CN1159340C - 一种大电导钙激活钾通道阻断剂－Martentoxin及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大电导钙激活钾通道阻断剂——Martentoxin及其制备方法和用途。本发明的Martentoxin是由37个氨基酸组成的单链多肽，它的分子量为4060道尔顿，等电点为9.5。本发明还提供了运用分子筛凝胶过滤、离子交换柱层析和高效液相色谱等进行提纯该多肽的方法。还提供了基因克隆该多肽的方法。本发明的多肽是一个优良的钾通道阻断剂。

Description

一种大电导钙激活钾通道阻断剂——Martentoxin及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，本发明描述了一种天然活性多肽——大电导钙激活钾通道阻断剂Martentoxin，它的氨基酸序列，编码该活性多肽的核苷酸序列，Martentoxin与大鼠脑突触体膜钾通道标本结合与竞争的药理特性，以及Martentoxin阻断大鼠肾上腺嗜铬细胞大电导钙激活钾通道的效应，本发明还涉及该活性多肽的纯化，克隆Martentoxin基因的方法，利用大分子相互作用实时分析系统研究Martentoxin同大鼠脑突触体膜钾通道标本结合与竞争的方法，利用全细胞膜片钳研究Martentoxin与大鼠肾上腺嗜铬细胞大电导钙激活钾通道作用的方法。

背景技术

几乎各种器官的所有细胞中，都存在有钾通道[Genome.Biol.1，REVIEWS0004(2000)]。除了几个显著的共同特征，这些钾通道在结构和功能上都有着很大的变异。其主要功能为控制钾离子流，细胞体积，激素及递质的释放，静息电位和神经、肌肉的兴奋性。已有多种化学配体用来研究钾通道的调控机制；其中，高亲和力的天然毒素作为十分有价值的工具物被用来鉴定通道的药理和电生理信号转导。直到现在，已有一大类同源的神经毒素多肽被分离和鉴定。这些天然多肽通过在胞外堵塞入口小孔，抑制了离子通过钾通道的流动[Annu.Rev.Neurosci.20，91-123(1997)]。

在过去的30年中，关于蝎毒素的大量研究表明，其中一类能够特异地影响各种离子通道活性并改变其功能特性[Handbook of neurotoxicology(Chang，L.W.& Dyer，R.S.，eds)Marcel Dekker Inc.，New York.683-716(1995)]。它们多数已被验明是特异阻断钾通道的短链多肽，通常由28-42个氨基酸组成，分子内含有3到4个二硫键[J.Bioenerg.Biomembr.23，615-46(1991)]。这些阻断剂和钾通道孔道的相互作用已被用来研究钾通道的结构和功能。由于钾通道的多样性，已引起了对蝎毒素研究的广泛关注，并期望发现更高选择性的通道配体物质。同时，根据靶钾通道亚型和结构特性的不同，钾通道阻断剂的分类越来越复杂：a)作用于大电导钙激活钾通道(BK_Ca)和/或Kv1.3通道的毒素，如iberiotoxin(IbTX)和charybdotoxin(ChTX)，其特点为在N末端有一个多聚谷氨酰胺，它们的序列同源性为60-70％[J.Biol.Chem.265，11083-11090(1990)；J.Biol.Chem.265，15564-15571(1990)]；b)作用于中电导钙激活钾通道(IKCa)和电压依赖型钾通道(Kv)的毒素，如kaliotoxin(KTX)和agitoxin(AgTX)，它们之间有78-89％的同源性[J.Biol.Chem.267，1640-1647(1992)；Biochemistry 33，6834-6839(1994)]；c)作用于电压依赖型钾通道(Kv)的毒素，如noxiustoxin(NTX)，margatoxin(MgTX)和CllTX1，它们有64-79％的同源性[Carlsberg Res.Commun.47，285-289(1982)；J.Biol.Chem.268，18866-18874(1993)；Biochem.J.304，51-56(1994)]；d)另一类作用于电压依赖型钾通道(Kv)的毒素，如maurotoxin(MTX)，Pi1，Pi2和Pi3，它们之间的序列同源性为54-64％且都有4对二硫键[Eur.J.Biochem.242，491-498(1996)；J.Membr.Biol.152，49-56(1996)]。e)高亲和力地(IC50＜1nM)与apamin敏感的小电导钙激活钾通道(SKCa)结合的毒素，如P05[FEBSLett.320，189-192(1993)]。

东亚钳蝎Buthus martensi Karsch(BmK)广泛分布于中国淮河以北至蒙古和朝鲜地区。目前已从东亚钳蝎粗毒中分离和鉴定了数种特异作用于钠通道的长链调制剂，它们被分别命名为BmK I，BmK II，BmK IT，BmK IT2，BmKAS，BmK AS-1和BmK abT[Toxicon 34，987-1001(1996)；Toxicon 37，519-536(1999)；FEBS lett.479，136-140(2000)；Neuropharmacology.3，352-357(2001)]，7个特异作用于钾通道的短链阻断剂，它们被分别命名为BmTX1，BmTX2，BmKTX，BmP01，BmP02，BmP03和BmP05[Biochemistry 36，13473-13482(1997)；Eur.J.Biochem.245，457-464(1997)；Regulatory Peptides.1-3，85-92(2000)]。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种纯化的大电导钙激活钾通道阻断剂Martentoxin。

本发明的另一目的是提供编码Martentoxin活性多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供从东亚钳蝎粗毒中纯化Martentoxin的方法。

