KR20150131151A - 피씨에스케이9에 대한 신규의 결합 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 명세는 PCSK9에 결합하는 신규의 리포칼린 뮤테인에 관한 것이다. 상기 명세는 또한 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 상응하는 핵산 분자 및 리포칼린 뮤테인뿐만 아니라 그의 암호화 핵산 분자의 생성 방법을 제공한다.
Description
I. 배경
인간 프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형(PCSK9)은 주로 신장, 간 및 장에서 발현되는 분비 단백질이다. 상기는 3개의 도메인, 즉 억제성 프로-도메인(아미노산 1-152; 아미노산 1-30에 신호 서열을 포함한다), 세린 프로테아제 도메인(또는 촉매 도메인; 아미노산 153-448에), 및 시스테인 잔기가 풍부한, 210 잔기 길이(아미노산 449-692에)의 C-말단 도메인(또는 시스테인/히스티딘-풍부 도메인)을 갖는다. PCSK9는 소포체에서 상기 프로-도메인과 촉매 도메인간에 자가촉매적 절단을 겪는 효소원으로서 합성된다. 상기 프로-도메인은 절단후 성숙한 단백질에 결합된 채로 있으며, 복합체가 분비된다. 상기 시스테인-풍부 도메인은, 활성화된 프로테아제의 폴딩 및 조절에 필수적인 것으로 보이는 다른 퓨린/켁신/서브틸리신-유사 세린 프로테아제들의 P-(가공) 도메인과 유사한 역할을 할 수 있다.
PCSK9는 세린 프로테아제의 프로테이나제 K 분비성 서브틸리신-유사 상과의 일원이며(문헌[Naureckiene et al, 2003 Arc. Biochem. Biophys. 420:55-67]) 간 저밀도 지방단백질 수용체(LDL-R)의 강한 음의 조절인자로서 작용한다. PCSK9는 혈류 중에서 순환하는 저밀도 지방단백질(LDL) 입자의 수준을 조절함으로써 콜레스테롤 대사에 중요한 역할을 한다. 상승된 수준의 PCSK9는 간에서 LDL-R 수준을 감소시켜, 혈장 중에 높은 수준의 저밀도 지방단백질 콜레스테롤(LDL-c) 및 관상동맥 질병에 대한 증가된 민감성을 생성시키는 것으로 나타났다(문헌[Peterson et a.l, J Lipid Res. 49(7): 1595-9 (2008)]).
상기 저-밀도 지방단백질 수용체(LDL-R)는 혈류 중 저밀도 지방단백질(LDL)의 제거를 통해 죽상동맥경화증 및 고콜레스테롤혈증을 예방한다. LDL-R은 PCSK9에 의해 번역후 수준에서 조절된다. PCSK9 녹아웃 마우스는 혈장 LDL-c 수준의 대략 50% 감소를 나타내었고 혈장 LDL-c의 감소에 있어서 스타틴류에 대해 증대된 감도를 나타내었다(문헌[Rashid S, et al (2005) Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379]). 인간 유전자 데이터는 또한 항상성에 있어서 PCSK9의 역할을 지지한다. PCSK9의 돌연변이는 혈장 중 LDL-c의 이상 수준과 관련된다(문헌[Horton et al, 2006 Trends. Biochem. Sci. 32(2):71-77]). 최근에, 추정상 PCSK9의 "기능상실" 돌연변이인 2개의 돌연변이가 확인되었다. 이들 돌연변이를 갖는 개인은 LDL-c의 혈장 수준의 대략 40% 감소를 가지며 이는 관상 심장 질병의 대략 50 내지 90% 감소로 이행된다.
따라서, PCSK9의 활성을 길항하고 다양한 병적인 상태들에서 수행되는 상응하는 PCSK9 역할을 차단하거나 감소시키는 PCSK9의 억제제를 생성시키는 것이 매우 유리할 것이다.
II. 정의
하기의 목록은 본 명세서 전체를 통해 사용되는 용어, 어구 및 약어를 정의한다. 본 원에서 나열되고 정의된 모든 용어들은 모든 문법적인 형태들을 포함하고자 한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "리포칼린"이란 용어는 그의 초2차 구조, 즉 한쪽 단부에서 4개의 고리에 의해 짝을 이루어 연결되어 결합 주머니를 한정하는 8개의 β-가닥을 포함하는 원통형 β-주름 시트 초2차 구조 영역에 의해 한정되는 폴리펩티드를 지칭한다. 리포칼린(문헌[Pervaiz and Brew, FASEB J. 1 (1987), 209-214])은 다양한 유기체들로부터 단리된 작은, 종종 단량체성인 분비 단백질의 한 과이다(문헌[Flower, Biochem. J. 318 (1996), 1-12]). 상기 리포칼린은 비교적 적은 상호 서열 유사성을 가지며 동일한 단백질 구조 부류에의 이들의 소속은 X-선 구조 분석에 의해 최초로 밝혀졌다(문헌[Sawyer et al, Nature 327 (1987), 659]).
상기와 관련하여, 논의된 본 발명에 사용되는 바와 같은 "리포칼린 뮤테인"은 리포칼린으로부터 유래되고 한쪽 단부에서 4개의 고리에 의해 짝을 이루어 연결되어 결합 주머니를 한정하는 8개의 β-가닥을 포함하는 원통형 β-주름 시트 초2차 구조 영역을 갖는 뮤테인을 지칭하며, 여기에서 상기 4개 고리 중 적어도 3개 각각의 적어도 하나의 아미노산이 돌연변이되었다(예를 들어 PCT 공보 WO 1999/16873을 참조하시오). 일부 특정한 실시태양에서, 상기 리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린으로부터 유래될 수 있다. 그러나, 일부 다른 특정한 실시태양에서, 상기 리포칼린 뮤테인은 인간 눈물 리포칼린 외의 리포칼린으로부터 유래될 수도 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "피험자"란 용어는 임의의 척추동물, 예를 들어 포유동물을 포함한다. 포유동물은 비제한적으로 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 비-인간 영장류, 예를 들어 원숭이), 토끼, 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)를 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 개인 또는 피험자는 인간이다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "프로단백질 전환효소 서브틸리신 켁신 9형"("PCSK9", "NARC-1"과 호환 가능하다)이란 용어는 달리 가리키지 않는 한, 영장류(예를 들어 인간) 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)와 같은 포유동물을 포함하여, 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 고유 PCSK9를 지칭한다. 상기 용어는 "완전-길이", 가공되지 않은 PCSK9뿐만 아니라 세포 또는 임의의 그의 단편에서의 가공으로부터 생성되는 임의의 형태의 PCSK9를 포함한다. 상기 용어는 또한 PCSK9의 천연 변이체, 예를 들어 연접 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "벡터"란 용어는 상기에 연결되는 또 다른 핵산을 전파시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 상기 벡터가 도입된 숙주 세포의 게놈에 통합된 벡터를 포함한다. 몇몇 벡터는 상기 벡터에 작동적으로 연결되는 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있다. 상기와 같은 벡터를 본 발명에서 "발현 벡터"라 칭한다.
III. 도면의 설명
도 1은 리포칼린 뮤테인 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 11에 대한 표면 플라스몬 공명에 의한 온-율 및 오프-율의 전형적인 측정을 제공한다. 인간 PCSK9("hPCSK9")(서열번호 34)에 대해 생성되는 해리 상수(KD), 결합율(kon) 및 해리율(koff)을 실시예 6의 표 1에 요약한다.
도 2는 리포칼린 뮤테인 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8이 PCSK9와 그의 수용체 LDL-R 간의 상호작용을 차단할 수 있었음을 입증한다. 비오틴화된 hPCSK9(도 2A) 또는 비오틴화된 hPCSK9_D374Y 돌연변이체(도 2B)를 가변 농도의 상기 뮤테인과 예비-배양하고 중화되지 않은 PCSK9를 고정화된 용해성 LDL-R을 갖는 ELISA 플레이트상에서 정량분석하였다. 음성 대조용 서열번호 2는 경쟁 효과를 갖지 않았다. 데이터를 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다. 생성되는 IC50 값들을 실시예 7의 표 2에 요약한다.
도 3은 ELISA 포맷으로 측정된 바와 같은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 리포칼린 뮤테인의 교차반응성 프로파일을 도시한다. hPCSK9_D374Y 돌연변이체 및 키노몰구스 원숭이 PCSK9에 대한 상기 리포칼린 뮤테인의 완전한 교차반응성이 거의 동일한 KD 값들로부터 자명하다(표 3을 참조하시오). 상기 시험된 농도 범위내에서, 또한 마우스 PCSK9에 대한 교차반응성이 존재하지만, 친화성은 보다 낮다. 음성 대조군(서열번호 2)으로부터 결합은 탐지되지 않았다. 데이터를 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다.
도 4는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 리포칼린 뮤테인이 세포-기재 분석에서 hPCSK9의 그의 수용체 LDL-R에 대한 결합을 차단하는데 유효함을 예시한다. 상기 분석은 형광-표지된 Dil-LDL의 감소된 세포내 흡수를 이끌어내는 HepG2 세포상의 LDL-R의 PCSK9-유도된 내면화에 근거한다. 세포를 고정된 농도의 hPCSK9(100 nM)와 배양하고 상기 리포칼린 뮤테인으로 적정하였다. 상기 리포칼린 뮤테인의 농도에 대해서, BMG 페라스타(PheraStar) 판독기를 사용하여 485/535 ㎚에서 측정된 세포내 Dil-LDL의 표준화된 형광 신호를 플롯팅하였다. 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 리포칼린 뮤테인에 대해 생성되는 IC50 값들을 표 4에 제공한다. PCSK9에 대한 리포칼린 뮤테인의 결합이 세포내로의 Dil-LDL 흡수의 PCSK9-매개된 감소를 복원시킨 반면, 서열번호 2의 음성 대조군은 효과가 없었다. 상기 곡선들은 비선형 회귀 "S자 용량-반응, 가변 기울기" 모델(5PL 정합)을 사용하여 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 4에 의해 정합되었다. 데이터는 PCSK9 자극된 및 자극되지 않은 세포의 값에 의해 표준화하였다.
도 5는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은, 서열번호 13(도 5C), 서열번호 20(도 5A) 및 서열번호 21(도 5B)의 리포칼린 뮤테인의 hPCSK9에의 결합 및 비결합에 대한 온-율 및 오프-율의 전형적인 측정을 제공한다. 생성되는 KD들을 표 5에 요약한다(실시예 10을 참조하시오).
도 6은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은, 다양한 PCSK9 종에의 리포칼린 뮤테인(서열번호 20)의 결합 및 비결합에 대한 온-율 및 오프-율의 전형적인 측정을 제공한다. 리포칼린 뮤테인 서열번호 20 및 다른 뮤테인들에 대해 생성되는 KD들을 표 6에 요약한다(실시예 11을 참조하시오).
도 7은 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32의 리포칼린 뮤테인들의 PEG화된 버전들이 서열번호 13의 변형되지 않은 리포칼린 뮤테인(0.16 nM의 IC50을 나타내었다)과 유사하게, 각각 0.19, 0.53 및 0.37 nM의 IC50으로 hPCSK9에 결합할 수 있음을 입증한다. 비오틴화된 hPCSK9를 가변 농도의 상기 리포칼린 뮤테인과 예비 배양하고 중화되지 않은 hPCSK9를, hPCSK9에 대한 결합에 대해서 상기 리포칼린 뮤테인과 경쟁하는 양성 대조군으로서 사용되는 기준 항체(그의 경쇄를 서열번호 29로 나타내는 반면 그의 중쇄는 서열번호 33으로 나타낸다)로 고정화된 ELISA 플레이트상에서 정량분석하였다. 데이터를 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다.
도 8은 서열번호 22, 서열번호 13 및 서열번호 20의 리포칼린 뮤테인 및 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32의 상기 뮤테인 각각의 PEG화된 변이체가 세포-기재 LDL-R 고갈 분석에서 hPCSK9의 생물 활성을 차단할 수 있음을 입증한다. 상기 시험된 리포칼린 뮤테인 및 서열번호 2의 음성 대조군의 일련의 희석물을 LDL 기아 HepG2 세포상에서 일정한 농도의 hPCSK9와 배양한다. 상기 HepG2 표면상의 LDL-R의 수준을 특이적인 염소 항-hLDL-R 항체(R&D Cat. No. AF2148)를 사용하여 평가하였다. PCSK9-유도된 최대 LDL-R 내면화를 100%로 설정하였다. 리포칼린 뮤테인의 첨가는 PCSK9의 활성을 용량-의존적인 방식으로 차단하였다. 이에 관하여, 서열번호 22, 서열번호 13 및 서열번호 20의 리포칼린 뮤테인에 대한 IC50 값은 각각 76 nM, 103 nM 및 91 nM이었다. 따라서, 상기 PEG화된 리포칼린 뮤테인(각각 서열번호 30 내지 32를 포함하며, 이들 서열번호는 상기 명세의 3개의 리포칼린 뮤테인 변이체의 아미노산 서열을 나타내지만 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자의 서열은 포함하지 않는다)에 대해 측정된 IC50이 이들 각각의 PEG화되지 않은 형태들(각각 서열번호 13, 20 및 22)과 상이하지 않으므로 PEG화는 리포칼린 뮤테인의 차단 능력에 영향을 미치지 않았다. 서열번호 2의 음성 대조군은 PCSK9의 활성에 영향을 미치지 않았다. 요약하면, 상기 리포칼린 뮤테인은 PCSK9의 생물 활성을 억제하였으며 따라서 상기 세포 표면상의 LDL-R을 복원시킨다. 상기 데이터를 S자 용량-반응 모델로 정합시켰다.
도 9는 OmpA 신호 서열(OmpA) 및 인간 눈물 리포칼린 뮤테인에 이어서 스트렙-태그 II를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터 pTLPC26(또한 pTlc26이라 칭함)을 도시한다. 상기 돌연변이된 유전자 카셋트의 클로닝에 사용된 BstXI-제한 부위 및 상기 구조 유전자의 측면에 인접한 제한 부위들이 모두 표지된다. 유전자 발현은 테트라사이클린 프로모터/오퍼레이터(tetp /o)의 조절하에 있다. 전사는 지방단백질 전사 종결자(tlpp)에서 종결된다. 상기 벡터는 복제기원(ori), 섬유상 파지 f1의 유전자간 영역(f1-IG), 암피실린 내성 유전자(amp) 및 테트라사이클린 억제 유전자(tetR)를 추가로 포함한다. pTLPC26의 핵산 서열의 관련 분절은 서열번호 35로서 서열 목록에 제공된다. 상기 분절은 XbaI 제한 부위로 시작하여 HindIII 제한 부위로 끝난다. 상기 영역 밖의 벡터 요소들은 벡터 pASK75와 일치하며, 상기 벡터의 완전한 뉴클레오티드 서열은 독일 특허 공보 DE 44 17 598 A1에 제공되어 있다.
