JP2000125861A

JP2000125861A - ヒト・アポトーシス抑制蛋白質ｎａｉｐに対するモノクローナル抗体と、ｎａｉｐの検定方法

Info

Publication number: JP2000125861A
Application number: JP10304550A
Authority: JP
Inventors: Shigemori Ikeda; 穣衛池田; Harumi Sakai; 治美酒井
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1998-10-26
Filing date: 1998-10-26
Publication date: 2000-05-09
Also published as: US6982322B1; CA2356595A1; WO2000024889A1; US20050202517A1; US20030108967A1; US7141435B2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト・アポトーシス抑制蛋白質ＮＡＩＰの簡
便かつ高精度の検定方法と、そのための材料を提供す
る。【解決手段】配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト
・アポトーシス抑制蛋白質ＮＡＩＰを特異的に認識する
モノクローナル抗体であって、配列番号１のアミノ酸番
号２５６−５８６のアミノ酸配列またはその一部配列か
らなるポリペプチドを含む免疫原によって免疫した哺乳
動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞株との融合細胞で
あるハイブリドーマ細胞群がそれぞれ産生する抗ＮＡＩ
Ｐモノクローナル抗体と、これらの抗体を用いたＮＡＩ
Ｐ検定方法、並びに検定キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願は、ヒト・アポトー
シス抑制蛋白質ＮＡＩＰを特異的に認識するモノクロー
ナル抗体と、このＮＡＩＰの免疫検定法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術とその課題】アポトーシスは、プログラム
された細胞死の一種であり、周囲の細胞との接触の欠
乏、細胞質の濃縮化、エンドヌクレアーゼの活性に関連
したクロマチンの凝縮および核凝縮、核の断片化、膜被
包性球状小体化、隣接するマクロファージもしくは上皮
細胞などによる球状小体の貪食、またはエンドヌクレア
ーゼ活性によりＤＮＡのヌクレオソーム単位が 180〜20
0 塩基長のＤＮＡに断片化するといった現象が観察さ
れ、このような現象が認められるアポプティック体細胞
の最終断片が隣接する細胞により貪食される機構として
論じられている（例えば、Immunology Today 7:115-11
9, 1986；Science 245:301-305, 1989 ）。

【０００３】このアポトーシスを制御する遺伝子として
しては、例えば、1985年に胞性Ｂ細胞腫から発見された
ガン遺伝子のひとつであるbcl-2 遺伝子が知られてい
る。このbcl-2 遺伝子は、免疫系や神経性の細胞で高頻
度に発現しており、この遺伝子の発現産物はこれら細胞
のアポトーシスを抑制することによって、ヒトの免疫機
能や神経系機能の恒常性を維持していると考えられてい
る。また、このbcl-2 遺伝子は、胎児では特に広範囲に
は発現していることから、個体発生の際の形態形成にも
重要な役割を果たしていると考えられてもいる。

【０００４】一方、この出願の発明者等は、家族性の遺
伝病である脊髄性筋萎縮症候群（Spinal Mascular Atro
py：ＳＭＡ）の原因遺伝子として、ヒト染色体５ｑ１
３．１領域より神経細胞アポトーシス抑制蛋白質（Neur
onal Apoptosis Inhibitory Protein : ＮＡＩＰ）遺伝
子を単離している（Roy et al., Cell 80: 167-178, 19
95）。すなわち、このＮＡＩＰ遺伝子の変異またはコピ
ー数の減少が脊髄ニューロンのアポトーシスを生じさ
せ、これがＳＭＡ発症の原因となると想定されている。
また、このＮＡＩＰ遺伝子を種々の培養細胞に導入し、
アポトーシスを誘起させる刺激を細胞に与えたところ、
その細胞死が抑制されることが明らかにされ（Liston e
t al., Nature 379:349-353, 1996 ）、ＮＡＩＰが神経
細胞だけではなく、体細胞全体のアポトーシス抑制因子
であることが明らかにされている。

【０００５】そしてこの出願の発明者等は、ＮＡＩＰの
全アミノ酸配列とＮＡＩＰをコードするｃＤＮＡを単離
し、既に特許出願している（特願平９−２８０８３１
号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】前記のとおり、ＮＡＩ
ＰはＳＭＡをはじめとする各種アポトーシス性疾患に関
与する蛋白質であり、それらの疾患の発症メカニズムの
解明、発症の危険性の診断、発症の予防もしくは病態の
改善、治療のための医療技術および薬剤の開発等のため
には、ＮＡＩＰ発現量を正確に検定することが不可欠で
ある。

【０００７】この出願の発明は以上のとおりの事情に鑑
みてなされたものであり、ＮＡＩＰの検定に不可欠な抗
ＮＡＩＰモノクローナル抗体と、このモノクローナル抗
体を用いたＮＡＩＰ検定方法を提供することを課題とし
ている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この出願の発明者等は、
前記の課題を解決するために検討を重ねた結果、ＮＡＩ
Ｐの抗原領域が、配列番号１のアミノ酸番号２５６−５
８６の領域であることを見出した。この出願は、この知
見に基づき、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト・
アポトーシス抑制蛋白質ＮＡＩＰを特異的に認識するモ
ノクローナル抗体であって、配列番号１のアミノ酸番号
２５６−５８６のアミノ酸配列またはその一部配列から
なるポリペプチドを含む免疫原によって免疫した哺乳動
物の抗体産生細胞とミエローマ細胞株との融合細胞であ
るハイブリドーマ細胞群がそれぞれ産生する抗ＮＡＩＰ
モノクローナル抗体を提供する。

【０００９】この出願はまた、モノクローナル抗体の具
体例として、エピトープ領域が配列番号１のアミノ酸番
号３５４−３６８の領域であるモノクローナル抗体ｈｎ
ｍｃ３６５と、同じくアミノ酸番号３７３−３８７の領
域であるモノクローナル抗体ｈｎｍｃ３８１を提供す
る。またこの出願は、第１のＮＡＩＰ検定方法として、
マーカー標識した前記の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体
とＮＡＩＰを含む試料とを接触させて標識抗体とＮＡＩ
Ｐを結合させ、この結合体におけるマーカーのシグナル
強度を測定することを特徴とする方法を提供する。

【００１０】この第１の検定方法においては、抗ＮＡＩ
Ｐモノクローナル抗体が、前記のモノクローナル抗体ｈ
ｎｍｃ３６５またはｈｎｍｃ３８１であること、マーカ
ーが酵素、放射性同位体または蛍光色素であることを好
ましい態様としている。さらにまたこの出願は、第２の
ＮＡＩＰ検定方法として、抗ＮＡＩＰ一次抗体とＮＡＩ
Ｐを含む試料とを接触させて一次抗体とＮＡＩＰを結合
させ、この結合体に抗ＮＡＩＰ二次抗体を結合させ、こ
の二次抗体に結合したマーカーのシグナル強度を測定す
る方法であって、(1) 一次抗体と二次抗体を請求項１の
抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体とする、(2) 一次抗体を
請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体とし、二次抗
体を抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体とする、または(3)
一次抗体を抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体とし、二次抗
体を請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体とする、
ことを特徴とする方法を提供する。

【００１１】この第２の検定方法においては、抗ＮＡＩ
Ｐ一次抗体が固相化されていること、抗ＮＡＩＰモノク
ローナル抗体が前記モノクローナル抗体ｈｎｍｃ３６５
および／またはｈｎｍｃ３８１であること、およびマー
カーが酵素、放射性同位体または蛍光色素であることを
好ましい態様としている。この出願はまた、第１のＮＡ
ＩＰ検定キットとして、少なくとも以下の要素、(a) 抗
ＮＡＩＰ一次抗体が固相化されたプレート、および(b)
マーカー標識された抗ＮＡＩＰ二次抗体、からなるキッ
トであって、(1) 一次抗体と二次抗体が請求項１の抗Ｎ
ＡＩＰモノクローナル抗体である、(2) 一次抗体が請求
項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体であり、二次抗体
が抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体である、または(3) 一
次抗体が抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体であり、二次抗
体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体である、
ことを特徴とするＮＡＩＰ検定キットを提供する。

