AT500564B1 - Verfahren zur tumordiagnose - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors sowie ein Set zum Nachweis von Proteinen.

Tumor-Marker sind Substanzen, die beispielsweise in Blut, Harn oder Körpergeweben von 5 Patienten mit Tumoren in Mengen, die höher als normale sind, detektierbar sind. Ein Tumor-Marker kann vom Tumor selbst oder vom Körper als Reaktion auf das Vorhandensein eines Tumors erzeugt werden. Tumor-Marker sind beispielsweise Proteine, Antigene oder Hormone. Die Ärzte können Veränderungen der Tumor-Marker-Mengen verwenden, um den Verlauf der Krankheit zu verfolgen, die Wirkung der Behandlung zu messen und auf ein Wiederauftreten zu io prüfen.

Bestimmte Tumor-Marker sind in ihrer Empfindlichkeit hinsichtlich der Detektion eines Tumors genauer als andere. Je empfindlicher sie sind, desto früher ist eine Diagnose möglich. Die Normalmengen sind von Mensch zu Mensch und von Labor zu Labor verschieden. 15

In Park et al. (Mol.Cell.Biol., März 2002, 22 (5): 1307-16) wird die Rolle des Transkriptionsfaktors c-Myc in der Zellproliferation und in der Tumorneogenese beschrieben. Es wurde festgestellt, dass es verschiedene, für die Aktivität des c-Myc entscheidende Co-Faktoren gibt, zu denen u.a. TIP49 zählt. 20

Auch in Wood et al. (Mol.Cell. Februar 2000, 5 (2): 321-30) und Feng et al. (Cancer Res. Dezember 2003, 63 (24) : 8726-34) wurde die Funktion von TIP49 vor allem bei Tumoren näher untersucht, wobei bestätigt wurde, dass TIP49 eine bedeutende Rolle für die c-Myc-Aktivität spielt. 25

In der WO 2001/85980 wird ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die gegen Krebserkrankungen wirksam sind, durch die Messung der Bindungsaktivität von Liganden zu Mitgliedern der TIP49-Proteinfamilie offenbart. Wird diese Bindungsaktivität durch die Anwesenheit einer bestimmten Substanz reduziert, eignet sich diese zur Behandlung von Tumorerkrankun-30 gen.

In Makino et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1998, Bd. 245, (3), S. 819-823) wird der Nachweis von Antikörpern, gerichtet gegen TIP49 im Serum von Patienten, die an einer Autoimmunerkrankung wie z.B. Polymyositis und Autoimmun-Hepatitis leiden, geoffenbart. Ferner 35 wird die Verwendung eines derartigen Antikörpers als Marker für bestimmte Bindegewebserkrankungen beschrieben.

Maxwell et al. (Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 21.11.2000, 97 (24) : 13009-14) und Herzfeld et al. (Cancer, 1. November 1980, 46 (9): 2047-54) beschreiben eine erhöhte Aktivität von Pyrrolin-5-40 carboxylat-Reduktase in Blasenkrebszellen bzw. in Darmkrebszellen von erwachsenen Individuen.

In Lee et al. (J.Am.Acad.Dermatol., Sept. 2003, 49 (3): 487-91) wird die erhöhte Expression von Peroxiredoxin II in bösartigen vaskulären Tumoren beschrieben, wobei darauf hingewiesen 45 wird, dass dieses Enzym nicht in allen bösartigen Tumoren exprimiert wird, sodass Peroxiredoxin II sich gemäß Lee et al. ausschließlich zur Verwendung bei der Diagnose von vaskulären Tumoren eignet.

In der WO 2000/70340 wird eine allgemeine Methode zur Bestimmung von Markerproteinen mit so Hilfe eines Expressionsprofils beschrieben.