도 10은 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)의 폴리펩티드 서열과 비교하여 몇몇 인간 눈물 리포칼린계 뮤테인의 아미노산 서열들(서열번호 2-28로서 나열됨)의 정렬을 도시한다.
도 11: 도 11A는 실시예 3에 대한 암호화된 아미노산들의 예상 분포를 제공한다. 명확성을 위해서, 1% 미만의 빈도를 갖는 아미노산들은 모두 생략되며; 앰버 정지 코돈(TAG)은 코돈 억제 세균 균주, TG1 F가 파지 디스플레이 과정에 사용되기 때문에 암호화 글루타민으로서 간주된다. 또한, 성숙 라이브러리의 서열분석으로부터 획득된 실험 데이터(도 11B 및 도 11 C)는, 세린의 빈도가 목적하는 경우보다 더 높음(이는 PCR에 의한 올리고 합성 또는 올리고 조립에서의 어느 한쪽으로의 편향을 반영한다)에도 불구하고, 상기 예상 분포와 실험 분포간에 양호한 합치가 존재함을 나타낸다. 상기 발견과 일치하여, 2개 라이브러리에 대한 돌연변이 분포의 실험적으로 획득된 빈도(도 11E 및 도 11F)는 이론적으로 예상되는 분포(도 11D)에 가깝지만, 보다 낮은 빈도쪽으로 이동한다.
도 12는 모세관 나노DSC 장비(Q2000, TA 인스트루먼츠(Instruments))를 사용하여 나노 차동 주사 열량계("나노DSC") 측정으로부터 획득된 온도기록도를 도시하며, 리포칼린 뮤테인들(서열번호 13 및 서열번호 63-65)의 용융 곡선들의 오버레이를 나타낸다. 열-안정화된 유도체들(서열번호 63-65)의 용융 곡선들이 서열번호 13에 비해 현저하게 이동된다.
도 13은 리포칼린 뮤테인들(서열번호 62-71)에 대한 표면 플라스몬 공명에 의한 온-율 및 오프-율의 전형적인 측정을 제공한다. 도 13A 내지 도 13J는 각각 서열번호 62-71에 상응한다. 인간 PCSK9("hPCSK9")(서열번호 34)에 대해 생성되는 해리 상수(KD), 결합율(kon) 및 해리율(koff)을 실시예 17의 표 10에 요약한다.
도 14는 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)의 폴리펩티드 서열과 비교하여 몇몇 인간 눈물 리포칼린계 뮤테인의 아미노산 서열들(서열번호 13, 22, 62-71로서 나열됨)의 정렬을 도시한다.
도 1은 리포칼린 뮤테인 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 11에 대한 표면 플라스몬 공명에 의한 온-율 및 오프-율의 전형적인 측정을 제공한다. 인간 PCSK9("hPCSK9")(서열번호 34)에 대해 생성되는 해리 상수(KD), 결합율(kon) 및 해리율(koff)을 실시예 6의 표 1에 요약한다.
도 2는 리포칼린 뮤테인 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8이 PCSK9와 그의 수용체 LDL-R 간의 상호작용을 차단할 수 있었음을 입증한다. 비오틴화된 hPCSK9(도 2A) 또는 비오틴화된 hPCSK9_D374Y 돌연변이체(도 2B)를 가변 농도의 상기 뮤테인과 예비-배양하고 중화되지 않은 PCSK9를 고정화된 용해성 LDL-R을 갖는 ELISA 플레이트상에서 정량분석하였다. 음성 대조용 서열번호 2는 경쟁 효과를 갖지 않았다. 데이터를 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다. 생성되는 IC50 값들을 실시예 7의 표 2에 요약한다.
도 3은 ELISA 포맷으로 측정된 바와 같은 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 리포칼린 뮤테인의 교차반응성 프로파일을 도시한다. hPCSK9_D374Y 돌연변이체 및 키노몰구스 원숭이 PCSK9에 대한 상기 리포칼린 뮤테인의 완전한 교차반응성이 거의 동일한 KD 값들로부터 자명하다(표 3을 참조하시오). 상기 시험된 농도 범위내에서, 또한 마우스 PCSK9에 대한 교차반응성이 존재하지만, 친화성은 보다 낮다. 음성 대조군(서열번호 2)으로부터 결합은 탐지되지 않았다. 데이터를 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다.
도 4는 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 리포칼린 뮤테인이 세포-기재 분석에서 hPCSK9의 그의 수용체 LDL-R에 대한 결합을 차단하는데 유효함을 예시한다. 상기 분석은 형광-표지된 Dil-LDL의 감소된 세포내 흡수를 이끌어내는 HepG2 세포상의 LDL-R의 PCSK9-유도된 내면화에 근거한다. 세포를 고정된 농도의 hPCSK9(100 nM)와 배양하고 상기 리포칼린 뮤테인으로 적정하였다. 상기 리포칼린 뮤테인의 농도에 대해서, BMG 페라스타(PheraStar) 판독기를 사용하여 485/535 ㎚에서 측정된 세포내 Dil-LDL의 표준화된 형광 신호를 플롯팅하였다. 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 리포칼린 뮤테인에 대해 생성되는 IC50 값들을 표 4에 제공한다. PCSK9에 대한 리포칼린 뮤테인의 결합이 세포내로의 Dil-LDL 흡수의 PCSK9-매개된 감소를 복원시킨 반면, 서열번호 2의 음성 대조군은 효과가 없었다. 상기 곡선들은 비선형 회귀 "S자 용량-반응, 가변 기울기" 모델(5PL 정합)을 사용하여 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 4에 의해 정합되었다. 데이터는 PCSK9 자극된 및 자극되지 않은 세포의 값에 의해 표준화하였다.
도 5는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은, 서열번호 13(도 5C), 서열번호 20(도 5A) 및 서열번호 21(도 5B)의 리포칼린 뮤테인의 hPCSK9에의 결합 및 비결합에 대한 온-율 및 오프-율의 전형적인 측정을 제공한다. 생성되는 KD들을 표 5에 요약한다(실시예 10을 참조하시오).
도 6은 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같은, 다양한 PCSK9 종에의 리포칼린 뮤테인(서열번호 20)의 결합 및 비결합에 대한 온-율 및 오프-율의 전형적인 측정을 제공한다. 리포칼린 뮤테인 서열번호 20 및 다른 뮤테인들에 대해 생성되는 KD들을 표 6에 요약한다(실시예 11을 참조하시오).
도 7은 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32의 리포칼린 뮤테인들의 PEG화된 버전들이 서열번호 13의 변형되지 않은 리포칼린 뮤테인(0.16 nM의 IC50을 나타내었다)과 유사하게, 각각 0.19, 0.53 및 0.37 nM의 IC50으로 hPCSK9에 결합할 수 있음을 입증한다. 비오틴화된 hPCSK9를 가변 농도의 상기 리포칼린 뮤테인과 예비 배양하고 중화되지 않은 hPCSK9를, hPCSK9에 대한 결합에 대해서 상기 리포칼린 뮤테인과 경쟁하는 양성 대조군으로서 사용되는 기준 항체(그의 경쇄를 서열번호 29로 나타내는 반면 그의 중쇄는 서열번호 33으로 나타낸다)로 고정화된 ELISA 플레이트상에서 정량분석하였다. 데이터를 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다.
도 8은 서열번호 22, 서열번호 13 및 서열번호 20의 리포칼린 뮤테인 및 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32의 상기 뮤테인 각각의 PEG화된 변이체가 세포-기재 LDL-R 고갈 분석에서 hPCSK9의 생물 활성을 차단할 수 있음을 입증한다. 상기 시험된 리포칼린 뮤테인 및 서열번호 2의 음성 대조군의 일련의 희석물을 LDL 기아 HepG2 세포상에서 일정한 농도의 hPCSK9와 배양한다. 상기 HepG2 표면상의 LDL-R의 수준을 특이적인 염소 항-hLDL-R 항체(R&D Cat. No. AF2148)를 사용하여 평가하였다. PCSK9-유도된 최대 LDL-R 내면화를 100%로 설정하였다. 리포칼린 뮤테인의 첨가는 PCSK9의 활성을 용량-의존적인 방식으로 차단하였다. 이에 관하여, 서열번호 22, 서열번호 13 및 서열번호 20의 리포칼린 뮤테인에 대한 IC50 값은 각각 76 nM, 103 nM 및 91 nM이었다. 따라서, 상기 PEG화된 리포칼린 뮤테인(각각 서열번호 30 내지 32를 포함하며, 이들 서열번호는 상기 명세의 3개의 리포칼린 뮤테인 변이체의 아미노산 서열을 나타내지만 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자의 서열은 포함하지 않는다)에 대해 측정된 IC50이 이들 각각의 PEG화되지 않은 형태들(각각 서열번호 13, 20 및 22)과 상이하지 않으므로 PEG화는 리포칼린 뮤테인의 차단 능력에 영향을 미치지 않았다. 서열번호 2의 음성 대조군은 PCSK9의 활성에 영향을 미치지 않았다. 요약하면, 상기 리포칼린 뮤테인은 PCSK9의 생물 활성을 억제하였으며 따라서 상기 세포 표면상의 LDL-R을 복원시킨다. 상기 데이터를 S자 용량-반응 모델로 정합시켰다.
도 9는 OmpA 신호 서열(OmpA) 및 인간 눈물 리포칼린 뮤테인에 이어서 스트렙-태그 II를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터 pTLPC26(또한 pTlc26이라 칭함)을 도시한다. 상기 돌연변이된 유전자 카셋트의 클로닝에 사용된 BstXI-제한 부위 및 상기 구조 유전자의 측면에 인접한 제한 부위들이 모두 표지된다. 유전자 발현은 테트라사이클린 프로모터/오퍼레이터(tetp /o)의 조절하에 있다. 전사는 지방단백질 전사 종결자(tlpp)에서 종결된다. 상기 벡터는 복제기원(ori), 섬유상 파지 f1의 유전자간 영역(f1-IG), 암피실린 내성 유전자(amp) 및 테트라사이클린 억제 유전자(tetR)를 추가로 포함한다. pTLPC26의 핵산 서열의 관련 분절은 서열번호 35로서 서열 목록에 제공된다. 상기 분절은 XbaI 제한 부위로 시작하여 HindIII 제한 부위로 끝난다. 상기 영역 밖의 벡터 요소들은 벡터 pASK75와 일치하며, 상기 벡터의 완전한 뉴클레오티드 서열은 독일 특허 공보 DE 44 17 598 A1에 제공되어 있다.
도 10은 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)의 폴리펩티드 서열과 비교하여 몇몇 인간 눈물 리포칼린계 뮤테인의 아미노산 서열들(서열번호 2-28로서 나열됨)의 정렬을 도시한다.
도 11: 도 11A는 실시예 3에 대한 암호화된 아미노산들의 예상 분포를 제공한다. 명확성을 위해서, 1% 미만의 빈도를 갖는 아미노산들은 모두 생략되며; 앰버 정지 코돈(TAG)은 코돈 억제 세균 균주, TG1 F가 파지 디스플레이 과정에 사용되기 때문에 암호화 글루타민으로서 간주된다. 또한, 성숙 라이브러리의 서열분석으로부터 획득된 실험 데이터(도 11B 및 도 11 C)는, 세린의 빈도가 목적하는 경우보다 더 높음(이는 PCR에 의한 올리고 합성 또는 올리고 조립에서의 어느 한쪽으로의 편향을 반영한다)에도 불구하고, 상기 예상 분포와 실험 분포간에 양호한 합치가 존재함을 나타낸다. 상기 발견과 일치하여, 2개 라이브러리에 대한 돌연변이 분포의 실험적으로 획득된 빈도(도 11E 및 도 11F)는 이론적으로 예상되는 분포(도 11D)에 가깝지만, 보다 낮은 빈도쪽으로 이동한다.
도 12는 모세관 나노DSC 장비(Q2000, TA 인스트루먼츠(Instruments))를 사용하여 나노 차동 주사 열량계("나노DSC") 측정으로부터 획득된 온도기록도를 도시하며, 리포칼린 뮤테인들(서열번호 13 및 서열번호 63-65)의 용융 곡선들의 오버레이를 나타낸다. 열-안정화된 유도체들(서열번호 63-65)의 용융 곡선들이 서열번호 13에 비해 현저하게 이동된다.
도 13은 리포칼린 뮤테인들(서열번호 62-71)에 대한 표면 플라스몬 공명에 의한 온-율 및 오프-율의 전형적인 측정을 제공한다. 도 13A 내지 도 13J는 각각 서열번호 62-71에 상응한다. 인간 PCSK9("hPCSK9")(서열번호 34)에 대해 생성되는 해리 상수(KD), 결합율(kon) 및 해리율(koff)을 실시예 17의 표 10에 요약한다.
도 14는 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)의 폴리펩티드 서열과 비교하여 몇몇 인간 눈물 리포칼린계 뮤테인의 아미노산 서열들(서열번호 13, 22, 62-71로서 나열됨)의 정렬을 도시한다.
