DE10153584A1

DE10153584A1 - Verfahren zur Indentifizierung Tumor-spezifischer Antigene auf Krebszellen

Info

Publication number: DE10153584A1
Application number: DE2001153584
Authority: DE
Inventors: Jens Hain; Martin Von Bergen; Thomas Marti
Original assignee: MEGAMEDICS GmbH
Current assignee: MEGAMEDICS GmbH
Priority date: 2001-11-02
Filing date: 2001-11-02
Publication date: 2003-05-15
Also published as: EP1634080A2; WO2003038439A2; WO2003038439A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung Tumor-spezifischer Antigene auf Krebszellen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß DOLLAR A a) humane Seren mit zytotoxischen Eigenschaften gegenüber Krebszellen identifiziert werden, DOLLAR A b) Proteinfraktionen aus lysierten Krebszellen mit diesen zytotoxischen Seren inkubiert werden, DOLLAR A c1) diejenigen Proteinfraktionen, welche die Tötung der Krebszellen inhibieren, bestimmt und aufgereinigt oder DOLLAR A c2) Targetantigene über Westernblot-Analyse identifiziert werden und DOLLAR A d) nachfolgend mittels Massenspektrometrie eine Charakerisierung erfolgt.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung Tumor-spezifischer Antigene auf Krebszellen. Ziel der Erfindung ist die Entwicklung therapeutisch und diagnostisch einsetzbarer Wirkstoffe. Anwendungsgebiete sind demzufolge die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Die Suche nach Krebszell-spezifischen Targetmolekülen erfolgt zur Zeit vorwiegend anhand von systematischen Untersuchungen mit Genomics- und Proteomics-Techniken (Nuttall M. E. (2001) Cells Tissues Organs 169, 265-271; Kallioniemi O. P. (2001) Hum. Mol. Genet. 10, 657-662). Dabei wird in den meisten Fällen der DNS-, RNS- und/oder Protein-Gehalt von normalem und krankem Gewebe quantifiziert und miteinander verglichen. Potentielle Targetmoleküle können sodann aufgrund einer Überexpression im Krebsgewebe nachgewiesen werden. Diese Vorgehensweise liefert jedoch keinen Hinweis zur Funktion der identifizierten Targets. Um abzuklären, ob die identifizierten Targets für die Entwicklung neuer Wirkstoffe überhaupt geeignet sind, muss deren Funktionsweise nachfolgend in umfangreichen Testverfahren aufgeklärt werden.
Die Erfindung hat das Ziel, auf der Grundlage des humanen Immunsystems neue Tumorzell-Targets für die Entwicklung therapeutisch und diagnostisch einsetzbarer Wirkstoffe zu finden. Die Aufgabe besteht darin, dafür ein effektives Verfahren zu entwickeln.
Die Aufgabe der Erfindung wird mit den in den Ansprüchen dargelegten Maßnahmen gelöst. In einzelnen werden chronologisch folgende Methoden eingesetzt:

Identifizierung von humanen Seren mit zytotoxischen Eigenschaften gegenüber Krebszellen (CISS-Assay)

- Tumorzellen, die von den häufigsten humanen Krebsarten abgeleitet sind, werden auf Mikrotiterplatten kultiviert und mit Seren unterschiedlicher Herkunft inkubiert. Anschliessend werden die Zellen mit dem Fluoreszenzfarbstoff Propidium Jodid versetzt, was eine selektive Anfärbung der toten Zellen bewirkt. Die resultierenden Fluoreszenzänderungen werden im Plattenfluorimeter vermessen, und ermöglichen dadurch eine Identifizierung von Seren mit zytotoxischen Eigenschaften gegenüber Krebszellen (CISS- Assay). Diese sog. zytotoxischen Seren werden nun für die Targetsuche eingesetzt.

