusu.

Ako je vidno z obrázku 7A a 7B, anti-a_vp₃ protilátka, LM609, blokovala angiogenézu, ktorá vznikla následkom pôsobenia bFGF a TNF-α, kým anti-a_vp₅ protilátka, P1F6, mala malý inhibičný efekt. Na druhej strane, ako je vidno z obrázkov 7C-7E, P1F6 bola efektívna v inhibícii angiogenézy indukovanej VEGF, TGF-α alebo PMA, kým LM609 nemala takýto účinok.

PMA je účinný induktor angiogenézy, ktorý je schopný aktivovať proteínkinázu C (PKC), ktorá patrí do intracelulárnej rodiny serín-treonínových kináz. Preto sme taktiež testovali účinky PKC inhibítora (kalfostínu C) na angiogenézu na kuracej CAM. Kalfocín C blokoval angiogenézu indukovanú PMA (obrázok 7E), ako i VEGF (obrázok 7C) a TGF-α (obrázok 7D), pričom mal minimálne účinky na angiogenézu sprostredkovanú bFGF (obrázok 7A) alebo TNF-α (obrázok 7B).

Spolu tieto výsledky naznačujú existenciu dvoch samostatných odlišných ciest angiogenézy, pričom jedna cesta je závislá na a_vP3-sprostredkovanom signále, ktorý je značne nezávislý od PKC, ako to predtým opísali Brooks a kol., Science, 264:569-571 (1994) a druhá cesta je umožnená α_νβδsprostredkovaným signálom, ktorý je absolútne závislý na aktivácii PKC.

Okrem hore uvedených experimentov sa kvôli určeniu lokalizácie mAbs P1F6 a LM609 v CAM tkanivách, ktoré sa intravenózne očkovali s LM609, blokovali fixované rezy s 2,5% BSA v HBSS počas 1 hodiny pri laboratórnej teplote s následným značením s 1:250 riedenou kozou anti-myšou

31116/H sekundárnou protilátkou označenou rodamínom (Tágo). Rezy sa potom analyzovali fluorescenčným mikroskopom Zeiss.

B) Inhibícia angiogenézy indukovanej rastovými faktormi pomocou topickej aplikácie inhibítorov

Aby sa stanovilo, či má α_νβδ aktívnu úlohu v procese angiogenézy, na CAM sa umiestnili filtračné papieriky nasýtené vyššie opísanými rastovými faktormi kvôli indukcii angiogenézy, po ktorých nasledovala aplikácia buď P1F6 alebo LM609.

Na filtračné papieriky sa pôsobilo 50 ml HBSS, ktorý obsahoval 25 mg mAb v celkovom objeme 25 μΙ sterilného HBSS v čase 0, 24 a 48 hodín. CAMs sa odobrali a umiestnili sa do 35 mm Petriho misiek a premyli sa jedenkrát s 1 ml PBS. Spodná strana filtračného papierika a CAM tkanivo sa potom analyzovali pod stereomikroskopom Olympus dvomi pozorovateľmi dvojitým slepým spôsobom. Inhibícia angiogenézy sa považovala za preukaznú, keď CAMs vykazovali >50% redukciu infiltrácie krvných ciev CAM priamo pod papierik. Experimenty sa zopakovali štyrikrát pre každú protilátku so 6 až 7 embryami pre každý variant pokusu.

Vplyvy integrínových protilátok na už existujúce zrelé krvné cievy vzniknuté počas normálneho vývoja ciev v oblastiach priľahlých k oblastiam bez ciev sa sledovali na vaskularizovaných oblastiach CAM z 10 dňových embryí, ktoré nedostali kontaktnú aplikáciu cytokínu, a na ktoré sa umiestnili kúsky filtračného papiera nasýtené s mAbs.

CAM stanovenia sa uskutočnili taktiež so syntetickými peptidmi tohto vynálezu na stanovenie vplyvu cyklických a linearizovaných peptidov na angiogenézu indukovanú rastovými faktormi. 8 μς peptidov, pripravených tak, ako sa predtým opísalo, sa jednotlivo podalo v celkovom objeme 25 μΙ sterilného HBSS. Peptidový roztok sa ihneď aplikoval na CAM preparáty a potom znovu po 24 a 48 hodinách. Po 72 hodinách sa filtračný papier a okolité CAM tkanivo odobralo a sledovalo sa tak, ako sa opísalo vyššie.

31116/H

Podobné stanovenia sa uskutočnili s MMP-2 fragmentmi a organickými molekulami tak, ako sa opísalo v príklade 7 v pre MMP-2 fragmenty a príklade 10 pre organické molekuly.

C) Inhibícia angiogenézy indukovanej nádorom pomocou topickej aplikácie

1) Ovplyvnenie monoklonálnymi protilátkami

Okrem stanovení angiogenézy, ktoré sa opísali vyššie, kde sa hodnotili účinky anti-a_vp₅ protilátky a peptidových antagonistov, skúmala sa taktiež úloha α_νβδ v angiogenéze indukovanej nádorom. Ako induktor sa použili ľudské tkanivá, ktoré neobsahujú α_νβ5, a ktoré predtým rástli a izolovali sa z CAM 17dňových kuracích embryí. Fragmenty sa pripravili tak, ako sa opísalo v príklade 5C.

Ako sa vyššie opísalo, mAbs sa jednotlivo topicky aplikovali na nádorové fragmenty v koncentrácii 25 pg v 25 pi HBSS a otvory na škrupinách sa potom zalepili páskou. mAbs sa pridali znovu tým istým spôsobom po 24 hodinách a 48 hodinách. Po 72 hodinách sa nádory a okolité CAM tkanivo analyzovali tak, ako sa opísalo vyššie.

Ako sa opísalo v príklade 5C, nádory sa na počiatku odvodili transplantáciou ľudských bunkových línií, ktoré neexprimovali integrín α_νβ₅, na CAM 10-dňových kuracích embryí.

Za účelom kvantifikácie vplyvu mAbs na angiogenézu indukovanú nádorom, sa krvné cievy vstupujúce do nádoru v rámci roviny CAM počítali v stereomikroskope dvoma pozorovateľmi dvojitým slepým spôsobom.

Syntetické peptidy pripravené v príklade 3, MMP-2 preparáty opísané v príklade 7 a organické molekuly pripravené v príklade 10 sa podobne kontaktne aplikovali na nádorom indukovaný angiogénny CAM systém tak, ako sa opísalo vyššie. Vplyv peptidov vrátane MPP-2 preparátov a organických molekúl opísaných v tomto vynáleze na životaschopnosť ciev sa stanovil podobným spôsobom.

31116/H

D) Inhibícia angiogenézy indukovanej nádorom pomocou intravenóznej aplikácie

1) Ovplyvnenie monoklonálnymi protilátkami

Krvné cievy indukované nádorom pripravené tak, ako sa vyššie opísalo, sa ovplyvnili taktiež mAbs aplikovanými intravenóznym injekčným podaním. CS1 melanómové nádory sa umiestnili na CAM tak, ako sa opísalo v príklade 5C a otvory sa uzatvorili páskou a o 24 hodín neskôr sa do krvných ciev kuracieho embrya jedenkrát intravenózne podalo 100 až 300 pg purifikovaných mAbs tak, ako sa predtým opísalo. Kuracie embryá sa potom inkubovali 7 dní. Rozsah angiogenézy sa potom sledoval tak, ako sa vyššie opísalo. Po tomto čase sa nádory odobrali a analyzovala sa ich hmotnosť, aby sa určil vplyv účinku protilátky na rast nádoru alebo suspenzie.

Výsledky pôsobenia 300 pg α_νβδ špecifickej protilátky P1F6 na CS-1 nádory sú na obrázku 8. Hmotnosť nádoru sa výrazne znížila na menej ako 50 mg v porovnaní s nádormi neovplyvnenými CSAT. α_νβ₃ špecifická protilátka, LM609, taktiež inhibovala rast nádoru, avšak menej účinne ako P1F6. Porovnateľné výsledky sa získali s nádormi, na ktoré sa pôsobilo s 100 pg P1F6. Takže P1F6 bol účinný v inhibícii a^₅-sprostredkovanej angiogenézy v nádorovom modeli na CAM preparátoch, výsledkom čoho bol úbytok masy nádorových buniek.

2) Ovplyvnenie inými α_νβδ antagonistami

Taktiež sa stanovili vplyvy peptidov, MMP-2 preparátov alebo organických molekúl v CAM teste na vaskulatúre indukovanej nádorom. Preparát nádor-CAM sa použil tak, ako sa opísalo vyššie s výnimkou, že namiesto intravenózneho injekčného podania mAb sa do viditeľných krvných ciev intravenózne podali jednotlivé syntetické peptidy, vrátane MMP-2

31116/H preparátov, ktoré sa pripravili tak, ako sa opísalo v príklade 7 a organických molekúl pripravených tak, ako sa opísalo v príklade 10.

V jednej konkrétnej skupine testov sa uskutočnili ďalšie testy nádorovej regresie s peptidom 85189 (sekvencia č. 9), ktorý reaguje s α_νβ₅ alebo peptidom 69601 (sekvencia č. 5), ktorý slúži ako kontrola. Stanovenia sa uskutočnili tak, ako sa opísalo vyššie s výnimkou, že do CAM sa intravenózne injekčné podalo 100 pg peptidu v čase 18 hodín po implantácii rôznych nádorov, medzi ktoré v tomto prípade patrili nádory UCLA P-3, M21-L a FgM. Po ďalších 48 hodinách sa nádory odstránili a zistila sa ich čerstvá hmotnosť.

Obrázky 18, 19 a 20 postupne zobrazujú redukciu hmotnosti nádorov UCLA P-3, M21-L a FgM po intravenóznom podaní peptidu 85189, čo bolo v protiklade s PBS alebo peptidom 69601, ktoré nemali žiaden vplyv.

Príklad 7

Identifikácia g^s-špecifických antagonistov zistených inhibíciou prichytenia buniek a stanovením väzby lioand-receptor

A) Inhibícia prichytenia buniek

Na určenie špecifity antagonistov tohto vynálezu k integrínovým receptorom, sa vykonali stanovenia inhibície prichytenia buniek tak, ako sa opisuje nižšie.

V stručnosti, najprv sa melanómové bunky škrečka CS-1, v ktorých neprebieha expresia α_νβ₃ a α_νβδ, transfekovali plazmidom pre expresiu β₅ podjednotky tak, ako to predtým opísali Filardo a kol., J. Celí Biol., 130:441-450 (1995). Špecifičnosť potenciálnych α_νβδ antagonistov sa určila pomocou hodnotenia schopnosti blokovať prichytenie CS-1 buniek exprimujúcich α_νβδ k platničkám pokrytým VN alebo laminínom. V príklade typického stanovenia sa na platničky najprv naväzovalo 10 pg/ml substrátu cez noc. Po opláchnutí a blokovaní s 1% tepelne denaturovaným BSA v PBS pri laboratórnej teplote počas 30 minút sa peptid 85189 (sekvencia č. 9) miešal s CS-1 bunkami

31116/H v koncentračnom rozpätí od 0,0001 μΜ po 100 μΜ, kvôli aplikácii do jamiek v množstve 50 000 buniek/jamku. Po 10-15 minútovej inkubácii pri 37 °C sa odstránil roztok obsahujúci bunky a peptidy. Po farbení 1% kryštálovou violeťou sa potom určil počet prichytených buniek. Kryštálová violeť zachytená bunkami sa eluovala pridaním 100 mikrolitrov (μΙ) 10% kyseliny octovej. Bunková adhézia sa kvantifikovala meraním optickej hustoty eluovanej kryštálovej violete pri vlnovej dĺžke 600 nm.

Podobné stanovenia sa uskutočnili s fúznymi proteínmi alebo so syntetickými peptidmi obsahujúcimi rôzne oblasti MMP-2 proteínu. Polypeptidy odvodené z MMP-2 zahrňujú oblasti C-konca MMP-2, ktoré sú aktívne vo väzbových interakciách s α_νβδ a teda sú schopné inhibovať aktiváciu MMP-2 a sprievodné aktivity. Tieto polypeptidy sa pripravujú ako syntetické polypeptidy so sekvenciou odvodenou z C-koncovej domény MMP-2 tak, ako sa opísalo v príklade 1, alebo ako fúzne proteíny, ktoré zahrňujú celú časť C-koncovej domény MMP-2, alebo jej časť, pripravené tak, ako sa opisuje nižšie. Znázornené sú špecifické sekvencie kuracích i ľudských C-koncových molekúl MMP-2.