IV. 명세의 상세한 설명
하나의 태양에서, 본 명세는 프로단백질 전환효소 서브틸리신/켁신 9형 또는 PCSK9에 결합하는 인간 눈물 리포칼린의 뮤테인을 제공한다. 일부 실시태양에서, 상기 리포칼린 뮤테인은 PCSK9에 대해 높은 친화성을 갖는다. 본 명세의 뮤테인의 표적으로서 PCSK9는 전형적으로 포유동물 단백질, 예를 들어 비인간 영장류 단백질 또는 인간 단백질이다. 완전-길이 인간 PCSK9는 서열번호 34에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
본 명세의 리포칼린 뮤테인은 또한 PCSK9의 면역원성 단편에 결합할 수 있다. PCSK9의 면역원성 단편은, 하나 이상의 에피토프, 미모토프 또는 다른 항원 결정인자를 가지며 따라서 면역 반응을 유도하거나 또는 상기 단편에 대한 항체를 발생시킬 수 있는 단편이다. 상기 면역원성 단편은 단일 에피토프를 포함하거나 또는 다수의 에피토프를 가질 수 있다. 항원-제공 시스템, 예를 들어 담체 단백질을 사용하여 면역계에 의한 인식에 필요한 크기를 제공할 수 있으므로, 상기 면역원성 단편에 대해 특정한 크기 제한을 적용하지 않는다. 따라서, 상기 면역원성 단편은 또한 "합텐", 즉 그 자체가 항원성일 필요가 없는 단편이거나 또는 특히 그의 작은 분자량 및 따라서 작은 크기로 인해 낮은 면역원성을 가질 수도 있다. 전형적으로 면역원성 단편은 단독으로 또는 담체상에 제공시 면역글로불린에 의해 결합될 수 있다. PCSK9의 면역원성 단편은 전형적으로 LDL-R과 상호작용할 수 있으며 이에 의해 혈류 중에서 순환하는 저밀도 지방단백질(LDL) 입자를 조절할 수 있다. 일부 실시태양에서, PCSK9의 면역원성 단편은 본 명세에 따른 리포칼린 뮤테인에 의해 인식되고/되거나 결합되는 완전길이 리간드의 능력을 유지한다. 예를 들어, 상기 면역원성 단편은 N-말단 및/또는 C-말단 단축된 단백질 또는 펩티드일 수 있다.
다양한 실시태양에서, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 비-인간 영장류 PCSK9(또는 키노몰구스 원숭이 PCSK9 또는 침팬지 PCSK9)의 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편과 검출 가능한 친화성으로, 즉 적어도 200 nM의 KD로 결합할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 비-인간 영장류 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편과 약 10 nM 이하, 약 1 nM 또는 약 0.3 nM의 KD로 결합할 수 있다. 다양한 실시태양에서, 항원 결합 부분은 마우스 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편과 약 10 nM 이하, 약 1 nM 또는 약 0.5 nM의 KD로 결합한다.
다양한 실시태양에서, 상기 명세의 하나 이상의 리포칼린 뮤테인은 인간 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편과 검출 가능한 친화성, 즉 적어도 200 nM의 KD로 결합할 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 인간 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편과 약 10 nM 이하, 약 1 nM, 약 0.1 nM, 약 0.5 nM, 약 0.25 nM, 약 10 pM 또는 심지어 더 낮은 KD로 결합할 수 있다.
일부 추가의 실시태양에서, 인간 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편에 대한 하나 이상의 리포칼린 뮤테인의 결합 친화성은 0.1 nM 이하의 KD 및 일부 실시태양에서 약 1 피코몰(pM) 이하의 KD를 갖는 것으로 밝혀졌다(도 7을 참조하시오).
선택된 표적, 본 발명의 경우 PCSK9에 대한 리포칼린 뮤테인의 결합 친화성을 측정할 수 있으며, 이때 뮤테인-리간드 복합체의 KD 값을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다수의 방법들에 의해 측정할 수 있다. 상기와 같은 방법은 비제한적으로 형광 적정, 경쟁 ELISA, 열량측정방법, 예를 들어 등온 적정 열량측정(ITC), 및 표면 플라스몬 공명(BIAcore)을 포함한다. 상기와 같은 방법들의 예를 하기에 상세히 개시한다(예를 들어 실시예 7을 참조하시오).
하나의 실시태양에서, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 PCSK9의 길항물질로서 작용할 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "PCSK9의 길항물질"이란 용어는 PCSK9와 LDL-R 간의 결합을 방해할 수 있는 작용제를 지칭한다. 일부의 경우에, PCSK9 길항물질을 PCSK9와 LDL-R 간의 결합을 완전히 또는 부분적으로 억제하는 그의 능력에 의해 확인할 수 있다.
더욱 또한, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 PCSK9에 대한 LDL-R의 결합에 대해서 경쟁적일 수 있다(실시예 7을 참조하시오).
또한, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 PCSK9에 대한 서열번호 29 및 서열번호 33을 포함하는 단클론 항체의 결합에 대해서 경쟁적일 수 있다(실시예 12를 참조하시오).
추가의 실시태양에서, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 LDL-R의 PCSK9-매개된 하향조절을 완전히 또는 부분적으로 억제할 수 있다. 억제는 예를 들어 상기 명세의 리포칼린 뮤테인에 노출 시 LDL-R의 PCSK9-매개된 하향조절이, 상기 리포칼린 뮤테인의 억제하에서 또는 상기 뮤테인의 부재하에서의 LDL-R의 PCSK9-매개된 하향조절에 비해, 적어도 약 10% 미만, 예를 들어 적어도 약 25%, 50%, 75% 미만이거나 또는 완전히 억제되는 경우 발생한다. 일부 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 LDL-R의 PCSK9-매개된 하향조절을 용량-의존적인 방식으로 억제할 수 있다. 일부 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 LDL-R의 PCSK9-매개된 하향조절의 억제는 실시예 13에 필수적으로 개시된 바와 같이 HEPG2-세포-기재 분석에서 입증될 수 있다.
더욱 또 다른 실시태양에서, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 PCSK9의 존재하에서 LDL 흡수를 복원시킬 수 있다. 일부 추가의 실시태양에서, PCSK9 존재하에서의 LDL 흡수의 복원은 실시예 11에 필수적으로 개시된 바와 같이 HEPG2-세포 기재 분석에서 입증될 수 있다. 일부 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 분석을 계획하기 위해서, HEPG2 세포를 고정된 농도의 hPCSK9(예를 들어 100 nM)와 배양시키고 이어서 하나 이상의 리포칼린 뮤테인으로 적정할 수 있다.
PCSK9는 인간 눈물 리포칼린의 비-천연 리간드를 정의하는 것으로 간주될 수 있다. "비-천연 리간드"란 용어는 생리 조건하에서 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 결합하지 않는 화합물을 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같은 "인간 눈물 리포칼린"이란 용어는 SWISS-PROT 데이터 뱅크 수납 번호 P31025의 단백질에 상응하는 성숙한 인간 눈물 리포칼린을 지칭하는 반면, 상기 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)은 SWISS-PROT 수납 번호 P31025의 서열에 포함되는 N-말단 신호 펩티드를 포함하지 않는다.
상기 명세의 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)과 높은 서열 일치성을 갖는다. 이와 관련하여, 상기 명세의 뮤테인의 아미노산 서열은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 아미노산 서열과 실질적으로 유사할 수 있다. 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열과 실질적으로 유사한, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인의 각 서열은 다양한 실시태양에서 상기 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열에 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 82%, 적어도 85%, 적어도 87% 또는 적어도 90%, 적어도 95%의 일치성을 가질 수 있으나(예를 들어 도 10 및 도 14를 참조하시오), 단 변경된 위치 또는 서열은 유지된다.
"일치성"이란 유사성 또는 관계를 측정하는 서열들의 성질을 의미한다. 일치성을, 일치하는 잔기들의 수를 잔기들의 총수로 나누고 생성물에 100을 곱하여 측정한다. 2개의 예시적인 예로서, 서열번호 3의 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 아미노산 서열과 82.28%의 서열 일치성을 갖고, 서열번호 7의 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린과 83.54%의 아미노산 서열 일치성을 갖는다.
"틈"은 아미노산의 첨가 또는 결실의 결과인 정렬 중 공간이다. 따라서, 정확하게 동일한 서열의 2개 사본은 100% 일치성을 갖지만, 그다지 보존되지 않고 결실, 첨가 또는 치환을 갖는 서열은 보다 낮은 정도의 일치성을 가질 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 다수의 컴퓨터 프로그램들, 예를 들어 Blast(문헌[Altschul, et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402]), Blast2(문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410]), 및 스미스-워터맨(Smith-Waterman)(문헌[Smith, et al. (1981) J. Mol. Biol. 147, 195-197])을 표준 매개변수들을 사용하여 서열 일치성을 측정하는데 이용할 수 있다.
상기 명세의 핵산 또는 폴리펩티드에 관하여 "돌연변이된" 또는 "뮤테인"이란 용어는 천연 핵산 또는 폴리펩티드에 비해, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 교환, 결실 또는 삽입을 각각 지칭한다. 본 명세의 뮤테인은 상응하는 고유의 인간 눈물 리포칼린에 비해 적어도 3개의 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린의 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)의 선형 폴리펩티드 서열의 서열 위치 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 및 108 중 어느 하나에서 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 17 또는 18을 포함하여 적어도 2개의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 위치 26-34는 AB 고리 중에 포함되고, 상기 위치 56-58은 CD 고리 중에 포함된다. 상기 위치 80은 α-나선 영역 중에 위치한다. 위치 83은 상기 α-나선 영역과 베타-시트(βF) 사이의 단일 고리-한정 아미노산이다. 상기 위치 104-106 및 108은 눈물 리포칼린의 β-배럴 구조의 개방 단부의 결합 부위 중 GH 고리 중에 포함된다. 이들 영역의 정의는 상기 문헌[Flower, 1996], 상기 문헌[Flower, et al, 2000] 및 상기 문헌[Breustedt et al. (2005)]에 따라 본 발명에 사용된다.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 리포칼린 뮤테인은 61 및/또는 153번 위치의 고유 시스테인 잔기의 세린 잔기에 의한 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 시스테인 잔기 61 및 153에 의해 형성된 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 구조적 다이설파이드 결합(각각의 고유 핵산 라이브러리의 수준에서)의 제거(상기 문헌[Breustedt, et al., 2005]을 참조하시오)는, 안정하게 폴딩될 뿐만 아니라 또한 주어진 비-천연 리간드와 높은 친화성으로 결합할 수 있는 인간 눈물 리포칼린 뮤테인을 제공하는 것으로 밝혀졌음이 주목된다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 구조적 다이설파이드 결합의 제거는, 비-천연 인공 다이설파이드 결합의 (자발적인) 생성 또는 상기 명세의 뮤테인내로의 의도적인 도입(실시예 참조)을 허용하고, 이에 의해 예를 들어 상기 뮤테인의 안정성을 증가시키는 추가의 이점을 제공하는 것으로 또한 여겨진다. 그러나, PCSK9에 결합하고 Cys 61과 Cys 153 사이에 형성된 다이설파이드 결합을 갖는 인간 눈물 리포칼린 뮤테인도 또한 본 명세의 부분이다.
일부 실시태양에서, 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 아미노산 치환 Cys 61 → Ala, Phe, Lys, Arg, Thr, Asn, Tyr, Met, Ser, Pro 또는 Trp 및/또는 Cys 153 → Ser 또는 Ala를 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 101번 위치의 고유 시스테인 잔기의 세린 잔기에 의한 아미노산 치환을 포함한다. 더욱이, 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 111번 위치의 고유 아르기닌 잔기의 프롤린 잔기에 의한 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 114번 위치의 고유 리신 잔기의 트립토판 잔기에 의한 아미노산 치환을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 Arg 111 → Pro 및 Lys 114 → Trp 중에서 선택된 추가의 아미노산 치환일 수 있는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 또 다른 아미노산에 의해 치환되는 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열의 101번 위치에 시스테인을 추가로 포함할 수 있다. 상기 치환은 예를 들어 돌연변이 Cys 101 → Ser 또는 Cys 101 → Pro일 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 하나 이상을 포함한다: Arg 26 → Ser, Phe, Trp, His 또는 Thr, Glu 34 → Asn, Thr, Arg 또는 Gly, Leu 56 → Met, Ser, Gln, Phe, His 또는 Asn 및 Ser 58 → Lys, Ala, Arg, Trp 또는 Pro.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유한다: Met 31 → Ala, Gly, His, Pro, Ser Aps, Glu 또는 Gln, Leu 33 → Tyr, Trp, Tyr, Phe, Pro 또는 Ala, Ser 61 → Trp 또는 Phe, Asp 80 → Ser, Met, Pro, Ile, Gln, Tyr, Ser, Val 또는 Thr, Glu 104 → Leu, Pro, Ser, Ala, Asn, Thr, Lys 또는 Asp, His 106 → Pro, Gln, Gly, Arg, Val, Thr, Asn 또는 Leu 및 Lys 108 → Gln, Ala, Trp, Tyr, Arg, Asp, Asn, Ser, Glu 또는 Thr.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 하나 이상을 포함한다: Glu 27 → Arg, Ser, Gln, Thr, Phe, Lys, Ala 또는 Arg, Pro 29 → Gly, Asp, Asn, Ile, Leu 또는 Met, Asn 32 → Ile, Leu, Tyr, Met 또는 Trp 및 Leu 105 → Cys, Tyr, Trp, Glu, Arg, Ser, His, Ala, Val, Asp, Pro, Gly 또는 Lys.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유한다: Phe 28 → Cys, Arg, Lys, Trp, Asp, Gly, His, Leu 또는 Asn; Glu 30 → Arg, Asp, Thr, Ser, Gly, Ala 또는 Asn, Ile 57 → Tyr, Trp, His, Gln, Thr 또는 Arg, Lys 83 → Arg, Ser, Gln, Thr 또는 Glu.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Arg 26 → Phe; Asn 32 → Ile; Glu 34 → Thr; Leu 56 → Met; Ser 58 → Ala 및 Lys 83 → Ser의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Arg 26 → Trp; Asn 32 → Leu; Glu 34 → Thr; Leu 56 → Ser 및 Ser 58 → Ala의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Arg 26 → His; Asn 32 → Tyr; Glu 34 → Thr; Leu 56 → Ser; Ser 58 → Arg 및 Lys 83 → Gln의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Arg 26 → Phe; Asn 32 → Met; Glu 34 → Thr; Leu 56 → Gln; Ser 58 → Ala 및 Lys 83 → Thr의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Asn 32 → Trp; Glu 34 → Arg; Leu 56 → Asn; Ser 58 → Trp 및 Lys 83 → Ser의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Arg 26 → Phe; Asn 32 → Leu; Glu 34 → Thr; Leu 56 → Phe; Ser 58 → Ala 및 Lys 83 → Arg의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Arg 26 → Thr; Asn 32 → Trp; Glu 34 → Asn; Leu 56 → His; Ser 58 → Pro 및 Lys 83 → Ser의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Asn 32 → Trp; Glu 34 → Asn; Leu 56 → Phe; Ser 58 → Arg 및 Lys 83 → Glu의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Arg 26 → Trp; Asn 32 → Leu; Glu 34 → Thr; Leu 56 → Met; Ser 58 → Ala 및 Lys 83 → Ser의 조합을 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Asn 32 → Trp; Glu 34 → Gly; Leu 56 → Gln; Ser 58 → Ala 및 Lys 83 → Gln의 조합을 포함한다.
