CN1069699C

CN1069699C - 一种活性重组酰胺化酶及其对多肽的酰胺化修饰应用

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Publication number: CN1069699C
Application number: CN97106383A
Authority: CN
Inventors: 李伯良; 江智红; 吴祥甫; 杨宇虹; 杨新颖; 黄荣; 陈虎
Original assignee: Shanghai Institute of Biochemistry
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 1997-04-16
Filing date: 1997-04-16
Publication date: 2001-08-15
Anticipated expiration: 2017-04-16
Also published as: CN1172856A

Abstract

本发明涉及一种大鼠来源的C端酰胺化酶基因在昆虫细胞中的活性表达。将编码大鼠甘氨肽酰化单氧酶(rPAM)的氧化酶结构域(PHM)cDNA插入昆虫杆状病毒转移表达载体，并通过同源重组得到在昆虫细胞中表达活性PHM的重组病毒。昆虫细胞表达的PHM可直接用于甘氨肽的酰胺化修饰。

Description

一种活性重组酰胺化酶及其对多肽的酰胺化修饰应用

本发明涉及酰胺化酶的基因工程活性表达和对多肽的C端酰胺化加工。

大量具有药用价值的激素、神经肽、毒肽等C末端均为酰胺化修饰，这对其生物活性和稳定性都是十分重要的。例如降钙素，若以非酰胺化的Pro残基替代天然的酰胺化Pro，则其生物活性要下降3,000倍。此翻译后加工过程由酰胺化酶—甘氨肽酰化单氧酶(Peptidylglycineα-Amidating Monooxygenase，PAM，EC 1.14.17.3)催化完成(Bradbury A.F.，et al.，1982，Nature，298：686)。酰胺化酶广泛地存在于两栖类到人的组织中，且有较高的同源性。但基因工程常用的大肠杆菌等原核生物和已建立的昆虫细胞系中，却缺乏该酶活性，表达产物没有翻译后的酰胺化加工。

因而酰胺化酶的开发研究就显得十分必要。PAM可以从含量及活性高的组织中分离纯化，例如血清、人甲状腺、蛙皮、大鼠髓样甲状腺瘤组织及细胞株、猪心房、猪垂体等，这方面国际上已有不少专利报道。但从天然组织中提取酰胺化酶的方法，受到材料来源的限制，纯化工艺繁琐，另外纯化产物往往带有组织中的蛋白酶的污染，在对多肽的修饰过程中，造成对底物、酰胺化产物以及酶本身的降解，从而影响其进一步的开发应用。用基因工程方法生产酰胺化酶，是另一条途径。

PAM cDNA已从多种种属中被克隆，并在多种哺乳动物细胞中得到活性表达(Eipper B.A.，et al.，1991，J.Biol.Chem.，266：7827；Kato I.，et al.，1990，Biochem.Biophy.Res.Commun.，172：197；Mains R.E.，et al.，1991，Mol.Endocrinol.，5：187)，但仅限于基础研究。在大肠杆菌中也还未见有活性表达的报道，复性也极为困难。杆状病毒表达载体是近年来发展起来的新型表达载体系统，利用该系统可在昆虫细胞和虫体中高效表达外源基因，产量可远高于哺乳动物细胞，而且有较完善的翻译后加工体系，如二硫键配对、糖基化等，因此在基因工程药物生产中较细菌、酵母、哺乳动物细胞等体系更具潜在的优势(Karl M.，et al.，1994，Insect Cell Biotechnology，CRC press)。

PAM是在多肽生物合成中被发现的第一个双功能酶，有两个催化结构域—氧化酶(PHM)和裂解酶(PAL)，生理pH条件下，顺序催化酰胺化的两步反应：末端为Gly的肽前体首先由PHM氧化为肽酰羟化甘氨酸中间体，然后经PAL裂解为酰胺化产物和乙醛酸。但研究中发现，碱性条件下不需PAL的作用，中间体可自发转化为产物(Eipper B.A.，et al.，1991，J.Biol.Chem.，266：7827)。因而在酰胺化反应中，PHM比PAL更为重要。既然单单PHM已可满足酰胺化加工的要求，而且一般来说，单表达PHM比表达PAM全酶，更容易且产率高，因此PHM的活性表达在酰胺化酶的基因工程生产中更有意义。

