CN105246503A - Pcsk9的新颖结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与PCSK9结合的新颖脂质运载蛋白突变蛋白。本发明还提供编码脂质运载蛋白突变蛋白的对应核酸分子和用于产生脂质运载蛋白突变蛋白的方法以及其编码核酸分子。

Description

PCSK9的新颖结合蛋白
背景技术
人类前蛋白转换酶枯草杆菌蛋白酶/kexin第9类(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，PCSK9)是一种主要表达于肾脏、肝脏和肠内的分泌蛋白。其具有三个结构域：抑制性前结构域(氨基酸1-152；包括位于氨基酸1-30的信号序列)、丝氨酸蛋白酶结构域(或催化结构域；位于氨基酸153-448)和长度为210个残基(位于氨基酸449-692)的C端结构域(或富含半胱氨酸/组氨酸的结构域)，其富含半胱氨酸残基。合成PCSK9以作为在内质网内的前结构域和催化结构域之间经历自催化切割的酶原。该前结构域与切割后的成熟蛋白结合，且该复合物会被分泌。该富含半胱氨酸的结构域可扮演类似于其他Furin/kexin/枯草杆菌蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶的P-(加工)结构域，其似乎对于该活化的蛋白酶的折叠与调节而言是必需的。
PCSK9为丝氨酸蛋白酶的蛋白酶K分泌枯草杆菌蛋白酶样的亚家族的成员(Naureckiene等人.,2003Arc.Biochem.Biophys.420:55-67)，且其作用为肝低密度脂蛋白受体(LDL-R)的强负调节剂。PCSK9在通过控制在血流中循环的低密度脂蛋白(LDL)颗粒水平的胆固醇代谢中起重要作用。PCSK9水平的上升已被证实在肝脏中降低LDL-R水平，从而导致在血浆中具有高水平的低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)且对冠状动脉疾病的感受性增加。(Peterson等人,JLipidRes.49(7):1595-9(2008))。
低密度脂蛋白受体(LDL-R)通过清除在血流中的低密度脂蛋白(LDL)而预防动脉粥状硬化和高胆固醇血症。LDL-R在转译后的水平由PCSK9所调节。PCSK9基因剔除小鼠表现出在血浆LDL-c水平的约50％减少，且增加对他汀类药物在减少血浆LDL-c的敏感性(RashidS等人(2005)ProcNatlAcadSci102:5374-5379)。人类的基因资料也支持PCSK9在体内恒定(homeostasis)的作用。PCSK9中的突变与血浆中LDL-c水平异常有关(Horton等人，2006Trends.Biochem.Sci.32(2):71-77)。最近被鉴定出的两个突变据推测是PCSK9中“丧失功能”的突变。具有这些突变的个体在血浆中的LDL-c水平减少约40％，其换算后为减少约50-90％的冠状心脏疾病。
因此，产生PCSK9的抑制剂将会是非常有利的，所述PCSK9的抑制剂拮抗PCSK9的活性且阻断或减少在各种病理状态中PCSK9所起的相关作用。
发明内容
定义：
下表定义整个说明书中使用的术语、用语和缩写。所有在本文中列出和定义的术语意在涵盖所有语法形式。
如本文所用，术语“脂质运载蛋白”指由其超二级结构定义的多肽，所述超二级结构即圆柱状β折叠片超二级结构区域，所述区域包含通过在一端的四个环成对连接的八个β链，由此定义结合袋。脂质运载蛋白(Pervaiz和Brew,FASEBJ.1(1987),209-214)为一个小的家族，通常为单体分泌蛋白，其已经从不同生物体中被分离出来(Flower,Biochem.J.318(1996),1-12)。脂质运载蛋白承受相对小的相对序列相似性，且首先通过X-射线结构分析阐明它们属于同一蛋白结构家族(Sawyer等人，Nature327(1987),659)。
在这方面，如本文所讨论的“脂质运载蛋白突变蛋白”指这样的突变蛋白，其源自脂质运载蛋白且具有圆柱状β折叠片超二级结构区域，所述区域包含通过在一端的四个环成对连接的八个β链，由此定义结合袋，其中所述四个环中的至少三个的每一个的至少一个氨基酸已经突变(参见，例如，PCT公开WO1999/16873)。在一些具体实施方式中，所述脂质运载蛋白突变蛋白可源自人类泪液脂质运载蛋白。然而，在一些其他具体实施方式中，所述脂质运载蛋白突变蛋白可源自人类泪液脂质运载蛋白以外的脂质运载蛋白。
如本文所用，术语“受试者”包括任何脊椎动物，如，哺乳动物。哺乳动物包括、但不限于，家畜(如，乳牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类动物(如，人类和非人类灵长类动物例如猴子)、兔和啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。在某些实施方式中，该个体或受试者为人类。
如本文所用的“前蛋白转换酶枯草杆菌蛋白酶kexin第9类”(“PCSK9”，可与“NARC-1”互换使用)指来自任何脊椎动物来源的任何天然PCSK9，所述任何脊椎动物来源包括哺乳动物例如灵长类动物(如人类)和啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)除非另有说明。该术语涵盖“全长”未加工的PCSK9，以及在细胞内加工所得到的任何形式的PCSK9或其任何片段。该术语也涵盖PCSK9的天然存在的变体，如剪接变体或等位基因变体。
如本文所用的术语“载体”指能够增殖与其连接的其他核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及并入将其引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作连接的核酸序列的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
附图说明
图1：提供了通过表面等离子体共振对于脂质运载蛋白突变蛋白SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:11的结合速率和解离速率的典型测量。所得到的对人类PCSK9(“hPCSK9”)(SEQIDNO:34)的解离常数(KD)、结合速率(kon)和解离速率(koff)总结于实施例6的表1中。
图2：证明脂质运载蛋白突变蛋白SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8能够阻断在PCSK9与其受体LDL-R之间的相互作用。生物素化的hPCSK9(图2A)或生物素化的hPCSK9_D374Y突变体(图2B)与可变浓度的所述突变蛋白预先培养，且在ELISA板上用固定化的可溶LDL-R定量未中和的PCSK9。负对照SEQIDNO:2不具有竞争性效果。用单点结合模型拟合数据。所得的IC50值总结于实施例7的表2中。
图3：显示如在ELISA形式中测量的SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9的脂质运载蛋白突变蛋白的交叉反应性概况。脂质运载蛋白突变蛋白对hPCSK9_D374Y突变体和对石蟹猕猴PCSK9的完整交叉反应性由几乎相同的KD值所显现(参见表3)。在测试的浓度范围内，对小鼠PCSK9也具有交叉反应性，但亲和力较低。负对照(SEQIDNO:2)则未检测到结合反应。用单点结合模型拟合数据。
图4：示出了在以细胞为基础的分析中，SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的脂质运载蛋白突变蛋白有效阻断hPCSK9与其受体LDL-R的结合。该分析基于在HepG2细胞上PCSK9诱导的LDL-R内化，从而导致荧光标记的Dil-LDL的胞内摄取减少。细胞与固定浓度(100nM)的hPCSK9培养，且用脂质运载蛋白突变蛋白进行滴定。将使用BMGPheraStar读板器在485/535nm下测量的胞内Dil-LDL的标准化荧光信号针对脂质运载蛋白突变蛋白的浓度绘图。所得到的SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8的脂质运载蛋白突变蛋白的IC50值列于表4中。脂质运载蛋白突变蛋白对PCSK9的结合恢复了Dil-LDL摄取至细胞内的PCSK9介导的减少，而SEQIDNO:2的负对照则无作用。通过GraphPadPrism4，使用非线性回归“S形剂量-反应，可变斜率”模型进行曲线的拟合(5PL拟合)。通过PCSK9刺激的和未刺激的细胞的值进行数据标准化。
图5：提供了如通过表面等离子体共振测量的SEQIDNO:13(图5C)、SEQIDNO:20(图5A)和SEQIDNO:21(图5B)的脂质运载蛋白突变蛋白对hPCSK9的结合与未结合的结合速率与解离速率的典型测量。所得到的KD总结于表5中(参见实施例10)。
图6：提供了如通过表面等离子体共振测量的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNO:20)对各种PCSK9种类的结合与未结合的结合速率与解离速率的典型测量。所得到的脂质运载蛋白突变蛋白SEQIDNO:20和其他突变蛋白的KD总结于表6中(参见实施例11)。
图7：证明了SEQIDNO:30、SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的PEG化形式的脂质运载蛋白突变蛋白能够与hPCSK9结合，IC50分别为0.19、0.53和0.37nM，与SEQIDNO:13的未修饰的脂质运载蛋白突变蛋白类似，其IC50显示为0.16nM。生物素化的hPCSK9与可变浓度的脂质转载蛋白突变蛋白预先培养，在固定了基准抗体(其轻链由SEQIDNO:29表示，而其重链由SEQIDNO:33表示)的ELISA板上定量未中和的PCSK9，所述基准抗体用作正对照，以与脂质转载蛋白突变蛋白竞争与hPCSK9的结合。用单点结合模型拟合数据。
图8：证明在以细胞为基础的LDL-R耗尽分析中，SEQIDNO:22、SEQIDNO:13和SEQIDNO:20的脂质运载蛋白突变蛋白及其相应PEG化的SEQIDNO:30、SEQIDNO:31和SEQIDNO:32的变体能够阻断hPCSK9的生物活性。在LDL匮乏的HepG2细胞上将连续稀释的测试脂质运载蛋白突变蛋白和SEQIDNO:2的负对照与恒定浓度的hPCSK9一起培养。通过使用特定的山羊抗-hLDL-R抗体(R&DCAT.No.AF2148)评价在该HepG2表面上的LDL-R含量。PCSK9介导的最大LDL-R内化被设定为100％。脂质运载蛋白突变蛋白的加入以剂量依赖方式阻断PCSK9的活性。就此而言，SEQIDNO:22、SEQIDNO:13和SEQIDNO:20的脂质运载蛋白突变蛋白的IC50值分别为76nM、103nM和91nM。因此，PEG化并不影响脂质运载蛋白突变蛋白的阻断能力，因为对于该PEG化的脂质运载蛋白突变蛋白(分别包含SEQIDNOs:30-32，其代表本发明的三个脂质运载蛋白突变蛋白的变体的氨基酸序列，但不包括该聚乙二醇(PEG)分子的序列)测量的IC50值与其各自未PEG化的形式(分别为SEQIDNOs:13、20和22)并无不同。SEQIDNO:2的负对照对PCSK9的活性则无影响。总之，该脂质运载蛋白突变蛋白抑制PCSK9的生物活性，因此恢复了在该细胞表面上的LDL-R。用S形剂量-反应模型拟合数据。
图9：显示编码包含OmpA信号序列(OmpA)和人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白接着该Strep-tagII的融合蛋白的表达载体pTLPC26(也称为pTlc26)。标记了用于克隆该突变基因盒的BstXI限制酶切位点和位于结构基因侧翼的限制性位点。在四环霉素启动子/操纵子(tetp/o)的控制下表达基因。转录终止于脂蛋白转录作用终止子(tlpp)。该载体进一步包含复制起点(ori)、丝状噬菌体f1的基因间区域(f1-IG)、氨苄青霉素抗性基因(amp))以及四环霉素抑制基因(tetR)。pTLPC26的核酸序列的相关片段列于序列表中的SEQIDNO:35。该片段始于XbaI限制性位点，终于HindIII限制性位点。在该区域外的载体元件与载体pASK75相同，其完整的核苷酸序列示于德国专利公开DE4417598Al中。
图10：描述某些以人类泪液脂质运载蛋白为基础的突变蛋白的氨基酸序列(列于SEQIDNOs:2-28)与成熟人类泪液脂质运载蛋白的多肽序列(SEQIDNO:1)比较的比对。
图11：图11A提供实施例3中编码氨基酸的预期分布。注意，为了清楚起见，具有少于1％的频率的所有氨基酸均被省略；因为在噬菌体展示过程中使用密码子抑制因子菌株TG1F，故琥珀终止密码子(TAG)被当作编码谷氨酰胺。此外，从成熟文库(图11B和图11C)的测序获得的实验数据显示，预期与实验的分布之间具有良好的匹配，尽管丝氨酸的频率高出预期，反映出寡核苷酸合成或通过PCR的寡核苷酸组装的偏差。与此发现一致的是，实验获得的两个文库(图11E和图11F)的突变分布频率与理论上预期的分布(图11D)接近，但移向较低频率。
图12：描述代表脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNO:13和SEQIDNOs:63-65)的熔融曲线迭加的温谱图，其获自使用毛细管nanoDSC设备(Q2000,TA)的纳米差异化扫描热量计(“nanoDSC”)测量。与SEQIDNO:13相比较，热稳定的衍生物(SEQIDNOs:63-65)的熔融曲线显着地位移。
图13：提供了通过表面等离子体共振对于脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNOs:62-71的结合速率与解离速率的典型测量。图13A-图13J分别对应于SEQIDNOs:62-71。所得到的对人类PCSK9(“hPCSK9”)(SEQIDNO:34)的解离常数(KD)、结合速率(kon)和解离速率(koff)总结于实施例17的表10中。
图14：描述某些以人类泪液脂质运载蛋白为基础的突变蛋白的氨基酸序列(列为SEQIDNOs:13、22、62-71)与成熟人类泪液脂质运载蛋白的多肽序列(SEQIDNO:1)相比较的比对。
具体实施方式
在一方面，本发明提供与前蛋白转换酶枯草杆菌蛋白酶/kexin第9类或PCSK9结合的人类泪液脂质运载蛋白的突变蛋白。在一些实施方式中，该脂质运载蛋白突变蛋白对PCSK9具有高亲和力。作为本发明的突变蛋白的靶标的PCSK9一般而言为哺乳动物蛋白，例如，非人类灵长类动物蛋白或人类蛋白。全长人类PCSK9具有SEQIDNO:34所示的氨基酸序列。
本发明的脂质运载蛋白突变蛋白也能够结合PCKS9的免疫原性片段。PCKS9的免疫原性片段为具有一个或多个表位、模拟表位或其他抗原决定簇的片段，且因此能够诱导免疫反应或能够产生针对其的抗体。该免疫原性片段可包括单一表位或可具有多个表位。因为抗原呈递系统，如载体蛋白，可被用于提供被免疫系统识别所需的尺寸，因此没有具体的尺寸限制应用于该免疫原性片段。因此，该免疫原性片段也可为“半抗原”，即本身不需具有抗原性或可能具有低免疫原性的片段，具体而言因为该片段的小分子量和相对应的尺寸。一般而言，免疫原性片段可以单独或当在载体上呈现时，由免疫球蛋白结合。PCSK9的免疫原性片段一般能够与LDL-R相互作用，由此调节在血流中循环的低密度脂蛋白(LDL)颗粒。在一些实施方式中，PCSK9的免疫原性片段保留了全长配体被根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白识别和/或结合的能力。例如，该免疫原性片段可为N端和/或C端缩短的蛋白或肽。
在不同的实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够与非人类灵长类动物PCSK9(例如，石蟹猕猴PCSK9或黑猩猩PCSK9)或其具有可检测亲和力(即具有至少200nM的解离常数(KD))的免疫原性片段结合。在一些实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与非人类灵长类动物PCSK9或其具有等于或小于约10nM、约1nM或约0.3nM的KD的免疫原性片段结合。在不同的实施方式中，抗原结合部分与小鼠PCSK9或其具有等于或小于约10nM、约1nM或约0.5nM的KD的免疫原性片段结合。
在不同的实施方式中，本发明的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白能够与人类PCSK9或其具有可检测亲和力(即具有至少200nM的KD)的免疫原性片段结合。在一些实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与人类PCSK9或其具有等于或小于约10nM、约1nM、约0.1nM、约0.5nM、约0.25nM、约10pM或甚至更少的KD的免疫原性片段结合。
在一些进一步的实施方式中，与人类PCSK9或其免疫原性片段结合的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白的结合亲和力已被发现具有0.1nM以下的KD，且在一些实施方式中，具有等于或小于约1皮摩尔(picomolar，pM)的KD(参见图7)。
可以测量脂质运载蛋白突变蛋白与选定的靶标(在本例中为PCSK9)的结合亲和力，由此通过本领域技术人员已知的多种方法测定突变蛋白-配体复合物的KD值。这些方法包括、但不限于，荧光滴定、竞争ELISA、量热法(例如等温滴定量热法(ITC))和表面等离子体共振(BIAcore)。这些方法的实例详述如下(参见，如，实施例7)。
在一个实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可作为PCSK9的拮抗剂。如本文所用，术语“PCSK9的拮抗剂”指能够干扰PCSK9和LDL-R之间的结合的试剂。在一些情况下，PCSK9的拮抗剂可由其完全或部分抑制PCSK9和LDL-R之间的结合的能力而被鉴别。
此外，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与LDL-R竞争与PCSK9的结合(参见实施例7)。
此外，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与包含SEQIDNO:29和SEQIDNO:33的单克隆抗体竞争与PCSK9的结合(参见实施例12)。
在另一个实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够完全或部分抑制PCSK9介导的LDL-R的下调。与存在对照或缺乏脂质运载蛋白突变蛋白的情况下PCSK9介导的LDL-R的下调相比较，当暴露于本发明的脂质运载蛋白突变蛋白时，抑制发生，例如，其中PCSK9介导的LDL-R的下调为减少至少约10％，例如减少至少约25％、50％、75％，或完全地抑制。在一些进一步的实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够以剂量依赖的方式来抑制PCSK9介导的LDL-R的下调。在一些进一步的实施方式中，PCSK9介导的LDL-R的下调的抑制可在基于HEPG2细胞的分析中被证实，如实施例13中实质地描述。
在另一个实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够在存在PCSK9的情况下恢复LDL摄取。在一些进一步的实施方式中，在存在PCSK9的情况下LDL摄取的恢复可在基于HEPG2细胞的分析中被证实，如实施例11中实质地描述。在一些进一步的实施方式中，为了设定该分析，HEPG2细胞可与固定浓度的hPCSK9(如100nM)一起培养，然后可与脂质运载蛋白突变蛋白进行滴定。
PCSK9可用于定义人类泪液脂质运载蛋白的非天然配体。术语“非天然配体”指在生理条件下不与成熟人类泪液脂质运载蛋白结合的化合物。如本文所使用，术语“人类泪液脂质运载蛋白”指对应于SWISS-PROT数据库登录号P31025的蛋白的成熟人类泪液脂质运载蛋白，然而该成熟人类泪液脂质运载蛋白(SEQIDNO:1)并不包括含括在该SWISS-PROT登录号P31025的序列中的N端信号肽。
本发明的突变蛋白的氨基酸序列与成熟人类泪液脂质运载蛋白(SEQIDNO:1)具有高序列同一性。在此背景下，本发明的突变蛋白的氨基酸序列可基本上相似于成熟人类泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列。本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的相应序列，与成熟人类泪液脂质运载蛋白的序列基本上相似，在不同的实施方式中，可与成熟人类泪液脂质运载蛋白的序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少85％、至少87％或至少90％同一性，包括至少95％同一性(参见，例如，图10和图14)，条件是保留改变的位置或序列。
“同一性”指序列的属性，其量度序列的相似性或关系。通过将相同残基的数目除以残基总数再乘以100来计算同一性。如两个示例性实例所示，SEQIDNO:3的突变蛋白与成熟人类泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列具有82.28％的序列同一性，且SEQIDNO:7的突变蛋白与成熟人类泪液脂质运载蛋白具有83.54％的氨基酸序列同一性。
“间隔”为比对中的空隙，其是氨基酸添加或缺失的结果。因此，完全相同的序列的两个拷贝具有100％同一性，但不那么高度保守的序列和具有缺失、添加或替换的序列可具有较低程度的同一性。本领域技术人员将认识到，若干计算机程序可用于使用标准参数来测定序列同一性，例如Blast(Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25,3389-3402)、Blast2(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215,403-410)，和Smith-Waterman(Smith等人(1981)J.Mol.Biol.147,195-197)。
参照本发明的核酸或多肽的术语“突变的”或“突变蛋白”指与天然存在的核酸或多肽相比较，分别交换、缺失或插入一个或多个核苷酸或氨基酸。与对应的天然人类泪液脂质运载蛋白相比较，本发明的突变蛋白包括至少三个置换。