【００１２】この第１の検定キットにおいては、マーカ
ーが放射性同位体または蛍光色素、もしくは酵素である
ことを好ましい態様としており、マーカーが酵素の場合
には、さらに次の要素、(c) 酵素活性によって発色する
基質を有することを好ましい態様としている。

【００１３】この出願はまたさらに、第２のＮＡＩＰ検
定キットとして、少なくとも以下の要素、(a) 抗ＮＡＩ
Ｐ一次抗体が固相化されたプレート、(b) 抗ＮＡＩＰ二
次抗体、および(c) 二次抗体に結合するマーカー、から
なるキットであって、(1) 一次抗体と二次抗体が請求項
１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体である、(2) 一次抗
体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体であり、
二次抗体が抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体である、また
は(3) 一次抗体が抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体であ
り、二次抗体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗
体である、ことを特徴とするＮＡＩＰ検定キットを提供
する。

【００１４】この第２の検定キットにおいては、マーカ
ーが放射性同位体または蛍光色素、もしくは酵素である
ことを好ましい態様としており、マーカーが酵素の場合
には、さらに次の要素、(d) 酵素活性によって発色する
基質を有することを好ましい態様としている。

【００１５】なお、これらの検定キットにおいては、抗
ＮＡＩＰモノクローナル抗体が、前記モノクローナル抗
体ｈｎｍｃ３６５および／またはｈｎｍｃ３８１である
ことを好ましい態様としている。以下、この発明の実施
形態について詳しく説明する。

【００１６】

【発明の実施の形態】この発明の抗ＮＡＩＰモノクロー
ナル抗体は、公知のモノクローナル抗体作成法（「単ク
ローン抗体」、長宗香明、寺田弘共著、廣川書店、1990
年； "Monoclonal Antibody" James W. Goding, third
edition, Academic Press, 1996 ）に従い、例えば以下
の様な手順で作製することができる。１：ハイブリドーマ細胞群の作製配列番号１のアミノ酸番号２５６−５８６またはその一
部配列からなるポリペプチドを含む免疫原を用いて哺乳
動物を免疫し、必要に応じて適宜に追加免疫して動物を
充分に感化する。次いでこの動物から抗体産生細胞（リ
ンパ細胞または脾臓細胞）を摘出し、これとミエローマ
（骨髄種）細胞株との融合細胞を得る。そして、これら
の融合細胞株から、目的とするモノクローナル抗体をそ
れぞれに産生する複数の細胞を選択し、培養することに
よって、ハイブリドーマ細胞群を得ることができる。以
下、各工程を詳しく説明する。ａ）免疫原の調製配列番号１のアミノ酸番号２５６−５８６のアミノ酸配
列を有するポリペプチドは、配列番号２のヌクレオチド
配列を有するＮＡＩＰｃＤＮＡのヌクレオチド番号１０
５６−２０４９を含むＤＮＡ断片を制限酵素切断等によ
り切り出し、このＤＮＡ断片を適当な宿主−ベクター系
で発現させることによって調製することができる。

【００１７】あるいは、配列番号１のアミノ酸番号２５
６−５８６の領域の一部連続配列（１０−２０アミノ
酸）からなるポリペプチドを調製してもよい。この場
合、配列の異なるポリペプチドを用いることによって、
エピトープの異なるモノクローナル抗体をそれぞれに産
生するハイブリドーマ細胞群が得られる。これらのポリ
ペプチドは、他の蛋白質（例えば、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラ−ゼ：ＧＳＴ）との融合蛋白質の形で使
用することもできる。このような融合蛋白質の使用は、
宿主−ベクター系の発現産物からの目的蛋白質の単離、
および後記するハイブリドーマ細胞のスクリーニング工
程を容易かつ確実とする点において特に好ましい。

【００１８】なお、ポリペプチドは、配列番号１のアミ
ノ酸番号２５６−５８６における１以上のアミノ酸残基
が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有するも
の、あるいはそのような欠失、置換または付加を有する
一部連続配列からなるものであってもよい。ｂ）動物の免疫被免疫動物としては、公知のハイブリドーマ作製法に用
いられる哺乳動物を使用することができる。具体的に
は、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウ
マ等である。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させ
るミエローマ細胞の入手容易生等の観点からは、マウス
またはラットを被免疫動物とするのが好ましい。また、
実際に使用するマウスおよびラットの系統は特に制限は
なく、マウスの場合には、たとえば各系統Ａ、AKR 、
BALB/c、BDP 、BA、CE、C3H 、57BL、C57BR 、C57L、DB
A 、FL、HTH 、HT1 、LP、NZB 、NZW 、RF、RIII、SJL
、SWR 、WB、129 等が、またラットの場合には、たと
えば、Low 、Lewis 、Spraque、Daweley 、ACI 、BN、F
ischer 等を用いることができる。このうち、後述のミ
エローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスでは
BALB/c 系統が、ラットではlow 系統が被免疫動物とし
て特に好ましい。なお、これらマウスまたはラットの免
疫時の週齢は５〜１２週齢が好まい。

【００１９】動物の免疫は、免疫原であるポリペプチド
溶液を動物の皮内または腹腔内に投与することによって
行うことができる。抗原の投与スケジュールは被免疫動
物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投
与回数２〜６回、投与間隔１〜２週間が好ましい。ま
た、抗原の投与量は動物の種類、個体差等により異なる
が、一般には、10-100μg/μl 程度とする。ｃ）細胞融合上記の投与スケジュールの最終免疫日から１〜５日後に
被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞またはリン
パ細胞を無菌的に取り出す。これらの脾臓細胞またはリ
ンパ細胞からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法に従
って行うことができる。

【００２０】次いで、抗体産生細胞とミエローマ細胞と
を融合する。このミエローマ細胞には特段の制限はな
く、公知の細胞株から適宜に選択して用いることができ
る。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際
の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧ
ＰＲＴ(Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transfer
ase)欠損株を用いるのが好ましい。すなわち、マウス由
来の X63-Ag8(X63), NS1-Ag4/1(NS-1), P3X63-Ag8.Ul(P
3Ul), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC
11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO,BU.1等、ラット
由来の 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等、ヒト由来の U266AR
(SKO-007), GM1500・GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-
LOW-HMy2(HMy2), 8226AR/NIP4-1(NP41)等である。

【００２１】抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合
は、公知の方法に従い、細胞の生存率を極度に低下させ
ない程度の条件下で適宜実施することができる。そのよ
うな方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃
度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを
混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法
等を用いることができる。

【００２２】融合細胞と非融合細胞の選択は、例えば、
公知のＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミ
ジン）選択法により行うのが好ましい。この方法は、ア
ミノプテリン存在下で生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株の
ミエローマ細胞を用いて融合細胞を得る場合に有効であ
る。すなわち、未融合細胞および融合細胞をＨＡＴ培地
で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を
持ち合わせた融合細胞のみを選択的に残存させ、かつ増
殖させることができる。ｄ）ハイブリドーマのスクリーニング目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドー
マ細胞のスクリーニングは、公知の酵素免疫検定法（Ｅ
ＩＡ：Enzyme Immunoassay）、放射線免疫測定法（ＲＩ
Ａ：Radio Immunoassay ) 、蛍光抗体法等により行うこ
とができる。また、融合蛋白質を免疫原とした場合に
は、融合パートナーである蛋白質について上記の各スク
リーニング方法を併せて実施することによって、より確
実にハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることがで
きる。