C-koncová doména odvodená z kuracieho MMP-2, taktiež označovaná ako hemopexínová doména tesne susediaca s kĺbovou oblasťou, zahrňuje aminokyselinové zvyšky 445-637 MMP-2. Úplná nukleotidová a kódovaná aminokyselinová sekvencia kuracieho MMP-2 sa opisuje nižšie a zobrazená je na obrázkoch 15A a 15B, s nukleotidovými sekvenciami uvedenými ako sekvencia č. 23 a s aminokyselinovými sekvenciami uvedenými ako sekvencia č. 24. Nukleotidová a kódovaná aminokyselinová sekvencia ľudského MMP-2 sa opisuje taktiež nižšie, pričom aminokyselinová sekvencia je zobrazená na obrázku 16 a taktiež ako sekvencia č. 25. C-koncová doména ľudského MMP-2, ktorá zodpovedá 445-637 oblasti kuracieho MMP-2 začína od aminokyselinového zvyšku 439 a končí s 631 z dôvodu šiestich chýbajúcich zvyškov z ľudskej sekvencie tak, ako sa zobrazuje na obrázkoch 15A a 15B. Syntetické peptidy odvodené z C-koncovej oblasti ľudského, ako i kuracieho MMP-2, a používané na testovanie terapeutických spôsobov tohto vynálezu, sú

31116/H uverejnené v tabuľke 1. Sekvencie aminokyselinových zvyškov syntetických peptidov sú rovnaké ako sekvencie tvorené rekombinantnými fúznymi proteínmi, ale bez fúzovanej časti GST. Fúzne proteíny s C-koncovou oblasťou odvodenou z kuracieho alebo ľudského MMP-2 sa pripravili tak, ako sa opisuje nižšie.

MMP-2 fúzny proteín je chimerickým polypeptidom so sekvenciou Ckoncovej oblasti MMP-2, alebo jej časti, fúzovanej (účinne viazanej kovalentnou peptidovou väzbou) s nosičovým (fúzovaným) proteínom, ako je glutatiónsulfhydryltransferáza (GST).

Pre amplifikáciu rôznych oblastí kuracieho alebo ľudského MMP-2 sa stanovili primérové sekvencie na základe známych cDNA sekvencií kuracieho alebo ľudského MMP-2. Úplná cDNA nukleotidová sekvencia prepisovaného reťazca neupraveného kuracieho MMP-2, ktorý sa tiež označuje ako progelatináza, je zobrazená na obrázkoch 15A a 15B zároveň s odvodenou aminokyselinovou sekvenciou zobrazenou v druhom riadku (Aimes a kol., Biochem. J., 300:729-736, 1994). Tretie a štvrté riadky tohto obrázku zobrazujú odvodenú aminokyselinovú sekvenciu ľudského MMP-2 (Collier a kol., J. Biol. Chem., 263:6579-6587 (1988)) a myšieho MMP-2 (Reponen a kol., J. Biol. Chem., 267:7856-7862 (1992)). Identické zvyšky sú naznačené bodkami, kým odlišné zvyšky sú udané ich jednopísmenovým IUPAC označením. Chýbajúce zvyšky sú naznačené pomlčkou. Číslovanie zvyškov začína od prvého zvyšku proenzýmu, pričom aminokyselinovým zvyškom signálneho peptidu sú priradené záporné čísla. Nukleotidová sekvencia je číslovaná podľa tohto obrázku, avšak v Zozname sekvencií je prvý nukleotid označený číslom 1. Predpokladaný začiatok translácie (ATG) je označený tromi kótovacími šípkami a terminálny signál translácie (TGA) je naznačený hviezdičkou. Aminokyselinové terminálne sekvencie kuracieho proenzýmu sa nachádzajú v rámci oblasti označenej kosoštvorcami a sekvencie aktívneho enzýmu sú označené samostatnými kótovacími šípkami. Ako sa už uviedlo, sekvencie nukleotidových a aminokyselinových zvyškov kuracej progelatinázy sú uvedené

31116/H spolu ako sekvencia č. 23, zatiaľ čo kódovaná sekvencia aminokyselinových zvyškov je uvedená oddelene ako sekvencia č. 24.

Matricou na tvorbu amplifikovaných oblastí kuracieho MMP-2 bola buď cDNA kódujúca celú dĺžku zrelého kuracieho MMP-2 polypeptidu poskytnutá Dr. J. P. Quigley z State University of New York, Stoney Brook, New York, alebo cDNA generovaná z celkovej bunkovej templátovej RNA získanej štandardnými postupmi z odobratej vzorky tkaniva kuracej chorioalantoickej membrány. Naposledy spomínaná cDNA sa získala pomocou reverznej transkriptázy MuLV a downstream priméru špecifického pre 3’-koncové nukleotidy, 5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3’ (Sekvencia č. 26), pričom 5’ a 3' konce tejto sekvencie boli komplementárne s nukleotidmi 1932-1912 publikovanej sekvencie kuracieho MMP-2. Ako sa opísalo v legende k obrázku 15, tu opísané nukleotidové pozície primérov zodpovedajú nukleotidovým pozíciám zobrazeným na obrázku a nie tým, ktoré sú uvedené v Zozname sekvencií, keďže sekvencie v Zozname sekvencií začínajú s číslom 1 a nie ako záporné číslo, ako je to znázornené na obrázku. Polymerázová reťazová reakcia s reverznou transkriptázou (RT-PCR) sa vykonala podľa doporučení výrobcu sady GeneAmp RNA PCR (Perkin Elmer). Primér sa upravil tak, aby obsahoval EcoRI reštrikčné miesto.

Z ktorejkoľvek hore opísanej cDNA matrice sa pomocou PCR s vyššie opísaným 3’ primérom (sekvencia č. 26) a jedným z početných dolu uvedených 5’ primérov, získali početné C-koncové oblasti kuracieho MMP-2, pričom každá z nich mala prirodzený cysteínový zvyšok v polohe 637 na karboxy- konci. Amplifikované oblasti kódujú nasledujúce MMP-2 fúzne proteíny, ktoré majú sekvencie zodpovedajúce sekvenciám zobrazeným na obrázkoch 15A a 15B a taktiež sekvencií č. 24: 1) 203-637; 2) 274-637; 3) 292-637; 4) 410-637; 5) 445637. 5’ priméry alebo upstream priméry na amplifikáciu každej z nukleotidových oblastí kódujúcich hore uvedené MMP-2 fúzne proteíny sa navrhli tak, aby kódovali štartovacie miesta na transláciu z 3’-konca, vzhľadom k vytvorenému, t.j. pomocou PCR vloženému vnútornému BamHI reštrikčnému miestu, aby sa tak umožnila priama ligácia do expresných vektorov pGEX-ΙλΤ alebo pGEX31116/H

3Χ. 5’ priméry zahrňovali nasledujúce sekvencie, ktorých 5’ a 3’ konce zodpovedali naznačeným 5’ a 3’ nukleotidovým pozíciám sekvencie kuracieho MMP-2, ktorá je zobrazená na obrázku (pozície štartovacích miest pre aminokyselinové reťazce sú taktiež naznačené pre každý primér): 1) Nukleotidy 599-619, kódujúce 203 štartovacie miesto 5’ATGGGATCCACTGCAAATTTC3’ (sekvencia č. 27); 2) Nukleotidy 809-830, kódujúce 274 štartovacie miesto 5’GCCGGATCCATGACCAGTGTA3’ (sekvencia č. 28); 3) Nukleotidy 863-883, kódujúce 292 štartovacie miesto 5’GTGGGATCCCTGAAGACTATG3’ (sekvencia č. 29); 4) Nukleotidy 1217-1237, kódujúce 410 štartovacie miesto 5’AGGGGATCCTTAAGGGGATTC3’ (sekvencia č. 30); 5) Nukleotidy 13251345, kódujúce 445 štartovacie miesto 5’CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3’ (sekvencia č. 31).

Naznačené nukleotidové oblasti matrice cDNA sa následne amplifikovali v 35 cykloch (temperovacia teplota 55 °C) podľa návodu výrobcu Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim). Výsledné PCR produkty sa purifikovali na géloch, štiepili sa reštrikčnými enzýmami BamHI a EcoRI a opätovne sa purifikovali pred ligáciou do expresných vektorov pGEX-ΙλΤ alebo pGEX-3X (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko), ktoré sa podobne štiepili a defosforylovali pred samotnou ligáciou. Výber plazmidu bol založený na požadovanom čítacom rámci amplifikovaného produktu. Bunky E. coli kompetentného kmeňa BSJ72 alebo BL21 sa transformovali jednotlivými skonštruovanými vektormi pomocou tepelného šoku. Predtým ako sa vykonalo sekvenovanie pozitívnych klonov dideoxy metódou, kvôli overeniu integrity zavedenej kódujúcej sekvencie, sa vo výsledných kolóniách pomocou PCR monitorovala inkorporácia plazmidu kódujúceho jednotlivé MMP-2 fúzne proteíny. Okrem toho sa overenie inkorporácie plazmidu potvrdilo expresiou GST-MMP-2 fúzneho proteínu s vhodnou veľkosťou.

Purifikácia každého z rekombinantných GST-MMP-2 fúznych proteínov sa uskutočnila s použitím kultúr v log fáze indukovaných IPTG presne tak, ako to opísal výrobca GST Gene Fusion System (Pharmacia Biotech). V krátkosti, napestované baktérie sa lyžovali ultrazvukom a inkubovali sa s detergentom,

31116/H potom sa roztok vyčíril a rekombinantný proteín sa imobilizoval na Sepharose 4B s naviazaným glutatiónom (Pharmacia Biotech). Po opakovanom premytí sa imobilizované fúzne proteíny jednotlivo vyplavovali zafinitnej matrice s 10 mM redukovaným glutatiónom v 50 mM Tris-HCI, pH 8,0 a dôkladne sa dialyzovali oproti PBS, aby sa pred použitím odstránil reziduálny glutatión.

Predchádzajúce snahy vytvoriť fúzne proteíny medzi zvyškami 445 a 637 kuracieho MMP-2, ktoré mali iba jeden kódovaný zvyšok cysteínu, vyústili do vzniku nerozpustných produktov. Kvôli vytvoreniu ďalších rozpustných MMP-2 fúznych proteínov odvodených z C-koncovej oblasti, ktorá nezahŕňa endogénny koncový cysteínový zvyšok nachádzajúci sa v predtým opísanom fúznom proteíne, sa do amplifikovaných MMP-2 oblastí zaviedli, ak to bolo nutné, nukleotidové sekvencie kódujúce cysteínový zvyšok, v závislosti od konkrétnych fúznych proteínov. Cysteínový zvyšok sa prirodzene nachádza vsekvencii kuracieho MMP-2 v polohe 446 a v polohe 637. V ľudskej sekvencii, tieto pozície zodpovedajú pozíciám 440 a 631. Preto sa fúzne proteíny navrhovali tak, aby obsahovali umelo vložené koncové cysteínové zvyšky na amino- alebo karboxy- konci zaujímavých sekvencii kuracieho MMP-2 tak, aby sa umožnil vznik disulfidovej väzby s prirodzene sa nachádzajúcim cysteínom na druhom konci tak, ako si to konštrukt vyžadoval. Syntetické MMP-2 fragmenty kuracieho i ľudského pôvodu sa pripravili podobne, ako sa opísalo predtým v príklade 3.

Oligonukleotidové priméry sa navrhli tak, aby umožnili amplifikáciu Ckoncových oblastí kuracieho MMP-2, vrátane tých, ktoré kódujú pozície aminokyselinových zvyškov 445-518, 445-552, 516-637 a 549-637. V prípade fúznych proteínov obsahujúcich zvyšok 517, prirodzene kódujúci tyrozínový zvyšok, sa tento nahradil cysteínom, aby sa tak umožnilo disulfidové viazanie s cysteínovým zvyškom v pozícii 446 alebo 637. V prípade fúznych proteínov obsahujúcich zvyšok 551, prirodzene kódujúci tryptofánový zvyšok, sa tento nahradil cysteínom, aby sa tak umožnilo disulfidové viazanie s cysteínovým zvyškom v pozícii 446 alebo 637.

