CN103819546A - 一种以水蛭素为融合伴侣制备重组小分子蛋白或多肽的方法 - Google Patents

一种以水蛭素为融合伴侣制备重组小分子蛋白或多肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明建立了一种融合表达小分子蛋白(多肽)的新方法，其特征是：以水蛭素为融合伴侣(标签)，将小分子目的蛋白(多肽)拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达，同时在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间设计一个连接肽(其中包含蛋白酶或化学切割位点或可自切割的蛋白内含子intein)，这样融合蛋白表达后可通过酶切或化学切割或诱导自切割释放出目的蛋白(多肽)。该法优点：(1)水蛭素融合伴侣(标签)较小(分子量7Kd)，可有效增加小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占比率，最终提高目的小分子蛋白(多肽)产量；(2)水蛭素作为融合伴侣(标签)融合后仍具抗凝活性，可方便对融合蛋白的表达和纯化进行实时检测与追踪。

Description

一种以水蛭素为融合伴侣制备重组小分子蛋白或多肽的方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及建立一种重组多肽融合表达新技术，该技术的技术特征是以水蛭素为融合伴侣(标签)制备重组小分子蛋白(多肽)。
技术背景
当采用基因工程技术表达一些外源性多肽或小分子蛋白时，表达产物往往会由于被宿主细胞内的蛋白酶降解而造成表达量大大降低。为了有效解决这一问题，目前普遍采用融合表达技术。所谓融合表达就是通过基因重组技术将外源小分子蛋白(多肽)拼接于融合伴侣(标签)下游进行表达，然后通过酶切或化学切割释放出目的小分子蛋白(多肽)的技术。在进行基因拼接融合时应保持目的小分子蛋白(多肽)编码基因与融合伴侣(标签)编码基因阅读框架一致。此外，在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间需要设计1个或1个以上的蛋白酶切位点(如肠激酶切割位点)或化学切割位点或可以自己切割的蛋白内含子(intein)，这样就可以在融合蛋白表达出来之后通过酶切或化学切割或诱导自切割等手段释放出目的小分子蛋白(多肽)。
采用融合伴侣(标签)进行融合表达的优点在于：(1)对分子量较小的外源目的小分子蛋白(多肽)进行融合表达可增强表达产物的稳定性，减少或避免宿主细胞蛋白酶对表达产物的降解；(2)某些融合伴侣(标签)可以增强目的蛋白或多肽的可溶性；(3)方便目的蛋白的分离纯化。
目前普遍使用在低等生物或细菌中以可溶性状态高表达的蛋白作为融合伴侣(标签)以提高目的小分子蛋白(多肽)的表达量、可溶性及稳定性，采用的融合伴侣(标签)有曼氏血吸虫谷胱甘肽-S-转移酶(GST，28kDa)、大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP，40kDa)、蛋白二硫化物异构酶(NusA，55kDa)、大肠杆菌二硫键异构酶(Dsb A，21kDa)等。
然而，在使用上述这些融合伴侣(标签)对小分子目的蛋白(多肽)进行取融合表达时，虽然融合蛋白容易得到高水平表达，但由于融合伴侣(标签)自身分子量偏大，小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占的比率相对较低(通常仅占到融合蛋白的1/5～1/10甚至更低)，这样就势必严重影响了小分子目的蛋白(多肽)的最终收率。
水蛭素是一类从医用水蛭唾液腺中分离得到的抗凝抗栓多肽物质，分子量为7Kd，由65-66个氨基酸残基组成，是目前发现的最强的凝血酶特异性抑制剂。水蛭素分子形如蝌蚪，分为头、体、尾三部分：(1)头部N端形成一个致密、疏水的球状结构(1-47)，含有3个链内二硫键(Cys6-Cys14，Cys16-Cys28，Cys22-Cys39)，它可与凝血酶活性位点结合，抑制其催化活力；(2)尾部C端(49-65)含有多个带负电的酸性氨基酸，它与凝血酶的阴离子结合表位(纤维蛋白原结合位点)结合，抑制凝血酶与纤维蛋白原的相互作用；(3)中间部分pro-Arg-pro(46-48)与凝血酶的精氨酸环(侧链凹穴)结合，不被蛋白酶降解，具有很好的稳定性。水蛭素抑制凝血酶的作用过程由两个步骤完成。首先，水蛭素C端尾部结合到凝血酶的阴离子结合位点区域上，然后水蛭素N端核心区域结合到凝血酶活性位点，头尾两个功能区协同作用，对凝血酶具有高度的亲和性。水蛭素分子非常稳定，即使在100℃加热5-10分钟都不会改变其结构和生物学活性。