일부 실시태양에서, 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 하기의 아미노산 치환 세트들 중 하나를 포함한다:
(1) Glu 27 → Ser; Phe 28 → Arg; Pro 29 → Gly; Glu 30 → Asp; Met 31 → Ala; Leu 33 → Trp; Ile 57 → Tyr; Asp 80 → Met; Glu 104 → Pro; Leu 105 → Tyr; His 106 → Gln; Lys 108 → Ala,
(2) Glu 27 → Gln; Phe 28 → Cys; Pro 29 → Asp; Glu 30 → Thr; Met 31 → Gly; Leu 33 → Trp; Ile 57 → Tyr; Leu 105 → Cys; His 106 → Gly; Lys 108 → Trp,
(3) Glu 27 → Glu; Phe 28 → Trp; Pro 29 → Asn; Glu 30 → Gly; Met 31 → His; Leu 33 → Tyr; Ile 57 → Tyr; Asp 80 → Pro; Glu 104 → Ser; Leu 105 → Trp; His 106 → Pro; Lys 108 → Tyr,
(4) Glu 27 → Thr; Phe 28 → Asp; Pro 29 → Asn; Glu 30 → Ser; Met 31 → Pro; Leu 33 → Phe; Ile 57 → Tyr; Asp 80 → Ile; Glu 104 → Ala; Leu 105 → Glu; His 106 → Arg; Lys 108 → Arg,
(5) Glu 27 → Phe; Phe 28 → Lys; Pro 29 → Ile; Glu 30 → Ala; Met 31 → Ser; Leu 33 → Pro; Ile 57 → Trp; Asp 80 → Gln; Glu 104 → Asn; Leu 105 → Arg; His 106 → Gln; Lys 108 → Asp,
(6) Glu 27 → Lys; Phe 28 → Gly; Pro 29 → Pro; Glu 30 → Thr; Met 31 → Pro; Leu 33 → Trp; Ile 57 → His; Asp 80 → Tyr; Glu 104 → Ala; Leu 105 → Ser; His 106 → Val; Lys 108 → Asn,
(7) Glu 27 → Glu; Phe 28 → His; Pro 29 → Leu; Glu 30 → Ala; Met 31 → Asp; Leu 33 → Ala; Ile 57 → Gln; Asp 80 → Ile; Glu 104 → Ala; Leu 105 → Tyr; His 106 → Pro; Lys 108 → Ser,
(8) Glu 27 → Ala; Phe 28 → Asp; Pro 29 → Met; Glu 30 → Gly; Met 31 → Asp; Leu 33 → Pro; Ile 57 → Thr; Asp 80 → Thr; Glu 104 → Thr; His 106 → Thr; Lys 108 → Arg,
(9) Glu 27 → Arg; Phe 28 → Leu; Pro 29 → Asp; Glu 30 → Asn; Met 31 → Glu; Leu 33 → Trp; Ile 57 → Tyr; Asp 80 → Gln; Glu 104 → Pro; Leu 105 → Arg; His 106 → Asn; Lys 108 → Ala,
(10) Glu 27 → Lys; Phe 28 → Asn; Pro 29 → Met; Glu 30 → Gly; Met 31 → Gln; Leu 33 → Pro; Ile 57 → Arg; Asp 80 → Ile; Glu 104 → Asp; Leu 105 → Arg; His 106 → Leu; Lys 108 → Thr, 또는
(11) Glu 27 → Ser; Phe 28 → Arg; Pro 29 → Gly; Glu 30 → Asp; Met 31 → Ala; Leu 33 → Trp; Ile 57 → Tyr; Asp 80 → Met; Glu 104 → Pro; Leu 105 → Gly; His 106 → Gln; Lys 108 → Ala.
특정 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Arg 26 → Phe; Glu 27 → Ser; Phe 28 → Arg; Pro 29 → Gly; Glu 30 → Asp; Met 31 → Ala; Asn 32 → Ile; Leu 33 → Trp; Glu 34 → Thr; Leu 56 → Met; Ile 57 → Tyr; Ser 58 → Ala; Lys 83 → Ser; Glu 104 → Pro 및 Lys 108 → Thr의 조합을 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 하나 이상을 포함한다: Thr 43 → Ile 또는 Ala, Glu 45 → Gly, Asn 48 → Gly, Glu 63 → Gly, Ala 66 → Vla, Glu 69 → Vla, Lys 70 → Arg, Ala 79 → Thr, Met 또는 Vla, Asp 80 → Met 또는 Ser, Gly 82 → Ser, His 84 → Gln, Vla 85 → Gly, Tyr 87 → Ser, Ile 88 → Thr 또는 Leu, His 92 → Pro, Leu 105 → His, Gly 또는 Tyr 및 His 106 → Gln 또는 Arg.
더욱 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 아미노산 치환: Glu 27 → Phe; Phe 28 → Lys; Pro 29 → Ile; Asn 32 → Trp; Leu 33 → Pro; Glu 34 → Arg; Leu 56 → Asn; Ile 57 → Trp; His 106 → Gln 및 Lys 108 → Glu의 조합을 포함한다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 하나 이상을 포함한다: Glu 43 → Gly 또는 Ala, Glu 45 → Gly, Ser 58 → Trp 또는 Arg, Glu 63 → Asp, Glu 69 → Gly, Lys 70 → Arg, Asp 80 → Gln, Val 또는 Thr, Gly 82 → Asp, Lys 83 → Ser 또는 Arg, Ala 86 → Glu 또는 Ser, Phe 99 → Leu, Glu 102 → Lys 또는 Val, Glu 104 → Asn 또는 Lys 및 Pro 106 → Thr.
일부 추가의 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 79, 92 및 105 중 어느 하나에 하나 이상의 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함한다. 예를 들어, 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 하기의 아미노산 치환들을 포함할 수 있다: Ala 79 → Met, Thr 또는 Val, His 92 → Pro 및/또는 Leu 105 → Ala, Val, Asp, Pro, Arg, Gly, Lys 또는 His.
상기에 정의된 바와 같이, 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)의 선형 폴리펩티드 서열의 26, 27, 28, 30, 31, 33, 34, 57, 61, 80, 83, 104-106 및 108번 위치의 서열 위치에 위치하는 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시태양에서 상기 명세의 뮤테인은 상기 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열 위치 중 2개 이상, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 16개의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 특정한 실시태양에서, 상기 뮤테인은 상기 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 각각의 서열 위치 26, 27, 28, 30, 31, 33, 53, 57, 61, 64, 66, 80, 83, 104-106 및 108에 돌연변이된 아미노산 잔기를 갖는다(예를 들어 도 10 및 도 14를 참조하시오).
일부 실시태양에서, 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 또한 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 아미노산 서열에 관하여, 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 고리 영역내 임의의 위치에 시스테인 잔기에 의한 고유 아미노산 잔기의 하나 이상, 예를 들어 적어도 2, 적어도 3 또는 적어도 4개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 뮤테인은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 아미노산 서열에 관하여 28 또는 105번 위치에 시스테인 잔기에 의한 고유 아미노산의 아미노산 치환을 포함한다.
나머지 영역, 즉 서열 위치 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 및 108과 다른 영역에서, 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 상기 돌연변이된 아미노산 서열 위치 밖의 야생형(천연) 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 또한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 상기 뮤테인의 결합 활성 및 폴딩을 적어도 필수적으로 방해하거나 간섭하지 않는 한 서열 위치/위치들에 상기와 같은 돌연변이를 가질 수 있다. 상기와 같은 돌연변이는 확립된 표준 방법을 사용하여 DNA 수준에서 매우 쉽게 수행될 수 있다. 상기 아미노산 서열의 변경의 예시적인 예는 아미노산 치환뿐만 아니라 삽입 또는 결실이다. 상기와 같은 치환은 보존적일 수 있다, 즉 아미노산 잔기가 크기뿐만 아니라, 특히 극성에 관하여 화학적으로 유사한 성질의 아미노산 잔기로 치환된다. 보존적 치환의 예는 하기 그룹의 일원 중의 치환이다: 1) 알라닌, 세린, 및 쓰레오닌; 2) 아스파트산 및 글루탐산; 3) 아스파라진 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 리신; 5) 아이소류신, 류신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판. 다른 한편으로, 비-보존적 변경을 상기 아미노산 서열에 또한 도입시킬 수 있다. 또한, 단일 아미노산 잔기의 치환 대신에, 이 결실 또는 삽입이 안정한 폴딩된/기능성 뮤테인을 생성시키는 한, 눈물 리포칼린의 1차 구조의 하나 이상의 연속적인 아미노산을 또한 삽입하거나 결실시킬 수 있다(예를 들어 절두된 N- 및 C-말단을 갖는 뮤테인을 생성시키는 실험 섹션을 참조하시오).
상기 아미노산 서열의 상기와 같은 변형은 몇몇 제한 효소들에 대한 절단 부위를 통합시킴으로써 상기 돌연변이된 리포칼린 유전자 또는 그의 부분들의 서브-클로닝을 단순화시키기 위한 단일 아미노산 위치의 지향 돌연변이유발을 포함한다. 또한, 이들 돌연변이를 통합시켜 주어진 표적에 대한 리포칼린 뮤테인의 친화성을 추가로 개선시킬 수 있다. 더욱 또한, 폴딩 안정성, 혈청 안정성, 단백질 내성 또는 수 용해도를 개선시키거나 또는 필요한 경우 응집 성향을 감소시키기 위해 상기 뮤테인의 몇몇 특성을 조절하기 위해서 돌연변이를 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 시스테인 잔기를 다른 아미노산으로 돌연변이시켜 다이설파이드 결합 형성을 방지할 수 있다. 예를 들어 다른 화합물, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 하이드록시에틸 전분(HES), 비오틴, 펩티드 또는 단백질에의 접합을 위해서, 또는 비-천연 다이설파이드 결합의 형성을 위해서 새로운 반응성 그룹을 도입시키기 위해 다른 아미노산 서열 위치를 시스테인으로 고의로 돌연변이시키는 것도 또한 가능하다. 시스테인 잔기를 인간 눈물 리포칼린 뮤테인의 아미노산 서열에 도입시키기 위한 상기와 같은 돌연변이의 예시적인 가능성은 치환 Thr 40 → Cys, Glu 73 → Cys, Arg 90 → Cys, Asp 95 → Cys, 및 Glu 131 → Cys를 포함한다. 예를 들어 각각의 눈물 리포칼린 뮤테인의 혈청 반감기를 증가시키기 위해서, 아미노산 위치 40, 73, 90, 95 및/또는 131 중 어느 하나의 측면에 상기 생성된 티올 모이어티를 사용하여 상기 뮤테인을 PEG화 또는 HES화시킬 수 있다.
본 명세는 또한 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열의 처음 4개의 N-말단 아미노산 잔기(His-His-Leu-Leu; 1-4번 위치) 및/또는 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열의 마지막 2개의 C-말단 아미노산 잔기(157번 위치의 Ser 및 158번 위치의 Asp)가 결실된(도 10 및 도 14를 참조하시오) 상기 정의된 바와 같은 뮤테인을 포함한다. 야생형 서열의 또 다른 가능한 돌연변이는 PCT 공보 WO 2005/019256에 개시된 바와 같은 5 내지 7번 서열 위치의 아미노산 서열(Ala Ser Asp)을 Gly Gly Asp로 변화시키는 것이다.
상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인은 서열번호 3-28, 62-71 및 82에 제시된 아미노산 서열 중 어느 하나 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나 또는 상기로 이루어질 수 있다.
상기 명세의 리포칼린 뮤테인과 관련하여 본 발명에 사용되는 바와 같은 "단편"이란 용어는 N-말단 및/또는 C-말단 단축된, 즉 N-말단 및/또는 C-말단 아미노산 중 적어도 하나가 결여된 완전-길이 성숙 리포칼린으로부터 유래된 단백질 또는 펩티드에 관한 것이다. 상기와 같은 단편은 상기 성숙 리포칼린의 1차 서열 중 적어도 10개 이상, 예를 들어 20 또는 30개 이상의 연속적인 아미노산을 포함할 수 있다.
본 명세에 사용되는 바와 같은 "변이체"란 용어는 예를 들어 치환, 결실, 삽입 또는 화학적 변형에 의한 아미노산 서열의 변형을 포함하는 상기 명세의 리포칼린 뮤테인의 유도체에 관한 것이다. 상기와 같은 변형은 일부 실시태양에서 상기 뮤테인의 기능성을 감소시키지 않는다. 예를 들어, 상기와 같은 변이체를 생성시키기 위해서, 상기 명세의 뮤테인의 하나 이상의 아미노산을 그들 각각의 D-입체이성체에 의해 또는 20개의 천연 아미노산 이외의 아미노산, 예를 들어 오르니틴, 하이드록시프롤린, 시트룰린, 호모세린, 하이드록시리신, 노르발린에 의해 치환시킬 수 있다. 그러나, 상기와 같은 치환은 또한 보존적일 수도 있다, 즉 아미노산 잔기가 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환된다. 보존적 치환의 예는 하기 그룹의 일원 중의 치환이다: 1) 알라닌, 세린, 및 쓰레오닌; 2) 아스파트산 및 글루탐산; 3) 아스파라진 및 글루타민; 4) 아르기닌 및 리신; 5) 아이소류신, 류신, 메티오닌 및 발린; 및 6) 페닐알라닌, 타이로신 및 트립토판.
상기 명세의 리포칼린 뮤테인은 단량체성 단백질로서 존재할 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 명세에 따른 리포칼린 뮤테인은 자발적으로 이량체화되거나 올리고머화될 수 있다. 안정한 단량체를 형성하는 리포칼린 뮤테인의 사용은, 예를 들어 보다 빠른 확산 및 보다 양호한 조직 침투로 인해 일부 용도에서 유리할 수 있다. 다른 실시태양에서 안정한 동종이량체 또는 다량체를 자발적으로 형성하는 리포칼린 뮤테인의 사용은, 상기와 같은 다량체가 주어진 표적에 대한 (추가의) 증가된 친화성 및/또는 결합활성을 제공할 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 더욱 또한, 상기 리포칼린 뮤테인의 올리고머성 형태는 보다 느린 해리율 또는 연장된 혈청 반감기를 가질 수 있다. 안정한 단량체를 형성하는 뮤테인의 이량체화 또는 다량체화를 원하는 경우, 상기는 예를 들어 각각의 올리고머화 도메인, 예를 들어 jun-fos 도메인 또는 류신-지퍼를 상기 명세의 뮤테인에 융합시키거나 또는 "듀오칼린(Duocalin)"(또한 하기를 참조하시오)의 사용에 의해 성취될 수 있다.
