KR100868047B1

KR100868047B1 - 홍합 접착단백질 Ｍｇｆｐ-5 및 이의 생산방법

Info

Publication number: KR100868047B1
Application number: KR1020020047815A
Authority: KR
Inventors: 차형준; 황동수
Original assignee: 주식회사 포스코; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 2002-08-13
Filing date: 2002-08-13
Publication date: 2008-11-10
Also published as: KR20040015532A

Abstract

본 발명은 홍합 접착단백질 Mgfp-5 및 이의 생산방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 신규한 mgfp-5 유전자, 이를 포함하는 벡터, 이를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 생산된 재조합 Mgfp-5에 관한 것으로, 본 발명을 통하여 접착활성을 가지는 재조합 접착단백질을 경제적이면서도 대량으로 생산하여 화학접착제 대용으로 사용할 수 있다.

홍합, 접착단백질, Mgfp-5, 벡터, 형질전환체

Description

홍합 접착단백질 Ｍｇｆｐ-5 및 이의 생산방법{ADHESIVE PROTEIN Mgfp-5 ISOLATED FROM MUSSEL AND METHOD OF PRODUCING SAME}

도 1은 미틸러스 갈로프로빈시얼리스로부터 추출한 RNA를 주형으로 Mgfp-5 단백질 cDNA 단편을 RT-PCR하여 전기영동한 사진이고,

도 2는 본 발명의 Mgfp-5 단백질의 염기 서열을 Mefp-5의 염기 서열과 비교한 것이고,

도 3은 본 발명의 Mgfp-5 단백질의 아미노산 서열을 Mefp-5의 아미노산 서열과 비교한 것이고,

도 4는 pTrcHis 벡터에 mgfp-5 cDNA를 삽입하여 pMDG05 벡터를 제작하는 과정을 나타내는 것이고,

도 5는 배양 시간에 따른 재조합 Mgfp-5를 생산하는 BL21 대장균 세포의 성장을 비교균주인 pTrcHis 벡터로 형질전환된 대장균과 비교하여 나타낸 그래프이고,

도 6은 발현 유도 후 시간에 따른 재조합 Mgfp-5의 발현을 SDS-PAGE(A)와 웨스턴블롯(B)으로 분석한 것이고,

도 7은 대장균에서 발현된 재조합 Mgfp-5의 용해도(solubility)를 조사하기 위하여 전세포, 세포파쇄물 및 세포 상등액을 준비하여 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴블롯(B)으로 분석한 것이고,

도 8은 친화크로마토그래피를 이용하여 재조합 Mgfp-5를 정제한 크로마토그래프(A) 및 재조합 Mgfp-5의 SDS-PAGE 분석 사진(B)이고,

도 9는 기준 아미노산 혼합물(A)과 분리정제된 재조합 Mgfp-5(B)의 아미노산 조성분석을 통한 스펙트럼 도면이고,

도 10은 재조합 Mgfp-5의 화학적 수정을 확인하기 위하여 티로시나제(tyrosinase)에 의한 타이로신의 도파 및 도파 퀴논으로의 전환을 측정한 그래프이다.

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 홍합 접착단백질 Mgfp-5 및 이의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 mgfp-5 유전자, 이를 포함하는 벡터, 이를 포함하는 형질전환체 및 상기 형질전환체로부터 생산된 재조합 Mgfp-5에 관한 것이다.

[종래기술]

해양 생명체인 홍합(mussel)은 접착단백질(adhesive protein)을 생산, 분비함으로써 홍합 자신을 바다 속의 바위와 같은 젖은 고체표면에 단단히 부착할 수 있어, 파도의 충격이나 바닷물의 부력 효과에 영향을 받지 않는다(J.H. Waite 등, 1983, Biological Review 58, 209-231).

홍합 접착단백질은 현재 알려진 화학합성 접착제와 비교하였을 때 강력한 자연 접착제로 알려져 있으며, 대부분의 에폭시 수지보다 약 두 배 정도의 높은 인장강도를 나타내면서도 휘어질 수 있는 유연성을 가지고 있다. 또한 홍합 접착단백질은 플라스틱, 유리, 금속, 테플론 및 생체물질 등의 다양한 표면에 접착할 수 있는 능력을 가지고 있으며, 젖은 표면에 몇 분 안에 붙을 수 있다. 이러한 특성은 아직까지 화학접착제 분야에서 미완의 과제로 남아있다.