目前水蛭素分子已经在大肠杆菌中已获得高水平分泌表达(J Ind MicrobiolBiotechnol，2012，39(10)：1487-1494.)。本发明根据水蛭素的分子结构特征，以其为融合伴侣(标签)建立了一种新的融合表达系统，该系统的显著技术特征是：以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣(标签)融合表达目的小分子蛋白(多肽)，然后以酶切或化学切割等方式从融合蛋白中释放出小分子目的蛋白(或多肽)。该系统的显著优点是：(1)水蛭素融合伴侣(标签)分子量较小，可以有效增加小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中的比率；(2)通过分析水蛭素融合蛋白的抗凝活性可以方便快捷地对重组融合蛋白的表达水平进行实时检测；(3)利用水蛭素融合伴侣(标签)的理化性质快速纯化融合蛋白并在纯化过程中对之进行追踪。
发明内容
本发明目的在于建立一种融合表达小分子蛋白(多肽)的新方法。该方法的显著技术特征是：以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣(标签)，将小分子目的蛋白(多肽)拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达。此外，为了在融合表达后能够得到目的蛋白(多肽)，可以在融合伴侣与目的蛋白(多肽)之间设计一个连接肽(其中可以包含蛋白酶切位点(如肠激酶切割位点)或化学切割位点或可以自己切割的蛋白内含子intein)，这样可以在表达后对融合蛋白进行酶切或化学切割或诱导自切割以释放出目的蛋白(多肽)。
该融合表达方法的显著优点是：(1)水蛭素融合伴侣(标签)分子量较小(分子量7Kd)，这样可以有效增加小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占的比率，从而最终提高目的小分子蛋白(多肽)的产量；(2)水蛭素作为融合伴侣(标签)融合后仍具有抗凝活性，这样可以通过分析水蛭素融合蛋白的抗凝活性方便快捷地对融合蛋白的表达水平进行实时检测；(3)在融合蛋白纯化过程中可以通过分析其抗凝活性而对其进行追踪。
露那辛(Lunasin)是一种最初从大豆中分离得到的活性肽，由43个氨基酸残基组成，分子量为5KDa，具有体外及动物体内实验及动物学实验表明：具抗有抗炎、肿瘤预防等药理活性。
由于露那辛多肽在植物体内含量非常低，且合成成本较高。为此，本发明以以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣(标签)，将露那辛拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达。同时在两者之间设计一个含牛肠激酶酶切位点的连接肽，这样融合蛋白表达后可以通过牛肠激酶进行切割从而释放出N-末端与天然露那辛完全一致且具有生物活性的目的多肽露那辛。
本发明所建立的以水蛭素(分子量7Kd)为融合伴侣(标签)的表达方法不只限于露那辛的表达，该方法可以应用于其它蛋白或多肽的融合表达。
附图说明
图1：融合蛋白rHV3-Lunasin编码基因序列。灰色部分为水蛭素III(HV3)融合标签，其后为-GGGDDDDK-连接肽，箭头所指为牛肠激酶切割位点，切割位点之后为目的多肽露那辛序列，*代表终止密码子。
图2：融合蛋白(rHV3-Lunasin)分泌表达载体pTASHL示意图。Ptac：Tac启动子；AP：氨苄抗性基因，HV3：水蛭素III基因，Luansin：露那辛(Luansin)基因，Sig：L-门冬酰胺酶II信号肽简并基因，Ori：pUC质粒复制起始点，rrnBT1T2：转录终止子。
图3：牛肠激酶酶切rHV3-Lunasin融合蛋白的Tricine/SDS-PAGE电泳图谱。M：低分子量蛋白Marker；lane1：纯化的融合蛋白rHV3-Lunasin；lane2：融合蛋白rHV3-Lunasin在23℃经重组牛肠激酶酶切12h后的酶切液；lane3：酶切后纯化的rHV3；lane4：酶切后纯化的Lunasin。