本发明的另一目的是提供从东亚钳蝎基因库中克隆Martentoxin基因的方法。

本发明的进一步目的在于提供一个利用Martentoxin作为研究钾通道组成、电和生物化学特性以及与钾通道相关的生理和病理现象的便利而有用工具的方法。

本发明涉及一种分离的多肽，经分子筛凝胶过滤、离子交换柱层析和高效液相色谱，从东亚钳蝎粗毒中分离纯化的活性多肽，由该多肽蛋白测序部分氨基酸序列<210.>1，设计引物克隆出Martentoxin的全序列，推导出成熟的Martentoxin由37个氨基酸<210>2组成，其分子量经质谱鉴定为4060道尔顿，其等电点经IEF Standards测定为9.5。

利用VNTIsuite 5.5 biosoftware(Informax，USA)进行序列分析比较发现，Martentoxin的氨基酸序列<210>2与已知的大多数短链钾通道配体毒素多肽(包括ChTx类，KTx类，NTx类)的序列同源性为39％-50％，与另两个毒素多肽TmTX和Lqh15-1的序列同源性较高，分别为73％和75％。

本发明还涉及了一种从东亚钳蝎基因库中克隆的多核苷酸，即编码具有<210>2氨基酸序列的多核苷酸，该多核苷酸序列是具有<210>7的核苷酸序列，通过序列分析比较发现，<210>7的核苷酸序列与已知的短链钾通道配体毒素多肽(包括ChTx类，KTx类，NTx类)的编码核苷酸序列在结构上有明显差异，即<210>7在编码区上游存在一个其它相关核苷酸序列不存在的内含子序列——内含子1(参图2b)。

本发明还涉及了一系列Martentoxin的功能特性，包括：利用生物大分子相互作用实时分析系统(BIAcore)鉴定了Martentoxin与大鼠脑突触体结合的动力学特征及Martentoxin与几个已知钾通道配体(ChTx，apamin，TSN，BmP03)结合大鼠脑突触体钾通道的竞争关系；利用膜片钳全细胞记录观察了Martentoxin阻断大鼠肾上腺嗜铬细胞全细胞大电导钙激活钾电流的电生理特性等。

综合BIAcore和膜片钳的结果，发现Martentoxin对大电导钙激活钾通道具有极强的阻断性和高度的选择性，与常用实验室工具药ChTx的作用一致；利用BIAcore测定的数据还表明，Martentoxin与大鼠脑突触体结合的解离时间速率比ChTx高，由此可知，Martentoxin与大电导钙激活钾通道的结合更加牢固。

本发明的活性多肽可以通过分子凝胶过滤，离子交换柱层析和高效液相色谱，从东亚钳蝎粗毒中分离提纯，也可以通过基因克隆表达的方法生产这种多肽。

从东亚钳蝎粗毒中分离提纯该多肽是这样完成的：

首先，将东亚钳蝎粗毒溶解于1-4摩尔/升醋酸溶液中，0-10摄氏度10000-15000rpm高速离心10-20分钟，取上清液于凝胶柱中进行分子筛柱层析分离。继之，利用离子交换柱层析和高效反相色谱进行反复纯化，直至最后得到一个单峰，该单一的蛋白质组分就是本发明的Martentoxin。

毒素的纯度和分子量经电喷雾质谱仪进行鉴定，分子量为4060道尔顿，并用蛋白质测序仪进行Edman自动降解测序，测得该多肽的氨基酸序列。用IEF Standards测定毒素的等电点为9.5

经由上述鉴定后，确定了该多肽的序列和性质，据此，可以通过基因克隆的方法克隆本发明的多肽。利用TRIZOL试剂和Wizard DNA纯化试剂盒，从东亚钳蝎的毒腺中提取Martentoxin的总RNA和总基因DNA。将提取的总RNA反转录为cDNA，在3′RACE中作为模板。根据天然毒素N末端的部分残基序列，设计引物，将天然东亚钳蝎毒素的cDNA扩增。在3’RACE决定的部分序列的基础上，设计和合成反义引物。扩增的PCR片段被纯化并直接连接到pGEM-T载体上，转化大肠杆菌DH5α。重组质粒用T7引物在ABI PRISM 377 DNA序列仪中自动测序。

在确定了Martentoxin及其编码基因结构特征的基础上，进一步利用BIAcore技术鉴定它与大鼠脑突触体膜钾通道的结合及竞争特性。以成年雄性Wistar大鼠制备脑突触体膜。突触体膜的浓度以牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白，采用Bio-Rad蛋白分析法进行蛋白浓度测定。配体-受体相互作用和竞争结合分析在Pharmacia公司的BIAcore上进行。以N-ethyl-N-dimethyl aminepropyl)-carbdiimide和N-hydroxysuccimide溶液活化实验中使用的CM5芯片。Martentoxin溶解于醋酸钠后固定于芯片上。BIAcore动力学结合分析流程如下：首先，不同浓度的脑突触体膜流经被固定的Martentoxin，然后，以一定浓度的脑突触体膜为对照，将Apamin，BmP03，ChTX，Toosendanin(川楝素TSN)与大鼠脑突触体膜孵育，然后流经固定有Martentoxin的芯片。结合和解离常数用BIA Evaluation 1.0和2.0软件包分析。

在鉴定了Martentoxin与钾通道的结合及竞争特性后，运用全细胞膜片钳方法进一步确定Martentoxin对大鼠肾上腺嗜铬细胞大电导钙激活钾通道的阻断效应。将成年Wistar大鼠肾上腺嗜铬细胞经酶解得到单细胞，这些细胞在CO₂培养箱中用DMEM经1-4天的培养，用于实验。运用制真菌素打孔电压钳技术，电压门控膜电流在全细胞电压钳条件下得以记录。通过多通道微灌注系统记录，对照/冲洗用液和毒素吹打在细胞上。NG108-15细胞在35毫米塑料培养皿中进行培养。从成年大鼠的背根神经节中分离得到背根神经元。利用全细胞电压钳记录NG108-15细胞和背根神经元的全细胞钾电流，通过重力加药系统给予正常外液和毒素。

