CN104946677A

CN104946677A - Bk通道的特异性配体的重组质粒及其重组表达方法

Info

Publication number: CN104946677A
Application number: CN201510158077.6A
Authority: CN
Inventors: 吉永华; 施健; 陶杰; 祝艳
Original assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Current assignee: University of Shanghai for Science and Technology
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2015-09-30

Abstract

本发明涉及一种BK通道的特异性配体的重组质粒及其重组表达方法，该配体质粒为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。本发明提供了体外表达载体pGEX-4T-3的构建以及MarTX体外表达方法的技术参数。本发明所得到的短链蝎毒素MarTX在pGEX-4T-3系统中被成功表达，其分子量和生物活性与天然MarTX 几乎吻合；重组MarTX 可选择性地阻断BK通道（α+β4），部分抑制mKv1.3通道的电流，但对hKv4.2和hKv3.1a没有明显的调制效应。

Description

BK通道的特异性配体的重组质粒及其重组表达方法

技术领域

本发明涉及一种BK通道的特异性配体的重组质粒的重组表达方法。

背景技术

在众多离子通道中，钾离子通道是分布最广泛、亚型最多、结构最复杂的一类离子通道，几乎存在大多数的生物中。钾离子通道控制了广泛的生物功能，其对于动作电位在可兴奋性细胞中的产生和传播有着关键性作用，其激活和失活特性与动作电位的发放模式有着密切关系。钾离子通道的特异性配体在天然产物中的含量微乎其微，难以通过传统的分离纯化手段获得；且由于其分子量小的限制，通过常规体外表达方式，也难以获得有活性的多肽。

目前，虽然已有超过10种短链毒素从东亚短钳蝎（Buthus martensi Karsch）毒中被分离提取出来，然而无一被成功地体外表达，其中就包括BK通道的特异性配体Martentoxin。Martentoxin（MarTX）是一种特异性作用于BK通道的短链肽毒素，由37个氨基酸残基构成（分子量4060 Da），隶属于α-KTX 16亚家族，亦被称为BmTX3B。因此，通过体外表达途径获得天然产物中稀少的Martentoxin，对于充分地解析BK通道的受体位点，及通道与配体相互作用的模式具有重要的推进作用。但仅通过常规的体外表达方法获得重组Martentoxin（rMartentoxin），其产量和活性均不高。

发明内容

本发明的目的在于克服技术中存在的缺陷，提供一种采用分子生物手段针对性地修改体外表达载体pGEX-4T-3，并优化体外表达方法，从而获得重组的rMarTX的方法，该方法具有良好的产量和毒素活性。

本发明利用膜片钳检测了rMarTX对4种钾通道的药理学效应，其对4种钾通道的药理学效应和野生型几乎吻合。

曾有报告提示，重组毒素容易在诸如BL21及其衍生物BL21（DE3）菌株等原核细胞表达系统中形成包涵体，降低了其表达产物的活性和得率。在本研究中，GST-rMarTX融合蛋白始终溶于上清液中，并没有形成包涵体。这或许是由于融合蛋白本身性质与超声破菌的实验条件决定的；冷冻干燥后对rMarTX的重折叠及HPLC的检测也保证了毒素的结构准确和得率。经电生理记录验证，1 μM的rMarTX可有效地抑制BK通道的电流，其IC₅₀和Hill系数与天然毒素十分相近。由此表明，经BL21（DE3）系统表达具有生物活性的rMarTX的途径是可行的。

为了提高毒素的产量，除了pGEX-4T-3载体外，我们还尝试了以下几种异源表达系统（pET32a和pGEX-KG）。遗憾的是，这些系统的产率不及pGEX-4T-3（表1），最后被放弃采用。

