AT500564A1 - Verfahren zur tumordiagnose - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors sowie ein Set zum Nachweis von Proteinen.

Tumor-Marker sind Substanzen, die beispielsweise in Blut, Harn oder Körpergeweben von Patienten mit Tumoren in Mengen, die höher als normale sind, detektierbar sind. Ein Tumor-Marker kann vom Tumor selbst oder vom Körper als Reaktion auf das Vorhandensein eines Tumors erzeugt werden. Tumor-Marker sind beispielsweise Proteine, Antigene oder Hormone. Die Arzte können Veränderungen der Tumor-Marker-Mengen verwenden, um den Verlauf der Krankheit zu verfolgen, die Wirkung der Behandlung zu messen und auf ein Wiederauftreten zu prüfen.

Bestimmte Tumor-Marker sind in ihrer Empfindlichkeit hinsichtlich der Detektion eines Tumors genauer als andere. Je empfindlicher sie sind, desto früher ist eine Diagnose möglich. Die Normalmengen sind von Mensch zu Mensch und von Labor zu Labor verschieden.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Tumor-Marker vorzusehen, welcher empfindlich und spezifisch ist, mit dem Stadium und der Reaktion auf eine Behandlung korreliert und welcher leicht messbar ist. Weiters sollte der Tumor-Marker gut reproduzierbare Ergebnisse bringen.

Das Ziel der vorliegenden Erfindung wird mit einem Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors erreicht, welches die Schritte umfasst: - Vorsehen einer Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe, - Bestimmen der Konzentration mindestens eines Proteins in der Probe, wobei das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94, Q8NBS9, - Vergleichen der Konzentration des Proteins in der Probe mit einem entsprechenden Standard, und - Diagnostizieren eines Tumors, wenn die Konzentration über dem entsprechenden Standard liegt. Diese Proteine erwiesen sich als hoch spezifische und selektive Tumor-Marker. Sie sind als vorausgesagte hypothetische Proteine bekannt, die in keiner normalen Zelllinie exprimiert werden:

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Tabelle 1: Hypothetische Proteine Q96c36 CHR1-AAH20553 ähnlich der Pyrrolin-5-carboxylat-reduktase-Isoform 5 3,57E-05 P42694 SW:y054_HUMAN potentielle Helicase mit Zink-Finger-Domäne 4 pMism:7,63 060376 CHR9-O60376 P1.11659_4 6 3,60E-06 Q9h370 HUMANGP:CHR19-Q9H370 Prol512 5 pMism:8,92 CAD13067a HUMANGP:CHR3-CAD13067 unbenanntes Protein-Produkt 8 pMism:13,06 Q9BS94 TR_HUM:Q9BS94 ähnlich der 3-Hydroxyisobu-tyryl-Coenzym A-Hydrolase 5 pMism:8,11 Q8NBS9 TR_HUM:Q9BVH9 Thioredoxin-Domäne, enthaltend Protein 5 [Vorläufer] Thioredoxin-artiges Protein p46 Endoplasmatisches Retikulum-Protein ERp46 5 pMism:8,53

Es genügt, die Konzentration von nur einem dieser Proteine zu bestimmen, da jedes der Proteine selbst ein Tumor-Marker ist. Es ist jedoch auch möglich, zwei oder mehrere der Proteine zu bestimmen. Die Konzentration der Proteine wird mit jeder auf dem Gebiet bekannten Methode bestimmt, z.B. immunologisch, histoche-misch, mittels Massen-Spektrometer oder anderen.

Der Ausdruck „entsprechender Standard" bezieht sich auf einen Wert, der einer gesunden Person entspricht, z.B. einer Person, die keinen Tumor hat. Der Standard kann beispielsweise bestimmt werden, indem parallel zur Gewebe- oder Flüssigkeitsprobe eine Probe vorgesehen wird, die keinen Tumor aufweist, z.B. eine Probe, die von einer gesunden Person genommen wurde. Der Standard kann jedoch auch ein bestimmter theoretischer Wert sein, der in jedem Fall zutrifft. Ein Tumor wird diagnostiziert, wenn die Konzentration der Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe über dem entsprechenden Standard liegt, was bedeutet, dass die Protein-Konzentration in dieser Gewebe- oder NACHGEREiC. .f • « · · « # · ···· · ♦ · ♦ · * · t · ·· · ......- *3 -*

Flüssigkeits-Probe über 1%, vorzugsweise über 5%, noch mehr bevorzugt über 10% des entsprechenden Standards sein sollte.