本发明有着如下的效果：

本发明提供了纯化的Martentoxin。

本发明同时还提供了可得到高纯度Martentoxin的纯化方法。

本发明提供了Martentoxin的氨基酸序列。通过序列分析比较发现，该多肽氨基酸序列<210>2与已知的大多数短链钾通道配体毒素多肽(包括ChTx类，KTx类，NTx类)的序列同源性为39％-50％，与两个毒素多肽TmTX和Lqh15-1的序列同源性较高，分别为73％和75％。可以依据本发明确定的Martentoxin的氨基酸序列，化学合成或基因重组Martentoxin及其类似多肽。

本发明提供了Martentoxin完整的cDNA序列，与其它钾通道配体毒素多肽的cDNA序列比较，有崭新的发现。解析Martentoxin的基因谱，发现其分子中有两个内含子，一个(91bp)与其它所有已知蝎毒素多肽一样，座落在靠近信号肽的C-端区，另一个(83bp)却与众不同地座落在5’UTR区。由于增加一个内含子可以显著性地改变编码区的拓扑结构，从而影响基因转录的方式和效率，因此Martentoxin的编码基因是一个新型的短链蝎毒素基因，属于短链蝎毒素基因库中一个新型的组群。

本发明提供了得到Martentoxin完整的cDNA序列的克隆方法，并提供了通过基因工程表达Martentoxin的基础。

本发明在鉴定的Martentoxin及其编码基因结构和特征的基础上，进一步提供了Martentoxin作用于钾通道标本的功能特性如下：

本发明提供了Martentoxin与大鼠脑突触体膜钾通道标本结合的解离常数为4.72±1.54×10^-10摩尔/升，说明Martentoxin与脑型钾通道具有极强的亲和性和强烈的作用。

本发明提供了Martentoxin与大鼠脑突触体膜钾通道标本结合的动力学参数。Martentoxin与大鼠脑突触体膜的结合速率常数约为1.67×10⁴摩尔/升^{- 1}秒^-1，与一个已被商品化的特异作用于钾通道的短链蝎毒素多肽charybdotoxin(约为7.5×10⁸摩尔/升^-1秒^-1)相比，Martentoxin可快速地与大鼠脑突触体膜钾通道标本结合；Martentoxin与大鼠脑突触体膜的解离速率常数约为5.50×10⁶秒^-1，与charybdotoxin(约为1.95×10^-2秒^-1)相比，Martentoxin与大鼠脑突触体膜钾通道标本解离非常慢。以上数据说明Martentoxin对钾通道的结合作用强于charybdotoxin。

本发明提供了Martentoxin对大鼠肾上腺嗜铬细胞大电导钙激活钾通道的阻断作用。100纳摩尔/升Martentoxin具有与等量charybdotoxin相同的药理功效，即可有效地压抑大鼠肾上腺嗜铬细胞约70％的大电导钙激活的钾电流，且其阻遏效应是可逆的。由此可见，Martentoxin是一种强烈的大电导钙激活钾通道的阻断剂。

本发明提供了Martentoxin对大电导钙激活钾通道的选择性作用。在Martentoxin与大鼠脑突触体钾通道标本的结合竞争实验中，50微摩尔/升charybdotoxin可以抑制45.59％的Martentoxin结合，同样浓度的apamin(欧洲短链蜂毒素小肽，特异作用于小电导钙激活钾通道)和BmP03(另一个来自同种蝎毒的短链肽类毒素，可选择性地阻遏一种电压门控钾通道-短暂外向钾通道)则只有轻微的抑制，分别为6.72％和15.49％。

另一方面，在膜片钳全细胞记录中，100纳摩尔/升Martentoxin具有与等量charybdotoxin相同的药理功效，即可有效地压抑大鼠肾上腺嗜铬细胞约70％的大电导钙激活的钾电流，但即使在给药剂量高达300纳摩尔/升的条件下，Martentoxin仅可分别压抑NG 108-15细胞和大鼠背根神经约10％的电压门控钾电流。以上数据清楚表明，Martentoxin是一种选择性作用于大电导钙激活钾通道的阻断剂。

因此，本发明的Martentoxin是一个新型的功能特异的大电导钙激活钾通道阻断剂。可作为实验用大电导钙激活钾通道的选择性阻断剂。可为探讨钾通道的组成、电和生物化学信号特征增添新的有力探针工具物。可作为调节和治疗钾通道相关生理和病理现象的潜在调制剂或药品。Martentoxin的氨基酸序列和核苷酸序列可作为化学合成以及基因重组工程表达该类多肽的基础。。

附图说明

图1a为BmK粗毒的分子筛图谱。将500毫克BmK粗毒Sephadex G-50凝胶柱(2.5×120厘米)层析分离。层析柱经平衡并由0.05摩尔/升、pH 7.5的盐酸洗脱。洗脱的流速为12毫升/小时，5毫升/管。

图1b为组分F-4的离子交换层析图。取200毫克图1(a)的F-4组分在CM Sephadex C-50凝胶柱(2×100厘米)上的离子交换层析。层析柱经平衡并分别由0.01摩尔/升、0.05摩尔/升、0.1摩尔/升、0.25摩尔/升和0.5摩尔/升的NH₄HCO₃缓冲液洗脱。流速为30毫升/小时，5毫升/管。

图1c为组分F-4-7的HPLC图谱。用0.1％TFA和60％乙睛进行梯度洗脱，25℃条件下1毫升/分钟。

图1d为组分F-4-7-0(Martentoxin)的质谱鉴定和等电点测定图(电泳图)。左边为Martentoxin的质谱鉴定图，右边为等电点测定图。等电点测定图中的条带1为Martentoxin，条带2是标样：a)细胞色素c；b)扁豆凝集素；c)人血红蛋白C；d)人血红蛋白A；e)马肌血球素；f)人碳酸酐酶；g)牛碳酸酐酶；h)β-乳球蛋白B；I)藻青蛋白。