Schmid et al. (Electrophoresis, October 1995, 16 (10): 1961-8) und Schramm et al. (Klin. Padi-atr., November-Dezember 2003, 215 (6): 293-7) beschreiben die Verwendung von zweidimensionaler Gelelektrophorese, gegebenenfalls in Kombination mit einem MALDI-TOF-55 Massenspektrometer zur Aufnahme eines Proteinprofils von Tumorzellen. Die aus diesen Ver- 3 AT 500 564 B1 suchen gewonnenen Proteinprofile, die das gesamte Proteom der untersuchten Tumorzellen aufzeigen, können dazu verwendet werden, Expressionsunterschiede und somit Markerproteine zu identifizieren. 5 Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Tumor-Marker zur Diagnostizierung eines embryonalen Tumors vorzusehen, welcher empfindlich und spezifisch ist, mit dem Stadium korreliert und welcher leicht messbar ist. Weiters sollte der Tumor-Marker gut reproduzierbare Ergebnisse bringen. io Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird mit einem Verfahren zur Diagnostizierung eines embryonalen Tumors, insbesondere eines primitiven neuroektodermalen Tumors, erreicht, welches die Schritte umfasst: - Vorsehen einer zerebralen Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe, 15 - Bestimmen der Konzentration mindestens zweier Proteine in der Probe, wobei die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94 und Q8NBS9, - Vergleichen der Konzentration des Proteins in der Probe mit einem entsprechenden Standardwert, und 20 - Diagnostizieren eines Tumors, wenn die Konzentration über dem entsprechenden Standard wert liegt. Diese Proteine erwiesen sich als hoch spezifische und selektive Tumor-Marker. Sie sind als vorausgesagte hypothetische Proteine bekannt, die in keiner Zelllinie exprimiert werden: 25 Tabelle 1: Hypothetische Proteine 30 35 40 45 Q96c36 CHR1-AAH20553 ähnlich der Pyrrolin-5-carboxylat-reduktase-lsoform 5 3.57E-05 P42694 SW:y054_HUMAN potentielle Helicase mit Zink-Finger-Domäne 4 pMism: 7,63 060376 CHR9-O60376 P1.11659_4 6 3.60E-06 Q9h370 HUMANGP:CHR19- Q9H370 Pro1512 5 pMism: 8,92 CAD13067* HUMANGP:CHR3-CAD13067 unbenanntes Protein-Produkt 8 pMism: 13,06 Q9BS94 TR_HUM:Q9BS94 ähnlich der 3-Hydroxyisobutyryl-Coenzym A-Hydrolase 5 pMism: 8,11 Q8NBS9 TR_HUM:Q9BVH9 Thioredoxin-Domäne, enthaltend Protein 5 [Vorläufer] Thioredoxin-artiges Protein p46 Endoplasmatisches Retikulum-Protein ERp46 5 pMism: 8,53 so Es genügt, die Konzentration von nur einem dieser Proteine zu bestimmen, da jedes der Proteine selbst ein Tumor-Marker ist. Es ist jedoch auch möglich, zwei oder mehrere der Proteine zu bestimmen. Die Konzentration der Proteine wird mit jeder auf dem Gebiet bekannten Methode bestimmt, z.B. immunologisch, histochemisch, mittels Massen-Spektrometer oder anderen. 55 Der Ausdruck „entsprechender Standardwert“ bezieht sich auf einen Wert, der einer gesunden 4 AT 500 564 B1

Person entspricht, z.B. einer Person, die keinen Tumor hat. Der Standardwert kann beispielsweise bestimmt werden, indem parallel zur zerebralen Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe eine Probe vorgesehen wird, die keinen Tumor aufweist, z.B. eine Probe, die von einer gesunden Person genommen wurde. Der Standardwert kann jedoch auch ein bestimmter theoretischer 5 Wert sein, der in jedem Fall zutrifft. Ein Tumor wird diagnostiziert, wenn die Konzentration der zerebralen Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe über dem entsprechenden Standardwert liegt, was bedeutet, dass die Protein-Konzentration in dieser zerebralen Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe über 1%, vorzugsweise über 5%, noch mehr bevorzugt über 10% des entsprechenden Standardwertes sein sollte. 10

