JP2003532401A

JP2003532401A - 癌診断および抗癌剤のスクリーニングのためのアッセイ

Info

Publication number: JP2003532401A
Application number: JP2001582361A
Authority: JP
Inventors: マティアス・ゲオルク・クリスティアン・グスタイガー; ヴィルヘルム・クレック
Original assignee: Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research
Current assignee: Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2003-11-05
Also published as: CA2408002A1; WO2001085762A2; AU7402601A; WO2001085779A2; WO2001085980A3; AU6594701A; AU2001265947B9; WO2001085762B1; US20040028684A1; CA2408297A1; AU2001274026B2; CA2408213A1; US20030092054A1; AU2001265947B2; EP1287020A2; JP2003532405A; JP2003532428A; WO2001085980A2; AU2001256353A1; WO2001085779A3

Abstract

(57)【要約】新規ＲＭＰホモログ、ならびに本タンパク質をコードする核酸およびアンチセンス核酸が提供される。アミノ酸調節に依存する状態、癌、神経変性、筋肉低下、免疫疾患およびＡＩＤＳのようなＲＭＰに依存する状態の診断法ならびにＲＭＰに依存する状態に対して活性な薬剤を同定するためのスクリーニング法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は癌診断および治療への適用を伴う、細胞増殖の分野に関する。本発明
はまた、予防的であれ治療的であれ、抗癌活性の可能性のある化合物のスクリー
ニングに関する。考慮されるスクリーニングアッセイは、細胞分裂、遺伝子発現
および形質転換に関与するそのままの細胞のインビボの生化学的機構の部分を模
倣すると考えられる。

【０００２】世界の豊かな国において、癌は概ね５人に１人の死亡の原因である。１９９３
年に、米国癌学会は５種の最も一般的な癌は、肺、胃、胸部、結腸／直腸および
子宮頸部のものであると報告している。癌は全ての例において致命的であるわけ
ではなく、癌を発症した人の約半分のみがそれで死亡する。癌患者およびその医
師らが対面する問題は、癌の治療をしようと努めることが雑草退治を試みている
ようであることである。癌細胞は外科的に除去するか、毒性化合物または照射に
より死滅できるが、癌性細胞の全ての除去は非常に困難である。一般的なゴール
は、癌細胞を選択的に殺し、一方体の正常細胞は影響を受けずに残すことである
。この努力の一部は、新規抗癌剤の同定に関与する。

【０００３】癌細胞は細胞サイクルの正常制御を失っており、正常細胞と比較して、制御を
超えて分裂する。細胞サイクルを制御する細胞下機構は、細胞の中身の複製およ
び分裂の必須の工程を誘導および調和させる相互作用タンパク質のセットからな
る複合生化学的デバイスである。正常細胞サイクルにおいて、制御システムは、
サイクルの特異的ポイントで停止できるように制御される。停止ポイントは複製
または分裂の工程からフィードバックのシステムを可能にする。それらはまた環
境シグナルにより制御するためのポイントを提供する。

【０００４】遺伝子発現は細胞分裂およびその制御において不可欠な部分を担う。細胞分裂
の損失は、ある場合、遺伝子発現の変更を本来有し得る。癌細胞における遺伝子
変更の分析は、何らかの方法で細胞分裂の制御に関与するタンパク質をコードす
る多くの遺伝子で明らかになっている。

【０００５】癌遺伝子はこのような遺伝子の一つのファミリーである。癌遺伝子は、変異形
で癌細胞で発現されるか、過剰発現される。このような癌遺伝子の生成物は細胞
増殖を促進する。癌遺伝子の非変異または正常発現バージョンは原癌遺伝子とし
て既知であり、これは正常細胞で発現させ、正常細胞機構の構造タンパク質をコ
ードする。

【０００６】癌に関連する遺伝子生成物の他の種は、腫瘍抑制遺伝子により発現されるもの
であり、この遺伝子生成物は細胞増殖の抑制に働く。腫瘍抑制遺伝子の変異また
はこの遺伝子生成物の機能の損失は、増殖の正常制御の損失および制御を超えた
細胞分裂をもたらす。

【０００７】癌細胞およびそれらの癌遺伝子または腫瘍抑制遺伝子の研究は、成長因子が、
細胞内シグナル伝達カスケードの複合ネットワークを介して正常細胞中で細胞増
殖をどのように制御するかを示すのを助けている。これらのカスケードは、最終
的に遺伝子転写および細胞サイクル制御システムの構築と活性化を制御する。細
胞サイクル制御機構の成分部分およびどのようにそれが作動するかに関する知識
が増えるに連れて、癌細胞における制御の損失を正すための可能性は増えている
。制御の必須ポイントおよび必須タンパク質が制御ヒエラルキーで同定されてお
り、必要に応じて、プロモーターまたは阻害剤として作用するように薬剤で標的
化する可能性がある。

【０００８】細胞サイクル制御システムは、タンパク質の二つの主要なファミリーに基づく
。第１は、サイクリン依存性タンパク質キナーゼ(ＣＤＫ)であり、その多くの変
異体、例えば、ＣＤＫ１およびＣＤＫ２が存在する。ＣＤＫは選択タンパク質を
セリンおよびスレオニン残基でリン酸化する。タンパク質の第２の種類はＣＤＫ
分子に結合し、標的をリン酸化するその能力を制御するサイクリンと呼ばれる分
化した活性化タンパク質のファミリーである。サイクリンそれ自体は細胞サイク
ルの各段階で合成および分解のサイクルに付される。サイクリンの種々の種、例
えば、サイクリンＡおよびサイクリンＢが存在する。

【０００９】 Chao Y et al (1998) Cancer Research 58:985-990は、正常サイクリンＡレベ
ルを発現する患者と比較した、患者におけるサイクリンＡの過剰発現と、腫瘍細
胞の増殖活性の間の相関を報告している。サイクリンＡを過剰発現する患者は、
過剰発現しない患者よりも短い平均無症候期間であった。Chao et al (1998)は
またサイクリンＡ相互作用タンパク質(Ｓｋｐ２)は過剰発現したとき、サイクリ
ンＡと同じ腫瘍細胞活性を示さないと報告した。Chao et al (1998)は、Ｓｋｐ
２の発現が細胞サイクル進行にどのように関与するかに注目しているが、Ｓｋｐ
２の実際の生化学的機能はまた未知である。

【００１０】より最近の文献において、Chao Y et al (1999) Cancer Letters 139:1-6は、
サイクリンＡが新規抗肝細胞癌(ＨＣＣ)治療の検査の有用な標的を提供し得ると
示している。例えば、アンチセンスｍＲＮＡを使用したＳｋｐ２の過剰発現の遮
断を調査する実験の結果は、異常Ｓｋｐ２発現がＨＣＣ増殖と直接の相関がない
ことを示す。

【００１１】ＣＤＫの活性は細胞の制御の対象であり、ＣＤＫ阻害タンパク質(ｐ２７)は同
定されている。正常細胞において、ｐ２７はＤＮＡ複製に必須のＣＤＫの白湯を
制御することが示されている。ｐ２７のレベルは、静止細胞で高く、分裂の刺激
を受けている細胞で低いことが判明している。ｐ２７はそれ自体細胞を分裂に駆
動する活性化ＣＤＫの阻害により、細胞分裂のブレーキとして作用する。ｐ２７
のレベルの減少は阻害から活性化ＣＤＫを離し、細胞を分裂に駆動する。このｐ
２７の活性と一致して、その不安定化が、腫瘍侵略性および癌患者の悪い予後と
一般に相関している。

【００１２】細胞サイクル制御システムは動的システムであり、ｐ２７それ自体細胞中で一
定レベルで残らない。レベルは細胞サイクルのポイントに依存して異なる。ｐ２
７の低いレベルはユビキチン化および続くプロテアソーム仲介分解を介した破壊
のためである。ｐ２７のユビキチン介在分解の必須条件は、活性化ＣＤＫによる
スレオニン残基１８７(Ｔ１８７)のリン酸化である。リン酸化ｐ２７のユビキチ
ン化に必要な酵素は知られていないが、酵母のようなシステムにおけるユビキチ
ン化の知識から、ｐ２７に特異的なヒトユビキチンタンパク質リガーゼ(Ｅ３)が
存在し得ると予測される。

【００１３】 Sutterluety H et al (1999) Nature Cell Biology 1:207-214は、Ｓｐｋ２が
、ユビキチン化経路を介して細胞中のｐ２７の分解を促進することを報告してい
る。Ｓｋｐ２はＦ−Ｂｏｘ−タンパク質(ＦＢＰ)ファミリーのタンパク質メンバ
ーである。Ｓｋｐ２はＳｋｐ１、ＣｌｕＡ(Cdc53)、Ｆ−Ｂｏｘタンパク質(ＳＣ
Ｆ)複合体のｐ２７特異的レセプターであるように見える。このような複合体は
酵母中で既知であり、ＦＢＰサブユニットがユビキチン化の基質に特異性を有す
るユビキチン−タンパク質リガーゼ(Ｅ３)として働く。Ｅ３は活性化ユビキチン
分子のユビキチン接合酵素(Ｅ２)から分解する基質への移動を促進する。同様に
、ヒトにおいて、ＳＣＦ複合体が存在し、Ｓｋｐ２は、ｐ２７と特異的に相互作
用する能力を有し、ｐ２７のユビキチン仲介分解に必須であるように見えるＦＢ
Ｐである。インビボおよびインビトロの両方で、Ｓｋｐ２はリン酸化ｐ２７をユ
ビキチン化し、分解する細胞性組織の律速成分であることが判明している。

【００１４】Ｓｋｐ２は一つの遺伝子の生成物であり、それ自体細胞を分裂に駆動する点で
珍しい能力を有する。この能力は、他の既知の遺伝子生産物のわずか、例えば、
Ｅ２Ｆ−１、ｃ−ＭｙｃおよびサイクリンＥ−ＣＤ２複合体のみしか共有しない
。細胞サイクルのＧ１／Ｓ遷移時のＳｋｐ２の適時の蓄積は、哺乳類細胞におけ
るＤＮＡ複製開始の制御をする少数の律速段階の一つであり得る。Sutterluety
et al (1999)は、ＳＣＦ複合体に凝集しないＳｋｐ２の変異が、異所性に生成さ
れた野生型ｐ２７の排除の除外に不完全であることを発見した。また、変異Ｓｋ
ｐ２はサイクリン−Ｅ／Ａ関連キナーゼの活性化およびＳ相の導入を引き起こし
た。Ｓｋｐ２はまたＣＤＫの独立した結合部位であり、活性化ＣＤＫはｐ２７の
Ｔ１８７残基のリン酸化に関与するように見える。Sutterluety et al (1999)は
、また、どのように正常Ｓｋｐ２が、サイクリンＥ／Ａ依存的キナーゼの活性化
およびＳ相への挿入が非分解可能ｐ２７変異体の発現により遮断されるときでさ
え、サイクリンＡタンパク質の蓄積を誘導するかに注目している。考慮されるの
は、Ｓｋｐ２がサイクリンＡを上方制御し、この下方制御されたｐ２７とは無関
係であると結論付けられている。Ｓｋｐ２がサイクリンＡを上方制御する機構は
未知である。形質転換細胞におけるＳｋｐ２の観察される上昇したレベルは、腫
瘍抑制作用因ｐ２７の分解の速度の増加をもたらすことにより、腫瘍発生(tumou
rigenesis)の工程に、少なくとも部分的に寄与するはずであるという示唆がある
。ｐ２７発現の欠失は、結腸直腸および乳癌の患者の無症状生存と相関する。ま
た、ｐ２７は腫瘍抑制にハプロ−不完全(haplo-insufficient)であることが判明
している。