본 명세에 따른 눈물 리포칼린 뮤테인을 인간 눈물 리포칼린의 천연 형태의 돌연변이유발에 의해 수득할 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "돌연변이유발"이란 용어는 인간 눈물 리포칼린(Swiss-Prot 데이터 뱅크 기입번호 P31025)의 주어진 서열 위치의 천연 아미노산이 각각의 천연 폴리펩티드 서열 중의 상기 특정 위치에 존재하지 않는 적어도 하나의 아미노산에 의해 치환될 수 있도록 실험 조건을 선택함을 의미한다. "돌연변이유발"이란 용어는 또한 하나 이상의 아미노산의 결실 또는 삽입에 의한 서열 분절 길이의 (추가적인) 변형을 포함한다. 따라서, 예를 들어 선택된 서열 위치의 하나의 아미노산이 3개의 무작위 돌연변이의 신장부에 의해 치환되어, 야생형 단백질의 각 분절의 길이에 비해 2개의 아미노산 잔기가 삽입되는 것은 상기 명세의 범위내에 있다. 상기와 같은 삽입 또는 결실을, 상기 명세에서 돌연변이유발을 가할 수 있는 펩티드 분절들 중 어느 하나에 서로 독립적으로 도입시킬 수 있다. 상기 명세의 하나의 예시적인 실시태양에서, 다수의 돌연변이의 삽입을 선택된 리포칼린 스캐폴드의 고리 AB내에 도입시킬 수 있다(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용되는 PCT 공보 WO 2005/019256을 참조하시오). "무작위 돌연변이유발"이란 용어는 미리 결정된 단일 아미노산(돌연변이)이 일정한 서열 위치에 존재하는 것이 아니라 적어도 2개의 아미노산을 돌연변이유발 중 미리 정해진 서열 위치에 일정한 확률로 통합시킬 수 있음을 의미한다.
인간 눈물 리포칼린의 암호화 서열(문헌[Redl, B. et al. (1992) J. Biol.Chem. 267, 20282-20287])은 본 명세에서 선택된 펩티드 분절의 돌연변이유발을 위한 출발점으로서 사용된다. 상기 인용된 아미노산 위치들의 돌연변이유발을 위해서, 당해 분야의 숙련가는 원하는 대로 위치-선택적 돌연변이유발을 위한 다양한 확립된 표준 방법들을 갖는다. 통상적으로 사용되는 기법은 목적하는 서열 위치에 축퇴성 염기 조성을 갖는 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 사용하는 PCR(폴리머라제 쇄 반응)에 의한 돌연변이의 도입이다. 예를 들어, 코돈 NNK 또는 NNS(여기에서 N은 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민이고; K는 구아닌 또는 티민이고; S는 아데닌 또는 시토신이다)의 사용은 돌연변이유발 중 20개 아미노산 전부 + 앰버 정지 코돈의 통합을 허용하는 반면, 코돈 VVS(여기에서 V는 아데닌, 구아닌 또는 시토신이다)는 가능하게 통합되는 아미노산의 수를 12로 제한하는데, 그 이유는 상기가 아미노산 Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val을 상기 폴리펩티드 서열의 선택된 위치내로 통합되는 것으로부터 제외시키기 때문이며; 코돈 NMS(여기에서 M은 아데닌 또는 시토신이다)의 사용은 예를 들어 선택된 서열 위치에서 가능한 아미노산의 수를 11로 제한하는데, 그 이유는 상기가 아미노산 Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Val이 선택된 서열 위치에서 통합되는 것으로부터 제외시키기 때문이다. 이에 관하여, 정규의 20개 천연 아미노산 이외의 다른 아미노산, 예를 들어 셀레노시스테인 또는 피로리신에 대한 코돈을 또한 뮤테인의 핵산에 통합시킬 수 있음이 주목된다. 또한 문헌[Wang, L., et al. (2001) Science 292, 498-500], 또는 문헌[Wang, L., and Schultz, P.G. (2002) Chem. Comm. 1, 1-11]에 개시된 바와 같이, 다른 통상적이지 않은 아미노산, 예를 들어 o-메틸-L-타이로신 또는 p-아미노페닐알라닌을 삽입하기 위해서 정지 코돈으로서 대개 인식되는 UAG와 같은 "인공" 코돈을 사용하는 것도 가능하다.
예를 들어 이노신, 8-옥소-2'데옥시구아노신 또는 6(2'-데옥시-β-D-리보퓨라노실)-3,4-다이하이드로-8H-피리민도-1,2-옥사진-7-온과 같은 감소된 염기쌍 특이성을 갖는 뉴클레오티드 구성 블록의 사용(문헌[Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603])은 선택된 서열 분절내로의 돌연변이의 도입에 대한 또 다른 선택권이다.
추가의 가능성은 소위 트리플릿-돌연변이유발이다. 상기 방법은 암호화 서열내로의 통합을 위해 상이한 뉴클레오티드 트리플릿의 혼합물을 사용하며, 상기 트리플릿은 각각 하나의 아미노산을 암호화한다(문헌[Virnekas B, et al, (1994) Nucleic Acids Res 22, 5600-5607]).
상기 각 폴리펩티드의 선택된 영역에 돌연변이를 도입시키기 위한 한 가지 가능한 전략은 4개의 올리고뉴클레오티드의 사용을 기본으로 하며, 상기 올리고뉴클레오티드는 각각 돌연변이되는 상응하는 서열 분절들 중 하나로부터 부분적으로 유래된다. 이들 올리고뉴클레오티드를 합성하는 경우, 당해 분야의 숙련가는, 모든 천연 아미노산을 암호화하는 코돈이 무작위로 발생하고, 최종적으로 리포칼린 펩티드 라이브러리를 생성시키도록 돌연변이되는 아미노산 위치에 상응하는 뉴클레오티드 트리플릿의 합성을 위한 핵산 구성 블록들의 혼합물을 사용할 수 있다. 예를 들어, 첫 번째 올리고뉴클레오티드는 그의 서열 중에서(돌연변이되는 위치로부터 떨어져서) 상기 리포칼린 폴리펩티드의 가장 N-말단인 위치에서 돌연변이되는 펩티드 분절에 대한 암호화 가닥에 상응한다. 따라서, 두 번째 올리고뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드 서열을 따르는 두 번째 서열 분절에 대한 비-암호화 가닥에 상응한다. 세 번째 올리고뉴클레오티드는 차례로 상기 상응하는 세 번째 서열 분절에 대한 암호화 가닥에 상응한다. 최종적으로, 네 번째 올리고뉴클레오티드는 상기 네 번째 서열 분절에 대한 비-암호화 가닥에 상응한다. 폴리머라제 쇄 반응은 각각 첫 번째 및 두 번째 올리고뉴클레오티드 및 별도로, 필요한 경우, 각각 세 번째 및 네 번째 올리고뉴클레오티드로 수행될 수 있다.
이들 반응 모두의 증폭 산물들을 다양한 공지된 방법에 의해 상기 첫 번째에서부터 네 번째 서열 분절까지의 서열을 포함하는 단일 핵산에 결합시킬 수 있으며, 여기에서 돌연변이들은 선택된 위치들에서 도입되었다. 이를 위해서, 상기 산물들을 모두 예를 들어 측면에 인접하는 올리고뉴클레오티드뿐만 아니라 하나 이상의 매개자 핵산 분자(상기 분자는 상기 두 번째 및 세 번째 서열 분절 사이에 상기 서열을 제공한다)를 사용하여 신규의 폴리머라제 쇄 반응에 가할 수 있다. 상기 돌연변이유발에 사용되는 올리고뉴클레오티드의 서열내 수 및 배열의 선택에 있어서, 당해 분야의 숙련가는 원하는 대로 다수의 대안을 갖는다.
상기 정의된 핵산 분자를 리포칼린 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 및/또는 벡터의 생략된 5'- 및 3'-서열을 결찰하여 연결시킬 수 있으며 공지된 숙주 유기체 중에 클로닝시킬 수 있다. 다수의 확립된 과정을 결찰 및 클로닝에 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 클로닝 벡터의 서열 중에 또한 존재하는 제한 엔도뉴클레아제에 대한 인식 서열을 합성 올리고뉴클레오티드의 서열내로 조작할 수 있다. 따라서, 각 PCR 산물의 증폭 및 효소 절단 후에 생성되는 단편을 상응하는 인식 서열을 사용하여 쉽게 클로닝시킬 수 있다.
돌연변이유발을 위해 선택된 단백질을 암호화하는 유전자내의 보다 긴 서열 분절들에 또한 공지된 방법을 통해, 예를 들어 증가된 오류율의 조건하에서 폴리머라제 쇄 반응의 사용에 의해, 화학적 돌연변이유발에 의해, 또는 세균성 돌연변이 유발 균주를 사용함으로써 무작위 돌연변이유발을 가할 수 있다. 상기와 같은 방법을 또한 리포칼린 뮤테인의 표적 친화성 또는 특이성의 추가적인 최적화에 사용할 수 있다. 추정상 실험 돌연변이유발의 분절 밖에서 발생하는 돌연변이가 종종 허용되거나 또는 심지어, 예를 들어 리포칼린 뮤테인의 개선된 폴딩 효율 또는 폴딩 안정성에 기여하는 경우 이로운 것으로조차 입증될 수 있다.
상기 명세에 따른 예시적인 방법에서, 인간 눈물 리포칼린을 암호화하는 핵산 분자에 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 및 108 중 하나 이상에서 돌연변이유발을 가한다. 일부 실시태양에서, 상기 핵산 분자에, 상기 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 61, 101, 111, 114 및 153 중 하나 이상에서 돌연변이유발을 추가로 가한다.
상기 명세의 하나의 실시태양에서, 인간 눈물 리포칼린의 뮤테인의 생성 방법은 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 및 108 중 어느 하나의 코돈의 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 또는 17개를 돌연변이시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 56, 57, 58, 80, 83, 104, 105, 106 및 108의 코돈 18개 전부를 돌연변이시킨다.
상기 명세의 추가의 실시태양에서, 상기 명세에 따른 방법은 성숙한 인간 눈물 리포칼린(서열번호 1)의 선형 폴리펩티드 서열 중 61번 및 153번 위치의 시스테인을 암호화하는 코돈 모두의 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서 61번 위치를, 단지 몇 개의 가능한 경우를 언급하자면, 알라닌, 페닐알라닌, 리신, 아르기닌, 쓰레오닌, 아스파라진, 타이로신, 메티오닌, 세린, 프롤린 또는 트립토판 잔기를 암호화하도록 돌연변이시킨다. 153번 위치를 돌연변이시키는 실시태양에서, 세린 또는 알라닌과 같은 아미노산을 153번 위치에 도입시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 바와 같은 상기 명세의 또 다른 실시태양에서, 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 111 및/또는 114를 암호화하는 코돈을, 예를 들어 111번 위치에서 아르기닌 및 114번 위치에서 트립토판을 암호화하도록 돌연변이시킨다.
상기 명세의 방법들의 또 다른 실시태양은, 코돈이 임의의 다른 아미노산을 암호화하도록 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 101번 위치에서 시스테인을 암호화하는 코돈을 돌연변이유발시킴을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 101번 위치를 암호화하는 돌연변이된 코돈은 세린을 암호화한다. 따라서, 일부 실시태양에서 61, 101 및 153번 위치의 시스테인 코돈 중 2개 또는 3개 모두를 또 다른 아미노산의 코돈으로 치환시킨다.
상기 명세의 방법에 따라, 리포칼린 뮤테인을, 인간 눈물 리포칼린을 암호화하는 핵산 분자로부터 출발하여 수득한다. 상기와 같은 핵산 분자에 돌연변이유발을 가하고 상기 분자를 적합한 세균 또는 진핵생물 숙주 유기체에 재조합 DNA 기술에 의해 도입시킨다. 리포칼린 뮤테인의 핵산 라이브러리를 획득하는 것은 항체-유사 성질을 갖는 리포칼린 뮤테인, 즉 주어진 표적에 대해 친화성을 갖는 뮤테인을 생성시키는 것에 대해 당해 분야에 공지된 임의의 적합한 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 상기와 같은 조합적인 방법들의 예는 예를 들어 PCT 공보 WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, 또는 WO 2006/56464에 상세히 개시되어 있다. 이들 특허 출원 각각의 내용은 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 적합한 숙주에서 돌연변이유발이 가해진 핵산 서열의 발현 후에, 주어진 표적에 결합하는 다수의 각 리포칼린 뮤테인에 대한 유전 정보를 갖는 클론들을 상기 획득된 라이브러리로부터 선택할 수 있다. 이들 클론의 선별에 대해 널리 공지된 기법들, 예를 들어 파지 디스플레이(상기 문헌[Kay, B.K. et al. (1996)]; 상기 문헌[Lowman, H.B. (1997)] 또는 상기 문헌[Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999)]에 재고찰되어 있다), 콜로니 선별(문헌[Pini, A. et al. (2002) Comb. Chem. High Throughput Screen. 5, 503-510]에 재고찰되어 있다), 리보솜 디스플레이(문헌[Amstutz, P. et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12, 400-405]에 재고찰되어 있다) 또는 문헌[Wilson, D.S. et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755]에 보고된 바와 같은 mRNA 디스플레이 또는 WO 99/16873, WO 00/75308, WO 03/029471, WO 03/029462, WO 03/029463, WO 2005/019254, WO 2005/019255, WO 2005/019256, 또는 WO 2006/56464에 구체적으로 개시된 방법들을 사용할 수 있다.