在一些实施方式中，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白的突变蛋白包括在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列(SEQIDNO:1)的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任一个处的至少2个、包括3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、17或18个突变的氨基酸残基。位置26-34包括在AB环中，位置56-58包括在CD环中。位置80位于α螺旋区中。位置83为在此α螺旋区和β折叠片(βF)之间的单一环定义氨基酸。位置104-106和108包括在泪液脂质运载蛋白的β桶结构的开放端处结合位置中的GH环中。本文所用的这些区域的定义根据Flower(Flower，1996年，同上，Flower等人，2000年，同上)和Breustedt等人(2005年，同上)。
在一些实施方式中，根据本发明的人类脂质运载蛋白突变蛋白可进一步包括将位置61和/或153处的天然半胱氨酸残基由丝氨酸残基进行氨基酸置换。在此背景下，值得注意的是，已发现将成熟人类泪液脂质运载蛋白的由半胱氨酸残基61和153形成的结构二硫键移除(在对应天然核酸文库的程度上)(参照Breustedt等人，2005年，同上)，提供这样的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白，所述突变蛋白不仅稳定地折叠，而且还能够以高亲和力结合给定的非天然配体。不希望受到理论的束缚，据信消除结构二硫键提供进一步的优点，即允许非天然人工二硫键(自发)产生或故意引入本发明的突变蛋白中(参见实施例)，例如由此增加该突变蛋白的稳定性。然而，结合PCSK9且在Cys61与Cys153之间具有形成的二硫键的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白亦为本发明的一部份。
在一些实施方式中，本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换：Cys61→Ala、Phe、Lys、Arg、Thr、Asn、Tyr、Met、Ser、Pro或Trp和/或Cys153→Ser或Ala。
在一些实施方式中，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括将位置101处的天然半胱氨酸残基由丝氨酸残基进行氨基酸置换。另外，在一些实施方式中，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括将位置111处的天然精氨酸残基由脯氨酸残基进行氨基酸置换。在一些实施方式中，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括将位置114处的天然赖氨酸残基由色氨酸残基进行氨基酸置换。
在一些实施方式中，本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括至少一个氨基酸置换，其可为另外的氨基酸置换，其选自Arg111→Pro和Lys114→Trp。本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白可进一步包括由另一个氨基酸置换在成熟人类泪液脂质运载蛋白的序列位置101处的半胱氨酸。这一置换可例如为突变Cys101→Ser或Cys101→Pro。
在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换中的一个或多个：Arg26→Ser、Phe、Trp、His或Thr，Glu34→Asn、Thr、Arg或Gly，Leu56→Met、Ser、Gln、Phe、His或Asn，和Ser58→Lys、Ala、Arg、Trp或Pro。
在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Met31→Ala、Gly、His、Pro、SerAps、Glu或Gln，Leu33→Tyr、Trp、Tyr、Phe、Pro或Ala，Ser61→Trp或Phe，Asp80→Ser、Met、Pro、Ile、Gln、Tyr、Ser、Val或Thr，Glu104→Leu、Pro、Ser、Ala、Asn、Thr、Lys或Asp，His106→Pro、Gln、Gly、Arg、Val、Thr、Asn或Leu，和Lys108→Gln、Ala、Trp、Tyr、Arg、Asp、Asn、Ser、Glu或Thr。
在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换中的一个或多个：Glu27→Arg、Ser、Gln、Thr、Phe、Lys、Ala或Arg，Pro29→Gly、Asp、Asn、Ile、Leu或Met，Asn32→Ile、Leu、Tyr、Met或Trp，和Leu105→Cys、Tyr、Trp、Glu、Arg、Ser、His、Ala、Val、Asp、Pro、Gly或Lys。
在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Phe28→Cys、Arg、Lys、Trp、Asp、Gly、His、Leu或Asn；Glu30→Arg、Asp、Thr、Ser、Gly、Ala或Asn，Ile57→Tyr、Trp、His、Gln、Thr或Arg，Lys83→Arg、Ser、Gln、Thr或Glu。
在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Arg26→Phe；Asn32→Ile；Glu34→Thr；Leu56→Met；Ser58→Ala和Lys83→Ser。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Arg26→Trp；Asn32→Leu；Glu34→Thr；Leu56→Ser和Ser58→Ala。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Arg26→His；Asn32→Tyr；Glu34→Thr；Leu56→Ser；Ser58→Arg和Lys83→Gln。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Arg26→Phe；Asn32→Met；Glu34→Thr；Leu56→Gln；Ser58→Ala和Lys83→Thr。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Asn32→Trp；Glu34→Arg；Leu56→Asn；Ser58→Trp和Lys83→Ser。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Arg26→Phe；Asn32→Leu；Glu34→Thr；Leu56→Phe；Ser58→Ala和Lys83→Arg。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Arg26→Thr；Asn32→Trp；Glu34→Asn；Leu56→His；Ser58→Pro和Lys83→Ser。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Asn32→Trp；Glu34→Asn；Leu56→Phe；Ser58→Arg和Lys83→Glu。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Arg26→Trp；Asn32→Leu；Glu34→Thr；Leu56→Met；Ser58→Ala和Lys83→Ser。在一些实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Asn32→Trp；Glu34→Gly；Leu56→Gln；Ser58→Ala和Lys83→Gln。
在一些实施方式中，本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的集合中的一个：
(1)Glu27→Ser；Phe28→Arg；Pro29→Gly；Glu30→Asp；Met31→Ala；Leu33→Trp；Ile57→Tyr；Asp80→Met；Glu104→Pro；Leu105→Tyr；His106→Gln；Lys108→Ala，
(2)Glu27→Gln；Phe28→Cys；Pro29→Asp；Glu30→Thr；Met31→Gly；Leu33→Trp；Ile57→Tyr；Leu105→Cys；His106→Gly；Lys108→Trp，
(3)Glu27→Glu；Phe28→Trp；Pro29→Asn；Glu30→Gly；Met31→His；Leu33→Tyr；Ile57→Tyr；Asp80→Pro；Glu104→Ser；Leu105→Trp；His106→Pro；Lys108→Tyr，
(4)Glu27→Thr；Phe28→Asp；Pro29→Asn；Glu30→Ser；Met31→Pro；Leu33→Phe；Ile57→Tyr；Asp80→Ile；Glu104→Ala；Leu105→Glu；His106→Arg；Lys108→Arg，
(5)Glu27→Phe；Phe28→Lys；Pro29→Ile；Glu30→Ala；Met31→Ser；Leu33→Pro；Ile57→Trp；Asp80→Gln；Glu104→Asn；Leu105→Arg；His106→Gln；Lys108→Asp，
(6)Glu27→Lys；Phe28→Gly；Pro29→Pro；Glu30→Thr；Met31→Pro；Leu33→Trp；Ile57→His；Asp80→Tyr；Glu104→Ala；Leu105→Ser；His106→Val；Lys108→Asn，
(7)Glu27→Glu；Phe28→His；Pro29→Leu；Glu30→Ala；Met31→Asp；Leu33→Ala；Ile57→Gln；Asp80→Ile；Glu104→Ala；Leu105→Tyr；His106→Pro；Lys108→Ser，
(8)Glu27→Ala；Phe28→Asp；Pro29→Met；Glu30→Gly；Met31→Asp；Leu33→Pro；Ile57→Thr；Asp80→Thr；Glu104→Thr；His106→Thr；Lys108→Arg，
(9)Glu27→Arg；Phe28→Leu；Pro29→Asp；Glu30→Asn；Met31→Glu；Leu33→Trp；Ile57→Tyr；Asp80→Gln；Glu104→Pro；Leu105→Arg；His106→Asn；Lys108→Ala，
(10)Glu27→Lys；Phe28→Asn；Pro29→Met；Glu30→Gly；Met31→Gln；Leu33→Pro；Ile57→Arg；Asp80→Ile；Glu104→Asp；Leu105→Arg；His106→Leu；Lys108→Thr，或
(11)Glu27→Ser；Phe28→Arg；Pro29→Gly；Glu30→Asp；Met31→Ala；Leu33→Trp；Ile57→Tyr；Asp80→Met；Glu104→Pro；Leu105→Gly；His106→Gln；Lys108→Ala。
在一个具体实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Arg26→Phe；Glu27→Ser；Phe28→Arg；Pro29→Gly；Glu30→Asp；Met31→Ala；Asn32→Ile；Leu33→Trp；Glu34→Thr；Leu56→Met；Ile57→Tyr；Ser58→Ala；Lys83→Ser；Glu104→Pro和Lys108→Thr。在另一个实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，该人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换中的一个或多个：Thr43→Ile或Ala，Glu45→Gly，Asn48→Gly，Glu63→Gly，Ala66→Vla，Glu69→Vla，Lys70→Arg，Ala79→Thr、Met或Vla，Asp80→Met或Ser，Gly82→Ser，His84→Gln，Vla85→Gly，Tyr87→Ser，Ile88→Thr或Leu，His92→Pro，Leu105→His、Gly或Tyr，和His106→Gln或Arg。
在另一个具体实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换的组合：Glu27→Phe；Phe28→Lys；Pro29→Ile；Asn32→Trp；Leu33→Pro；Glu34→Arg；Leu56→Asn；Ile57→Trp；His106→Gln和Lys108→Glu。在又一个具体实施方式中，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，该人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括以下氨基酸置换中的一个或多个：Glu43→Gly或Ala，Glu45→Gly，Ser58→Trp或Arg，Glu63→Asp，Glu69→Gly，Lys70→Arg，Asp80→Gln、Val或Thr，Gly82→Asp，Lys83→Ser或Arg，Ala86→Glu或Ser，Phe99→Leu，Glu102→Lys或Val，Glu104→Asn或Lys，和Pro106→Thr。
在一些进一步的实施方式中，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置79、92和105中的任一个处包含一个或多个突变的氨基酸残基。例如，本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白可包括以下氨基酸置换：Ala79→Met、Thr或Val，His92→Pro和/或Leu105→Ala、Val、Asp、Pro、Arg、Gly、Lys或His。
如上所定义，本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白包括至少一个氨基酸置换，其位于成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列(SEQIDNO:1)的位置26、27、28、30、31、33、34、57、61、80、83、104-106和108的序列位置处。在一些实施方式中，本发明的突变蛋白包括成熟人类泪液脂质运载蛋白的这些序列位置中的二个或更多个，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸置换。在一个具体实施方式中，该突变蛋白在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置26、27、28、30、31、33、53、57、61、64、66、80、83、104-106和108中的每一个处具有突变的氨基酸残基(参见，例如，图10和图14)。
在一些实施方式中，关于成熟人类泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列，本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白还可在成熟人类泪液脂质运载蛋白的环区域内的位置中任一个处包括一个或多个，包括至少二个、至少三个或至少四个天然氨基酸残基由半胱氨酸残基置换的氨基酸置换。在一些实施方式中，根据本发明的突变蛋白在关于成熟人类泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列的位置28或105处包括天然氨基酸由半胱氨酸残基置换的氨基酸置换。
在剩余区域中，即不同于26-34、56-58、80、83、104-106和108的区域中，本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白在突变的氨基酸序列位置以外可包括野生型(天然的)氨基酸序列。在一些实施方式中，根据本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白还可在一个序列位置/多个序列位置处携带一个或多个氨基酸突变，只要这样的突变至少实质上不会妨碍或干扰该突变蛋白的结合活性和折叠即可。这样的突变可以使用已建立的标准方法在DNA层次上及其容易地实现。改变氨基酸序列的示例性实例为插入或缺失以及氨基酸置换。这种置换可为保守性的，即用具有相似化学特性的氨基酸残基替换氨基酸残基，所述相似化学特性具体而言是关于极性以及尺寸。保守性置换的实例为以下组的成员之间的替换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。另一方面，还可以在该氨基酸序列中引入非保守性的改变。此外，除了替换单一氨基酸残基以外，还可以插入或缺失一个或多个连续的泪液脂质运载蛋白的一级结构的氨基酸，只要这些缺失或插入造成稳定折叠的/功能性的突变蛋白(参见，例如，产生具有截短的N端和C端的突变蛋白的实验部分)。
该氨基酸序列的这种修饰包括单一氨基酸位置的直接突变，以便通过引入某些限制性酶的切割位点而简化该突变的脂质运载蛋白基因或其部分的亚克隆。此外，这些突变也可被并入以进一步改进脂质运载蛋白突变蛋白对给定靶标的亲和力。此外，如果需要，可引入突变以便调节该突变蛋白的某些特性，例如改善折叠稳定性、血清稳定性、蛋白质抗性或水溶性，或是减少聚集倾向。例如，天然存在的半胱氨酸残基可被突变为其他氨基酸以防止二硫键形成。还可以故意将其他氨基酸序列位置突变成为半胱氨酸以便引入新的反应基团，例如，为了与其他化合物缀合，例如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、生物素、肽或蛋白质，或是为了形成非天然存在的二硫键。将半胱氨酸残基引入人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白的氨基酸序列的这样的突变的示例性可能性包括以下置换：Thr40→Cys，Glu73→Cys，Arg90→Cys，Asp95→Cys，和Glu131→Cys。在氨基酸位置40、73、90、95和/或131中任一个的一侧处产生的巯基部分可被用来使突变蛋白聚二乙醇化(PEGylate)或羟乙基淀粉化(HESylate)，例如，以便增加相应泪液脂质运载蛋白突变蛋白的血清半衰期。
本发明还涵盖如上定义的突变蛋白，其中成熟人类泪液脂质运载蛋白的序列的N端前四个氨基酸残基(His-His-Leu-Leu；位置1-4)和/或成熟人类泪液脂质运载蛋白的序列的C端最后两个氨基酸残基(在位置157处的Ser和在位置158处的Asp)已被缺失(参见图10和图14)。该野生型序列的另一可能的突变是将序列位置5至7处的氨基酸序列(AlaSerAsp)改变为GlyGlyAsp，如PCT公开WO2005/019256所述。
本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白可包括如SEQIDNOs:3-28、62-71和82所示的氨基酸序列中的任一个或其片段或变体，由如SEQIDNOs:3-28、62-71和82所示的氨基酸序列中的任一个或其片段或变体组成，或实质上由如SEQIDNOs:3-28、62-71和82所示的氨基酸序列中的任一个或其片段或变体组成。
如本文与本发明的脂质运载蛋白突变蛋白有关所用的术语“片段”涉及源自其N端和/或C端缩短(即缺少N端和/或C端氨基酸中的至少一个)的全长成熟脂质运载蛋白的蛋白质或肽。这样的片段可包括该成熟脂质运载蛋白的一级序列的至少10个，更多例如20或30个或更多个连续的氨基酸，且通常在该成熟脂质运载蛋白的免疫分析中可检测到。
如本发明所用的术语“变体”涉及本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的衍生物，其包括氨基酸序列的修饰，例如通过置换、缺失、插入或化学修饰。这样的修饰在一些实施方式中并不减少该突变蛋白的功能性。例如，为了产生这样的变体，本发明的突变蛋白的一个或多个氨基酸可被其各自的D立体异构物或被天然存在的20种氨基酸以外的氨基酸(例如鸟氨酸、羟脯氨酸、瓜氨酸、高丝氨酸、羟基赖氨酸、正缬氨酸)所替换。然而，这样的置换也可是保守性的，即氨基酸残基由化学上相似的氨基酸残基所替换。保守性置换的实例为以下组的成员之间的替换：1)丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸；2)天冬氨酸和谷氨酸；3)天冬酰胺和谷氨酰胺；4)精氨酸和赖氨酸；5)异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可作为单体蛋白存在。在一些实施方式中，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白能够自发性地二聚化或寡聚化。使用形成稳定单体的脂质运载蛋白突变蛋白可在某些应用中具有优势，例如因为较快的扩散和较佳的组织渗透性。在其他实施方式中，使用自发地形成稳定同质二聚体或多聚体的脂质运载蛋白突变蛋白可具有优势，因为这样的多聚体可提供对给定靶标的(进一步)增加的亲和力和/或亲合性。此外，脂质运载蛋白突变蛋白的寡聚体的形式可具有较慢的解离速率或延长的血清半衰期。如果形成稳定的单体的突变蛋白的二聚化或多聚化是期望的，这可以例如通过将各别寡聚结构域例如jun-fos结构域或亮氨酸拉链融合至本发明的突变蛋白或通过使用“Duocalins”来实现(参见下文)。