Aufreinigung und Identifizierung von spezifischen Target-Proteinen auf Krebszellen (ICIS-Assay)

- Kultivierte Krebszellen werden lysiert, und die enthaltenen Proteinkomponenten mit chromatographischen Trennverfahren fraktioniert. Die Eingrenzung der potentiellen Targets erfolgt mit Hilfe des sog. ICIS-Assay. Dabei werden die Proteinfraktionen mit den im CISS-Assay identifizierten zytotoxischen Seren inkubiert, und auf ihre Fähigkeit zur Inhibition der Zytotoxizität untersucht. Mit Hilfe dieses ICIS-Assays werden diejenigen Proteinfraktionen bestimmt, welche durch Bindung der zytotoxischen Serumkomponenten die Tötung der Krebszellen inhibieren. Die Proteinfraktionen werden solange aufgereinigt und jeweils im ICIS-Assay getestet, bis schlussendlich eine homogene Molekülkomponente vorliegt, welche das reine Target reflektiert.

Identifizierung von spezifischen Target-Antigenen auf Krebszellen durch Westernblot-Analyse mit depletierten Seren

- Alternativ zum ICIS-Assay werden Target-Antigene über Westernblot-Analyse identifiziert. Dazu werden zytotoxische Seren durch wiederholte Adsorption an die Krebszellen von ihren toxischen Molekülen befreit. Nach Auftrennung der Gesamtproteine von Krebszellen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese werden nun durch vergleichende Westernblot-Analyse potentielle Target- Antigene identifiziert: Die entsprechenden Proteinbanden werden selektiv nur bei der Westernblot-Analyse mit nicht-depletiertem Serum erkannt, während unspezifische Banden sowohl von depletiertem wie auch von nicht-depletiertem Serum erkannt werden.

Die mit der ICIS- und/oder Westernblot-Analyse selektionierten Tumor-Targets, werden nachfolgend mittels Massenspektrometrie identifiziert und charakterisiert. Das entsprechende Protein wird dann, rekombinant oder nativ, wiederum als Einzelantigen in den ICIS-Assay eingesetzt, um letztendlich als Target-Antigen für die weitere molekularmedizinische Verwendung (z. B. als Angriffspunkt für therapeutische oder diagnostische Immunkonjugate) validiert zu werden.
Der Ablauf des gesamten Verfahrens zur Target-Identifizierung mit humanen Seren ist synoptisch in Abb. 1 dargestellt.
Im Vergleich zu den systematischen Ansätzen des Standes der Technik weist das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren folgende Vorteile auf:

- Die Targetidentifizierung erfolgt mittels eines Funktions-gestützten Auswahlverfahrens. Die resultierenden Targets sind somit funktionell bereits validiert und können direkt für die Entwicklung neuer Wirkstoffe eingesetzt werden.
- Die Targetsuche basiert auf dem humanen Immunsystem, d. h. die Target-Antigene werden von körpereigenen Immunkomponenten gesunder Individuen erkannt. Das Unwirksamkeits- und auch Nebenwirkungsrisiko daraus entwickelter Immunotherapeutika kann deshalb als minimal eingestuft werden.

Ausführungsbeispiel

Material und Methoden

Seren

Es wurden Seren unterschiedlicher Patienten/Probanden aus dem Bestand der eigenen Serumbank sowie von kooperierenden Blutspendeeinrichtungen getestet.

Tumorzellen

HT29 Zellen (eine Colon adenocarcinom Zelllinie) wurden von der American Type Culture Collection (ATCC HTB-38) bezogen und entsprechend den dort publizierten Vorschriften kultiviert und passagiert.

Hochdurchsatz-Zytotoxizitätstest auf Mikrotiterplatten (CISS-Assay)

HT29 Zellen wurden mit Hilfe einer 16 Kanalpipette in 96-Well-Mikrotiterplatten transferiert und bei einer eingesäten Dichte von 20.000 Zellen pro Well 2 Tage in 100 µl Kulturmedium (McCoy's 5A mit 10% FCS) kultiviert. Nach Entfernen des Kulturmediums wurden die exponentiell wachsenden adhärenten Zellen mit jeweils 20 µl der zu testenden Seren überschichtet und eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurden pro Well 30 µl Propidium-Jodid (PI, 40 µg/ml in Phosphatpuffer) zugesetzt und eine weitere Stunde bei 37°C inkubiert. PI ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der in Zellen mit zerstörter Zellmembran eindringt, in die DNS interkaliert, und dann bei Anregung mit 536 nm-Licht eine spezifische Emission bei 617 nm zeigt. Die Fluoreszenz der mit PI angefärbten toten Zellen wurde in einem Plattenfluorimeter (BioTek FL600) gemessen und so die relative Toxizität der getesteten Seren bestimmt. Als negative Kontrolle dienten Zellen die mit nicht toxischem Kulturserum (FCS) inkubiert wurden. Als positive Kontrolle (100% PI- Einbau) wurden Zellen in 50% Dimethylsulfoxid (DMSO) inkubiert.