图4：融合蛋白rHV3-Lunasin在23℃经肠激酶酶切12h后的C18RP-HPLC图。峰1：rHV3；峰2：Lunasin。
图5：纯化后Lunasin的MALDI-TOF/TOF质谱图。
图6：纯化的Lunasin对人结肠癌细胞HCT-116抑制率的量效关系(IC50＝59.11μM)。
图7：纯化的Lunasin对人乳腺癌细胞MDA-MB-231抑制率的量效关系(IC50＝50.94μM)。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1  水蛭素III(HV3)融合标签与目的多肽露那辛(Lunasin)融合基因的设计与克隆
水蛭素III(HV3)融合标签与目的多肽露那辛(Lunasin)融合蛋白包括(从N端至C端)：(1)水蛭素III(HV3)66个氨基酸残基；(2)-GGGDDDDK-连接肽(其中DDDDK为肠激酶切割位点)；(3)露那辛(Lunasin)43个氨基酸残基。在此基础上，根据E.coli偏爱密码子设计并合成上述融合蛋白编码基因(见图1)。
实施例2  水蛭素III-露那辛融合蛋白表达菌株的构建
将实施例1中所述融合基因用Nhe I及Hind III双酶切后亚克隆到表达载体pTASH(Tan S，Wu W，Liu J，Protein Expr Purif2002，25，430-436.)的相应酶切位点，得到的重组表达载体命名为pTASHL(见图2)，并测序验证其序列正确性。用CaCl2法将重组表达质粒pTASHL转化E.coli JM109宿主菌，得到rHV3-Lunasin融合蛋白表达工程菌JM109/pTASHL。
实施例3  水蛭素III-露那辛融合蛋白在7L反应器中的表达
接种JM109/pTASHL工程菌单菌落于200ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中37℃，220rpm，培养12h。按4％的接种量接种于7L生物反应器(Laboratory Fermenter Type L1523，Bioengineering AG，Switzerland)中的5L发酵培养基(1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉，4％谷氨酸钠，1％麦芽粉，0.671％KH2PO4，0.757％Na2HPO4·12H2O，100μg/ml氨苄青霉素，pH6.5)，37℃搅拌培养，发酵液pH用磷酸控制在6.5-7.2，溶氧控制在40％-60％。当发酵液OD600nm达到3.0时以大约30ml h-1l-1流加培养基I(10％麦芽粉，pH6.5)，补料时间维持约4h菌体生长达到平台期，饥饿2h后以大约20ml h-1l-1流加培养基II(3.33％蛋白胨，1.67％酵母粉，13.3％谷氨酸钠，10％麦芽粉，pH6.5)直至发酵结束。整个发酵过程维持时间约24h。
发酵结束后离心后收集发酵液上清，并采用凝血酶滴定法(见Tan S，Wu W，Liu J，Protein Expr Purif2002，25，430-436.)测定其抗凝活性：于酶标板小孔中加入200μl0.5％人纤维蛋白原溶液(pH7.4，50mM Tris-HCl缓冲液配置)，再加入10μl待测溶液，充分混匀。用微量进样器吸取标准凝血酶溶液(100NIH/ml)进行滴定，每次滴定5μl(0.5NIH)，时间间隔为1min，若在1min内纤维蛋白原发生凝固，说明已达到终点。由凝血酶的消耗量可以换算出水蛭素抗凝活性单位数，每消耗一个凝血酶单位(NIHU)相当于一个抗凝血酶单位(ATU)。经测定，上清中融合蛋白抗凝血酶活性达到2000ATU/ml。
实施例4  融合蛋白rHV3-Lunasin的制备
利用融合蛋白和一般蛋白在热稳定性上的差别，发酵液上清用HCl调节pH至3.0后，加热到95℃维持8min，10000rpm离心去除部分已热变性的蛋白沉淀。上清液经5K超滤膜除盐浓缩。
融合蛋白rHV3-Lunasin的计算机预测等电点为4.01。为此用50mM柠檬酸-NaOH(pH3.0)缓冲液平衡阳离子柱SP sepharose Fast Flow(φ1.0×20em)，除盐后的发酵液上清以0.5ml/min的速度上样。依次用50mM柠檬酸-NaOH(pH3.0)缓冲液和20mM HAc-NaOH(pH4.2)缓冲液清洗杂蛋白，然后用20mMHAc-NaOH(pH5.0)缓冲液进行洗脱，收集活性组分。