图2a为Martentoxin的全基因序列图，图2b为Martentoxin的基因编码图。由Martentoxin cDNA推测得其前体氨基酸序列。N-末端的26个残基是通过Edman降解测定得。外显子和内含子分别用大写和小写表示。成熟多肽用粗体标明。P1、P2为3’RACE，5’RACE的引物，P3，P4为Martentoxin基因扩增的引物。P1、P2、P3和P4一侧的箭头表示作用的方向，P1和P2下面标有下划线的为与P1和P2引物相匹配的核苷酸片段，P3、P4下面标有打点标记的为与P3、P4引物相匹配的核苷酸片段，aataa(下用两条线表明)可能为多肽的Poly(A)信号。Sp：单链；MP：成熟多肽。

图3为Martentoxin与其它蝎毒素钾通道阻断剂的氨基酸序列同源性比较图。如图，这些序列是根据它们共有的六个半胱氨酸(粗体字母)来比对的，为了优化比对，我们引入了空位。其中：

AgTX1(agitoxins)、ChTX(charybdotoxin)、Lqh15-1纯化自Leiuerusquinquest-riatusvar Hebraeus；

BmTx1、BmTx2、BmKTx纯化自Buthus martensi Karsch；

CllTX1纯化自Centmroides limpidus limpidus；

NTX(noxiustoxin)纯化自Centruroides noxiusHoffmann；

LbTX(limbatotoxin)纯化自Centruroides limbatus；

IbTX(iberiotoxin)、TmTX(tamulotoxin)纯化自Buthus tamulus；

KTX(kaliotoxin)纯化自Androctonus mauretanicus mauretanicus；

MgTX(margatoxin)纯化自Centruroides margaritatus.

图4为Martentoxin与大鼠脑突触体膜钾通道标本结合的BIAcore分析图。Martentoxin被固定在CM5芯片上，一系列浓度的突触体膜(38.1-131微克/毫升)流经Martentoxin。芯片用0.1N的NaOH再生，能够保持95％以上的Martentoxin结合活性。

图5a为Martentoxin(M)与TSN(A)，ChTX(B)，Apamin(C)和BmP03(D)对大鼠脑突触体膜结合竞争图，图中I为结合相，II为解离相；图5b为图5a解离相的放大图；图5c为TSN(A)，ChTX(B)，Apamin(C)和BmP03(D)对Martentoxin(M)大鼠脑突触体膜钾通道标本结合的抑制百分比图。在37℃条件下，相同浓度(0.5×10-6摩尔/升)的川楝素TSN(A)、ChTX(B)、Apamin(C)、和BmP03(D)与新鲜制备的突触体膜温育30分钟。然后混合物流经固定在芯片上的Martentoxin。芯片用0.1纳摩尔/升的NaOH再生。

图6为为TSN，ChTX，Apamin和BmP03对Martentoxin大鼠脑突触体膜钾通道标本结合的抑制-剂量图。浓度范围从5纳摩尔/升到50微摩尔/升。随着浓度增加，TSN和ChTX显示出抑制饱和。它们的半饱和浓度IC50分别为约10纳摩尔/升和20纳摩尔/升。

图7a为在大鼠肾上腺嗜铬细胞(RACCs)上记录大电导钙激活钾通道(Bkca)的方法图。根据图7a下方的刺激模式，将从同一个细胞上记录到的两条曲线放在一起。由于在0毫伏的前置电压下，没有钙离子内流，BK通道几乎全部失活，所以0Ca2+电流主要是电压门控钾电流。I(10毫摩尔/升Ca2+)和I(0Ca2+)的差值就是纯的BK电流(n＝15).

图7b为Martentoxin和ChTX对RACCs上Bkca通道效应比较图电流-电压曲线的作用图。在建立了全细胞打孔电压钳(入路电阻＜20兆欧)，就施加图7a中的刺激模式，同时交替施加对照液，Martentoxin(左图)或ChTX(右图).数据表明100纳摩尔/升Martentoxin和100纳摩尔/升ChTX，均几乎完全抑制BK(n＝8)。

图8为Martentoxin和ChTX对RACCs上Bkca电流-电压曲线的作用图。

图8a从-80到80毫伏，通过一串以20毫伏递增的刺激诱导出膜电流。图8a的左图为，正常2毫摩尔/升Ca2+外液；图8(a)的中图为，施加100纳摩尔/升Martentoxin；图8a的右图为，外液含0Ca2+和0.1毫摩尔/升EGTA.

图8b为图8a的外向峰电流和膜电位的关系图。“N”型的电流-电压曲线是典型的BKCa电流特征，原因在于激活了电压门控钙电流。注意“N型”被Martentoxin强烈抑制。当0Ca2+外液施加时，N-型也消失了。这些数据提示Martentoxin抑制BKCa电流。

具体实施方式

下面用实施例详细描述本发明。在下列实施例中，利用各种生物化学手段，将Martentoxin从东亚钳蝎粗毒中分离纯化并鉴定其生化特性。然后利用其氨基酸序列特征，从东亚钳蝎基因库中克隆出编码Martentoxin的基因并分析其构成特性。利用实时生物分子相互作用分析技术，鉴定了Martentoxin与大鼠脑突触体膜的药理结合特性，并进一步分析了Martentoxin和多种已知钾通道配体的竞争结合关系。利用全细胞电压钳方法，分别观察了Martentoxin对大鼠肾上腺嗜铬细胞大电导钙激活钾电流，神经瘤细胞株NG108-15细胞和DRG神经元电压门控钾电流的遏制效应。这些实施例从生化特征，基因组构，药理结合及细胞电生理特性出发，全面而充分地展示了Martentoxin是一个新型的具有独特结构与功能特征的钾通道阻断剂，可为探讨钾通道的组成、电和生物化学信号特征增添新的有力探针工具物。