根据本发明的泪液脂质运载蛋白突变蛋白可通过人类泪液脂质运载蛋白的天然存在形式的突变而获得。如本文所用，术语“突变”意为选择实验条件，使得在人类泪液脂质运载蛋白(Swiss-Prot数据库条目P31025)的给定序列位置处天然存在的氨基酸可被至少一个不存在于该相应天然多肽序列中的此特定位置处的氨基酸所置换。术语“突变”还包括通过缺失或插入一个或多个氨基酸而另外修饰序列区段的长度。因此，例如，在选定序列位置处的一个氨基酸被整个三个随机的突变所替换，从而造成与野生型蛋白的对应区段的长度相比较，插入了两个氨基酸残基，这样的情况包含在本发明的范围内。这样的插入或缺失可被彼此独立地引入到本发明中可经受突变的肽区段的任一个中。在本发明的一个示例性实施方式中，若干突变的插入可被引入到所选定的脂质运载蛋白支架的AB环中(参见PCT公开WO2005/019256，其通过引用全文并入本文中)。术语“随机突变”意为在某个序列位置处不存在预定的单一氨基酸(突变)，但在突变过程中以一定的机率有至少二个氨基酸可以被引入预定的序列位置处。
人类泪液脂质运载蛋白的编码序列(Redl,B.等人(1992)J.Biol.Chem.267,20282-20287)被用作在本发明中选定的肽区段的突变的起始点。对于列举的氨基酸位置的突变，本领域技术人员可用各种已经建立的定点突变标准方法。常用的技术为通过PCR(聚合酶链反应)引入突变，其中使用合成的寡核苷酸混合物，其在所需的序列位置处具有简并碱基组合物。例如，使用密码子NNK或NNS(其中N＝腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶；K＝鸟嘌呤或胸腺嘧啶；S＝腺嘌呤或胞嘧啶)允许在突变过程中并入所有20种氨基酸加上琥珀终止密码子，而密码子VVS(其中V＝腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶)将可能并入的氨基酸数目限制为12个，因为其将氨基酸Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val从并入该多肽序列所选的位置中排除；例如，使用密码子NMS(其中M＝腺嘌呤或胞嘧啶)将在所选的序列位置处可能的氨基酸数目限制为11个，因为其将氨基酸Arg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val从并入该所选的序列位置处排除。在这方面应该注意的是，其他氨基酸(非常规20种天然存在的氨基酸)的密码子，例如硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸也可被并入突变蛋白的核酸中。如Wang,L.等人(2001)Science292,498-500或Wang,L.和Schultz,P.G.(2002)Chem.Comm.1,1-11所述，也可以使用“人工”密码子例如UAG，其通常识别为终止密码子，以便插入其他不常见的氨基酸，例如，邻-甲基-L-酪氨酸或对-氨基苯丙氨酸。
利用具有降低的碱基对特异性的核苷酸构筑块，例如肌苷、8-氧代-2’脱氧鸟苷或6(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3,4-二氢-8H-pyrimindo-1,2-恶嗪-7-酮(Zaccolo等人(1996)J.Mol.Biol.255,589-603)，是另一种将突变引入所选定的序列区段的选择。
另一种可能性是所谓的三联体-突变。此方法使用不同的核苷酸三联体的混合物，其中每一个编码一种氨基酸，用于并入编码序列中(B等人(1994)NucleicAcidsRes22,5600-5607)。
一种可能用于将突变引入各别多肽的选定区域的策略基于使用四个寡核苷酸，其中每一个部分源自要被突变的相应序列区段中的一个。当合成这些寡核苷酸时，本领域技术人员可以利用核酸构筑块的混合物来合成那些对应于要被突变的氨基酸位置的核苷酸三联体，使得随机出现编码所有天然的氨基酸密码子，其最后造成脂质运载蛋白肽文库的产生。例如，在其序列中的第一寡核苷酸对应于(除了突变的位置)在该脂质运载蛋白多肽的最N端位置处要被突变的肽区段的编码链。因此，第二寡核苷酸对应于在该多肽序列中后面的第二序列区段的非编码链。第三寡核苷酸依次对应于相应的第三序列区段的编码链。最后，第四寡核苷酸对应于第四序列区段的非编码链。聚合酶链反应可用相应的第一和第二寡核苷酸进行，如果需要，也可分别用相应的第三和第四寡核苷酸进行。
这两种反应的扩增产物可以通过各种已知的方法组合为包括来自该第一至第四序列区段的序列的单一核酸，其中在选定的位置处已引入突变。为此，这两种产物均可例如经受新的聚合酶链反应，其中使用侧翼的寡核苷酸以及一个或多个介体核酸分子，其贡献在第二和第三序列区段之间的序列。在选择用于突变的寡核苷酸序列内的数目和排列方面，本领域技术人员可使用多种替代方案。
如上文定义的核酸分子可以通过连接与编码脂质运载蛋白多肽的核酸的缺失的5'-和3'-序列和/或载体连接，且可以被克隆到已知的宿主生物体重。有许多已建立的程序可用于连接和克隆。例如，也存在于该克隆载体的序列中的限制性内切酶的识别序列可被工程化到合成的寡核苷酸的序列中。因此，在相应的PCR产物扩增和酶促切割之后，所得到的片段可以使用相应的识别序列而容易地克隆。
在编码选择用于突变的蛋白质的基因内较长的序列区段也可以经由已知方法来经受随机突变，例如，通过使用在增加误差率的条件下进行的聚合酶链反应、通过化学突变或通过使用细菌突变株。这样的方法也可以用于进一步优化脂质运载蛋白突变蛋白的靶标亲和力或特异性。在实验突变的区段以外可能发生的突变通常是被容忍的，或甚至可以证实是有利的，例如如果它们对该脂质运载蛋白突变蛋白的折叠效率或折叠稳定性具有贡献的话。
在根据本发明的一个示例性方法中，使编码人类泪液脂质运载蛋白的核酸分子在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列(SEQIDNO:1)的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的一个或多个处经受突变。在一些实施方式中，该核酸分子进一步在该成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置61、101、111、114和153中的一个或多个处经受突变。
在本发明的一个实施方式中，用于产生人类泪液脂质运载蛋白的突变蛋白的方法包括，使成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任一个的密码子的至少2、3、4、5、6、8、10、12、14、15、16、或17个突变。在一个实施方式中，使成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26、27、28、29、30、31、32、33、34、56、57、58、80、83、104、105、106和108的密码子的所有18个突变。
在本发明的另一个实施方式中，根据本发明的方法包括编码在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列(SEQIDNO:1)中的位置61和153处的半胱氨酸的两个密码子的突变。在一个实施方式中，位置61被突变为编码丙氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、甲硫氨酸、丝氨酸、脯氨酸或色氨酸残基，仅举出几种可能性而已。在位置153被突变的实施方式中，氨基酸例如丝氨酸或丙氨酸可以被引入到位置153处。
如本文所述，在本发明的另一个实施方式中，编码成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置111和/或114的密码子被突变为编码例如在位置111处的精氨酸和在位置114处的色氨酸。
本发明的方法的另一个实施方式包括编码在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的位置101处的半胱氨酸的密码子的突变，使得该密码子编码任何其他氨基酸。在一个实施方式中，编码位置101的突变的密码子编码丝氨酸。因此，在一些实施方式中，在位置61、101和153处的半胱氨酸密码子中的二个或所有三个均被另一个氨基酸的密码子所替代。
根据本发明的方法，脂质运载蛋白突变蛋白的获得开始于编码人类泪液脂质运载蛋白的核酸分子。这样的核酸分子经受突变，且通过重组DNA技术被引入到适当的细菌或真核生物宿主生物体中。使用本领域已知的任何适当的技术可以获得脂质运载蛋白突变蛋白的核酸文库，以产生具有抗体样的特性的脂质运载蛋白突变蛋白，即对给定靶标具有亲和力的突变蛋白。这种组合方法的实例详述于例如，PCT公开WO99/16873、WO00/75308、WO03/029471、WO03/029462、WO03/029463、WO2005/019254、WO2005/019255、WO2005/019256、或WO2006/56464。这些专利申请中的每一个的内容均通过引用全文并入本文中。将经受突变的核酸序列在适当的宿主中表达之后，可以从获得的文库中筛选携带多个相应脂质运载蛋白突变蛋白的基因信息的克隆，所述突变蛋白结合给定靶标。熟知技术可用于筛选这些克隆，例如噬菌体展示(在Kay,B.K.等人(1996年)，同上；Lowman,H.B.(1997年)，同上或Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999年)，同上中的综述)、菌落筛选(在Pini,A.等人(2002)Comb.Chem.HighThroughputScreen.5,503-510中的综述)、核醣体展示(在Amstutz,P.等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12,400-405中的综述)或在Wilson,D.S.等人(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98,3750-3755中所报告的mRNA展示，或在WO99/16873、WO00/75308、WO03/029471、WO03/029462、WO03/029463、WO2005/019254、WO2005/019255、WO2005/019256、或WO2006/56464中所具体描述的方法。
所得到的编码一种或多种本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子可使用任何适当的表达系统被表达。获得的一种脂质运载蛋白突变蛋白或多种脂质运载蛋白突变蛋白可以被进一步筛选。筛选可在例如竞争性条件下进行。如本文所用的竞争性条件意为脂质运载蛋白突变蛋白的筛选涵盖至少一个步骤，其中使该脂质运载蛋白突变蛋白和给定的野生型脂质运载蛋白的非天然配体在存在另外的配体的情况下接触，该另外的配体与该突变蛋白竞争与该非天然配体的结合。此另外的配体可为该靶标的生理配体、过量的该靶标本身或该靶标的任何其他非生理配体，其至少结合与本发明的突变蛋白识别的表位重叠的表位，因此干扰该突变蛋白的靶标结合。可替代地，通过将与该突变蛋白的结合位置不同的表位以变构效应复合到该靶标上，该另外的配体竞争该突变蛋白的结合。
使用温和的M13噬菌体的噬菌体展示技术的一个实施方式(在Kay,B.K.等人(1996年)，同上；Lowman,H.B.(1997年)同上或Rodi,D.J.和Makowski,L.(1999年)中综述)提供作为可用于本发明的筛选方法的实例。可用来筛选本发明突变蛋白的噬菌体展示技术的另一个实施方式为Broders等人所描述的超级噬菌体技术(Broders等人，(2003)“Hyperphage.Improvingantibodypresentationinphagedisplay.”MethodsMol.Biol.205:295-302)。其他温和噬菌体例如f1或裂解性噬菌体例如T7也可被采用。针对示例性筛选方法，产生M13噬菌粒，其允许突变的脂质运载蛋白核酸序列表达为N端带有信号序列的融合蛋白，例如OmpA-信号序列，且带有该M13噬菌体的壳体蛋白pIII或其能够在C端被并入该噬菌体壳体蛋白的片段。包括野生型序列的氨基酸217至406的噬菌体壳体蛋白的C端片段ΔpIII可被用来产生融合蛋白。在一个实施方式中，使用pIII的C端片段，其中在位置201处的半胱氨酸残基丢失或被另一氨基酸所替换。
据此，本发明的方法的一个进一步的实施方式包括可操作地融合编码一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，且由突变得到在3’端具有编码M13家族的丝状噬菌体的壳体蛋白pIII或该壳体蛋白的片段的基因，以便筛选用于与给定配体结合的至少一个突变蛋白。
该融合蛋白可包括另外的组分，例如亲和力标签，其允许该融合蛋白或其部分的固定、检测和/或纯化。此外，终止密码子可位于编码该脂质运载蛋白或其突变蛋白的序列区域和该噬菌体壳体基因或其片段之间，其中该终止密码子，例如琥珀终止密码子，在适当抑制株中的翻译过程中至少部分被翻译为氨基酸。
例如，该噬菌粒载体pTLPC27(参见，例如，PCT公开WO2008/015239的图20和SEQIDNO:9)，也称为pTlc27，可被用于制备编码人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒文库。本发明的编码该泪液脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子可使用二个BstXI限制性位点而被插入到该载体中。在连接之后，用所得的核酸混合物转化适当的宿主株例如E.coliXL1-Blue以得到大量的独立克隆。如果需要，可产生相应的载体用于制备超级噬菌体文库。
所得到的文库接着在液体培养物中用适当的M13-辅助噬菌体或超级噬菌体进行超级感染，以便产生功能性噬菌粒。该重组噬菌粒在其表面上展示该脂质运载蛋白突变蛋白，作为与该壳体蛋白pIII或其片段的融合物，而该融合蛋白的N端信号序列被正常地切除。另一方面，其还带有一个或多个拷贝数的由该辅助噬菌体供应的天然壳体蛋白pIII，因此能够感染接受者，一般而言为带有F-或F’质粒的菌株。在超级噬菌体展示的情况下，该超级噬菌体在其表面上展示该脂质运载蛋白突变蛋白，作为与感染性壳体蛋白pIII的融合物，但不具有天然的壳体蛋白。在感染辅助噬菌体或超级噬菌体的过程中或之后，可诱导该脂质运载蛋白突变蛋白和该壳体蛋白pIII之间的融合蛋白的基因表达，例如通过添加无水四环霉素。选择诱导条件使得获得的噬菌粒的主要部分在其表面上展示至少一个脂质运载蛋白突变蛋白。在超级噬菌体展示的情况下，诱导条件导致带有三至五条由该脂质运载蛋白突变蛋白和该壳体蛋白pIII组成的融合蛋白的超级噬菌粒的群。已知各种用于分离噬菌粒的方法，例如用聚乙二醇沉淀。分离通常在培养6-8小时之后进行。
分离的噬菌粒接着可通过与所需靶标一起培养来经受筛选，其中该靶标以这样的形式呈现，所述形式允许至少暂时固定携带具有所需结合亲和力的突变蛋白作为在其壳体上的融合蛋白的那些噬菌粒。本领域技术人员已知的各种实施方式中，该靶标可例如与载体蛋白例如血清白蛋白缀合，且通过该载体蛋白与蛋白结合表面例如聚苯乙烯结合。适用于ELISA技术或所谓的“免疫粘附”的微量滴定板可用于例如固定该靶标。替代性地，也可使用该靶标与其他结合基团例如生物素的缀合物。该靶标接着可以被固定在选择性地结合该基团的表面上，例如微量滴定板或涂覆了链霉亲和素、中性亲和素或抗生物素蛋白的顺磁粒子。如果该靶标与免疫球蛋白的Fc部分融合，也可使用例如微量滴定板或涂覆了蛋白A或蛋白G的顺磁粒子的表面实现固定。
呈现于表面上的非特异性噬菌粒结合位置可以用封闭溶液饱和，如已知用于ELISA的方法的封闭溶液。然后该噬菌粒一般在存在生理缓冲液的情况下与固定在表面上的靶标接触。未结合的噬菌粒通过多次清洗来移除。留在该表面上的噬菌粒粒子接着被洗脱。若干方法可用于洗脱。例如，该噬菌粒可以通过添加蛋白酶或在存在酸、碱、清洁剂或离液盐或者在适度变性的条件下进行洗脱。一种这样的方法为使用pH2.2的缓冲液洗脱，其中该洗脱液随后被中和。替代性地，可添加不含靶标的溶液以便与该固定的靶标竞争与该噬菌粒的结合，或者靶标特异性的噬菌粒可通过与免疫球蛋白或与目标靶标特异性结合的天然配体蛋白竞争而被洗脱。
之后，用洗脱的噬菌粒感染大肠杆菌细胞。替代性地，可从洗脱的噬菌粒中提取核酸序列，用于序列分析、扩增或以另一种方式转化细胞。从由此方法获得的大肠杆菌克隆开始，新鲜的噬菌粒或超级噬菌粒再次根据上述方法通过用M13辅助噬菌体或超级噬菌体超级感染而产生，且以此方法扩增的噬菌粒再次地在固定的靶标上经受筛选。为了获得优化形式的带有本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒，多重筛选周期通常是必要的。在一些实施方式中，选择筛选周期的数目，使得在其后的功能分析中至少0.1％的被研究的克隆产生对于给定靶标具有可检测亲和力的突变蛋白。取决于尺寸，即所用的文库的复杂度，一般需要2至8个周期以达到此目的。
针对所筛选的突变蛋白的功能性分析，以得自该筛选周期的噬菌粒感染大肠杆菌菌株，且分离相对应的双股噬菌粒DNA。由此噬菌粒DNA开始，或也由从该噬菌粒提取的单股DNA开始，本发明所筛选的突变蛋白的核酸序列可以通过本领域已知的方法来测定，且氨基酸序列可由其推导。突变的区域或整个脂质运载蛋白突变蛋白的序列可被亚克隆到另一个表达载体上，且在适当的宿主生物体中表达。例如，载体pTLPC26(如图9中的描述所述)，也称为pTlc26，可被用于在大肠杆菌菌株例如E.coliTG1中表达。由此所产生的脂质运载蛋白突变蛋白可通过各种生物化学方法纯化。例如用pTlc26产生的脂质运载蛋白突变蛋白可携带亲和力肽，一种所谓的亲和力标签，例如在其C端，且因此可以通过亲和色谱法进行纯化。亲和力标签的实例包括、但不限于生物素、Strep-tag、Strep-tagII(Schmidt等人，同上)、寡聚组氨酸、聚组氨酸、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或钙调蛋白结合肽(CBP)。
一些亲和力标签为半抗原，例如但不限于，二硝基酚和地高辛。一些亲和力标签为表位标签，例如-肽(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly)、T7表位(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、单纯疱疹病毒糖蛋白D的序列Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp的HSV表位、序列Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala的血凝素(HA)表位、水泡性口炎病毒糖蛋白的VSV-G表位(Cys-Tyr-The-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Lys)、序列Gly-Ala-Pro-Val-Pro-Tyr-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg的E表位标签、序列Gly-Val-Ser-Ser-Thr-Ser-Ser-Asp-Phe-Arg-Asp-Arg的E2表位标签、哺乳动物MAPK/ERK激酶的C端序列Glu-Glu-Thr-Ala-Arg-Phe-Gln-Pro-Gly-Tyr-Arg-Ser的Tag-100表位标签、序列Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser的S-标签、转录因子c-myc的序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu的“myc”表位和猿猴病毒5的副粘病毒的P和V蛋白上存在的小V5表位(Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)。此外，但一般不作为单一标签，可使用增加可溶性的标签例如NusA、硫氧还原蛋白(TRX)、小泛素样修饰剂(SUMO)和泛素(Ub)。半抗原和表位标签可与对应抗体或抗体样的蛋白质性分子组合使用作为结合配偶体。序列Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser的S-肽表位可被用作与相应抗体结合或与S-蛋白组合的表位标签作为结合配偶体(Hackbarth,JS,等人,BioTechniques(2004)37,5,835-839)。
筛选也可以其他方式进行。许多相应的实施方式是本领域技术人员已知的，或描述于文献中。此外，可应用方法的组合。例如，筛选的或至少通过“噬菌体展示”富集的克隆可另外进行“菌落筛选”。此操作程序的优点为可以关于对于靶标具有可检测结合亲和力的突变蛋白的产生直接分离处的个别克隆。
除了使用大肠杆菌作为在“噬菌体展示”技术或“菌落筛选”方法中的宿主生物体之外，其他细菌菌株、酵母或昆虫细胞或哺乳动物细胞也可被用于此目的。为了进一步从如上所述的随机文库中筛选脂质运载蛋白突变蛋白，还可应用包括限制突变的演进的方法，以便在重复筛选周期之后关于对于靶标的亲和力或特异性优化已经对于该靶标具有某些结合活性的突变蛋白。
对技术人员而言很明显的是，复合物形成取决于许多因素，例如结合配偶体的浓度、竞争者的存在、缓冲系统的离子强度等。筛选和富集一般在允许分离脂质运载蛋白突变蛋白的条件下进行，所述脂质运载蛋白突变蛋白在与所需靶标复合的情况下，具有至少200nM的解离常数。然而，洗涤和洗脱步骤可在不同的严格度下进行。关于该动力学特性的筛选也是可能的。例如，筛选可在有利于该靶标与突变蛋白形成复合物的条件下进行，所述突变蛋白显示出从该靶标缓慢解离，或换句话说具有低koff速率。可选地，筛选可在有利于突变蛋白与靶标之间复合物的快速形成或换句话说具有高kon速率的条件下进行。作为进一步示例性的替代方法，筛选可在筛选突变蛋白的改进的热稳定性(与野生型脂质运载蛋白或已对预先筛选的靶标具有亲和力的突变蛋白相比较)的条件下进行。
一旦已经筛选出对给定靶标具有亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白，另外也可以使这样的突变蛋白进行另一次突变，以便随后筛选具有甚至更高亲和力的变体或具有改进特性的变体，例如更高的热稳定性、改进的血清稳定性、热力学稳定性、改进的溶解度、改进的单体行为、改进的热变性抗性、化学变性抗性、蛋白水解抗性或清洁剂抗性等。此进一步的突变，其中在目标为更高亲和力可被视为体外“亲和力成熟”的情况下，可通过基于合理设计的位置特异性突变或随机突变来实现。用于获得更高亲和力或改进的特性的另一可能方法为使用易错PCR，其造成在脂质运载蛋白突变蛋白的序列位置的选定范围内的点突变。易错PCR可根据任何已知的实验方法来进行，例如由Zaccolo等人，(1996)J.Mol.Biol.255,589-603中所描述的。适用于此目的的随机突变的其他方法包括如Murakami,H.等人(2002)Nat.Biotechnol.20,76-81所述的随机插入/缺失突变，或者如Bittker,J.A.等人(2002)Nat.Biotechnol.20,1024-1029所述的非同源随机重组(NRR)。如果需要的话，亲和力突变还可根据WO00/75308或Schlehuber,S.等人(2000)J.Mol.Biol.297,1105-1120中所描述的操作程序进行，其中获得对地高辛具有高亲和力的胆色素结合蛋白的突变蛋白。