Vorzugsweise ist dieser Standard 0. Da es sich zeigte, dass diese Proteine in Proben von gesunden Individuen nicht exprimiert werden, zeigt jede Konzentration eines der oben erwähnten Proteine über 0 das Vorhandensein eines Tumors an. 15 Vorzugsweise wird die Konzentration der Proteine 060376, Q9h370 und CAD13067 bestimmt. Wenn alle drei Proteine im Vergleich zu ihren entsprechenden Standardwerten oder früheren Werten eine höhere Konzentration aufweisen, ist dies eine verlässliche und spezifische Indikation für die Diagnostizierung eines Tumors. Protein 060376 enthält eine Prohibitin-Domäne, die eine Rolle zur Inhibierung der DNA-Synthese andeutet [Lamerdin et al., 1998, direkte Hinterle-20 gung bei EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken], Das Protein Q9BS94 enthält eine NIF-1-Domäne, die ein minimales Protein-Phosphatase-Motiv repräsentiert. Dieses Protein könnte eine Rolle für die Signal-Transduktion in Bezug auf Phosphorylierung/Dephosphorylierungs-Reaktionen spielen [Zhang et al., 1999, direkte Hinterlegung bei EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken]. Das Protein CAD13067 [Gstaiger et al., 2001; direkte Hinterlegung bei 25 EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken] präsentiert keine bekannte Domäne oder Motiv und es kann keine putative Funktion vorhergesagt werden. Homologienachforschungen zeigten keine signifikanten Treffer.

Noch mehr bevorzugt wird die Konzentration des Proteins mittels Massen-Spektrometrie, Anti-30 körpern, Gel-Elektrophorese oder einer Kombination davon bestimmt. Dies sind konventionelle Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind, und der Fachmann auf dem Gebiet kann verschiedene Parameter variieren, um die optimale Detektionsmethode zu entwerfen. Eine Kombination solcher Methoden ist beispielsweise die Trennung von Proteinen mittels Gel-Elektrophorese, z.B. zwei-dimensionale Gel-Elektrophorese, wonach die getrennten Spots 35 mittels Massen-Spektrometrie, z.B. MALDI-MS, identifiziert werden. Dies ermöglicht die Identifizierung der obigen Proteine.

Supratentoriale zerebrale primitive neuroektodermale Tumoren (PNETs) sind seltene embryonale Tumoren, die am üblichsten in der frühen Kindheit auftreten und für etwa 5% zerebraler 40 Hemispheren-Tumoren und 3% aller Gehirn-Tumoren bei Kindern verantwortlich sind. Der Ausdruck „PNET“ wurde geprägt, um einen zerebralen Hemisphären-Tumor zu beschreiben der aus primitiven Neuroepithel-Zellen besteht, die die Fähigkeit zur Differenzierung bei Neuronen-, Astrozyten-, Ependym- oder Mesenchym-Linien aufweisen. Auf Grund ihres vermuteten gemeinsamen Ursprungs aus pluripotenten Neuroepithel-Zellen und ähnlichen lichtmikroskopi-45 sehen Merkmalen wurde später vorgeschlagen, dass zerebrale PNETs die supratentorialen Gegenstücke von Medullo-blastom wären und daher mit ähnlichen Tumoren an anderen Stellen, wie Pinealoblastom und Retinoblastom, zu einer Gruppe zusammengefasst werden sollten. Als gegenteilige Meinung wurde weiters vorgeschlagen, dass diese Tumoren eindeutige Gebilde sind, die aus Progenitor-Zellen hervorgehen. Trotz ihrer offensichtlichen morphologischen so Ähnlichkeiten und ihrer gemeinsamen Neigung, sich innerhalb des Zentralnervensystems über subarachnoide Bahnen zu verbreiten, unterscheiden sich diese Tumoren signifikant hinsichtlich ihrer Prognose mit einem annähernd 30% fünfjährigen Progressions-freien Überleben der supratentorialen PNET gegenüber 60-80% für Medulloblastom. 55 Es wurden zusätzliche Beweise geliefert, dass zerebraler PNET ein Tumor-Gebilde ist, das sich 5 AT 500 564 B1 vom Medulloblastom unterscheidet, indem DNA-Microarray-Gen-Expressions-Profilierung verwendet wurde.