【００２３】このようなスクリーニングによって、エピ
トープ領域の異なるモノクローナル抗体をそれぞれに産
生するハイブリドーマ細胞群が得られる。従って、この
発明のモノクローナル抗体は、前記の方法によって作製
されたハイブリドーマ細胞群の各々が産生する複数のモ
ノクローナル抗体を全て含むものである。なお、スクリ
ーニング後のハイブリドーマ細胞は、メチルセルロース
法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法により
クローニングし、抗体産生に用いる。

【００２４】以上の通りの方法によって得たハイブリド
ーマ細胞は、液体窒素中または-80℃以下の冷凍庫中に
凍結状態で保存することができる。２：モノクローナル抗体の取得および精製上記１で作成したハイブリドーマ細胞を公知の方法で培
養することによって、ＮＡＩＰを特異的に認識するモノ
クローナル抗体を得ることができる。

【００２５】培養は、例えば、前記のクローニング法で
使用した同じ組成の培地中で培養してもよく、あるいは
モノクローナル抗体を大量に産生するためには、マウス
腹腔内にハイブリドーマ細胞を注射し、腹水からモノク
ローナル抗体を採取してもよい。このようにして得たモ
ノクローナル抗体は、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、
イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロ
マトグラフィー法等により精製することができる。

【００２６】次のこの発明のＮＡＩＰ検定方法について
説明する。第１の検定方法は、マーカー標識した抗ＮＡ
ＩＰモノクローナル抗体（Ｍ−ｍＡｂ）溶液とＮＡＩＰ
を含む試料とを接触させて標識モノクローナル抗体とＮ
ＡＩＰを結合させ、この結合体（Ｍ−ｍＡｂ：ＮＡＩ
Ｐ）を分離する。分離手段としては、クロマト法、塩析
法、アルコール沈殿法、酵素法、固相法等の公知の方法
を採用することができる。そして、マーカーとして酵素
を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する
基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによ
って酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準
値との比較からＮＡＩＰ量が算出される。マーカーとし
て放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発す
る放射線量をシンチレーションカウンター等により測定
する。また、マーカーとして蛍光色素を用いる場合に
は、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量
を測定すればよい。

【００２７】第２の検定方法は、ＮＡＩＰに対するエピ
トープ領域の異なる２種類の抗体（一次抗体および二次
抗体）を用いる。具体的には、先ず、一次抗体（Ａｂ
Ｉ）とＮＡＩＰを含む試料とを接触させて両者を結合さ
せ、この結合体（ＡｂＩ：ＮＡＩＰ）にマーカー標識し
た二次抗体（Ｍ−ＡｂII）を結合させ、この三者の結合
体（ＡｂＩ：ＮＡＩＰ：Ｍ−ＡｂII）におけるマーカー
のシグナル強度を測定する。あるいは、さらにシグナル
を増強させるためには、非標識の二次抗体を先ず結合体
（ＡｂＩ：ＮＡＩＰ）に結合させ、この二次抗体にマー
カーを結合させるようにしてもよい。このような二次抗
体へのマーカー標識分子の結合は、例えば二次抗体をビ
オチン化し、マーカーをアビジン化しておくことによっ
て行うことができる。あるいは、二次抗体の一部領域
（例えば、Ｆｃ領域）を認識する抗体（三次抗体）をマ
ーカー標識し、この三次抗体を二次抗体(II)に結合させ
るようにしてもよい。なお、一次抗体と二次抗体は、両
方ともこの発明の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体を用い
ることもでき、あるいは、一次抗体と二次抗体のいずれ
か一方を抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体（例えば、前記
ポリペプチドで免疫した動物の抗血清）とすることもで
きる。

【００２８】この第２の方法は、液相系で行うこともで
き、または固相系で行うこともできるが、極微量定量と
操作の簡便化のためには、固相系で行うことが好まし
い。すなわちこの固相系の方法は、一次抗体を樹脂プレ
ート等に固相化し、この固相化抗体にＮＡＩＰを結合さ
せ、非結合ＮＡＩＰを洗浄した後、プレート上に残った
結合ＮＡＩＰに二次抗体を結合させ、この二次抗体のシ
グナル強度を測定する方法である。この方法は、いわゆ
る「サンドイッチ法」と呼ばれる方法であり、マーカー
として酵素を用いる場合には、「ＥＬＩＳＡ（enzyme l
inked immunospecific assay）」として広く用いられて
いる方法である。

【００２９】これらの方法においてマーカーとして用い
る酵素は、turn over numberが大であること、抗体と結
合させても安定であること、基質を特異的に着色させる
等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常
のＥＩＡに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダー
ゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファター
ゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラ
ーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸
脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物
質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素とモノ
クローナル抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋
剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質
としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使
用することができる。例えば酵素としてペルオキシダー
ゼを使用する場合には、3.3'5.5'−テトラメチルベンジ
シンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用
いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることが
できる。

【００３０】マーカーとして用いる放射性同位体として
は、¹²⁵Ｉや³Ｈ等の通常のＲＩＡで用いられているも
のを使用することができる。蛍光色素としては、フルオ
レッセンスイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）やテトラメ
チルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等の
通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することがで
きる。

【００３１】この発明の検定キットは、上記第２の検定
方法を固相系で行うサンドイッチ法のためのキットであ
る。このようなキットは、被検成分の種類に応じて各種
のものが市販されており、この発明の検定キットも、抗
体として前記抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体および／ま
たは抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体を用いることを除
き、公知公用のキットに用いられている各要素によって
構成することができる。また、前記構成要素からなるこ
の発明の検定キットには、非結合ＮＡＩＰおよび／また
は非結合二次抗体を洗浄するための洗浄液を備えるよう
にしてもよい。

【００３２】

【実施例】以下、実施例を示してこの発明を詳細かつ具
体的に説明するが、この発明はこれらの例に限定される
ものではない。実施例１：モノクローナル抗体の作成 (1) 免疫原の調製配列番号１にヌクレオチド配列を示したＮＡＩＰｃＤＮ
Ａの1056−2049番目領域（ＮＡＩＰ256-586 領域）を増
幅し、このＤＮＡ断片をｐＧＥＸ−３Ｘ(Pharmacia社
製) の制限酵素ＥcoＲＩ部位に挿入した。塩基配列を確
認した後、この組換えベクターｐＧＥＸ−３Ｘ（ＮＡＩ
Ｐ. 256-586 ）で宿主大腸菌ＢＬ21（ＤＥ３）ｐＬysＳ
を形質転換し、ＬＢ培地中で30℃で５時間培養し、IPTG
を加え、さらに20℃で３時間培養した。菌体を遠心によ
り分離し、溶解溶液（ＰＢＳ、Ｔriton Ｘ-100）に溶か
し、一度−80℃で凍結させ融解させた後、超音波破砕を
行った。1000 x gで30分遠心し、上清をグルタチオンセ
ファロース４Ｂカラムに通液し、ＧＳＴ−ＮＡＩＰ（25
6-586 ）融合蛋白質を得た。 (2) 動物の免疫前記(1) で得た融合蛋白質50μg/μl をBalb/cマウスの
腹腔内に投与して初回免疫とした。初回免疫から２週間
後の２回目の免疫を行い、その後は１週間間隔で６回ま
で免疫した。なお、融合蛋白質は、初回免疫では等量の
Ｆreund 完全アジュバンドと混合して投与し、２回目か
ら５回目までＦreund 不完全アジュバンドと混合して投
与した。最終免疫は融合蛋白質溶液のみを投与した。 (3) 細胞融合最終免疫日の３日後に脾臓細胞を無菌的に摘出し、この
脾臓細胞とマウスのミエローマ細胞株ＳＰ２／０−Ａg1
4 とを混合し、ポリエチレングリコール＃４０００を用
いて融合処理した。得られた細胞を96穴プレートにま
き、ＨＡＴ培地により融合細胞を選択した。 (4) スクリーニング免疫原として使用したＮＡＩＰポリペプチドを固相化し
たＥＬＩＳＡプレートと、ＧＳＴを固相化したＥＬＩＳ
Ａプレートを作製し、ＧＳＴプレートには反応せず、Ｎ
ＡＩＰプレートにのみ反応するクローンを選択し、スク
リーニングした。次いで、各ハイブリドーマの培養上清
のうち、ＮＡＩＰポリペプチドに反応するウェルを陽性
として、陽性ウェルより限界希釈法を用いてハイブリド
ーマのクローニングを行い、単一クローンとなったハイ
ブリドーマの培地に対して再度スクリーニングを行い、
複数のハイブリドーマ細胞を得た。 (5) モノクローナル抗体の作成得られた２種類のハイブリドーマ細胞をBalb/c系マウス
の腹腔内にそれぞれ投与し、１週間後にモノクローナル
抗体を含む腹水を採取した。この腹水から、プロテイン
Ｇを用いたアファニティーカラムにより２種類のモノク
ローナル抗体ｈｎｍｃ３６５およびｈｎｍｃ３８１を精
製した。