这些实施例仅仅是例示，而不以任何形式限制本发明。在不违背本发明的基本精神和原则的前提下，对本发明的任何等同替代、改动或改进都将落入本发明待批权利要求的范围内。

实施例1  Martentoxin的纯化和鉴定

约0.2克BmK粗毒(购自中国江苏苏州一养蝎场)溶解于1毫升2摩尔/升的醋酸溶液中，4℃温度下以12500rpm转速离心25分钟。取上清液上样于Sephadex G-50凝胶柱(2.5×120厘米)进行柱层析分离后，得到至少5个组分(参见图1a)。其中的组分F-4通过DEAE-Sephadex A-50层析柱，可进一步分为5个亚组分(参见图1b)。亚组分F-4-7用高效反相色谱(美国Waters公司510型)进行纯化，最后，得到亚组分F-4-7-0(参见图1c)，该多肽被命名为Martentoxin。HPLC柱为Cosmosil C8柱(4.6×150毫米，日本Nakarai公司)。

毒素的纯度和分子量经电喷雾质谱仪(美国Finnigan Corporation)进行鉴定，其质谱图(参见图1d左边部分)为高纯度的单一峰，质谱鉴定其精确分子量为4060Da。

用蛋白质测序仪(Model 477A，Applied BioSystems，USA)进行Edman自动降解测序。经蛋白质测序仪测定得到天然Martentoxin从N-末端到第26位的部分残基序列，其中第8、13和17位应为Cys残基(参见图2a)。

用IEF Standards(Bio-Rad)测定毒素的等电点。IEF标样由9种天然蛋白质组成：藻青蛋白(Phycocyanin，pI为4.45，4.65，4.75)，β-乳球蛋白B(β-Lactoglobulin B，pI为5.10)，牛碳酸酐酶(Bovine carbonic anhydrase，pI为6.00)，人碳酸酐酶(Human carbonic anhydrase，pI为6.50)，马肌血球素(Equine myoglobin，pI为7.00)，人血红蛋白A(Human hemoglobin A，pI为7.10)，人血红蛋白C(Human hemoglobin C，pI为7.50)，扁豆凝集素(Lentil lectin，pI为7.8，8.0，8.2)和细胞色素c(Cytochrome c，pI为9.6)。5微升标样和毒素的混和液用于凝胶电泳。凝胶用Coomassie蓝R-250染料染色。测得Martentoxin的等电点为9.5(参见图1d的右边部分)。

本施例中的溶解时，醋酸的浓度可在1-4摩尔/升选择，旋转的反应温度可在0-10摄氏度，转速可在10000-15000rpm，反应时间可在10-30分钟之间选择。

实施例2  Martentoxin的基因克隆和基因编码结构

基因克隆

利用TRIZOL试剂(Promega，USA)和Wizard DNA纯化试剂盒(Promega，USA)，Martentoxin的总RNA和总基因DNA从蝎子的毒腺中提取。

用Superscript II reverse transcriptase(GIBCO BRL，USA)和一般的Oligo(dT)适配子引物[5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’]扩增，将5微克的总RNA反转录为cDNA。

合成的cDNA在3′RACE中作为模板。根据天然毒素的N末端1-6个残基序列(FGLIDV)，设计了引物1(<210>3)。利用引物1和适配子引物[5′-ATTGAAGCTTACG CGTCGACTA TATT-3′]，扩增天然毒素的cDNA，该PCR扩增在PE-2400(PERKIN ELMER，USA)上进行。

在3’RACE决定的部分序列的基础上，设计和合成反义引物。Martentoxin的基因特异的引物2(<210>4)与<210>2的第30-34个碱基(QNNQC)相对应。前一步骤中合成的cDNA用Glassmax柱(G IBCO BRL USA)分离，通过终端的脱氧核苷酸转移酶在3’端加上同聚核苷酸dC尾，被加上dc尾的cDNA利用引物2和一个锚定引物[5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’]被首次扩增。为了得到更多的特定cDNA，第一次PCR扩增产物被稀释，并利用引物2和一个普遍扩增引物[5’-GGGCACGCGTCGACTAGTAC-3’]，第一次PCR扩增的产物被作为第二次扩增的模板。

根据决定了的Martentoxin的cDNA的5’UTR和3’UTR序列设计的引物，对Martentoxin的基因DNA进行扩增。向前的P3引物(<210>5)对应着5’UTR序列，向后的P4引物(<210>6)对应着3’UTR序列。扩增的PCR片段被纯化并直接连接到pGEM-T载体(Promega，USA)上，转化大肠杆菌DH5α。重组的质粒被纯化并用T7引物在ABI PRISM 377 DNA序列仪(PERKIN ELMER，USA)中自动测序。

利用5’RACE和3’RACE的方法得到Martentoxin的全cDNA序列，开放阅读框含有177bp，编码一个包括22个残基的信号肽序列和37个残基的成熟肽的59个氨基酸残基的Martentoxin前体。多聚腺氨酸信号(AATAAA)定位于终止密码子下游的35bp处。利用对应于cDNA的5’UTR区域和3’UTR区域的P3和P4引物做PCR扩增，直接得到Martentoxin的基因组DNA序列。最后，得到包含有Martentoxin cDNA的三个相同的克隆。在基因组DNA中包含有两个内含子：一个定位于起始密码子(TGA)上游区域从-104碱基到-22碱基处，共有83bp。另一个位于信号肽C末端的Ser后面，共有91bp长。