Bisher ist jedoch sehr wenig über die Protein-Profile dieser Tumoren bekannt und es existieren 5 nur wenige Zelllinien. Die gut untersuchte permanente Zelllinie PFSK-1 stammt von einem primitiven neuroektodermalen Tumor des rechten Stirnlappens eines 22 Monate alten Knaben und wurde im Jahr 1992 von Fults und Mitarbeitern etabliert (Fults et al. Establishment and characterisation of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemi-sphere. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 51:272-280, 1992). PFSK-1 zeigt reichliche Nestin-io Immunreaktivität, ein intermediäres Filament-Protein, das auch von neuroektodermalen Stammzellen exprimiert wird. Es wurde keine Immunreaktivität nachgewiesen mit Antikörpern gegen Neurofilamente, Galactocerebrosid oder saures Gliafaserprotein, was darauf hinweist, dass keiner der Hauptzelltypen des reifen Nervensystems, Neuronen und Astrozyten vorhanden waren. Insbesondere können diese Tumoren mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens diagnosti-15 ziert werden, da die oben erwähnten Proteine spezifische und empfindliche Marker für embryonale Tumoren, insbesondere primitive neuroektodermale Tumoren (PNETs), z.B. supratentoria-ler zerebraler PNET, sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Set zur Detektion von mindestens zwei 20 Proteinen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94 und Q8NBS9, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es mindestens zwei Antikörper umfasst, die für die mindestens zwei Proteine spezifisch sind. Ein Antikörper ist für eines der obigen Proteine spezifisch, und der zweite Antikörper ist für ein anderes dieser Proteine spezifisch. Vorzugsweise umfasst das Set drei Antikörper, wovon jeder für eines der Protei-25 ne 060376, Q9h370 und CAD13067, spezifisch ist. Dies ermöglicht die Durchführung des obigen Verfahrens für die empfindliche und spezifische Diagnose eines Tumors, insbesondere eines embryonalen Tumors, z.B. PNET. Das Set kann natürlich weitere Reagenzien, z.B. Puffer, Standards mit einer bekannten Konzentration eines oder mehrerer der oben erwähnten Proteine und andere umfassen. 30

Vorzugsweise sind die Antikörper markiert, bevorzugt mit einem radioaktiven oder fluoreszierenden Marker. Dies ermöglicht die unmittelbare Detektion der oben erwähnten Proteine.

Noch mehr bevorzugt sind die Antikörper auf einem festen Träger, vorzugsweise einem Chip, 35 immobilisiert. Der feste Träger kann weiters eine Säule, eine Vertiefung eines Microarrays, eine Membran, ein Filter usw. sein. Mit diesem Set ist es möglich, das Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors durchzuführen, wobei die Probe auf dem festen Träger vorgesehen wird, wonach die oben erwähnten Proteine an die Antikörper binden und am festen Träger immobilisiert werden, auf welchem die Proteine detektiert werden können, beispielsweise in einem 40 Sandwich-Test.

Die vorliegende Erfindung ist mit Hilfe der folgenden Beispiele und der Figur, auf welche die Erfindung jedoch nicht eingeschränkt ist, näher beschrieben, wobei die Figur ein Gel von getrennten PFSK-1-Proteinen zeigt. 45

BEISPIELE

Beispiel 1: Zweidimensionale Elektrophorese so Proteine der supratentorialen PNET-Zelllinie PFSK-1 wurden mittels zweidimensionaler Elektrophorese (2-TE) getrennt, und die Protein-Spots wurden nach Färbung mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht. PFSK-1 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC 2060, Menassas, VA, USA) 55 gekauft. PFSK-1 wurde in Minimum Essential Medium (Eagle) mit 2 mM L-Glutamin und Earle's 6 AT 500 564 B1 BSS, das so eingestellt war, dass es 1,5 g/l Natriumbicarbonat, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 1,0 mM Natriumpyruvat enthält, mit 10% fötalem Rinderserum kultiviert. Die Zellkultur wurde in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% V/V C02 in Luft bei 37°C gehalten. 5