表1 各表达载体和大肠杆菌菌株rMarTX的得率

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种BK通道的特异性配体的重组表达方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a．基于MarTX的cDNA序列，涉及两对引物，MarTX-正向引物为：5’-TTCGGATCCTTTGGACTCATAGA-3’，其中包含一个BamH I的酶切位点；MarTX-反向引物为：5’-CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT-3’，其中包含一个Sma I的酶切位点；构建载体质粒pGEX-4T-3-martentoxin；

b．根据设计PCR点突变的引物序列：

其正向引物为：5’-GATGACGATGACAAGTTTGGACTCATAGACGTAAAATGTTTTG-3’，其中包含小肠激酶识别位点的DNA序列；

反向引物是凝血酶酶切位点的DNA序列，该序列为：5’-GGATCCACGCGGAACCAGATC-3’，其中包含一个BamH I位点；以该pGEX-4T-3-martentoxin质粒为模板进行反向PCR，所得产物经纯化回收得该.DNA 回收产物；该反向PCR的反应体系为：pGEX-4T-3-martentoxin 1μl,正向引物 1μl,反向引物 1μl,2.5mmol/L dNTPs 5μl, 10XPCR buffer 5μl,25mmol/L MgCl₂2.8μl,2.5U/μl KOD 1μl,ddH₂O 33.2μl；

c.将步骤b所得DNA纯化回收并且将其回收产物磷酸化，并与T4 连接酶连接；

d.将步骤c所得产物转化E.coli/DH5α感受态细胞，得到了完整的表达质粒pGEX-4T-3-MarTX；

e. 将步骤d所得表达质粒pGEX-4T-3-MarTX转化至大肠杆菌菌株中，以诱导毒素蛋白的表达，在冰浴下超声破碎细胞，得裂解物；

f. 将步骤e所得裂解物分离纯化，超滤管脱盐后，小肠激酶酶切并在室温孵育20 h，得酶切产物；

g. 将步骤f所得酶切产物经纯化后真空冷冻干燥，使用含有50 mM DTT的Tris-碱缓冲液（pH 8.0）还原，得重组产物；该重组产物在包含1 mM还原型谷胱甘肽（GSH）和0.1 mM氧化型谷胱甘肽（GSSG）的0.05 M Tris-碱缓冲液（pH 8.0，其中有2 M盐酸胍）中重折叠，得到BK通道的特异性配体的重组表达质粒。

该重组表达质粒的序列为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。

上述的步骤c中的DNA 纯化回收的具体步骤为:

①柱平衡步骤：向吸附柱 CA2 中，（吸附柱放入收集管中）加入 500 μL 平衡液 BL，12,000 rpm 离心一分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

②将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量；

③向胶块中加入溶胶液 PN：如凝胶重为 0.1g，溶胶液为 100 μL，依此类推；50℃水浴放置 10 分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

④将上一步所得溶液加入一个吸附柱 CA2 中（吸附柱放入收集管中），室温放置 2 分钟，12,000 rpm 离心 60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2 放入收集管中；

⑤向吸附柱 CA2 中加入 700 μL 漂洗液 PW，12,000 rpm 离心 60 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2 放入收集管中；

⑥向吸附柱 CA2 中加入 500 μL 漂洗液 PW，12,000 rpm 离心 60 秒，倒掉废液；

⑦将吸附柱 CA2 放回收集管中，12,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除尽漂洗液。将吸附柱 CA2 开盖至于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；

⑧将吸附柱 CA2 放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量洗脱缓冲液 EB，洗脱缓冲液 EB 应置于 65-70°C水浴预热，室温放置 2 分钟；12,000 rpm 离心 2 分钟收集 DNA 溶液。

上述的步骤d的转化E.coli/DH5α感受态细胞，得到了完整的表达质粒pGEX-4T-3-MarTX的具体步骤为：10 μL 连接产物与 100 μL 的感受态细胞温和混匀，插入冰中放置 30 分钟；42℃热击 90 秒，然后快速插入冰中 3 分钟；加入 400 μL 的不含氨苄青霉素的液体 LB 培养基，180 rpm，37℃培养45分钟；吸取 100 μL 涂板，37℃正置 15 分钟，待完全吸收后，倒置培养 14-16 小时。挑取单菌落，接种于 3 mL 含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 培养基中，37℃振摇16～18 h；利用普通质粒小提试剂盒小量抽提质粒，阳性重组子送测序；从而得到了完整的表达质粒pGEX-4T-3-MarTX。