상기 명세의 하나 이상의 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 상기 생성된 핵산 분자들을 임의의 적합한 발현 시스템을 사용하여 발현시킬 수 있다. 상기 수득된 리포칼린 뮤테인 또는 리포칼린 뮤테인들을 추가로 선택할 수 있다. 상기 선택을 예를 들어 경쟁 조건하에서 수행할 수 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 경쟁 조건이란 리포칼린 뮤테인의 선별이 상기 리포칼린 뮤테인 및 야생형 리포칼린의 주어진 비-천연 리간드를 추가적인 리간드(상기 뮤테인의 상기와 같은 비-천연 리간드에의 결합과 경쟁하는)의 존재하에서 접촉되게 하는 적어도 하나의 단계를 포함함을 의미한다. 이러한 추가적인 리간드는 상기 표적의 생리학적 리간드, 과잉의 상기 표적 자체, 또는 상기 명세의 뮤테인에 의해 인식되는 에피토프에 적어도 겹치는 에피토프와 결합하고 따라서 상기 뮤테인의 표적 결합을 방해하는 상기 표적의 임의의 다른 비-생리학적 리간드일 수 있다. 한편으로, 상기 추가적인 리간드는 알로스테릭 효과에 의해 상기 뮤테인의 결합 부위와 별개의 에피토프를 상기 표적에 착화시킴으로써 상기 뮤테인의 결합과 경쟁한다.
용원성 M13 파지를 사용하는 파지 디스플레이 기법(상기 문헌[Kay, B.K. et al.(1996)]; 상기 문헌[Lowman, H. B. (1997)] 또는 상기 문헌[Rodi, D.J., & Makowski, L. (1999)]에 재고찰되어 있다)의 실시태양이 본 명세에 사용될 수 있는 선택 방법의 일례로서 제공된다. 상기 명세의 뮤테인의 선별에 사용될 수 있는 파지 디스플레이 기술의 또 다른 실시태양은 문헌[Broders et al. (2003) "Hyperphage. Improving antibody presentation in phage display." Methods Mol. Biol. 205:295-302]에 개시된 바와 같은 하이퍼파지(hyperphage) 파지 기술이다. f1과 같은 다른 용원성 파지 또는 T7과 같은 세포용해 파지를 또한 사용할 수 있다. 예시적인 선택 방법을 위해서, N-말단에서 신호 서열, 예를 들어 OmpA-신호 서열, 및 C-말단에서 파지 캡시드에 통합될 수 있는 파지 M13 또는 그의 단편의 캡시드 단백질 pIII과의 융합물로서 돌연변이된 리포칼린 핵산 서열의 발현을 허용하는 M13 파지미드를 생성시킨다. 야생형 서열의 아미노산 217 내지 406을 포함하는 파지 캡시드 단백질의 C-말단 단편 ΔpIII을 사용하여 상기 융합 단백질을 생성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서 pIII의 C-말단 단편이 사용되며, 여기에서 201번 위치의 시스테인 잔기가 생략되거나 또는 또 다른 아미노산에 의해 치환된다.
따라서, 상기 명세의 방법의 추가의 실시태양은 주어진 리간드의 결합을 위해서 적어도 하나의 뮤테인을 선택하기 위해, 하나 이상의 리포칼린 뮤테인을 암호화하고 3' 단부에서 돌연변이유발로부터 생성되는 핵산 분자를, 상기 M13-과의 섬유상 박테리오파지의 외피 단백질 pIII 또는 상기 외피 단백질의 단편을 암호화하는 유전자와 작동적으로 융합시킴을 포함한다.
상기 융합 단백질은 상기 융합 단백질 또는 그의 부분들의 고정화, 검출 및/또는 정제를 허용하는 추가적인 성분들, 예를 들어 친화성 태그를 포함할 수 있다. 더욱 또한, 상기 리포칼린 또는 그의 뮤테인을 암호화하는 서열 영역과 상기 파지 캡시드 유전자 또는 그의 단편 사이에 정지 코돈을 배치시킬 수 있으며, 여기에서 상기 정지 코돈, 예를 들어 앰버 정지 코돈은 적합한 억제 균주에서 번역 중에 아미노산으로 적어도 부분적으로 번역된다.
예를 들어, 파스미드 벡터 pTLPC27(예를 들어 PCT 공보 WO 2008/015239의 도 20 및 서열번호 9를 참조하시오)(또한 pTlc27이라 칭함)을 인간 눈물 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 파지미드 라이브러리의 제조에 사용할 수 있다. 상기 눈물 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 본 발명의 핵산 분자를 2개의 BstXI 제한 부위를 사용하여 상기 벡터에 삽입할 수 있다. 결찰 후 적합한 숙주 균주, 예를 들어 이 콜라이 XL1-Blue를 생성되는 핵산 혼합물로 형질전환시켜 다수의 독립적인 클론을 제공한다. 경우에 따라 하이퍼파지미드 라이브러리의 제조를 위해 각각의 벡터를 생성시킬 수 있다.
상기 생성되는 라이브러리를 기능성 파지미드를 생성시키기 위해서 후속으로 액체 배지 중에서 적합한 M13-헬퍼 파지 또는 하이퍼파지로 초감염(superinfected)시킨다. 상기 재조합 파지미드는 상기 외피 단백질 pIII 또는 그의 단편과의 융합물로서 그의 표면상에 리포칼린 뮤테인을 나타내는 반면, 상기 융합 단백질의 N-말단 신호 서열은 통상적으로 절단된다. 다른 한편으로, 상기는 또한 상기 헬퍼 파지에 의해 공급되는 고유 캡시드 단백질 pIII의 하나 이상의 사본을 가지며 따라서 수용자, 일반적으로 F- 또는 F'-플라스미드를 갖는 세균 균주를 감염시킬 수 있다. 하이퍼파지 디스플레이의 경우에, 상기 하이퍼파지미드는 그의 표면상에, 상기 감염성 외피 단백질 pIII을 갖지만 고유의 캡시드 단백질은 없는 융합물로서 상기 리포칼린 뮤테인을 나타낸다. 헬퍼 파지 또는 하이퍼파지에 의한 감염 중에 또는 상기 감염 후에, 상기 리포칼린 뮤테인과 상기 캡시드 단백질 pIII 간의 융합 단백질의 유전자 발현을, 예를 들어 무수테트라사이클린의 첨가에 의해 유도할 수 있다. 상기 유도 조건은 상기 수득된 파지미드의 실질적인 분획이 그의 표면상에 적어도 하나의 리포칼린 뮤테인을 나타내도록 선택된다. 하이퍼파지 디스플레이의 경우에 유도 조건은 상기 리포칼린 뮤테인 및 캡시드 단백질 pIII로 이루어지는 3 내지 5개의 융합 단백질을 갖는 하이퍼파지미드의 집단을 생성시킨다. 상기 파지미드를 단리하기 위한 다양한 방법들, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜에 의한 침전이 공지되어 있다. 단리는 전형적으로 6 내지 8시간의 배양 기간 후에 발생한다.
이어서 상기 단리된 파스미드에 대해 목적하는 표적과의 배양에 의해 선택이 수행될 수 있으며, 여기에서 상기 표적은 외피 중에 융합 단백질로서 목적하는 결합 활성을 갖는 뮤테인을 갖는 상기 파지미드의 적어도 일시적인 고정화를 허용하는 형태로 존재한다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다양한 실시태양들 중에서, 상기 표적을 예를 들어 담체 단백질, 예를 들어 혈청 알부민과 접합시키고 상기 담체 단백질을 통해 단백질 결합 표면, 예를 들어 폴리스티렌에 결합시킬 수 있다. ELISA 기법에 적합한 미세적정 플레이트 또는 소위 "면역-스틱"을 예를 들어 상기와 같은 표적의 고정화에 사용할 수 있다. 한편으로, 상기 표적과 다른 결합 그룹, 예를 들어 비오틴과의 접합체를 사용할 수 있다. 이어서 상기 표적을 상기 그룹과 선택적으로 결합하는 표면, 예를 들어 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘 또는 아비딘으로 코팅된 전자기 입자 또는 미세적정 플레이트상에 고정화시킬 수 있다. 상기 표적을 면역글로불린의 Fc 부분에 융합시키는 경우, 고정화를 또한 표면, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G로 코팅된 미세적정 플레이트 또는 전자기 입자로 성취할 수 있다.
상기 표면상에 존재하는 불특정 파지미드-결합 부위들을 ELISA 방법에 대해 공지된 바와 같이 차단 용액으로 포화시킬 수 있다. 이어서 상기 파지미드를 전형적으로는 생리학적 완충제의 존재하에서 상기 표면상에 고정화된 표적과 접촉되게 한다. 결합되지 않은 파지미드를 수회의 세척에 의해 제거한다. 이어서 상기 표면상에 남아있는 파지미드 입자를 용리시킨다. 용리를 위해서, 여러가지 방법들이 가능하다. 예를 들어, 상기 파지미드는 프로테아제의 첨가에 의해서 또는 산, 염기, 세제 또는 카오트로픽염의 존재하에서 또는 보통의 변성 조건하에서 용리될 수 있다. 하나의 상기와 같은 방법은 pH 2.2의 완충제를 사용하는 용리이며, 여기에서 용리물을 후속으로 중화시킨다. 한편으로, 상기 파지미드에의 결합에 대해 상기 고정화된 표적과 경쟁하기 위해서 유리 표적의 용액을 가하거나 또는 표적-특이적인 파지미드를, 관심 표적과 특이적으로 결합하는 면역글로불린 또는 천연 리간드화 단백질과의 경쟁에 의해 용리시킬 수 있다.
그 후에, 이 콜라이 세포를 상기 용리된 파지미드로 감염시킨다. 한편으로, 상기 핵산 서열을 상기 용리된 파지미드로부터 추출하고 또 다른 방식으로 서열 분석, 증폭 또는 세포의 형질전환에 사용할 수 있다. 상기 방식으로 수득된 이 콜라이 클론으로부터 출발하여, 신선한 파지미드 또는 하이퍼파지미드를 다시 상술한 방법에 따라 M13 헬퍼 파지 또는 하이퍼파지에 의한 초감염에 의해 생성시키며 이러한 방식으로 증폭된 파지미드에 다시 한번 상기 고정화된 표적상에서의 선별을 수행하였다. 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 갖는 파지미드를 최적화된 형태로 수득하기 위해서 종종 다수의 선택 주기들이 필요하다. 상기 선택 주기의 수는 일부 실시태양에서 후속의 기능 분석시 상기 연구된 클론의 적어도 0.1%가 주어진 표적에 대해 검출 가능한 친화성을 갖는 뮤테인을 생성시키도록 하는 방식으로 선택된다. 상기 사용되는 라이브러리의 크기, 즉 복잡성에 따라, 2 내지 8회의 주기가 상기 목적에 전형적으로 요구된다.
상기 선별된 뮤테인의 기능 분석을 위해서, 이 콜라이 균주를 상기 선택 주기로부터 획득된 파스미드로 감염시키고 상응하는 이중 가닥 플라스미드 DNA를 단리시킨다. 상기 파지미드 DNA, 또는 또한 상기 파지미드로부터 추출된 단일-가닥 DNA로부터 출발하여, 상기 명세의 선택된 뮤테인의 핵산 서열을 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정할 수 있으며 이로부터 상기 아미노산 서열을 추론할 수 있다. 전체 리포칼린 뮤테인의 돌연변이된 영역 또는 서열을 또 다른 발현 벡터상에 서브클로닝하고 적합한 숙주 유기체에서 발현시킬 수 있다. 예를 들어 벡터 pTLPC26(도 9의 설명에서 지칭된 바와 같다)(또한 pTlc26이라 지칭됨)을 이 콜라이 TG1과 같은 이 콜라이 균주에서의 발현에 사용할 수 있다. 상기와 같이 생성된 리포칼린 뮤테인을 다양한 생화학적 방법에 의해 정제할 수 있다. 예를 들어 pTlc26에 의해 생성된 리포칼린 뮤테인은, 예를 들어 그의 C-말단에 친화성 펩티드, 소위 친화성 태그를 가질 수 있으며 따라서 상기를 친화성 크로마토그래피에 의해 정제시킬 수 있다. 친화성 태그의 예는 비제한적으로 스트렙-태그, 스트렙-태그 II(상기 문헌[Schmidt et al.]), 올리고히스티딘, 폴리히스티딘, 면역글로불린 도메인, 말토스-결합 단백질, 글루타치온-S-스랜스퍼라제(GST) 또는 칼모듈린 결합 펩티드(CBP)를 포함한다.
일부 친화성 태그는 합텐, 예를 들어 비제한적으로 다이니트로페놀 및 디곡시제닌이다. 일부 친화성 태그는 에피토프 태그, 예를 들어 플래그(FLAG)(등록상표)-펩티드(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-Gly), T7 에피토프(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly), 말토스 결합 단백질(MBP), 헤르페스 단순 바이러스 당단백질 D의 서열 Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp의 HSV 에피토프, 서열 Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala의 헤마글루티닌(HA) 에피토프, 수포성 구내염 바이러스 당단백질(Cys-Tyr-The-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Lys)의 VSV-G 에피토프, 서열 Gly-Ala-Pro-Val-Pro-Tyr-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg의 E 에피토프 태그, 서열 Gly-Val-Ser-Ser-Thr-Ser-Ser-Asp-Phe-Arg-Asp-Arg의 E2 에피토프 태그, 서열 Glu-Glu-Thr-Ala-Arg-Phe-Gln-Pro-Gly-Tyr-Arg-Ser의 포유동물 MAPK/ERK 키나제의 C-말단의 Tag-100 에피토프 태그, 서열 Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser의 S-태그, 서열 Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu의 전사 인자 c-myc의 "myc" 에피토프 및 유인원 바이러스 5(Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)의 파라믹소바이러스의 P 및 V 단백질상에 존재하는 작은 V5 에피토프이다. 또한, 그러나 일반적으로 단일 태그로서가 아닌, 용해도-향상 태그, 예를 들어 NusA, 티오레독신(TRX), 작은 유비퀴틴-유사 변경자(SUMO), 및 유비퀴틴(Ub)을 사용할 수도 있다. 합텐 및 에피토프 태그를 결합짝으로서 상응하는 항체 또는 항체 유사 단백질성 분자와 함께 사용할 수 있다. 서열 Lys-Glu-Thr-Ala-Ala-Ala-Lys-Phe-Glu-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser의 S-펩티드 에피토프를 각 항체와 관련하여 에피토프 태그로서 또는 결합짝으로서 S-단백질과 함께 사용할 수 있다(문헌[Hackbarth, JS, et al., BioTechniques (2004) 37, 5, 835-839]).