在这方面，对技术人员而言很清楚的是，亲和力的KD值(在各突变蛋白与其配体之间形成的复合物的解离常数)可在某个实验范围内变化，取决于用于测定特定脂质运载蛋白突变蛋白对于给定配体的亲和力的方法和实验设置。这表示，例如取决于该KD值是通过表面等离子体共振(Biacore)还是通过竞争性ELISA测定，在测得的KD值中可能有轻微的偏差或容忍范围。
另外也包括在本发明的范围中的是上述突变蛋白的形式，其中个别突变蛋白关于其潜在的免疫性已被改变或修饰。
细胞毒性T-细胞识别在与I类主要组织相容性复合物(MHC)分子相关的抗原呈递细胞的细胞表面上的肽抗原。该肽与MHC分子结合的能力是等位基因特异的，且与其免疫原性相关。为了减少给定蛋白质的免疫原性，预测在蛋白质中的哪些肽具有与给定的MHC分子结合的潜力的能力是很有价值的。采用计算线程方式以确认潜在的T-细胞表位的方法在先前已被描述，以预测给定的肽序列与MHCI类分子的结合(Altuvia等人(1995)J.Mol.Biol.249,244-250)。
这种方法也可用于鉴别在本发明的突变蛋白中的潜在的T细胞表位，并取决于其预期用途，基于其预测的免疫原性利用特定突变蛋白的筛选。还可以进一步使已预测含有T细胞表位的肽区域经受另外的突变，以减少或消除这些T细胞表位，从而使免疫原性最小化。已描述了将双性表位从基因工程改造的抗体中移除(Mateo等人(2000)Hybridoma19,6,463-471)，且可适用于本发明的突变蛋白。
由此获得的突变蛋白可具有最小化的免疫原性，这对于将它们用于例如下文所述的那些的治疗和诊断应用中是所期望的。
对于本文所公开的脂质运载蛋白突变蛋白的若干应用，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与部分例如在其N端或其C端融合，所述部分可为蛋白质、蛋白区域或肽，例如信号序列和/或亲和力标签。
亲和力标签，如或II(Schmidt,T.G.M.等人(1996)J.Mol.Biol.255,753-766)、myc-标签、FLAG-标签、His6-标签或HA-标签或蛋白质例如谷胱甘肽-S-转移酶，也允许容易地检测和/或纯化重组蛋白，是适合的融合配偶体的进一步实例。最后，具有生色或荧光特性的蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)或黄色荧光蛋白(YFP)也是适合于本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的融合配偶体。例如，当用于下文实施例中所述的实验时，本文所公开的脂质运载蛋白突变蛋白携带由10个氨基酸(SAWSHPQFEK)组成的C端II纯化标签(IBAGmbH)。
对于一些应用，以标记的形式采用本发明的突变蛋白也是有用的。相应地，本发明还涉及与选自下述的标记部分缀合的脂质运载蛋白突变蛋白：酶标记、放射性标记、有色标记、荧光标记、生色标记、发光标记、半抗原、地高辛、生物素、金属复合物、金属、胶体金。该突变蛋白还可与低分子量的有机化合物缀合。如本文所用，术语“低分子量的有机化合物”意指单体碳基化合物，其可具有脂肪族、脂环族和/或芳香族部分。在典型的实施方式中，该低分子量的有机化合物为具有至少二个碳原子的主链的有机化合物，且在一些实施方式中不超过7或12个可旋转的碳键。这样的化合物的分子量在约100至约2000道尔顿、例如约100至约1000道尔顿的范围内。其可任选地包括一个或二个金属原子。
一般而言，可以用任何合适的化学物质或酶标记脂质运载蛋白突变蛋白，所述化学物质或酶以化学、物理、光学或酶促反应直接或间接产生可检测的化合物或信号。用于物理反应且同时用于光学反应/标记物的一个实例为经照射发射荧光，或当使用放射性标记时，发射x-射线。碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶为酶标记的实例(且同时为光学标记)，其催化生色反应产物的形成。一般而言，通常用于抗体的所有标记(那些专门用于免疫球蛋白的Fc部分内的糖部分的除外)，也可用于与本发明的突变蛋白缀合。本发明的突变蛋白也可以与任何合适的治疗活性剂缀合，例如，用于将这些试剂靶向性地递送到给定的细胞、组织、器官，或者用于选择性靶向细胞，例如，在不影响周围正常细胞的情况下靶向肿瘤细胞。这样的治疗活性剂的实例包括放射性核素、毒素、有机小分子和治疗性肽(例如作为细胞表面受体的激动剂/拮抗剂的肽，或者竞争在给定靶标上的蛋白结合位点的肽)。然而，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白也可以与治疗活性核酸分子缀合，所述核酸分子例如反义核酸分子、小干扰RNA、微小RNA或核糖酶。这样的缀合物可通过本领域熟知的方法产生。
在一个实施方式中，本发明的突变蛋白也可以被耦合到部分，所述部分可靶向受试者体内的特定身体区域、生物体、组织、器官或细胞，以便将本发明的突变蛋白递送到此受试者的所需身体区域、生物体、组织、器官或细胞中。其中可能需要这样的修改的一个实例是血脑屏障的穿越。为了穿越血脑屏障，本发明的突变蛋白可以耦合至有助于穿越此屏障的主动转运的部分(参见GaillardPJ等人，Diphtheria-toxinreceptor-targetedbraindrugdelivery.InternationalCongressSeries,20051277,185-198或GaillardPJ等人Targeteddeliveryacrosstheblood-brainbarrier.ExpertOpinDrugDeliv.20052,299-309)。这样的蛋白部分例如以商品名2B-TransTM可得(至BBBtechnologiesBV,Leiden,NL)。
如上所指出的，在一些实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可以与可延长该突变蛋白的血清半衰期的部分缀合(此方面也参见PCT公开WO2006/56464，其中这样的缀合策略参考对于CTLA-4具有结合亲和力的人类嗜中性粒细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白突变蛋白进行描述)。在本说明书中使用时，术语“缀合物”或“缀合”包括将部分通过化学试剂连接到脂质运载蛋白突变蛋白，所述化学试剂例如交联剂或是将部分耦合到氨基酸等的侧基团的试剂。此外，当用于本文时，该术语应理解为包括将部分通过形成共价键在任一端基因融合至脂质运载蛋白突变蛋白，例如通过翻译方式将可延长半衰期的部分融合至脂质运载蛋白突变蛋白。技术人员将从使用所述术语的上下文理解到，化学试剂是否用于缀合，或者翻译方式的融合是否意为通过遗传工程来实现。延长血清半衰期的部分可以是聚亚烷基二醇分子、羟乙基淀粉、脂肪酸分子例如棕榈酸(Vajo和Duckworth(2000)Pharmacol.Rev.52,1-9)、免疫球蛋白的Fc部分、免疫球蛋白的CH3结构域、免疫球蛋白的CH4结构域、白蛋白或其片段、白蛋白结合肽或白蛋白结合蛋白、转铁蛋白，仅举几个例子而已。该白蛋白结合蛋白可为细菌白蛋白结合蛋白、白蛋白结合肽、工程化的白蛋白结合多肽、抗体、包括结构域抗体的抗体片段(参见例如美国专利6,696,245)或对于白蛋白具有结合活性的脂质运载蛋白突变蛋白。相应地，用于延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期的适合的缀合配偶体包括白蛋白(Osborn,BL等人(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.303,540-548)，或白蛋白结合蛋白，例如，细菌白蛋白结合结构域，如链球菌G蛋白的结构域(T.和SkerraA.(1998)J.Immunol.Methods218,73-83)。可被用作缀合配偶体的白蛋白结合肽的实例为例如具有Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys共有序列的那些，其中Xaa1是Asp、Asn、Ser、Thr、或Trp；Xaa2是Asn、Gln、His、Ile、Leu、或Lys；Xaa3是Ala、Asp、Phe、Trp、或Tyr；Xaa4是Asp、Gly、Leu、Phe、Ser、或Thr，如美国专利申请2003/0069395或Dennis等人(Dennis,M.S.,Zhang,M.,Meng,Y.G.,Kadkhodayan,M.,Kirchhofer,D.,Combs,D.&Damico,L.A.(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043)中所述。
链球菌G蛋白(SpG)为存在于某些链球菌菌株表面上的双官能受体，能够与IgG和血清白蛋白二者结合(Bjorck等人，MolImmunol24:1113,1987)。该结构以若干结构和功能上不同的结构域高度重复(Guss等人，EMBOJ5:1567,1986)，更确切地说，是三个Ig结合结构域和三个血清白蛋白结合结构域(Olsson等人，EurJBiochem168:319,1987)。在SpG中该三个血清白蛋白结合结构域之一的结构已被确定，显示三螺旋束折叠(Kraulis等人，FEBSLett378:190,1996；Johansson等人，J.Biol.Chem.277:8114-20,2002)。46个氨基酸基序被定义为ABD(白蛋白结合结构域)，随后也被命名为G148-GA(GA为G蛋白相关的白蛋白结合)。例如，在PCT公开WO2009/016043中公开了该46个氨基酸基序ABD的白蛋白结合变体。
除了在G蛋白中的那些结构域之外，其它细菌白蛋白结合结构域也已确定，其中一些在结构上类似于G蛋白的那些结构域。含有这样的白蛋白结合结构域的蛋白质的实例为PAB、PPL、MAG和ZAG蛋白(Rozak等人，Biochemistry45:3263-3271,2006)。这样的白蛋白结合结构域的结构和功能的研究已经进行，如由Johansson及其同事所报道(Johansson等人，JMolBiol266:859-865,1997)。此外，Rozak等人报道了G148-GA3的人工变体的创造，其被筛选并关于不同的物种特异性和稳定性进行了研究(Rozak等人，Biochemistry45:3263-3271,2006)，而Jonsson等人开发了对于人类血清白蛋白具有非常大改进的亲和力的G148-GA3人工变体(Jonsson等人，ProtEngDesSel21:515-27,2008)。对于一些变体而言，实现更高的亲和力的代价是降低热稳定性。
除了上述含有该三螺旋的蛋白质之外，也有其他结合白蛋白的不相关的细菌蛋白质。
最近，在链球菌G蛋白菌株148(G148)的白蛋白结合区域内实验性地鉴别出一些T和B细胞表位(Goetsch等人，ClinDiagnLabImmunol10:125-32,2003)。该研究的作者将G148的T细胞表位用于疫苗中有兴趣，即利用该白蛋白结合区域的固有的免疫刺激特性。Goetsch等人还发现了B细胞表位，即在免疫后在G148的序列中被抗体結合的区域。
然而，在用于人类施用的药物組合物中，需要的是无免疫反应。因此，该白蛋白结合结构域G148由于其上述免疫刺激特性而由此不适合用于此类组合物中。这些缺点和缺陷可由例如在PCT公开WO2012/004384中公开的工程化的白蛋白结合多肽克服或减缓，所述PCT公开通过引用全文并入本文。
在这方面，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与白蛋白结合蛋白缀合，其经由一个或多个肽键连接物，例如GGG与KLGGGG作为非限制实例，与人类血清白蛋白(“HAS”)结合。在一些实施方式中，该白蛋白结合蛋白可以是白蛋白结合结构域，例如链球菌G蛋白菌株148(G148)。在一些其他实施方式中，白蛋白结合蛋白可以是工程化的白蛋白结合多肽。例如，该白蛋白结合多肽可以具有包含SEQIDNO:85的氨基酸序列。SEQIDNO:85的白蛋白结合多肽在一些实施方式中可因此具有另外的氨基酸残基，其附着在任一末端，如三个氨基酸KLN。在这方面，本发明提供了示例性的缀合脂质运载蛋白突变蛋白，其包含如SEQIDNO:83-84中任一个所示的氨基酸序列。
在其它实施方式中，白蛋白本身或白蛋白的生物活性片段可以用作本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的结合配偶体。术语“白蛋白”包括所有哺乳动物白蛋白，例如人类血清白蛋白(“HAS”)或牛血清白蛋白或大鼠白蛋白。白蛋白或其片段可以重组方式产生，如美国专利5,728,553或欧洲专利申请EP0330451和EP0361991中所描述的。作为代表性的实例，重组人类白蛋白NovozymesDeltaLtd.(Nottingham,UK)可与脂质运载蛋白突变蛋白缀合或融合以延长该突变蛋白的半衰期。
如果白蛋白结合蛋白是抗体片段，其也可以是结构域抗体。工程化结构域抗体以允许精確地控制生物物理特性和体内半衰期，从而建立最佳的安全性和有效性的产品概况。结构域抗体例如从DomantisLtd(Cambridge,UKandMA,USA)商购得到。
使用转铁蛋白作为部分来延长本发明的突变蛋白的血清半衰期，该突变蛋白可以基因融合至非糖基化转铁蛋白的N或C端或两端。非糖基化转铁蛋白具有14-17天的半衰期，且转铁蛋白的融合蛋白也将类似地具有延长的半衰期。转铁蛋白载体也提供高生物利用度、生物分布和循环稳定性。此技术可从BioRexis商购得到(BioRexisPharmaceuticalCorporation,PA,USA)。作为蛋白质稳定剂/半衰期延长配偶体的重组人类转铁蛋白(DeltaFerrinTM)也可从NovozymesDeltaLtd.(Nottingham,UK)商购得到。
如果免疫球蛋白的Fc部分被用于延长本发明的突变蛋白的血清半衰期的目的，则可使用可从SyntonixPharmaceuticals,Inc(MA,USA)商购得到的SynFusionTM技术。使用此Fc融合技术允许产生长效生物药物，且可例如由连接到抗体的Fc区的突变蛋白的两个拷贝组成，以提高药物动力学、溶解度和生产效率。
然而，延长本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的半衰期的另一替代方案为将长的、非结构化的、柔性的富含甘氨酸的序列(例如，具有约20至80个连续甘氨酸残基的聚甘氨酸)融合至本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的N或C端。此方法公开于例如WO2007/038619中，也称为术语“rPEG”(重组PEG)。
如果聚亚烷基二醇分子被用于延长本发明的突变蛋白的血清半衰期的目的，则聚亚烷基二醇可为被取代、未被取代、直链或支链的。它也可以是活化的聚亚烷基衍生物。合适的化合物的实例为聚乙二醇(PEG)分子或其活化的衍生物，如在WO99/64016、美国专利6,177,074或美国专利6,403,564中有关干扰素所描述的，或如对于例如经PEG修饰的天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶(PEG-ADA)或PEG-超氧化物歧化酶(参见例如，Fuertges等人(1990)TheClinicalEfficacyofPoly(EthyleneGlycol)-ModifiedProteinsJ.Control.Release11,139-148)的蛋白质所描述的。这样的聚合物(例如聚乙二醇)的分子量可为约300至约70000道尔頓，包括例如，具有约10,000、约20,000、约30,000或约40000道尔頓的分子量的聚乙二醇。此外，由于例如在美国专利6,500,930或6,620,413中所述，碳水化合物寡聚物与聚合物，如淀粉或羟乙基淀粉(HES)，可与本发明的突变蛋白缀合以实现延长血清半衰期的目的。在一些进一步的实施方式中，为了延长本发明的突变蛋白的血清半衰期，建议使用PEG30或PEG40，其在动物/人类可进行不同于较短的PEG的正常肾过滤，因为PEG12或PEG20的更快消除可限制本发明的PEG缀合的脂质运载蛋白突变蛋白(聚乙二醇化)的效力和持续时间。在这方面，本发明提供了示例性的可与PEG缀合的如SEQIDNO:30-32所示的脂质运载蛋白突变蛋白。
在另一个实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可与一个或多个部分融合，所述部分可给该融合物赋予新特性，例如酶促活性或对于其它分子的结合亲和力。这类合适的部分的实例为碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、谷胱甘肽-S-转移酶、G蛋白的白蛋白结合结构域、蛋白A、抗体片段、寡聚化结构域、具有相同或不同结合特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(其导致形成“Duocalins”，参见SchlehuberS.和SkerraA.(2001年)，Duocalins，源自自脂质运载蛋白折叠的具有双特异性的工程化的配体结合蛋白，Biol.Chem.382,1335-1342)或毒素。
特别是，可将本发明的脂质运载蛋白突变蛋白与单独的酶活性位点融合，使得产生的融合物的两个“部件”可以一起作用于给定的治疗靶标上。例如，当融合在一起时，脂质运载蛋白突变蛋白的结合结构域可附着于致病靶标上，由此允许该酶结构域消除该靶标的生物学功能。
如果上述部分之一与本发明的人类泪液脂质运载蛋白突变蛋白缀合时，缀合至氨基酸侧链可以是有利的。合适的氨基酸侧链可以天然存在于人类泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列中，或可通过突变将其引入。在合适的结合位置经由突变被引入的情况下，一种可能性是在适当的位置上将氨基酸替换为半胱氨酸残基。在一个实施方式中，这样的突变包括Thr40→Cys、Glu73→Cys、Arg90→Cys、Asp95→Cys或Glu131→Cys置换中的至少一个。在这些位置中任一个处的新产生的半胱氨酸残基可在以下被用于将突变蛋白与延长该突变蛋白的血清半衰期的部分缀合，所述部分例如PEG或其活化的衍生物。
在另一个实施方式中，为了提供合适的氨基酸侧链以将上述部分之一一与本发明的突变蛋白缀合，可以通过突变引入人工氨基酸。一般而言，这样的人工氨基酸被设计成更具反应性，从而有助于与所需的部分缀合。这种可经由人工tRNA引入的人工氨基酸的一个实例为对乙酰基-苯丙氨酸。
在一些实施方式中，根据本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可包含信号序列。在多肽的N端的信号序列将这个多肽引导至特定的细胞腔室，例如大肠杆菌的周质或真核细胞的内质网。本领域已知大量信号序列。用于使多肽分泌到大肠杆菌的周质中的示例性信号序列为OmpA-信号序列。
本发明还涉及包括编码如本文所述的突变蛋白的核苷酸序列的核酸分子(DNA和RNA)。由于遗传密码子的简并性允许某些密码子被其他指定相同氨基酸的密码子所置换，本发明并不限于编码本发明的突变蛋白的特定核酸分子，而是涵盖包含编码功能性突变蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。在这方面，本发明提供编码本发明的某些脂质运载蛋白突变蛋白的核酸序列(如SEQIDNO:36-61、72-81和86-89所示)。
因此，本发明包括编码根据本发明的突变蛋白的核酸序列，其具有在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的至少一个密码子处的突变，其中编码在该成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置61与153处的半胱氨酸残基的至少一个的密码子已被突变为编码任何其他氨基酸残基。在一些进一步的实施方式中，编码根据本发明的突变蛋白的核酸序列具有在该成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置79、92和105中的任一位置上的至少一个密码子处的突变。
如本文所公开的内容也包括编码本发明的泪液脂质运载蛋白突变蛋白的核酸分子，其包括实验突变的所指示的序列位置之外的另外的突变。这种突变通常可被容忍，或者甚至被证明是有利的，例如，如果它们对于该突变蛋白的改进的折叠效率、血清稳定性、热稳定性或配体结合亲和力具有贡献的话。
在本申请中所公开的核酸分子可被“可操作地连接”至一个或多个调控序列，以允许表达该核酸分子。
如果核酸分子如DNA包括含有关于转录和/或翻译调控的序列元件，且这样的序列被“可操作地连接“至编码多肽的核苷酸序列，则该核酸分子被称为“能够表达核酸分子”或者能够“允许表达核酸分子”。可操作的连接为这样的连接，其中调节序列元件与要表达的序列以使基因能够表达的方式连接。基因表达所需的调节区域的确切性质在不同物种之间可有所不同，但一般而言，这些区域包括启动子，其在原核生物中包含启动子本身，即指导转录启动的DNA分子；以及DNA元件，其当转录成RNA时，将发出翻译起始的信号。这样的启动子区域通常包括涉及转录和翻译起始的5'非编码序列，如-35/-10盒和在原核生物中的Shine-Dalgarno元件或在真核生物中的TATA盒、CAAT序列以及5'-加帽元件。这些区域还可以包括增强子或抑制子元件，以及用于将天然多肽靶向到宿主细胞的特定腔室的翻译信号和前导序列。
此外，3'端非编码序列可以含有参与转录终止、聚腺苷酸化等等的调控元件。然而，如果这些终止序列不在特定宿主细胞中具有令人满意的功能，那么它们可以被替换为在该细胞中具有功能的信号。
因此，本发明的核酸分子可以包括调节序列，如启动子序列。在一些实施方式中，本发明的核酸分子包括启动子序列和转录终止序列。合适的原核启动子为，例如，tet启动子、lacUV5启动子或T7启动子。在真核细胞中表达用的启动子的实例为SV40启动子或CMV启动子。