上述的步骤e的具体方法为：将步骤b所述的表达质粒pGEX-4T-3-MarTX被转化至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中，菌株细胞在含有0.1 mg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)培养基（体积为1 L）中生长，培养温度为37℃ ；当菌液O_D600值达到0.4-0.6时，加入终浓度为0.5 mM的Isopropyl-β-d-thiogalactoside（IPTG）以诱导毒素蛋白的表达，大肠杆菌细胞在28℃持续生长4小时；以5000 g转速离心10 min以收集细胞，重悬于70 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl, 4.3 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.4）；冰浴并超声破碎细胞（4 bursts/min），持续20 min，得裂解物。

上述的步骤f的具体步骤为：将步骤e所得裂解物在4 ℃下，以12,000 g的转速离心15 min，上清液使用0.45的滤膜过滤，通过含有谷胱甘肽-琼脂糖4B填料颗粒的Econo-层析柱亲和层析，流速控制在0.03 mL/min；由事先预冷的30 mL PBS缓冲液洗脱，流速为0.3 mL/min；GST-rMarTX融合蛋白用10 mM谷胱甘肽洗脱缓冲液从亲和柱填料上洗脱；GST-rMarTX通过截留分子量为10 kDa超滤管脱盐，加入10 U/mL的小肠激酶酶切并在室温孵育20 h，得酶切产物。

在构建载体质粒pGEX-4T-3-martentoxin的表达系统中，6个多余的碱基对出现在凝血酶酶切位点和MarTX的cDNA序列之间。这将会导致表达产物GST-rMarTX被凝血酶酶切后rMarTX的N端出现多余的2个氨基酸残基。在本专利的重组表达方法中，通过创新性地引入小肠激酶酶切位点，致使N端两个额外的氨基酸被移除，其结果易化了rMarTX对BK通道的阻断效应。其特征步骤为：通过使用KOD突变试剂盒所描述的点突变方法可将多余的碱基对去除。PCR点突变的正向引物为（5’-GATGACGATGACAAGTTTGGACTCATAGACGTAAAATGTTTTG-3’）包含小肠激酶识别位点的DNA序列（下划线），反向引物是凝血酶酶切位点的DNA序列（5’-GGATCCACGCGGAACCAGATC-3’），其中包含一个BamH I位点（下划线）。从而使得本发明的质粒在分子改造过的pGEX-4T-3系统中被成功表达，之后的功能鉴定其分子量和生物活性与天然MarTX 几乎吻合。

目前，超过10种短链毒素从东亚短钳蝎毒中被分离提取出来，然而无一被成功地体外表达，其中就包括BK通道的特异性配体Martentoxin。仅通过常规的体外表达方法获得重组Martentoxin（rMartentoxin），其产量和活性均不高。本发明通过针对性地修改体外表达载体pGEX-4T-3，优化常规的体外表达方法，从而获得重组的rMarTX，该方法所得产物具有良好的产量和毒素活性。

附图说明

图1为pGEX-4T-3-rMarTX表达系统的构建。（A）MarTX 的基因由PCR扩增通过BamH I/Sma双酶切位点连接入载体；（B）原始表达载体，pGEX-4T-3-rMarTX包含凝血酶（thrombin）的酶切位点（上）。突变后的载体，pGEX-4T-3-rMarTX包含小肠激酶酶切位点（下）。

图2为SDS-PAGE分析。泳道M，蛋白分子量Markers；泳道1，未诱导的细胞样品；泳道2，经IPTG诱导的细胞样品；泳道3，提取自诱导细胞的所有可溶性蛋白；泳道4，亲和层析后洗脱产物（融合蛋白GST-rMarTX）；泳道5，脱盐后的融合蛋白；泳道6，小肠激酶酶切产物（箭头处的条带为目的产物rMarTX）。