Die PFSK-1-Zellen wurden dreimal mit 10 ml PBS (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) gewaschen und 10 min bei 300 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 0,5 ml Proben-Puffer, bestehend aus 40 mM Tris, 5 M Harnstoff (Merck, Darmstadt, Deutschland), 2 M Thioharnstoff (Sigma, St. Louis, MO, USA), 4% CHAPS io (3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propan-sulfonat) (Sigma), 10 mM 1,4-Dithioerythrit (Merck), 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (Merck) und Protease-Hemmer komplett (Roche, Basel, Schweiz) suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 1 h lang stehen lassen und bei 14.000xg 60 min lang zentrifugiert. Die Entsalzung erfolgte mit einer Ultrafree-4 Zentrifugen-Filtereinheit (Millipore). Der Proteingehalt im Überstand wurde mit der 15 Coomassie-Blau-Methode bestimmt.

Proben von 1 mg Protein wurden auf immobilisierten nichtlinearen Gradienten-Streifen mit pH 3-10 in Probentassen an ihren basischen und sauren Enden aufgetragen. Das Fokussieren begann bei 200 V, und die Spannung wurde allmählich auf 8000 V mit 4 V/min erhöht und 20 weitere 3 h lang konstant gehalten (etwa 150000 Vh insgesamt). Die zweit-dimensionale Trennung wurde auf 9-16% Gradienten-Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gelen durchgeführt. Die Gele (180x200x1,5 mm) wurden bei 40 mA pro Gel laufen lassen. Nach 12stündiger Protein-Fixierung in 50% Methanol, das 10% Phosphorsäure enthielt, wurden die Gele mit kolloidalem Coomassie-Blau (Novex, San Diego, CA, USA) 12 h lang gefärbt. Die Molekülmassen wurden 25 bestimmt, indem man Standard-Protein-Marker (Biorad, Hercules, CA, USA) laufen ließ, die den Bereich 10-250 kDa abdeckten. Die pl-Werte wurden verwendet, wie von der Lieferfirma der immobilisierten pH-Gradienten-Streifen angegeben. Überschüssige Farbe wurde aus den Gelen mit destilliertem Wasser ausgewaschen, und die Gele wurden mit einem ImageScanner (Amersham Pharmacia Biosciences, Uppsala, Schweden) gescannt. Die elektronischen Abbil-30 düngen der Gele wurden aufgezeichnet, wobei Photoshop- (Adobe) und PowerPoint- (Micro-soft)-Software verwendet wurde. Die Figur zeigt ein repräsentatives Gel von PFSK-1-Proteinen, wobei 1 mg des gesamten Proteins aufgebracht wurde.