为此，本发明的目的是将克隆的带有信号肽和前导肽的大鼠的PHM催化结构域编码序列，重组入昆虫杆状病毒转移表达载体中，在昆虫细胞sf21中实现活性表达，表达的产物可直接用于甘氨肽的酰胺化修饰。

本发明提供了一种克隆的带有信号肽和前导肽的大鼠的PHM催化结构域编码基因。通过噬菌体原位杂交和PCR方法，从大鼠的脑cDNA库中筛选到PAM的三个基因片段(图1中片段P为筛库的探针，a，b和c为所筛选到的PAM基因片段)，经DNA全序列分析，片段a为502bp，编码rPAM N端信号肽、前导肽及部分成熟蛋白部分；片段b为422bp，编码rPAM的氧化酶结构域PHM的部分序列；片段c为2388bp，包括编码部分氧化酶结构域PHM、全部裂解酶PAL结构域、跨膜区序列、C端胞质区的序列及一部分3′端非翻译序列。上述三个基因片段部分重叠，跨越rPAM的全酶编码序列，但它们无合适的限制性酶切位点进行重组。通过设计适宜引物，将片段c中PHM的编码序列用PCR扩增出，并与片段a和b通过PCR重组，获得完整的PHM编码序列(图2，图3)；本发明还提供了含PHM基因的昆虫杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2及可用于在昆虫细胞sf21或sf9中分泌表达活性型PHM的重组病毒BacPHM(由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，1997年3月5日，保藏编号为CGMCC0295)。将拼接获得的完整的PHM编码序列(含信号肽和前导肽)，通过酶切位点EcoRI和BamHI，插入昆虫杆状病毒转移表达载体pBacPAK8(CLONTECH公司产品，产品目录号为6145-1)，构建成表达质粒 (图4)；pBacPHM2与修饰的苜蓿尺蠖核多角体病毒BacPAK6线性化DNA共转染秋粘虫细胞sf21，通过同源重组得到在核多角体蛋白基因启动子(polyhedrin promoter)控制下的PHM基因的。

本发明还提供了BacPHM感染sf21细胞后的活性表达产物—单功能酰胺化酶PHM。用BacPHM感染sf21细胞，无血清培养上清在72h后检测到酰胺化酶最高活力(图5)；分泌至培养基中的酶活力远高于胞内(图7)；经聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和PAM的特异性抗体的蛋白质印迹(western blot)分析，表达产物分子量约为41kD(图6，C和S分别为感染BacPHM的～10⁵个sf21细胞胞内及～10μl培养基上清中的蛋白，C0和S0分别为感染BacPAK6的sf21细胞胞内及培养基上清中的蛋白。)；分泌至培养基中的产量约为1μg/ml培养基。重组PHM可对C末端为Gly的多肽进行酰胺化修饰。以α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly三肽为底物，其酰胺化反应最适pH约为5.0(图8)。

本发明还利用重组的PHM对甘氨肽进行酰胺化修饰。以α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly和D-Tyr-Val-Gly为例，在微酸性及中性pH条件下，PHM可将它们分别转为α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly(OH)和D-Tyr-Val-Gly(OH)中间产物；而反应体系中加入0.1M NaOH时，所生成的中间产物可在1分钟内完全转为酰胺化产物；底物和产物可通过HPLC进行分离。