상기 선택을 또한 다른 방법에 의해 수행할 수 있다. 다수의 상응하는 실시태양들은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있거나 문헌에 개시되어 있다. 더욱이, 방법들의 조합을 적용할 수 있다. 예를 들어 "파지 디스플레이"에 의해 선택되거나 또는 적어도 농축된 클론들에 "콜로니 선별"을 추가로 가할 수 있다. 상기 과정은 개별적인 클론을 표적에 대한 검출 가능한 결합 친화성으로 리포칼린 뮤테인의 생성에 관하여 직접 단리할 수 있다는 이점을 갖는다.
"파지 디스플레이" 기법 또는 "콜로니 선별" 방법에서 숙주 유기체로서 이 콜라이의 사용 외에, 다른 세균 균주들인 효모 또는 또한 곤충 세포 또는 포유동물 세포를 상기 목적에 사용할 수 있다. 상술한 바와 같은 무작위 라이브러리로부터의 리포칼린 뮤테인의 선별에 더하여, 제한된 돌연변이유발을 포함한 진화 방법을 또한, 반복된 선별 주기 후의 표적에 대한 친화성 또는 특이성에 관하여 상기 표적에 대한 일부 결합 활성을 이미 갖는 뮤테인을 최적화하기 위해서 적용할 수 있다.
복합체 형성이 결합짝의 농도, 경쟁자의 존재, 완충 시스템의 이온 강도 등과 같은 다수의 인자들에 의존함은 숙련가에게 쉽게 자명하다. 선택 및 농축을 일반적으로는, 목적하는 표적과의 복합체 중에서 적어도 200 nM의 해리 상수를 갖는 리포칼린 뮤테인의 단리를 허용하는 조건하에서 수행한다. 그러나, 세척 및 용리 단계는 다양한 엄격성하에서 수행될 수 있다. 동역학적 특성에 관한 선택이 또한 가능하다. 예를 들어, 상기 선택을, 표적과 상기 표적으로부터 느린 해리, 즉 낮은 koff율을 나타내는 뮤테인과의 복합체 형성에 유리한 조건하에서 수행할 수 있다. 한편으로, 선택을 상기 뮤테인과 상기 표적간의 복합체의 빠른 형성, 즉 높은 kon율에 유리한 조건하에서 수행할 수 있다. 추가의 예시적인 대안으로서, 선별을 상기 뮤테인의 개선된 열-안정성(미리 선택된 표적에 대해 이미 친화성을 갖는 야생형 리포칼린 또는 뮤테인에 비해)을 선택하는 조건하에서 수행할 수 있다.
일단 주어진 표적에 대해 친화성을 갖는 리포칼린 뮤테인이 선택되었으면, 훨씬 더 높은 친화성을 갖는 변이체 또는 개선된 성질, 예를 들어 보다 높은 열-안정성, 개선된 혈청 안정성, 열역학적 안정성, 개선된 용해도, 개선된 단량체성 반응양상, 열변성에 대한 개선된 내성, 화학적 변성, 단백질분해, 또는 세제 등을 갖는 변이체를 후속으로 선택하기 위해서 상기와 같은 뮤테인에 또 다른 돌연변이유발을 가하는 것도 추가로 가능하다. 이러한 추가적인 돌연변이유발(보다 높은 친화성을 목적으로 하는 경우에 시험관내 "친화성 성숙화"로서 간주될 수 있다)을 합리적인 설계 또는 무작위 돌연변이에 근거한 부위 특이적 돌연변이에 의해 성취할 수 있다. 보다 높은 친화성 또는 개선된 성질을 획득하기 위한 또 다른 가능한 접근법은 실수유발 PCR의 사용으로, 이는 상기 리포칼린 뮤테인의 선택된 범위의 서열 위치에 걸쳐 점 돌연변이를 생성시킨다. 상기 실수유발 PCR을 문헌[Zaccolo et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 589-603]에 개시된 바와 같은 임의의 공지된 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 상기와 같은 목적에 적합한 다른 무작위 돌연변이유발 방법은 문헌[Murakami, H et al. (2002) Nat.Biotechnol. 20, 76-81]에 개시된 바와 같은 무작위 삽입/결실(RID) 돌연변이유발 또는 문헌[Bittker, J. A et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20,1024-1029]에 개시된 바와 같은 비상동적 무작위 재조합(NRR)을 포함한다. 경우에 따라, 친화성 성숙화를 또한 WO 00/75308 또는 문헌[Schlehuber, S. et al. (2000) J. Mol. Biol. 297, 1105-1120]에 개시된 과정에 따라 수행할 수 있으며, 이때 디곡시제닌에 대해 높은 친화성을 갖는 빌린-결합 단백질의 뮤테인이 수득되었다.
상기에 관하여, 상기 친화성의 KD 값(각 뮤테인과 그의 리간드 간에 형성된 복합체의 해리 상수)이 주어진 리간드에 대한 특정 리포칼린 뮤테인의 친화성을 측정하는데 사용되는 방법 및 실험 설비에 따라, 일정한 실험 범위내에서 변할 수 있음은 숙련가에게 명백하다. 이는, 상기 측정된 KD 값 또는 허용성 범위에 있어서, 예를 들어 상기 KD 값이 표면 플라스몬 공정(바이아코어(Biacore))에 의해서 측정되었는지 또는 경쟁 ELISA에 의해 측정되었는지에 따라 약간의 편차가 존재할 수 있음을 의미한다.
각각의 뮤테인이 그의 잠재적인 면역원성에 관하여 변경되거나 변형된 상기 뮤테인의 형태들이 본 명세의 범위내에 또한 포함된다.
세포독성 T-세포는 I 등급 주 조직적합성 복합체(MHC) 분자와 함께 항원-제공 세포의 세포 표면상의 펩티드 항원을 인식한다. MHC 분자에 결합하는 상기 펩티드의 능력은 대립유전자 특이적이며 그의 면역원성과 상관된다. 주어진 단백질의 면역원성을 감소시키기 위해서, 단백질 중의 어느 펩티드가 주어진 MHC 분자에 결합하는 능력을 갖는지를 예견하는 능력은 큰 가치를 갖는다. 잠재적인 T-세포 에피토프를 확인하기 위한 컴퓨터 스레딩(threading) 접근법을 사용하는 접근법이 MHC I 등급 분자에 대한 주어진 펩티드 서열의 결합을 예견하기 위해 앞서 개시되었다(문헌[Altuvia et al. (1995) J. Mol. Biol. 249, 244-250]).
상기와 같은 접근법을 또한 상기 명세의 뮤테인 중 잠재적인 T-세포 에피토프를 확인하고 그의 의도된 용도에 따라 그의 예견된 면역원성을 근거로 특정한 뮤테인을 선별하기 위해서 사용할 수 있다. 더욱 또한 T-세포 에피토프를 함유하는 것으로 예견된 펩티드 영역에, 상기 T-세포 에피토프를 감소시키거나 제거하고 따라서 면역원성을 최소화시키는 추가적인 돌연변이유발을 수행하는 것도 가능할 수 있다. 유전 공학 항체로부터 양친성 에피토프를 제거하는 것이 개시되었으며(문헌[Mateo et al. (2000) Hybridoma 19, 6, 463-471]) 이는 본 명세의 뮤테인에 적합할 수 있다.
상기와 같이 수득된 뮤테인은 최소화된 면역원성을 가질 수 있으며, 이는 치료 및 진단 용도, 예를 들어 하기에 개시되는 용도들에 사용하기에 바람직하다.
본 발명에 개시된 리포칼린 뮤테인의 다수의 용도를 위해서, 본 발명의 리포칼린 뮤테인을 예를 들어 그의 N-말단 또는 C-말단에서, 단백질, 단백질 도메인 또는 펩티드, 예를 들어 신호 서열 및/또는 친화성 태그일 수 있는 모이어티에 융합시킬 수 있다.
친화성 태그, 예를 들어 스트렙-태그(등록상표) 또는 스트렙-태그(등록상표) II(문헌[Schmidt, T.G.M. et al. (1996) J. Mol. Biol. 255, 753-766]), myc-태그, FLAG-태그, His6-태그 또는 HA-태그 또는 단백질, 예를 들어 글루타치온-S-트랜스퍼라제가 또한 용이한 검출 및/또는 재조합 단백질의 정제를 허용하며 이들은 적합한 융합 짝의 추가적인 예들이다. 최종적으로, 색원성 또는 형광 성질을 갖는 단백질, 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) 또는 황색 형광 단백질(YFP)이 또한 상기 명세의 리포칼린 뮤테인에 적합한 융합 짝이다. 예를 들어, 하기 실시예들에 개시된 실험들에 사용시 본 발명에 개시된 리포칼린 뮤테인은 10개의 아미노산(SAWSHPQFEK)으로 이루어지는 C-말단 스트렙-태그(등록상표) II 정제 태그(IBA GmbH)를 갖는다.
일부 용도를 위해서, 상기 명세의 뮤테인들을 표지된 형태로 사용하는 것이 또한 유용할 수 있다. 따라서, 상기 명세는 또한 효소 표지, 방사성 표지, 착색된 표지, 형광 표지, 색원성 표지, 발광 표지, 합텐, 디곡시제닌, 비오틴, 금속 착체, 금속 및 콜로이드성 금으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 표지 부분에 접합된 리포칼린 뮤테인에 관한 것이다. 상기 뮤테인을 또한 저분자량 유기 화합물에 접합시킬 수도 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "저분자량 유기 화합물"이란 용어는 지방족, 지환족 및/또는 방향족 모이어티들을 가질 수 있는 단량체성 탄소-계 화합물을 나타낸다. 전형적인 실시태양에서 상기 저분자량 유기 화합물은 적어도 2개의 탄소 원자, 및 일부 실시태양에서 7 또는 12 이하의 회전성 탄소 결합을 갖는 주쇄를 갖는 유기 화합물이다. 상기와 같은 화합물은 약 100 내지 약 200 달톤, 예를 들어 약 100 내지 약 1000 달톤 범위의 분자량을 갖는다. 상기는 하나 또는 2개의 금속 원자를 임의로 포함할 수도 있다.
일반적으로, 화학적, 물리적, 광학적 또는 효소 반응에서 검출 가능한 화합물 또는 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성시키는 임의의 적합한 화학 물질 또는 효소로 상기 리포칼린 뮤테인을 표지할 수 있다. 물리적 반응 및 동시에 광학적 반응/마커의 일례는 조사시 형광의 방출 또는 방사성 표지 사용시 X-선의 방출이다. 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제 및 β-갈락토시다제는 색원성 반응 산물의 형성을 촉매화하는 효소 표지(및 동시에 광학 표지)의 예들이다. 일반적으로, 항체에 통상적으로 사용되는 모든 표지(오직 면역글로불린의 Fc 부분 중의 당 모이어티와 사용되는 것들은 제외한다)를 또한 본 명세의 뮤테인에의 접합에 사용할 수 있다. 상기 명세의 뮤테인을 또한 임의의 적합한 치료 활성제와, 예를 들어 주어진 세포, 조직 또는 기관에의 상기와 같은 작용제의 표적화된 전달을 위해서 또는 주변 정상 세포에는 영향을 미치지 않으면서 세포, 예를 들어 종양 세포의 선택적인 표적화를 위해서 접합시킬 수 있다. 상기와 같은 치료 활성제의 예는 방사성핵종, 독소, 유기 소분자, 및 치료학적 펩티드(예를 들어 주어진 세포 표적상의 단백질 결합 부위에 대해서 경쟁하는 세포 표면 수용체 또는 펩티드의 작용물질/길항물질로서 작용하는 펩티드)를 포함한다. 그러나, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 또한 치료학적으로 활성인 핵산 분자, 예를 들어 안티센스 핵산 분자, 작은 간접 RNA, 미세 RNA 또는 리보자임과 접합시킬 수도 있다. 상기와 같은 접합체는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 명세의 뮤테인을 또한 피험자의 목적하는 신체 영역, 유기체, 조직, 기관 또는 세포에 상기 명세의 발명 뮤테인을 전달하기 위해서 상기와 같은 피험자내의 특정한 신체 영역, 유기체, 조직, 기관 또는 세포를 표적화할 수 있는 모이어티에 결합시킬 수 있다. 상기와 같은 변형이 바람직할 수 있는 일례는 혈액-뇌-장벽의 횡단이다. 상기 혈액-뇌-장벽을 횡단하기 위해서, 상기 명세의 뮤테인을, 상기 장벽을 횡단하는 능동 수송을 촉진하는 부분에 결합시킬 수 있다(문헌[Gaillard PJ, et al., Diphtheria-toxin receptor-targeted brain drug delivery. International Congress Series, 2005 1277, 185-198] 또는 문헌[Gaillard PJ, et al. Targeted delivery across the blood-brain barrier. Expert Opin Drug Deliv. 2005 2, 299-309]을 참조하시오). 상기와 같은 부분을 예를 들어 상표명 2B-트랜스(Trans)(상표)(to-BBB 테크놀로지스 BV, 네덜란드 라이덴 소재)하에서 입수할 수 있다.