【００１５】 Carrano A. C. et al (1999) Nature Cell Biology 1:193-199は、どのように
Ｓｋｐ２が物理的にリン酸化ｐ２７と、インビトロおよびインビボの両方で相互
作用するかを報告している。ｐ２７ユビキチン化に機構的に必須であるリガーゼ
の全ての成分が発見しなければならないままであるが、Carrano et al (1999)は
、Ｓｌｐ２がこの機構の重要な部分であり、基質認識およびｐ２７への特異性を
提供することを証明している。Ｓｋｐ２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドが細胞においてＳｋｐ２発現を減少させ、それにより内因性ｐ２７のレベルの
増加をもたらすことが判明している。Carrano et al (1999)は、ｐ２７のユビキ
チン化が起こるためには、サイクリンＥ−ＣＤＫ２またはサイクリンＡ−ＣＤＫ
２の更なる必要性を確認している。細胞におけるｐ２７分解は、有糸分裂刺激に
続くＳｋｐ２およびサイクリンの両方の蓄積による二重制御に付されるように見
える。

【００１６】癌の分子ベースを解明している科学者に興味深いのは、遺伝子発現の制御の分
子ベースに関連する研究の分野である。癌におけるＳｋｐ２およびｐ２７の見か
けの必須の役割と以前は非関連であったのは、Bauer A. et al (1998) Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 95:14787-17492において報告されたPontin 52である。Pont
in 52は、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質(ＴＢＡ)の結合部位を有する核タン
パク質である。Pontin 52のタンパク質等価物は、ＴＩＰ４９と呼ばれる。Wood
M. A. et al (2000) Molecular Cell 5:321-300は、培養ラット胚線維芽細胞の
ｃ−Ｍｙｃ腫瘍形成製性形質転換が、ＴＩＰ４９を必須補助因子として必要とす
ることを観察している。

【００１７】ＲＮＡポリメラーゼサブユニットが、遺伝子発現の制御における転写調節剤の
標的を提供するはずであると考えられている。ＲＮＡポリメラーゼIIサブユニッ
ト５(ＲＰＢ５)は、過剰発現されたとき、Ｈｂｘのトランス活性化機能を阻害す
るタンパク質であるＲＰＢ５−仲介タンパク質(ＲＭＰ)と相互作用することが証
明されている(Dorjsuren D. et al. (1998) Molecular Cell Biol. 18:7546-755
5)。

【００１８】ＲＭＰホモログであるＮＮＸ３もまた文献に記載され(Van Leuven et al. (19
98) Genomics 54:511-520)、骨格筋、神経節および腫瘍細胞系で発現されること
が発見されている。しかし、その機能は解明していなかった。

【００１９】 Genebank配列AC008507.6およびAC073732は、対応するＲＭＰ／ＮＮＸ３配列に
相同性の領域を有するヒトおよびマウスcontigを各々提供する。

【００２０】 Genebank配列AF083242は７２６塩基対を含み、図１に配列番号２として示す。
本ＤＮＡ配列は、任意の構造的または機能的タンパク質をコードすることも既知
でなく、ゲノムにおいて任意の調節性または他の効果を有することが知られてい
る配列でもない。また利用可能なのは、ｃＤＮＡ配列に由来する配列である。こ
れは図２に配列番号１として明示する。また図１に示す、Genebank配列(配列番
号２)と種々の程度の相同性を有する多くの発現配列標識(ＥＳＴ)が存在する。

【００２１】発明の要約本発明は： MEAPTVETPP DPSPPSAPAP ALVPL(配列番号３) の少なくとも５連続アミノ酸、好ましくは配列番号３の少なくとも１０、１５、
２０またはそれ以上の連続アミノ酸を有するタンパク質またはペプチドを提供す
る。より好ましくは、ペプチド配列は任意の付加的ペプチドまたはタンパク質配
列のＮ−末端である。最も好ましくは、本発明は配列番号４に明示の配列を有す
るタンパク質を提供する。所望により、タンパク質またはペプチドはリン酸化し
得る。

【００２２】本発明のタンパク質またはペプチドを特異的に認識する抗体、特にホスホスペ
シフィック(phosphospecific)抗体が提供される。

【００２３】また提供されるのは、所望によりホスホロチオエートおよび／またはメチルホ
スホネートのようなヌクレアーゼ分解に耐性であるヌクレオチド残基を含み得る
、アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドを含む、本発明のタンパク質ま
たはペプチドをコードする核酸またはその相補的配列である。

【００２４】また提供されるのは、本発明の核酸を含む拡散功逐物、ならびに構築物を含む
、宿主細胞、特に真核宿主細胞、好ましくは昆虫細胞または哺乳類細胞である。

【００２５】本発明はまた願の予防または処置のための医薬の製造のための、ならびに医薬
として使用する、本発明の抗体、核酸、構築物または宿主細胞の使用も包含する
。

【００２６】本発明の他の態様において、ＲＭＰまたはそのフラグメントと、ＲＢＰ５以外
の少なくとも一つの他のタンパク質を含む複合体を提供する。好ましくは、複合
体はＳｋｐ２、ＳＴＡＰ１、ＴＩＰ４８、ＴＩＰ４９またはプレフォルディンを
、所望によりＲＰＢ５と共に含む。

【００２７】本発明の更なる態様において、アミノ酸調節に依存する状態の種々の診断法が
提供される。一つの実施態様において、方法は： (ａ)個体からサンプルを回収する； (ｂ)サンプルのＲＭＰまたはＲＭＰ活性を測定する；そして (ｃ)サンプル中のＲＭＰまたはＲＭＰ活性の存在と、アミノ酸調節に依存する状
態を相関させる段階を含む。

【００２８】アミノ酸調節に依存する状態は、慢性腎臓、心臓、肝臓、または肺疾患、癌、
ＡＩＤＳ、ダイエット状態、およびラパマイシン処置に感受性の状態を含む。方
法は、ＲＭＰのリン酸化状態の測定および状態とリン酸化ＲＭＰの状態の相関を
含み得る。あるいは、サンプル中のＲＭＰのレベルを測定し、標準レベルと比較
する；それにより、標準レベルと比較したＲＭＰの減少を、アミノ酸調節に依存
する状態と相関させることができる。細胞におけるＲＭＰの細胞性局在化をまた
状態の指標として使用できる。更なる態様において、ＲＭＰ活性を、例えば、ア
ミノ酸生合成をもたらす少なくとも一つの遺伝子の発現の導入(または抑制の上
昇)の分析により測定する。

【００２９】また提供されるのは、本発明の診断法に基づいたラパマイシンで処置する個体
の選択法である。

【００３０】本発明の診断法に有用な種々の試薬を含むキットも提供され、このようなキッ
トは１個以上のＲＭＰを認識する抗体；特に、ホスホスペシフィック抗体、サン
プルを回収する手段、ＲＭＰ特異的抗体を検出する手段を、所望により、指示書
、細胞融解緩衝液、アッセイ緩衝液、二次抗体および診断アッセイの実施に有用
な他の試薬または容器を含む。

【００３１】本発明によりまた提供されるのは、ＲＭＰ分解のモジュレーターの種々のスク
リーニング法である(または何らかの方法でアミノ酸調節に依存する状態に有効
な試薬の同定)。例えば： (ａ)ＲＭＰを含む細胞抽出物を、ＲＭＰ分解の調節剤の可能性のあるものを含む
反応混合物中でインキュベートする、 (ｂ)該ＲＭＰまたはリン酸化ＲＭＰの量、所望によりまたコントロールタンパク
質の量を測定する；そして (ｃ)ＲＭＰ分解の調節剤の存在と反応混合物におけるＲＭＰまたはＲＭＰリン酸
化のレベルの変化を、該候補調節剤が反応混合物に存在しない場合に関連して相
関させる：段階を含む方法が提供される。調節剤はＲＭＰ抑制剤であり得、この場合、レベ
ルの変化は非リン酸化ＲＭＰレベルの維持である。あるいは、調節剤はＲＭＰ活
性剤であり得、この場合レベルの変化はＲＭＰリン酸化の上昇またはＲＭＰレベ
ルの減少である。

【００３２】試験化合物の存在下でのＲＭＰのＲＰＢ５(ＲＮＡ pol IIサブユニット５；C
heong et al., EMBO J. 14(1), 143-150 (1995))への結合の測定、所望によりま
た試験化合物の非存在下での結合の測定を含む、抗癌化合物を同定する方法はま
た本発明により提供される。

【００３３】更に別の実施態様において、ＲＭＰタンパク質複合体と試験化合物を接触させ
、ついで：(ａ)そのまま残る複合体の量、(ｂ)損失したそのままの複合体の量、
または(ｃ)複合体から放出された遊離タンパク質またはポリペプチドサブユニッ
トの量を測定することを含む、抗癌剤を同定する方法が提供される。所望により
、本方法は、試験化合物と接触させる前にそのタンパク質サブユニット成分から
複合体を形成する段階を含む。

【００３４】本発明にまた包含されるのは、本発明法の任意の方法により同定された、ラパ
マイシン以外の、抗癌剤またはＲＭＰ分解の調節剤、好ましくは抗増殖剤である
。

【００３５】他の態様において、本発明は、癌の予防または処置の医薬としてのおよび／ま
たはその医薬を製造するための、本発明のスクリーニング法により同定した、ラ
マパイシン以外の薬剤の使用を提供する。

【００３６】更なる態様において、本発明は、本発明のスクリーニング法で同定したラマパ
イシン以外の化合物の有効量を投与することを含む、アミノ酸調節に依存する状
態の阻害法を提供する。このような状態は、限定しないが、癌、血管形成、糖尿
病、細胞加齢、神経変性疾患、免疫学的疾患、筋肉低下、ストレス(トラウマ、
熱傷、敗血症、熱)、慢性疾患(慢性腎臓、心臓、肝臓および肺疾患)およびＡＩ
ＤＳを含む。

【００３７】発明の詳細な記載本発明者らはＳｋｐ２およびｐ２７の発現レベルに関して、種々の異なる癌細
胞タイプのスクリーニングをしている。発明者らはまたＳｋｐ２およびＨ−ＲＡ
Ｓ^G12Vの両方と、一次齧歯類線維芽細胞の共形質転換を行なっている。これらの
実験のほかに、発明者らは、Ｓｋｐ２が多くのヒト癌を担う癌遺伝子であること
を発見している。

【００３８】Ｓｋｐ２の癌原性機能の調査において、発明者らはＳｋｐ２−関連タンパク質
１(ＳＴＡＰ１)と呼ばれる新規タンパク質を予想外に発見した。発明者らはＳＴ
ＡＰ１に対する抗体を生成し、これらの抗体をＨｅＬａ細胞からのＳＴＡＰ１を
免疫沈降するための抗体として使用した。免疫沈降物は、驚くべきことに、いく
つかのＳＴＡＰ１−共免疫沈降タンパク質を含むことが判明した。ＳＴＡＰ１を
含むタンパク質は、複合体を形成することが判明した。タンパク質の分子量を質
量分析により測定し、ついでタンパク質および遺伝子配列のデータベースをタン
パク質の試みおよび同定のために調査した。全く予想外に、タンパク質のＳＴＡ
Ｐ１含有複合体は、ＴＩＰ４８、ＴＩＰ４９、ＲＰＢ５(ＲＮＡ pol IIサブユニ
ット５)、ＲＭＰ１(ＲＮＡ pol IIメディエータータンパク質)ならびに他の現在
まで未知のタンパク質を含むことが判明している。