综上，本发明优点如下：利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达酰胺化酶，产量可远高于哺乳动物细胞，还能建立悬浮培养体系，利于该酶的产业化生产；同时在昆虫细胞中引入了酰胺化酶活性，利于昆虫细胞中表达产物的翻译后酰胺化修饰；单表达PHM比表达PAM全酶，其转录、翻译效率要高，表达产物要稳定，不涉及全酶中两个结构域在折叠中的相互影响，而且已经可满足酰胺化加工的要求；克隆表达的PHM带有信号肽和前导肽，有效引导了表达产物的外泌，利于产物的纯化和稳定性，避免胞内蛋白酶的降解，也为重组病毒的筛选提供了方便，只需检测细胞分泌至无血清培养基中的酰胺化酶活性，即可挑出阳性病毒。昆虫细胞中表达的活性PHM在基础理论研究和医药开发应用方面均具有重要的意义。

附图说明：

图1.大鼠PAM蛋白和cDNA的结构以及所筛选的PAM基因片段a，b，c相对全基因的位置和核苷酸序列。

图2.PHM的DNA拼接战略。

图3.PHM的DNA核苷酸及相应编码的氨基酸序列。

图4.昆虫细胞的PHM的转移表达质粒的构建。

图5.重组病毒BacPHM感染sf21细胞的表达时相。

图6.被重组病毒BacPHM感染的sf21细胞表达产物的western blot分析。

图7.重组病毒BacPHM感染的sf21细胞胞内及培养基上清中的酰胺化酶活力比较。

图8.昆虫细胞表达的PHM的酶活力和反应pH值的关系。

图9.重组PHM与两种甘氨肽反应后的HPLC分析。a，标准D-Tyr-Val-Gly和D-Tyr-Val-NH₂ HPLC分析；b，D-Tyr-Val-Gly与失活的PHM反应后HPLC分析；c，D-Tyr-Val-Gly与活性PHM反应后HPLC分析；d，标准α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly和α-N-acetyl-Tyr-Val-NH₂ HPLC分析；e，α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly与失活的PHM反应后HPLC分析；f，α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly与活性PHM反应后HPLC分析。

图10.D-Tyr-Val-Gly(A)和α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly(B)经重组酰胺化酶修饰后的产物的质谱分析。

本发明通过以下实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1.大鼠PHM cDNA基因片段的筛选和克隆从大鼠脑cDNA库(Stratagene公司产品，#936515)中，通过噬菌斑原位杂交和PCR方法，筛选和克隆PAM cDNA基因片段。PAM探针DNA(图1中片段P)，按随机引物标记试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)推荐方法进行同位素标记。噬菌斑原位杂交方法按cDNA库说明书推荐方法。经两轮杂交筛选，获得两个阳性杂交克隆。经全序列测定，它们在全基因中的位置如图1片段c和片段b。b，c尚未覆盖PHM全编码序列。为获得片段b前面的编码序列，设计合成一对引物：

引物1：5′CTGCGAATTCATGGCCGGACG 3′

引物1′：5′GCTTCCAGTTTCTCCTCCAAC 3′

其中5′端引物1带有限制性内切酶EcoRI识别位点和编码PAM N端信号肽的若干密码子，用PCR方法扩增基因片段。加2μlλcDNA库于20μl重蒸水中，置70℃水浴保温5min，然后放入冰中冷却。加入10μl 10×PCR缓冲液，8μl 2.5mmol/L dNTP，3μl 50mmol/L MgCl₂，两种引物各100pmol，Taq DNA聚合酶2.5单位，使终体积为100μl，在DNA Thermal Cycle 480扩增仪上进行PCR循环。94℃变性、55℃复性、72℃延伸各1分钟，35个循环后，在72℃下延伸15min，最后保温在4℃。用PCR方法从原库中扩增获得～502bp片段(图1片段a)，序列分析证明其编码大鼠PAM信号肽、前导肽和PHM结构域N端部分序列。