【００３３】ｈｎｍｃ３６５はサブクラスＩｇＧ１で、
そのエピトープ領域は配列番号１のアミノ酸番号３５４
−３６８の領域であり、ｈｎｍｃ３８１はサブクラスＩ
ｇＧ２ｂで、エピトープ領域は配列番号１のアミノ酸番
号３７３−３８７の領域であることを確認した。実施例２：ポリクローナル抗体の作成実施例１(1) と同様に調製したＧＳＴ−ＮＡＩＰ（256-
586 ）融合蛋白質を免疫原として、定法によりウサギ
（Japanese White Rabit）を免疫し、抗血清を単離し、
上記融合蛋白質を結合したセファロース４Ｂカラムによ
ってポリクローナル抗体を精製した。実施例３：ＥＬＩＳＡキットの作成 (1) 一次抗体固相化プレート 150mmol/l の塩化ナトリウムおよび１g/L のアジ化ナト
リウムを含む10mmol/lのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.
5 ）に、実施例１で作成したの抗ＮＡＩＰモノクローナ
ル抗体ｈｎｍｃ３６５溶液（20μg/ml）を溶解し、この
溶液をＥＬＩＳＡ用96穴プレートの各穴に50μl ずつ分
注した。４℃で16時間保存後、150mmol/l の塩化ナトリ
ウムを含む10mmol/lのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.5
）で洗浄し、抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体固相化プ
レートを作成した。 (2) ビオチン化二次抗体実施例２で作成した抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体10mg
に対し、N,N-ジメチルホルムアミドに溶解したビオチン
アミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルを0.01mmol添加した。25℃で３時間保温後、50mmol/l
のリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ7.4 ）中で16時間透析
を行い、ビオチン化抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体を作
成した。 (3) 二次抗体結合マーカー西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン
溶液を、150mmol/l の塩化ナトリウムおよび１g/l のカ
ゼインを含む10mmol/lのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.
2 ）で0.5 μg/mlの濃度に希釈し、マーカー溶液とし
た。実施例４：ＮＡＩＰ検定 (1) 操作方法精製ＮＡＩＰを様々な濃度で含有する試料溶液を、150m
mol/l の塩化ナトリウムを含む10mmol/lリン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ7.2 ）で希釈し、実施例３(1) の一次抗体
固相化プレートの各穴に50μl づつ分注した。37℃で１
時間保温後、150mmol/塩化ナトリウムを含む10mmol/lリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ7.2 ）で洗浄した。

【００３４】次に、実施例３(2) のビオチン化抗ＮＡＩ
Ｐポリクローナル抗体を、150mmol/塩化ナトリウムおよ
び１g/l カゼインを含む10mmol/lリン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ7.2 ）で0.5 μg/ml濃度に希釈し、前記プレート
の各穴に100 μl づつ分注した。37℃で１時間保温後、
150mmol/l 塩化ナトリウムを含む10mmol/lリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ7.2 ）で洗浄した。

【００３５】最後に、実施例３(3) の西洋ワサビ・ペル
オキシダーゼ標識ストレプトアビジン溶液を前記プレー
トの各穴に100 μl づつ分注し、37℃で１時間保温後、
150mmol/l 塩化ナトリウムを含む10mmol/lリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ7.2 ）で洗浄した。 (2) 発色反応・吸光度測定 3,3',5,5'-テトラメチルベンジジンを50mmol/l濃度とな
るようにN, N−ジメチルホルムアミドに溶解し、この溶
液を100mmol/l 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ5.5 ）で１
／100 に希釈し、ろ紙でろ過した。この溶液10mlに10g/
l の過酸化水素水を0.1ml 添加し、発色液とした。この
発色液を前記プレートの各穴に50μl づつ分注し、30℃
で30分間保温した後、２mol/l 硫酸を各穴に50μl づつ
分注し、反応を停止させた後、450nm の吸光度を測定し
た。 (3) 結果図１は、試料溶液中の精製ＮＡＩＰ濃度と前記方法によ
り測定した吸光度との関係を示したグラフ図である。試
料中のＮＡＩＰ濃度は測定限界４ng/ml から20ng/ml の
範囲で検定可能であった。

【００３６】この結果から、例えば図１のような測定結
果を標準線とすることによって、ＮＡＩＰ濃度未知の試
料についても、その吸光度からＮＡＩＰ濃度を正確に検
定することが可能であることが確認された。

【００３７】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この出願に
よって、生体試料中のヒト・アポトーシス抑制蛋白質Ｎ
ＡＩＰを簡便かつ高精度で定量化することが可能とな
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】試料溶液中の精製ＮＡＩＰ濃度と前記方法によ
り測定した吸光度との関係を示したグラフ図である。