Martentoxin与其它钾通道阻断剂的序列比较    利用VNTIsuite 5.5biosoftware(Informax，USA)进行序列比较。Martentoxin与其他包含有来自于同一毒腺中的毒素BmTX1，BmTX2和BmKTX的ChTX和KTX组的序列相似性为35-50％，和TmTX和Lqh15-1两个毒素有很高的序列相似性73％和75.5％。

实施例3  Martentoxin与脑突触体的药理结合及竞争特性

首先，选用5-8周龄，250-350克的成年雄性Wistar大鼠，按照贾凌云等描述的方法(贾凌云等，Neuroreport 16，3359-3362，1999)制备脑突触体，突触体膜悬浮液包括(均为毫摩尔/升)：氯化胆碱，140；氯化钙，1.8；氯化钾，5.4；硫酸镁，0.8；D-葡萄糖，10；HEPES-Tris，25，pH值用Tris调至7.4并即刻用于Biosensor分析。流程中所有的缓冲液都含有下列蛋白酶抑制剂：PMSF(50微克/毫升1，Wako Company，Japan)，pepstatin A(1微摩尔/升，Sigma)，iodoaceta-mide(1毫摩尔/升，Wako Company，Japan)和1，10-phenanthroline(1毫摩尔/升，DojindoCompany，Japan)。突触体膜的浓度以BSA作为标准蛋白，采用Bio-Rad蛋白分析法进行蛋白浓度测定。

然后将样品固定和BIACORE分析(贾凌云等，Neuroreport 16，3359-3362，1999)。将400毫摩尔/升的N-ethyl-N-dimethyl aminepropyl)-carbdiimide和100毫摩尔/升的N-hydroxysuccimide(Pharmacia)以1∶1(体积/体积)混匀，取40微升混合液用以活化实验中使用的CM5芯片。同时，将Martentoxin溶解于10毫摩尔/升酸钠中，终浓度为200微克/毫升，以6微升/分钟的速度注射30微升，固定于芯片上。没有反应的芯片基团将被50微升，1摩尔/升ethanolamine hydrochloride(pH 8.0，Pharmacia)所关闭而失活。固定在芯片上的Martentoxin与大鼠脑突触体膜的结合信号记录为共振单位(RU)，该单位直接与结合在芯片上的量成比例。

前述固定在芯片表面上的Martentoxin有350RU。通过注射一系列不同浓度(38.1-131微克/毫升)的大鼠脑突触体膜，流经被固定的Martentoxin，得到了Martentoxin结合动力学。配体-受体相互作用和竞争结合分析在Pharmacia公司的BIAcore上进行。大鼠脑突触体膜能快速地与固化在芯片上的Martentoxin结合，并呈浓度依赖性。流经的缓冲液使得我们可以监控固定在芯片上的Martentoxin与大鼠脑突触体膜的一级解离。Martentoxin结合的动力学如图4所示。结合和解离速率分别为1.67×10⁴摩/升^-1秒^-1and5.50×10-6秒-1(表1)，这些数据说明Martentoxin对钾通道的亲和性远高于ChTX。

表1  生物传感实时分析Martentoxin与大鼠脑突触体膜结合动力学平衡常数

突触体膜浓度(μg/ml)	结合速率常数(×104M-1S-1)	解离速率常数(×10-6S-1)	解离常数(×10-10M)
				131	1.12	8.34	7.48
127	0.94	7.66	8.15
				106	1.28	7.28	5.70

72.7	1.68	3.35	2.00
				38.1	3.35	0.87	0.26
平均值±标准差	1.67	5.50	4.72±1.54

以一定浓度的脑突触体膜为对照(98.7微克/毫升)，与Apamin(Sigma)，BmP03，ChTX(Sigma)和Toosendanin(TSN)(它们的浓度均为0.5微摩/升)在37℃条件下孵育30分钟，然后流经固定有Martentoxin(M)的芯片。结合和解离常数用BIA Evaluation 1.0和2.0软件包分析。图5显示了川楝素(TSN)，ChTX，Apamin和BmP03与Martentoxin在大鼠脑突触体膜上竞争结合的流程图及其抑制百分比。结果表明，以同量的大鼠脑突触体膜(98.7微克/毫升)作为对照，Martentoxin对大鼠脑突触体膜的结合能够被TSN和ChTX显著抑制百分比分别为57.95％和38.62％，而对于Apamin和BmP03，与对照相比，分别只有12.49％和5.25％的Martentoxin结合被抑制。

TSN，ChTX，Apamin和BmP03(从5纳摩/升到50微摩/升)对Martentoxin与大鼠脑突触体膜结合的抑制(图6)表明，TSN和ChTX对其结合的抑制是浓度依赖性的，且该抑制效应在TSN和ChTX达到50微摩/升的时候出现饱和(抑制百分比分别为64.35％和45.59％)，TSN和ChTX的IC₅₀分别为10纳摩/升和20纳摩/升。即使在高达50μM浓度下，BmP03对Martentoxin与大鼠脑突触体膜结合的抑制也很小，抑制百分比仅为6.72％。然而，在0.5，5.0和50μM的浓度范围内，Apamin对Martentoxin与大鼠脑突触体膜结合的抑制效应却表现为是一个钟形曲线，分别有12.49，26.43and15.49％的Martentoxin结合被抑制。由于ChTX是大电导钙激活钾通道的阻断剂，而TSN是广谱的钾通道阻断剂，所以它们对Martentoxin的强烈抑制说明Martentoxin是钾通道，特别是大电导钙激活钾通道的强烈的阻断剂；另一方面，Apamin是小电导钙激活钾通道的阻断剂，BmP03是一种电压门控钾通道的阻断剂，Martentoxin被ChTx强烈抑制，而只被Apamin和BmP03少量抑制，说明Martentoxin对BKca的阻断是选择性的。