自片段a、b、c可拼接获得带有信号肽的rPHM的全部编码序列。因没有合适的酶切位点进行重组，进而设计合成引物，并采用新一代PCR重组技术，将片段进行拼接。PCR重组拼接战略如图2。引物1如上所述。引物2为5′CATGGAAAGGATCCTGCTCTAAT AC3＇，其中相应增加的3个碱基CCT编码Pro，使在rPHM和rPAL编码区的衔接处构建了-BamH1切点。用M13反向引物和正向引物，从含片段b的pBluescript SK+质粒中扩增获得～640 bp片段F1；F1与片段a有部分重叠序列，经变性、退火，作一步延伸反应。再用引物1和M13正向引物，扩增出约1000bp的片段a和b的拼接产物F2。同样，以M13反向引物和引物2，从克隆片段c中，经PCR扩增出～480bp的片段F3。F2经EcoRI单酶切后的3′端与F3有90bp的重叠。将两者一起变性，退火后，作一步延伸反应。再加入引物1、引物2，PCR扩增获得～1160bp的片段F4。F4经全序列分析，证明为完整的大鼠preproPHM编码基因(图3)。

实施例2.重组PHM在昆虫杆状病毒(Baculovirus)系统中的表达

a.昆虫杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2的构建基因片段F4包含大鼠PAM信号肽、前导肽和PHM编码区序列，通过EcoRI和BamHI酶切位点，插入昆虫杆状病毒转移表达载体pBacPAK8，使大鼠PHM基因处于核多角体蛋白启动子(ph promoter)控制之下，构建成杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2(图4)。

b.表达大鼠PHM基因的重组病毒BacPHM的获得

昆虫杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2和修饰的苜蓿尺蠖核多角体病毒BacPAK6的Bau36AI酶解线性化DNA，在脂质体介导下共转染sf21细胞。共转染上清再感染sf21细胞并进行空斑筛选。重组病毒的筛选采用的是酶活测定方法。挑取的空斑病毒扩增后，感染96孔板细胞，并换无血清昆虫细胞培养基SF-900II培养，三天后吸取培养基进行酰胺化测活。以¹²⁵I标记的α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly三肽为底物，检测酰胺化酶活力。碘标采用IODO-GEN法。40μl酶活测定反应体系中，含有25μM底物，1～2μg胞内蛋白样品或10μl培养基，120mM Na(MES)pH6.0，1μM CuSO4，1mM抗坏血酸，N-乙基顺丁烯二酰亚胺(N-Ethylmaleimide，NEMI)0.5mM和0.25mg/ml过氧化氢酶。样品均以双份在37℃保温4h。反应结束，加入10μl 1N NaOH，0.05％三甲胺饱和的乙酸乙酯抽提。在碱性条件下用乙酸乙酯抽提，酰胺化产物α-N-acetyl-Tyr-Val-NH₂疏水性极强，进入有机相，而未反应底物则溶于水相中。吸取上层有机相，测γ计数，计算产物的生成量。表达活性高的病毒再进行一轮空斑筛选，最终获得表达PHM高活力的阳性单克隆重组病毒BacPHM。

c.大鼠PHM在秋粘虫细胞sf21中的表达

首先确定PHM的表达时相。将纯化的重组病毒BacPHM，感染sf21细胞，并换无血清培养基SF-900II培养，于每天取少量感染上清，检测培养基中酰胺化酶活性，在感染24h后，即可检测到培养基中明显的酰胺化酶活。在第三天，培养基中的酶活达到最高，随后又下降(图5)。分别对胞内及培养基中表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。病毒感染细胞3天后，收集培养基，加入等体积Laemili上样缓冲液，制备胞外蛋白样品；贴壁细胞悬浮于20mM Na(TES)，pH7.5/10mM甘露醇/1％TritonX-100溶液中，液氮中冻融，离心后上清制备细胞胞内蛋白样品。Western-blot分析结果表明(图6)，细胞胞内及培养基上清中均有明显与PHM抗血清反应的条带，显示的分子量约为41kD，表达产物的N端已去掉信号肽。