【配列表】 Sequence Listing <110> Applicant name: Japan Science and Technology Corporation, and Hatumi SAKAI <120> Title of Invention: ヒト・アポトーシス抑制蛋白質ＮＡＩＰに対するモノクローナル抗体と、ＮＡＩＰ検定方法 <130> File reference: NP98449 <160> Nuber of SEQ ID Nos: 2 <210> SEQ ID NO （配列番号）: 1 <211> Length: 1403 <212> Type: PRT <213> Organism: homosapiens <400> Sequence Met Ala Thr Gln Gln Lys Ala Ser Asp Glu Arg Ile Ser Gln Phe Asp 1 5 10 15 His Asn Leu Leu Pro Glu Leu Ser Ala Leu Leu Gly Leu Asp Ala Val 20 25 30 Gln Leu Ala Lys Glu Leu Glu Glu Glu Glu Gln Lys Glu Arg Ala Lys 35 40 45 Met Gln Lys Gly Tyr Asn Ser Gln Met Arg Ser Glu Ala Lys Arg Leu 50 55 60 Lys Thr Phe Val Thr Tyr Glu Pro Tyr Ser Ser Trp Ile Pro Gln Glu 65 70 75 80 Met Ala Ala Ala Gly Phe Tyr Phe Thr Gly Val Lys Ser Gly Ile Gln 85 90 95 Cys Phe Cys Cys Ser Leu Ile Leu Phe Gly Ala Gly Leu Thr Arg Leu 100 105 110 Pro Ile Glu Asp His Lys Arg Phe His Pro Asp Cys Gly Phe Leu Leu 115 120 125 Asn Lys Asp Val Gly Asn Ile Ala Lys Tyr Asp Ile Arg Val Lys Asn 130 135 140 Leu Lys Ser Arg Leu Arg Gly Gly Lys Met Arg Tyr Gln Glu Glu Glu 145 150 155 160 Ala Arg Leu Ala Ser Phe Arg Asn Trp Pro Phe Tyr Val Gln Gly Ile 165 170 175 Ser Pro Cys Val Leu Ser Glu Ala Gly Phe Val Phe Thr Gly Lys Gln 180 185 190 Asp Thr Val Gln Cys Phe Ser Cys Gly Gly Cys Leu Gly Asn Trp Glu 195 200 205 Glu Gly Asp Asp Pro Trp Lys Glu His Ala Lys Trp Phe Pro Lys Cys 210 215 220 Glu Phe Leu Arg Ser Lys Lys Ser Ser Glu Glu Ile Thr Gln Tyr Ile 225 230 235 240 Gln Ser Tyr Lys Gly Phe Val Asp Ile Thr Gly Glu His Phe Val Asn 245 250 255 Ser Trp Val Gln Arg Glu Leu Pro Met Ala Ser Ala Tyr Cys Asn Asp 260 265 270 Ser Ile Phe Ala Tyr Glu Glu Leu Arg Leu Asp Ser Phe Lys Asp Trp 275 280 285 Pro Arg Glu Ser Ala Val Gly Val Ala Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu 290 295 300 Phe Tyr Thr Gly Ile Lys Asp Ile Val Gln Cys Phe Ser Cys Gly Gly 305 310 315 320 Cys Leu Glu Lys Trp Gln Glu Gly Asp Asp Pro Leu Asp Asp His Thr 325 330 335 Arg Cys Phe Pro Asn Cys Pro Phe Leu Gln Asn Met Lys Ser Ser Ala 340 345 350 Glu Val Thr Pro Asp Leu Gln Ser Arg Gly Glu Leu Cys Glu Leu Leu 355 360 365 Glu Thr Thr Ser Glu Ser Asn Leu Glu Asp Ser Ile Ala Val Gly Pro 370 375 380 Ile Val Pro Glu Met Ala Gln Gly Glu Ala Gln Trp Phe Gln Glu Ala 385 390 395 400 Lys Asn Leu Asn Glu Gln Leu Arg Ala Ala Tyr Thr Ser Ala Ser Phe 405 410 415 Arg His Met Ser Leu Leu Asp Ile Ser Ser Asp Leu Ala Thr Asp His 420 425 430 Leu Leu Gly Cys Asp Leu Ser Ile Ala Ser Lys His Ile Ser Lys Pro 435 440 445 Val Gln Glu Pro Leu Val Leu Pro Glu Val Phe Gly Asn Leu Asn Ser 450 455 460 Val Met Cys Val Glu Gly Glu Ala Gly Ser Gly Lys Thr Val Leu Leu 465 470 475 480 Lys Lys Ile Ala Phe Leu Trp Ala Ser Gly Cys Cys Pro Leu Leu Asn 485 490 495 Arg Phe Gln Leu Val Phe Tyr Leu Ser Leu Ser Ser Thr Arg Pro Asp 500 505 510 Glu Gly Leu Ala Ser Ile Ile Cys Asp Gln Leu Leu Glu Lys Glu Gly 515 520 525 Ser Val Thr Glu Met Cys Met Arg Asn Ile Ile Gln Gln Leu Lys Asn 530 535 540 Gln Val Leu Phe Leu Leu Asp Asp Tyr Lys Glu Ile Cys Ser Ile Pro 545 550 555 560 Gln Val Ile Gly Lys Leu Ile Gln Lys Asn His Leu Ser Arg Thr Cys 565 570 575 Leu Leu Ile Ala Val Arg Thr Asn Arg Ala Arg Asp Ile Arg Arg Tyr 580 585 590 Leu Glu Thr Ile Leu Glu Ile Lys Ala Phe Pro Phe Tyr Asn Thr Val 595 600 605 Cys Ile Leu Arg Lys Leu Phe Ser His Asn Met Thr Arg Leu Arg Lys 610 615 620 Phe Met Val Tyr Phe Gly Lys Asn Gln Ser Leu Gln Lys Ile Gln Lys 625 630 635 640 Thr Pro Leu Phe Val Ala Ala Ile Cys Ala His Trp Phe Gln Tyr Pro 645 650 655 Phe Asp Pro Ser Phe Asp Asp Val Ala Val Phe Lys Ser Tyr Met Glu 660 665 670 Arg Leu Ser Leu Arg Asn Lys Ala Thr Ala Glu Ile Leu Lys Ala Thr 675 680 685 Val Ser Ser Cys Gly Glu Leu Ala Leu Lys Gly Phe Phe Ser Cys Cys 690 695 700 Phe Glu Phe Asn Asp Asp Asp Leu Ala Glu Ala Gly Val Asp Glu Asp 705 710 715 720 Glu Asp Leu Thr Met Cys Leu Met Ser Lys Phe Thr Ala Gln Arg Leu 725 730 735 Arg Pro Phe Tyr Arg Phe Leu Ser Pro Ala Phe Gln Glu Phe Leu Ala 740 745 750 Gly Met Arg Leu Ile Glu Leu Leu Asp Ser Asp Arg Gln Glu His Gln 755 760 765 Asp Leu Gly Leu Tyr His Leu Lys Gln Ile Asn Ser Pro Met Met Thr 770 775 780 Val Ser Ala Tyr Asn Asn Phe Leu Asn Tyr Val Ser Ser Leu Pro Ser 785 790 795 800 Thr Lys Ala Gly Pro Lys Ile Val Ser His Leu Leu His Leu Val Asp 805 810 815 Asn Lys Glu Ser Leu Glu Asn Ile Ser Glu Asn Asp Asp Tyr Leu Lys 820 825 830 His Gln Pro Glu Ile Ser Leu Gln Met Gln Leu Leu Arg Gly Leu Trp 835 840 845 Gln Ile Cys Pro Gln Ala Tyr Phe Ser Met Val Ser Glu His Leu Leu 850 855 860 Val Leu Ala Leu Lys Thr Ala Tyr Gln Ser Asn Thr Val Ala Ala Cys 865 870 875 880 Ser Pro Phe Val Leu Gln Phe Leu Gln Gly Arg Thr Leu Thr Leu Gly 885 890 895 Ala Leu Asn Leu Gln Tyr Phe Phe Asp His Pro Glu Ser Leu Ser Leu 900 905 910 Leu Arg Ser Ile His Phe Pro Ile Arg Gly Asn Lys Thr Ser Pro Arg 915 920 925 Ala His