【００３９】任意の理論に縛れることを望ずに、発明者らはＳｋｐ２がＳＴＡＰ１および、
転写制御アパレイタスの既知の要素、例えば、ＴＩＰ４９(およびＴＩＰ４８)、
ＲＰＢ５およびＲＭＰ１との複合体を介して相互作用できる腫瘍遺伝子を代表し
、この連結がタンパク質−タンパク質結合および酵素的活性の阻害剤としての攻
撃の新しいポイントを提供することを理解する。このような阻害剤は、抗増殖性
およびしたがって、抗癌特性を有することが期待される。この発見の観点から、
適当なスクリーニングアッセイは、本発明により、例えば、新規抗癌剤の同定の
ために開発できる。

【００４０】本発明の一つの態様において、ＲＭＰ１コード配列ならびに得られるタンパク
質生成物が提供される。ヒトＲＭＰ１ホモログの先に公開された配列は、本発明
で提供される配列のＮ−末端の約７０アミノ酸を欠くか(ＮＮＸ３：Van Leuven
et al.; NCBI Accession No. AAD08679, 21 Jan 1999)またはＲＭＰ１のＮ末端
から５０アミノ酸を、非関連配列由来の約２５アミノ酸で置換されている(Dorjs
uren et al.; NCBI Accession NO. NP_003787, 1 Nov 2000)。本発明で、ヒトゲ
ノム配列が解明され、本発明により提供されるＲＭＰ１を測定するための慣用的
事柄であると予期するであろう。それにも関らず、アップデートされた配列デー
タベースはまだ切断ヒトＲＭＰ１ホモログ配列のみ提供している(ACBI Accessio
n No. XP_012802, 16 April 2001)。

【００４１】したがって、本発明の一つの態様において、 MEAPTVETPP DPSPPSAPAP ALVPL(配列番号３) の少なくとも５連続アミノ酸、好ましくは配列番号３の少なくとも１０、１５、
２０またはそれ以上の連続アミノ酸を有するタンパク質またはペプチドを提供す
る。より好ましくは、ペプチド配列は任意の付加的ペプチドまたはタンパク質配
列のＮ−末端である。最も好ましくは、本発明は配列番号４に明示の配列を有す
るタンパク質を提供する。所望により、タンパク質またはペプチドはリン酸化し
得る。リンペプチドは、ホスホスペシフィックペプチドの製造に特員有ようであ
り、それは、ついで、天然に存在するホスホ−ＲＭＰとの反応に関して試験でき
る。本発明のタンパク質およびペプチドは、下記に詳述する診断およびスクリー
ニング法に特に有用である。

【００４２】本発明の方法において有用なのはまたＲＭＰ１変異体またはそのフラグメント
である。ＲＭＰ１変異体は、配列番号４と実質的に相同性の配列、特に、少なく
とも６０％、好ましくは少なくとも７０または８０％、より好ましくは少なくと
も９０％、より更に好ましくは少なくとも９９％の同一性(相同性)の程度を有す
る。

【００４３】ＲＭＰ１変異体は好ましくは、少なくとも一つの転写制御因子、所望により細
胞の他のタンパク質またはポリペプチドに結合親和性および／または会合親和性
を有する。好ましいＲＭＰ１変異体は、１個以上のＴＩＰ４８、ＴＩＰ４９およ
びＲＰＢ５、所望によりまた他のタンパク質またはポリペプチドに結合親和性お
よび／または会合親和性を有する。

【００４４】ＲＭＰ１の変異体は変異変異体(mutant variant)の全ての形、例えば、少なく
とも一つのアミノ酸が欠失または置換しているものを含む。アミノ酸の置換が関
与する任意の変化は、好ましくは中性または保存的置換である。

【００４５】他の変異体は、少なくとも１個の付加的アミノ酸を配列に含む、および／また
は融合タンパク質のような更に付加的アミノ酸配列またはドメインを含むタンパ
ク質またはポリペプチドを含み、当分野で既知である。

【００４６】ＲＭＰ１タンパク質またはポリペプチドの更なる変異体は、配列中の少なくと
も一つのアミノ酸が天然または非天然アナログであるものを含む。また、配列中
の１個以上のアミノ酸を、例えば、物理的安定性を増加させるため、または酵素
的、特にプロテアーゼまたはキナーゼ活性への感受性を低下させるために、化学
的に修飾し得る。

【００４７】本発明の更なる態様において、本発明のタンパク質またはペプチドをコードす
る核酸、ならびにその相補的配列が提供される。特に、核酸は配列番号５(配列
番号３のアミノ酸配列をコードし、配列番号６のフラグメントとして発見)の少
なくともフラグメント、またはその相補鎖を含み、好ましくは、配列番号６に記
載の配列、またはその相補鎖を含む。このような核酸はプローブおよびプライマ
ーとして、特に、ＲＭＰ１の完全長核酸コード配列を得るために有用である。

【００４８】本発明のＲＭＰ１タンパク質、またはそのポリペプチドフラグメントは、実質
的に図４(配列番号６)に明示の核酸配列により、またはそれと少なくとも７０％
相同性を有し、低ストリンジェンシー条件下でそれとハイブリダイズでき、少な
くとも配列番号５のフラグメント、好ましくは、少なくとも１または１０ヌクレ
オチドのフラグメントを含む、配列コードされる。低ストリンジェンシー条件は
、約０.０１×ＳＳＣ緩衝剤を用い、比較して、高ストリンジェンシーは約１０
倍多い濃度を用いる。配列相同性は少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９
０％、より好ましくは少なくとも９５％、より更に好ましくは９７.５％、最も
好ましくは少なくとも９９％であり得る。

【００４９】本発明の他の態様は、配列番号５または配列番号６の核酸の全てまたは一部に
対する核酸アンチセンス、または配列番号５または配列番号６と少なくとも７０
％相同性を有し、配列番号５または配列番号６と低ストリンジェンシー条件下で
それとハイブリダイズでき、前記のＲＭＰ１タンパク質またはポリペプチドをコ
ードする配列に対するアンチセンスを提供する。あるいは、アンチセンスＲＮＡ
はＲＭＰ１遺伝子の制御配列、特に、遺伝子の５'上流配列(プロモーター領域)
に対してアンチセンスであり得る。核酸がアンチセンスである配列は、少なくと
も８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よ
り更に好ましくは９５％、最も好ましくは少なくとも９９％の相同性(同一性)を
有する。

【００５０】核酸は、好ましくは少なくとも１０塩基長、より好ましくは少なくとも１５、
よりさらに好ましくは少なくとも５０塩基長である。核酸はＲＮＡまたはｄＮＡ
、センスまたはアンチセンス、およびある実施態様において、二本鎖または一本
鎖であり得る。ある実施態様において、核酸(センスまたはアンチセンス)の少な
くとも数個のヌクレオチド残基をヌクレアーゼ分解に耐性に作り得、これらはホ
スホロチオエートおよび／またはメチルホスホネートのような残基から選択でき
る。

【００５１】前記のアンチセンス核酸は、有利には医薬として使用でき、好ましい医薬適用
は、癌のようなアミノ酸調節に依存する状態の予防または治療用の医薬の製造の
ためである。

【００５２】したがって、本発明はまた個体に前記の核酸、好ましくはアンチセンス核酸の
有効量を投与することを含む、アミノ酸調節に依存する状態を予防または処置す
る方法を提供する。

【００５３】本発明の他の実施態様は、(ａ)本発明のＲＭＰ１タンパク質またはポリペプチ
ドをコードする少なくとも一つの核酸配列部分(ｂ)前記のアンチセンス核酸(ま
たは。例えば、細胞におけるアンチセンスの発現が予測される場合、その相補鎖
)、または(ｃ)前記の核酸およびＲＭＰ以外のタンパク質をコードする少なくと
も一つの核酸配列(またはそのホモログ)を含む。このような構築物は天然に存在
しない。構築物は、ベクターとしての機能をそれらに与えるであろうＤＮＡの必
須配列を欠くが、通常“ハイブリッド”として存在する。それらはリンカーまた
は制限部位として機能する核酸配列を含み得る。好ましい構築物は当業者に既知
のオリゴヌクレオチド合成の方法を使用して合成する。

【００５４】また提供されるのは、前記の構築物を含むベクターである。好ましいベクター
は、発現ベクター、好ましくはプラスミドまたはウイルスであるが、クローニン
グベクターも、所望によりプラスミドの形で提供される。

【００５５】本発明はベクターを含む宿主細胞を提供する；好ましくは、宿主細胞は本発明
のＲＭＰ１１タンパク質またはポリペプチドを発現する。好ましい宿主細胞は真
核細胞、より好ましくは昆虫細胞または哺乳類細胞である。

【００５６】本発明の構築物、ベクターおよび形質転換宿主細胞は、アミノ酸調節に依存す
る状態の予防または処置用の医薬として、ならびに、医薬の製造のために、使用
する。

【００５７】本発明のタンパク質またはペプチドを特異的に認識する抗体、特にホスホスペ
シフィック抗体が提供される。抗体を製造する方法は、当分野で既知である。Ｒ
ＭＰに特異的な抗体は、動物を免疫原性量のＲＭＰで免疫化することにより容易
に得ることができる。したがって、ＲＭＰを認識する抗体は、動物の免疫化によ
り得られるポリクローナル抗体および抗血清の両方を含み、これはウェスタンブ
ロッティング、ＥＬＩＳＡ、免疫染色(immunostaining)または他の当分野で既知
の慣用法により確認できる。

【００５８】ウシ血清のような担体タンパク質と所望により連結した、ＲＭＰの一部も、特
に、ホスホスペシフィック抗体が望まれる場合、免疫原として使用できる。タン
パク質フラグメントは、ペプチド合成装置により合成し得、好ましくは８以上の
アミノ酸を含む。

【００５９】ポリクローナル抗体が感作により得ることができる場合、モノクローナル抗体
を、感作動物のリンパ球から得られ得るハイ振り土―マにより分泌させる(Chapt
er 6, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pres
s, 1988)。したがって、ＲＭＰを認識するモノクローナル抗体、特にホスホスペ
シフィック抗体も提供される。“ホスホスペシフィック抗体”なる用語は、抗体
がＲＭＰのリンペプチドフラグメントまたはリン酸化ＲＭＰを特異的に認識する
が、非リン酸化ＲＭＰまたはそのペプチドフラグメントを認識しないことを意味
する。

【００６０】本発明において、抗体はまたその活性フラグメントを含む。活性フラグメント
は、抗原−抗体反応の活性を有する抗体のフラグメントを意味する。特に、活性
フラグメントで、挙げられるのは、Ｆ(ａｂ')２、Ｆａｂ'、ＦａｂおよびＦｖで
ある。例えば、Ｆ(ａｂ')２は、本発明の抗体をペプシンで消化させた場合得ら
れ、Ｆａｂはパパインで消化させた場合得られる。Ｆａｂ'は、Ｆ(ａｂ')２を２
−メルカプトエタノールのような試薬で還元し、モノヨード酢酸でアルキル化し
た場合、得られる。Ｆｖは重鎖の可変領域および軽鎖の可変旅行きがリンカーで
接続している場合、単活性フラグメントである。キメラ抗体は、これらの活性フ
ラグメントを保存し、これらの活性フラグメント以外のフラグメントに関して他
の動物のフラグメントで置換することにより得る。特に、ヒト化抗体が想定され
る。