本发明的核酸分子也可以是载体或任何其他类型的克隆载体如质粒、噬菌粒、噬菌体、杆状病毒、粘粒或人工染色体的一部分。
在一个实施方式中，该核酸分子包含在噬菌粒中。噬菌粒载体是指编码溫和噬菌体(如M13或f1)或其与目标cDNA融合的功能部分的基因间区域的载体。在用这样的噬菌粒载体和适当的辅助噬菌体(例如M13K07、VCS-M13或R408)超感染细菌宿主细胞之后，产生完整的噬菌体粒子，由此使编码的异源cDNA与其展示于该噬菌体表面上的相应多肽进行物理耦合(参见例如，Lowman,H.B.(1997)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26,401-424，或Rodi,D.J.,和Makowski,L.(1999)Curr.Opin.Biotechnol.10,87-93)。
除了上述的调控序列和编码本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的核酸序列之外，这样的克隆载体可包括源自与用于表达的宿主细胞相容的物种的复制和控制序列以及在转化或转染的细胞上赋予可选择表型的筛选标记物。大量合适的克隆载体是本领域已知的，并且可商购获得。
编码本发明的脂质运载蛋白突变蛋白的DNA分子，特别是含有这样的脂质运载蛋白突变蛋白的编码序列的克隆载体可被转化到能够表达该基因的宿主细胞中。转化可通过使用标准技术进行。因此，本发明还涉及包含如本文所公开的核酸分子的宿主细胞。
转化的宿主细胞在适用于表达编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列的条件下培养。合适的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌(E.Coli)或枯草芽孢桿菌，或真核细胞，例如酿酒酵母、毕赤酵母、SF9或High5昆虫细胞、永生化的哺乳动物细胞系(如HeLa细胞或CHO细胞)或初代哺乳动物细胞。
本发明还涉及一种用于产生本发明的突变蛋白的方法，其中该突变蛋白、该突变蛋白的片段或该突变蛋白和另一个多肽的融合蛋白，通过遗传工程方法从编码该突变蛋白的核酸开始产生。该方法可以在体内进行，该突变蛋白可以例如在细菌或真核宿主生物体中产生，然后从该宿主生物体或其培养物中分离。还可以例如通过使用体外翻译系统而在体外产生蛋白。
当在体内产生该突变蛋白时，编码本发明的突变蛋白的核酸通过重组DNA技术(如上面已经概述的)被引入适合的细菌或真核宿主生物体中。为了这个目的，该宿主细胞首先使用已建立的标准方法，用含有编码本发明的突变蛋白的核酸分子的克隆载体进行转化。该宿主细胞接着在允许异源DNA表达的条件下培养，因此合成相应的多肽。随后，从细胞或从培养基中回收该多肽。
在本发明的一些泪液脂质运载蛋白突变蛋白中，在Cys61与Cys153之间天然存在的二硫键被移除。相应地，这样的突变蛋白(或任何其它不包含分子内二硫键的泪液脂质运载蛋白突变蛋白)可以在具有还原氧化环境的细胞隔间中产生，例如，在革兰氏阴性菌的细胞质中。在本发明的脂质运载蛋白突变蛋白含有分子内二硫键的情况下，可期望使用适当的信号序列将新生的多肽引导到具有氧化还原环境的细胞隔间中。这种氧化环境可由革兰氏阴性菌如大肠杆菌的周质、在革兰氏阳性细菌的细胞外环境或在真核细胞的内质网的内腔中提供，并且通常有利于结构的二硫键的形成。然而，也可在宿主细胞例如大肠杆菌的细胞溶质中产生本发明的突变蛋白。在这种情况下，该多肽可以直接以可溶状态且折叠状态获得，或者以包涵体的形式回收，随后在体外复性。另一种选择是使用具有氧化细胞内环境的特定宿主菌株，其因此可在细胞溶质中形成二硫键(VenturiM等人(2002)J.Mol.Biol.315,1-6)。
然而，并不一定仅通过使用基因工程技术来产生或制造本发明的脂质运载蛋白突变蛋白。而是，脂质运载蛋白突变蛋白也可通过化学合成、如Merrifield固相多肽合成法或通过体外转录和翻译而获得。例如，可以使用分子建模来鉴别有希望的突变，然后在体外合成所要的(设计的)多肽，并调查其对于给定靶标的结合活性。蛋白质的固相和/或液相合成的方法是本领域熟知的(参见例如BruckdorferT.等人(2004)Curr.Pharm.Biotechnol.5,29-43)。
在另一个实施方式中，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白可使用本领域技术人员已知的充分建立的方法通过体外转录/翻译产生。
由上面的公开显而易见的，本发明的脂质运载蛋白突变蛋白或其融合蛋白或缀合物可以用于许多应用中。一般而言，本文所公开的突变蛋白及其衍生物可以因此类似于抗体或其片段用于许多领域中。因此，在医学中存在本发明的突变蛋白的众多可能的应用。
例如，本发明涵盖本发明的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白或一种或多种包含这种突变蛋白的组合物用于在受试者中结合PCSK9和/或在受试者中抑制PCSK9与低密度脂蛋白受体(LDL-R)的结合的用途。在一些实施方式中，这种用途包括给该受试者施用有效量的本发明的一种或多种突变蛋白或一种或多种包含这种突变蛋白的组合物。在这方面，本申请还公开了结合PCSK9以及在受试者中抑制PCSK9与LDL-R的结合的方法，包括给该受试者施用有效量的本发明的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白或一种或多种包含这种突变蛋白的组合物。
在本发明的另一方面，本发明涉及本发明的脂质运载蛋白突变蛋白用于与PCSK9形成复合物的用途。在这方面，还应该指出，各个突变蛋白和其配体之间的复合物的形成受到许多不同的因素影响，例如各自的结合配偶体的浓度、竞争者的存在、所用的缓冲系统的pH和离子强度和用于测定KD的实验方法(例如荧光滴定、竞争性ELISA或表面等离子体共振，仅举几例)，或者甚至是用于评估实验数据的数学算法。
在一些实施方式中，本文所公开的本发明脂质运载蛋白突变蛋白可用于检测PCSK9。这样的用途可包括下述步骤：在合适的条件下使该突变蛋白与疑似含有给定配体的样品接触，由此允许在该突变蛋白与该给定配体之间形成复合物，并且通过合适的信号检测复合的突变蛋白。
该可检测的信号可通过标记而引起，如上所解释地，或通过由于结合、即该复合物形成本身而造成的物理性质的改变而引起。一个实例为表面等离子体共振，其值在结合配偶体的结合期间改变，其中一个固定在表面例如金箔上。
另一方面，本发明提供了包含本发明的至少一种突变蛋白的试剂盒，该试剂盒还包含用于使用该试剂盒的一个或多个说明书。
在一些实施方式中，该试剂盒进一步包括与其一体的或作为一个或多个单独文件的关于内容或该试剂盒和本发明的一种或多种突变蛋白的使用的信息。该试剂盒可包括本发明的一种或多种突变蛋白，其在稀释剂中配制以用于重构。这样的稀释剂，例如无菌稀释剂，也可包括在该试剂盒中，例如在容器内。
本文所公开的脂质运载蛋白突变蛋白也可用于PCSK9的分离。这样的用途可包括下述步骤：在适合的条件下使该突变蛋白与应该含有所述配体的样品接触，由此允许在该突变蛋白与该配体之间形成复合物，并且从该样品分离该突变蛋白/配体复合物。
在将本发明的突变蛋白用于检测PCSK9以及分离PCSK9的用途中，该突变蛋白和/或PCSK9可被固定在合适的固相上。
在一些实施方式中，本发明的一种或多种脂质运载蛋白突变蛋白也可用于将化合物靶向至要用该化合物处理的预选的生物体、组织、器官或细胞，其中PCSK9存在于这样的生物体、组织、器官或细胞中。对于这样的目的，该突变蛋白与目标化合物接触以便允许复合物形成。然后，包括该突变蛋白和目标化合物的复合物被递送到该预选的生物体、组织、器官或细胞。这种使用特别合适于、但并不限于，将药物(选择性地)递送到预选的生物体、组织、器官或细胞，例如受感染的身体部位，其应该要用该药物治疗。除了在突变蛋白与目标化合物之间形成复合物之外，该突变蛋白还可以与给定化合物反应，以得到突变蛋白和化合物的缀合物。类似于上述复合物，这种缀合物可以适合于将该化合物递送至预选的生物体、组织、器官或细胞。这种突变蛋白和化合物的缀合物还可以包括将突变蛋白和化合物彼此共价连接的连接物。任选地，这样的连接物在血流中是稳定的，但在细胞环境中是可切割的。
对本领域技术人员而言，经审查以下的实施例及其附图(其并非意图用于限制)，本发明的另外的目的、优点和特征将变得显而易见。因此，应当理解的是，虽然本发明通过示例性实施方式以及任选的特征进行特定的公开，但本领域技术人员可以追求本文所公开于其中的公开内容的修改以及变化，且这样的修改及变化被认为是在本发明的范围内。
实施例
实施例1：重组人类PCSK9和人类PCSK9突变体的产生和表征
在转染的HEK293F细胞中表达包含C端FLAG标签的人类PCSK9(SEQIDNO:34)。将600ml转染的细胞培养于DMEM/TS/0.05％BSA中6天，回收含有hPCSK9的上清液。hPCSK9与FLAGM2树脂结合，用50CV洗涤缓冲液(10mMTris/HCLpH7.4，150mlNaCl，2mMCaCl2，10％甘油)洗涤，并用含有100μg/ml3×FLAG肽的5CV洗涤缓冲液洗脱。洗脱的蛋白经由使用Superdex20016/60柱子(GEHealthcare)的凝胶过滤进一步纯化。使用HepG2细胞用LDL-R细胞ELISA进行功能测试。
为了目标脂质运载蛋白突变蛋白的选择与筛选，hPCSK9可被生物素化。在室温下用5倍摩尔过量的EZ-LinkNHS-显色生物素试剂(ThermoScientific公司)培养hPCSK91小时。去除过量的生物素，通过超过滤浓缩被生物素化的蛋白质。Streptacin下拉测定(pull-downassay)确定生物素化。
以相同方法产生并表征获得的功能性hPCSK9_D374Y突变体、食蟹猕猴PCSK9和小鼠PCSK9。
实施例2：具有2x1010个独立脂质运载蛋白突变蛋白的文库的产生和抗PCSK9的脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒筛选
通过成熟人类泪液脂质运载蛋白的随机突变产生具有高度多样性的2x1010个脂质运载蛋白突变蛋白的随机文库(参见例如，WO2007/107563)。为了筛选PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白，来自该文库的2x1012个噬菌粒与200nM生物素化的人类和/或食蟹猕猴PCSK9一起培养。涂覆中性亲和素或链霉亲和素的顺磁性珠子用来捕获PCSK9/噬菌粒复合物，其随后用磁铁分离。通过用1mlPBS/T洗涤该磁珠8次去除未结合的噬菌粒。结合的噬菌粒先通过用三乙胺培养洗脱，然后再用0.1M甘氨酸pH2.2洗脱。进行连续4轮的筛选。
使用标准方法(Sambrook等人，(1989)Molecularcloning:alaboratorymanual)用BstX1进行DNA消化，随后经由琼脂糖凝胶电泳纯化，分离噬菌体展示筛选之后获得的噬菌粒制备物的突变的中心盒。将DNA插入到同样切割的载体pTlc10中，其在四环霉素启动子的控制下允许细菌产生突变蛋白。CaCl2胜任的TG1-F’细胞用连接混合物进行转化，并在LB/Amp平板上涂板。使用单个菌落接种2xYT/Amp培养基并培养过夜(14-18小时)至平台期。随后，从平台期培养物中接种50μl2xYT/Amp并于37℃下培养3小时，然后转移到22℃，直到OD595达到0.6-0.8。通过添加补充了1.2μg/ml无水四环霉素的10μl2xYT/Amp诱导抗运载蛋白(anticalin)的产生。培养物在22℃下培养至第二天。在将40μl的5％(w/v)BSA加入PBS/T中，并于25℃下培养1小时后，培养物准备用于筛选测定。
为了进行脂质运载蛋白突变蛋白的筛选，将均携带FLAG标签的人类和石蟹猕猴PCSK9(PBS/T中1μg/ml)通过抗FLAG标签抗体(SigmaAldrich,St.Louis,MO)在微量滴定板上捕获，该抗体在前一天以在PBS中5μg/ml的终浓度被涂覆在微量滴定板上。将抗Flag标签抗体单独作为负对照。接着，添加20μl的BSA封闭的培养物，并于25℃下培养1小时。用在PBS/T中1:10000稀释的与辣根过氧化物酶缀合的抗-T7抗体(“HRP”，MerckKgaA,Darmstadt)检测结合的突变蛋白。针对定量，加入20μlQuantaBlu荧光过氧化物酶底物，并于320nm的激发波长和430nm的发射波长下测量。
实施例3：用于PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白的优化的偏差成熟文库的产生
为了优化从上述实施例2中的脂质运载蛋白文库中鉴定的PCSK9特异性的突变蛋白，基于脂质运载蛋白突变蛋白SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:7(以下在此实施例中称为“母克隆”)，分别生成另外的文库。以得到仅所选位置的部分随机的方式产生所述文库。该设计被制成使得对于每一个所选择的位置，所编码的氨基酸以70％的机率对应于相应的母克隆中的氨基酸，而其可以以30％的机率为不同的氨基酸。在所靶向的位置的数目为N、B为偏差的情况下，每个克隆的交换的最大可能数目为Nx(1-B)。例如，在母克隆的氨基酸具有70％偏差的情况下，如果有20个氨基酸位置被部分随机化，这将导致与母克隆相比较平均整体含有六个突变的突变体文库，但仅在靶标位置上而已。然而，并非所有的克隆都具有6个交换：每个克隆的突变频率将遵循二项式分布，如在图11D中所描绘。
为了组装这样的文库，使用在聚合酶链反应(“PCR”)(Stemmer等人，(1995)Gene164:49‐53)中的寡核苷酸的递归组装。通过标准亚磷酰胺化学产生寡核苷酸(Beaucage等人，(1981)TetrahedronLett.22,1859-62；McBride等人，(1983)TetrahedronLett.24,245-8)。为了允许70％偏差的编码，我们为该20种经典氨基酸中每一个的核苷酸三联体的每一个位置计算了优化的混合物。例如，通过核苷亚磷酰胺构建块：“abc”的混合物产生编码丝氨酸的混合物，其具有70％的偏差，并允许在剩余的30％中具有不同的氨基酸，其中a对应于85％的胸腺嘧啶核苷的混合物和各5％的亚氨基二甲胺(guaninidine)、胞嘧啶和腺苷，b对应于85％的胞嘧啶与各5％的其它核苷的混合物，c对应于50％的胍与50％的胸腺嘧啶核苷的混合物(参见图11)。
使用上述的技术，所述基于SEQIDNO:3、SEQIDNO:4和SEQIDNO:7的文库分别通过递归PCR产生。随后，将生成的脂质运载蛋白突变蛋白以高效率克隆到基本上如所描述的噬菌粒载体中(参见例如，Kim等人，(2009)JAmChemSoc131(10):3565-76)。该文库的大小为7x109至11x109个突变体。这些文库被用于随后的噬菌体筛选(参见实施例4)。
实施例4：优化的抗PCSK9脂质运载蛋白突变蛋白的噬菌粒筛选
为了筛选优化的PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白，使用来自实施例3中描述的文库的2x1012个噬菌粒。噬菌粒被溶解在补充了0.1％Tween-20(v/v)的PBS(即PBS/T)、50mM芐脒和1％(w/v)酪蛋白中。为了筛选具有增加的亲和力的脂质运载蛋白突变蛋白，噬菌粒与降低浓度的范围为0.01-10nM的生物素化的PCSK9蛋白一同培养。在某些情况下，噬菌粒在65℃下培养10分钟以筛选具有增加的热耐受性的突变蛋白。封闭的噬菌粒与生物素化的PCSK9蛋白培养40分钟，之后加入0.3mM脱硫生物素到该溶液中以饱和游离的链霉亲和素结合位点，并继续培养20分钟。接着，加入封闭的(PBS/T中1％(w/v)酪蛋白)且消耗的(drained)顺磁珠子达20分钟来捕获PCSK9-噬菌粒复合物，所述顺磁珠子涂覆链霉亲和素或中性亲和素。通过使用1mlPBS/T洗涤珠子八次，彻底再悬浮，随后用磁铁收集珠子以去除未复合的噬菌粒。为了特异性地筛选具有降低的koff率的突变蛋白，通过应用更严格的洗涤操作程序(在第一轮后进行另外5次洗涤步骤，在第2轮后进行另外10次洗涤步骤，在第3轮后进行另外15次洗涤步骤，以及在第4轮后进行另外20次洗涤步骤)，或者将突变蛋白-PCSK9复合物与不同量(10nM-5μM)的纯化亲本突变蛋白(如SEQIDNOs:3、4或7)一起培养，使在优化的与亲本脂质运载蛋白突变蛋白之间竞争PCSK9结合。此外，应用这两种方法的组合。结合的噬菌粒首先用300μl70mM三乙胺洗涤10分钟，随后立即用100μl1MTris-ClpH6.0中和上清液。在一个中间洗涤循环之后，剩余的噬菌粒用100mM甘氨酸pH2.2洗涤10分钟，随后立即用50μl0.5MTris-base中和。汇集洗脱级分，用于感染4ml对数期的大肠杆菌培养物(OD5500.45-0.6)以进行再扩增。在搅拌的条件下培养30分钟后，以5000xg离心2分钟收集细菌，再悬浮于1ml的2×YT培养基中，并在3个大的LB/Amp琼脂平板上涂板(10g/l细菌用胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，5g/l氯化钠，pH7.5，15g/l琼脂，100μg/ml氨芐青霉素)。平板于32℃下培养整夜。感染的细胞使用补充了100μg/ml氨芐青霉素的50ml2xYT培养基(2xYT/Amp)从琼脂平板上刮下。将适当体积的细菌悬浮液接种于50ml2xYT/Amp培养基，使OD550达到0.08。该培养物在37℃下于振荡器上(160rpm)培养直到OD550达到0.5，然后通过温和搅拌培养15分钟且在37℃下于振荡器上培养45分钟，用辅助噬菌体(1.5x1011pfu)感染。随后，加入卡那霉素至70μg/ml的终浓度以筛选感染辅助噬菌体的细菌。最后，通过加入25ng/ml无水四环霉素诱导pIII-脂质运载蛋白的表达。
实施例5：通过筛选进行PCSK9特异性的Tlc突变蛋白的鉴定
如实施例4中所述，使用标准方法(Sambrook等人，1989年)用BstX1进行DNA消化，随后经由琼脂糖凝胶电泳纯化，分离噬菌体展示筛选之后获得的噬菌粒制备物的突变的中心盒。将DNA插入到同样切割的载体中，其在四环霉素启动子的控制下允许细菌产生突变蛋白。CaCl2胜任的TG1-F’细胞用连接混合物进行转化，并在LB/Amp平板上涂板。使用单个菌落接种2xYT/Amp培养基并培养过夜(14-18小时)至平台期。随后，从平台期培养物中接种50μl2xYT/Amp并于37℃下培养3小时，然后转移到22℃，直到OD595达到0.6-0.8。通过添加补充了1.2μg/ml无水四环霉素的10μl2xYT/Amp诱导脂质运载蛋白突变蛋白的产生。培养物在22℃下培养至第二天。在将40μl的5％(w/v)BSA加入PBS/T中，并于25℃下培养1小时后，培养物准备用于筛选测定。
为了进行脂质运载蛋白突变蛋白的筛选，将均携带FLAG标签的人类和石蟹猕猴PCSK9(PBS/T中1μg/ml)以及hPCSK9-D374Y突变体通过抗FLAG标签抗体(SigmaAldrich,St.Louis,MO)在微量滴定板上捕获，该抗体在前一天以在PBS中5μg/ml的终浓度被涂覆在平板上。接着，添加20μl的BSA封闭的培养物，并于25℃下培养1小时。用在PBS/T中1:10000稀释的与HRP缀合的抗-T7抗体(MerckKgaA,Darmstadt)检测结合的脂质运载蛋白突变蛋白。针对定量，加入20μlQuantaBlu荧光过氧化物酶底物，并于320nm的激发波长和430nm的发射波长下测量。
为了进行脂质运载蛋白突变蛋白的亲和力排名，将在PBS中的抗Strep-tag抗体(IBA,Goettingen)涂覆在微量滴定板上，并加入20μlBSA封闭的培养物，其允许脂质运载蛋白突变蛋白在该滴定板上被特异性捕获。加入不同浓度(0.5-5nM)的生物素化的PCSK9蛋白，并在充分洗涤后用extravidin-HRP(SigmaAldrich,St.Louis,MO)检测特异性结合的PCSK9蛋白。针对定量，加入20μlQuantaBlu，并于320nm的激发波长和430nm的发射波长下测量。
通过在微量滴定板上涂覆抗FLAG标签(在PBS中5μg/ml)，随后捕获hPCSK9-D374Y突变体(在PBS/T中1μg/ml)，进行竞争性脂质运载蛋白突变蛋白的筛选。将封闭的培养物针对30nM纯化的LDL受体调整，且将其加入具有捕获的hPCSK9-D374Y突变体的滴定板中72小时。这使得该系统平衡和竞争性突变蛋白的可靠筛选。用HRP缀合的抗-组氨酸标签抗体(在PBS/T中1μg/ml；Abcam,Cambridge,UK)检测结合的受体。针对定量，加入20μlQuantaBlu荧光过氧化物酶底物，并于320nm的激发波长和430nm的发射波长下测量。
实施例6：代表性的脂质运载蛋白突变蛋白对PCSK9的亲和力
为了测量代表性群体的脂质运载蛋白突变蛋白对生物素化的PCSK9的结合亲和力，使用以表面等离子体共振(SPR)为基础的分析，其中利用BiacoreT200设备(GEHealthcare)。针对SPR亲和力分析(图1)，使用生物素捕获试剂盒(GEHealthcare)。
在每个测量周期中，将生物素捕获试剂(GEHealthcare)以2μl/分钟的流速施加到感应器芯片CAP(GEHealthcare)上的参考和测量通道持续5分钟。以4μg/ml的浓度将生物素化的PCSK9以10μl/分钟的流速注射在该测量通道上持续2分钟。为了测定亲和力，三至四次稀释的SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12在HBS-EP+(0.01MHEPESpH7.4，0.15M氯化钠，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20)缓冲液中制备，并施加到该芯片表面，其中对于SEQIDNO:3、SEQIDNO:6、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12使用500、125、31和8nM的浓度，对于SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10使用300、75、19和5nM的浓度，对于SEQIDNO:7使用75、19和5nM的浓度。结合分析以3分钟的接触时间、20分钟的解离时间和施加30μl/分钟的流速进行。所有测量均在25℃下进行。通过注射6M的胍-盐酸与0.25M氢氧化钠(2分钟)，接着用运行缓冲液进行另外的洗涤以及2分钟的稳定期，进行感应器芯片CAP表面的再生。在测量之前，进行了由三个连续的再生步骤组成的一个调整周期。数据用BiacoreT200评估软件(1.0版)进行评估。使用双重参照。使用1:1的结合模型以拟合原始数据。