分别测定胞内及培养基上清中表达产物的酰胺化活性，测活方法同前。酶液与¹²⁵I-Ac-Tyr-Val-Gly底物保温4h后，加入NaOH，使反应中间产物转化为酰胺化产物，乙酸乙酯抽提相的γ计数显示(图7)，胞内及培养基中表达的PHM均有明显的酰胺化活力，且分泌于培养基中的酶活远高于胞内，而对照组感染BacPAK6(不含PHM基因的病毒)的细胞，胞内及培养基上清中均未检测到酰胺化酶活性。

实施例3.重组表达的酰胺化酶对甘氨肽进行酰胺化加工修饰及其产物的检测

浓缩10倍的含PHM的无血清培养基10μl分别与8nmol α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly或D-Tyr-Val-Gly保温4h后，加入NaOH至终浓度0.2M，1min内反应中间产物可完全转为酰胺化产物。15,000rpm离心10min，反应液全部上HPLC柱(KONTRON高压二元梯度HPLC系统-DAD型，柱为RP18 Spheri-5，ABI，4.6×100mm)。HPLC A液为1mM NH₄HCO₃，pH9.0，B液为乙腈，280nm检测。乙腈在8min内由0％连续洗脱至50％。以加热失活(100℃，15min)的PHM反应产物作为对照。

HPLC结果表明(图9)，表达的PHM对两种甘氨肽均能酰胺化，未观察到加工中中间产物的积累。收集产物峰，进一步用ESI质谱分析(图10)。理论推算α-N-acetyl-Tyr-Val-Gly和D-Tyr-Val-Gly的分子量分别为380和338，而N-acetyl-Tyr-Val-NH₂和D-Tyr-Val-NH₂的分子量分别为322和281。质谱分析结果显示，D-Tyr-Val-Gly(图10A)和N-acetyl-Tyr-Val-Gly(图10B)经酰胺化酶修饰产物子量均与理论推算相符(^*号所示)。

Claims

1.一种重组大鼠酰胺化酶的氧化酶基因，其特征在于该重组基因具有以下DNA核苷酸序列：CTGCGAATTC 10ATGGCCGGACGCGCCCGCAGCGGTCTGCTACTGCTGCTGCTGGGGCTGCTCGCCCTGCAG 70AGCAGCTGCCTGGCCTTCAGAAGCCCACTTTCTGTCTTTAAGAGGTTTAAAGAAACTACC 130AGATCATTTTCCAATGAATGCCTTGGTACCATTGGACCAGTCACCCCTCTTGATGCATCA 190GATTTTGCGCTGGATATTCGCATGCCTGGGGTTACACCTAAAGAGTCTGACACATACTTC 250TGCATGTCCATGCGTCTGCCTGTGGATGAGGAAGCCTTCGTGATTGACTTCAAGCCTCGT 310GCCAGCATGGATACTGTCCACCATATGCTGCTGTTTGGATGCAATATGCCCTCGTCCACT 370GGAAGTTACTGGTTTTGTGATGAAGGAACCTGTACAGATAAAGCCAATATTCTATATGCC 430TGGGCAAGGAATGCTCCCCCCACCCGGCTCCCGAAAGGTGTTGGATTCAGAGTTGGAGGA 490GAAACTGGAAGCAAATACTTCGTCCTTCAAGTTCACTATGGCGATATCAGTGCTTTTCGA 550GATAATCACAAAGACTGCTCTGGCGTGTCCGTACATCTCACACGTGTGCCCCAGCCTTTA 610ATTGCGGGCATGTACCTTATGATGTCTGTTGACACTGTCATACCACCAGGAGAGAAAGTA 670GTGAATGCTGACATTTCGTGCCAATACAAAATGTATCCAATGCATGTGTTTGCCTACAGA 730GTCCACACTCACCATTTAGGTAAGGTGGTGAGCGGATACAGAGTAAGAAACGGACAGTGG 790ACACTGATTGGACGCCAGAACCCCCAGCTGCCACAGGCTTTCTACCCTGTGGAACACCCC 850GTTGATGTTACTTTTGGTGATATACTGGCAGCCAGATGTGTGTTCACTGGTGAAGGGAGG 910ACAGAGGCCACCCATATCGGCGGCACTTCTAGTGACGAAATGTGTAACCTGTACATCATG 970TATTACATGGAAGCCAAATATGCACTTTCCTTCATGACCTGTACAAAGAACGTGGCTCCA 1030GATATGTTCAGAACTATCCCAGCAGAGGCCAATATCCCAATTCCTGTCAAACCGGACATG 1090GTTATGATGCACGGGCATCACAAAGAAGCAGAAAACAAAGAAAAGAGTGCTTTAATGCAG 1150CAGCCAAAACAGGGAGAGGAAGAAGTATTAGAGCAGGATCCT TAA 1195