【００６１】ＲＭＰを検出する方法は、所望により、酵素反応の使用と共に、例えば、上記
に言及したように抗体を使用する方法を含む。ＲＭＰを認識する抗体は、ＲＭＰ
抗体に特異的な二次抗体を使用して検出でき、それは所望により放射性標識、酵
素、アビジンまたはビオチン、または蛍光物質(ＦＩＴＣまたはローダミン)で例
えば標識する。

【００６２】本発明にまた包含されるのは、医薬、特に癌の予防または処置のための医薬製
造のための、または医薬としての、ＲＭＰを特異的に認識する抗体の使用である
。

【００６３】本発明の更なる実施態様において、ＲＭＰ１、その変異体またはフラグメント
と、ＲＰＢ５以外の少なくとも一つの他のタンパク質を含む複合体が提供される
。ＲＭＰ１複合体は、好ましくは、１個以上のＳｋｐ２、ＳＴＡＰ１(図２；配
列番号１)、ＴＩＰ４８、ＴＰＩ４９およびプレフォルディンを、所望によりＲ
ＰＢ５と共に含む。サブユニットＳＴＡＰ１、ＴＩＰ４８、ＴＩＰ４９、ＲＰＢ
５、ＲＭＰ１は約１：１：１：１：１の比率で存在得るが、他の比率も可能であ
る。所望により、付加的タンパク質またはポリペプチドは１：１の化学量論的比
率で存在し得るが、また他の比率も可能である。

【００６４】本発明は、ＲＭＰ１、その変異体またはフラグメントおよび３個以上の他のタ
ンパク質またはポリペプチドを含む、転写制御タンパク質複合体を提供する。こ
れらの他のタンパク質またはポリペプチドは、前記の通りであり得る。

【００６５】前記の本発明の任意の複合体において、タンパク質またはポリペプチドサブユ
ニット成分は、各々、５から５００ｋＤ、好ましくは５から３００ｋＤ、より好
ましくは１０から２００ｋＤ、より更に好ましくは１０から１００ｋＤの分子量
を有し得る。ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは質量分析は、分子量を確立する方法を提供
する。

【００６６】前記の通りの本発明の複合体は、ＳＴＡＰ１またはＳＴＡＰ１のポリペプチド
フラグメントに対して反応性の抗体を使用した免疫沈降により得られ得る。理想
的に、本発明の複合体は他の細胞性不純物を実質的に含まない。したがって、単
離複合体は、少なくとも８０％純度、好ましくは９０％純度、より好ましくは９
５％純度、より更に好ましくは９９％純度である。純度は種々の方法、例えば、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定できる。

【００６７】本発明の複合体を生成する別法は、それらを構造タンパク質またはポリペプチ
ドサブユニットから凝集することであり得る。一つの方法は、各構造サブユニッ
トの過剰発現をするように細胞を形質転換し、細胞中で複合体の凝集が起こるよ
うにすることである。好ましい発現システムは形質転換昆虫細胞を用いる。

【００６８】他の方法は、インビトロで構造サブユニットを一緒に複合体の自己凝集に十分
な条件下で混合することである。好ましくは、サブユニットの混合は実質的に同
じに起こる。形質転換細胞の粒子複合体の集合、続く単離およびそれらのインビ
トロでの全複合体の自己凝集を促進する条件下での残りのサブユニットとの混合
を含む、混合の多くの他の可能性が存在する。また、粒子複合体はインビトロで
、混合し、次いで残りのサブユニットと混合することにより製造できる。サブユ
ニットまたは粒子複合体のインビトロでの混合の程度は複合体を生成するために
重要でないと考える。

【００６９】本発明の更なる態様において、アミノ酸調節に依存する状態の診断法が提供さ
れる。最も広い態様において、方法は (ａ)個体からサンプルを回収する； (ｂ)サンプルのＲＭＰまたはＲＭＰ活性を測定する；そして (ｃ)サンプル中のＲＭＰまたはＲＭＰ活性の存在と、アミノ酸調節に依存する状
態を相関させる段階を含む。

【００７０】本発明の方法は、典型的に細胞または組織サンプルにおけるＲＭＰの存在、レ
ベル、細胞性局在化または活性の測定を含み、サンプルはしばしばヒトから得る
が、本方法がウシ、ウマ、ヒツジなどの農業的に重要な哺乳類、またはネコおよ
びイヌのような獣医学的に興味深い他の動物から得ることができることを容易に
理解できるであろう。アッセイは、体組織、生殖細胞系列組織、または癌組織の
ような任意の細胞または組織サンプル、ならびに胸膜液、血液、血清、血漿およ
び尿のような体液からのサンプルで行なうことができる。

【００７１】 “サンプル”は、通常、アッセイ可能な形のＲＭＰを提供するために予備処理
に付すが、必ずしも付さない、分析する材料である。これは、通常細胞抽出物の
形成を必要とし、その方法は当分野で既知である(例えば、Scopes, Protein Pur
ification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y
., 1987参照)。

【００７２】本発明の最も広い態様において、一貫性が維持される限り、サンプルの回収お
よび取り扱いに限定はない。サンプルを生検、外科的切除、塗抹標本等のように
、当分野で既知の方法により得る。

【００７３】ＲＭＰまたはＲＭＰ活性恩臨床的サンプルにおける測定の一貫性は、種々の技
術の使用により確認できる。例えば、各組織抽出物の質をコントロールするため
に、アルカリホスファターゼのような他の酵素活性を、内部コントロールとして
使用できる。加えて、内部標準は、アッセイ条件のコントロールとしてサンプル
におけるＲＭＰと同時に測定できる。したがって、分析段階は、サンプルにおけ
るコントロールタンパク質の検出、所望により、コントロールタンパク質で得た
シグナルでのＲＰＭで得た値の標準化を含む。

【００７４】サンプル中のＲＭＰの存在は、当分野で既知の方法を使用したＲＭＰタンパク
質の検出により決定でいる。本発明において、ＲＭＰまたはＲＭＰ活性の測定に
使用するアッセイの限定はない。例えば、ＲＭＰはＲＭＰに特異的な抗体を使用
した免疫アッセイにより検出できる。抗体は、例えば、タンパク質が酵素結合免
疫アッセイにより同定したものである二次元ゲルのウェスタンブロットで、また
は、全細胞性タンパク質、または部分的に精製されたタンパク質のドットブロッ
ト(抗体サンドイッチ)アッセイにおいて使用できる。子の増し実施態様において
、リン酸化ＲＭＰをホスホスペシフィック抗体を使用して測定する。

【００７５】サンプル濃縮およびタンパク質精製の方法は文献に記載されている(Scopes, 1
987参照)。例えば、望ましい場合、細胞抽出物に存在するＲＭＰを、硫酸アンモ
ニウムで沈殿させるか、または抽出物を商品として入手できるタンパク質濃縮フ
ィルター、例えば、AmiconまたはMillipore、限外濾過ユニットを通して濃縮で
きる。抽出物をアニオンまたはカチオン交換樹脂、またはゲル濾過マトリックス
のような適当な精製マトリックスに適用するか、分取電気泳動に付す。このよう
な場合において、各精製段階後に得たＲＭＰおよびタンパク質の収量はサンプル
中のＲＭＰの量を測定する際に考慮する必要がある。しかし、これらの分離が一
般に困難であり、ＲＭＰの損失をもたらし得るため、前処理していない細胞抽出
物がアッセイに好ましい。

【００７６】上記のように、一つの実施態様において、サンプル中のＲＭＰの存在は免疫学
的技術を使用して測定する。本発明のＲＭＰ、特に、ＲＭＰ１の存在は、アミノ
酸調節に依存する状態の診断に有用な情報を提供できる。好ましい実施態様にお
いて、ＲＭＰのリン酸化状態を、例えば、細胞抽出物または前処理細胞抽出物の
ようなサンプルの免疫“ドット”ブロットにおけるホスホスペシフィック抗体の
使用により、測定する。サンプル中のリン酸化ＲＭＰの存在は、アミノ酸調節に
依存する状態の指標である。

【００７７】別の実施態様において、サンプル中のＲＭＰのレベルを測定し、標準レベルと
比較する。該標準レベルと比較したＲＭＰレベルの減少はアミノ酸調節に依存す
る状態の指標である。標準レベルは状態に罹患していない第２の個体から得たサ
ンプルにおけるＲＭＰのレベルであり得る。状態が癌であるなら、標準レベルは
同じ個体から得た非癌性組織のＲＭＰレベル、または癌性増殖に隣接した組織か
ら除去したサンプルにおけるＲＭＰレベルであり得る。

【００７８】ＲＭＰの標準レベルは、アミノ酸調節に依存する状態を有するものおよびその
ような状態を有してないものの二つの統計学的有意なクラスに患者の集団を分け
るために選択する。本発明の一つの実施態様において、標準値はＲＭＰを有する
ことが既知の組織に見られるＲＭＰのレベル、すなわち、その状態に罹患してい
ない正常組織におけるＲＭＰのレベルであるように選択する。

【００７９】あるいは、ＲＭＰの標準レベルを、正常個体と比較した、１個以上のアミノ酸
腸背得tに調節に依存する状態のＲＭＰレベルの統計的有意相関を得るために回
収することにより決定する。

【００８０】典型的に、罹患および非罹患個体の間のＲＭＰレベルの変化は、測定の比較可
能な状態下で少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは１０倍で
ある。当業者は、感受性が低いアッセイをサンプル中のＲＭＰのレベルの測定に
選択した場合、ＲＭＰの検出可能なレベルを提供するために、使用するサンプル
／抽出物の量を増やすか、上記のような慣用法を使用して抽出物を予備処理する
ことが必要であり得ることを認識するであろう。アッセイ法は、本発明の方法に
おいて相対的値が十分であるため、望まない限りＲＭＰの絶対的値の測定は必要
ではない；しかし、ＲＭＰレベルの定量のための既知の任意の方法がこの測定に
使用される。

【００８１】状態の診断のＲＭＰレベルの予め選択した範囲は、既知の臨床的症状を有する
被検体から得た同じ細胞または組織サンプルに関して確立できる。十分な測定は
、比較をする値に関する統計的に有意な範囲の値を得るために成す。ＲＭＰの予
め決定した範囲は、典型的に最も高い相関を確認するために試験した個体に適用
した方法と同じアッセイ技術を使用して得る。標準値は、ＲＭＰを測定する特異
的細胞または組織および使用する特異的アッセイにより変化し得る。一定の細胞
または粗S期に関するＲＭＰの予め決定した範囲は、非罹患個体ｋらの値とみな
されるＲＭＰレベルの標準値の決定についで使用でき、陰性診断と相関する。本
発明の方法は任意の他の物質恩測定を必要としないか、または、本発明のこの後
者の態様において、アッセイ工程の標準レベルを確立したら、一つの測定にさえ
依存できる。一つの測定を信頼する場合、アッセイは好ましくはＲＭＰレベルを
測定する条件下で行なう。

【００８２】 (例えば、そして限定する意図はないが、非希釈サンプルで検出できず、長時
間インキュベートしたサンプルでのみ検出可能な活性であるなど)標準値と比較
して測定された低いレベルのＲＭＰ(またはＲＭＰ無し)は、アミノ酸調節に依存
する状体温指標であり、医師が適当な治療をしなければならないことを示す。標
準レベルと同等のまたは高いＲＭＰレベルは、良好な診断の指標である。