实施例4  Martentoxin对全细胞钾电流的阻遏作用

电生理记录  成年Wistar大鼠(250-300g)RACC细胞按如前所述方法培养，经40分钟酶解得到单细胞，这些细胞在CO₂培养箱中用DMEM经1-4天的培养，用于实验。运用制真菌素打孔电压钳技术，电压门控膜电流在全细胞电压钳条件下得以记录。实验设备为Axon 200B(Axon Instruments，Foster City，CA)或者PC-2B(INBIO Inc.，中国，武汉)等运用pClamp8数据获得技术的电压钳放大器。数据分析软件是Igor software(AveMatrix，LackOswego，OR)。标准外液中包括(毫摩/升)：125 NaCl，2.8 KCl，2 CaCl₂，1 MgCl₂，10 HEPES，pH值调至7.4。[0 Ca²⁺]液的配方同上，而在[10 Ca²⁺]液中，10毫摩/升Ca²⁺代替了NaCl。吸管的标准内液包括(毫摩/升)：45 KCl，8 NaCl，1MgCl₂，10 HEPES，nystatin 250ug/ml，pH值调至7.2。所有用液的配方都与洗液相似，除了前者含有特异的药物。通过RCP-2B多通道微灌注系统(INBIOInc.，中国，武汉)记录，对照/冲洗用液和毒素吹打在细胞上，在7个通道中有一个快速的电转换时间(＜100毫秒)。尖布直径100微米的吹管置于离细胞120微米处。通过电导测试的结果，纯水用作灌注液，在运行速度设定为100微升/分钟或更快的条件下，保证RCP-2B使细胞周围的溶液能100％的接近给定条件。

37℃条件下，5％CO₂和95％空气的湿润空气中，NG108-15细胞在35毫米塑料培养皿中进行培养。电极溶液包括(毫摩/升)：KCl，150；MgCl₂，0.8；N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid(HEPES)，10；ethyleneglycolbis(β-aminoethyl ether)-N，N，N’，N’-tetraacetic acid(EGTA)，10；pH值用2毫摩/升的NaOH.调至7.2。

背根神经元从成年大鼠(120±12g)的背根神经节(DRG)中急性分离得到细胞。电极溶液包括(毫摩/升)：KCl，140；MgCl2，2；HEPES，10；EGTA，10；ATP 4；pH值用2毫摩/升的NaOH.调至7.4。

NG108-15细胞和DRG神经元的电压钳记录在室温条件下进行(20-25℃)。全细胞钾电流用玻璃微管记录，当充满内液时，电阻达2-5兆欧。由400毫秒的测试脉冲从-70毫伏的钳制电压激发的膜电流用EPC-9(HEKAelektronik，Germany)放大器测量。记录在2.9千赫下过滤，数据整理并保存在电脑中。

Martentoxin的电生理效应大鼠RACC细胞中BK_Ca电流的膜片箝记录过程如图7所示。依赖Ca²⁺的外向电流的记录利用打孔全细胞模式，用液分别为10毫摩/升和0 Ca²⁺。0 Ca²⁺和10毫摩/升Ca²⁺记录的时间间隔为1分钟。在80毫伏激发的外向电流先于100和0毫伏去极化。在含有10毫摩/升Ca²⁺的溶液中电流比在含有0 Ca²⁺的溶液中大，是因为在0毫伏去极化的时候，有通过电压依赖Ca²⁺通道的电流，在紧接着的80毫伏去极化过程中激活了BK_Ca。在0毫摩/升-Ca²⁺液中，剩余的外向电流是不依赖于Ca²⁺的钾电流。在10毫摩/升Ca²⁺液中，被激活的电流全部是单纯的BK_Ca电流，是在100毫秒去极化脉冲前通过Ca²⁺通道的Ca²⁺流活化的(图7a)。因此，BK_Ca电流可以用10毫摩/升Ca²⁺程序来记录。

图7b显示的是以ChTX为对照，Martentoxin对BK_Ca的作用。左侧显示的是100纳摩/升Martentoxin作用于RACC之前、之中和之后激活的外向电流。Martentoxin曲线为施药5分钟后，而冲洗曲线是在用空白液冲洗后10分钟记录的。右侧显示的是100纳摩/升ChTX作用于另一RACC之前、之中和之后激活的外向电流。ChTX曲线为施药7分钟后，而冲洗曲线是在用空白液冲洗后10分钟记录的。图7显示了Martentoxin具有同ChTX同样强烈地直接阻断Bkca的作用。

如图8所示，100纳摩/升Martentoxin可阻断全部钾电流的60％(均值为57±3％，n＝9)，或者70％的Ca²⁺依赖BK_Ca电流(假定10％的电流不是Ca²⁺依赖的，而是电压依赖的)。与此形成对照的是，100纳摩尔/升ChTX阻断了全部钾电流的80％(均值为74±3％，n＝8)，或者90％的BK_Ca电流。因此，Martentoxin有着ChTX77％的功能。

图8a阐明了RACC中，Martentoxin(100纳摩/升)对去极化脉冲活化的电流影响。为了便于对照，同一个细胞的电流分别在含Ca²⁺(左侧，对照)和缺Ca²⁺(右侧)条件下激活。图8b绘出了外向电流。当用液含有2毫摩/升Ca²⁺，电流-电压曲线呈现一个显著的N形，而当Ca²⁺被除去的时候，多数的外向电流消失了，而且电流-电压曲线中的N形也被消除了。因此，曲线中的N形代表着Ca²⁺依赖的钾电流。Martentoxin可以阻断约60％的N形电流(n＝9)。为了测定SK_Ca通道对BK_Ca可能的影响，采用了图7a所示的流程。实验中，200纳摩/升浓度的apamin存在下，加入Martentoxin吹入缓冲液中。然而，结果发现，有或无apamin(n＝6)对于电流-电压曲线没有明显的变化，这提示在图7和8中Martentoxin所阻断的多数Ca²⁺敏感电流是BK_Ca电流。这与在图7a中得到的结论是一致的，即SK_Ca只占很少的一部分。