图3为rMarTX的RP-HPLC色谱和质谱分析。（A）天然MarTX的RP-HPLC色谱图，使用C18柱以5％-95％乙腈（包含0.1％三氟乙酸TFA）线性梯度分离纯化产物，控制流速为1 mL/min，并在230 nm波长下检测样品吸收峰；（B）rMarTX在相同条件下的RP-HPLC色谱。（C）rMarTX的质谱分析，rMarTX理论分子量应为4060 Da，实际测得rMarTX的分子量为4059.06 Da。

图4为rMarTX对HEK293T细胞中神经型BK通道（α+β4）的抑制效应。（A）施加1 μM rMarTX前后，表达有BK通道（α+β4）的HEK293T细胞的全细胞电流。钳制电位被设置在-70 mV，电流由+100 mV的脉冲激发，电极内自由钙浓度为300 nM；（B）rMarTX抑制BK通道电流的剂量依懒性曲线通过Hill方程拟合，IC₅₀=186.66±0.04 nM，Hill系数为2.41±0.92（n=5-6）。

图5为rMarTX对hKv3.1a、hKv4.2和mKv1.3通道的药理作用。（A）施加10 μM rMarTX前后，表达有hKv3.1a通道的HEK293T细胞的全细胞电流。钳制电位被设置在-100 mV，电流由+40 mV的脉冲激发；（B）施加10 μM rMarTX前后，表达有hKv4.2通道的HEK293T细胞的全细胞电流；（C）施加1 μM rMarTX前后，表达有mKv1.3通道的HEK293T细胞的全细胞电流；（D）统计分析rMarTX对hKv3.1a的药理作用，浓度分别为100 nM（I_f=1.03±0.04，n=9，p> 0.05），1 μM（I_f=0.99±0.04，n=9，p>0.05），10 μM（I_f=0.95±0.04，n=3，p>0.05）；（E）统计分析rMarTX对hKv4.2的药理作用，浓度分别为100 nM（I_f=0.87±0.16，n=5，p>0.05），1 μM（I_f =0.88±0.09，n=5，p>0.05）和10 μM（I_f=0.92±0.06，n=9，p>0.05）；（F）统计分析rMarTX对mKv1.3的药理作用，浓度分别为100 nM（I_f=0.88±0.02，n=10，p<0.001），1 μM（I_f=0.77±0.05，n = 8，p<0.001），10 μM（I_f=0.71±0.04，n = 6，p<0.001）。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是要对本发明作进一步的限定。本领域的技术人员应该理解，对本发明内容的技术特征所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1：pGEX-4T-3-Martentoxin质粒的构建

基于MarTX的cDNA序列（GenBank号 AF534113.1），两对引物被设计用以扩增MarTX的编码序列及引入载体pGEX-4T-3上的酶切位点。MarTX-正向引物（5’-TTCGGATCCTTTGGACTCATAGA-3’），其中包含一个BamH I的酶切位点（下划线）；MarTX-反向引物（5’-CTTCCCGGGTTAATCAGTAGCAT-3’）包含一个Sma I的酶切位点（下划线）。MarTX的cDNA序列被插入在pGEX-4T-3的BamH I和 Sma I两酶切位点间，从而得到了完整的表达质粒pGEX-4T-3-MarTX，如图1-A所示。

在该表达系统中，6个多余的碱基对出现在凝血酶酶切位点和MarTX的cDNA序列之间。这将会导致表达产物GST-rMarTX被凝血酶酶切后rMarTX的N端出现多余的2个氨基酸残基（GS，图1B）。通过使用KOD突变试剂盒（Toyobo公司，日本）所描述的点突变方法可将多余的碱基对去除。PCR点突变的正向引物为（5’-GATGACGATGACAAGTTTGGACTCATAGACGTAAAATGTTTTG-3’）包含小肠激酶识别位点的DNA序列（下划线），反向引物是凝血酶酶切位点的DNA序列（5’-GGATCCACGCGGAACCAGATC-3’），其中包含一个BamH I位点（下划线）。所有构建的质粒序列都经过测序验证（Lifetechnologies公司，中国）。