또한 접착단백질은 인간세포를 공격하거나 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 수술시 생체조직의 접착이나 부러진 치아의 접착 등의 의료분야에 응용 가능성이 크다(J. Dove 등, 1986, Journal of American Dental Association 112, 879).

홍합접착단백질이 기질의 표면에 접착하는 기작은 타이로신 잔기의 화학적 수정에 의한 것으로 보고되고 있다(T.J. Deming, 1999, Curremt Opinion in Chemical Biology 3, 100-105; M. Yu 등, 1999, The Journal of American Chemical Society 121, 5825-5826). 대부분의 홍합 접착단백질에서 전체 아미노산 서열에서 타이로신이 차지하는 비중이 약 20-30 %이다. 접착단백질내의 타이로신에는 수화과정을 통하여 OH기가 첨가되어 도파(Dopa)로 변하고, 이 도파가 표면에의 접착에 가장 주된 역할을 수행하는 것으로 추정되고 있다. 또한 도파는 산화과정을 거쳐 최종적으로 도파 퀴논(Dopa o-quinone)으로 변화되는데 이 도파 퀴논은 접착단백질들 사이의 가교화(cross-linking)을 일으키게 함으로써 접착을 견고하게 하는 역할을 수행한다(J.H. Waite, 1990, Comparative Biochemistry Physiology Part B 97, 19-27).

현재 홍합 접착단백질은 추출(extraction)에 의하여 생산되고 있다. 그러나 1 g의 자연 접착단백질을 추출하는데 10,000마리의 홍합이 사용되어, 홍합 접착단백질 1 g에 7만5천불정도의 매우 높은 가격대가 형성되어 있다.

홍합 단백질에 대한 연구는 미틸러스 에둘리스(Mytilus edulis), 미틸러스 갈로프로빈시얼리스(Mytilus galloprovincialis) 및 미틸러스 코루스커스(Mytilus coruscus)에 대해서 이루어졌다(T.J. Deming, 1999, Curremt Opinion in Chemical Biology 3, 100-105).

지금까지 홍합접착단백질에 대한 연구는 크게 다양한 홍합단백질들의 개발과 유전자 재조합 기술을 이용한 대량생산으로 나누어 이루어지고 있다. 보고된 홍합접착단백질로는 Mefp(Mytilus edulis foor protein)-1, Mgfp(Mytilus galloprovincialis foor protein)-1, Mcfp(Mytilus coruscus foor protein)-1, Mefp-2, Mefp-3, Mgfp-3 등이 있다(T.J. Deming, 1999, Curremt Opinion in Chemical Biology 3, 100-105; V. Vreeland, 1998, Journal of Phycology 34, 1-8). 그러나 최근의 연구결과에서 Mefp-1은 홍합접착단백질이 분비되는 족사(byssus)의 표면에 분포하고 있는 것이 발견되어서, Mefp-1이 접착에 크게 관여하는 단백질이 아니며 물 속에서 접착제를 보호해주는 코팅제의 역할을 하는 것으로 추정되고 있으며(T.J. Deming, 1999, Curremt Opinion in Chemical Biology 3, 100-105; L.M. Rzepecki 등, 1992, Biological Bulletin 183, 123-137), 홍합 접착단백질이 접착하는 기질과 가장 가까운 곳에 존재하는 단백질 Mefp-5가 발견되 고 그 염기서열 및 아미노산 서열이 분석되었다(J.H. Waite 등, 2001, Biochemistry 40, 2887-2893).