另外一个方面，通过全细胞记录定性分析了Martentoxin对背根神经节和NG108-15细胞上Kv电流的抑制作用。结果发现在高达300纳摩/升的Martentoxin下，仅有约10％的电压门控钾电流被抑制。说明Martentoxin对BKca地作用是选择性的。

从上述实验可知，Martentoxin是一个具有独特结构和功能的钾通道阻断剂，是一个性能较优的钾通道阻断剂，同时也是一个可用于研究钾通道组成、电和生物化学信号特征的探针工具物。

序列表

<110>吉，永华

<120>一种大电导钙激活钾通道阻断剂-Martentoxin及其制备方法和用途

<160>7

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>26

<212>PRT

<213>Buthus martensi Karsch

<214>东亚钳蝎

<400>1

Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr

  1               5                  10                  15

Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln

             20                  25

<210>2

<211>37

<212>PRT

<213>Buthus martensi Karsch

<214>东亚钳蝎

<400>2

Phe Gly Leu Ile Asp Val Lys Cys Phe Ala Ser Ser Glu Cys Trp Thr

  1               5                  10                  15

Ala Cys Lys Lys Val Thr Gly Ser Gly Gln Gly Lys Cys Gln Asn Asn

             20                  25                  30

Gln Cys Arg Cys Tyr

         35

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>Buthus martensi Karsch

<214>东亚钳蝎

<220>

<221>misc_feature

<222>(13，17，25)

<223>y＝c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(16，19)

<223>n＝a或g或c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(22)

<223>h＝a或c或t

<400>3

acgatgactt ttyggnytna thgayg                                      26

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>Buthus martensi Karsch

<214>东亚钳蝎

<400>4

ccccgcacat tgattattct                                             20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>Buthus martensi Karsch

<214>东亚钳蝎

<400>5

ctacattttt ccatacaagt                                             20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Buthus martensi Karsch

<214>东亚钳蝎

<400>6

ttcacacatc atttatttta                                              20

<210>7

<211>435

<212>DNA

<213>Buthus martensi Karsch

<214>东亚钳蝎

<400>7

catttttcca tacaagtata aagtcaagta agttgacaat acaatatata attataattt 60

aaaattttgt ctaattttat taatttgttt catttgtgta atttataaag ctgttttcaa 120

ttgtggagaa aatgaaaatt ttttctattc ttttggtagc tctcattatc tgttcaataa 180

gtaagtttca cgttatcttt tcaatttttt tcttttattt gcatgatatg atagtacagt 240

atatagataa caaatacata attatatcta ggcatttgta ctgaggcatt tggactcata 300

gacgtaaaat gttttgcatc tagtgaatgt tggacagctt gcaaaaaagt aacaggatcg 360

ggacaaggaa agtgccagaa taatcaatgt cgatgctact gattaatctt cctaaggttt 420

aaaataaatg atgta                                                  435

Claims (7)

1.一种活性多肽——Martentoxin，其特征在于，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，分子量为4060道尔顿，等电点为9.5。

2.一种多核苷酸，其特征在于，是编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的多核苷酸序列，即SEQ ID No.7的第289-399位的序列。

3.一种多核苷酸，其特征在于，具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。

4.一种从东亚钳蝎粗毒中制备Martentoxin的方法，其特征在于包括以下步骤：

将东亚钳蝎粗毒溶解于1-4摩尔/升醋酸溶液中，0-10摄氏度10000-15000rpm高速离心10-30分钟，取上清液上样于凝胶柱进行柱层析分离，得到至少5个组分；收集蛋白吸收第三峰上阳离子交换柱，收集蛋白吸收第五峰；收集的第五峰成分用高效反相色谱进行反复洗脱纯化，最后得到单峰。

5、一种基因克隆制备Martentoxin的全cDNA的方法，其特征在于包括以下步骤：

利用TRIZOL试剂和Wizard DNA纯化试剂盒，从蝎子的毒腺中提取Martentoxin的总RNA；

利用反转录酶和适配子引物5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’扩增，将总RNA反转录为cDNA；

根据天然毒素的N末端1-6个残基序列设计引物15’-ACGATGACTTTTGGTATGAG-3’；利用引物1和适配子引物配对，以总cDNA为模板，扩增出3’-RACE产物；

以3’-RACE产物的部分序列设计合成反义引物5’-CCCCGCACATTGATTATTCT-3’，即引物2；前一步骤中合成的cDNA经柱纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶在3’端加上同聚核苷酸dC尾，被加上dc尾的cDNA利用引物2和锚定引物5’-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3’，扩增得到dC加尾的cDNA，以得到的产物为模板，利用引物2和普遍扩增引物5’-GGGCACGCGTCGACTAGTAC-3’重新扩增，最后得到高丰度的5’-RACE产物；

将5’-RACE产物和3’-RACE产物进行拼接，得到Martentoxin的全cDNA。

6.一种Martentoxin的用途，其特征在于，SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或SEQ ID No.7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列可用于制备大电导钙激活钾通道的阻断剂。

7、如权利要求6所述的Martentoxin的用途，其特征在于，所述的大电导钙激活钾通道为大鼠肾上腺的嗜铬细胞的大电导钙激活钾通道。

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