V krátkosti, plazmidový konštrukt pGEX-3X, kódujúci rekombinantný GST/MMP-2(410-637) fúzny proteín pripravený tak, ako sa uviedlo vyššie, sa

31116/H použil ako matrica na amplifikáciu podľa postupu výrobcu sady Expand High Fidelity PCR Kit (Boehringer Mannheim) s použitím sady oligonukleotidových primérov, ktorých návrh bol založený na zverejnenej sekvencii kuracieho MMP2 (zobrazená taktiež na obrázkoch 15A a 15B a v sekvencii č. 23). Jeden upstream primér mal nukleotidovú sekvenciu

5’CTCGGATCCTCTGCAAGCACG3’ (sekvencia č. 32) a bol navrhnutý tak, aby kódoval štartovacie miesto na transláciu kuracieho MMP-2 proteínu v pozícii 445, ktorá nasledovala za umelo vytvoreným interným BamHI endonukleázovým reštrikčným miestom na inzerciu do GST vektora pGEX-3X. 5’ a 3’ konce priméru zodpovedali pozíciám 1325-1345 sekvencie kuracieho MMP-2 na obrázkoch 15A a 15B. Ďalší upstream primér mal nukleotidovú sekvenciu 5’GCAGGATCCGAGTGCTGGGTTTATAC3’ (sekvencia č. 33) a bol navrhnutý tak, aby kódoval štartovacie miesto na transláciu kuracieho MMP-2 proteínu v pozícii 516, ktorá nasledovala za umelo vytvoreným interným BamHI reštrikčným miestom na inzerciu do GST vektora pGEX-ΙλΤ. 5’ a 3’ konce priméru zodpovedali pozíciám 1537-1562 sekvencie kuracieho MMP-2 na obrázku. Tretí upstream primér mal nukleotidovú sekvenciu 5OCAGAATTCAACTGTGGCAGAAACAAG3’ (sekvencia č. 34) a bol navrhnutý tak, aby kódoval štartovacie miesto na transláciu kuracieho MMP-2 proteínu v pozícii 549, ktorá nasledovala za umelo vytvoreným interným BamHI endonukleázovým reštrikčným miestom na inzerciu do GST vektora, a kódoval taktiež cysteínový zvyšok v pozícii 551. 5’ a 3’ konce priméru zodpovedali pozíciám 1639-1665 sekvencie kuracieho MMP-2 na obrázku.

Tieto upstream priméry sa jednotlivo použili s jedným z nasledujúcich downstream primérov uvedených nižšie, aby sa vytvorili vyššie opísané oblasti C-koncovej domény kuracieho MMP-2. Prvý downstream primér (antisense) mal nukleotidovú sekvenciu 5OTAGAATTCCAGCACTCATTTCCTGC3’ (sekvencia č. 35), a bol navrhnutý tak, aby kódoval terminačné miesto translácie kuracieho MMP-2 proteínu v pozícii 518, aby kódoval cysteínový zvyšok v polohe 517, a aby obsahoval interné reštrikčné miesto na endonukleázu EcoRI kvôli inzercii do GST vektora. 5’ a 3’ konce priméru, zapísané v 5’-3’ smere, zodpovedali pozíciám 1562-1537 sekvencie kuracieho

31116/H

MMP-2 na obrázku. Druhý downstream primér mal nukleotidovú sekvenciu 5TCTGAATTCTGCCACAGTTGAAGG3’ (sekvencia č. 36) a bol navrhnutý tak, aby kódoval terminačné miesto translácie kuracieho MMP-2 proteínu v pozícii 552, aby kódoval cysteínový zvyšok v polohe 551 a aby obsahoval interné EcoRI endonukleázové reštrikčné miesto kvôli inzercii do GST vektora. 5’ a 3’ konce priméru, zapísané v 5-3' smere, zodpovedali pozíciám 1666-1643 sekvencie kuracieho MMP-2 na obrázku. Tretí downstream primér mal nukleotidovú sekvenciu 5’ATTGAATTCTTCTACAGTTCA3’ (sekvencia č. 37) a bol navrhnutý tak, aby kódoval terminačné miesto translácie kuracieho MMP-2 proteínu v pozícii 637, a aby obsahoval interné EcoRI endonukleázové reštrikčné miesto na inzerciu do GST vektora. 5’ a 3’ konce priméru, zapísané v 5’-3’ smere, zodpovedali pozíciám 1932-1912 sekvencie na obrázku.

Oblasti karboxy-konca kuracieho MMP-2 spojené vyššie uvedenými upstream a downstream primérmi, použité vo vhodných kombináciách tak, aby sa vytvorili fúzne proteíny obsahujúce aspoň jeden umelo vytvorený cysteínový zvyšok tak, ako sa opísalo vyššie, sa jednotlivo amplifikovali v 30 cykloch s temperovacou teplotou 55 °C podľa postupu výrobcu sady Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim). Výsledné produkty amplifikácie sa jednotlivo purifikovali, a podľa potreby sa štiepili s reštrikčnými enzýmami BamHI a/alebo EcoRI, a opäť sa purifikovali pred ligáciou do vhodných vektorov GST fúznych proteínov, a to buď pGEX-3X alebo pGEX-ΙλΤ, ako sa naznačilo vyššie podľa čítacieho rámca upstream oligonukleotidového priméru. Na ligáciu amplifikovaných MMP-2 produktov sa vektory podobne štiepili, ako i defosforylovali pred ligačnou reakciou. Bunky E. coli kompetentného kmeňa BL21 sa jednotlivo transformovali výslednými vektorovými konšruktmi obsahujúcimi MMP-2 pomocou tepelného šoku. Kvôli overeniu integrity zavedenej kódujúcej sekvencie sa v získaných kolóniách monitorovala inkorporácia vhodného plazmidu kódujúceho fúzny proteín pomocou PCR, pričom sa sledovala produkcia GST fúzneho proteínu s vhodnou veľkosťou predtým, ako sa uskutočnilo sekvenovanie pozitívnych klonov dideoxy metódou. Purifikácia GST fúznych proteínov sa potom uskutočnila s použitím

31116/H kultúr v log fáze indukovaných IPTG v podstate tak, ako sa to vyššie opísalo pre produkciu ostatných GST-MMP-2 fúznych proteínov.

Okrem vyššie opísaných kuracích MMP-2 GST fúznych proteínov sa vytvorili dva ľudské MMP-2 GST fúzne proteíny na expresiu aminokyselinových oblastí 203-631 a 439-631 zo zrelého polypeptidu ľudského MMP-2 proenzýmu. Naznačené oblasti zodpovedajú kuracím MMP-2 oblastiam 203-637 a 445-637. Ľudské MMP-2 GST fúzne proteíny sa vytvorili pomocou PCR tak, ako sa vyššie opísalo pre kuracie MMP-2 GST fúzne proteíny, s využitím cDNA matrice, ktorá kódovala úplný čítací rámec ľudského MMP-2, ktorý poskytol Dr. W. G. Stetler-Stevenson z National Cancer Inštitúte, Bethesda, MD. Upstream 5’ primérové sekvencie sa navrhli na základe predtým publikovanej sekvencie ľudského MMP-2 (Collier a kol., J. Biol. Chem., 263:6579-6587 (1988) tak, aby kódovali vložené vnútorné EcoRI reštrikčné miesto, ktoré umožňuje inzerciu amplifikovaných produktov do vhodného expresného vektora.

Jeden upstream primér mal nukleotidovú sekvenciu 5OATGAATTCTACTGCAAGTT3’ (Sekvencia č. 38) a bol navrhnutý tak, aby kódoval štartovacie miesto na transláciu kuracieho MMP-2 proteínu v pozícii 203, ktoré nasledovalo za umelo vytvoreným interným EcoRI endonukleázovým reštrikčným miestom na inzerciu do pGEX-ΙλΤ GST vektora. 5’ a 3’ konce priméru zodpovedali pozíciám 685 a 704 sekvencie otvoreného čítacieho rámca ľudského MMP-2. Ďalší upstream primér mal nukleotidovú sekvenciu 5’CACTGAATTCATCTGCAAACA3’ (sekvencia č. 39) a bol navrhnutý tak, aby kódoval kuracie MMP-2 štartovacie miesto na transláciu v pozícii 439, ktoré nasledovalo za umelo vytvoreným vnútorným EcoRI endonukleázovým reštrikčným miestom na inzerciu do pGEX-ΙλΤ GST vektora. 5’ a 3’ konce priméru zodpovedali pozíciám 1392 a 1412 sekvencie otvoreného čítacieho rámca ľudského MMP-2.

Každý z hore uvedených primérov sa samostatne používal s downstream primérom, ktorý mal 5’ koniec komplementárny s bázou 1998 a 3’ koniec s bázou 1978 sekvencie ľudského MMP-2, ktorá končí distálne k otvorenému čítaciemu rámcu MMP-2 a riadi ukončenie proteínu po aminokyselinovom

31116/H zvyšku 631. Amplifikované produkty vytvorili exprimované fúzne proteíny obsahujúce aminokyselinové zvyšky ľudského MMP-2 203-631 (sekvencia č. 40) a 439-631 (sekvencia č. 12).

Výsledné PCR produkty sa purifikovali, štiepili sa s EcoRI a opäť sa purifikovali pred ligáciou do pGEX-ΙλΤ plazmidu, ktorý sa podobne štiepil a defosforyloval pred ligačnou reakciou. Bunky sa transformovali tak, ako sa vyššie opísalo.

Pre použitie v terapeutických spôsoboch tohto vynálezu sa pripravili i ďalšie ľudské MMP-2 fúzne proteíny tak, ako sa vyššie opísalo a obsahovali aminokyselinové zvyšky 410-631 (sekvencia č. 11), 439-512 (sekvencia č. 13), 439-546 (sekvencia č. 14), 510-631 (sekvencia č. 15) a 543-631 (sekvencia č. 16).

B) Stanovenie viazania ligandu s receptorom a_vp5-imunoreaktívne protilátky pripravené v príklade 1 a syntetické peptidy pripravené v príklade 3 sa testovali meraním ich schopnosti zabraňovať väzbovej aktivite α_νβ5, α_νβ₃ a α.||_όβ3 v stanoveniach viazania ligandov s purifikovanými receptormi. Metódy pre tieto väzbové štúdie opísali Barbas a kol., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:10003-10007 (1993), Smith a kol., J. Biol. Chem., 265:11008-11013 (1990) a Pfaff a kol., J. Biol. Chem., 269:2023320238 (1994), ktoré sa tu zverejňujú vo forme citácie.

Opisuje sa spôsob identifikácie antagonistov v stanovení viazania ligandu s receptorom, v ktorom je receptor imobilizovaný na pevnom nosiči a ligand, ako i antagonista sú rozpustné. Opisuje sa taktiež stanovenie viazania ligandu s receptorom, pri ktorom je ligand imobilizovaný na pevnom nosiči a receptor, ako i antagonisty sú rozpustné.

Stručne opísané, vybrané purifikované integríny sa jednotlivo imobilizovali v Titertek mikrotitrovacích jamkách v množstve 50 nanogramov (ng) na pokrytie jednej jamky. Purifikácia receptorov použitých v stanoveniach viazania ligandu s receptorom je dobre známa v danej vednej disciplíne a dá

31116/H ľahko uskutočniť postupmi známymi odborníkom v danej oblasti. Po 18 hodinovej inkubácii pri teplote 4 °C sa nešpecifické väzbové miesta na platničke blokovali s 10 miligramami/mililiter (mg/ml) bovinného sérum albumínu (BSA) vo fyziologickom roztoku pufrovanom Tris. V rámci inhibičných štúdií sa testovala schopnosť rôznych koncentrácií vybraných protilátok alebo peptidov blokovať viazanie ¹²⁵l-vitronektínu alebo iných značených ligandov k integrínovým receptorom α_νβ5, α_νβ3, α_νβι, a αι^β3.

Hoci tieto ligandy vykazujú optimálnu väzbu s príslušným integrínom, vitronektín s α_νβδ a α_νβ3 a fibrinogén s amfo, inhibícia vo väzbových Štúdiách, s použitím protilátok alebo peptidov na blokovanie viazania vitronektínu k ľubovoľnému z týchto receptorov umožňuje presné určenie množstva peptidu v mikromóloch na liter (μΜ), ktoré je nevyhnutné na polovičnú inhibíciu maximálneho viazania receptora s ligandom. Rádioaktívne označené ligandy sa použili v 1 nM koncentráciách a viazanie sa ovplyvňovalo neznačenými syntetickými peptidmi. Po trojhodinovej inkubácii sa premytím odstránil voľný ligand a viazaný ligand sa stanovil kvantifikáciou gama žiarenia.