针对SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6和SEQIDNO:11所得到的拟合曲线分别如图1(A-D)所示。例如，该数据显示，SEQIDNO:3(图1A)以高亲和力与PCSK9结合(KD＝0.85nM)。结合速率常数ka或kon、解离速率常数kd或koff和为所有脂质运载蛋白突变蛋白得到的解离常数KD总结于下文的表1中。
表1：
分子 kon[M-1*s-1] koff[s-1] KD[nM]
SEQ ID NO:3 1.77E+05 1.50E-04 0.85
SEQ ID NO:4 4,79E+04 1,39E-04 2.89
SEQ ID NO:5 3,40E+04 1,63E-04 4.8
SEQ ID NO:6 5,66E+04 2,32E-04 4.1
SEQ ID NO:7 7,24E+05 4,84E-03 6.69
SEQ ID NO:8 1,54E+05 1,38E-03 8.96
SEQ ID NO:9 2,33E+05 4,80E-03 20.59
SEQ ID NO:10 5,70E+05 7,19E-03 12.61
SEQ ID NO:11 4,70E+04 8,90E-05 1.89
SEQ ID NO:12 2,44E+04 1,56E-04 6.4
实施例7：代表性的脂质运载蛋白突变蛋白对PCSK9作用的竞争性模式
体外使用竞争性ELISA形式测试在实施例6公开的脂质运载蛋白突变蛋白是否以竞争性模式与PCSK9结合。在该实验中，恒定浓度的人类PCSK9(SEQIDNO:34)或人类PCSK9_D374Y突变体用不同浓度的脂质运载蛋白突变蛋白培养1小时。在溶液中此预培养中之后，将脂质运载蛋白突变蛋白/PCSK9混合物的等分试样转移至涂覆了人类LDL-R的ELISA平板上，以测量未被封闭而结合hLDL-R的hPCSK9的浓度。
所有的培养步骤均在300rpm振荡下进行，并且在每个培养步骤后用100μlPBS-T缓冲液(PBS(磷酸盐缓冲盐水)，0.05％Tween20)洗涤培养板5次，其中使用BiotekELx405选择CW洗涤机。在第一步骤中，用20μl的重组人类LDL-R(R&DSystems,Cat.No.2148-LD/CF)以在PBS中5μg/ml的浓度在4℃下过夜涂覆384孔荧光板。洗涤后，将LDL-R涂覆的孔用100μlPBS-T/BSA(在含有0.05％Tween20的PBS中2％BSA(牛血清白蛋白))在室温(“RT”)下封闭1小时。
固定浓度的25nM人类PCSK9或0.25nM人类PCSK9_D374Y突变体在溶液中与下述一起培养：(i)不同浓度的SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8，或SEQIDNO:29和SEQIDNO:33的基准抗体，或者(ii)作为负对照的SEQIDNO:2，其中采用300nM的起始浓度，在PBS-T/BSA缓冲液中以1:3的比例连续稀释至5pM。在室温下培养1小时后，将20μl的反应混合物转移到LDL-R-涂覆的ELISA板，在室温下20分钟以捕获未结合(游离的)或非竞争性结合的PCSK9。为了将ELISA读出结果转化为游离的hPCSK9浓度(参见下文)，在PBS-T/BSA中制备含有不同浓度的hPCSK9或hPCSK9_D374Y突变体(起始为25/50nM(1:3连续稀释11次))的标准曲线，且在MSD(MesoScaleDiscovery)板上培养20分钟。
为了检测并定量结合的PCSK9，移除残余的上清液，且将20μl小鼠抗FlagM2-辣根过氧化物酶(“HRP”)(Sigma-Aldrich)以在PBS-T/BSA中1:5000稀释加入，并于室温下培养1小时。洗涤后，将20μlQuantaBlu荧光过氧化物酶底物加入到每个孔中，并在15分钟后使用GENiosPlus读板器(Tecan)在320nm的激发波长和430nm的发射波长下测量荧光。
评估如下进行：游离的hPCSK9或hPCSK9_D374Y突变体浓度c(hPCSK9)游离的/c(hPCSK9_D374Y)游离的从相对荧光信号计算，其中使用平行测定的标准曲线，并相对于脂质运载蛋白突变蛋白浓度c(SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、或SEQIDNO:29和SEQIDNO:33的基准抗体)绘图。为了获得在其下PCSK9/LDL-R复合物形成被50％阻断时该脂质运载蛋白突变蛋白的浓度(IC50)，根据c(PCSK9)游离的＝c(PCSK9)tot/(1+c(脂质运载蛋白突变蛋白)/IC50))，通过用单点结合模型进行非线性回归，进行该曲线的拟合，其中总追踪物浓度c(PCSK9)tot和上面获得的IC50值为自由参数。使用GraphPadPrism4软件进行曲线拟合。
综上所述，负对照SEQIDNO:2不与PCSK9结合；相反地，当竞争hLDL-R时，SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8表现出对hPCSK9和hPCSK9_D374Y突变体的强竞争性结合。拟合的IC50值如下表2以及图2(A和B)所示。针对野生型和突变体PCSK9均显示出脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNOs:3、4和6-9)作用的竞争性模式。在竞争ELISA中使用hPCSK9的IC50值单独受到25nM的固定浓度影响。在竞争ELISA中使用0.25nMhPCSK9_D374Y突变体，IC50值受到脂质运载蛋白突变蛋白的亲和力以及该固定突变体浓度的影响。
表2：
分子 hPCSK9野生型IC50[nM] hPCSK9_D374Y IC50[nM]
SEQ ID NO:3 13.8 0.13
SEQ ID NO:4 6.2 0.37
SEQ ID NO:6 10.1 0.21
SEQ ID NO:7 13.2 0.13
SEQ ID NO:8 10.7 0.32
实施例8：代表性的脂质运载蛋白突变蛋白对PCSK9的特异性和物种交叉反应性
脂质运载蛋白突变蛋白的特异性和物种交叉反应性(图3(A-D))在结合ELISA中进行测定，其原理如下：生物素化的配体(人类PCSK9、人类PCSK9_D374Y、小鼠PCSK9和食蟹猕猴PCSK9)被捕获于中性亲和素涂覆的ELISA板上，并且加入可变浓度的脂质运载蛋白突变蛋白。用兔抗StreptagII抗体(GenScript,Cat.No.A00626)和HRP标记的抗兔IgG抗体(JacksonImmunoResearch,Cat.No.211-035-109)检测结合的脂质运载蛋白突变蛋白。
在下面详细的实验方案中，培养和洗涤步骤如上面实施例7中所述的竞争ELISA方案进行。用20μl的中性亲和素以在PBS中5μg/ml的浓度在4℃下过夜涂覆适合用于荧光测量的384孔板(GreinerFLUOTRACTM600，黑色平底、高结合)。洗涤后，将中性亲和素涂覆的孔用100μl封闭缓冲液(PBS-T/BSA)室温下封闭1小时。再次洗涤后，20μl生物素化的配体，人类PCSK9、人类PCSK9_D374Y、小鼠PCSK9或食蟹猕猴PCSK9，以在PBS-T/BSA中1μg/ml的浓度在室温下加入1小时。过量的配体通过进一步的洗涤步骤去除。
将脂质运载蛋白突变蛋白的浓度调整至100nM，接着溶液在PBS-T/BSA缓冲液中以1:3的比例连续稀释至2nM。将体积为20μl的稀释物转移到该384孔板，使其在室温下结合1小时。
培养之后，移除残余的上清液，且加入1:5.000稀释于PBS-T/BSA中的20μl抗StreptagII抗体，并在室温下培养1小时。再次移除上清液。为了检测结合的抗StreptagII抗体，加入20μl的小鼠抗兔IgG-HRP抗体，并在室温下培养1小时。洗涤后，将20μl荧光HRP底物(Quantablue,Pierce)加入到每个孔中，并进行反应15分钟。使用Safire微量板读板器(Tecan)读取在该板上每个孔以相对荧光单位(RFU)计的荧光强度。为了获得在其下最大荧光信号达到50％的脂质运载蛋白突变蛋白浓度(EC50)，根据RFU＝RFUmax·c(脂质运载蛋白突变蛋白)/(EC50+c(脂质运载蛋白突变蛋白))，通过用单点结合模型进行非线性回归，进行该曲线的拟合，其中最大相对荧光RFUmax和EC50值为自由参数。使用GraphPadPrism4软件进行曲线拟合。
综上所述，可检测到SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:9与人类PCSK9、人类PCSK9_D374Y突变体、小鼠PCSK9和食蟹猕猴PCSK9的结合，而负对照SEQIDNO:2则显示不与这些靶标中的任一个结合。拟合的EC50值如下文表3所示。对于人类PCSK9和食蟹猕猴PCSK9的EC50值相当，从而显示脂质运载蛋白突变蛋白与食蟹猕猴PCSK9完全交叉反应。对小鼠PCSK9的亲和力则相似或最多低10倍，而对于人类PCSK9_D374Y突变体的EC50值则与对于人类PCSK9获得的那些值相似。
表3：
实施例9：在以细胞为基础的分析中脂质运载蛋白突变蛋白介导的Dil-标记的LDL摄取的下调的恢复
采用以细胞为基础的分析来证明结合PCSK9的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQNO:3、SEQNO:4、SEQNO:6、SEQNO:7和SEQNO:8)的下述能力：在HepG2细胞中，中和表面LDL-R分子的数量的PCSK9介导的减少，和因此恢复下调的LDL摄取。SEQIDNO:2作为负对照。
在这方面，将HepG2细胞在96孔聚-d-赖氨酸涂覆的平板(Greiner,955946)中以60,000细胞/孔的密度在含有10％FCS(胎牛血清)的100μl/孔DMEM培养基(PANP04-04510)中涂板。24小时后，将培养基转换为含1％FCS的DMEM培养基(100μl/孔)。18小时后，除去培养基并换成(无洗涤步骤)含有20μg/mlLDL-FL(Invitrogen,L3483)但不含FCS的50μlDMEM。以浓度为4000nM起始，进行脂质运载蛋白突变蛋白的1:2连续稀释。在含有15μg/mlPCSK9的DMEM进行一个稀释系列，另一个稀释系列是在纯DMEM中，作为对照。脂质运载蛋白突变蛋白和PCSK9预先在室温下培养30分钟，然后将50μl加入细胞中，使得PCSK9的最终浓度为100nM。在平板上的总样本体积为100μl，且所有样本以5倍重复测定。在不含LDL和PCSK9的DMEM中、在含LDL和PCSK9的DMEM中、和在含LDL但不含PCSK9的DMEM中的细胞用作对照。
在细胞用PBS洗涤以前，将具有样本的平板在37℃下培养6小时。用100μlPBS填充各孔，且使用BMGPheraStar读板器在485/535nm下读取细胞的荧光。
为了测定IC50值，排除5个重复中最高值和最低值，计算每个剩余数据点的平均值和标准差。该曲线通过GraphPadPrism4拟合，其中采用非线性回归“S形计量-反应，可变斜率”模型(5PL拟合)。通过受刺激和未受刺激的细胞(有/无PCSK9的细胞)将数据标准化。拟合的曲线如图4所示，且计算的IC50值总结于下文的表4中。
表4：
分子 IC50[nM]
SEQ ID NO:3 71.8
SEQ ID NO:4 85.8
SEQ ID NO:6 44.5
SEQ ID NO:7 95.8
SEQ ID NO:8 81.2
实施例10：另外的脂质运载蛋白突变蛋白对PCSK9的亲和力
为了测量另外的脂质运载蛋白突变蛋白对生物素化的人类PCSK9(hPCSK9-Bio)的结合亲和力，进行以表面等离子体共振(SPR)为基础的分析，其中使用BiacoreT200设备(GEHealthcare)。针对SPR亲和力分析(图5(A-C))，使用生物素捕获试剂盒(GEHealthcare)。
在每个测量中，将周期生物素捕获试剂(GEHealthcare)以2μl/分钟的流速施加到感应器芯片CAP(GEHealthcare)上的参考和测量通道持续5分钟。以1μg/ml的浓度将hPCSK9-Bio以10μl/分钟的流速注射到该测量通道上持续2分钟。为了测定亲和力，三至四次稀释的SEQIDNOs:13-28的脂质运载蛋白突变蛋白(参见表5)在HBS-EP+缓冲液中制备，并施加到该芯片表面，其中对于所述突变蛋白使用128、32、8和2nM的浓度。结合分析以3分钟的接触时间、15分钟的解离时间和施加30μl/分钟的流速进行。所有测量均在25℃下进行。通过注射6M的胍-盐酸与0.25M氢氧化钠(2分钟)，接着用运行缓冲液进行另外的洗涤以及2分钟的稳定期，进行感应器芯片CAP表面的再生。在测量之前，进行了由三个连续的再生步骤组成的一个调整周期。数据用BiacoreT200评估软件(1.0版)进行评估。使用双重参照。使用1:1的结合模型以拟合原始数据。
针对一些脂质运载蛋白突变蛋白所得到的拟合曲线如图5所示。即SEQIDNO:13(图5C)、SEQIDNO:20(图5A)和SEQIDNO:22(图5B)以高亲和力与人类PCSK9结合。结合速率常数ka或kon、解离速率常数Kd或koff和为所有突变蛋白得到的解离常数KD总结于下文的表5中。
表5：
分子 kon[M-1*s-1] koff[s-1] KD[nM]
SEQ ID NO:13 2.75E+05 8.77E-05 0.32
SEQ ID NO:14 2.56E+05 1.05E-04 0.41
SEQ ID NO:15 2.78E+05 1.07E-04 0.38
SEQ ID NO:16 2.55E+05 1.29E-04 0.51
SEQ ID NO:17 2.49E+05 1.11E-04 0.45
SEQ ID NO:18 3.13E+05 1.11E-04 0.35
SEQ ID NO:19 2.47E+05 1.32E-04 0.53
SEQ ID NO:20 3.13E+05 9.73E-05 0.31
SEQ ID NO:21 2.45E+05 1.37E-04 0.56
SEQ ID NO:22 7.53E+05 2.63E-04 0.35
SEQ ID NO:23 8.36E+05 1.76E-04 0.21
SEQ ID NO:24 3.67E+05 1.15E-04 0.31
SEQ ID NO:25 4.36E+05 1.05E-04 0.24
SEQ ID NO:26 6.68E+05 2.30E-04 0.34
SEQ ID NO:27 7.34E+05 3.10E-04 0.42
SEQ ID NO:28 6.84E+05 1.98E-04 0.29
实施例11：另外的脂质运载蛋白突变蛋白对PCSK9的物种交叉反应性
为了测量脂质运载蛋白突变蛋白SEQIDNO:13、SEQIDNO:20和SEQIDNO:22对生物素化的人类、石蟹猕猴和小鼠PCSK9的结合亲和力，采取以表面等离子体共振(SPR)为基础的分析，其中使用BiacoreT200设备(GEHealthcare)。针对SPR亲和力分析(图6(A-C))，使用生物素捕获试剂盒(GEHealthcare)。
在下面的实验方案中，捕获、样本结合和再生步骤以及数据评估都如上文实施例10中所描述的进行。为了测定亲和力，四次稀释的所述突变蛋白在HBS-EP+缓冲液中制备，并施加到芯片表面，其中分别使用128、32、8和2nM的浓度。
对于SEQIDNO:20所得到的拟合曲线如图6所示。数据显示SEQIDNO:20以高亲和力与人类PCSK9(图6A)和石蟹猕猴PCSK9(图6B)结合。与小鼠PCSK9(图6C)的亲和力较低。结合速率常数ka或kon、解离速率常数Kd或koff和所得到的解离常数KD总结于下文的表6中。
表6：
实施例12：另外的脂质运载蛋白突变蛋白在溶液中与PCSK9的结合
在体外使用竞争电化学发光(ECL)分析形式，测试在溶液中脂质运载蛋白突变蛋白及其聚乙二醇化的变体(此处具有支链PEG40)对生物素化的人类PCSK9(hPCSK9-Bio)的结合(图7)。在该实验中，恒定浓度的hPCSK9-Bio与可变浓度的脂质运载蛋白突变蛋白SEQIDNO:13、SEQIDNO:20和SEQIDNO:22以及聚乙二醇化的变体SEQIDNO:30、SEQIDNO:31和SEQIDNO:32培养1小时。在溶液中预培养之后，将脂质运载蛋白突变蛋白/PCSK9混合物的等分试样转移至涂覆了单克隆基准抗体(包含SEQIDNO:29的轻链和SEQIDNO:33的重链)的ECL板，以测量未被脂质运载蛋白突变蛋白(聚乙二醇化以及非聚乙二醇化的形式)封闭而因此能够被该抗体结合的hPCSK9的浓度(图7)。对于那些脂质运载蛋白突变蛋白作用的竞争性模式用hPCSK9-Bio显示。
所有的培养步骤均在300rpm振荡下进行，并且在每个培养步骤后用80μlPBS-T缓冲液(PBS，0.05％Tween20)洗涤培养板5次，其中使用BiotekELx405选择CW洗涤机。在第一步骤中，用20μl的基准抗体以在PBS中5μg/ml的浓度在4℃下过夜涂覆384孔MSD板。洗涤后，将LDL-R涂覆的孔用60μlPBS-T/BSA(在含有0.05％Tween20的PBS中2％BSA)在室温下封闭1小时。
固定浓度的10pMhPCSK9-Bio与不同浓度的所述突变蛋白培养于溶液中，其中采用100nM的起始浓度，在PBS-T/BSA缓冲液中以1:3的比例连续稀释至1.7pM。在室温下培养1小时后，将20μl的反应混合物转移到包覆抗体的ELISA板，在室温下20分钟捕获未结合(游离的)PCSK9。为了将ELISA读出结果转化为游离的hPCSK9浓度(参见下文结合的hPCSK9-Bio的检测和定量)，在PBS-T/BSA中制备含有不同浓度的hPCSK9-Bio(起始为10nM(1:3连续稀释11次))的标准曲线，且在MSD(MesoScaleDiscovery)板上培养20分钟。
为了检测并定量结合的hPCSK9-Bio，移除残余的上清液，且将20μlSulfo-标签-标记的链霉亲和素(MesoScaleDiscovery)以在PBS-T/BSA中1μg/ml的浓度加入，并于室温下培养1小时。洗涤后，将35μl2×MSD读取缓冲液与表面活性剂(MesoScaleDiscovery)加入到每个孔中，并在15分钟内使用SECTORImager2400(MesoScaleDiscovery)测量电化学发光(ECL)信号。
评估如下进行：游离的PCSK9浓度c(PCSK9)游离的从ECL信号计算，其中使平行测定的标准曲线，并相对于脂质运载蛋白突变蛋白浓度c(脂质运载蛋白突变蛋白)绘图。为了获得在其下PCSK9/基准抗体复合物形成被50％阻断时该脂质运载蛋白突变蛋白的浓度(IC50)，根据c(PCSK9)游离的＝c(PCSK9)tot/(1+c(脂质运载蛋白突变蛋白)/IC50))，通过用单点结合模型进行非线性回归，进行该曲线的拟合，其中总追踪物浓度c(PCSK9)tot和IC50值作为自由参数。使用GraphPadPrism4软件进行曲线拟合。
综上所述，脂质运载蛋白突变蛋白SEQIDNO:13、SEQIDNO:20和SEQIDNO:22以及聚乙二醇化的变体SEQIDNO:30、SEQIDNO:31和SEQIDNO:32表现出强的与hPCSK9-Bio的竞争性结合，当针对基准抗体竞争时(包含SEQIDNOs:29和33)。拟合的IC50总结于下文的表7中。
表7：
分子 IC50[nM]
SEQ ID NO:13 0.16
SEQ ID NO:20 0.11
SEQ ID NO:22 0.09
SEQ ID NO:30 0.19
SEQ ID NO:31 0.53
SEQ ID NO:32 0.37
实施例13：通过另外的脂质运载蛋白突变蛋白抑制LDL-R的PCSK9介导的下调
人类PCSK9诱导LDL-R的内化，因此诱导LDL-R从细胞表面耗尽。在此分析中，LDL-R的表达在实施例12中所述的脂质运载蛋白突变蛋白(聚乙二醇化的(此处具有支链PEG40)以及非聚乙二醇化的形式)的存在下进行评价，以确定脂质运载蛋白突变蛋白抑制PCSK9在介导LDL-R细胞表面耗尽的活性的潜力，而SEQIDNO:2则用作负对照。
使HEPG2细胞(10,000个细胞/孔)在预先涂覆了100μg/ml聚-d-赖氨酸的384孔MSD(MesoscaleDiscovery)中贴附24小时。接着将完全培养基(含有1mg/mlG418和10％FBS的DMEM培养基)转换为缺乏血清或含10％脂质运载蛋白-缺陷血清的DMEM，以使LDL-R在细胞表面上有最大表达。细胞接着用PBS洗涤，且在100nMPCSK9的存在下连续稀释的脂质运载蛋白突变蛋白在37℃下培养6小时。然后将混合物以轻轻敲击的方式移除，接着通过加入-Histofix在室温下进行细胞固定20分钟。细胞用PBS洗涤两次，且以封闭缓冲液(PBS/FCS4％/BSA2％)在4℃下过夜培养。轻轻地去除缓冲液，并将1μg/ml的山羊抗hLDL-R(R&Dsystems,Cat.No.AF2148)和2μg/ml的驴抗山羊-Sulfotag(MSD,Cat.No.R32AG-1)在封闭缓冲液中在室温下培养1小时。细胞接着用PBS轻轻地洗涤两次，并加入不含有表面活性剂的读取缓冲液(MSD)。使用SECTORImager2400(MSD)测量ECL信号。评估如下进行：通过在缺乏竞争者(此处为脂质运载蛋白突变蛋白)的情况下将对于PCSK9活性测量的信号设定为100％PCSK9活性，转换ECL信号。使用GraphPadPrism4软件，用S形剂量-反应模型、采用共享斜率来拟合数据(图8)。得到的IC50值和IC90值总结于下文的表8中。
表8:
分子 IC50[nM] IC90[nM]
SEQ ID NO:13 103.3 216.1
SEQ ID NO:20 91.7 192.0
SEQ ID NO:22 76.9 160.9
SEQ ID NO:30 82.6 172.8
SEQ ID NO:31 82.6 172.8
SEQ ID NO:32 70.7 147.8
实施例14：通过位置饱和突变产生热稳定的PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白
为了改进PCSK9特异性的突变蛋白的热稳定性，在SEQIDNO:13的脂质运载蛋白突变蛋白的位置79和105上进行突变(如图14所示)。产生SEQIDNO:13的热稳定衍生物的文库，其方式导致上述位置的饱和随机化，要么是本身产生的，要么与使用在聚合酶链反应中的NNK寡核苷酸的递归组装(参见例如WO2007/107563)组合产生的。为了同样的目的，SEQIDNO:22的脂质运载蛋白突变蛋白在位置92处从组氨酸突变为脯氨酸(如图14所示)。