Phe Ser Val Leu Glu Thr Cys Phe Asp Lys Ser Gln Val Pro 930 935 940 Thr Ile Asp Gln Asp Tyr Ala Ser Ala Phe Glu Pro Met Asn Glu Trp 945 950 955 960 Glu Arg Asn Leu Ala Glu Lys Glu Asp Asn Val Lys Ser Tyr Met Asp 965 970 975 Met Gln Arg Arg Ala Ser Pro Asp Leu Ser Thr Gly Tyr Trp Lys Leu 980 985 990 Ser Pro Lys Gln Tyr Lys Ile Pro Cys Leu Glu Val Asp Val Asn Asp 995 1000 1005 Ile Asp Val Val Gly Gln Asp Met Leu Glu Ile Leu Met Thr Val Phe 1010 1015 1020 Ser Ala Ser Gln Arg Ile Glu Leu His Leu Asn His Ser Arg Gly Phe 1025 1030 1035 1040 Ile Glu Ser Ile Arg Pro Ala Leu Glu Leu Ser Lys Ala Ser Val Thr 1045 1050 1055 Lys Cys Ser Ile Ser Lys Leu Glu Leu Ser Ala Ala Glu Gln Glu Leu 1060 1065 1070 Leu Leu Thr Leu Pro Ser Leu Glu Ser Leu Glu Val Ser Gly Thr Ile 1075 1080 1085 Gln Ser Gln Asp Gln Ile Phe Pro Asn Leu Asp Lys Phe Leu Cys Leu 1090 1095 1100 Lys Glu Leu Ser Val Asp Leu Glu Gly Asn Ile Asn Val Phe Ser Val 1105 1110 1115 1120 Ile Pro Glu Glu Phe Pro Asn Phe His His Met Glu Lys Leu Leu Ile 1125 1130 1135 Gln Ile Ser Ala Glu Tyr Asp Pro Ser Lys Leu Val Lys Leu Ile Gln 1140 1145 1150 Asn Ser Pro Asn Leu His Val Phe His Leu Lys Cys Asn Phe Phe Ser 1155 1160 1165 Asp Phe Gly Ser Leu Met Thr Met Leu Val Ser Cys Lys Lys Leu Thr 1170 1175 1180 Glu Ile Lys Phe Ser Asp Ser Phe Phe Gln Ala Val Pro Phe Val Ala 1185 1190 1195 1200 Ser Leu Pro Asn Phe Ile Ser Leu Lys Ile Leu Asn Leu Glu Gly Gln 1205 1210 1215 Gln Phe Pro Asp Glu Glu Thr Ser Glu Lys Phe Ala Tyr Ile Leu Gly 1220 1225 1230 Ser Leu Ser Asn Leu Glu Glu Leu Ile Leu Pro Thr Gly Asp Gly Ile 1235 1240 1245 Tyr Arg Val Ala Lys Leu Ile Ile Gln Gln Cys Gln Gln Leu His Cys 1250 1255 1260 Leu Arg Val Leu Ser Phe Phe Lys Thr Leu Asn Asp Asp Ser Val Val 1265 1270 1275 1280 Glu Ile Ala Lys Val Ala Ile Ser Gly Gly Phe Gln Lys Leu Glu Asn 1285 1290 1295 Leu Lys Leu Ser Ile Asn His Lys Ile Thr Glu Glu Gly Tyr Arg Asn 1300 1305 1310 Phe Phe Gln Ala Leu Asp Asn Met Pro Asn Leu Gln Glu Leu Asp Ile 1315 1320 1325 Ser Arg His Phe Thr Glu Cys Ile Lys Ala Gln Ala Thr Thr Val Lys 1330 1335 1340 Ser Leu Ser Gln Cys Val Leu Arg Leu Pro Arg Leu Ile Arg Leu Asn 1345 1350 1355 1360 Met Leu Ser Trp Leu Leu Asp Ala Asp Asp Ile Ala Leu Leu Asn Val 1365 1370 1375 Met Lys Glu Arg His Pro Gln Ser Lys Tyr Leu Thr Ile Leu Gln Lys 1380 1385 1390 Trp Ile Leu Pro Phe Ser Pro Ile Ile Gln Lys 1395 1400 1403 <210> SEQ ID NO （配列番号）: 2 <211> Length: 5984 <212> Type: DNA <213> Organism: homosapiens <220> Feature <221> Name/key: CDC <222> Location: 292..4500 <400> Sequence ACAAAAGGTC CTGTGCTCAC CTGGGACCCT TCTGGACGTT GCCCTGTGTT CCTCTTCGCC 60 TGCCTGTTCA TCTACGACGA ACCCCGGGTA TTGACCCCAG ACAACAATGC CACTTCATAT 120 TGGGGACTTC GTCTGGGATT CCAAGGTGCA TTCATTGCAA AGTTCCTTAA ATATTTTCTC 180 ACTGCTTCCT ACTAAAGGAC GGACAGAGCA TTTGTTCTTC AGCCACATAC TTTCCTTCCA 240 CTGGCCAGCA TTCTCCTCTA TTAGACTAGA ACTGTGGATA AACCTCAGAA AATGGCCACC 300 CAGCAGAAAG CCTCTGACGA GAGGATCTCC CAGTTTGATC ACAATTTGCT GCCAGAGCTG 360 TCTGCTCTTC TGGGCCTAGA TGCAGTTCAG TTGGCAAAGG AACTAGAAGA AGAGGAGCAG 420 AAGGAGCGAG CAAAAATGCA GAAAGGCTAC AACTCTCAAA TGCGCAGTGA AGCAAAAAGG 480 TTAAAGACTT TTGTGACTTA TGAGCCGTAC AGCTCATGGA TACCACAGGA GATGGCGGCC 540 GCTGGGTTTT ACTTCACTGG GGTAAAATCT GGGATTCAGT GCTTCTGCTG TAGCCTAATC 600 CTCTTTGGTG CCGGCCTCAC GAGACTCCCC ATAGAAGACC ACAAGAGGTT TCATCCAGAT 660 TGTGGGTTCC TTTTGAACAA GGATGTTGGT AACATTGCCA AGTACGACAT AAGGGTGAAG 720 AATCTGAAGA GCAGGCTGAG AGGAGGTAAA ATGAGGTACC AAGAAGAGGA GGCTAGACTT 780 GCATCCTTCA GGAACTGGCC ATTTTATGTC CAAGGGATAT CCCCTTGTGT GCTCTCAGAG 840 GCTGGCTTTG TCTTTACAGG TAAACAGGAC ACGGTACAGT GTTTTTCCTG TGGTGGATGT 900 TTAGGAAATT GGGAAGAAGG AGATGATCCT TGGAAGGAAC ATGCCAAATG GTTCCCCAAA 960 TGTGAATTTC TTCGGAGTAA GAAATCCTCA GAGGAAATTA CCCAGTATAT TCAAAGCTAC 1020 AAGGGATTTG TTGACATAAC GGGAGAACAT TTTGTGAATT CCTGGGTCCA GAGAGAATTA 1080 CCTATGGCAT CAGCTTATTG CAATGACAGC ATCTTTGCTT ACGAAGAACT ACGGCTGGAC 1140 TCTTTTAAGG ACTGGCCCCG GGAATCAGCT GTGGGAGTTG CAGCACTGGC CAAAGCAGGT 1200 CTTTTCTACA CAGGTATAAA GGACATCGTC CAGTGCTTTT CCTGTGGAGG GTGTTTAGAG 1260 AAATGGCAGG AAGGTGATGA CCCATTAGAC GATCACACCA GATGTTTTCC CAATTGTCCA 1320 TTTCTCCAAA ATATGAAGTC CTCTGCGGAA GTGACTCCAG ACCTTCAGAG CCGTGGTGAA 1380 CTTTGTGAAT TACTGGAAAC CACAAGTGAA AGCAATCTTG AAGATTCAAT AGCAGTTGGT 1440 CCTATAGTGC CAGAAATGGC ACAGGGTGAA GCCCAGTGGT TTCAAGAGGC AAAGAATCTG 1500 AATGAGCAGC TGAGAGCAGC TTATACCAGC GCCAGTTTCC GCCACATGTC TTTGCTTGAT 1560 ATCTCTTCCG ATCTGGCCAC GGACCACTTG CTGGGCTGTG ATCTGTCTAT TGCTTCAAAA 1620 CACATCAGCA AACCTGTGCA AGAACCTCTG GTGCTGCCTG AGGTCTTTGG CAACTTGAAC 1680 TCTGTCATGT GTGTGGAGGG TGAAGCTGGA AGTGGAAAGA CGGTCCTCCT GAAGAAAATA 1740 GCTTTTCTGT GGGCATCTGG ATGCTGTCCC CTGTTAAACA GGTTCCAGCT GGTTTTCTAC 1800 CTCTCCCTTA GTTCCACCAG ACCAGACGAG GGGCTGGCCA GTATCATCTG TGACCAGCTC 1860 CTAGAGAAAG AAGGATCTGT TACTGAAATG TGCATGAGGA ACATTATCCA GCAGTTAAAG 1920 AATCAGGTCT TATTCCTTTT