한편, Mefp-1 접착단백질은 10개의 아미노산으로 이루어진 데카펩타이드(decapeptide) 구조가 80번 정도 반복되는 염기 서열을 가지고 있고, 비슷한 홍합종인 미틸러스 갈로프빈시얼리스와 미틸러스 코루커스에서도 유사한 염기 상동성을 가지며, 반복되는 데카펩타이드에서 x-Y-x-x-x-Y-K라는 모티프를 공통적으로 가지고 있다(K. Inoue 등, 1996, Journal of Molecular Evolution 43, 348-356). 이러한 특수한 구조 때문에 많은 연구자들이 Mefp-1이나 Mgfp-1과 상동성을 가지는 단백질을 클로닝하고, 대장균, 효모 및 곤충 등의 재조합 시스템에서 유전학적으로 대량생산하려고 시도하였으나 단백질의 발현에는 실패하여 왔다. 또한, 발현의 문제를 극복하기 위하여 시도되었던 데카펩타이드 구조를 모방하여 10번 이내로 반복하게 하는 cDNA를 인공적으로 설계한 모델펩타이드의 경우 발현은 성공적으로 확인되었으나 접착능력은 매우 미미한 것으로 알려져 있다(M. Kitamura 등, 1999, Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry 37, 729-736).

상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 미틸러스 갈로프빈시얼리스로부터 분리한 신규한 접착단백질 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 미틸러스 갈로프빈시얼리스로부터 분리한 신규한 접착단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 접착단백질을 생물학적 활성을 지닌 상태로 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 접착단백질을 효율적으로 생산하는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 형질전환체로부터 생산 및 분리된 재조합 접착단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 mgfp-5 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 Mgfp-5를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 mgfp-5 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 형질전환체로부터 생산된 재조합 Mgfp-5를 제공한다.

또한 본 발명은 (a) mgfp-5 유전자를 발현가능하도록 포함하는 pMDG05(KCTC 10291BP) 벡터를 제조하는 단계, (b) 상기 pMDG05 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계, (c) 상기 형질전환체를 배양하고, 재조합 Mgfp-5의 발현을 유도하여 재조합 Mgfp-5를 생산하는 단계 및 (d) 상기 재조합 Mgfp-5를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 Mgfp-5 단백질 생산방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 홍합의 한 종류인 미틸러스 갈로프로빈시얼리스로부터 신규한 접착단백질 유전자를 획득하였으며, 이로부터 번역되는 접착단백질을 대장균으로부터 생산하는 시스템을 확립하였다.

본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein-5) 유전자를 제공한다. 상기 mgfp-5 유전자의 일예로, 염기서열을 서열번호 3으로 기재한다.

서열번호 3의 mgfp-5 유전자 및 서열번호 4의 Mgfp-5 아미노산 서열을 기존에 보고된 서열과 비교 검색하였을 때, 아직까지 보고된바 없는 신규한 서열임을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명은 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 mgfp-5 유전자를 포함하는 벡터를 제공한다. 상기 벡터는 mgfp-5를 발현가능하도록 포함하는 것으로, 더욱 바람직하게는 원핵생물 또는 진핵생물에서 Mgfp-5를 발현할 수 있는 벡터이다.

상기 벡터의 구체적인 예로는 pGEM-T/mgfp-5 및 pMDG05일 수 있다. pGEM-T/mgfp-5는 클로닝용 벡터로, pGEM-T 벡터의 PstI/EcoRI 제한효소자리에 mgfp-t가 삽입되어 있으며, pMDG05는 대장균 발현용 벡터로, pTrcHisA 벡터의 PstI/EcoRI 제한효소자리에 mgfp-5가 삽입되어 있다. 상기 pMDG05는 trc 프로모터를 포함하고 있어 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside)를 이용하여 발현을 유도할 수 있으며, 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 단백질 분리정제를 위한 히스티딘(histidine) 친화성 리간드(affinity ligand)를 위한 유전서열이 mgfp-5 유전자의 앞에 존재한다. 상기 pMDG05 벡터는 대한민국 대전시 유성구 어은동에 소재한 한국생명공학연구원(KCTC)에 2002년 6월 20일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 10291BP를 받았다.

또한 본 발명의 상기의 벡터가 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 상기 형질전환체는 원핵생물유래 세포 또는 진핵생물유래 세포를 숙주로 하여 상기 mgfp-5 유전자를 포함하는 벡터를 도입하여 제조할 수 있다. 구체적인 예로 본 발명에서는 E. coli BL21/pMDG05를 제공한다.