Vorzugsweise ist dieser Standard 0. Da es sich zeigte, dass diese Proteine in gesunden Proben nicht exprimiert sind, zeigt jede Konzentration eines der oben erwähnten Proteine über 0 das Vorhandensein eines Tumors an.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung einer Progression eines Tumors, welches die Schritte umfasst: - Vorsehen einer Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe A, - Bestimmen der Konzentration mindestens eines Proteins in der Probe, wobei das Protein ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94, Q8NBS9, - Vergleichen der Konzentration des Proteins in der Probe A mit der Konzentration des Proteins in einer Probe B, die in einem früheren Stadium genommen wurde, wobei die Progression des Tumors diagnostiziert wird, wenn die Konzentration in Probe Ά über der Konzentration in Probe B liegt. Dies bedeutet, dass wenn die Konzentration des Proteins in der Probe A über der Konzentration des Proteins in der Probe B liegt, z.B. der Konzentration, die in einem früheren Stadium gemessen wurde, der Tumor sich im Stadium der Progression befindet, d.h., im Stadium des Wachstums. Im anderen Fall, z.B. wenn die Konzentration in Probe A gleich ist oder niedriger ist als die Konzentration in Probe B, dann ist der Tumor gleichbleibend oder im Stadium der Abnahme. Eine solche Information ist insbesondere wertvoll, wenn die Entwicklung und das Stadium der Krankheit sowie die Wirkung einer spezifischen Therapie für einen Patienten bestimmt wird.

Vorzugsweise wird die Konzentration der Proteine 060376, Q9h370, CAD13067 bestimmt. Wenn alle drei Proteine im Vergleich zu ihren entsprechenden Standards oder früheren Werten eine höhere Konzentration aufweisen, ist dies eine verlässliche und spezifische Indikation für die Diagnostizierung eines Tumors. Protein 060376 enthält eine Prohibitin-Domäne, die eine Rolle zur Inhibierung der DNA-Synthese andeutet [Lamerdin et al., 1998, direkte Hinterlegung bei EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken].

Das Protein Q9BS94 enthält eine NIF-1-Domäne, die ein minimales Protein-Phosphatase-Motiv repräsentiert. Dieses Protein könnte | NACHGEREICHT | • ·· ♦ · ·· · · · · • t I · ·· · · • · · · t #· ♦ · · · · • · * ♦ · * · · ·· · .....- 4*-*’ eine Rolle für die Signal-Transduktion in Bezug auf Phosphory-lierung/Dephosphorylierungs-Reaktionen spielen [Zhang et al., 1999, direkte Hinterlegung bei EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken].

Das Protein CAD13067 [Gstaiger et al., 2001; direkte Hinterlegung bei EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken] präsentiert keine bekannte Domäne oder Motiv und es kann keine putative Funktion vorhergesagt werden. Homologienachforschungen zeigten keine signifikanten Treffer.

Noch mehr bevorzugt wird die Konzentration des Proteins mittels Massen-Spektrometrie, Antikörpern, Gel-Elektrophorese oder einer Kombination davon bestimmt. Dies sind konventionelle Techniken, die dem Fachmann auf dem Gebiet wohl bekannt sind, und der Fachmann auf dem Gebiet kann verschiedene Parameter variieren, um die optimale Detektionsmethode zu entwerfen. Eine Kombination solcher Methoden ist beispielsweise die Trennung von Proteinen mittels Gel-Elektrophorese, z.B. zwei-dimensionale Gel-Elektrophorese, wonach die getrennten Spots mittels Massen-Spektrometrie, z.B. MALDI-MS, identifiziert werden. Dies ermöglicht die Identifizierung der obigen Proteine.

Vorteilhaft wird die Konzentration des Proteins auf mRNA-Ebene festgestellt. Die mRNA-Moleküle können beispielsweise mit Hilfe von komplementären Polynukleinsäuren, z.B. RNA-Sequenzen, detektiert werden, wobei das doppelsträngige Produkt detektiert wird, oder mit Hilfe von Primern, die die bestimmte RNA-Sequenz spezifisch amplifizieren, wonach die Amplifikationsprodukte detektiert werden. Da mRNA-Moleküle für Proteine, die exprimiert werden, vorhanden sind, kann die Detektion der mRNA-Moleküle als Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins und der Konzentration der oben erwähnten Proteine verwendet werden.