AGATGACTAC AAAGAAATAT GTTCAATCCC TCAAGTCATA 1980 GGAAAACTGA TTCAAAAAAA CCACTTATCC CGGACCTGCC TATTGATTGC TGTCCGTACA 2040 AACAGGGCCA GGGACATCCG CCGATACCTA GAGACCATTC TAGAGATCAA AGCATTTCCC 2100 TTTTATAATA CTGTCTGTAT ATTACGGAAG CTCTTTTCAC ATAATATGAC TCGTCTGCGA 2160 AAGTTTATGG TTTACTTTGG AAAGAACCAA AGTTTGCAGA AGATACAGAA AACTCCTCTC 2220 TTTGTGGCGG CGATCTGTGC TCATTGGTTT CAGTATCCTT TTGACCCATC CTTTGATGAT 2280 GTGGCTGTTT TCAAGTCCTA TATGGAACGC CTTTCCTTAA GGAACAAAGC GACAGCTGAA 2340 ATTCTCAAAG CAACTGTGTC CTCCTGTGGT GAGCTGGCCT TGAAAGGGTT TTTTTCATGT 2400 TGCTTTGAGT TTAATGATGA TGATCTCGCA GAAGCAGGGG TTGATGAAGA TGAAGATCTA 2460 ACCATGTGCT TGATGAGCAA ATTTACAGCC CAGAGACTAA GACCATTCTA CCGGTTTTTA 2520 AGTCCTGCCT TCCAAGAATT TCTTGCGGGG ATGAGGCTGA TTGAACTCCT GGATTCAGAT 2580 AGGCAGGAAC ATCAAGATTT GGGACTGTAT CATTTGAAAC AAATCAACTC ACCCATGATG 2640 ACTGTAAGCG CCTACAACAA TTTTTTGAAC TATGTCTCCA GCCTCCCTTC AACAAAAGCA 2700 GGGCCCAAAA TTGTGTCTCA TTTGCTCCAT TTAGTGGATA ACAAAGAGTC ATTGGAGAAT 2760 ATATCTGAAA ATGATGACTA CTTAAAGCAC CAGCCAGAAA TTTCACTGCA GATGCAGTTA 2820 CTTAGGGGAT TGTGGCAAAT TTGTCCACAA GCTTACTTTT CAATGGTTTC AGAACATTTA 2880 CTGGTTCTTG CCCTGAAAAC TGCTTATCAA AGCAACACTG TTGCTGCGTG TTCTCCATTT 2940 GTTTTGCAAT TCCTTCAAGG GAGAACACTG ACTTTGGGTG CGCTTAACTT ACAGTACTTT 3000 TTCGACCACC CAGAAAGCTT GTCATTGTTG AGGAGCATCC ACTTCCCAAT ACGAGGAAAT 3060 AAGACATCAC CCAGAGCACA TTTTTCAGTT CTGGAAACAT GTTTTGACAA ATCACAGGTG 3120 CCAACTATAG ATCAGGACTA TGCTTCTGCC TTTGAACCTA TGAATGAATG GGAGCGAAAT 3180 TTAGCTGAAA AAGAGGATAA TGTAAAGAGC TATATGGATA TGCAGCGCAG GGCATCACCA 3240 GACCTTAGTA CTGGCTATTG GAAACTTTCT CCAAAGCAGT ACAAGATTCC CTGTCTAGAA 3300 GTCGATGTGA ATGATATTGA TGTTGTAGGC CAGGATATGC TTGAGATTCT AATGACAGTT 3360 TTCTCAGCTT CACAGCGCAT CGAACTCCAT TTAAACCACA GCAGAGGCTT TATAGAAAGC 3420 ATCCGCCCAG CTCTTGAGCT GTCTAAGGCC TCTGTCACCA AGTGCTCCAT AAGCAAGTTG 3480 GAACTCAGCG CAGCCGAACA GGAACTGCTT CTCACCCTGC CTTCCCTGGA ATCTCTTGAA 3540 GTCTCAGGGA CAATCCAGTC ACAAGACCAA ATCTTTCCTA ATCTGGATAA GTTCCTGTGC 3600 CTGAAAGAAC TGTCTGTGGA TCTGGAGGGC AATATAAATG TTTTTTCAGT CATTCCTGAA 3660 GAATTTCCAA ACTTCCACCA TATGGAGAAA TTATTGATCC AAATTTCAGC TGAGTATGAT 3720 CCTTCCAAAC TAGTAAAATT AATTCAAAAT TCTCCAAACC TTCATGTTTT CCATCTGAAG 3780 TGTAACTTCT TTTCGGATTT TGGGTCTCTC ATGACTATGC TTGTTTCCTG TAAGAAACTC 3840 ACAGAAATTA AGTTTTCGGA TTCATTTTTT CAAGCCGTCC CATTTGTTGC CAGTTTGCCA 3900 AATTTTATTT CTCTGAAGAT ATTAAATCTT GAAGGCCAGC AATTTCCTGA TGAGGAAACA 3960 TCAGAAAAAT TTGCCTACAT TTTAGGTTCT CTTAGTAACC TGGAAGAATT GATCCTTCCT 4020 ACTGGGGATG GAATTTATCG AGTGGCCAAA CTGATCATCC AGCAGTGTCA GCAGCTTCAT 4080 TGTCTCCGAG TCCTCTCATT TTTCAAGACT TTGAATGATG ACAGCGTGGT GGAAATTGCC 4140 AAAGTAGCAA TCAGTGGAGG TTTCCAGAAA CTTGAGAACC TAAAGCTTTC AATCAATCAC 4200 AAGATTACAG AGGAAGGATA CAGAAATTTC TTTCAAGCAC TGGACAACAT GCCAAACTTG 4260 CAGGAGTTGG ACATCTCCAG GCATTTCACA GAGTGTATCA AAGCTCAGGC CACAACAGTC 4320 AAGTCTTTGA GTCAATGTGT GTTACGACTA CCAAGGCTCA TTAGACTGAA CATGTTAAGT 4380 TGGCTCTTGG ATGCAGATGA TATTGCATTG CTTAATGTCA TGAAAGAAAG ACATCCTCAA 4440 TCTAAGTACT TAACTATTCT CCAGAAATGG ATACTGCCGT TCTCTCCAAT CATTCAGAAA 4500 TAAAAGATTC AGCTAAAAAC TGCTGAATCA ATAATTTGTC TTGGGGCATA TTGAGGATGT 4560 AAAAAAAGTT GTTGATTAAT GCTAAAAACC AAATTATCCA AAATTATTTT ATTAAATATT 4620 GCATACAAAA GAAAATGTGT AAGGCTTGCT AAAAAACAAA ACAAAACAAA ACACAGTCCT 4680 GCATACTCAC CACCAAGCTC AAGAAATAAA TCATCACCAA TACCTTTGAG GTCCCTGAGT 4740 AATCCACCCC AGCTAAAGGC AAACCCTTCA ATCAAGTTTA TACAGCAAAC CCTCCATTGT 4800 CCATGGTCAA CAGGGAAGGG GTTGGGGACA GGTCTGCCAA TCTATCTAAA AGCCACAATA 4860 TGGAAGAAGT ATTCAATTTA TATAATAAAT GGCTAACTTA ACGGTTGAAT CACTTTCATA 4920 CATGGATGAA ACGGGTTTAA CACAGGATCC ACATGAATCT TCTGTGGGCC AAAATATGTT 4980 CCTTAATCCT TGTAGAACCT GTCTTCTATA TTGAACTAGC TTTGGTACAG TAGAGTTAAC 5040 TTACTTTCCA TTTATCCACT GCCAATATAA AGAGGAAACA GGGGTTAGGG AAAAATGACT 5100 TCATTCCAGA GGCTTCTCAG AGTTCAACAT ATGCTATAAT TTAGAATTTT CTTATGAATC 5160 CACTCTACTT GGGTAGAAAA TATTTTATCT CTAGTGATTG CATATTATTT CCATATCATA 5220 GTATTTCATA GTATTATATT TGATATGAGT GTCTATATCA ATGTCAGTGT CCAGAATTTC 5280 GTTCCTACCA GTTGAGTAGT TTTCTGAACG GCCAGAAGAC CATTCGAAAT TCATGATACT 5340 ACTATAAGTT GGTAAACAAC CATACTTTTA TCCTCATTTT TATTCTCACT AAGAAAAAAG 5400 TCAACTCCCC TCCCCTTGCC CAAGTATGAA ATATAGGGAC AGTATGTATG GTGTGGTCTC 5460 ATTTGTTTAG AAAACCACTT ATGACTGGGT GCGGTGGCTC ACACCTGTAA TCCCAGCACT 5520 TTGGGAGGCT GAGGCGGGCG AATCATTTGA GGTGAGGAGT TCGAGACCGG CCTGGCCAGC 5580 ATGGTGAAAC CCCATTTTTG CTAAAGGTAC AAAAATTAGC CAGGTGTGGT GGCACATGCC 5640 TGTGGTCCCA GCCACTGGGG CGGCTGAGAC GCAGGACTTG CTTGAACCCG GGAGGCAGAG 5700 GTTGCAGTGA GCCGAGATGG CGCCACTGCA TTCCAGCCTG GGCAACAGAG CAAGACCCTG 5760 TCTGTTTCAA AACAAAAAAC AAAACCACTT ATATTGCTAG CTACATTAAG AATTTCTGAA 5820 TATGTTACTG AGCTTGCTTG TGGTAACCAT TTATAATATC AGAAAGTATA TGTACACCAA 5880 AACATGTTGA ACATCCATGT TGTACAACTG AAATATAAAT AATTTTGTCA ATTATACCTA 5940 AATAAAACTG GAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 5984