E. coli BL21/pMDG05는 통상의 LB 백지에서 배양할 수 있으며, 조합 Mgfp-5 단백질의 발현을 유도하기 위하여 IPTG를 첨가할 수 있다. 바람직한 재조합 Mgfp-5의 발현방법은 LB(5 g/liter yeast extract, 10 g/liter Tryptone, 10 g/liter NaCl) 배지에 배양하고, 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.6 내지 0.9 일 때 IPTG를 0.1 내지 10 mM 첨가하여 2시간 내지 7시간 배양하는 것이다.

상기의 방법으로 발현시킨 재조합 Mgfp-5는 수용성형태로 생산되며, 세포파쇄물을 니켈 레진이 충진된 컬럼으로 크로마토그래피를 실시하여 재조합 Mgfp-5를 정제할 수 있다.

또한 본 발명은 재조합 Mgfp-5 생산방법을 제공한다. 상기 생산방법은 (a) mgfp-5 유전자를 발현가능하도록 포함하는 pMDG05(KCTC 10291BP) 벡터를 제조하는 단계, (b) 상기 pMDG05 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계, (c) 상기 형질전환체를 배양하고, 재조합 Mgfp-5의 발현을 유도하여 재조합 Mgfp-5를 생산하는 단계 및 (d) 상기 재조합 Mgfp-5를 분리 및 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명의 재조합 Mgfp-5는 접착활성을 가져 접착제용도로 사용할 수 있다. 접착활성은 재조합 Mgfp-5내 아미노산들 중 타이로신의 수정실험에 의하여 확인한 것이다. 타이로신은 티로시나제에 의하여 도파로 수정되고, 상기 도파는 도파퀴논으로 변형되는데, 도파 및 도파퀴논은 접착단백질의 표면 접착에 작용하는 것으로 알려져 있다.

따라서, 본 발명에서는 신규한 mgfp-5 유전자, Mgfp-5를 클로닝하였을 뿐만 아니라 재조합 Mgfp-5를 접착활성을 가진 형태로 형질전환체에서 생산할 수 있는 방법을 확립하였다. 이에 Mgfp-5 단백질 및 재조합 Mgfp-5는 다양한 기질에 대한 접착제로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 인체에 무해하여 의약품으로 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: mgfp-5 유전자의 클로닝

포항의 죽도시장에서 홍합(M. galloprovincialis)을 구입하고, 얼음 속에 보관하여 실험실로 운반한 다음 홍합의 발 부분을 잘라두었다. 홍합의 발로부터 총 RNA를 산 구안디늄 티오시아네이트 페놀-클로로포름 방법(acid guandinium thiocyanate phenol-chloroform method)으로 분리하였다 (P. Chomczynski 등, 1987, Analytical Biochemistry 162, 156-159).

수득한 총 RNA를 주형으로 하여 MLV 역전사 효소(reverse transcriptase; Gibco-BRL, 미국)와 oligo-dT 12~18 프라이머(Gibco-BRL)를 이용하여 한 가닥(single strand) cDNA를 합성하였다. 얻고자 하는 염기서열이 최근에 보고된 mefp-5 염기 서열(J.H. Waite 등, 2001, Biochemistry 40, 2887-2893)과의 상동성이 있을 것으로 판단하고 PCR을 위한 프라이머 세트로 서열번호 1의 mgfp-5-U와 서열번호 2의 mgfp-5-D를 설계, 제작하여 cDNA를 주형으로 PCR하여 234bp 크기의 cDNA를 수득하였고 이를 mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein-5) cDNA라 명하였다(도 2).

mgfp-5 cDNA는 TA 클로닝 벡터인 pGEM-T(Promega, 미국)에 넣어 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석 결과, 유전자 mgfp-5의 분비서열(secretion signal sequence)을 제외한 서열은 서열번호 3에, 이로부터 코딩되는 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타내었다.

mefp-5와의 유전자 서열 유사성 분석(Bio-Edit Sequence Alignment Editor, Department of Microiology, Northcarolina State University)을 실시하였고, 그 결과 mgfp-5 유전자는 염기서열비교에서 mefp-5와 94% 일치하였고(도 2), 코딩되는 아미노산 서열도 14번째 아미노산이 알라닌(alanine)에서 쓰레오닌(threonine)으로 치환되어 있으며 68번째와 72번째에 라이신(lysine)과 글라이신(glycine)이 첨가된 것으로 나타났다(도 3).