实施例15：通过筛选鉴定热稳定的PCSK9特异性的突变蛋白
将如实施例14所述在PCR组装后获得的文库制备物的突变的中心盒插入到载体中，所述载体在四环霉素启动子的控制下允许细菌产生脂质运载蛋白突变蛋白(如实施例5所述)。
为了进行优化的脂质运载蛋白突变蛋白的亲和力排名，将在PBS中稀释的抗Strep-tag抗体(IBA,Goettingen)涂覆在微量滴定板上，并加入20μlBSA封闭的培养物，其允许脂质运载蛋白突变蛋白在该滴定板上被特异性捕获。加入不同浓度(0.5-5nM)的生物素化的PCSK9蛋白，并在充分洗涤后用extravidin-HRP(SigmaAldrich,St.Louis,MO)检测特异性结合的PCSK9蛋白。针对定量，加入20μlQuantaBlu，并于320nm的激发波长和430nm的发射波长下测量。
在如上文所述的相同方法中进行热稳定的脂质运载蛋白突变蛋白的筛选，差别仅在于在与PCSK9靶标培养之前，将含脂质运载蛋白突变蛋白的细菌提取物加热至65℃达30min。筛选出与未加热的样本相比较在加热步骤后显示未受影响的结合信号的那些突变蛋白，用于测序。
实施例16：测量优化的PCSK9特异性的突变蛋白的熔融温度
为了测定PCSK9特异性的突变蛋白的熔融温度，使用毛细管nanoDSC设备(Q2000,TAInstruments)，以1C/分钟扫描(25-100℃)在PBS(Gibco)中蛋白质浓度为1mg/ml的样品。整合软件从所显示的温谱图计算该熔融温度(meltingtemperature，Tm)。
对于两个脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNO:22和SEQIDNO:13)连同由其优化的衍生物(SEQIDNOs:62-71)所得到的熔融温度一起总结于下文的表9中。例如，该数据显示，与SEQIDNO:13相比较，SEQIDNO:63、SEQIDNO:64和SEQIDNO:65的Tm显著更高，且熔融开始就被往上位移13℃(图12)。
表9：
实施例17：优化的脂质运载蛋白衍生物对PCSK9的亲和力
为了测量代表性群体的脂质运载蛋白突变蛋白对生物素化的人类PCSK9的结合亲和力，使用以表面等离子体共振(SPR)为基础的分析，其中利用BiacoreT200设备(GEHealthcare)。针对SPR亲和力分析，使用生物素捕获试剂盒(GEHealthcare)。
在每个测量周期中，将生物素捕获试剂(GEHealthcare)以2μl/分钟的流速施加到感应器芯片CAP(GEHealthcare)上的参考和测量通道持续5分钟。以4μg/ml的浓度将生物素化的PCSK9以10μl/分钟的流速注射在该测量通道上持续2分钟。为了测定亲和力，三至四次稀释的SEQIDNOs:62-71在HBS-EP+(0.01MHEPESpH7.4，0.15M氯化钠，3mMEDTA，0.005％表面活性剂P20)缓冲液中制备，并施加到该芯片表面，其中使用128nM、32nM、8nM和4nM的终浓度。结合分析以3分钟的接触时间、20分钟的解离时间和施加30μl/分钟的流速进行。所有测量均在25℃下进行。通过注射6M的胍-盐酸与0.25M氢氧化钠(2分钟)，接着用运行缓冲液进行另外的洗涤以及2分钟的稳定期，进行感应器芯片CAP表面的再生。在测量之前，进行了由三个连续的再生步骤组成的一个调整周期。数据用BiacoreT200评估软件(1.0版)进行评估。使用双重参照。使用1:1的结合模型以拟合原始数据。
针对SEQIDNOs:62-71的脂质运载蛋白突变蛋白所得到的拟合曲线分别如图13(A-J)所示。该数据显示，与SEQIDNO:13和SEQIDNO:22的脂质运载蛋白突变蛋白相比较，热稳定的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNOs:62-71)的亲和力完全保留。结合速率常数ka或kon，而解离速率常数kd或koff。为所述脂质运载蛋白突变蛋白得到的解离常数KD总结于下文的表10中。
表10：
SEQ ID kon[M-1*s-1] koff[s-1] KD[nM]
SEQ ID NO:13 2,81E+05 6,84E-05 0,24
SEQ ID NO:65 2,39E+05 7,61E-05 0,32
SEQ ID NO:64 3,23E+05 7,25E-05 0,22
SEQ ID NO:66 2,51E+05 8,17E-05 0,33
SEQ ID NO:67 2,49E+05 7,60E-05 0,31
SEQ ID NO:68 2,63E+05 8,03E-05 0,31
SEQ ID NO:63 2,35E+05 7,84E-05 0,33
SEQ ID NO:69 2,63E+05 7,66E-05 0,29
SEQ ID NO:70 2,23E+05 7,39E-05 0,33
SEQ ID NO:71 2,72E+05 8,81E-05 0,32
SEQ ID NO:22 5,91E+05 2,19E-04 0,37
SEQ ID NO:62 4,98E+05 1,65E-04 0,33
实施例18：在大肠杆菌中产生PCSK9特异性的Tlc突变蛋白
在大肠杆菌中表达PCSK9-特异性脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNOs:62、82、83和84)。将编码每个脂质运载蛋白突变蛋白(分别为SEQIDNOs:86、87、88和89)的DNA插入到经过同样切割的载体中，其在T5启动子(在SEQIDNOs:62、82和84的情况下)或T7A3启动子(在SEQIDNO:83的情况下)的控制下允许细菌产生突变蛋白。通过使用阴离子交换柱、苯基琼脂糖柱、凝胶过滤柱和螯合柱(在SEQIDNOs:82和84的情况下)的柱层析法的组合从细胞裂解液中纯化该突变蛋白。纯化的突变蛋白最后溶解于PBS中。
实施例19：Biacore分析
所有操作程序均用BiacoreT200(GEHealthcare)在25℃下进行。HBS-EP+缓冲液(10mMHEPES，pH7.4，0.15M氯化钠，3mMEDTA，和0.05％表面活性剂P20)作为运行缓冲液。使用标记试剂即EZ-Link磺基-NHS-LC-LC-生物素(ThermoScientific)，以一般方法进行PCSK9蛋白的生物素化，且未反应的试剂通过去盐离心柱去除。生物素捕获试剂盒(GEHealthcare)用于将生物素化的PCSK9配体固定到传感器芯片。该CAP传感器芯片上的流动池(预先固定了ss-DNA寡核苷酸)与缀合了链霉亲和素的互补ss-DNA寡核苷酸进行杂交，接着进行生物素化的配体注射。
针对捕获实验，将链霉亲和素-DNA缀合物注射到两个流动池中持续20秒，且生物素化的PCSK9样本在运行缓冲液中稀释为1ng/μl，然后以10μl/分钟注射到一个流动池中持续1分钟，而另一个流动池则留下来不具有捕获的样本以提供参考表面。设计捕获操作方案以产生配体样本的捕获水平，得到的Rmax值不超过20RU。
针对每个动力学实验，制备范围为0.03nM至100nM的不同浓度的纯化的PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白作为分析物，并以30μl/分钟注射持续300秒，随后解离30分钟。用2分钟脉冲的在0.25M氢氧化钠中6M盐酸胍进行捕获和参考表面的再生。
解离常数(KD)使用1:1Langmuir结合模型进行计算。原始数据集使用BiacoreT200评估软件(1.0版，GEHealthcare)进行分析，且参考流动池的传感图从样本捕获的流动池的传感图中减去。
实施例20：无细胞的PCSK9-LDLRTR-FRET分析
分泌的PCSK9有利于肝LDLR的降解，从而导致血清LDL-C含量的增加。因此，干扰PCSK9与LDLR之间相互作用的PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白造成LDLR循环至细胞质膜的增强，其激活LDL-C的摄入，且最终降低了循环的LDL-C含量。
使用无细胞的TR-FRET分析来测定脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNO:62、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83和SEQIDNO:84)对PCSK9与LDLR之间结合的抑制效果。通过与5倍摩尔过量的EZ-LinkNHSChromogenic生物素试剂(ThermoScientific公司)在室温下培养1小时制备用于该分析中的生物素标记的hPCSK9(生物素-hPCSK9)，并通过illustraNAP柱(GEHealthcareLifeScience)去除过量的生物素。铕标记的LDLR(Eu-LDLR)如先前的报告中所描述的方法制备(FisherTS等人，J.Biol.Chem.(2007)282(28),20502-20512)。
以384孔形式进行无细胞的PCSK9-LDLRTR-FRET分析。在34mg/ml的人类血清白蛋白存在或缺乏的情况下，将终浓度为20nM的生物素-hPCSK9与在结合缓冲液(10mMHEPES，pH7.4，150mM氯化钠，0.1mM氯化钙和0.05％(w/v)BSA)中若干浓度的测试脂质运载蛋白突变蛋白在室温下培养2小时。然后10μl的上述生物素-hPCSK9-脂质运载蛋白溶液和10μl的Eu-LDLR/Alexa-SA溶液(1.0nM的Eu-LDLR，80nM的链霉亲和素/AlexaFluor647缀合物(Invitrogen)，10mM的HEPES，pH7.4、150mM氯化钠，0.1mM氯化钙和0.05％(w/v)BSA)在孔中混合，并在室温下黑暗中培养2小时，接着在冰箱中培养过夜。使用BMGLabSystemsRubystar读板器读取样本，设定读取20次/孔，50μs整合延迟与200微秒整合时间，总读取时间为1100ms/孔。以在665/620nm波长下的发射率测量FRET。以下列方程式计算TR-FRET比例。
TR-FRET比例＝(在665nm下的计数/在620nm下的计数)x10,000
为了获得在其下PCSK9/LDL-R复合物形成被50％阻断时该脂质运载蛋白突变蛋白的浓度(IC50)，该曲线係以非线性回归与单点结合模型进行拟合。使用KaleidaGraph4.1.1版本软件进行曲线拟合(SynergySoftware公司)。通过用单点结合模型进行非线性回归，进行该曲线的拟合。使用KaleidaGraphver4.1.1软件(SynergySoftware)进行曲线拟合。
所得到的计算的IC50值总结于下文实施例21下面的表11中。
实施例21：PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白的体内血浆半衰期
脂质运载蛋白突变蛋白与可以靶向特定身体区域、生物体、组织、器官或细胞的部分的缀合可以延长脂质运载蛋白突变蛋白在体内的半衰期。例如，人类血清白蛋白(HAS)的半衰期据报告为～19天(BiochimicaetBiophysicaActa1830；5526-5534,2013)，因此将PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白(SEQIDNO:62和SEQIDNO:82)与结合HSA的白蛋白结合蛋白(如G148和SEQIDNO:85)缀合，因此可以在体内表现出脂质运载蛋白突变蛋白的长半衰期。
为了观察与白蛋白结合蛋白缀合的效果，以及测定PCSK9特异性的脂质运载蛋白突变蛋白的血浆长半衰期，将若干测试脂质运载蛋白突变蛋白给正常大鼠进行静脉内给药，并使用夹心ELISA测量该脂质运载蛋白突变蛋白的血浆浓度。用来测定血浆半衰期的血液采样在不同时间点进行，接着进行测试脂质运载蛋白突变蛋白的给药。
针对四个脂质运载蛋白突变蛋白所得到的血浆半衰期总结于下文的表11中。例如，该数据显示，与单独的脂质运载蛋白突变蛋白相比较，与可以结合HSA的部分缀合的脂质运载蛋白突变蛋白具有更长的半衰期。
表11：
本文示例性所描述的实施方式可以适当地在没有本文中未具体公开的任何一种或多种要素、一种或多种限制的情况下实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地解读且无限制。另外，本文所采用的术语和表达被用作为描述的术语而非限制，并且无意图在使用这些术语和表达时，排除掉显示和描述的特征的任何等同物或其部分，而是认可各种修改可以在本发明要求保护的范围内。因此，应当理解的是，虽然这些实施方式已通过优选的实施方式和任选的特征而被具体公开，本领域技术人员可以寻求其修改和变化，并且这样的修改和变化被认为是在本发明的范围内。本文所述的所有专利、专利申请、教科书和同行评审的出版物均通过引用全文并入本文。此外，当在通过引用并入本文的参考文献中的定义或使用的术语与本文所提供该术语的定义不一致或相反时，适用本文所提供的该术语的定义，而不适用该参考文献中该术语的定义。每个较窄种类和亚属分组落入一般性公开范围内，也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般描述，且具有从该种类中取出任何主题的条件或负面限制，而不管该去除的材料是否在本文中具体陈述。此外，当特征是以马库什组的形式描述时，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以该马库什组中任何单独成员或亚组的形式描述。进一步的实施方式将由以下的权利要求书中变得显而易见。

Claims (63)

1.一种人类泪液脂质运载蛋白的突变蛋白，其中所述突变蛋白包含：
(a)在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任一个或多个处的突变的氨基酸残基；和
(b)在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的序列位置61、101、111、114和153中的任一个或多个处的突变的氨基酸残基，
并且其中所述突变蛋白与PCSK9特异性结合。
2.一种脂质运载蛋白突变蛋白，其是PCSK9的拮抗剂。
3.一种脂质运载蛋白突变蛋白，其竞争LDL-R与PCSK9的结合。
4.一种脂质运载蛋白突变蛋白，其竞争包含SEQIDNO:29和SEQIDNO:33的单克隆抗体与PCSK9的结合。
5.一种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够完全或部分抑制PCSK9介导的LDL-R的下调。
6.一种脂质运载蛋白突变蛋白，其能够在存在PCSK9的情况下恢复LDL摄取。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白与非人类灵长类动物PCSK9或其免疫原性片段结合，且解离常数(KD)等于或小于10nM。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白与小鼠PCSK9或其免疫原性片段结合，且解离常数(KD)等于或小于10nM。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白与人类PCSK9或其片段结合，且解离常数(KD)等于或小于10nM。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白与人类PCSK9或其片段结合，且解离常数(KD)等于或小于1nM。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白与人类PCSK9或其片段结合，且解离常数(KD)等于或小于0.1nM。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的脂质运载蛋白突变蛋白，其中所述突变蛋白与人类PCSK9或其片段结合，且解离常数(KD)等于或小于1pM。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Arg26→Ser、Phe、Trp、His或Thr。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Glu34→Asn、Thr、Arg或Gly，Leu56→Met、Ser、Gln、Phe、His或Asn。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Ser58→Lys、Ala、Arg、Trp或Pro。
16.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Met31→Ala、Gly、His、Pro、SerAps、Glu或Gln。
17.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Leu33→Tyr、Trp、Tyr、Phe、Pro或Ala。
18.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Ser61→Trp或Phe，Asp80→Ser、Met、Pro、Ile、Gln、Tyr、Ser、Val或Thr。
19.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Glu104→Leu、Pro、Ser、Ala、Asn、Thr、Lys或Asp。
20.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：His106→Pro、Gln、Gly、Arg、Val、Thr、Asn或Leu。
21.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Lys108→Gln、Ala、Trp、Tyr、Arg、Asp、Asn、Ser、Glu或Thr。
22.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Glu27→Arg、Ser、Gln、Thr、Phe、Lys、Ala或Arg。
23.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Pro29→Gly、Asp、Asn、Ile、Leu或Met。
24.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Asn32→Ile、Leu、Tyr、Met或Trp。
25.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Leu105→Cys、Tyr、Trp、Glu、Arg、Ser、His、Ala、Val、Asp、Pro、Gly或Lys。
26.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Phe28→Cys、Arg、Lys、Trp、Asp、Gly、His、Leu或Asn。
27.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Glu30→Arg、Asp、Thr、Ser、Gly、Ala或Asn。
28.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Ile57→Tyr、Trp、His、Gln、Thr或Arg。
29.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，所述突变蛋白包含以下氨基酸置换中的至少一个：Lys83→Arg、Ser、Gln、Thr或Glu。
30.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，其包含以下氨基酸置换的集合中的一个：
(a)Arg26→Phe；Asn32→Ile；Glu34→Thr；Leu56→Met；Ser58→Ala和Lys83→Ser，
(b)Arg26→Trp；Asn32→Leu；Glu34→Thr；Leu56→Ser和Ser58→Ala，
(c)Arg26→His；Asn32→Tyr；Glu34→Thr；Leu56→Ser；Ser58→Arg和Lys83→Gln；
(d)Arg26→Phe；Asn32→Met；Glu34→Thr；Leu56→Gln；Ser58→Ala和Lys83→Thr；
(e)Asn32→Trp；Glu34→Arg；Leu56→Asn；Ser58→Trp和Lys83→Ser，
(f)Arg26→Phe；Asn32→Leu；Glu34→Thr；Leu56→Phe；Ser58→Ala和Lys83→Arg，
(g)Arg26→Thr；Asn32→Trp；Glu34→Asn；Leu56→His；Ser58→Pro和Lys83→Ser，
(h)Asn32→Trp；Glu34→Asn；Leu56→Phe；Ser58→Arg和Lys83→Glu，
(i)Arg26→Trp；Asn32→Leu；Glu34→Thr；Leu56→Met；Ser58→Ala和Lys83→Ser，或
(j)Asn32→Trp；Glu34→Gly；Leu56→Gln；Ser58→Ala和Lys83→Gln。
31.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，其包含以下氨基酸置换的集合中的一个：
(a)Glu27→Ser；Phe28→Arg；Pro29→Gly；Glu30→Asp；Met31→Ala；Leu33→Trp；Ile57→Tyr；Asp80→Met；Glu104→Pro；Leu105→Tyr；His106→Gln；Lys108→Ala，
(b)Glu27→Gln；Phe28→Cys；Pro29→Asp；Glu30→Thr；Met31→Gly；Leu33→Trp；Ile57→Tyr；Leu105→Cys；His106→Gly；Lys108→Trp，
(c)Glu27→Glu；Phe28→Trp；Pro29→Asn；Glu30→Gly；Met31→His；Leu33→Tyr；Ile57→Tyr；Asp80→Pro；Glu104→Ser；Leu105→Trp；His106→Pro；Lys108→Tyr，