Beispiel 2: MALDI-MS 35

Spots wurden mit einem „Spot-Picker“ herausgeschnitten und in Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen gegeben. Jeder Spot wurde mit 100 μΙ von 30% Acetonitril in 50 mM Ammoniumbicar-bonat entfärbt und in einem Speedvac-Verdampfer getrocknet. Jedes getrocknete Gel-Stück wurde mit 4 μΙ von 3 mM Tris-HCI, pH 9,0, das 50 ng Trypsin (Promega, Madison, Wl, USA) 40 enthielt, wieder hydratisiert. Nach 16 h bei Raumtemperatur wurden 7 μΙ destilliertes Wasser zu jedem Gel-Stück zugegeben, und die Proben wurden 10 min lang geschüttelt. 4 μΙ von 50% Acetonitril, das 0,3% Trifluoressigsäure enthielt, und die Standard-Peptide, Des-Arg-Bradykinin (Sigma, 904,4681 Da) und adrenokortikotropes Hormon-Fragment 18-39 (Sigma, 2465,1989 Da), wurden zu jedem Gel-Stück zugegeben und 10 min lang geschüttelt. Das Aufträgen der 45 Probe erfolgte unter Verwendung von SymBiot I-Proben-Prozessor (PE Biosystems, Framing-ham, MA, USA). 1,5 μΙ der Peptidmischung wurden gleichzeitig auf 1 μΙ Matrix, bestehend aus einer gesättigten Lösung von a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (Sigma) in 50% Acetonitril, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, aufgetragen. Die Proben wurden in einem Flugzeitmassenspektrometer (Reflex 3, Bruker Analytics, Bremen, Deutschland) analysiert. Eine Beschleu-50 nigungsspannung von 20 kV wurde verwendet. Die Peptid-Übereinstimmung und die Protein-Suche wurden automatisch durchgeführt. Die Peptidmassen wurden mit den theoretischen Peptidmassen von Menschen verglichen, und, wenn dies keinen Erfolg brachte, von allen verfügbaren Proteinen aller Spezies. Monoisotopische Massen wurden verwendet, und eine Massentoleranz von 0,0025% wurde zugelassen. Die identifizierten Proteine sind in Tabelle 1 auf-55 gezählt und beschrieben und in der Figur gezeigt: 10 15 20 25 30 35 40 45 50 7

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Eine umfassende Karte der supratentorialen PNET-Zelllinie PFSK-1, die aus 157 Proteinen aus mehreren Klassen besteht, wurde erstellt. Die hypothetischen Proteine, die in PFSK-1 expri-miert sind, wurden noch nie zuvor in irgendeiner gesunden Zelle eines Individuums oder Tumor-Zelllinie beschrieben. Die Karte ähnelt sehr nicht-Neuronen- und nicht-Glia-Zelllinien und tat-5 sächlich waren keine spezifischen Neuronen- oder Glia-Strukturen einschließlich Neurofilamente, synaptosomale Proteine, saures Gliafaserprotein oder CNPase nachweisbar, Proteine, die man in Neuronen- oder Glia-Zelllinien mit proteomischen Methoden ständig fand. Die Karte ähnelt auch nicht jenen der kürzlich berichteten Medulloblastom-Zelllinien. Ein erster Hinweis, der auf den Mesenchym-Ursprung von PSFK-1 hinweisen könnte, kommt aus der Expression io von Vimentin, einem intermediären Filament der Klasse III und dem Haupt-Phosphoprotein, das man bei Mesenchymzellen und Tumoren findet. FUSE-binding-Protein 1, ein Helicase- und Sequenz-spezifisches Einzelstrang-Bindungs-Protein, aktiviert das weit stromaufwärts befindliche Element von c-myc und könnte daher eine Verbindung zu diesem Protoonkogen vorsehen. Und tatsächlich spielt Myc eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese einer Reihe von Tumo-15 ren. Die unreife Beschaffenheit der Tumor-zelllinie PFSK-1 wird infolge der Expression der potentiellen Helicase P42694, einem Mitglied der DNA2/NAM7-Helicase-Familie, die in embryonalen Geweben hoch exprimiert ist, vorgeschlagen. Das Vorhandensein des Neuroendokrin-Proteins VGF in PSFK-1, das stark an den Entwicklungsprozessen beteiligt ist, könnte die Unreife der Zelllinie unterstreichen, doch darf der Ausdruck „Neuroendokrin“ nicht zur Interpre-20 tation führen, dass PFSK-1 einer Neuronen-Zelllinie zugeordnet werden könnte; VGF wird in einer Reihe humaner Gewebe exprimiert, obwohl die Expression nicht in jeder bisher untersuchten Zelllinie, einschließlich Amnion, Fibroblast, Nieren-Epithel, Bronchien-Epithel oder Lymphozyten, unter Verwendung einer vergleichbaren Methodik bewiesen werden konnte. 25 Bei den oben angegebenen Zelltypen, Mesothel-Zellen und HCN2-Neuronen, konnte SYT-interagierendes Protein SIP nicht detektiert werden [Antonson et al., 1998, direkte Hinterlegung bei den EMBL/GenBank/DDBJ Datenbanken], jedoch bei Medulloblastom-Zelllinien, und hier bei PFSK-1, war es ein reichlich vorkommendes Protein und könnte daher als Tumormarker-Anwärter betrachtet werden. 30