실시예 2: Mgfp-5의 유전학적 생산을 위한 벡터제작

pGEM-T 벡터에 들어있는 mgfp-5 cDNA를 PstI과 EcoRI 제한효소자리(restriction enzyme site)를 이용하여 분리한 후 PstI과 EcoRI 제한효소로 잘려진 pTrcHisA 벡터(Invitrogen, 미국)에 삽입하여, pMDG05(4630bp)를 제 조하였다(도 4). pMDG05는 대한민국 대전시 유성구 어은동에 소재한 한국생명공학연구원(KCTC)에 2002년 6월 20일자로 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 10291BP를 받았다.

pMDG05 벡터는 대장균 발현용 프로모터인 trc 프로모터를 포함하고 있어 IPTG(isopropylthio-β-D-galactoside, Sigma, 미국)를 이용하여 발현을 유도할 수 있으며, 친화크로마토그래피(affinity chromatography)를 이용한 단백질 분리정제를 위한 히스티딘(histidine) 친화성 리간드(affinity ligand)를 위한 유전서열이 mgfp-5 유전자의 앞에 존재한다.

실시예 3: Mgfp-5를 생산하는 형질전환체의 제조

pMDG05 벡터는 클로닝용 E. coli Top10(Invitrogen) 및 단백질 발현용으로 사용된 E. coli BL21에 각각 CaCl₂ 버퍼를 사용하여 컴피턴트(competent) 세포를 만든 후 열충격(42 ℃에서 2분간 방치)방법에 의해 형질전환하였다. 형질전환된 콜로니의 선별은 앰피실린(ampicillin, Sigma)을 사용하여 수행하여, E. coli Top10/pMDG05 및 E. coli BL21/pMDG05을 수득하였다.

실시예 4: Mgfp-5의 생산

(1) E. coli BL21/pMDG05으로부터 Mgfp-5의 발현

E. coli BL21/pMDG05는 LB(5 g/liter yeast extract, 10 g/liter Tryptone, 10 g/liter NaCl) 배지에 배양하고, 배양액의 흡광도가 600 nm에서 0.8 정도가 되었을 때 IPTG를 첨가(1 mM)하여 재조합 접착단백질인 Mgfp-5의 발현을 유도하였다. 이때 50 ㎖ 멸균된 튜브에 10 ㎖의 LB 배지를 넣고(500 ㎍의 앰피실린 첨가) 12시간 키운 배양액을 100 ㎖의 LB 배지가 들어있는 500 ㎖ 플라스크에 넣어 접종하였다.

E. coli BL21/pMDG05의 배양시간별 세포성장을 E. coli BL21/pTrcHis와 비교하였고, 도 5에 성장그래프로 나타내었다. 도 5에서, E. coli BL21/pMDG05는 IPTG로 발현 유도 후 곧 성장이 멈추는 것으로 확인되었다. 이러한 현상은 발현유도 시점을 다르게 하여 배양한 경우에도 조금의 차이는 있었으나 거의 동일하였다.

(2) Mgfp-5의 발현양상 측정

재조합 Mgfp-5 접착단백질의 발현을 분석하기 위하여, IPTG 첨가후 시간에 따른 배양액을 수집한 다음 이를 SDS-PAGE한 다음 웨스턴블롯을 실시하였다.