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者酒井治美神奈川県厚木市元町１−20 シャトレ・ストンリバーＩＩ207 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA53 BA61 CA04 CA07 DA06 GA03 GA11 HA15 4B064 AG01 AG26 AG27 AG31 CA02 CA10 CA19 CA20 CC24 DA13 4B065 AA26X AA90X AA92X AA93Y AB01 AB05 AC14 BA02 BA08 CA24 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA76 DA86 DA89 EA50 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１のアミノ酸配列を有するヒト
・アポトーシス抑制蛋白質ＮＡＩＰを特異的に認識する
モノクローナル抗体であって、配列番号１のアミノ酸番
号２５６−５８６のアミノ酸配列またはその一部配列か
らなるポリペプチドを含む免疫原によって免疫した哺乳
動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞株との融合細胞で
あるハイブリドーマ細胞群がそれぞれ産生する抗ＮＡＩ
Ｐモノクローナル抗体。
【請求項２】エピトープ領域が、配列番号１のアミノ
酸番号３５４−３６８の領域である請求項１の抗ＮＡＩ
Ｐモノクローナル抗体。
【請求項３】エピトープ領域が、配列番号１のアミノ
酸番号３７３−３８７の領域である請求項１の抗ＮＡＩ
Ｐモノクローナル抗体。
【請求項４】マーカー標識した請求項１の抗ＮＡＩＰ
モノクローナル抗体とＮＡＩＰを含む試料とを接触させ
て標識抗体とＮＡＩＰを結合させ、この結合体における
マーカーのシグナル強度を測定することを特徴とするＮ
ＡＩＰの検定方法。
【請求項５】抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体が、請求
項２または３のモノクローナル抗体である請求項４のＮ
ＡＩＰ検定方法。
【請求項６】マーカーが酵素、放射性同位体または蛍
光色素である請求項４または５のＮＡＩＰ検定方法。
【請求項７】抗ＮＡＩＰ一次抗体とＮＡＩＰを含む試
料とを接触させて一次抗体とＮＡＩＰを結合させ、この
結合体に抗ＮＡＩＰ二次抗体を結合させ、この二次抗体
に結合したマーカーのシグナル強度を測定する方法であ
って、 (1) 一次抗体と二次抗体を請求項１の抗ＮＡＩＰモノク
ローナル抗体とする、 (2) 一次抗体を請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗
体とし、二次抗体を抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体とす
る、または (3) 一次抗体を抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体とし、二
次抗体を請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体とす
る、ことを特徴とするＮＡＩＰの検定方法。
【請求項８】一次抗体が固相化されている請求項７の
ＮＡＩＰ検定方法。
【請求項９】抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体が、請求
項２および／または３のモノクローナル抗体である請求
項７または８のＮＡＩＰ検定方法。
【請求項１０】マーカーが酵素、放射性同位体または
蛍光色素である請求項７、８または９のＮＡＩＰ検定方
法。
【請求項１１】少なくとも以下の要素、 (a) 抗ＮＡＩＰ一次抗体が固相化されたプレート、およ
び(b) マーカー標識された抗ＮＡＩＰ二次抗体、からな
るキットであって、 (1) 一次抗体と二次抗体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノク
ローナル抗体である、 (2) 一次抗体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗
体であり、二次抗体が抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体で
ある、または (3) 一次抗体が抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体であり、
二次抗体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体で
ある、ことを特徴とするＮＡＩＰ検定キット。
【請求項１２】抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体が、請
求項２および／および３のモノクローナル抗体である請
求項１１のＮＡＩＰ検定キット。
【請求項１３】マーカーが放射性同位体または蛍光色
素である請求項１１または１２の検定キット。
【請求項１４】マーカーが酵素であり、さらに以下の
要素、 (c) 酵素活性によって発色する基質を有する請求項１１
または１２の検定キット。
【請求項１５】少なくとも以下の要素、 (a) 抗ＮＡＩＰ一次抗体が固相化されたプレート、 (b) 抗ＮＡＩＰ二次抗体、および (c) 二次抗体に結合するマーカー、からなるキットであ
って、 (1) 一次抗体と二次抗体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノク
ローナル抗体である、 (2) 一次抗体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗
体であり、二次抗体が抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体で
ある、または (3) 一次抗体が抗ＮＡＩＰポリクローナル抗体であり、
二次抗体が請求項１の抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体で
ある、ことを特徴とするＮＡＩＰ検定キット。
【請求項１６】抗ＮＡＩＰモノクローナル抗体が、請
求項２および／または３のモノクローナル抗体である請
求項１５のＮＡＩＰ検定キット。
【請求項１７】マーカーが放射性同位体または蛍光色
素である請求項１５または１６の検定キット。
【請求項１８】マーカーが酵素であり、さらに以下の
要素、 (d) 酵素活性によって発色する基質を有する請求項１５
または１６の検定キット。