【００８３】当業者は、細胞抽出物の使用がほとんどの目的で好ましいが、そのままの細胞
を用いることができるように方法を修飾できることも認識するであろう。この実
施態様において、そのままの細胞をＲＭＰに特異的な抗体で処理し、例えば、当
分野で既知の免疫組織化学技術を使用してＲＭＰの局在化を可視化する(Van Leu
wen, 1998, Genomics 54:511-520)。あるいは、細胞性局在化を、例えば、スク
ロース勾配上の細胞性成分の分画後に、核抽出物および細胞質抽出物から得たサ
ンプルを分析することにより測定できる。理論に縛れることを望まないが、本発
明者らはＲＭＰが、アミノ酸生合成を担う遺伝子の発現を阻害し得る場所である
、正常組織の核に局在していると考える。逆に、罹患個体からの罹患組織におい
て、ＲＭＰは核から放出され、アミノ酸合成の抑制を上げ、該状態と共に細胞質
に移ると考える。好ましい実施態様において、ＲＭＰ局在化はホスホスペシフィ
ック抗体で可視化する。

【００８４】更なる実施態様において、ＲＭＰ活性を測定する。好ましい実施態様において
、ＲＭＰ活性はアミノ酸生合成をもたらす少なくとも一つの遺伝子の発現(また
は抑制の除去)の指標である。

【００８５】好ましい形式において、アミノ酸生合成に関与するタンパク質をコードする種
々の遺伝子配列を含むＤＮＡチップアレイを設計する。これらの遺伝子配列は種
々のデータベース(例えば、Genebank, NCBI)から容易に得ることができる。個体
からのＲＮＡサンプルを試験し、アミノ酸生合成遺伝子が、本質的に上記の技術
を使用して測定した標準値と比較して上方制御されているかどうかを測定する。
コントロール値またはコントロールサンプルと比較して、特異的なＲＮＡ、特に
、アミノ酸生合成に関与するタンパク質をコードするものの高いレベルを示すサ
ンプルはアミノ酸調節に感受性の状態の指標である。したがって、この実施態様
において、ＲＭＰ活性はアミノ酸生合成に関与する遺伝子の発現を抑制する能力
と同等と考える。この実施態様において、当分野で既知の、またはまだ開発され
ていないＲＮＡ調製の任意の方法を用い得るが、サンプル間のＲＮＡの質を維持
する、例えば、分解を最少にする注意をするべきである。

【００８６】どの診断法を使用するかに関係なく、アミノ酸調節に依存する状態は、慢性腎
臓、心臓、肝臓または肺疾患のような慢性病、白血病、膀胱癌、神経芽細胞腫、
胃癌、前立腺癌、乳癌、大腸癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌および肺癌のような癌
(但し、ＲＭＰの存在のみが測定されたときは癌はホジキン病ではない)、または
ＡＩＤＳにおけるような免疫不全、神経変性、筋肉低下、血管形成、糖尿病、細
胞加齢、またはダイエット状態を含む。また包含されるのは、ラパマイシン処置
に感受性の状態である。

【００８７】本発明の診断法は、医師が適当な治療を施すことを可能にする。ＲＭＰのこれ
らのアッセイを含む、あるアナライトのアッセイは、付加的情報の非存在下で主
治医により得られるか、解釈されることは予期されない。ＲＭＰを試験する方法
は、状態に関してより有用な情報を提供するが、本方法と組み合わせて付加的情
報を提供し得る試験を使用し得る。更に、任意のアッセイの結果は、絶対的な証
明よりむしろ臨床的状態の存在の可能性の指標として最もよく考慮される。同じ
状況が本発明に関して存在する。それにもかかわらず、診断の指標は臨床的に有
用な情報であり、情報が利用可能でない場合に可能であるよりも、より銃砲に基
づく方法で患者を処置するための他の情報と組合せて、医学専門家が使用できる
。特に、医師はＲＭＰを定量する更なる診断試験が、治療の効果を追跡するため
に定期的に必要であるかを決定できる。

【００８８】ＲＭＰリン酸化におけるラパマイシンの効果は、更に、本発明の診断法が個体
がラパマイシンに感受性であるか否かを決定するために使用できることを示唆す
る。癌に罹患している多くの個体はラパマイシンに応答せず、特定の治療に患者
が応答するかしないかを選択するための医師の能力は特に有用である。したがっ
て、本発明の更なる態様において、本明細書に記載の任意の診断法を使用して、
ラパマイシン、またはＩＧＦまたはＴＰＲ経路に依存する任意の他の薬剤で処置
するための、アミノ酸調節に依存する状態の処置のために個体を選択する方法が
提供される。

【００８９】本発明はまた本発明の方法を実施するためのキットを提供する。このようなキ
ットは容易に入手可能な物質から製造でき、種々の実施態様がある。例えば、こ
のようなキットは以下の物質の１個以上を含む；ＲＭＰを認識する抗体、好まし
くはホスホスペシフィック抗体、フィルターまたは他の半多孔性支持体のような
サンプルを回収する手段、反応試験管、緩衝液(例えば、細胞融解緩衝液または
アッセイ緩衝液)、二次抗体、ＲＭＰ特異的抗体を検出する手段、酵素基質、コ
ントロール試薬、オリゴヌクレオチドおよび指示書。広範囲の種々のキットおよ
び成分を本発明により製造でき、キットの考えられる使用者および使用者の特定
の要求に依存する。

【００９０】明確化のために、本発明のスクリーニング法(およびある場合、サンプルに依
存して診断法)は、ＲＭＰ１または、当分野で既知のＮＮＸ３またはＲＭＯのよ
うな任意の変異機能的フラグメントまたはホモログを使用(または検出)できる。
したがって、内容から明らかでない限り、ＲＭＰまたはＲＭＰ１に関する言及は
、ＲＭＰ１の両方の変異体およびそのフラグメントを含むが、典型的にＲＭＰ、
ＲＭＰ１またはＮＮＸ３が好ましい。好ましくは、図３に明示のＲＭＰ１をスク
リーニング法で使用するか、それが診断法で検出される。

【００９１】したがって、他の態様において、本発明は、本発明のＲＭＰ１タンパク質また
はポリペプチドへの試験化合物の結合を測定することを含み、所望によりまたＲ
ＭＰ１タンパク質またはポリペプチドへのコントロール化合物の結合の測定も含
む、抗癌化合物の同定法を提供する。

【００９２】また提供されるのは： (ａ)ＲＭＰを含む細胞抽出物を、ＲＭＰ分解の調節剤の可能性のあるものを含む
反応混合物中でインキュベートする、 (ｂ)該ＲＭＰまたはリン酸化ＲＭＰの量、所望によりまたコントロールタンパク
質の量を測定する；そして (ｃ)ＲＭＰ分解の調節剤(すなわち、アミノ酸調節に依存する状態に対して有効
な薬剤)の存在と反応混合物におけるＲＭＰまたはＲＭＰリン酸化のレベルの変
化を、該候補調節剤が反応混合物に存在しない場合に関連して相関させる：段階を含む、アミノ酸調節に依存する状態、特に癌に対して有効な薬剤のスクリ
ーニング法である。

【００９３】本質において、細胞抽出物を製造するおよび診断法においてＲＭＰを測定する
上記の技術は、本発明のスクリーニング法に適用できる。例えば、検出段階はＲ
ＭＰと抗体、好ましくはホスホスペシフィック抗体とのインキュベートを含む。
ＲＭＰ分解、リン酸化、細胞レベル、局在化およびＲＭＰ活性における化合物の
影響は、有効な薬剤のスクリーニングにおいて決定できる。同様に、コントロー
ルタンパク質を使用してＲＭＰ検出のために得た値を標準化できる。

【００９４】本方法は、例えば、レベルの変化は非リン酸化ＲＭＰレベルの維持であるＲＭ
Ｐ抑制剤、またはレベルの変化がＲＭＰリン酸化の上昇または全体的ＲＭＰレベ
ルの減少であるＲＭＰ活性剤の同定に適用できる。

【００９５】本発明によりまた提供されるのは、ＲＭＰのＲＢＰ５への結合を試験化合物の
存在下で測定し、所望よりまた試験化合物の非存在下での結合を測定することを
含む、アミノ酸調節に依存する状態、特に癌に対して有効な薬剤の同定法である
。ＲＭＰは好ましくは配列番号４に明示の通りである。

【００９６】好ましい方法は固相アッセイであり、最も好ましい実施態様において、ＲＭＰ
１タンパク質、そのフラグメントまたは変異体を支持体上に固定化する。リガン
ド結合アッセイに最も好ましい支持体は、ニッケルまたはニッケル被覆、例えば
ニッケル被覆マイクロタイタープレートであり、固体表面へのＨＩＳ６標識ＲＭ
Ｐ１の容易な接着を可能にする。本来、接着の他の手段を容易に適用できる。免
疫アッセイのために、ニトロセルロースのようなタンパク質を結合するフィルタ
ーまたは他の適当なブロット材料が最も好ましい。

【００９７】タンパク質および／またはその結合パートナー(例えば抗体)を、例えば、蛍光
標識、ビオチン、金属ゾル粒子または放射標識で標識し得る。好ましい実施態様
において、標識はユーロピウムである。

【００９８】他の態様において、本発明は、前記の通りの一定量の複合体と試験化合物を接
触させ、１個以上の：(ａ)そのまま残る複合体の量、(ｂ)損失したそのままの複
合体の量、または(ｃ)複合体から放出された遊離タンパク質またはポリペプチド
サブユニットの量を測定することを含む、抗癌剤の同定法を提供する。

【００９９】複合体の量は、複合体の１個以上の活性、好ましくは、酵素的および／または
リガンド結合活性の測定により決定し得る。リガンド結合を測定する場合、リガ
ンドは核酸またはタンパク質から選択され得、好ましくはタンパク質結合活性は
腫瘍遺伝子生成物である。例えばｃ−ＭｙｃまたはＳｋｐ２結合活性、ベータ−
カテニン結合活性、Ｈｂｘ結合アッセイまたはＲＮＡポリメラーゼII結合アッセ
イ。酵素活性を測定する場合、それはＡＴＰａｓｅ活性、および／またはＤＮＡ
ヘリカーゼ活性であり得る。

【０１００】複合体から損失した遊離タンパク質またはポリペプチドの量を測定する方法に
おいて、遊離タンパク質またはポリペプチドサブユニットは１個以上のＲＢＰ５
、ＲＭＰ１、ＴＩＰ４８、ＴＩＰ４９または前記の通りのＳＴＡＰ１タンパク質
またはポリペプチドであり得る。遊離タンパク質またはポリペプチドサブユニッ
ト量は、酵素的および／またはリガンド結合活性の測定により決定し得る。リガ
ンド結合アッセイの場合、リガンドは核酸またはタンパク質から選択され得、好
ましくはタンパク質結合活性は、腫瘍遺伝子生成物、例えばｃ−ＭｙｃまたはＳ
ｋｐ２結合活性、ベータ−カテニン結合活性、Ｈｂｘ結合アッセイまたはＲＮＡ
ポリメラーゼII結合であり得る。酵素活性を測定する場合、それはＡＴＰａｓｅ
活性、および／またはＤＮＡヘリカーゼ活性であり得る。

【０１０１】抗癌剤スクリーニングの全ての方法において、試験化合物と接触させる前に、
そのタンパク質サブユニット成分からの複合体の形成の更なる段階が存在し得る
。

【０１０２】本発明の他の態様は、スクリーニングの方法、好ましくは、前記の任意の方法
における、ＲＭＰ１の使用である。本発明のこの態様に関連するのは、前記の複
合体のインビトロ凝集のための１個以上のＲＭＰ１の使用である。

【０１０３】下記の実施例で証明するように、ＩＧＦおよびＴＯＲ経路はＲＭＰに収束する
ように見え、ＲＭＰを多くの可能性のある治療剤の標的とする。本発明は、本明
細書に記載の任意のスクリーニング法の実施による、アミノ酸合成により調節さ
れる状態に対して有効な薬剤、特に抗癌剤の同定を可能にする。