2、一种权利要求1所述氧化酶基因所编码的重组大鼠酰胺化酶的氧化酶，其特征在于该氧化酶具有以下的氨基酸序列：MetAlaGlyArgAlaArgSerGlyLeuLeuLeuLeuLeuLeuGlyLeuLeuAlaLeuGln 20SerSerCysLeuAlaPheArgSerProLeuSerValPheLysArgPheLysGluThrThr 40

(续后页) ArgSerPheSerAsnGluCysLeuGlyThrIleGlyProValThrProLeuAspAlaSer 60AspPheAlaLeuAspIleArgMetProGlyValThrProLysGluSerAspThrTyrPhe 80CysMetSerMetArgLeuProValAspGluGluAlaPheValIleAspPheLysProArg 100AlaSerMetAspThrValHisHisMetLeuLeuPheGlyCysAsnMetProSerSerThr 120GlySerTyrTrpPheCysAspGluGlyThrCysThrAspLysAlaAsnIleLeuTyrAla 140TrpAlaArgAsnAlaProProThrArgLeuProLysGlyValGlyPheArgValGlyGly 160GluThrGlySerLysTyrPheValLeuGlnValHisTyrGlyAspIleSerAlaPheArg 180AspAsnHisLysAspCysSerGlyValSerValHisLeuThrArgValProGlnProLeu 200IleAlaGlyMetTyrLeuMetMetSerValAspThrValIleProProGlyGluLysVal 220ValAsnAlaAspIleSerCysGlnTyrLysMetTyrProMetHisValPheAlaTyrArg 240ValHisThrHisHisLeuGlyLysValValSerGlyTyrArgValArgAsnGlyGlnTrp 260ThrLeuIleGlyArgGlnAsnProGlnLeuProGlnAlaPheTyrProValGluHisPro 280ValAspValThrPheGlyAspIleLeuAlaAlaArgCysValPheThrGlyGluGlyArg 300ThrGluAlaThrHisIleGlyGlyThrSerSerAspGluMetCysAsnLeuTyrIleMet 320TyrTyrMetGluAlaLysTyrAlaLeuSerPheMetThrCysThrLysAsnValAlaPro 340AspMetPheArgThrIleProAlaGluAlaAsnIleProIleProValLysProAspMet 360ValMetMetHisGlyHisHisLysGluAlaGluAsnLysGluLysSerAlaLeuMetGln 380GlnProLysGlnGlyGluGluGluValLeuGluGlnAspPro 394

3、含有权利要求1所述氧化酶基因的重组病毒，其特征在于是通过昆虫杆状病毒转移表达质粒pBacPHM2和修饰的苜蓿尺蠖核多角体病毒BacPAK6线性化DNA共转染秋粘虫细胞Sf21而获得的根据保藏登记号为CGMCC No.0295的重组病毒BacPHM。

4、如权利要求2所述的重组大鼠酰胺化酶的氧化酶，其特征在于是通过保藏登记号为CGMCC No.0295的重组病毒BacPHM感染秋粘虫细胞Sf21后表达所得的重组单功能酰胺化酶的氧化酶。

5、权利要求1所述重组大鼠酰胺化酶的氧化酶基因的应用，其征在于利用该重组氧化酶基因来制备能对甘氨肽进行酰化修饰加工的如权利要求2所述的酰胺化酶的氧化酶。