实施例2：rMarTX的体外表达与纯化

表达质粒pGEX-4T-3-MarTX被转化至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中，菌株细胞在含有0.1 mg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)培养基（体积为1 L）中生长，培养温度为37 °C。当菌液OD₆₀₀值达到0.4-0.6时，加入终浓度为0.5 mM的Isopropyl-β-d-thiogalactoside（IPTG）以诱导毒素蛋白的表达。大肠杆菌细胞在28 °C持续生长4小时。培养后，以5000 g转速离心10 min以收集细胞，重悬于70 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl, 4.3 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.4）。冰浴并超声破碎细胞（4 bursts/min），持续20 min。将裂解物在4 ℃下，以12,000 g的转速离心15 min。上清液使用0.45的滤膜过滤，通过含有谷胱甘肽-琼脂糖4B填料颗粒的Econo-层析柱（Bio-Rad公司，美国）亲和层析，流速控制在0.03 mL/min。后由事先预冷的30 mL PBS缓冲液洗脱，流速为0.3 mL/min。GST-rMarTX融合蛋白用10 mM谷胱甘肽洗脱缓冲液（GEB，Sigma-Aldrich公司，美国）从亲和柱填料上洗脱。GST-rMarTX通过截留分子量为10 kDa超滤管（Millipore公司，USA）脱盐，加入10 U/mL的小肠激酶酶切并在室温孵育20 h。酶切产物经过Sephadex G-50柱（GE公司，美国）去除GST标签，控制流速为15 mL/h。洗脱液的峰值通过波长为215nm的紫外分光光度计检测。回收产物选用包含C18柱（Agilent Eclipes XDB-C 18，4.6 mm × 150 mm，Agilent公司，美国）的反相HPLC（Waters 600E-2487，Waters Milford公司，美国）纯化，经由5%-95%乙腈（含0.1% 三氟乙酸 (TFA)）的线性梯度分离，控制流速为1 mL/min持续60 min，峰值通过230 nm 波长的紫外分光光度计检测吸收峰及其保留时间。纯化产物经过真空冷冻干燥后，使用含有50 mM DTT的Tris-碱缓冲液（pH 8.0）还原。重组产物在包含1 mM还原型谷胱甘肽（GSH）和0.1 mM氧化型谷胱甘肽（GSSG）的0.05 M Tris-碱缓冲液（pH 8.0，其中有2 M盐酸胍）中重折叠。HPLC系统用于分离纯化折叠正确的表达产物。以上所有洗脱和分离的蛋白产物都经过15% SDS-PAGE分析。正确折叠的纯化产物通过基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪检测其分子量（UltraflexBruker Daltonics公司，美国）。rMarTX的得率通过分析天平称量（Mettler-Toledo公司，瑞士联邦）。

如图2中显示了表达和分离提取rMarTX各步骤中洗脱产物的凝胶电泳分析。比较未经诱导的细胞样品（泳道1），经IPTG诱导的细胞样品（泳道2）中出现了一条新的蛋白条带。该条带的分子量约为30 kDa，与GST-rMarTX融合蛋白的理论分子量一致。超破碎细胞后的细胞上清液（泳道3）经过装有谷胱甘肽-琼脂糖4B凝胶的亲和层析色谱柱纯化，这就使得30 kDa产物（GST-rMarTX融合蛋白）得到了初步的分离纯化，在电泳中的泳道4仅出现30 kDa的条带。经过10 kDa超滤脱盐后的分离物被小肠激酶酶切。泳道5显示了酶切产生两条带，分别为26 kDa大小的和小于14 kDa的条带，分别代表GST标签和目的产物rMarTX。

酶切后的rMarTX通过反相HPLC纯化。天然的MarTX样品作为对照首先被注射入C18柱。如图3-A所示，对照的峰值出现在17 min。随后注入异质表达的rMarTX，其峰值也出现在17 min，如图3-B所示。收集保留时间与对照相近的rMarTX，真空干燥，准备做下一步分析。