Stoffwechsel-Enzyme ähnlich der Pyrrolin-5-carboxylat-Reductase-lsoform, ähnlich der 3-Hydroxyisobutyryl-CoA-Hydrolase und Thioredoxin-Domänen-enthaltendem Protein 5 wurden bisher nur aus Nukleinsäure-Sequenzen von malignen Tumoren vorhergesagt und könnten Isoformen darstellen, die vorwiegend oder spezifisch bei Malignität exprimiert werden. 35

Das vorausgesagte Protein P1.11659 (060376) enthält eine Prohibitin-Domäne, was auf eine Rolle bei der Inhibierung der DNA-Synthese hinweist [Lamerdin et al., 1998, direkte Hinterlegung bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken], und dieses Protein sowie die beiden nachfolgenden sind Tumor-spezifische/Tumorverwandte Gebilde. Das vorausgesagte Protein 40 Pro1512 (Q9h370) enthält eine NIF-1-Domäne, die ein minimales Protein-Phosphatase-Motiv representiert. Dieses Protein könnte eine Rolle bei der Signal-Transduktion hinsichtlich Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungs-Reaktionen spielen und stellt einen weiteren Tumor-Marker dar, da es niemals bei Zellen eines gesunden Individuums berichtet wurde [Zhang et al., 1999, direkte Hinterlegung bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken]. 45

Das vorausgesagte Protein unbenanntes Protein-Produkt CAD13067 [Gstaiger et al., 2001; direkte Vorlage bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken] präsentiert keine bekannte Domäne oder Motiv, und es kann keine putative Funktion vorausgesagt werden. Homologie-Nachforschungen haben keine signifikanten Treffer gezeigt. 50

Die Proteine wurde methodisch eindeutig identifiziert durch eine Protein-Chemikalie anstatt mit einem immunochemischen Verfahren, die Daten sind daher verlässlicher und unabhängig von der Antikörper-Spezifität und -Verfügbarkeit. Das Verfahren hat jedoch Einschränkungen wie z.B. sind sehr hohes und sehr niedriges Molekulargewicht und hydrophobe Proteine kaum 55 nachweisbar, und die hier gezeigte Karte besteht aus hydrophilen Strukturen.

Claims (7)

19 AT 500 564 B1 Patentansprüche: 1. Verfahren zur Diagnostizierung eines embryonalen Tumors, insbesondere eines primitiven neuroektodermalen Tumors, welches die Schritte umfasst:

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Standardwert 0 ist. 15

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Proteine 060376, Q9h370 und CAD13067 bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzent- 20 ration des Proteins mittels Massenspektrometrie, Antikörpern, Gel-Elektrophorese oder einer Kombination davon bestimmt wird.

5. Set zur Detektion von mindestens zwei Proteinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94 und Q8NBS9, dadurch ge- 25 kennzeichnet, dass es mindestens zwei Antikörper umfasst, die für die mindestens zwei Proteine spezifisch sind.

5 - Vorsehen einer zerebralen Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe, - Bestimmen der Konzentration mindestens zweier Proteine in der Probe, wobei die Protein ausgewählt sind aus einer Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94 und Q8NBS9, - Vergleichen der Konzentration des Proteins in der Probe mit einem entsprechenden Stan- io dardwert, und - Diagnostizieren eines Tumors, wenn die Konzentration über dem entsprechenden Standardwert liegt.

6. Set nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper markiert sind, vorzugsweise mit einem radioaktiven oder fluoreszierenden Marker. 30

7. Set nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper auf einem festen Träger, vorzugsweise auf einem Chip, immobilisiert sind. 35 Hiezu 1 Blatt Zeichnungen 40 45 50 55