매시간 마다 배양액으로부터 얻은 1 ㎖의 시료를 4 ℃, 10000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액을 제거한 전세포 시료는 -80 ℃에서 보관 후 분석시 사용하였다. 전세포 시료는 SDS-PAGE용 완충액(0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, 10 % glycerol, 5 % SDS, 5 % β-mercaptoethanol, 0.25 % bromophenol blue) 100 ㎕에 희석하고, 100 ℃에서 5분간 끓여 변성시켰다. SDS-PAGE의 경우 시료를 15% SDS-폴리 아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후 쿠마시블루(Coomasie blue) 염색 또는 실버염색(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 단백질 밴드를 검출하였다. 웨스턴블롯의 경우는 시료를 15% SDS-폴리 아크릴아마이드 젤에 전기영동한 후, 나이트로셀룰로즈 막에 15 V 전압하에 이동시켰다. 단백질이 전이된 나이트로셀룰로즈 막을 모노클로날 히스티딘 친화성 리간드 항체(R&D Systems, 미국)를 이용, Mgfp-5 단백질을 발색반응 후 검 출하였다.

도 6은 재조합 Mgfp-5의 발현유도 후 시간에 따른 발현양상을 나타낸 전기영동사진(A) 및 웨스턴 블롯사진(B)이다. 재조합 Mgfp-5은 대장균의 다른 단백질들에 비하여 약 16 kDa 크기의 진한 밴드로 발현되었으며, 이의 발현량은 전체단백질의 약 10 내지 13 %에 해당되었다. 또한 재조합 Mgfp-5는 발현 유도 후 발현은 증가되다가 약 4-5 시간 되었을 때 최대로 이루다가 그 후 발현양이 단백질 분해효소에 의하여 분해되어 줄어드는 것으로 확인되었다.

(3) 재조합 Mgfp-5의 발현형태 분석

재조합 Mgfp-5의 발현형태를 확인하기 위하여 세포시료를 전세포 시료와 세포를 파쇄(초음파 방법의 이용) 후 세포 파쇄물과 상등액으로 나누어 각각 SDS-PAGE와 웨스턴블롯을 수행하였다.

도 7은 E. coli BL21/pMDG05 배양액으로부터 분리한 세포상등액 및 세포 파쇄물의 전기영동사진(A) 및 웨스턴블롯사진(B)이다. SDS-PAGE와 웨스턴블롯 모두에서 세포 상등액의 경우 Mgfp-5 밴드가 진하게 검출된 반면, 세포 파쇄물의 경우에는 매우 미미한 양만이 검출됨으로써 재조합 Mgfp-5는 대장균에서 수용성 형태로 발현됨을 알 수 있었다. 이러한 수용성의 형상은 접착단백질의 활성을 위하여 단백질을 재접힘(refolding)공정과 같은 단계가 필요없이 분리정제 후 바로 이용할 수 있다는 장점을 가진다.

실시예 4: 재조합 Mgfp-5의 분리 및 정제

E. coli BL21/pMDG05에서 수용성 형상으로 발현되는 재조합 Mgfp-5 을 분리 정제하기 위하여 pMDG05 벡터에 들어 있는 히스티딘 친화성 리간드를 이용하여 친화크로마트그래피를 수행하였다.

실시예 3과 동일한 방법으로 E. coli BL21/pMDG05을 배양한 다음 재조합 Mgfp-5의 발현을 유도하였고, 배양한 대장균 세포를 원심분리 후 파쇄용 버퍼(50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH8.0)에 넣어 약 50배정도 농축한 후 1 ㎎/㎖ 라이소자임(lysozyme, Bio Basic Inc., 캐나다)을 첨가하고, 4 ℃에서 20분간 반응시켰다. 이후 초음파 파쇄기(sonicator)를 이용하여 얼음위에서 200 W로 10초간 파쇄하고, 15초 냉각하는 공정을 30회 반복하여 세포파쇄를 완료하였다. 파쇄된 대장균 시료를 14,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 세포파쇄물을 제거하고, 세포상등액만을 분리하여 분리정제를 위한 시료로 이용하였다.