Takže tu opísané stanovenie väzby ligandu s receptorom sa používa na testovanie cirkulárnych ako i linearizovaných syntetických peptidov, ako aj monoklonálnych protilátok a organických molekúl, ktoré vykazujú selektívnu špecifitu pre daný integrínový receptor, konkrétne α_νβ5, keďže pri využití tohto vynálezu sa použili antagonisty vitronektínového receptora (α_νβδ).

Príklad 8

In vivo represia rastu nádorového tkaniva pomocou a^s antagonistov meraná pomocou chimerického myšieho : ľudského modelu

In vivo chimerický myší: ľudský model sa vytvoril výmenou časti pokožky SCID myši za ľudskú novorodeneckú pokožku. In vivo chimerický myší : ľudský model sa pripravil v podstate tak, ako to opísali Yan a kol., J. Clin. Invest., 91:986-996 (1993). Stručne opísané, 2 cm² štvorcovej plochy pokožky sa odstránili chirurgicky z SCID myši (6-8 týždňov starej) a nahradili sa ľudskou

31116/H pokožkou. Myš sa uviedla do anestézie a z každej strany bočnej abdominálnej oblasti sa z plochy 5 cm² oholila srsť. Odstránením pokožky v jej plnej hrúbke smerom dolu k fascii sa pripravili dve okrúhle lôžka pre štep s plochou 2 cm². Štepy ľudskej pokožky sa odobrali z ľudskej novorodeneckej pokožky v jej plnej hrúbke a s rovnakou veľkosťou a umiestnili sa do ranových lôžok, kde sa prišili. Štep sa prikryl s náplasťou Band-Aid, ktorá sa prišila ku koži. Na prekrytie rany sa použila taktiež plátená páska Micropore.

Po prijatí pokožkového štepu sa ľudská pokožka zaočkovala bunkami melanómu. Na vytvorenie solídnych ľudských nádorov na ľudských pokožkových štepoch prítomných na SCID myšiach sa použila ľudská melanómová bunková línia. Do ľudského pokožkového štepu sa intradermálnou injekciou zaviedla bunková suspenzia 2 x 10⁶ buniek M21L, pochádzajúca z jednej bunky. Myši sa potom sledovali počas 2 až 4 týždňov, aby sa umožnil rast merateľných ľudských nádorov.

Po vytvorení merateľného nádoru sa myši podala intraperitoneálna injekcia 250 pg peptidu (v objeme 100 μΙ) so sekvenciou č. 9 (cyklický peptid Arg-Gly-Asp-D-Phe-Asn-NMeVal obsahujúci RGD) alebo kontrolný peptid, cyklo(Arg-pAla-Asp-D-Phe-Val), trikrát týždenne počas 3 týždňov. Na konci tohto obdobia sa nádor odobral a analyzovala sa jeho hmotnosť a histológia.

Výsledky sú zobrazené na obrázku 9, kde sa objem nádoru v mm³ vyniesol na os Y oproti pôsobeniam peptidov na osi X. Testovaný peptid so sekvenciou č. 9, označený na obrázku ako peptid 189, preukazne redukoval objem nádoru na približne 25 mm³ v porovnaní s kontrolným peptidom (označeným ako peptid 601), kde bol objem nádoru väčší ako 300 mm³.

Takže blokovanie α_νβ₅ receptora intravenóznym podaním α_νβδ antagonistického peptidu 189 malo za následok regresiu melanómového nádoru v tomto modelovom systéme tým istým spôsobom ako v CAM modelovom systéme a modelovom systéme králičích očí tak, ako sa predtým opísalo.

31116/H

V iných experimentoch s melanómovými nádorovými bunkami M21-L v chimerickom myšom : ľudskom testovacom systéme, sa porovnala odozva na mAb LM609 s odpoveďou získanou so syntetickým peptidom 85189 (sekvencia č. 9) a v porovnaní s kontrolným syntetickým peptidom 69601 (sekvencia č. 5). Stanovenie sa uskutočnilo tak, ako sa vyššie opísalo. Výsledky zobrazené na obrázku 21 ukazujú, že syntetický peptid 85189 redukoval objem nádoru pod 25 mm³ v porovnaní s kontrolným peptidom, kde bol objem nádoru približne 360 mm³. Použitá mAb LM609 taktiež redukovala objem nádoru na približne 60 mm³.

Takže výsledkom blokovania α_νβ₃ receptora intravenóznou aplikáciou c^3-špecifickej protilátky LM609 a peptidov bola regresia karcinómu v tomto modelovom systéme v porovnaní s inými modelovými systémami opísanými v tomto vynáleze.

V ďalších stanoveniach so SCID myším modelom, ktorý mal merateľné M21-L nádory, sa v predbežných analýzach vyhodnotila krivka závislosti na dávke peptidov 69601 (kontrola) a 85189 (testovaný peptid) podaných injekčné v koncentračnom rozsahu od 10 po 250 μg/ml. Po pôsobení uvedených látok sa určil priemerný objem a hmotnosť odstránených nádorov a výsledky sú uvedené na obrázkoch 22A a 22B. Peptid 85189 bol účinný v inhibícii rastu M21-L nádoru v rámci testovaného koncentračného rozsahu v porovnaní s pôsobením kontrolného peptidu, pričom najúčinnejšia dávka bola 250 pg/ml.

Kvôli analýze časovej závislosti účinnosti ovplyvnenia peptidom 85189 sa hodnotili dva režimy ovplyvnenia v tom istom SCID nádorovom modeli. V jednom teste sa ovplyvnenie ktorýmkoľvek peptidom (85189 alebo 69601) začalo na šiesty deň, pričom deň 0 bol deň subkutánneho injekčného podania 3 x 10⁶ M21-L nádorových buniek do myšej pokožky, s intraperitoneálnym injekčným podaním 250 μg/ml peptidu 85189 alebo kontrolného peptidu 69601 každý druhý deň až do 29. dňa. Druhé stanovenie sa uskutočnilo identicky, avšak s tým rozdielom, že pôsobenie peptidmi sa začalo na dvadsiaty deň. Na

31116/H konci stanovenia sa nádory odstránili a určil sa priemerný objem nádoru v mm³. Údaje sa vyniesli do grafu v tejto podobe +/- štandardná chyba priemeru.

Výsledky týchto stanovení, ktoré sú zobrazené na obrázkoch 23A a 23B naznačujú, že peptid 85189 na rozdiel od peptidu 69601 inhiboval rast nádoru počas rôznych dní potom, čo sa začalo ovplyvňovanie v závislosti od konkrétneho režimu ovplyvňovania. Takže peptid 85189 je efektívnym α_νβδ antagonistom angiogenézy, ako i nádorového rastu.

Pre určenie efektívnosti iných α_νβδ antagonistov tohto vynálezu, menovite protilátok, MMP-2 preparátov, pripravených predtým a anorganických molekúl, ktoré sa pripravili tak, ako sa opísalo v príklade 10, sa použil vyššie uvedený SCID/ľudský chimerický model.

Príklad 9

Príprava myšieho modelu retinálnei angiogenézy sprostredkovanej ayfe a jej inhibícia gJ3s antagonistami

Nový myší model štúdia vplyvov systémovo podávaných α_νβ3 3 ανβδ antagonistov, konkrétne cyklických peptidov na retinálnu angiogenézu sa použil na základe pozorovania expresie oboch integrínov v retinálnom neovaskulárnom tkanive v príklade 2C. U novonarodených myší sa tvorí povrchová retináina vaskulatúra počas prvých dvoch týždňov po narodení, čím vzniká bohatá, silne rozvetvená sieť ciev, ktoré majú počiatok v oblasti vstupu zrakového nervu a rozprestiera sa periferálne, čím sa pokrýva retinálny povrch podobným spôsobom ako sa to pozorovalo u ostatných cicavcov a u ľudí (Jiang a kol., Glia, 15:1-10 (1995).

V tomto modeli sa novonarodeným myšiam dvakrát denne počas štyroch dní začínajúc odo dňa 0 podala subkutánna injekcia s cyklickým peptidom RGDfV (sekvencia č. 4) (ktorý sa taktiež označuje ako peptid 203), alebo kontrolným peptidom RADfV (sekvencia č. 5). Na piaty deň po narodení sa

31116/H myšiam odstránili očné buľvy a fixovali sa 4,0 % paraformaldehydom (PFA) pri laboratórnej teplote.

Na kvantifikáciu myšej retinálnej angiogenézy sa merala vzdialenosť od vstupu zrakového nervu po najvzdialenejší bod vybranej cievy, ktorá sa vybrala v každom zo šiestich sektorov, na ktoré sa rozdelil kruh so stredom v mieste vstupu zrakového nervu. Vypočítala sa priemerná vzdialenosť a priemer sa vyrátal pomocou podobných údajov získaných z celého vrhu mláďat. Kvôli meraniu celkového objemu retinálnych krvných ciev sa celý objekt skenoval po 2,0 pm hrubých optických rezoch, ktoré sa uložili do pamäte. Na stanovenie citlivosti a spočítanie štvorcových pixlov na každom reze sa použila „seed„ funkcia programu Lasersharp od firmy Bio-Rad. Kvôli sumarizácii všetkých rezov a určeniu hodnoty pre všetky vaskulárne štruktúry sa na program napísal postup vo forme makra.

Pri priamom meraní rastu ciev z fotografií v dvoch rovinách sa ukázalo, že systémovo podaný peptidový antagonista 203 inhiboval retinálnu vaskulogenézu o 44 % v porovnaní s kontrolným peptidom (n=9, p<0,0000001, párový ŕ-test). Keďže sa nepozoroval žiadny štatisticky významný rozdiel medzi neovplyvnenou novonarodenou myšou a päťdňovou myšou, ktorá dostávala peptid 203, peptidový antagonista účinne inhiboval angiogenézu. Navyše sa nepozoroval žiadny štatisticky významný rozdiel medzi neovplyvnenou päťdňovou myšou a rovnako starou myšou, ktorá dostávala kontrolný peptid. Takže inhibícia retinálnej vaskulogenézy u novonarodených myší ovplyvnených RGDfV mala v porovnaní s neovplyvnenými myšami 100 % účinnosť.

Pri použití kvantitatívnejšej analýzy, ktorá zohľadňovala trojrozmernú podstatu rastu ciev, sa zistila 78 % redukcia retinálneho vaskulárneho objemu u zvierat ovplyvnených peptidom 203 v porovnaní s kontrolou. Priemerný objem ciev zvierat ovplyvnených peptidom 203 bol 3,6 x 10⁶ pm³ a zvierat ovplyvnených kontrolným peptidom bol 15,7 x 10⁶ pm³. Objem, ktorý zaberali krvné cievy u neovplyvnených novorodených myší bol bez rozdielu v porovnaní s päťdňovými zvieratami ovplyvnenými peptidom 203.

31116/H

Vyššie uvedené výsledky ukázali, že antagonisty špecificky blokovali tvorbu nových krvných ciev bez toho, aby mali vplyv na už vyvinuté cievy. Výsledky naznačujú, že patológia retinálnej neovaskulárnej choroby sa líši od patológie pozorovanej u subretinálnej neovaskulárnej choroby, a že α_νβ5 antagonisty sú účinní pri liečbe pacientov s chorobou straty zraku spojenou s angiogenézou.

Podobné stanovenia sa uskutočnili s MMP-2 α_νβ₅ antagonistami pripravenými podľa príkladu 7 a organickými mimetickými α_νβδ antagonistami pripravenými podľa príkladu 10.

Príklad 10

Príprava antagonistov na báze organických molekúl

Syntéza zlúčenín 7, 9, 10, 12, 14, 15, 16, 17 a 18, ktoré predstavujú organické molekuly α_νβδ antagonistov, ktoré sa opisujú nižšie a sú taktiež zobrazené na príslušných obrázkoch. Výsledné organické molekuly, ktoré sa označujú ako organické mimetické látky tohto vynálezu, sa potom používajú pri spôsoboch inhibície angiogenézy sprostredkovanej α_νβδ.

Pre každú z nižšie uvedených syntéz sa optická otáčavosť merala na spektrofotometri Perkin-Elmer 241, zatiaľ čo UV a viditeľné spektrá sa zaznamenali na spektrometri Beckmann DU-70. ¹H a ¹³C NMR spektrá sa získali pri 400 a 500 MHz na spektrometri Bruker AMX-400 a AMX-500. Hmotnostné spektrá s vysokou rozlišovacou schopnosťou (HRMS) sa získali na hmotnostnom spektrometri VG ZAB-ZSE vo FAB (fast atóm bombardment) podmienkach. Stĺpcová chromatografia sa vykonala na silikagéli s veľkosťou zrna 70-230 (mesh). Preparatívna TLC sa vykonala na platniach Merck Art. 5744 (0,5 mm). Body topenia sa získali na prístroji od firmy Thomas Hoover.