Herstellung von Zellextrakten

In Kulturflaschen gezüchtete HT29 Zellen wurden abtrypsiniert, 2 × mit PBS gewaschen, in 50 ml Plastikgefässe überführt und in Gegenwart von PBS mit Complete Protease Inhibitor eingefroren. Nach dem Auftauen wurden die Zellen 15 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet in 5 ml Extraktionspuffer (PBS mit Complete Protease Inhibitor, 0.04 mg/ml DNaseI, 0,02 mg/ml RNaseA, 2 mM MgCl₂) suspendiert und in 2 ml Reaktionsgefässe transferiert. Die Zentrifugation und das Resuspendieren in Extraktionspuffer wurden zweimal wiederholt. Anschliessend wurden die Zellen in einem gleichen Volumen Extraktionspuffer aufgenommen. Der Aufschluss der Zellen wurde mittels Ultraschallbehandlung durchgeführt (Ultraschallprozessor Typ UP200 s, Dr. Hielscher; Einstellungen: Cycle 0.7, Amplitude 80%). Es wurden jeweils zehn Ultraschallperioden eingesetzt. Hiernach wurden die Extrakte 1 Std. bei 15.000 g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit PBS auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml eingestellt und in den ICIS-Assay eingesetzt.
Die chromatographische Auftrennung der aus HT29 Zellen extrahierten Proteine wurde auf einer Gelfiltrationsmatrix vom Typ Sephacryl 300HR (Amersham Pharmacia) durchgeführt. Die Säule war an eine Flüssigkeitschromatografieanlage vom Typ BioCad- Sprint (Applied Biosystems) angeschlossen. Als isokratischer Laufpuffer wurde PBS verwendet, wobei die Flussrate 0.5 ml/Min. betrug. Das Eluat wurde bei 214 und 280 nm detektiert, und in Fraktionen von jeweils 2 ml gesammelt.

Inhibitionstest im Durchflusszytometer (ICIS-Assay)

Das Protokoll beruht im wesentlichen auf einer publizierten Methode (Ollert et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 4498-4503). Für die Messung der inhibitorischen Aktivität eines Zellextraktes oder einer chromatographisch aufgereinigten Fraktion auf die Serumvermittelte Zytotoxizität wurden zunächst 100 µl der zu untersuchenden Probe mit 100 µl eines zytotoxischen Serums 2 Std. auf Eis inkubiert. Anschliessend wurde der Ansatz 10 Min. bei 4°C und 15.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und mit 100 µl einer Suspension von HT29 Zellen (5 × 106 Zellen/ml in PBS mit 0.1% Gelatine) für 1 Std. auf Eis inkubiert. Danach wurden 500 µl PBS mit 0.1% Gelatine hinzugegeben, gut gemischt und die Reaktionsansätze während 5 Min. bei 4°C und 190 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 500 µl PBS mit 0.1% Gelatine resuspendiert. Es wurde nochmals 5 Min. bei 4°C und 190 g zentrifugiert und das Pellet in 100 µl PBS mit 0.1% Gelatine aufgenommen. Nach Zugabe von 100 µl eines nicht toxischen Serums wurde der Ansatz 1 Std. bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurden 500 µl PBS mit 0.1% Gelatine zugegeben und während 5 Min. bei 4°C und 190 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 400 µl PBS mit 0.1% Gelatine suspendiert. Die Proben wurden anschliessend mit 3 µl PI (0.25 mg/ml in Phosphatpuffer) versetzt und im Durchflusszytometer analysiert. Als Kontrollen wurden zytotoxisches und nicht-toxisches Serum sowie eine Pufferlösung verwendet, wobei die Probenvolumina jeweils durch Zugabe von PBS mit 0.1% Gelatine ausgeglichen wurden. Die Einstellungen des Durchflusszytometers waren: Anregung 488 nm, Emission 536 nm. Pro Probe wurden jeweils 5000 Zellen analysiert und die Ergebnisse mit der vom Hersteller gelieferten Software ausgewertet.