图3-C显示了对反相HPLC纯化产物的质谱分析。结果显示rMarTX的分子量为4059.06 Da，与天然MarTX的理论分子量（4060 Da）相差不到1 Da。体外表达重组多肽的得率达到0.61-1.31 mg/1 L LB培养基。

实例3：重组rMarTX的电生理检测

3.1 电生理实验的溶液配制

在膜片钳实验中，BK通道的细胞外液（mM）：NaCl 135, KCl 5, MgCl₂ 1.2, CdCl₂ 2.5, HEPES 5, glucose 10（以NaOH 调节pH至7.4）；电极内液（mM）：NaCl 10, KCl 117, MgSO₄ 2, HEPES 10, MgATP 2, EGTA 1（以 KOH调节pH至7.2）。

mKv1.3和hKv3.1a通道的细胞外液（mM）：NaCl 135，KCl 5，MgCl2 1，CaCl2 1.8，HEPES 10，glucose 10（由NaOH调整pH至7.4）；hKv4.2通道的细胞外液（mM）：NaCl 125，KCl 2，MgCl2 1，glucose 10，HEPES 10，TEA 20（由NaOH调整pH至7.4）。mKv1.3、hKv3.1a和hKv4.2的电极内液（mM）：KCl 130，MgCl2 0.5，MgATP 2，EGTA 10，HEPES 10（由KOH调整pH至7.3）。

3.2 瞬时转染

BK通道、mKv1.3、hKv3.1a和hKv4.2通道均是通过瞬时转染在HEK293T细胞中表达。瞬时转染采用24孔板体系，转染前一天，在500 μL培养基中接种0.5-2×10⁵细胞，不添加抗生素，到细胞汇合率达80-85%。对于每个转染样品，步骤如下：

（1）在50 μL的opti-MEM I无血清培养基溶解DNA，混合均匀。

（2）使用Lipofectamine^TM 2000（Invitrogen公司，美国）前先温和混匀，在50 μL培养基中加入适量的脂质体，室温放置5 min。

（3）孵育5 min之后，将溶解的DNA与脂质体2000混合（V总=100 μL）温和混匀，并于室温孵育20 min（溶液呈现混浊）

注意：混合物于室温下在6小时内稳定

（4）在每个细胞培养孔的培养基中加入100 μL混合物，混合地前后晃动培养板。

（5）在37 ℃，5% CO₂中孵育18-48小时，检测转入的基因表达量，在6小时后更换培养基。

3.3 rMarTX对BK通道（α+β4）的抑制效应

首先将在HEK293T细胞中表达的BK通道（α+β4）电流由+100 mV脉冲刺激诱发，与已报道的BK通道电流特征吻合。如图4-A所示，1 μM的rMarTX可以有效地抑制该电流，这种抑制效应与天然毒素十分相近。剂量依赖曲线可显示残余电流（I_f）的百分比。rMarTX对BK通道（α+β4）电流的半数抑制浓度（IC₅₀）为186 nM，与天然MarTX的抑制效应相近；Hill系数为2.41，与天然毒素的性质几乎吻合。

3.4 rMarTX对Kv通道的调制作用

hKv 3.1a的延迟整流钾电流由+40 mV的脉冲刺激激发，但钙电流不能被100 nM（I_f=1.03±0.04，n=9，p> 0.05），1 μM（I_f=0.99±0.04，n=9，p>0.05），10 μM（I_f=0.95±0.04，n=3，p>0.05，图5-A和5-D）的rMarTX抑制。rMarTX对由hKv 4.2产生的瞬时外向钾电流在100 nM（I_f=0.87±0.16，n=5，p>0.05），1 μM（I_f =0.88±0.09，n=5，p>0.05）和10 μM（I_f=0.92±0.06，n=9，p>0.05，图5-B和5-E）没有明显的调制效应。rMarTX在100 nM（I_f=0.88±0.02，n=10，p<0.001），1 μM（I_f=0.77±0.05，n=8，p<0.001），10 μM（I_f=0.71±0.04，n=6，p<0.001，图5-C和5-F）能部分抑制mKv1.3通道的钾电流。