31116/H

A) Zlúčenina 1: t-Boc-L-tyrozín benzylester, ktorý je znázornený na obrázku 10

Zlúčenina 1

Do roztoku /V-(ŕ-butoxykarbonyl)-L-tyrozínu (ŕ-fíoc-L-tyrozín) (1,0 ekvivalentov; Aidrich) v 0,10 molárnom (M) metylénchloride sa pridal dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (1,5 ekvivalentu) pri 25 °C a miešal sa na magnetickom miešadle 1 hodinu. Ďalej sa pridalo 1,5 ekvivalentu benzylakoholu a zmes sa miešala na magnetickom miešadle ďalších 12 hodín pri 25 °C. Reakčná zmes sa potom rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa dvakrát (2x) vodou, jedenkrát (1x) nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli. zlúčeninu 1, f-Boc-L-tyrozín benzylester je taktiež možné zakúpiť od firmy Sigma.

B) Zlúčenina 2: benzylester kyseliny (S)-3-(4-(4-brómbutyloxy)fenyl-2-N-tbutyloxykarbonylpropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 10 krok i)

Zlúčenina 2

Bľx

x.

- Benzyl ¹¹ r o I

Zmes ŕ-Boc-L-tyrozín benzylesteru (2 g, 5,38 mmol; syntetizovaný tak, ako sa vyššie opísalo), 1,4-dibrómbután (1,9 ml, 16,2 mmol; Aidrich), uhličitan horečnatý (5 g) a 18-crown-6 (0,1 g; Aidrich) sa zahrievala pri 80 °C 12 hodín.

3H16/H

Po ochladení sa precipitát odfiltroval a reakčná zmes sa vysušila do sucha vo vákuu. Hrubý produkt sa potom purifikoval kryštalizáciou s použitím 100 % hexánu, čím sa získalo 2,5 g (92 %) zlúčeniny 2.

C) Zlúčenina 3: benzylester kyseliny (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2-N-tbutyloxykarbonylpropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 10 krok ii)

Zlúčenina 3

Zlúčenina 2 (2,5 g, 4,9 mmol) sa miešala na magnetickom miešadle s azidom sodným (1,6 g, 25 mmol) v dimetylformamide (DMF) (20 ml) pri 25 °C 12 hodín. Rozpúšťadlo sa potom odparilo a na zvyšok sa pôsobilo vodou (približne 10 ml) a extrahoval sa dvakrát s etylacetátom. Organické vrstvy sa skombinovali, vysušili cez síran horečnatý a odparili sa, čím sa získalo 2,0 g (90 %) zlúčeniny 3 vo forme bezfarebnej sirupovitej látky. (FAB-MS: 469 (M+H⁺).

D) Zlúčenina 4: benzylester kyseliny (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2aminopropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 10 krok iii)

Zlúčenina 4

Zlúčenina 3 (2,0 g, 4,4 mmol) sa rozpustila v kyseline trifluóroctovej (TFA; 2 ml) a miešala sa na magnetickom miešadle 3 hodiny pri laboratórnej

3H16/H teplote. Odparením vo vákuu sa získalo 1,6 g zlúčeniny 4 (kvantitatívne vyhodnotené) vo forme bezfarebnej sirupovitej látky, ktorá sa použila bez ďalšej purifikácie v ďalšom kroku. FAB-MS.369 (M+H⁺).

E. Zlúčenina 5: benzylester kyseliny (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2butylsulfónamidpropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 10 krok iv)

Zlúčenina 5

N

Zmes zlúčeniny 4 (1,6 g; 4,3 mmol), butánsulfonátchloridu (0,84 ml; 6,6 mmol) a trietylamínu (1,5 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle v metylénchloride (20 ml) 12 hodín pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa potom odparila a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte, premyl sa zriedenou HCI, vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Po odparení do sucha sa hrubý produkt purifikoval pomocou flash chromatografie (silikagél, toluén/etylacetát 15:1), čím sa získalo 1,4 g (67 %) zlúčeniny 5 vo forme amorfnej tuhej látky.

F) Zlúčenina 6: kyselina (S)-3-(4-(4-aminobutyloxy)fenyl-2-butylsulfónamidopropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 10 krok v)

Zlúčenina 6

31116/H

Zlúčenina 5 (1,3 g; 2,6 mmol) sa rozpustila v 20 ml zmesi etylacetát/metanol/voda 5/3/1 a 0,2 ml kyseliny trifluóroctovej (TFA) a hydrogenovala sa vo vodíkovej atmosfére (tlak 1 atmosféra; prístroj firmy Parr Shaker) pri 25 °C v prítomnosti 100 mg paládia (10% na aktívnom uhlí). Po 3 hodinách sa katalyzátor odfiltroval a rozpúšťadlo sa odparilo, čím sa získala zlúčenina 6 vo forme olejového zvyšku. Po lyofilizácii zvody sa získal 1,0 g (kvantitatívne vyhodnotené) zlúčeniny 6 vo forme bieleho prášku. FAB-MS:373 (M+H⁺).

G) Zlúčenina 7: kyselina (S)-3-(4-(4-guanidínobutyloxy)fenyl-2-butylsulfónamidpropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 10 krok vi)

Zlúčenina 7

O

I!

NH

OH

Zlúčenina 6 (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimetylpyrazol-1-karboxamidínnitrát (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) a trietylamín (0,15 ml, 1,0 mmol) v dimetylformamide (DMF; 5 ml) sa zahrievali pri 60 °C 12 hodín. Po ochladení sa rozpúšťadlo odparilo vo vákuu a zvyšok sa purifikoval pomocou HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda + 0,3 % TFA od 99:1 po 1:99), čím sa po lyofilizácii získalo 50 mg (25 %) zlúčeniny 7 vo forme bieleho amorfného prášku. FAB-MS: 415 (M+H⁺), bod topenia: 70 °C.

H) Zlúčenina 8: kyselina (S)-3-(4-(4-aminobutyloxy)fenyl-2-N-t-butyloxykarbonylpropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 11 krok iii)

Zlúčenina 8

3H16/H

Zlúčenina 3 (0,5 g, 1,07 mmol) sa rozpustila v 10 ml zmesi etylacetát/metanol/voda 5/3/1 a 0,1 ml kyseliny trifluóroctovej (TFA) a hydrogenovala sa. vo vodíkovej atmosfére (tlak 1 atmosféra; prístroj firmy Parr Shaker) pri 25 °C v prítomnosti 30 mg paládia (10 % na aktívnom uhlí). Po 3 hodinách sa katalyzátor odfiltroval a rozpúšťadlo sa odparilo, čím sa získala zlúčenina 8 vo forme olejového zvyšku. Po lyofilizácii z vody sa získalo 370 mg (kvantitatívne vyhodnotené) zlúčeniny 8 vo forme bieleho prášku. FAB-MS: 353 (M+H⁺).

I) Zlúčenina 9: kyselina (S)-3-(4-(4-guanidinobutyloxy)fenyl-2-N-t-butyloxykarbonylpropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 11 krok iv)

Zlúčenina 9

Zlúčenina 8 (200 mg; 0,5 mmol), 3,5-dimetylpyrazol-1-karboxamidínnitrát (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) a trietylamín (0,15 ml, 1,0 mmol) v dimetylformamide (DMF; 5 ml) sa zahrievali pri 60 °C 12 hodín. Po ochladení sa rozpúšťadlo odparilo vo vákuu a zvyšok sa purifikoval pomocou HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda + 0,3 % TFA od 99:1 po 1:99), čím sa po lyofilizácii získalo 160 mg (90 %) zlúčeniny 9 vo forme bieleho amorfného prášku. FAB-MS: 395 (M+H⁺).

31116/H

J) Zlúčenina 10: kyselina (R)-3-(4-(4-guanidínobutyloxy)fenyl-2-butylsulfónamidpropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 12 kroky i-vi)

Zlúčenina 10

Identická postupnosť ako pri syntéze zlúčeniny 7 sa použila pri príprave D-tyrozínového analógu zlúčeniny 10, ktorého sa získalo 205 mg vo forme bieleho amorfného materiálu s FAB-MS: 415 (M+H⁺) tak, ako sa opisuje ďalej, pričom sa použili zlúčeniny 100-600 ako medziprodukty na syntézu zlúčeniny 10:

1) Zlúčenina 100: t-Boc-L-tyrozín benzylester, ktorý je znázornený na obrázku 12

Zlúčenina 100

Do roztoku /V-(ŕ-butoxykarbonyl)-D-tyrozínu (f-Boc-L-tyrozín) (1,0 ekvivalentov; Aldrich) v 0,10 M metylénchloride sa pridal dicyklohexylkarbodiimid (DCC) (1,5 ekvivalentu) pri 25 °C a následne sa miešal na magnetickom miešadle 1 hodinu. Ďalej sa pridalo 1,5 ekvivalentu benzylakoholu a zmes sa miešala na magnetickom miešadle ďalších 12 hodín pri 25 °C. Reakčná zmes sa potom rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran l l 16/H horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli.

2) Zlúčenina 200: benzylester kyseliny (R)-3-(4-(4-brómbutyloxy)fenyl-2-N-tbutyloxykarbonylpropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 12 krok i)

Zlúčenina 200

Zmes ŕ-Boc-L-tyrozín benzylesteru (2,0 g, 5,38 mmol; syntetizovaný tak, ako sa vyššie opísalo), 1,4-dibrómbutánu (1,9 ml, 16,2 mmol; Aldrich), uhličitanu horečnatého (5 g) a 18-crown-6 (0,1 g; Aldrich) sa zahrievala pri 80 °C 12 hodín. Po ochladení sa precipitát odfiltroval a reakčná zmes sa vysušila do sucha vo vákuu. Hrubý produkt sa potom purifikoval kryštalizáciou s použitím 100 % hexánu, čím sa získalo 2,5 g (92 %) zlúčeniny 200.

3) Zlúčenina 300: benzylester kyseliny (R)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2-N-tbutyloxykarbonylpropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 12 krok ii)

Zlúčenina 300

Zlúčenina 200 (2,5 g, 4,9 mmol) sa miešala na magnetickom miešadle s azidom sodným (1,6 g, 25 mmol) v dimetylformamide (DMF) (20 ml) pri 25 °C 12 hodín. Rozpúšťadlo sa potom odparilo a na zvyšok sa pôsobilo vodou

31116/H

100 (približne 10 ml) a extrahoval sa dvakrát s etylacetátom. Organické vrstvy sa skombinovali, vysušili cez síran horečnatý a odparili sa, čím sa získali 2,0 g (90 %) zlúčeniny 300 vo forme bezfarebnej sirupovitej látky (FAB-MS: 469 (M+H⁺).

4) Zlúčenina 400: benzylester kyseliny (R)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2aminopropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 12 krok iii)

Zlúčenina 400

Zlúčenina 300 (2,0 g; 4,4 mmol) sa rozpustila v kyseline trifluóroctovej (TFA; 2 ml) a miešala na magnetickom miešadle 3 hodiny pri laboratórnej teplote. Odparením vo vákuu sa získalo 1,6 g (kvantitatívne vyhodnotené) zlúčeniny 400 vo forme bezfarebnej sirupovitej látky, ktorá sa použila bez ďalšej purifikácie v ďalšom kroku. FAB-MS: 369 (M+H⁺).

5) Zlúčenina 500: benzylester kyseliny (R)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2butylsulfónamidopropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 12 krok iv)

Zlúčenina 500

N·:

U!

o

JJ.

O -Benzyl

Zmes zlúčeniny 400 (1,6 g; 4,3 mmol), butánsulfonátchloridu (0,84 ml;

6,6 mmol) a trietylamínu (1,5 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom

31116/H

101 miešadle v metylénchloride (20 ml) 12 hodín pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa potom odparila a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte, premyl sa zriedenou HCI, vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Po odparení do sucha sa hrubý produkt purifikoval pomocou flash chromatografie (silikagél, toluén/etylacetát 15:1), čím sa získalo 1,4 g (67 %) zlúčeniny 500 vo forme amorfnej tuhej látky.