(d)Glu27→Thr；Phe28→Asp；Pro29→Asn；Glu30→Ser；Met31→Pro；Leu33→Phe；Ile57→Tyr；Asp80→Ile；Glu104→Ala；Leu105→Glu；His106→Arg；Lys108→Arg，
(e)Glu27→Phe；Phe28→Lys；Pro29→Ile；Glu30→Ala；Met31→Ser；Leu33→Pro；Ile57→Trp；Asp80→Gln；Glu104→Asn；Leu105→Arg；His106→Gln；Lys108→Asp，
(f)Glu27→Lys；Phe28→Gly；Pro29→Pro；Glu30→Thr；Met31→Pro；Leu33→Trp；Ile57→His；Asp80→Tyr；Glu104→Ala；Leu105→Ser；His106→Val；Lys108→Asn，
(g)Glu27→Glu；Phe28→His；Pro29→Leu；Glu30→Ala；Met31→Asp；Leu33→Ala；Ile57→Gln；Asp80→Ile；Glu104→Ala；Leu105→Tyr；His106→Pro；Lys108→Ser，
(h)Glu27→Ala；Phe28→Asp；Pro29→Met；Glu30→Gly；Met31→Asp；Leu33→Pro；Ile57→Thr；Asp80→Thr；Glu104→Thr；His106→Thr；Lys108→Arg，
(i)Glu27→Arg；Phe28→Leu；Pro29→Asp；Glu30→Asn；Met31→Glu；Leu33→Trp；Ile57→Tyr；Asp80→Gln；Glu104→Pro；Leu105→Arg；His106→Asn；Lys108→Ala，
(j)Glu27→Lys；Phe28→Asn；Pro29→Met；Glu30→Gly；Met31→Gln；Leu33→Pro；Ile57→Arg；Asp80→Ile；Glu104→Asp；Leu105→Arg；His106→Leu；Lys108→Thr，或
(k)Glu27→Ser；Phe28→Arg；Pro29→Gly；Glu30→Asp；Met31→Ala；Leu33→Trp；Ile57→Tyr；Asp80→Met；Glu104→Pro；Leu105→Gly；His106→Gln；Lys108→Ala。
32.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，其包含以下氨基酸置换的组合：Arg26→Phe；Glu27→Ser；Phe28→Arg；Pro29→Gly；Glu30→Asp；Met31→Ala；Asn32→Ile；Leu33→Trp；Glu34→Thr；Leu56→Met；Ile57→Tyr；Ser58→Ala；Lys83→Ser；Glu104→Pro和Lys108→Thr。
33.根据权利要求32所述的突变蛋白，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，其进一步包括以下氨基酸置换中的一个或多个：Thr43→Ile或Ala，Glu45→Gly，Asn48→Gly，Glu63→Gly，Ala66→Vla，Glu69→Vla，Lys70→Arg，Ala79→Thr、Met或Vla，Asp80→Met或Ser，Gly82→Ser，His84→Gln，Vla85→Gly，Tyr87→Ser，Ile88→Thr或Leu，His92→Pro，Leu105→His、Gly或Tyr和His106→Gln或Arg。
34.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，其包含以下氨基酸置换的组合：Glu27→Phe；Phe28→Lys；Pro29→Ile；Asn32→Trp；Leu33→Pro；Glu34→Arg；Leu56→Asn；Ile57→Trp；His106→Gln和Lys108→Glu。
35.根据权利要求34所述的突变蛋白，与成熟人类泪液脂质运载蛋白相比较，其进一步包括以下氨基酸置换中的一个或多个：Glu43→Gly或Ala，Glu45→Gly，Ser58→Trp或Arg，Glu63→Asp，Glu69→Gly，Lys70→Arg，Asp80→Gln、Val或Thr，Gly82→Asp，Lys83→Ser或Arg，Ala86→Glu或Ser，Phe99→Leu，Glu102→Lys或Val，Glu104→Asn或Lys和Pro106→Thr。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白在关于成熟人类泪液脂质运载蛋白的氨基酸序列的位置28或105处包含天然氨基酸由半胱氨酸残基置换的氨基酸置换。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与成熟人类泪液脂质运载蛋白的序列具有至少75％的同一性。
38.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白具有如SEQIDNOs:3-28、62-71和82中任一个所示的氨基酸序列或其片段或变体。
39.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白具有如SEQIDNO:23所示的氨基酸序列或其片段或变体。
40.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白具有如SEQIDNO:13所示的氨基酸序列或其片段或变体。
41.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白具有如SEQIDNO:20所示的氨基酸序列或其片段或变体。
42.根据权利要求1-12中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白具有如SEQIDNO:22所示的氨基酸序列或其片段或变体。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与标记部分缀合。
44.根据权利要求1-42中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与能够靶向受试者内的特定身体区域、生物体、组织、器官或细胞的部分缀合。
45.根据权利要求1-42中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与能够延长所述突变蛋白的血清半衰期的部分缀合。
46.根据权利要求1-42中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与聚乙二醇分子缀合。
47.根据权利要求46所述的缀合的突变蛋白，其中所述缀合的突变蛋白包含如SEQIDNOs:30-32中任一个所示的氨基酸序列。
48.根据权利要求1-42中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与白蛋白结合蛋白缀合。
49.根据权利要求48所述的缀合的突变蛋白，其中所述缀合的突变蛋白包含如SEQIDNOs:83-84中任一个所示的氨基酸序列。
50.根据权利要求1-42中任一项所述的突变蛋白，其中所述突变蛋白与部分融合，所述部分能够给融合物赋予新特征。
51.一种产生人类泪液脂质运载蛋白的一种或多种突变蛋白的方法，其中所述一种或多种突变蛋白与PCSK9结合，所述方法包括：
(a)使编码人类泪液脂质运载蛋白的核酸分子在以下位置处经受突变：
(i)成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置26-34、56-58、80、83、104-106和108中的任一个或多个，和
(ii)成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置61、101、111、114和153中的任一个或多个，
由此获得编码人类泪液脂质运载蛋白的一种或多种突变蛋白的一种或多种核酸分子，
(b)在表达系统中表达在(a)中获得的所述一种或多种核酸分子，由此获得人类泪液脂质运载蛋白的一种或多种突变蛋白，和
(c)进一步筛选在(b)中获得的所述一种或多种突变蛋白。
52.根据权利要求51所述的方法，其中步骤(c)进一步包括：
(ci)提供PCSK9或其免疫原性片段，
(cii)使通过筛选获得的所述一种或多种突变蛋白与所述PCSK9或其免疫原性片段接触，由此允许在所述PCSK9或其免疫原性片段和对于其具有结合亲和力的突变蛋白之间形成复合物，和
(ciii)去除不具有结合亲和力或不具有实质结合亲和力的一种或多种突变蛋白。
53.根据权利要求51或52所述的方法，其中在步骤(c)中的筛选在竞争性条件下进行。
54.根据权利要求51-53中任一项所述的方法，其中步骤(a)进一步包括：(a)(iii)使所述编码人类泪液脂质运载蛋白的核酸分子在成熟人类泪液脂质运载蛋白的线性多肽序列的氨基酸序列位置79、92和105中的任一个或多个处经受突变。
55.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-50中任一项所述的突变蛋白的核苷酸序列。
56.一种如SEQIDNOs:36-61、72-81和86-89中任一个所示的核酸分子。
57.一种含有权利要求55或56所述的核酸分子的宿主细胞。
58.一种根据权利要求1-50中任一项所述的突变蛋白或包含所述突变蛋白的组合物在受试者中用于结合PCSK9的用途。
59.根据权利要求1-50中任一项所述的突变蛋白或包含所述突变蛋白的组合物在受试者中用于抑制PCSK9与LDL-R的结合的用途。
60.根据权利要求1-50中任一项所述的突变蛋白用于检测PCSK9的用途，所述检测包括：
(a)在适当条件下使所述突变蛋白与疑似含有PCSK9的测试样品接触，由此允许在所述突变蛋白和PCSK9或其结构域或片段之间形成复合物，和
(b)通过适当的信号检测所述复合物。
61.根据权利要求1-50中任一项所述的突变蛋白用于分离PCSK9的用途，所述用途包括：
(a)在适当条件下使所述突变蛋白与疑似含有PCSK9的样品接触，由此允许在所述突变蛋白和PCSK9或其结构域或片段之间形成复合物，和
(b)从所述样品中分离所述复合物。
62.根据权利要求1-50中任一项所述的突变蛋白用于将化合物靶向到预先选定的要用所述化合物处理的生物体、组织、器官或细胞的用途，所述用途包括以下步骤：
(a)将所述突变蛋白与所述化合物缀合，和
(b)将所述突变蛋白/化合物复合物递送到所述预先选定的生物体、组织、器官或细胞。
63.一种包含根据权利要求1-50中任一项所述的突变蛋白的试剂盒。
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Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
SG11201505856TA (en) 2013-03-14 2015-08-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Novel binding proteins for pcsk9
EP3102224B1 (en) * 2013-12-20 2019-02-20 NephroGenesis, LLC. Apparatuses for kidney dialysis and lipocalin protein for use in the prevention or treatment of uremia by dialysis
US9398085B2 (en) 2014-11-07 2016-07-19 Ringcentral, Inc. Systems and methods for initiating a peer-to-peer communication session
AU2016258952C1 (en) 2015-05-04 2020-12-24 Pieris Pharmaceuticals Gmbh Proteins specific for CD137
KR20210010890A (ko) * 2018-05-16 2021-01-28 립 테라퓨틱스, 엘엘씨 Pcsk9 결합 분자를 포함하는 조성물 및 사용 방법
JOP20190150A1 (ar) 2018-06-21 2019-12-21 Merck Sharp & Dohme مركبات مناهضة لـ pcsk9
EP3810177A4 (en) 2018-06-21 2022-05-11 RA Pharmaceuticals, Inc. CYCLIC PEPTIDES FOR PCSK9 INHIBITION
WO2019246386A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Ra Pharmaceuticals Inc. Cyclic polypeptides for pcsk9 inhibition
WO2020150473A2 (en) 2019-01-18 2020-07-23 Dogma Therapeutics, Inc. Pcsk9 inhibitors and methods of use thereof
KR20210146999A (ko) 2019-03-29 2021-12-06 피어이스 파마슈티컬즈 게엠베하 리포칼린 뮤테인의 흡입 투여
WO2022021000A1 (zh) * 2020-07-27 2022-02-03 深圳华大生命科学研究院 一种抗体结合的特征性表位及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679527A (zh) * 2007-04-13 2010-03-24 诺瓦提斯公司 用于调节前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(pcsk9)的分子和方法
WO2011154420A2 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Pieris Ag Tear lipocalin muteins binding il-4 r alpha

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01215289A (ja) 1988-02-22 1989-08-29 Toa Nenryo Kogyo Kk 遺伝子組換えによる正常ヒト血清アルブミンａの製造方法
FR2649991B2 (fr) 1988-08-05 1994-03-04 Rhone Poulenc Sante Utilisation de derives stables du plasmide pkd1 pour l'expression et la secretion de proteines heterologues dans les levures du genre kluyveromyces
US5728553A (en) 1992-09-23 1998-03-17 Delta Biotechnology Limited High purity albumin and method of producing
DE4417598A1 (de) 1994-05-19 1995-12-14 Max Planck Gesellschaft Verwendung des Tetracyclinpromotors zur stringent regulierten Produktion von rekombinanten Proteinen in prokaryontischen Zellen
US5908621A (en) 1995-11-02 1999-06-01 Schering Corporation Polyethylene glycol modified interferon therapy
US6620413B1 (en) 1995-12-27 2003-09-16 Genentech, Inc. OB protein-polymer chimeras
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
CA2233725A1 (en) 1998-03-31 1999-09-30 Hemosol Inc. Hemoglobin-hydroxyethyl starch complexes
ATE307597T1 (de) 1998-06-08 2005-11-15 Hoffmann La Roche Verwendung von peg-ifn-alpha und ribavirin zur behandlung chronischer hepatitis c
US6403564B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Schering Corporation Ribavirin-interferon alfa combination therapy for eradicating detectable HCV-RNA in patients having chronic hepatitis C infection
DE19926068C1 (de) 1999-06-08 2001-01-11 Arne Skerra Muteine des Bilin-Bindungsproteins
US7211395B2 (en) 2001-03-09 2007-05-01 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
AU2001298053A1 (en) 2001-09-27 2003-04-14 Pieris Proteolab Ag Muteins of apolipoprotein D
WO2003029462A1 (en) 2001-09-27 2003-04-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of human neutrophil gelatinase-associated lipocalin and related proteins
AT411852B (de) 2002-02-12 2004-06-25 Didosyan Yuri S Dr Verfahren und vorrichtung zur änderung des polarisationszustandes von licht mit einem magnetisch einachsigen kristall
US7691970B2 (en) 2003-08-25 2010-04-06 Pieris Ag Muteins of a bilin-binding protein with affinity for a given target
AU2003275958A1 (en) 2003-08-25 2005-03-10 Pieris Proteolab Ag Muteins of tear lipocalin
EP2899277A1 (en) 2004-11-26 2015-07-29 Pieris AG Compound with affinity for the cytotoxic T lymphocyte-associated antigen (CTLA-4)
JP2009509535A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 アムニクス， インコーポレイテッド タンパク様薬剤およびその使用
EP1996613B1 (en) * 2006-03-20 2014-04-30 Technische Universität München Muteins of tear lipocalin with affinity for the t-cell coreceptor cd4
DK2046820T3 (da) * 2006-08-01 2011-02-07 Pieris Ag Muteiner af tåre-lipocalin og fremgangsmåder til opnåelse deraf
WO2008057459A2 (en) * 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
CA2668131A1 (en) * 2006-11-07 2008-05-15 Merck & Co., Inc. Antagonists of pcsk9
EP2546261A3 (en) 2007-07-31 2013-08-14 Affibody AB New compositions, methods and use
CN103003296A (zh) 2010-07-09 2013-03-27 阿菲博迪公司 多肽
AP2014007792A0 (en) * 2012-01-09 2014-07-31 Pieris Ag Methods for preventing, treating or diagnosing disorders
SG11201505856TA (en) 2013-03-14 2015-08-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Novel binding proteins for pcsk9

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101679527A (zh) * 2007-04-13 2010-03-24 诺瓦提斯公司 用于调节前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin9型(pcsk9)的分子和方法
WO2011154420A2 (en) * 2010-06-08 2011-12-15 Pieris Ag Tear lipocalin muteins binding il-4 r alpha

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEFFEN SCHLEHUBER ET AL.: "Anticalins in Drug Development", 《 BIODRUGS》 *

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