【０１０４】本発明はラパマイシン以外の本方法の実施により同定される全ての薬剤、およ
び医薬としての、特に、癌および他のアミノ酸生合成により調節される状態の予
防または処置のための医薬としての使用を含む。

【０１０５】したがって、更なる態様において、本発明は医薬としての、本発明のスクリー
ニング法により同定された薬剤(ラパマイシン以外)の使用を提供する。

【０１０６】本発明は更にアミノ酸調節に依存する状態の予防または処置のための医薬の製
造のための、本発明のスクリーニング法により同定された薬剤を低ｋｙうするが
、但し、薬剤は癌または免疫学的不全の処置に使用するためのラパマイシンでは
ない。

【０１０７】本発明は、個体に上記の構築物、ベクター、宿主細胞または抗体の有効量を投
与することを含む、アミノ酸調節に依存する状態を予防または処置する方法を提
供する。

【０１０８】本発明はまた個体に、上記の本発明のスクリーニング法により同定された、癌
または免疫学的不全の処置に使用するためのラパマイシン以外の調節剤の有効量
を投与することを含む、アミノ酸調節に依存する状態を予防または処置する方法
を提供する。

【０１０９】本明細書でアミノ酸調節に依存する状態に関して言及している場所でこれらの
状態はＲＭＰに依存する臨床的状態の一つのセットを例示するとみなすべきであ
る。したがって、本発明の診断法はＲＭＰに依存する任意の状態の診断に使用で
きる。同様に、本発明は、ラパマイシン以外の、ＲＭＰに依存する状態に対して
活性な薬剤のスクリーニング法、本方法により同定された薬剤、ならびにＲＭＰ
に依存する状態のためのこれらの薬剤の使用を提供する。

【０１１０】本発明によりまた提供されるのは、恐らく当業者に既知の適当な賦形剤の存在
下である、医薬組成物中の上記の薬剤である。組成物は、組成物は、下記に詳述
の任意の適当な組成物の形で、当業者の知識の範囲内の投与の適当な方法により
投与し得る。投与の好ましい経路は非経腸である。非経腸投与において、本発明
の組成物は、薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液またはエマルジョ
ンのような単位投与注射可能形に製剤される。このような賦形剤は本質的に非毒
性および非治療剤である。このような賦形剤の例は生理食塩水、リンゲル液、デ
キストロース溶液およびハンクス溶液である。不揮発性油およびオレイン酸エチ
ルのような非水性賦形剤も使用し得る。好ましい賦形剤は５％デキストロースの
生理食塩水液である。賦形剤は、緩衝剤および防腐剤を含む、等張性および化学
安定性を促進する物質のような少量の添加剤を含み得る。

【０１１１】タンパク質は異種移植片拒絶反応、ＧＶＤＨ、アレルギーおよび自己免疫疾患
の予防に治療的に有効な濃度で投与する。投与量および投与の形態は個体に依存
する。一般に、組成物は機能的タンパク質が１pg／kgから１０mg／kg、より好ま
しくは１０μg／kgおよび５mg／kg、最も好ましくは０.１mg／kgおよび２mg／kg
の間で提供されるように投与する。好ましくは１回注射投与(bolus dose)として
投与する。連続的単時間輸液(３０分間)も使用し得る。本発明の組成物は、５お
よび２０μg／kg／分、より好ましくは７および１５μg／kg／分の間で注入し得
る。

【０１１２】特異的例にしたがい、必要な組成物の“治療的有効量”は、処置を必要とする
患者後流に十分な量、または少なくとも疾患およびその合併症を部分的に抑制す
る量として決定すべきである。このような使用に有効な量は疾患の重症度および
患者の健康の一般的状態に依存する。一回または複数回投与が、患者に必要なお
よび耐容性される投与量および頻度に依存して必要であり得る。

【０１１３】本発明の好ましい実施態様を実施例の方法でここに記載し、それは簡便には図
面を参照する：図１はＳＴＡＰ１の核酸配列(配列番号２)を示す。図２はＳＴＡＰ１の誘導されるアミノ酸配列(配列番号１)を示す。図３は先に公開された配列と提携した、ＲＭＰ１の他のヌクレオチド配列(“新
”配列番号４)を示す。図４はＲＭＰ１の最初の２５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列(配列番号
５)を示す。およびＲＭＰ１をコードするヌクレオチド配列(配列番号６)。

【０１１４】実施例１ − 細胞のＳｋｐ２およびＨ−Ｒａｓ^(G12V)トランスフェクションは
、それらを形質転換する。Ｓｋｐ２はＨ−Ｒａｓ^(G12V)と協同し、軟観点におけるコロニー形成で採点し
て一次齧歯類線維芽細胞の細胞形質転換、およびヌードマウスにおける腫瘍形質
転換をもたらす。このような形質転換体は、正常線維芽細胞またはＥ１Ａ／Ｈ−
Ｒａｓ^G12V−形質転換誘導体よりも有意に低いレベルのｐ２７を発現する。

【０１１５】候補腫瘍遺伝子の機能的特性の感受性アッセイは、これらの遺伝子単独で、ま
たは組み合わせてトランスフェクトできる胚細胞培養の使用に由来する。ラット
胚線維芽細胞に挿入したとき、Ｅ１ＡまたはＲ２Ｆ１のような腫瘍遺伝子は、Ｇ
ｌｙ^１２がＶａｌに変えられた(Ｇ１２Ｖ)Ｈ−Ｒａｓの腫瘍形成バージョンのよ
うな、共挿入された、協力する腫瘍細胞の存在下でのみそれらを形質転換できる
。Ｓｋｐ２およびＨ−Ｒａｓ^G12Vをコードする哺乳類発現プラスミドを単独でま
たは組み合わせて、一次ラット胚線維芽細胞にトランスフェクトした。３週間の
Ｇ４１８における選択の後、プレートを形態学的に形質転換されたコロニーに関
して採点する。Ｈ−Ｒａｓ^G12Vの非存在下で、Ｓｋｐ２単独は形態学的に形質転
換された増殖巣の発生に失敗した。対照的に、Ｓｋｐ２遺伝子と一緒のＨ−Ｒａ
ｓ^G12Vは、実質的に増加した数の形態学的に形質転換されたコロニーを発生させ
、プレート当たり平均７０−１１０コロニーを発生させた。Ｓｋｐ２とＨ−Ｒａ
ｓ^G12Vのトランスフェクションにより製造したコロニーは、容易に確立され、培
養で急速に増殖する細胞系を発生させた。これらのＳｋｐ２／Ｈ−Ｒａｓ^G12V−
発現細胞は、半固体培地(０.３％寒天含有新鮮培地)で平板培養した。２週間後
、プレートをコロニーの存在に関して分析した。Ｓｋｐ２／Ｈ−Ｒａｓ^G12V−発
現細胞は軟寒天で容易にコロニーを形成し、それは培養細胞形質転換の強い基準
であった。加えて、１^×１０６Ｓｋｐ２／Ｈ−Ｒａｓ^G12V発現細胞を、２−３
週齢ヌードマウスの脇腹に注射した。マウスを、注射部位の腫瘍の存在に関して
採点した。それから２週間後、腫瘍形成が、Ｓｋｐ２／Ｈ−Ｒａｓ^G12V発現細胞
を注射した全ての実験動物で検出されたが、コントロールＲＥＦではなかった。
共トランスフェクション実験の結果は、Ｓｋｐ２が腫瘍遺伝子として働くことが
できることを示す。

【０１１６】実施例２ − 細胞の免疫組織化学的分析は、腫瘍細胞におけるＳｋｐ２とｐ２
７の間の有意な逆関係を示す。Ｓｋｐ２発現を、ヒト一次口腔扁平上皮癌細胞癌、乳癌、リンパ腫および前立
腺癌のシリーズで分析した。一般に、５マイクロメーターの厚さのホルマリン固
定およびパラフィン包埋組織セクションを、ｐ２７に対するモノクローナル抗体
およびＳｋｐ２に対するポリクローナル抗体を使用して免疫組織化学的にｐ２７
およびＳｋｐ２タンパク質に関して染色した。

【０１１７】ｐ２７に対するモノクローナル抗体はTransduction Laboratories1から入手可
能である。Ｓｋｐ２に対するポリクローナル抗体は、適当に精製したＳｋｐ２町
生物で動物を免疫化することにより、平均的当業者により容易に生成される。ポ
リクローナル抗体は、ポリクローナル抗体は、更に、Lisztwag J et al (1998)
EMBO J 17:368-363に記載のように親和性精製できる。

【０１１８】結果は、ｐ２７およびＳｋｐ２の発現が、試験した全ての癌に反比例すること
を示す。これは、Ｓｋｐ２が最も腫瘍遺伝子として機能しそうであることを確認
する。

【０１１９】これらの結果は、ヒト癌の進行におけるＳＣＦユビキチンタンパク質リガーゼ
複合体の基質認識サブユニットが関係しているとみなす。

【０１２０】実施例３ − Ｓｋｐ２関連タンパク質(ＳＴＡＰ１)をコードするｃＤＮＡの単
離およびクローニング。酵母２ハイブリッドスクリーニングを、ベイトとしてＳｋｐ２を使用して行な
った。これから、約１８ｋＤａのタンパク質をコードするｃＤＮＡがクローン化
され、それはここで我々はＳＴＡＰ１(Ｓｋｐ２関連タンパク質１)と呼ぶ。ＳＴ
ＡＰ１タンパク質は現在まで未知である。

【０１２１】約１×１０^６クローンをｐＧＡＤ−ＧＨ(Clontech)において構築されたＨｅＬ
ａ細胞ライブラリーからスクリーニングし、それはＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイ
ンベクターはＳ２−１にクローン化されたヒトＳｋｐ２の残基１０１−４２３を
コードするベイトである。相互作用クローンは、トリプルドロップアウト媒体(
Ｌｅｕ／Ｔｒｐ／Ｈｉｓがなく２５ｍＭ３−アミノ−トリアゾールを伴う)で
の選択後に同定され、強いガラクトシダーゼ活性に関してアッセイした。３５陽
性クローンを配列決定した。配列比較は、全てのクローン化ｃＤＮＡは、約１８
ｋＤの分子量を有する、新規タンパク質ＳＴＡＰ１をコードすることを明らかに
した。

【０１２２】実施例４ − 組換えＳＴＡＰ１の製造。ヒトＳＴＡＰ１完全長バージョンを、Eshcerichia coli BL21において、グル
タチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)融合タンパク質として発現させ、グ
ルタチオン−セファロースで精製し、グルタチオンで溶出した。方法は、Kaelin
et al (1991) Cell. 64:521-532およびまたKrek et al (1994) Cell. 78:161-1
72に記載されている。

【０１２３】実施例５ − ＳＴＡＰ１に対して反応性の抗体の製造。上記実施例４からの溶出ＳＴＡＰ１物質をマウスに注射し、モノクローナル抗
体を生成した。慣用のモノクローナル抗体製造プロトコールは当業者に既知のよ
うに行なった。ポＳＴＡＰ１に対するリクローナル抗血清および抗体もまた当業
者に良く知られた標準形のプロトコールにしたがった、上記実施例４のＳＴＡＰ
１溶出物質のウサギへの注射により生成した。