6) Zlúčenina 600: kyselina (R)-3-(4-(4-aminobutyloxy)fenyl-2-butylsulfónamidpropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 12 krok v)

Zlúčenina 600

Zlúčenina 500 (1,3 g; 2,6 mmol) sa rozpustila v 20 ml zmesi etylacetát/metanol/voda 5/3/1 a 0,2 ml kyseliny trifluóroctovej (TFA) a hydrogenovala sa vo vodíkovej atmosfére (tlak 1 atmosféra; prístroj firmy Parr Shaker) pri 25 °C v prítomnosti 100 mg paládia (10 % na aktívnom uhlí). Po troch hodinách sa katalyzátor odfiltroval a rozpúšťadlo sa odparilo, čím sa získala zlúčenina 600 vo forme olejového zvyšku. Po lyofilizácii z vody sa získalo 1,0 gram (kvantitatívne vyhodnotené) zlúčeniny 600 vo forme bieleho prášku. FAB-MS: 373 (M+H⁺).

7) Zlúčenina 10: kyselina (R)-3-(4-(4-guanidínobutyloxy)fenyl-2-butylsulfónamidopropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 12 krok vi)

Zlúčenina 600 (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimetylpyrazol-1karboxamidínnitrát (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) a trietylamín (0,15 ml, 1,0 mmol) v dimetylformamide (DMF; 5 ml) sa zahrievali pri

31116/H

102 °C 12 hodín. Po ochladení sa rozpúšťadlo odparilo vo vákuu a zvyšok sa purifikoval pomocou HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda + 0,3 % TFA od 99:1 po 1:99), čím sa po lyofilizácii získalo 50 mg (25 %) zlúčeniny 10 vo forme bieleho amorfného prášku. FAB-MS: 415 (M+H⁺), bod topenia: 70 °C.

K) Zlúčenina 11: Benzylester kyseliny (S)-3-(4-(4-azidobutyloxy)fenyl-2-(10gáforsulfónamid)propiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 13

Zlúčenina 11 o

o

Zmes zlúčeniny 4 (1,0 g; 2,7 mmol), 10-gáforsulfonátchloridu (6,6 mmol; Aldrich Chemical Company) a trietylamínu (1,5 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle v metylénchloride (20 ml) 12 hodín pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa potom odparila a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte, premyl sa zriedenou HCI, vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Po odparení do sucha sa hrubý produkt purifikoval pomocou flash chromatografie (silikagél, toluén/etylacetát 15:1), čim sa získalo 1,4 gramu (67 %) zlúčeniny 11 vo forme amorfnej tuhej látky.

L) Zlúčenina 12: Kyselina (S)-3-(4-(4-guanidínobutyloxy)fenyi-2-(10gáforsulfónamidjpropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 13 kroky i-ii) Zlúčenina 12 n

NH

H₂N nh

II

3I!16/H

103

Zlúčenina 12 sa získala po hydrogenácii a guanylácii zlúčeniny 11 podľa nasledujúceho postupu:

Krok i: zlúčenina 11 (1,3 g; 2,6 mmol) sa rozpustila v 20 ml zmesi etylacetát/metanol/voda 5/3/1 a 0,2 ml kyseliny trifluóroctovej (TFA) a hydrogenovala sa vo vodíkovej atmosfére (tlak 1 atmosféra; prístroj firmy Parr Shaker) pri 25 °C v prítomnosti 100 mg paládia (10 % na aktívnom uhlí). Po troch hodinách sa katalyzátor odfiltroval a rozpúšťadlo sa odparilo, čím sa získal medziprodukt ako amín vo forme olejového zvyšku. Po lyofilizácii z vody sa získalo 1,0 gramu (kvantitatívne stanovené) medziproduktu ako amínu vo forme bieleho prášku, ktorý sa ďalej spracoval nasledujúcim spôsobom:

Krok ii: vyššie vytvorený medziprodukt vo forme amínovej zlúčeniny (200 mg, 0,5 mmol), 3,5-dimetylpyrazol-1-karboxamidínnitrát (DPFN) (170 mg; 0,8 mmol; Aldrich Chemical Company) a trietylamín (0,15 ml, 1,0 mmol) v dimetylformamide (DMF; 5 ml) sa zahrievali pri 60 °C 12 hodín. Po ochladení sa rozpúšťadlo odparilo vo vákuu a zvyšok sa purifikoval pomocou HPLC (Lichrocart RP-18, gradient acetonitril/voda + 0,3% TFA od 99:1 po 1:99), čím sa po lyofilizácii získalo 50 mg (25 %) zlúčeniny 12 vo forme bieleho amorfného prášku. FAB-MS: 509,6 (M+H⁺).

M) Zlúčenina 13: benzylester kyseliny (S)-3-(4-(5-brómpentyloxy)fenyl-2-N-tbutyloxykarbonylpropiónovej, ktorý je znázornený na obrázku 13

Zlúčenina 13

RB

γ O-Benzyl HN —BOC

Zmes f-Boc-L-tyrozín benzylesteru (4,5 gramu, 12,1 mmol; zlúčenina 1 syntetizovaná tak, ako sa vyššie opísalo), 1,5-dibrómpentánu (5 ml, 36,7 mmol;

3l l 16/H

104

Aldrich), uhličitanu horečnatého (10 g) a 18-crown-6 (0,25 g; Aldrich) sa zahrievala pri 80 °C 12 hodín. Po ochladení sa precipitát odfiltroval a reakčná zmes sa vysušila do sucha vo vákuu. Hrubý produkt sa potom purifikoval kryštalizáciou s použitím 100 % hexánu, čím sa získalo 5,35 g (85 %) zlúčeniny

13.

N) Zlúčenina 14: kyselina (S)-3-(4-(5-guanidínopentyloxy)fenyl-2-butylsulfónamidopropiónová, ktorá je znázornená na obrázku 13 kroky i-v)

Zlúčenina 14

Päťkroková reakčná postupnosť, zahrňujúca výmenu bromidu za azid, odštiepenie Boe-, sulfonyláciu s butánsulfonátchloridom, hydrogenáciu a guanyláciu s DPFN, sa vykonala rovnakými postupmi ako sú postupy opísané vyššie, pričom zlúčeniny 1-6 sa použili ako medziprodukty na vytvorenie zlúčeniny 7, alebo zlúčeniny 100-600 sa použili na vytvorenie zlúčeniny 10 tak, ako sa vyššie zverejnilo. Zlúčenina 14 sa získala vo forme bieleho prášku s FAB-MS: 429 (M+H⁺).

O) Zlúčenina 15: dihydrochloríd 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-aminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinónu, ktorý je znázornený na obrázku 14

1) Syntéza východiskového materiálu 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroxyfenyljpropionátu pre zlúčeninu 15

Zlúčenina 15

31116/H

105

Ο

Východiskový materiál 2-/V-BOC-amino-3-(4-hydroxyfenyl)propionát sa získal esterifikáciou (D alebo L), /\/-(ŕ-butoxykarbonyl)-L(D)-tyrozínu (ŕ-Boc-L(D)tyrozínu) (1,0 ekvivalentov; Sigma) v 0,10 M metanole a zriedenej 1 % HCI. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle 12 hodín pri 25 °C, neutralizovala sa prechodom cez uhličitan draselný a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 2-/V-BOC-amino-3-(4-hydroxyfenyl)propionát.

2) Syntéza východiskového materiálu 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónu pre zlúčeninu 15: podľa nasledujúceho trojkrokového postupu:

p-aminobenzonitril (1,0 ekvivalentov; Aldrich) v metylénchloride (0,10 M) sa miešal na magnetickom miešadle s 2,3-epoxypropanolom (1,0 ekvivalentov; Aldrich) 12 hodín pri 25 °C. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý

4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril (1,0 ekvivalentov; ktorý sa opísal vyššie) v dimetylformamide (0,10 M) sa pri 25 °C miešal na magnetickom miešadle s dietylkarbonátom (1,1 ekvivalentov; Aldrich) a ŕ-butylátom draselným (1,1 ekvivalentov, Aldrich) pri 110 °C 6 hodín. Potom sa reakčná zmes rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou

31H6/H

106 chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymetyl-2oxazolidín a ten sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymetyl-2-oxazolidín (1,0 ekvivalentov; ktorý sa opísal vyššie) v metylénchloride (0,10 M) sa pri 25 °C miešal na magnetickom miešadle s 1,1 ekvivalentmi sírovodíka, 1,1 ekvivalentmi metyljodidu a 1,1 ekvivalentmi acetátu amónneho. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle 6 hodín a potom sa rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal amidín, ktorý sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

1,0 ekvivalentov amidínu, syntetizovaného tak, ako sa vyššie opísalo, sa chránilo s 1,1 ekvivalentmi BOC-ON (2-(BOC-oxyimino)-2-fenylacetonitril; Aldrich) v metylénchloride (0,10 M) a miešalo sa pri 25 °C na magnetickom miešadle 6 hodín. Potom sa reakčná zmes rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom esterifikoval v 0,10 M metylénchloride a v 1,1 ekvivalentoch metánsulfonylchloridu. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle pri 0 °C 6 hodín a potom sa reakcia ukončila pridaním vody (5 ekvivalentov) a potom sa rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 3-p-/V-BOCamidinofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinón.

3) Spojenie medziproduktov 2-N-BOC-amino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu s 3p-N-BOC-amidinofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónom za účelom vytvorenia chránenej formy zlúčeniny 15, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2metoxykarbonyl-2-N-BOC-aminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinónu

31116/H

107

Zmes 1,9 gramu 2-A/-BOC-amino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu (ktorý sa opísal vyššie), 20 ml dimetylformamidu (DMF) a NaH (1,0 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle 30 minút pri laboratórnej teplote. Po miešaní sa pridalo 1,8 g 3-p-/\/-BOC-amidinofenyi-5-sulfonyloxymetylmetán-2oxazolidinónu (ktorý sa opísal vyššie) v 10 ml dimetylformamidu (DMF) a miešal sa znovu 15 minút pri laboratórnej teplote. Potom sa reakčná zmes rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získala chránená forma zlúčeniny 15, 3-(4-BOC-amidinofenyl)5-(4-(2-metoxykarbonyl-2-A/-BOC-aminoetyl)fenyoxyl-metyl-2-oxazolidinón, ktorá sa preniesla do nasledujúceho kroku.

4) Odstránenie ochranných skupín z chránenej formy zlúčeniny 15 a vytvorenie zlúčeniny 15: dihydrochlorid 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-aminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinónu, obrázok 14

Na chránenú formu zlúčeniny 15, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2metoxykarbonyl-2-/V-BOC-aminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinónu (1,0 ekvivalentov; syntetizovaná tak, ako sa vyššie opísalo) sa pôsobilo 4 ml 2N NaOH 4 hodiny pri laboratórnej teplote. Do zmesi sa potom pridávalo po kvapkách 40 ml 2N roztoku HCI v dioxáne pri teplote 0 °C až 25 °C počas 3 hodín. Potom sa reakcia ukončila pridaním hydrogenuhličitanu sodného (5 ekvivalentov) a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získala zlúčenina 15: dihydrochlorid 3-(4aminofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-amidinoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinónu; bod topenia 165 °C (d).

31116/H

108

P) Zlúčenina 16: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-N-butylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón, ktorý je znázornený na obrázku 14

1) Syntéza východiskového materiálu 2-N-butylsulfonylamino-3-(4hydroxyfenyljpropionátu pre zlúčeninu 16

Zlúčenina 16

o , .COOH Ί

NH -SO₂

Východiskový materiál 2-/V-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionát sa získal esterifikáciou (D alebo L) tyrozínu (1,0 ekvivalentov; Sigma) v 0,10 M metanoie a zriedenej 1 % HCI. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle 12 hodín pri 25°C, potom sa neutralizovala prechodom cez uhličitan draselný a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

Zmes hore uvedenej zlúčeniny (4,3 mmol), butylsulfonátchloridu (6,6 mmol) a trietylamínu (1,5 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle v metylénchloride (20 ml) 12 hodín pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa potom odparila a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte, premyl sa rozriedenou HCI, vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a vodou. Po odparení do sucha sa hrubý produkt purifikoval flash chromatografiou (silikagél, toluén/etylacetát 15:1), čím sa získala titulná zlúčenina.