친화크로마토그래피용 컬럼은 5 ㎖ 의 Hi TrapTM Chelating HP(Amersham Bioscience, 스웨덴)을 이용하였으며, 5 ㎖ 0.1 M NiSO₄를 흘려서 니켈이온을 컬럼 충전물에 충전시켰다. 전체적인 분리정제는 Acta Prime Purification System(Amersham Bioscience)을 이용하였다. 컬럼을 10 ㎖의 결합(binding)버퍼(20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH7.4)로 평형화(equilibration)시키고, 10 ㎖의 세포상등액 시료를 넣었다. 컬럼은 결합버퍼로 충분히 세척하고, 20 ㎖의 분리(elution)버퍼를 이미다졸 농도구배로 흘려주면서 재조합 Mgfp-5를 분리, 정제하였다. 고농도의 이미다졸을 제거하기 위하여 소듐포스페이트 버퍼(pH7.4)에서 4 ℃에서 12시간 이상 투석(dialysis, Spectra/Por^ⓡ molecularporous membrane tubing, Spectrum Lab., 미국)하였다. 분리정제된 재조합 Mgfp-5의 순도 및 수율은 은염색을 이용한 SDS-PAGE를 통하여 분석하였다.

도 8은 친화크로마토그래피를 이용한 재조합 Mgfp-5의 분리정제 크로마토그래프(A) 및 분리정제된 Mgfp-5의 순도(purity) 조사를 위하여 실시한 SDS-PAGE 사진(B)이다. 도 8에서, 친화크로마토그래피를 통하여 분리된 재조합 Mgfp-5는 약 95% 정도의 순도를 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 5: 재조합 Mgfp-5의 아미노산 분석

재조합 Mgfp-5의 아미노산 서열을 아미노산분석기(Hewlette Packard, 미국)로 분석하였다.

기준 아미노산 혼합물의 스펙트럼으로부터 각 아미노산들의 잔여시간(retension time)과 정량화 기준을 얻은 후 Mgfp-5 말단으로부터 순차적으로 분리된 아미노산의 스펙트럼을 통하여 아미노산 서열을 분석하였다. 기준 아미노산 혼합물의 스펙트럼(도 11A)으로부터 각 아미노산들의 잔여시간(retension time)과 정량화 기준을 얻은 후 재조합 Mgfp-5을 각 아미노산들로 분해하기 위하여 염산(HCl)과 고온으로 처리하여 얻은 시료의 스펙트럼(도 11B)을 통하여 각 아미노산 잔기들의 조성을 분석하였다. 분석결과는 하기 표 1에 나타내었다.

Amino Acid	Predicted composition (%)	Experimental composition (%) (±30%)
Ala(A), Pro(P)	3.39	4.19
Arg(D), Asn(N)	6.78	9.06
Glu(E), Gln(Q)	5.08	5.89
Cys(C)	0.85	-
Gly(G)	18.64	26.34
His(H)	9.32	9.23
Iso(I)	0.85	2.15
Leu(L)	2.54	2.35
Lys(K)	14.41	12.44
Met(M)	3.39	3.77
Phe(F)	-	-
Ser(S)	11.02	8.49
Thr(T)	1.69	1.81
Trp(W)	0.85	-
Tyr(Y)	16.95	14.28
Val(V)	-	-
Total	100	100

일반적으로 아미노산 조성분석의 경우 단백질의 분해과정에서의 아미노산의 손실 등이 나타나기 때문에 약 30% 정도의 오차가 생기는 것으로 알려져 있으므로, 분석을 통하여 나타난 아미노산 잔기들의 조성 및 비율은 mgfp-5 염기서열로부터 코드화되어 계산된 아미노산 잔기들의 조성 및 비율과 거의 일치하는 결과를 보였다(표 1). 이로부터 E. coli BL21/pMDG05로부터 발현 및 분리된 단백질이 홍합 접착단백질인 Mgfp-5임을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 재조합 Mgfp-5의 접착활성 검증

홍합 접착단백질의 아미노산 중에서 타이로신 잔기는 화학적 수정을 통하여 도파, 그리고 더 나아가 도파 퀴논으로 바뀌며, 이렇게 수정된 도파 및 도파 퀴논은 표면에의 접착에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 화학적 수정을 매개할 수 있는 버섯유래의 티로시나제(tyrosinase) 효소를 이용하여 재조합 Mgfp-5의 화학적 수정을 조사하였다.