Westernblot-Analyse mit depletierten Seren

Für die Depletion der Zytotoxizität von Seren wurden 80% konfluente HT29 Zellen (etwa 10⁷ Zellen) mit PBS gewaschen und mit 10 ml des für HT29 Zellen toxischen Serums 2979 während 1 Std. bei 37°C inkubiert. Der Serumüberstand wurde nachfolgend auf eine neue HT29 Zellkultur transferiert und diese wiederum 1 Std. bei 37°C inkubiert. Der Transfer- und Inkubationsschritt wurde insgesamt 8 mal durchgeführt. Die Zytotoxizität des depletierten Serums wurde nachfolgend im CISS-Assay gemessen.
Für die vergleichende Westerublot-Analyse wurden Proteinextrakte von HT29 Zellen mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt und anschliessend auf PVDF-Membranen transferiert. Zur Identifizierung von Tumorzell-Antigenen wurden 2 parallel hergestellte Blots mit nativem Serum 2979 bzw. depletiertem Serum 2979 inkubiert. Als 2. Antikörper wurden menschliche Immunglobuline, die mit dem enzymatischen Nachweissystem Horse- Radish-Peroxidase gekoppelt sind, eingesetzt. Die Detektion wurde mit Hilfe eines Chemilumineszenz-Substrates durchgeführt. Proteinbanden, die selektiv nur auf dem mit nicht-depletiertem Serum 2979 entwickelten Blot erscheinen, repräsentieren potentielle Tumorzell-Targets. Die entsprechenden Proteinspots werden aus den 2D-Gelen ausgestanzt, enzymatisch fragmentiert und die resultierenden Peptide mittels Massenspektrometrie analysiert.

Resultate

Seren verschiedener Blutspender wurden im CISS-Assay bezüglich ihrer zytotoxischen Eigenschaften analysiert. Abb. 2 zeigt, dass im Vergleich zur Negativkontrolle (FCS) mehrere Seren eine deutliche Erhöhung der PI-Fluoreszenz induzieren, und somit gegenüber HT29 Zellen zytotoxisch sind. Der CISS-Assay ermöglicht somit eine eindeutige Identifizierung von Seren mit zytotoxischer Wirkung auf unterschiedlichen Krebszelllinien.
Zur Aufreinigung von Target-Proteinen wurden HT29 Zellen lysiert, und die solubilisierten Proteinkomponenten mittels Gelfiltration auf Sephacryl 300HR fraktioniert. Die einzelnen Fraktionen wurden nachfolgend im ICIS-Assay in Bezug auf ihre Fähigkeit zur Inhibiton der zytotoxischen Aktivität von Serum 2979 untersucht. Die im Durchflusszytometer gemessene Zytotoxizität der Proben ist in Abb. 3 dargestellt. Die Resultate zeigen, dass die Fraktionen #1 und #2 eine starke Hemmung der Zytotoxizität von Serum 2979 bewirken, da sie offenbar die toxischen Serumkomponenten binden. Dieser Ansatz ermöglicht somit eine Identifizierung der Target-Moleküle, welche den zytotoxischen Effekt des Serums vermitteln. Die Proteinfraktionen #1 und #2 werden nun mit chromatographischen Trennmethoden weiter aufgereinigt und im ICIS-Assay getestet, bis schlussendlich ein reines Target-Protein vorliegt.
Zur Identifizierung von Target-Antigenen mittels Westernblot-Analyse wurden zytotoxische Seren durch wiederholte Adsorption an Krebszellen von ihrer Toxizität befreit. Abb. 4 zeigt, dass die PI-Fluoreszenz des zytotoxischen Serums 2979 nach dessen Depletion deutlich reduziert ist. Das depletierte Serum 2979 zeigt somit im CISS-Assay gegenüber HT29 Zellen praktisch keine zytotoxische Aktivität.
Nach Auftrennung der Gesamtproteine von HT29 Zellen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese können potentielle Target-Antigene nun durch vergleichende Westernblot-Analyse identifiziert werden. Die entsprechenden Proteinbanden treten selektiv nur bei einem mit nicht-depletiertem Serum entwickelten Westernblot auf, während unspezifische Proteine sowohl von depletiertem wie auch von nicht-depletiertem Serum erkannt werden.
Die mit der ICIS- und Westernblot-Analyse selektionierten Tumor-Targets werden nachfolgend mittels Massenspektrometrie und/oder Edman-Sequenzierung identifiziert. Das entsprechende Protein wird dann, rekombinant oder nativ, wiederum als Einzelantigen in den ICIS-Assay eingesetzt, um letztendlich als Target-Antigen für die weitere molekularmedizinische Verwendung (z. B. als Angriffspunkt für therapeutische oder diagnostische Immunkonjugate) validiert zu werden.