2) Syntéza východiskového materiálu 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónu pre zlúčeninu 16: podľa nasledujúceho trojkrokového postupu:

31U6/H

109 p-aminobenzonitril (1,0 ekvivalentov; Aldrich) v metylénchloride (0,10 M) sa miešal na magnetickom miešadle s 2,3-epoxypropanolom (1,0 ekvivalentov; Aldrich) 12 hodín pri 25 °C. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt 4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril (1,0 ekvivalentov; ktorý sa opísal vyššie) v dimetylformamide (0,10 M) sa pri 25 °C miešal na magnetickom miešadle s dietylkarbonátom (1,1 ekvivalentov; Aldrich) a ŕ-butylátom draselným (1,1 ekvivalentov, Aldrich) pri 110 °C 6 hodín. Potom sa reakčná zmes rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymetyl-2oxazolidín a preniesol sa do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymetyl-2-oxazolidín (1,0 ekvivalentov; ktorý sa opísal vyššie) v metylénchloride (0,10 M) sa pri 25 °C miešal na magnetickom miešadle s 1,1 ekvivalentmi sírovodíka, 1,1 ekvivalentmi metyljodidu a 1,1 ekvivalentmi acetátu amónneho. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle 6 hodín a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal amidín, ktorý sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

1,0 ekvivalentov amidínu, syntetizovaného tak, ako sa vyššie opísalo, sa chránilo s 1,1 ekvivalentmi BOC-ON (2-(BOC-oxyimino)-2-fenylacetonitril; Aldrich) v metylénchloride (0,10 M) a miešalo sa pri 25 °C na magnetickom miešadle 6 hodín. Potom sa reakčná zmes rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom esterifikoval v 0,10 M metylénchloride a 1,1 ekvivalentoch metánsulfonylchloridu. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle pri

31116/H

110 °C 6 hodín a potom sa reakcia ukončila pridaním vody (5 ekvivalentov) a potom sa rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 3-p-/V-BOCamidinofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinón.

3) Spojenie medziproduktov 2-N-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu s 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónom za účelom vytvorenia chránenej formy zlúčeniny 16, 3-(4-BOCamidinofenyi)-5-(4-(2-metoxykarbonyl-2-N-butylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinón

Zmes 1,9 gramu 2-/V-butylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu (ktorý sa vyššie opísal), 20 ml dimetylformamidu (DMF) a NaH (1,0 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle 30 minút pri iaboratórnej teplote. Po miešaní sa pridalo 1,8 g 3-p-/V-BOC-amidinofenyl-5sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónu (ktorý sa vyššie opísal) v 10 ml dimetylformamidu (DMF) a roztok sa miešal znovu 15 minút pri laboratórnej teplote. Potom sa reakčná zmes rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získala chránená forma zlúčeniny 16, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2-metoxykarbonyl2-/V-butylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinón, ktorá sa preniesla do nasledujúceho kroku.

4) Odstránenie ochranných skupín z chránenej formy zlúčeniny 16 a vytvorenie zlúčeniny 16: 3-(4-amidinofenyl)-5(4-(2-karboxy-2-N-butylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón, obrázok 14

31116/H

111

Na chránenú formu zlúčeniny 16, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2metoxykarbonyl-2-/\/-butylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinón (1,0 ekvivalentov; syntetizovaná tak, ako sa opísalo vyššie) sa pôsobilo 4 ml 2N NaOH dobu 4 hodín pri laboratórnej teplote. Do zmesi sa potom pridávalo po kvapkách 40 ml 2N roztoku HCI v dioxáne pri teplote 0 °C až 25 °C počas 3 hodín. Potom sa reakcia ukončila pridaním hydrogénuhličitanu sodného (5 ekvivalentov) a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získala zlúčenina 16: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-A/-butylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón; bod topenia 236-237 °C.

Q) Zlúčenina 17: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-N-propylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón, ktorý je znázornený na obrázku 14

1) Syntéza východiskového materiálu 2-N-propylsulfonylamino-3-(4hydroxyfenyljpropionátu pre zlúčeninu 17:

Zlúčenina 17

H,N'

NH =\ / N.

W // ^-COOH l'

NH — εοζ

Východiskový materiál 2-/V-propylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionát sa získal esterifikáciou (D alebo L) tyrozínu (1,0 ekvivalentov; Sigma) v 0,10 M metanole a zriedenej 1% HCI. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle 12 hodín pri 25 °C, potom sa neutralizovala prechodom cez uhličitan draselný a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran

31116/H

112 horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

Zmes hore uvedenej zlúčeniny (4,3 mmol), propylsulfonátchloridu (6,6 mmol) a trietylamínu (1,5 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle v metylénchloride (20 ml) 12 hodín pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa potom odparila a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte, premyl sa rozriedenou HCI, vodným roztokom hydrogénuhličitanu sodného a vodou. Po odparení do sucha sa hrubý produkt purifikoval flash chromatografiou (silikagél, toluén/etylacetát 15:1), čím sa získala titulná zlúčenina.

2) Syntéza východiskového materiálu 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónu pre zlúčeninu 17: podľa nasledujúceho trojkrokového postupu:

p-aminobenzonitril (1,0 ekvivalentov; Aldrich) v metylénchloride (0,10 M) sa miešal na magnetickom miešadle s 2,3-epoxypropanolom (1,0 ekvivalentov; Aldrich) 12 hodín pri 25 °C. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý 4-(2,3- dihydroxypropylamino)benzonitril sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

4-(2,3-dihydroxypropylamino)benzonitril (1,0 ekvivalentov; ktorý sa opísal vyššie) v dimetylformamide (0,10 M) sa pri 25 °C miešal na magnetickom miešadle s dietylkarbonátom (1,1 ekvivalentov; Aldrich) a ŕ-butylátom draselným (1,1 ekvivalentov, Aldrich) pri 110 °C 6 hodín. Potom sa reakčná zmes rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymetyl-2oxazolidín a preniesol sa do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymetyl-2-oxazolidín (1,0 ekvivalentov; ktorý sa opísal vyššie) v metylénchloride (0,10 M) sa pri 25 °C miešal na magnetickom miešadle s 1,1 ekvivalentmi sírovodíka, 1,1 ekvivalentmi metyljodidu a 1,1

31116/H

113 ekvivalentmi acetátu amónneho. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle 6 hodín a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal amidín, ktorý sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

1,0 ekvivalentov amidínu, syntetizovaného tak, ako sa vyššie opísalo, sa chránilo s 1,1 ekvivalentmi BOC-ON (2-(BOC-oxyimino)-2-fenylacetonitril; Aldrich) v metylénchloride (0,10 M) a miešalo sa pri 25 °C na magnetickom miešadle 6 hodín. Potom sa reakčná zmes rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom esterifikoval v 0,10 M metylénchloride a 1,1 ekvivalentoch metánsulfonylchloridu. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle pri 0 °C 6 hodín a potom sa reakcia ukončila pridaním vody (5 ekvivalentov) a potom sa rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 3-p-/V-BOCamidnofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinón.

3) Spojenie medziproduktov 2-N-propylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu s 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónom za účelom vytvorenia chránenej formy zlúčeniny 17, 3-(4-BOCamidinofenyl)-5-(4-(2-metoxykarbonyl-2-N-propylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinónu

Zmes 1,9 gramu 2-/V-propy!sulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu (ktorý sa vyššie opísal), 20 ml dimetylformamidu (DMF) a NaH (1,0 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle 30 minút pri laboratórnej teplote. Po miešaní sa pridalo 1,8 g 3-p-/V-BOC-amidinofenyl-5sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónu (ktorý sa vyššie opísal) v 10 ml

31116/H

114 dimetylformamidu (DMF) a miešal sa znovu 15 minút pri laboratórnej teplote. Potom sa reakčná zmes rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získala chránená forma zlúčeniny 17, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2-metoxykarbonyl2-A/-propylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinón, ktorá sa preniesla do nasledujúceho kroku.

4) Odstránenie ochranných skupín z chránenej formy zlúčeniny 17 a vytvorenie zlúčeniny 17: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-N-propylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón, obrázok 14

Na chránenú formu zlúčeniny 17, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2metoxykarbonyl-2-A/-propylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinón (1,0 ekvivalentov; syntetizovaný tak, ktorý sa opísal vyššie) sa pôsobilo 4 ml 2N NaOH počas 4 hodín pri laboratórnej teplote. Do zmesi sa potom pridávalo po kvapkách .40 ml 2N roztoku HCI v dioxáne pri teplote 0 °C až 25 °C v priebehu 3 hodín. Potom sa reakcia ukončila pridaním hydrogenuhličitanu sodného (5 ekvivalentov) a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získala zlúčenina 17: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-/\/-propylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón; bod topenia 200 °C (d).

R) Zlúčenina 18: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-N-etylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón, ktorý je znázornený na obrázku 14

1) Syntéza východiskového materiálu 2-N-etylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu pre zlúčeninu 18:

Zlúčenina 18

31116/H

115

•COOH

NH -SO

Východiskový materiál 2-A/-etylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionát sa získal esterifikáciou (D alebo L) tyrozínu (1,0 ekvivalentov; Sigma) v 0,10 M metanole a zriedenej 1 % HCI. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle 12 hodín pri 25 °C, potom sa neutralizovala prechodom cez uhličitan draselný a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

Zmes hore uvedenej zlúčeniny (4,3 mmol), etylsulfonátchloridu (6,6 mmol) a trietylamínu (1,5 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle v metylénchloride (20 ml) 12 hodín pri laboratórnej teplote. Reakčná zmes sa potom odparila a zvyšok sa rozpustil v etylacetáte, premyl sa rozriedenou HCI, vodným roztokom hydrogenuhličitanu sodného a vodou. Po odparení do sucha sa hrubý produkt purifikoval flash chromatografiou (silikagél, toluén/etylacetát 15:1), čím sa získala titulná zlúčenina.

2) Syntéza východiskového materiálu 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónu pre zlúčeninu 18: podľa nasledujúceho trojkrokového postupu:

p-aminobenzonitril (1,0 ekvivalentov; Aldrich) v metylénchloride (0,10 M) sa miešal na magnetickom miešadle s 2,3-epoxypropanolom (1,0 ekvivalentov; Aldrich) 12 hodín pri 25 °C. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý

4-(2,3- dihydroxyetylamino)benzonitril sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

31116/H

116

4-(2,3-dihydroxyetylamino)benzonitril (1,0 ekvivalentov; ktorý sa opísal vyššie) v dimetylformamide (0,10 M) sa pri 25 °C miešal na magnetickom miešadle s dietylkarbonátom (1,1 ekvivalentov; Aldrich) a ŕ-butylátom draselným (1,1 ekvivalentov, Aldrich) pri 110°C u 6 hodín. Potom sa reakčná zmes rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymetyl-2oxazolidín a preniesol sa do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

3-(4-kyanofenyl)-5-hydroxymetyl-2-oxazolidín (1,0 ekvivalentov; ktorý sa opísal vyššie) v metylénchloride (0,10 M) sa pri 25 °C miešal na magnetickom miešadle s 1,1 ekvivalentmi sírovodíka, 1,1 ekvivalentmi metyljodidu a 1,1 ekvivalentmi acetátu amónneho. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle 6 hodín a potom sa rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal amidín, ktorý sa preniesol do nasledujúceho kroku tak, ako je ďalej uvedené:

1,0 ekvivalentov amidínu, syntetizovaného tak, ako sa vyššie opísalo, sa chránilo s 1,1 ekvivalentmi BOC-ON (2-(BOC-oxyimino)-2-fenylacetonitril; Aldrich) v metylénchloride (0,10 M) a miešalo sa pri 25 °C na magnetickom miešadle 6 hodín. Potom sa reakčná zmes rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom esterifikoval v 0,10 M metylénchloride a v 1,1 ekvivalentoch metánsulfonylchloridu. Reakčná zmes sa miešala na magnetickom miešadle pri 0 °C 6 hodín a potom sa reakcia ukončila pridaním vody (5 ekvivalentov) a potom sa rozriedila s etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom

31116/H

117 purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získal 3-p-/V-BOCamidinofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinón.