25 units/㎖의 버섯 티로시나제를 4.2 ㎍/㎖의 재조합 Mgfp-5와 혼합하고, 실내온도에서 반응시키면서 화학적 수정의 정도를 흡광도의 변화를 통하여 조사하였다. 도파의 형성은 280 nm에서 흡광도를 측정하였고, 도파 퀴논의 형성은 395 nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 10은 재조합 Mgfp-5의 수정에 의한 도파 및 도파퀴논의 형성을 흡광도로 측정한 그래프이다. 도 10에서, 도파는 반응초기에 타이로신으로부터 빠르게 변형되어 형성되었으며, 3시간 이후로부터 흡광도의 증가폭이 감소하면서 조금씩 증가되는 양상이 관찰되었다. 또한 도파 퀴논은 타이로신에서 도파로 가는 반응의 다음 반응이므로 반응 2시간까지는 약하게 반응이 일어나다가, 그 이후 급속하게 증가하여 약 반응 4시간 이후부터 계속적인 증가를 관찰할 수 있었다.

또한 티로시나제 반응동안 작은 하얀 물질이 침전되는 현상이 관찰되었다. 이는 재조합 Mgfp-5들 사이의 가교화에 의하여 발생되는 것으로 추측된다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명에서는 신규한 접착단백질인 Mgfp-5를 클로닝하였을 뿐만 아니라 이를 대량생산할 수 있는 방법을 확립하였다. 본 발명의 재조합 Mgfp-5는 수용성 형태로 형질전환체로부터 생산할 수 있어 그 활용이 용이하고, 기존의 화학접착제를 대체할 수 있는 대체 생물접착제로 활용할 수 있으며, 의료용 접착제로 사용할 수 있다.

<110> POSCO Pohang University of Science & Technology <120> ADHESIVE PROTEIN Mgfp-5 ISOLATED FROM MUSSEL AND METHOD OF PRODUCING SAME <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mgfp-5-U <400> 1 ggcctgcagc agttctgaag aatacaaggg 30 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer Mgfp-5-D <400> 2 gggaattctt aactgctacc tccataa 27 <210> 3 <211> 231 <212> DNA <213> Mytilus galloprovincialis <220> <221> CDS <222> (1)..(228) <223> mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein-5) cDNA <400> 3 agt tct gaa gaa tac aaa ggt ggt tat tac cca ggc aat act tac cac 48 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 tat cat tca ggt ggt agt tat cac gga tcc ggc tat cat gga gga tat 96 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 aag gga aag tat tac gga aag gca aag aaa tac tat tat aaa tat aaa 144 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 aac agc gga aaa tac aag tat ctg aag aaa gct aga aaa tac cat aga 192 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 aag ggt tac aag aag tat tat gga ggt ggt agc agt ta g 231 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75 <210> 4 <211> 76 <212> PRT <213> Mytilus galloprovincialis <400> 4 Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His 1 5 10 15 Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr 20 25 30 Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys 35 40 45 Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg 50 55 60 Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser 65 70 75

Claims

서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드를 코딩하는 mgfp-5(Mytilus galloprovincialis foot protein-5) 유전자.
제 1항에 있어서, 상기 mgfp-5 유전자는 서열번호 3의 염기서열로 이루어지는 것인 유전자.
서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 Mgfp-5 단백질.
제 1항에 따른 mgfp-5 유전자를 포함하는 벡터.
제 4항에 있어서, 상기 벡터는 pMDG05(KCTC 10291BP)인 것인 벡터.
제 4항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 6항에 있어서, 상기 형질전환체는 원핵생물유래 세포 또는 진핵생물유래 세포인 것인 형질전환체.
제 6항에 있어서, 상기 형질전환체는 E. coli BL21/pMDG05인 것인 형질전환 체.
제 6항 내지 8항중 어느 한 항에 따른 형질전환체로부터 생산된 재조합 Mgfp-5.
(a) 제 1항 또는 2항의 mgfp-5 유전자를 발현가능하도록 포함하는 pMDG05(KCTC 10291BP) 벡터를 제조하는 단계;

(b) 상기 pMDG05 벡터를 숙주세포에 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;

(c) 상기 형질전환체를 배양하고, 재조합 Mgfp-5의 발현을 유도하여 재조합 Mgfp-5를 생산하는 단계; 및

(d) 상기 재조합 Mgfp-5를 분리 및 정제하는 단계

를 포함하는 Mgfp-5 생산방법.