Noch mehr bevorzugt ist der Tumor ein embryonaler Tumor, vorzugsweise ein primitiver neuroektodermer Tumor.

Supratentoriale zerebrale primitive neuroektodermale Tumoren (PNETs) sind seltene embryonale Tumoren, die am üblichsten in der frühen Kindheit auftreten und für etwa 5% zerebraler He-mispheren-Tumoren und 3% aller Gehirn-Tumoren bei Kindern verantwortlich sind. Der Ausdruck „PNET" wurde geprägt, um einen zerebralen Hemisphären-Tumor zu beschreiben, der aus primitiven Neuroepithel-Zellen besteht, die die Fähigkeit zur Differenzierung bei Neuronen-, Astrozyten-, Ependym- oder Mesenchym-Linien aufweisen. Auf Grund ihres vermuteten gemeinsamen ür- | NACHGEREICHT | • · · « I ·· · 9 ♦ · • ·· · * ♦ ··· · · • * · · · #· · * · * · • · ( · · ·· · ·· · ......- *5 - * ** sprungs aus pluripotenten Neuroepithel-Zellen und ähnlichen lichtmikroskopischen Merkmalen wurde später vorgeschlagen, dass zerebrale PNETs die supratentorialen Gegenstücke von Medulloblastom wären und daher mit ähnlichen Tumoren an anderen Stellen, wie Pinealoblastom und Retinoblastom, zu einer Gruppe zusammengefasst werden sollten. Als gegenteilige Meinung wurde weiters vorgeschlagen, dass diese Tumoren eindeutige Gebilde sind, die aus Progenitor-Zellen hervorgehen. Trotz ihrer offensichtlichen morphologischen Ähnlichkeiten und ihrer gemeinsamen Neigung, sich innerhalb des Zentralnervensystems über subarachnoide Bahnen zu verbreiten, unterscheiden sich diese Tumoren signifikant hinsichtlich ihrer Prognose mit einem annähernd 30% fünfjährigen Progressions-freien Überleben der supratentorialen PNET gegenüber 60-80% für Medulloblastom.

Es wurden zusätzliche Beweise geliefert, dass zerebraler PNET ein Tumor-Gebilde ist, das sich vom Medulloblastom unterscheidet, indem DNA-Microarray-Gen-Expressions-Profilierung verwendet wurde.

Bisher ist jedoch sehr wenig über die Protein-Profile dieser Tumoren bekannt und es existieren nur wenige Zelllinien. Die gut untersuchte permanente Zelllinie PFSK-1 stammt von einem primitiven neuroektodermalen Tumor des rechten Stirnlappens eines 22 Monate alten Knaben und wurde im Jahr 1992 von Fults und Mitarbeitern etabliert (Fults et al. Establishment and characteri-sation of a human primitive neuroectodermal tumor cell line from the cerebral hemisphere. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 51:272-280, 1992). PFSK-1 zeigt reichliche Nestin-Immunreaktivität, ein intermediäres Filament-Protein, das auch von neuroektodermalen Stammzellen exprimiert wird. Es wurde keine Immunreaktivität nachgewiesen mit Antikörpern gegen Neurofilamente, Galactocere-brosid oder saures Gliafaserprotein, was darauf hinweist, dass keiner der Hauptzelltypen des reifen Nervensystems, Neuronen und Astrozyten vorhanden waren. Insbesondere können diese Tumoren mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens diagnostiziert werden, da die oben erwähnten Proteine spezifische und empfindliche Marker für embryonale Tumoren, insbesondere primitive neuroektodermale Tumoren (PNETs), z.B. supratentorialer zerebraler PNET, sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Set zur Detektion von mindestens zwei Proteinen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067,