Legende zu den Abbildungen

Abb. 2: Bestimmung der PI-Fluoreszenz nach Inkubation von HT29 Zellen mit 5 unterschiedlichen Seren (CISS-Assay). Zum Vergleich sind die PI-Fluoreszenz einer Negativkontrolle (FCS) sowie einer Positivkontrolle (DMSO) gezeigt. Das zytotoxische Serum 2979 wurde für die nachfolgenden Analyseschritte eingesetzt.
Abb. 3: Bestimmung der Zytotoxizität von Proteinfraktionen aus HT29-Zellextrakten. Die Fraktionen #1-5 wurden mittels Gelfiltration auf Sephacryl 300HR hergestellt. A: Positivkontrolle (Serum 2979); B: Negativkontrolle (nicht-toxisches Serum); C: Pufferkontrolle.
Abb. 4: Vergleich der zytotoxischen Wirkung gegenüber HT29 Zellen von Serum 2979 vor und nach Depletion (CISS Assay). Als Negativkontrolle wurde FCS, und als Positivkontrolle DMSO eingesetzt.

Claims

1. Verfahren zur Identifizierung Tumor-spezifischer Antigene auf Krebszellen dadurch gekennzeichnet, daß

a) humane Seren mit zytotoxischen Eigenschaften gegenüber Krebszellen identifiziert werden,

b) Proteinfraktionen aus lysierten Krebszellen mit diesen zytotoxischen Seren inkubiert werden,

c) diejenigen Proteinfraktionen, welche die Tötung der Krebszellen inhibieren, bestimmt und aufgereinigt oder

d) Targetantigene über Westernblot-Analyse identifiziert werden und

e) nachfolgend mittels Massenspektrometrie eine Charakterisierung erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Tumorzellen der häufigsten humanen Krebsarten eingesetzt werden und die Anfärbung mit dem Fluoreszenzfarbstoff Propidiumjodid erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Identifizierung der humanen Seren mit zytotoxischen Eigenschaften
durch Inkubation von Tumorzellen mit Seren unterschiedlicher Herkunft
nachfolgende selektive Anfärbung der abgetöteten Zellen und
nachfolgende Bestimmung der Fluoreszenz erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteinfraktionen aus lysierten Krebzellen mit chromatographischen Trennverfahren erhalten werden und durch jeweilige Bestimmung der Inhibierung eine mehrfache Aufreinigung bis zur homogenen Molekülkomponente erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß humane Seren mit zytotoxischen Eigenschaften durch wiederholte Adsorption an die Krebszellen von ihren toxischen Molekülen befreit werden, eine Auftrennung der Gesamtproteine der Krebzellen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese und die Identifizierung von Target-Antigenen durch vergleichende Westernblot-Analyse erfolgt.

6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1-5 identifizierten Tumor-spezifischen Antigene zum Screening auf therapeutisch oder diagnostisch einsetzbare Wirkstoffe.

7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1-5 identifizierten Tumor-spezifischen Antigene zum Screening auf therapeutische, ggf. präventiv, oder diagnostische Anwendungen.