【０１２４】実施例６ − ＨｅＬａ細胞からのＳＴＡＰ１含有複合体の免疫沈降および電気
泳動的分離。大規模免疫沈降を、ＨｅＬａ全細胞抽出物で行なった。１００μgのプロテイ
ンＡに結合したモノクローナル抗−ＳＴＡＰ１抗体を、５０mlのＨｅＬａ核抽出
物(約２から１０^９)に添加し、２時間、４℃で回転させた。免疫沈降物を次いで
２５mlのＴＮＮ[２０ｍＭトリス−ＨＣｌ(ｐＨ８.０)、０.１ＭＮａＣｌ、
１ｍＭＥＤＴＡ、０.５％ＮＰ−４０]で４回洗浄した。沈殿タンパク質を３
００μlの０.２Ｍグリシン(ｐＨ２.５)でLaemmli緩衝液に輸出し、１０％ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲルで分離した。ゲルを次いで銀で染色した。

【０１２５】実施例７ − 質量分析によるＳＴＡＰ１関連タンパク質の分析。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離タンパク質を、Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O. a
nd Mann, M. (1996) Anal. Chem., 68:850-858に記載のように、実施例６のゲル
から切除し、ＤＴＴで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化し、トリプシン
で開裂した。切除したトリプティックペプチドを５％ギ酸、５％メタノールのＨ_２Ｏ溶液で、１μl Poros P20カラムで脱塩し、１μlに５％ギ酸、５０％メタ
ノールのＨ_２Ｏ溶液と共に、直接ナノエレクトロスプレーイオン化(NanoESI)針
中に濃縮する。NanoESI質量分析(ＭＳ)は、Wilm, M. and Mann, M. (1996) Anal
. Chem., 68:1-8の公開されている方法にしたがって行なった。マススペクトル
は、NanoESI源(Protana, Odense, Denmark)を備えたAPI 300マススペクトロメー
ター(PE Sciex, Toronto, Ontario, Canada)に獲得した。またW. R. Pearson &
D. J. Lipman (1998) PNAS, 85:2444-2448参照。

【０１２６】ＳＴＡＰ１含有複合体は、多数の、約２０程度のタンパク質を含むことが判明
している。ＳＴＡＰ１のみならず、複合体はまたＴＩＰ４８、ＴＩＰ４９(二つ
の進化的に保存されたＡＴＰａｓｅおよびＤＮＡヘリカーゼ)、ＲＰＢ５(ＲＮＡ
pol IIサブユニット５)、ＲＭＰ１(ＲＮＡ pol IIメディエータータンパク質
)および少なくとも３個の他の現在未知のタンパク質を含むことが判明している
。

【０１２７】実施例８ − スクロース密度勾配遠心およびウェスタン・ブロティングによる
ＳＴＡＰ含有複合体の分析。粗ＨｅＬａ細胞抽出物を５−３０％および１０−３０％(ｗ／ｖ)密度遠心に付
した。サンプルを、１０ｍＭトリス(ｐＨ７.５)、２５０ｍＭＮａＣｌ、０.５
％ＮＰ４０、１ＭＭＤＴＴ、バナジウム酸ナトリウム、ＰＭＳＦおよびアプロ
チニンから成るＴＮＮ緩衝液に充填した。緩衝液はまたスクリース勾配でも使用
したが、ＮＰ４０は除いた。

【０１２８】フラクションの各々をサンプル緩衝液と混合し、標準Laemlli変性ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで１２％で付した。多数のゲルを流し、ついで各々を抗体とブロットした
。ＲＭＰ１およびＴＩＰ４９に対するポリクローナルを、ＲＰＢ５、ＴＩＰ４８
、ＳＴＡＰ１およびＳｋｐ２に対するモノクローナルのように使用した。ブロッ
トしたゲルのレーンをその各々のシュークロースフラクションで配置し、明らか
になるのは、ＳＴＡＰ１含有複合体の成分が明らかに互いに会合し、勾配におけ
るタンパク質の主ピークの部分ではないことである。複合体の成分は、全て、高
分子量タンパク質沈殿物の早い溶出フラクションに全て見られる。Ｓｋｐ２はＳ
ＴＡＰ１含有複合体と比較して勾配において異なるパターンを有し、タンパク質
の主ピークの直前にピークである。

【０１２９】また最初に記載されたのは、どのようにＴＩＰ４９抗体がＳＤＳ−ＰＡＧＥ上
でのダブレットを認識するかである。わずかに高い分子量の免疫学的に関連した
ＴＩＰ４９変異体がある。

【０１３０】実施例９ − ＳＴＡＰ１関連ＤＮＡヘリカーゼ複合体の阻害剤である、抗癌剤
のスクリーニング。ＳＴＡＰ１含有ＴＩＰ４９、ＴＩＰ４８、ＲＰＢ５、ＲＭＰ１、ＳＴＡＰ１お
よびＳｋｐ２の成分の間の特異的相互作用を破壊する小分子化合物が、例えば、
抗癌剤と推定される。複合体の成分タンパク質は、組換えバキュロウイルスを使
用してＳｆ９昆虫細胞に発現する。複合体のサブユニットの間のペアを成す相互
作用の全ての可能な組合せを構築し、合成および天然化合物のスクリーニングに
使用する。実際には、昆虫細胞の共感染、続く適当な抗体での免疫沈降は、スク
リーニングアッセイに使用する複合体基質を提供する。上記の成分の二つの間の
共免疫沈降は、直接相互作用を示し、したがって、推定される抗癌剤による相互
作用の破壊の標的である。例えば、ＳＴＡＰ１およびＳｋｐ２は、このシステム
で共発現されたときに共免疫沈降し、何らかの方法でその結合を破壊する号し得
または天然化合物のスクリーニングアッセイの基盤として適当な結合対を提供す
る。小分子化合物をスクリーニングするために、組換えヘキサヒスチジン−標識
ＳＴＡＰ１を昆虫細胞から精製し、ニッケル被覆９６ウェルプレートの表面に固
定する。固定化ＳＴＡＰ１を精製ビオチニル化Ｓｋｐ２とインキュベートし、洗
浄する。続いて、ユーロピウム標識ストレプトアビジンを添加する。ついで、ユ
ーロピウムの時間分解蛍光を合成化学ライブラリーおよび天然生成物の非存在下
または存在下で追跡する。

【０１３１】実施例１０ − ＴＩＰ４８および／またはＴＩＰ４９ＡＴＰａｓｅ活性の阻
害剤である抗癌剤のスクリーニング。組換えＴＩＰ４８およびＴＩＰ４９を、Makino Y et al (1999) J Biol. Chem
. 274:15329-15335に記載の実験法を使用して、E. coliに発現させる。組換えＴ
ＩＰ４８およびＴＩＰ４９の精製、ならびにＡＴＰａｓｅ活性およびＤＮＡヘリ
カーゼ活性のアッセイは、またMakino Y et al (1999)に記載されている。精製
組換えタンパク質を使用して、ＴＩＰ４８および／またはＴＩＰ４９の正常酵素
活性を干渉する天然生成物または合成化合物をスクリーニングする。

【０１３２】スクリーニングアッセイは、簡便にはマイクロタイタープレートで行なう。Ｔ
ＩＰ４８および／またはＴＩＰ４９タンパク質をウェルに入れ、一方または両方
の酵素アッセイを天然または合成化学ライブラリー由来の化合物の存在下または
非存在下で行なう。有利には、ＡＴＰａｓｅマイクロアッセイ形式を、Henkel R
D et al (1988) Anal. Biochem. 169:312-318に記載のように使用できる。

【０１３３】実施例１１ − ヒトＲＭＰ１におけるラパマイシン感受性シグナル伝達ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳで増殖させる。指
数的に増殖するＨＥＬ２９３細胞を一晩血清から離し、ついで２０nＭラパマイ
シンの存在下または非存在下で５０ｎＭインシュリンで誘導する。タンパク質抽
出物をインシュリン誘導後０時間、１時間、２時間、４時間および８時間後に回
収した細胞から調製した。細胞抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に
付し、得られたゲルをウサギポリクローナル抗ヒトＲＭＰ抗体を使用した免疫ブ
ロットにより分析した。ＲＭＰに特異的な抗体は、標準実験室法を使用して容易
に調製できる。標識したウサギ抗体に特異的な二次抗体を使用して慣用法を使用
して免疫ブロット上にＲＭＰを可視化した。

【０１３４】ＲＭＰからの遅い移動が１時間誘導後にインシュリンにより誘導され、それは
実験の８時間にわたり維持され、速く移動する形の損失／消失およびゆっくり移
動する形の徐々の損失を伴った。２０ｎＭラパマイシン存在下で、この遅く移動
する形の形成は完全に遮断され、速く移動する形が実験中維持された。

【０１３５】これらの発見は、インシュリンシグナル伝達経路およびＴＰＲ／Ｓ６キナーゼ
経路の新規基質としてのＲＭＰ１を示唆する。ＲＭＰシグナル伝達のラパマイシ
ン感受性は、ＴＯＲまたはＳ６キナーゼがＲＭＰ１の新規インシュリン誘導形の
形成をコントロールする良好なキナーゼ候補物であることを示唆する。インシュ
リンおよびアミノ酸の存在下で(この実施例の培養培地中)、ＲＭＰは遅く移動す
る形として存在し、リン酸形を示す。これらの条件下で、細胞はアミノ酸を合成
し続ける。ラパマイシンの添加により、ＲＭＰは速く移動する形として存在し、
アミノ酸の合成を遮断する。

【０１３６】本明細書および２０００年５月１２日出願の優先権主張出願ＧＢ００１１４３
９.７に記載の全ての引用文献は、個々に言及したのと同程度に出典明示により
本明細書に包含させる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＳＴＡＰ１の核酸配列(配列番号２)を示す。