NACHGEREICHT 9 9 9 4· * · ·· · 4 4 4 9 9 44 · · · 9 9 9 4 9 9 4 9 4 4 9 9 9 4 4 4 4 9 9 4 4 9 9 4 9 ......- 6 Q9BS94, Q8NBS9, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es mindestens zwei Antikörper aufweist, die für die mindestens zwei Proteine spezifisch sind. Ein Antikörper ist für eines der obigen Proteine spezifisch, und der zweite Antikörper ist für ein anderes dieser Proteine spezifisch. Vorzugsweise umfasst das Set drei Antikörper, wovon jeder für eines der Proteine 060376, Q9h370, CAD13067, spezifisch ist. Dies ermöglicht die Durchführung des obigen Verfahrens für die empfindliche und spezifische Diagnose eines Tumors, insbesondere eines embryonalen Tumors, z.B. PNET. Das Set kann natürlich weitere Reagenzien, z.B. Puffer, Standards mit einer bekannten Konzentration eines oder mehrerer der oben erwähnten Proteine und andere umfassen.

Vorzugsweise sind die Antikörper markiert, bevorzugt mit einem radioaktiven oder fluoreszierenden Marker. Dies ermöglicht die unmittelbare Detektion der oben erwähnten Proteine.

Noch mehr bevorzugt sind die Antikörper auf einem festen Träger, vorzugsweise einem Chip, immobilisiert. Der feste Träger kann weiters eine Säule, eine Vertiefung eines Microarrays, eine Membran, ein Filter usw. sein. Mit diesem Set ist es möglich, das Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors durchzuführen, wobei die Probe auf dem festen Träger vorgesehen wird, wonach die oben erwähnten Proteine an die Antikörper binden und am festen Träger immobilisiert werden, auf welchem die Proteine detek-tiert werden können, beispielsweise in einem Sandwich-Test.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform ist ein Set zur Detektion von mindestens zwei Proteinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94, Q8NBS9 vorgesehen, wobei das Set Mittel zur Detektion der mRNA dieser Proteine aufweist. Hier gelten dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen, wie oben erwähnt, wobei das Set vorzugsweise Mittel zur Detektion der mRNA der drei Proteine 060376, Q9h370 und CAD13067 aufweist.

Vorzugsweise umfassen diese Mittel Polynukleinsäuren, die zu den mRNAs komplementär sind, oder Primer, die spezifisch an die mRNAs binden. Diese ermöglichen eine genaue und reproduzierbare Detektion von mRNA-Molekülen und daher spezifischen Proteinen, wie bereits oben erwähnt.

Die vorliegende Erfindung ist mit Hilfe der folgenden Beispiele und der Figur, auf welche die Erfindung jedoch nicht eingeschränkt ist, näher beschrieben, wobei die Figur ein Gel von

NACHGEREICHT • · · · · ·· · · ······ ·· · • t · · * ·· · • · * ·· ·· · - 7 - getrennten PFSK-l-Proteinen zeigt.

BEISPIELE

Beispiel 1: Zweidimensionale Elektrophorese

Proteine der supratentorialen PNET-Zelllinie PFSK-1 wurden mittels zweidimensionaler Elektrophorese (2-TE) getrennt, und die Protein-Spots wurden nach Färbung mit Coomassie-Blau sichtbar gemacht. PFSK-1 wurde von der American Type Culture Collection (ATCC 2060, Menassas, VA, USA) gekauft. PFSK-1 wurde in Minimum Essential Medium (Eagle) mit 2 mM L-Glutamin und Earle's BSS, das so eingestellt war, dass es 1,5 g/1 Natriumbicarbonat, 0,1 mM nicht-essentielle Aminosäuren und 1,0 mM Natriumpyruvat enthält, mit 10% fötalem Rinderserum kultiviert. Die Zellkultur wurde in einer angefeuchteten Atmosphäre von 5% V/V CO2 in Luft bei 37°C gehalten.

Die PFSK-l-Zellen wurden dreimal mit 10 ml PBS (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) gewaschen und 10 min bei 300 x g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 0,5 ml Proben-Puffer, bestehend aus 40 mM Tris, 5 M Harnstoff (Merck, Darmstadt, Deutschland), 2 M Thio-harnstoff (Sigma, St. Louis, MO, USA), 4% CHAPS (3-[(3-Cholami-dopropyl)-dimethylammonio]-1-propan-sulfonat) (Sigma), 10 mM 1,4-Dithioerythrit (Merck), 1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) (Merck) und Protease-Hemmer komplett (Roche, Basel,

Schweiz) suspendiert. Die Suspension wurde bei Raumtemperatur 1 h lang stehen lassen und bei 14.000xg 60 min lang zentrifugiert. Die Entsalzung erfolgte mit einer Ultrafree-4 Zentri-fugen-Filtereinheit (Millipore). Der Proteingehalt im Überstand wurde mit der Coomassie-Blau-Methode bestimmt.