3) Spojenie medziproduktov 2-N-etylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)~ propionátu s 3-p-N-BOC-amidinofenyl-5-sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónom za účelom vytvorenia chránenej formy zlúčeniny 18, 3-(4-BOCamidinofenyl)-5-(4-(2-metoxykarbonyl-2-N-etylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl2-oxazolidinónu

Zmes 1,9 gramu 2-/V-etylsulfonylamino-3-(4-hydroxyfenyl)propionátu (ktorý sa vyššie opísal), 20 ml dimetylformamidu (DMF) a NaH (1,0 ekvivalentov) sa miešala na magnetickom miešadle 30 minút pri laboratórnej teplote. Po miešaní sa pridalo 1,8 g 3-p-/V-BOC-amidinofenyl-5sulfonyloxymetylmetán-2-oxazolidinónu (ktorý sa vyššie opísal) v 10 ml dimetylformamidu (DMF) a miešal sa znovu 15 minút pri laboratórnej teplote. Potom sa reakčná zmes rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získala chránená forma zlúčeniny 18, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2-metoxykarbonyl2-/\/-etylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinón, ktorá sa preniesla do nasledujúceho kroku.

4) Odstránenie ochranných skupín z chránenej formy zlúčeniny 18 a vytvorenie zlúčeniny 18: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-N-etylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón, obrázok 14

Na chránenú formu zlúčeniny 18, 3-(4-BOC-amidinofenyl)-5-(4-(2metoxykarbonyl-2-/\/-etylsulfonylaminoetyl)fenyoxylmetyl-2-oxazolidinón (1,0 ekvivalentov; syntetizovaná tak, ako sa opísalo vyššie) sa pôsobilo 4 ml 2N NaOH dobu 4 hodín pri laboratórnej teplote. Do zmesi sa potom pridávalo po kvapkách 40 ml 2N roztoku HCI v dioxáne pri teplote 0 °C až 25 °C počas 3

31116/H

118 hodín. Potom sa reakcia ukončila pridaním hydrogénuhličitanu sodného (5 ekvivalentov) a potom sa rozriedila etylacetátom (0,10 M) a premyla sa 2x vodou, 1x nasýteným roztokom chloridu sodného a sušila sa cez síran horečnatý. Rozpúšťadlo sa potom odstránilo vo vákuu a hrubý produkt sa potom purifikoval stĺpcovou chromatografiou na silikagéli, čím sa získala zlúčenina 18: 3-(4-amidinofenyl)-5-(4-(2-karboxy-2-/V-etylsulfonylaminoetyl)fenoxy)metyl-2-oxazolidinón; bod topenia 212 °C (d).

Predchádzajúci opis patentu sa považuje za dostatočný, aby umožnil odborníkovi v danej oblasti použiť tento vynález. Odborníkom v danej oblasti budú z predchádzajúceho opisu, okrem modifikácií, ktoré sú tu zobrazené a opísané, zrejmé i rôzne ďalšie modifikácie tohto vynálezu, ktoré spadajú do rámca priložených patentových nárokov.

Claims (48)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Výrobok tvorený obalovým materiálom a farmaceutickým agens, ktorý je obsiahnutý v spomínanom obalovom materiáli, vyznačujúci sa tým, že farmaceutický agens je účinný na inhibíciu angiogenézy v tkanive, pričom spomínaný obalový materiál obsahuje označenie, ktoré indikuje, že spomínaný farmaceutický agens sa môže použiť na liečbu stavov pomocou inhibície angiogenézy, pričom farmaceutický agens je tvorený angiogenézu inhibujúcim množstvom α_νβ₅ antagonistu, ktorý pozostáva z polypeptidu s aminokyselinovou sekvenciou, ktorá zahrňuje časť karboxy- terminálnej domény metaloproteinázy matrixu, pričom spomínaný polypeptid je schopný sa viazať k integrínu α_νβ₅.'
2. 2. Výrobok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že polypeptid obsahuje sekvenciu aminokyselinových zvyškov zobrazenú vsekvenciách č. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 alebo 22.
3. 3. Výrobok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tkanivo je zapálené tkanivo a spomínaným stavom je artritída alebo reumatoidná artritída.
4. 4. Výrobok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tkanivo je solídny nádor alebo solídne nádorové metastázy.
5. 5. Výrobok podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že tkanivo je retinálne tkanivo a spomínaným stavom je retinopatia, diabetická retinopatia alebo degenerácia žltej škvrny.

   31116/H

   120
6. 6. α_νβ5 antagonista tvorený polypeptidom, ktorý má aminokyselinovú sekvenciu, ktorá zahrňuje časť karboxy- terminálnej domény metaloproteinázy matrixu, pričom spomínaný polypeptid je schopný sa viazať k integrínu α_νβδ·
7. 7. Antagonista podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že polypeptid obsahuje sekvenciu aminokyselinových zvyškov zobrazenú v sekvenciách č. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 alebo 22.
8. 8. Antagonista podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že polypeptidom je fúzny proteín.
9. 9. Antagonista podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že polypeptid má sekvenciu aminokyselinových zvyškov zobrazenú v sekvenciách č. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 alebo 22.
10. 10. Farmaceutický agens tvorený α_νβδ antagonistom podľa nároku 6 vo farmaceutický prijateľnom nosiči a v množstve dostatočnom na inhibíciu angiogenéz^ v tkanive.
11. 11. Spôsob inhibície angiogenézy v tkanive zahrňujúci podanie kompozitu do spomínaného tkaniva, pričom tento kompozit obsahuje angiogenézu inhibujúce množstvo α_νβδ antagonistu.
12. 12. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že antagonista je fúzny proteín, polypeptid, derivatizovaný polypeptid, cyklický polypeptid, monoklonálna protilátka alebo organická mimetická zlúčenina.

    31116/H

    121
13. 13. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že α_νβδ antagonista prednostne inhibuje väzbu fibrinogénu k α_νβδ v porovnaní s väzbou fibrinogénu k αι^β3·
14. 14. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že α_νβδ antagonista zahrňuje polypeptid, ktorý má sekvenciu aminokyselinových zvyškov, ktorá zahrňuje časť karboxy- terminálnej domény metaloproteinázy matrixu, pričom spomínaný polypeptid je schopný sa viazať k integrínu α_νβ₅.
15. 15. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že polypeptid má sekvenciu aminokyselinových zvyškov zobrazenú v sekvenciách č. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 alebo 22.
16. 16. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že polypeptid je fúzny proteín.
17. 17. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že polypeptid má sekvenciu aminokyselinových zvyškov zobrazenú v sekvenciách č. 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 alebo 22.
18. 18. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že tkanivo je zapálené tkanivo a spomínanou angiogenézou je angiogenéza zapáleného tkaniva.
19. 19. Spôsob podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že tkanivo je artritické tkanivo.

    31116/H

    122
20. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že artritické tkanivo sa nachádza u cicavcov s reumatoidnou artritídou.
21. 21. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že tkanivo je retinálne tkanivo pacienta s diabetickou retinopatiou a spomínaná angiogenéza je retinálna angiogenéza.
22. 22. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že tkanivo je solídny nádor alebo solídna nádorová metastáza a spomínaná angiogenéza je nádorová angiogenéza.
23. 23. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že podanie zahrňuje intravenózne, transdermálne, intrasynoviálne, intramuskulárne alebo perorálne podanie.
24. 24. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, že podanie sa vykonáva v spojení s chemoterapiou.
25. 25. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že podanie zahrňuje jedinú dávku podanú intravenózne.
26. 26. Spôsob indukcie regresie solídneho nádorového tkaniva pacienta zahrňujúci podanie kompozitu spomínanému pacientovi, pričom tento kompozit obsahuje terapeuticky účinné množstvo antagonistu α_νβδ integrínu, ktoré je dostačujúce na inhibíciu neovaskularizácie solídneho nádorového tkaniva.

    31116/H

    123
27. 27. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že antagonista je fúzny proteín, polypeptid, derivatizovaný polypeptid, cyklický polypeptid, monoklonálna protilátka alebo organická mimetická zlúčenina.
28. 28. Spôsob podľa nároku 26, vyznačujúci sa tým, že α_νβδ antagonista je α_νβδ antagonista podľa nároku 6.
29. 29. Spôsob inhibície rastu tkaniva neovaskularizácii podliehajúceho solídneho nádoru pacienta, ktorý zahrňuje podanie kompozitu spomínanému pacientovi, pričom tento kompozit obsahuje terapeuticky účinné množstvo antagonistu α_νβδ integrinu, ktoré je dostačujúce na inhibíciu rastu tkaniva solídneho nádoru.
30. 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že antagonista je fúzny proteín, polypeptid, derivatizovaný polypeptid, cyklický polypeptid, monoklonálna protilátka alebo organická mimetická zlúčenina.
31. 31. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že α_νβ₅ antagonista je α_νβδ antagonista podľa nároku 6.
32. 32. Spôsob liečby pacienta so zapáleným tkanivom, v ktorom sa vyskytuje neovaskularizácia, ktorý zahrňuje podanie kompozitu spomínanému pacientovi, pričom tento kompozit obsahuje terapeuticky účinné množstvo antagonistu α_νβδ integrinu.
33. 33. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že antagonista je fúzny proteín, polypeptid, derivatizovaný polypeptid, cyklický polypeptid, monoklonálna protilátka alebo organická mimetická zlúčenina.

    31116/H

    124
34. 34. Spôsob podľa nároku 32, vyznačujúci sa tým, že α_νβ₅ antagonista je α_νβδ antagonista podľa nároku 6.
35. 35. Spôsob liečby pacienta, u ktorého sa vyskytuje neovaskularizácia retinálneho tkaniva, kde liečba zahrňuje podanie kompozitu spomínanému pacientovi, pričom tento kompozit obsahuje neovaskularizáciu inhibujúce množstvo antagonistu α_νβδ integrínu.
36. 36. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že antagonista je fúzny proteín, polypeptid, derivatizovaný polypeptid, cyklický polypeptid, monoklonálna protilátka alebo organická mimetická zlúčenina.
37. 37. Spôsob podľa nároku 35, vyznačujúci sa tým, že α_νβδ antagonista je α_νβδ antagonista podľa nároku 6.
38. 38. Spôsob liečby restenózy vtákom tkanive pacienta, v ktorom dochádza k migrácii buniek hladkého svalstva následne po angioplastike, kde liečba zahrňuje podanie kompozitu spomínanému pacientovi, pričom tento kompozit obsahuje terapeuticky účinné množstvo antagonistu α_νβ₅ integrínu.
39. 39. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že antagonista je fúzny proteín, polypeptid, derivatizovaný polypeptid, cyklický polypeptid, monoklonálna protilátka alebo organická mimetická zlúčenina.
40. 40. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že α_νβ₅ antagonista je α_νβ5 antagonista podľa nároku 6.

    31116/H

    125
41. 41. Spôsob redukcie krvného zásobovania tkaniva, ktoré je potrebné na podporu nového rastu spomínaného tkaniva pacienta, ktorý zahrňuje podanie kompozitu spomínanému pacientovi, pričom tento kompozit obsahuje terapeuticky účinné množstvo antagonistu α_νβδ integrínu, dostatočné na redukciu spomínaného krvného zásobenia spomínaného tkaniva.
42. 42. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že antagonista je fúzny proteín, polypeptid, derivatizovaný polypeptid, cyklický polypeptid, monoklonálna protilátka alebo organická mimetická zlúčenina.
43. 43. Spôsob podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že α_νβδ antagonista je α_νβδ antagonista podľa nároku 6.
44. 44. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že angiogenéza je prítomná u pacienta, ktorý má očné ochorenie vybrané zo skupiny očných ochorení tvorenej diabetickou retinopatiou, s vekom spojenou degeneráciou žltej škvrny, predpokladanou očnou histoplazmózou, retinopatiou nedonosencov a neovaskulárnym glaukómom.
45. 45. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že angiogenéza je prítomná u pacienta, ktorý má neovaskulárnu poruchu rohovky, ktorá je vybraná zo skupiny porúch tvorenej transplantáciou rohovky, herpetickou keratitídou, luetickou keratitídou, pterygiom a neovaskulárnymi zápalovými zmenami v súvislosti s nosením kontaktných šošoviek (pannus).
46. 46. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že angiogenéza je indukovaná cytokínom.

    31116/H

    126
47. 47. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že cytokin patrí do skupiny tvorenej vaskulárnym endoteliálnym rastovým faktorom, transformujúcim rastovým faktorom-α a epidermálnym rastovým faktorom.
48. 48. Spôsob podľa nároku 46, vyznačujúci sa tým, že cytokin je vaskulárny endoteliálny rastový faktor a spomínaná angiogenéza patrí do skupiny tvorenej retinálnou angiogenézou, korneálnou angiogenézou, nádorovou angiogenézou a angiogenézou zapáleného tkaniva.