【図２】ＳＴＡＰ１の誘導されるアミノ酸配列(配列番号１)を示す。

【図３】先に公開された配列と提携した、ＲＭＰ１の他のヌクレオチド配
列(“新”配列番号４)を示す。

【図４】ＲＭＰ１の最初の２５アミノ酸をコードするヌクレオチド配列(
配列番号５)を示す。およびＲＭＰ１をコードするヌクレオチド配列(配列番号６
)。

【手続補正書】

【提出日】平成１４年１２月６日（２００２．１２．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ４Ｃ０８６ 45/00 ４Ｃ０８７ 45/00 48/00 ４Ｈ０４５ 48/00 Ａ６１Ｐ 1/16 Ａ６１Ｐ 1/16 3/10 3/10 7/00 7/00 9/00 9/00 11/00 11/00 13/12 13/12 17/02 17/02 21/00 21/00 25/00 25/00 31/04 31/04 31/18 31/18 35/00 35/00 37/00 37/00 43/00 １１１ 43/00 １１１Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/574 Ａ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/574 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＣ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (71)出願人ＮｏｖａｒｔｉｓＦｏｒｓｃｈｕｎｇｓｓｔｉｆｔｕｎｇＺｗｅｉｇｎｉｅｄｅｒｌａｓｓｕｎｇＦｒｉｅｄｒｉｃｈＭｉｅｓｃｈｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ (72)発明者マティアス・ゲオルク・クリスティアン・グスタイガースイス、ツェーハー−4054バーゼル、ビルジッヒシュトラーセ127番 (72)発明者ヴィルヘルム・クレックスイス、ツェーハー−4125リーヘン、エルレンシュトレスヒェン73番Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA36 DA78 FB03 FB07 FB08 4B024 AA01 AA12 BA80 CA04 DA02 DA11 DA12 EA04 GA11 HA15 4B065 AA57X AA72X AA90X AA90Y AB01 BA02 CA23 CA24 CA44 CA46 4C084 AA13 AA17 NA14 ZA012 ZA362 ZA512 ZA592 ZA752 ZA812 ZA892 ZA942 ZB072 ZB262 ZB352 ZC202 ZC352 ZC552 4C085 AA13 AA14 BB11 CC21 EE01 4C086 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA36 ZA59 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZB07 ZB26 ZB35 ZC35 ZC55 4C087 BB21 BB65 BC83 NA14 ZA01 ZA36 ZA59 ZA75 ZA81 ZA89 ZA94 ZB07 ZB26 ZB35 ZC35 ZC55 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA40 DA75 DA76 EA28 EA51 FA72 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１の少なくとも５連続アミノ酸を含むタンパク質ま
たはペプチド。
【請求項２】配列番号１の少なくとも１０連続アミノ酸を含む、請求項１
に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項３】配列番号１の少なくとも１５連続アミノ酸を含む、請求項１
に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項４】配列番号１の少なくとも２０連続アミノ酸を含む、請求項１
に記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項５】配列番号２に明示の配列を含む、請求項１に記載のタンパク
質またはペプチド。
【請求項６】タンパク質またはペプチドがリン酸化されている、請求項１
から５のいずれかに記載のタンパク質またはペプチド。
【請求項７】請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質またはペプチ
ドを認識する抗体。
【請求項８】請求項６のホスホペプチドまたはリン酸化タンパク質を特異
的に認識する抗体。
【請求項９】癌の予防または処置のための医薬の製造のための、請求項８
に記載の抗体の使用。
【請求項１０】医薬として使用する、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質またはペプ
チドをコードするための核酸またはその相補鎖。
【請求項１２】該核酸が配列番号３に明示の配列の少なくともフラグメン
トを含む、請求項１１に記載の核酸またはその相補鎖。
【請求項１３】該核酸が配列番号４に明示である請求項１１に記載の核酸
またはその相補鎖。
【請求項１４】配列番号４に記載の核酸の一部に対してアンチセンスな、
または配列番号４と少なくとも７０％相同性を有し、低ストリンジェンシー条件
下でハイブリダイズできる配列に対してアンチセンスな核酸。
【請求項１５】核酸がアンチセンスである配列が、配列番号４に少なくと
も８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、よ
り更に好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％相同性を
有する、請求項１２に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１６】ヌクレオチド残基の少なくともいくつかがヌクレアーゼ分
解に耐性であり、例えば、ホスホロチオエートおよび／またはメチルホスホネー
トから選択される、請求項１２または１３に記載のアンチセンス核酸。
【請求項１７】医薬として使用する、請求項１２から１４のいずれかに記
載のアンチセンス核酸。
【請求項１８】癌の予防または処置のための医薬の製造のための、請求項
１２から１４のいずれかに記載のアンチセンス核酸。
【請求項１９】請求項１１から１３または１４から１５のいずれかに記載
の核酸を含む、核酸構築物。
【請求項２０】請求項１９に記載の構築物を含む、宿主細胞。
【請求項２１】真核細胞、好ましくは昆虫細胞または哺乳類細胞である、
請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】医薬として使用する、請求項１９に記載の構築物。
【請求項２３】医薬として使用する、請求項２０に記載の宿主。
【請求項２４】癌の予防または処置のための医薬の製造のための、請求項
１９に記載の構築物の使用。
【請求項２５】癌の予防または処置のための医薬の製造のための、請求項
２０に記載の宿主の使用。
【請求項２６】ＲＭＰまたはそのフラグメントと、ＲＰＢ５以外の少なく
とも一つのタンパク質を含む、複合体。
【請求項２７】更にＳｋｐ２、ＳＴＡＰ１、ＴＩＰ４８、ＴＩＰ４９、プ
レフォルディンまたはＲＰＢ５を含む、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２８】 (ａ)個体からサンプルを回収する； (ｂ)サンプルのＲＭＰまたはＲＭＰ活性を測定する；そして (ｃ)サンプル中のＲＭＰまたはＲＭＰ活性の存在と、アミノ酸調節に依存する状
態を相関させる段階を含む、アミノ酸と油説に依存性の状態の診断法。
【請求項２９】段階(ｂ)における該分析が細胞抽出物の調製を含む、請求
項２８に記載の方法。
【請求項３０】該分析段階が該ＲＭＰを、ＲＭＰに特異的な抗体を含む反
応混合物中でインキュベートすることを含む、請求項２８または２９に記載の方
法。
【請求項３１】該状態が腎臓、心臓、肝臓または肺疾患から選択される、
請求項２８から３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】該状態が癌である、請求項２８から３０のいずれかに記載
の方法。
【請求項３３】該癌が白血病、前立腺、膀胱、胃、大腸、肺、肝臓および
神経芽細胞腫からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】該状態がＡＩＤＳである、請求項２８から３０のいずれか
に記載の方法。
【請求項３５】該状態がダイエット状態である、請求項２８から３０のい
ずれかに記載の方法。
【請求項３６】該状態がラパマイシン処置に感受性である、請求項２８か
ら３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】更に該ＲＭＰのリン酸化状態を測定し、リン酸化ＲＭＰの
存在と該状態を相関させる、請求項２８から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】リン酸化ＲＭＰの存在をホスホスペシフィック抗体を使用
して測定する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】更に該サンプル中のＲＭＰのレベルを測定し、ＲＭＰのレ
ベルを標準レベルと比較する；そして該標準レベルに対して減少したＲＭＰのレ
ベルをアミノ酸調節に依存する状態と相関させることを含む、請求項２８から３
６のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】該標準レベルが該状態に罹患していない第二の個体から得
たサンプルにおけるＲＭＰのレベルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】該状態が癌であり、該標準レベルが該個体から得た非癌性
組織におけるＲＭＰレベルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】該像体が癌であり、該標準レベルが癌性増殖に隣接した組
織から除去したサンプルにおけるＲＭＰレベルである、請求項３９に記載の方法
。
【請求項４３】該サンプルが細胞性サンプルであり、該方法が更に細胞に
おける該ＲＭＰの局在化の測定および該ＲＭＰの細胞質への局在化と該状態の相
関を含む、請求項２８から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】ＲＭＰ活性を測定し、ＲＭＰ活性の存在と該状態を層間さ
せることを含む、請求項２８から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】該ＲＭＰ活性がアミノ酸生合成をもたらす少なくとも一つ
の遺伝子の発現の誘導、または抑制の上昇である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】該サンプルがＲＮＡである、請求項４４または４５に記載
の方法。
【請求項４７】該サンプルが体液、例えば胸膜液、血液、血清、血漿、尿
である、請求項２８から４２または４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】該分析段階が更に該サンプルにおけるコントロールタンパ
ク質の検出を含む、請求項２８から４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】該コントロールタンパク質がアルカリホスファターゼであ
る、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】該方法が更に該ＲＭＰに関して得た第１の値を該コントロ
ールタンパク質で得た第２シグナルで標準化することを含む、請求項４８または
４９に記載の方法。
【請求項５１】請求項２８から５０のいずれかに記載の方法により状態を
診断する；そしてラパマイシンでの処置に関して該状態の診断をした個体を選択することを含む、アミノ酸調節に依存した状態の処置のために個体を選択する方法。
【請求項５２】該状態が癌である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】 (ａ)ＲＭＰを認識する抗体； (ｂ)サンプルを回収する手段；および (ｃ)指示書を含む、ラパマイシン感受性癌の検出用キット。
【請求項５４】該キットが更に細胞融解緩衝液およびアッセイ緩衝液を含
む、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】該抗体がホスホスペシフィック抗体である、請求項５３ま
たは５４に記載のキット。
【請求項５６】該キットが更に二次抗体を含む、請求項５３から５５のい
ずれかに記載のキット。
【請求項５７】該二次抗体を放射標識、蛍光標識、燐光性標識、クロモゲ
ン、酵素、酵素基質、ビオチン、アビジンまたはジゴキシゲニンで標識する、請
求項５６に記載のキット。
【請求項５８】該キットが更に該ＲＭＰ特異的抗体を検出する手段を含む
、請求項５３から５７のいずれかに記載のキット。
【請求項５９】 (ａ)ＲＭＰを含む細胞抽出物を、ＲＭＰ分解の調節剤の可
能性のあるものを含む反応混合物中でインキュベートする、 (ｂ)該ＲＭＰまたはリン酸化ＲＭＰの量、所望によりまたコントロールタンパク
質の量を測定する；そして (ｃ)ＲＭＰ分解の調節剤の存在と反応混合物におけるＲＭＰまたはＲＭＰリン酸
化のレベルの変化を、該候補調節剤が反応混合物に存在しない場合に関連して相
関させる：段階を含む、ＲＭＰ分解の調節剤のスクリーニング法。
【請求項６０】該調節剤がＲＭＰ抑制剤であり、該変化が非リン酸化ＲＭ
Ｐレベルの維持である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】該調節剤がＲＭＰ活性剤であり、該変化がＲＭＰリン酸化
の上昇である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】該調節剤がＲＭＰ活性剤であり、該変化がＲＭＰレベルの
減少である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】該検出段階が該ＲＭＰと抗体をインキュベートすることを
含む、請求項５９から６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】該抗体がホスホスペシフィック抗体である、請求項６３に
記載の方法。
【請求項６５】該ＲＭＰが固定化されている、請求項５９から６４のいず
れかに記載の方法。
【請求項６６】該ＲＭＰまたは抗体が蛍光標識、蛍光クエンチャー、放射
活性標識、シンチラントまたは酵素で標識されている、請求項６３から６５のい
ずれかに記載の方法。
【請求項６７】更に該反応混合物におけるコントロールタンパク質を含む
、請求項５９から６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】試験化合物のＲＭＰへの結合の測定を含み、所望によりコ
ントロール化合物のＲＭＰへの結合の測定を含む、抗癌化合物の同定法。
【請求項６９】試験化合物の存在下でのＲＭＰのＲＢＰ５への結合の測定
を含み、所望によりまた試験化合物の非存在下での該結合の測定を含む、抗癌化
合物の測定法。
【請求項７０】ＲＭＰが配列番号４に明示のものである、請求項６９に記
載の方法。
【請求項７１】少なくとも一つのタンパク質を標識しおよび／または固体
表面に結合する、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】請求項２６または２７複合体の一定量と試験化合物を接触
させ、ついで：(ａ)そのまま残る複合体の量、(ｂ)損失したそのままの複合体の
量、または(ｃ)複合体から放出された遊離タンパク質またはポリペプチドサブユ
ニットの量を測定することを含む、抗癌剤を同定する方法。
【請求項７３】更に試験化合物と接触させる前にそのタンパク質サブユニ
ット成分から複合体を形成する段階を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】請求項５９から７３のいずれかに記載の方法により同定さ
れら、ラパマイシン以外の抗癌剤またはＲＭＰ分解の調節剤、好ましくは抗増殖
剤。
【請求項７５】癌の予防または処置のための医薬の製造のための、永久抗
５９から７３のいずれかに記載の方法により同定した、ラパマイシン以外の薬剤
の使用。
【請求項７６】請求項５９から７３のいずれかにキサの方法により同定し
たラパマイシン以外の化合物の有効量を個体に投与することを含む、癌の予防ま
たは処置法。
【請求項７７】医薬としての請求項７４に記載の調節剤の使用。
【請求項７８】請求項７４に記載の調節剤の有効量を個体に投与すること
を含む、アミノ酸調節に依存する状態のを阻害する方法。
【請求項７９】該状態が癌、血管形成、糖尿病、細胞加齢、神経変性疾患
、免疫学的疾患、筋肉低下、ストレス(トラウマ、熱傷、敗血症、熱)、慢性疾患
(慢性腎臓、心臓、肝臓および肺疾患)およびＡＩＤＳからなる群から選択される
、請求項７８に記載の方法。