Proben von 1 mg Protein wurden auf immobilisierten nichtlinearen Gradienten-Streifen mit pH 3-10 in Probentassen an ihren basischen und sauren Enden aufgetragen. Das Fokussieren begann bei 200 V, und die Spannung wurde allmählich auf 8000 V mit 4 V/min erhöht und weitere 3 h lang konstant gehalten (etwa 150000 Vh insgesamt). Die zweit-dimensionale Trennung wurde auf 9-16% Gradienten-Natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-Gelen durchgeführt. Die Gele (180x200x1,5 mm) wurden bei 40 mA pro Gel laufen lassen. Nach 12stündiger Protein-Fixierung in 50% Methanol,

I NACHGEREICHT • · • · • · • # ·· · ♦ · # • ·♦ ·« · · « • · I l · · · · ♦ · « · · ·· · ··_ 3 _·· das 10% Phosphorsäure enthielt, wurden die Gele mit kolloidalem Coomassie-Blau (Novex, San Diego, CA, USA) 12 h lang gefärbt.

Die Molekülmassen wurden bestimmt, indem man Standard-Protein-Marker (Biorad, Hercules, CA, USA) laufen ließ, die den Bereich 10-250 kDa abdeckten. Die pl-Werte wurden verwendet, wie von der Lieferfirma der immobilisierten pH-Gradienten-Streifen angegeben. Überschüssige Farbe wurde aus den Gelen mit destilliertem Wasser ausgewaschen, und die Gele wurden mit einem ImageScanner (Amersham Pharmacia Biosciences, Uppsala, Schweden) gescannt.

Die elektronischen Abbildungen der Gele wurden aufgezeichnet, wobei Photoshop- (Adobe) und PowerPoint- (Microsoft)-Software verwendet wurde. Die Figur zeigt ein repräsentatives Gel von PFSK-l-Proteinen, wobei 1 mg des gesamten Proteins aufgebracht wurde.

Beispiel 2: MALDI-MS

Spots wurden mit einem „Spot-Picker" herausgeschnitten und in Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen gegeben. Jeder Spot wurde mit 100 μΐ von 30% Acetonitril in 50 mM Ammoniumbicarbonat entfärbt und in einem Speedvac-Verdampfer getrocknet. Jedes getrocknete Gel-Stück wurde mit 4 μΐ von 3 mM Tris-HCl, pH 9,0, das 50 ng Trypsin (Promega, Madison, WI, USA) enthielt, wieder hydratisiert. Nach 16 h bei Raumtemperatur wurden 7 μΐ destilliertes Wasser zu jedem Gel-Stück zugegeben, und die Proben wurden 10 min lang geschüttelt. 4 μΐ von 50% Acetonitril, das 0,3% Trifluoressigsäure enthielt, und die Standard-Peptide, Des-Arg-Bradykinin (Sigma, 904,4681 Da) und adrenokortikotropes Hormon-Fragment 18-39 (Sigma, 2465,1989 Da), wurden zu jedem Gel-Stück zugegeben und 10 min lang geschüttelt. Das Aufträgen der Probe erfolgte unter Verwendung von SymBiot I-Proben-Prozessor (PE Biosystems, Framingham, MA, USA). 1,5 μΐ der Peptidmischung wurden gleichzeitig auf 1 μΐ Matrix, bestehend aus einer gesättigten Lösung von cc-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (Sigma) in 50% Acetonitril, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure, aufgetragen. Die Proben wurden in einem Flugzeitmassenspektrometer (Reflex 3, Bruker Analytics, Bremen, Deutschland) analysiert. Eine Beschleunigungsspannung von 20 kV wurde verwendet. Die Peptid-Übereinstimmung und die Protein-Suche wurden automatisch durchgeführt. Die Peptidmassen wurden mit den theoretischen Peptidmassen von Menschen verglichen, und, wenn dies keinen Erfolg brachte, von allen verfügbaren Proteinen aller Spezies. Monoiso-