以上实验结果表明，短链蝎毒素 MarTX 在分子改造过的pGEX-4T-3系统中被成功表达，其分子量和生物活性与天然MarTX 几乎吻合；重组MarTX 可选择性地阻断BK通道（α+β4），部分抑制mKv1.3通道的电流，但对hKv4.2和hKv3.1a没有明显的调制效应。

<110> 上海大学

<120> BK通道的特异性配体的重组质粒及其重组表达方法

<160> 1

<210> 1

<211> 111

<212> DNA

<213> 质粒

<400> 1

TTTGG ACTCA TAGAC GTAAA ATGTT TTGCA TCTAG TGAAT GTTGG ACAGC TTGCA AAAAA 60

GTAAC AGGAT CGGGA CAAGG AAAGT GCCAG AATAA TCAAT GTCGA TGCTA C 111

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

TTCGG ATCCT TTGGA CTCAT AGA 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

CTTCC CGGGT TAATC AGTAG CAT 23

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

GATGA CGATG ACAAG TTTGG ACTCA TAGAC GTAAA ATGTT TTG 43

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

GGATC CACGC GGAAC CAGAT C 21

Claims

1.一种BK通道的特异性配体的重组表达方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

b．根据设计PCR点突变的引物序列：

c.将步骤b所得DNA 纯化回收并且将其回收产物磷酸化，并与T4 连接酶连接；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤c中的DNA 纯化回收的具体步骤为:

⑦将吸附柱 CA2 放回收集管中，12,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除尽漂洗液；

将吸附柱 CA2 开盖至于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验；

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤d的转化E.coli/DH5α感受态细胞，得到了完整的表达质粒pGEX-4T-3-MarTX的具体步骤为：10 μL 连接产物与 100 μL 的感受态细胞温和混匀，插入冰中放置 30 分钟；42℃热击 90 秒，然后快速插入冰中 3 分钟；加入 400 μL 的不含氨苄青霉素的液体 LB 培养基，180 rpm，37℃培养45分钟；吸取 100 μL 涂板，37℃正置 15 分钟，待完全吸收后，倒置培养 14-16 小时，

挑取单菌落，接种于 3 mL 含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的 LB 培养基中，37℃振摇16～18 h；利用普通质粒小提试剂盒小量抽提质粒，阳性重组子送测序；从而得到了完整的表达质粒pGEX-4T-3-MarTX。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤e的具体方法为：将步骤b所述的表达质粒pGEX-4T-3-MarTX被转化至大肠杆菌菌株BL21（DE3）中，菌株细胞在含有0.1 mg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani (LB)培养基（体积为1 L）中生长，培养温度为37℃ ；当菌液O_D600值达到0.4-0.6时，加入终浓度为0.5 mM的Isopropyl-β-d-thiogalactoside（IPTG）以诱导毒素蛋白的表达，大肠杆菌细胞在28℃持续生长4小时；以5000 g转速离心10 min以收集细胞，重悬于70 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS，137 mM NaCl, 4.3 mM Na2HPO4, 2.7 mM KCl, 1.4 mM KH2PO4, pH 7.4）；冰浴并超声破碎细胞（4 bursts/min），持续20 min，得裂解物。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤f的具体步骤为：将步骤e所得裂解物在4 ℃下，以12,000 g的转速离心15 min，上清液使用0.45的滤膜过滤，通过含有谷胱甘肽-琼脂糖4B填料颗粒的Econo-层析柱亲和层析，流速控制在0.03 mL/min；由事先预冷的30 mL PBS缓冲液洗脱，流速为0.3 mL/min；GST-rMarTX融合蛋白用10 mM谷胱甘肽洗脱缓冲液从亲和柱填料上洗脱；GST-rMarTX通过截留分子量为10 kDa超滤管脱盐，加入10 U/mL的小肠激酶酶切并在室温孵育20 h，得酶切产物。