用20mM HAc-NaOH(pH5.0)缓冲液平衡阴离子柱Q sepharose Fast Flow将阳离子柱洗脱液以0.5ml/min的速度上样。依次用20mMHAc-NaOH(pH5.0)缓冲液和含有0.05M NaCl的20mM HAc-NaOH(pH5.0)缓冲液清洗杂蛋白，然后用20mM HAc-NaOH(pH5.0)配制的0.05M NaCl-0.3M NaCl梯度洗脱，收集活性组分。Tricine/SDS-PAGE电泳结果显示，融合蛋白表观分子量为18KD左右(图3)，采用上海天能科技有限公司Tanon GIS软件分析表明纯度达到90％以上。
实施例5  酶切融合蛋白rHV3-Lunasin释放目的多肽Lunasin
用50mM Tris-HCl(pH8.0)将纯化的rHV3-Lunasin融合蛋白稀释至1mg/ml，并加入CaCl2至终浓度1mM，加入Tween-20至终浓度0.1％。重组牛肠激酶以50mM Tris-HCl(pH8.0)稀释至1mg/ml，按1∶100(W/W)于融合蛋白溶液中添加牛肠激酶并混匀，23℃反应12h。酶切后采用DuoFlow制备型液相色谱系统(Bio-rad公司)对反应混合物进行分离，色谱柱为Kromasil5-C18(10mm×250mm)，流动相A相为0.2％TFA/水，B相为甲醇，流速为1ml/min，梯度为：25％-95％B，60min，收集Lunasin活性峰(图4)。Trcine/SDS-PAGE结果(图3)显示制得的Lunasin分子量为5KD左右，MALDI-TOF/TOF质谱分析结果(图5)显示其分子量为5027.6029，与理论值一致。
实施例6  生物学活性测定(MTT法)
分别取对数生长期的人结肠癌细胞HCT-116和人乳腺癌细胞MDA-MB-231，调整其浓度为5×104个/ml，接种于96孔板，每孔200μl，37℃、5％CO2培养箱中过夜培养。第二天将培养液吸出，加入用DMEM培养基稀释的不同浓度的Lunasin，浓度梯度为100，80，40，20，10，1μM，每个浓度设五个复孔，只加DMEM培养基的细胞为阴性对照，每孔加200μl，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。72h后，每孔加入5mg/ml MTT20μl于37℃保温4h，弃上清，每孔加二甲亚砜150μl。震荡10min后，用Multiskan MK3酶标仪(ThermoScientific，USA)测定各孔A570nm，计算细胞抑制率。细胞抑制率计算公式如下：抑制率(％)＝(1-A570nm(sample)/A570nm(control))×100。
MTT分析结果显示，应用本方法制备的Lunasin对人结肠癌细胞HCT-116和人乳腺癌细胞MDA-MB-231生长均具有明显抑制作用并存在剂量依赖关系，抑制HCT-116细胞的IC50为59.11μM(图6)，抑制MDA-MB-231细胞的IC50为50.94μM(图7)。

Claims (4)

1.一种融合表达小分子蛋白(多肽)的方法，其技术特征是：以水蛭素为融合伴侣(标签)，将小分子目的蛋白(多肽)拼接于水蛭素融合伴侣下游进行融合表达。
2.根据权利要求1所述的融合表达方法，在融合伴侣(标签)水蛭素与目的小分子蛋白(多肽)之间可以设计一个连接肽，该连接肽中包含1个或1个以上的蛋白酶切位点(如肠激酶切割位点)或化学切割位点或可以自己切割的蛋白内含子(intein)，这样可以在表达后对融合蛋白进行酶切或化学切割或诱导自切割以释放出目的蛋白(多肽)。
3.根据权利要求1所述的融合表达方法，由于水蛭素融合伴侣(标签)分子量较小(约7Kd)，这样可以有效增加小分子目的蛋白(多肽)在融合蛋白中所占的比率，从而最终提高目的小分子蛋白(多肽)的产量。
4.根据权利要求1所述的融合表达方法，水蛭素作为融合伴侣(标签)与目的小分子蛋白(多肽)融合后仍具有抗凝活性，这样可以通过测定融合蛋白的抗凝活性方便快捷地对融合蛋白的表达和纯化进行实时检测与追踪。
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C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20140528