NACHGEREICHT *· *« Μ Μ Μ ···· • · ♦ * · ·· · · « * ···»·· ···· « • ·· ·· · · · ·♦· « • · · · · · I « | « · .....*9* topische Massen wurden verwendet, und eine Massentoleranz von 0,0025% wurde zugelassen. Die identifizierten Proteine sind in Tabelle 1 aufgezählt und beschrieben und in der Figur gezeigt:

NACHGEREICHT ·····« M · « * Tabelle 1. Liste identifizierter Proteine in der supratentorialen PNET-Zelllinie PFSK-

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Transkription und. Translation

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P301Q1 SW:ER60_HUMAN Protein-Disulfid-Isomerase a3-Vorläufer (ec 5.3.4.1) (Disulfid- 11 4.10E-18 5 7/5

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Eine umfassende Karte der supratentorialen PNET-Zelllinie PFSK-1, die aus 157 Proteinen aus mehreren Klassen besteht, wurde erstellt. Die hypothetischen Proteine, die in PFSK-1 exprimiert sind, wurden noch nie zuvor in irgendeiner normalen oder '"Tumor-Zelllinie beschrieben. Die Karte ähnelt sehr normalen nicht-Neuronen- und nicht-Glia-Zelllinien und tatsächlich waren keine spezifischen Neuronen- oder Glia-Strukturen einschließlich Neurofilamente, synaptosomale Proteine, saures Gliafaserprotein oder CNPase nachweisbar, Proteine, die man in Neuronen- oder Glia-Zelllinien mit proteomischen Methoden ständig fand. Die Karte ähnelt auch nicht jenen der kürzlich berichteten Medulloblastom-Zelllinien. Ein erster Hinweis, der auf den Mesenchym-Ursprung von PSFK-1 hinweisen könnte, kommt aus der Expression von Vimentin, einem intermediären Filament der Klasse III und dem Haupt-Phosphoprotein, das man bei Mesenchymzellen und Tumoren findet. FUSE-binding-Protein 1, ein Helicase- und Sequenz-spezifisches Einzelstrang-Bindungs-Protein, aktiviert das weit stromaufwärts befindliche Element von c-myc und könnte daher eine Verbindung zu diesem Protoonkogen vorsehen. Und tatsächlich spielt Myc eine wesentliche Rolle bei der Pathogenese einer Reihe von Tumoren. Die unreife Beschaffenheit der Tumorzelllinie PFSK-1 wird infolge der Expression der potentiellen Helicase P42694, einem Mitglied der DNA2/NAM7-Helicase-Fa-milie, die in embryonalen Geweben hoch exprimiert ist, vorgeschlagen. Das Vorhandensein des Neuroendokrin-Proteins VGF in PSFK-1, das stark an den Entwicklungsprozessen beteiligt ist, könnte die Unreife der Zelllinie unterstreichen, doch darf der Ausdruck „Neuroendokrin" nicht zur Interpretation führen, dass PFSK-1 einer Neuronen-Zelllinie zugeordnet werden könnte; VGF wird in einer Reihe humaner Gewebe exprimiert, obwohl die Expression nicht in jeder bisher untersuchten Zelllinie, einschließlich Amnion, Fibroblast, Nieren-Epithel, Bronchien-Epithel oder Lymphozyten, unter Verwendung einer vergleichbaren Methodik bewiesen werden konnte.

Bei den oben angegebenen Zelltypen, Mesothel-Zellen und HCN2-Neuronen, konnte SYT-interagierendes Protein SIP nicht de-tektiert werden [Antonson et al., 1998, direkte Hinterlegung bei den EMBL/GenBank/DDBJ Datenbanken], jedoch bei Medulloblastom-Zelllinien, und hier bei PFSK-1, war es ein reichlich vorkommendes Protein und könnte daher als Tumormarker-Anwärter be-

I NAHHfiFRPiriWT I trachtet werden.

Stoffwechsel-Enzyme ähnlich der Pyrrolin-5-carboxylat-Re-ductase-Isoform, ähnlich der 3-Hydroxyisobutyryl-CoA-Hydrolase und Thioredoxin-Domänen-enthaltendem Protein 5 wurden bisher nur aus Nukleinsäure-Sequenzen von malignen Tumoren vorhergesagt und könnten Isoformen darstellen, die vorwiegend oder spezifisch bei Malignität exprimiert werden.

Das vorausgesagte Protein PI.11659 (060376) enthält eine Prohibitin-Domäne, was auf eine Rolle bei der Inhibierung der DNA-Synthese hinweist [Lamerdin et al., 1998, direkte Hinterlegung bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken], und dieses Protein sowie die beiden nachfolgenden sind Tumor-spezifische/Tumor-verwandte Gebilde. Das vorausgesagte Protein Prol512 (Q9h370) enthält eine NIF-l-Domäne, die ein minimales Protein-Phosphata-se-Motiv representiert. Dieses Protein könnte eine Rolle bei der Signal-Transduktion hinsichtlich Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungs-Reaktionen spielen und stellt einen weiteren Tumor-Marker dar, da es niemals bei normalen Zellen berichtet wurde [Zhang et al., 1999, direkte Hinterlegung bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken] .

Das vorausgesagte Protein unbenanntes Protein-Produkt CAD13067 [Gstaiger et al., 2001; direkte Hinterlegung bei den EMBL/GenBank/DDBJ-Datenbanken] präsentiert keine bekannte Domäne oder Motiv, und es kann keine putative Funktion vorausgesagt werden. Homologie-Nachforschungen haben keine signifikanten Treffer gezeigt.

Die Proteine wurde methodisch eindeutig identifiziert durch eine Protein-Chemikalie anstatt mit einem immunochemischen Verfahren, die Daten sind daher verlässlicher und unabhängig von der Antikörper-Spezifität und -Verfügbarkeit. Das Verfahren hat jedoch Einschränkungen wie z.B. sind sehr hohes und sehr niedriges Molekulargewicht und hydrophobe Proteine kaum nachweisbar, und die hier gezeigte Karte besteht aus hydrophilen Strukturen.

NACHGEREICHT

Claims (12)

1. Patentansprüche: 1. Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors, welches die Schritte umfasst: - Vorsehen einer Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe, - Bestimmen der Konzentration mindestens eines Proteins in der Probe, wobei das Protein ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94, Q8NBS9, - Vergleichen der Konzentration des Proteins in der Probe mit einem entsprechenden Standard, und - Diagnostizieren eines Tumors, wenn die Konzentration über dem entsprechenden Standard liegt.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Standard 0 ist.
3. 3. Verfahren zur Diagnostizierung einer Progression eines Tumors, welches die Schritte umfasst: - Vorsehen einer Gewebe- oder Flüssigkeits-Probe A, - Bestimmen der Konzentration mindestens eines Proteins in der Probe, wobei das Protein ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94, Q8NBS9, - Vergleichen der Konzentration des Proteins in der Probe A mit der Konzentration des Proteins in einer Probe B, die in einem früheren Stadium genommen wurde, wobei die Progression des Tumors diagnostiziert wird, wenn die Konzentration in Probe A über der Konzentration in Probe B liegt.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Proteine 060376, Q9h370, CAD13067 bestimmt wird.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Proteins mittels Massenspektrometrie, Antikörpern, Gel-Elektrophorese oder einer Kombination davon bestimmt wird. - 24 -
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Proteins auf mRNA-Ebene bestimmt wird.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein embryonaler Tumor, vorzugsweise ein primitiver neuroektodermaler Tumor ist.
8. 8. Set zur Detektion von mindestens zwei Proteinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94, Q8NBS9, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens zwei Antikörper aufweist, die für die mindestens zwei Proteine spezifisch sind.
9. 9. Set nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper markiert sind, vorzugsweise mit einem radioaktiven oder fluoreszierenden Marker.
10. 10. Set nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper auf einem festen Träger, vorzugsweise auf einem Chip, immobilisiert sind.
11. 11. Set zur Detektion von mindestens zwei Proteinen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q96c36, P42694, 060376, Q9h370, CAD13067, Q9BS94, Q8NBS9, dadurch gekennzeichnet, dass es Mittel zur Detektion der mRNA der Proteine aufweist.
12. 12. Set nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel Polynukleinsäuren, die zu den mRNAs komplementär sind, oder Primer, die spezifisch an die mRNAs binden, umfassen. | NACHGEREICHT'