상기에 나타낸 바와 같이, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 일부 실시태양에서 상기 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시킬 수 있는 모이어티에 접합시킬 수 있다(상기에 관하여 또한, 상기와 같은 접합 전략이 CTLA-4에 대한 결합 친화성을 갖는 인간 호중구 젤라티나제-결합된 리포칼린의 뮤테인과 관련하여 개시되어 있는 PCT 공보 WO 2006/56464를 참조하시오). 본 명세서에 사용시, "접합체" 또는 "접합"이란 용어는 하나의 모이어티를 화학적 작용제, 예를 들어 가교결합제 또는 하나의 모이어티를 아미노산의 측 그룹에 결합시키는 작용제 등에 의해 리포칼린 뮤테인에 연결시킴을 포함한다. 또한, 상기 용어는 본 발명에 사용시, 하나의 모이어티를 예를 들어 리포칼린 뮤테인에 상기 반감기를 연장시키는 모이어티를 번역에 의해 융합시켜 공유 결합을 형성시킴으로써 어느 한 말단 단부에서 리포칼린 뮤테인에 유전학적으로 융합시킴을 포함하는 것으로 이해된다. 숙련가는 화학적 작용제가 접합에 사용되는지 또는 번역 융합이 유전 공학에 의해 성취됨을 의미하는 것인지를 상기 용어가 사용되는 상황으로부터 이해할 것이다. 상기 혈청 반감기를 연장시키는 모이어티는, 단지 몇 가지를 말하자면, 폴리알킬렌 글리콜 분자, 하이드록시에틸 전분, 지방산 분자, 예를 들어 팔미트산(문헌[Vajo & Duckworth (2000) Pharmacol. Rev. 52, 1-9]), 면역글로불린의 Fc 부분, 면역글로불린의 CH3 도메인, 면역글로불린의 CH4 도메인, 알부민 또는 그의 단편, 알부민 결합 펩티드, 또는 알부민 결합 단백질, 트랜스페린일 수 있다. 상기 알부민 결합 단백질은 세균성 알부민 결합 단백질, 알부민 결합 펩티드, 조작된 알부민 결합 폴리펩티드, 항체, 도메인 항체를 포함하는 항체 단편(예를 들어 미국특허 제 6,696,245 호를 참조하시오), 또는 알부민에 대한 결합 활성을 갖는 리포칼린 뮤테인일 수 있다. 상응하게, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인의 반감기를 연장시키기에 적합한 접합짝은 알부민(문헌[Osborn, B.L. et al. (2002) J. Pharmacol. Exp. Ther. 303, 540-548]), 또는 알부민 결합 단백질, 예를 들어 세균성 알부민 결합 도메인, 예를 들어 스트렙토코커스 단백질 G의 상기 도메인(문헌[Konig, T., & Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83])을 포함한다. 접합짝으로서 사용될 수 있는 알부민 결합 펩티드의 예는 예를 들어 미국특허 출원 2003/0069395 또는 문헌[Dennis, M. S., Zhang, M., Meng, Y. G., Kadkhodayan, M., Kirchhofer, D., Combs, D. & Damico, L. A. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043]에 개시된 바와 같은 Cys-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Cys 공통서열을 갖는 것들(여기에서 Xaa1은 Asp, Asn, Ser, Thr, 또는 Trp이고; Xaa2는 Asn, Gln, His, Ile, Leu, 또는 Lys이고; Xaa3은 Ala, Asp, Phe, Trp, 또는 Tyr이고; Xaa4는 Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, 또는 Thr이다)이다.
스트렙토코커스 단백질 G(SpG)는 몇몇 스트렙토코커스 균주의 표면상에 존재하는 이중-기능성 수용체이며 IgG와 혈청 알부민 모두에 결합할 수 있다(문헌[Bjorck et al. Mol Immunol 24:1 1 13, 1987]). 상기 구조는 다수의 구조적으로 및 기능적으로 상이한 도메인들(문헌[Guss et al, EMBO J 5: 1567, 1986]), 보다 정확하게는 3개의 Ig-결합 도메인 및 3개의 혈청 알부민 결합 도메인(문헌[Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987])이 고도로 반복된다. 상기 SpG 중의 3개의 혈청 알부민 결합 도메인 중 하나의 구조가 측정되었으며, 3-나선 다발 폴딩을 나타낸다(문헌[Kraulis et al, FEBS Lett 378: 190, 1996], 문헌[Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:81 14-20, 2002]). 46 아미노산 동기가 ABD(알부민 결합 도메인)로서 정의되었으며 후속으로 또한 G148-GA3(단백질 G-관련된 알부민 결합을 위한 GA)로 명명되었다. 예를 들어 PCT 공보 WO 2009/016043에, 상기 46 아미노산 동기 ABD의 알부민 결합 변이체가 개시되어 있다.
단백질 G 중의 도메인들과 다른 세균성 알부민 결합 도메인이 또한 동정되었으며, 이들 중 일부는 단백질 G의 도메인들과 구조적으로 유사하다. 상기와 같은 알부민 결합 도메인을 함유하는 단백질의 예는 PAB, PPL, MAG 및 ZAG 단백질이다(문헌[Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006]). 상기와 같은 알부민 결합 도메인의 구조 및 기능에 대한 연구가 요한슨(Johansson)과 동료들에 의해 수행되고 보고되었다(문헌[Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997]). 더욱 또한, 로작(Rozak) 등은 상이한 종 특이성 및 안정성에 관하여 선택되고 연구된 G148-GA3의 인공 변이체의 생성을 보고한 반면(문헌[Rozak et al, Biochemistry 45:3263-3271, 2006]), 요한슨 등은 인간 혈청 알부민에 대해 매우 많이 개선된 친화성을 갖는 G148-GA3의 인공 변이체를 개발하였다(문헌[Jonsson et al, Prot Eng Dcs Sel 21 :515-27, 2008]). 상기 변이체들 중 일부의 경우, 보다 높은 친화성이, 감소된 열 안정성의 댓가로 성취되었다.
상술한 단백질을 함유하는 3-나선 외에, 알부민과 결합하는 다른 관련되지 않은 세균성 단백질들이 또한 존재한다.
최근에, 몇몇 T- 및 B-세포 에피토프가 스트렙토코커스 단백질 G 균주 148(G148)의 알부민 결합 영역내에서 실험적으로 확인되었다(문헌[Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10: 125-32, 2003]). 상기 연구의 배후 저자들은 백신에 G148의 T-세포 에피토프를 사용하는 것에, 즉 상기 알부민 결합 영역 본래의 면역-자극 성질을 사용하는 것에 흥미를 가졌다. 괴체(Goetsch) 등은 G148의 서열에서 B-세포 에피토프, 즉 면역화후 항체에 의해 결합된 영역을 추가로 발견하였다.
그러나, 인간 투여용 약학 조성물에서 면역-반응은 요구되지 않는다. 따라서, 일부민 결합 도메인 G148은 그 자체가 그의 상기 언급된 면역-자극 성질로 인해 상기와 같은 조성물에 사용하기에 부적합하다. 상기와 같은 결점 및 결함들은 예를 들어 PCT 공보 WO 2012/004384(내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다)에 개시된 조작된 알부민 결합 폴리펩티드에 의해 극복되거나 다소 해결된다.
상기에 관하여, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 하나 이상의 펩티드-결합 링커, 비제한적인 예로서 GGG 및 KLGGGG를 통해 인간 혈청 알부민("HSA")에 결합하는 알부민 결합 단백질에 접합시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 알부민 결합 단백질은 알부민 결합 도메인, 예를 들어 스트렙토코커스 단백질 G 균주 148(G148)일 수 있다. 일부 다른 실시태양에서, 상기 알부민 결합 단백질은 조작된 알부민 결합 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어 상기 알부민 결합 폴리펩티드는 서열번호 85를 포함하는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 따라서 서열번호 85의 알부민 결합 폴리펩티드는 일부 실시태양에서 어느 한 말단 단부에 부착되는 추가적인 아미노산 잔기(들), 예를 들어 3개의 아미노산 KLN을 가질 수 있다. 이에 관하여, 본 명세는 서열번호 83-84 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 예시적인 접합된 리포칼린 뮤테인을 제공한다.
다른 실시태양에서, 알부민 자체 또는 알부민의 생물 활성 단편을 상기 명세의 리포칼린 뮤테인의 접합짝으로서 사용할 수 있다. "알부민"이란 용어는 모든 포유동물 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민("HSA") 또는 소 혈청 알부민 또는 래트 알부민을 포함한다. 상기 알부민 또는 그의 단편을 미국특허 제 5,728,553 호 또는 유럽 특허 출원 EP 0 330 451 및 EP 0 361 991에 개시된 바와 같이 재조합적으로 생성시킬 수 있다. 전형적인 예로서, 재조합 인간 알부민(리콤부민(Recombumin)(등록상표)) 노보자임스 델타 리미티드(Novozymes Delta Ltd.)(영국 노팅엄 소재)을 상기 뮤테인의 반감기를 연장시키기 위해서 리포칼린 뮤테인에 접합시키거나 융합시킬 수 있다.
알부민-결합 단백질이 항체 단편인 경우 상기는 도메인 항체일 수 있다. 도메인 항체는 생물물리학적 성질 및 생체내 반감기에 대한 정확한 조절을 허용하여 최적의 안전성 및 효능 생성물 프로파일을 생성하도록 조작된다. 도메인 항체는 예를 들어 도만티스 리미티드(Domantis Ltd.)(영국 캠프리지 및 미국 매사추세츠주 소재)로부터 상업적으로 입수될 수 있다.
상기 명세의 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키기 위한 모이어티로서 트랜스페린을 사용하여, 상기 뮤테인을 글리코실화되지 않은 트랜스페린의 N 또는 C 말단, 또는 상기 두 말단 모두에 유전학적으로 융합시킬 수 있다. 글리코실화되지 않은 트랜스페린은 14 내지 17일의 반감기를 가지며, 트랜스페린 융합 단백질은 유사하게 연장된 반감기를 가질 것이다. 상기 트랜스페린 담체는 또한 높은 생물학적 이용효능, 생체분포 및 순환 안정성을 제공한다. 이러한 기술을 바이오렉시스(BioRexis)(바이오렉시스 파마슈티칼 코포레이션(Pharmaceutical Corporation), 미국 펜실바니아주 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 단백질 안정제/반감기 연장짝으로서 사용하기 위한 재조합 인간 트랜스페린(델타페린(DeltaFerrin)(상표))을 또한 노보자임스 델타 리미티드(영국 노팅엄 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있다.
면역글로불린의 Fc 부분을 상기 명세의 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시킬 목적으로 사용하는 경우, 신토닉스 파마슈티칼스 인코포레이티드(Syntonix Pharmaceuticals, Inc.)(미국 매사추세츠주 소재)로부터 상업적으로 입수할 수 있는 신퓨전(SynFusion)(상표) 기술을 사용할 수 있다. 이러한 Fc-융합 기술의 사용은 보다 오래 작용하는 생물약제의 생성을 허용하며 상기 기술은 예를 들어 약동학, 용해도 및 생산 효율을 개선시키기 위해 항체의 Fc 영역에 연결된 뮤테인의 2개 사본으로 이루어질 수 있다.
상기 명세의 리포칼린 뮤테인의 반감기를 연장시키기 위한 더욱 또 다른 대안은 길고, 구조화되지 않은, 가요성 글리신-풍부 서열(예를 들어 약 20 내지 80개의 연속적인 글리신 잔기를 갖는 폴리글리신)을 상기 명세의 리포칼린 뮤테인의 N- 또는 C-말단에 융합시키는 것이다. 예를 들어 WO2007/038619에 개시된 이러한 접근법을 "rPEG"(재조합 PEG)라 또한 칭하였다.
폴리알킬렌 글리콜 분자를 상기 명세의 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시킬 목적으로 사용하는 경우, 상기 폴리알킬렌 글리콜은 치환되거나, 비치환되거나, 선형이거나 분지될 수 있다. 상기는 또한 활성화된 폴리알킬렌 유도체일 수 있다. 적합한 화합물의 예는 인터페론과 관련하여 WO 99/64016, 미국특허 제 6,177,074 호 또는 미국특허 제 6,403,564 호에 개시된 바와 같거나 또는 PEG-변형된 아스파라기나제, PEG-아데노신 데아미나제(PEG-ADA) 또는 PEG-초산화물 디스뮤타제와 같은 다른 단백질에 대해 개시된 바와 같은 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자 또는 그의 활성화된 유도체이다(예를 들어 문헌[Fuertges et al. (1990) The Clinical Efficacy of Poly(Ethylene Glycol)-Modified Proteins J. Control. Release 11, 139-148]을 참조하시오). 상기와 같은 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 약 300 내지 약 70,000 달톤의 범위, 예를 들어 약 10,000, 약 20,000, 약 30,000 또는 약 40,000 달톤의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜일 수 있다. 더욱이, 예를 들어 미국특허 제 6,500,930 호 또는 제 6,620,413 호에 개시된 바와 같이, 탄수화물 올리고- 및 중합체, 예를 들어 전분 또는 하이드록시에틸 전분(HES)을 혈청 반감기 연장을 목적으로 상기 명세의 뮤테인에 접합시킬 수 있다. 일부 추가의 실시태양에서, 상기 명세의 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시킬 목적으로, PEG30 또는 PEG40이 오히려 보다 짧은 PEG보다는 정상적인 신장 여과를 갖는 동물/인간에 제안될 수 있는데, 그 이유는 PEG12 또는 PEG20의 보다 빠른 제거가 상기 명세의 PEG-접합된(PEG화된) 리포칼린 뮤테인의 유효성 및 지속을 제한할 수도 있기 때문이다. 이에 관하여, 본 명세는 PEG-접합될 수 있는 서열번호 30-32에 나타낸 바와 같은 예시적인 리포칼린 뮤테인을 제공한다.
또 다른 실시태양에서, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을, 상기 융합물에 다른 분자에 대한 효소 활성 또는 결합 친화성과 같은 새로운 특성을 부여할 수 있는 하나 이상의 부분에 융합시킬 수 있다. 상기와 같은 적합한 부분의 예는 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루타치온-S-트랜스퍼라제, 단백질 G의 알부민-결합 도메인, 단백질 A, 항체 단편, 올리고머화 도메인, 동일하거나 상이한 결합 특이성의 리포칼린 뮤테인("듀오칼린"을 형성시킨다(문헌[Schlehuber, S., and Skerra, A. (2001), Duocalins, engineered ligand-binding proteins with dual specificity derived from the lipocalin fold. Biol. Chem. 382, 1335-1342] 참조)) 또는 독소이다.
특히, 상기 생성되는 융합물의 2개의 "성분"이 모두 주어진 치료 표적상에서 함께 작용할 수 있도록 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 별도의 효소 활성 부위와 융합시킬 수 있다. 예를 들어, 함께 융합시 상기 리포칼린 뮤테인의 결합 도메인은 질병-유발 표적에 부착하여, 상기 효소 도메인이 상기 표적의 생물 기능을 없애게 할 수 있다.
상기 모이어티들 중 하나를 상기 명세의 인간 눈물 리포칼린 뮤테인에 접합시키는 경우, 아미노산 측쇄에의 접합이 유리할 수 있다. 적합한 아미노산 측쇄는 인간 눈물 리포칼린의 아미노산 서열에 천연으로 존재하거나 또는 돌연변이유발에 의해 도입될 수 있다. 적합한 결합 부위가 돌연변이유발을 통해 도입되는 경우에, 한 가지 가능성은 적합한 위치에서 아미노산의 시스테인 잔기에 의한 치환이다. 하나의 실시태양에서, 상기와 같은 돌연변이는 Thr 40→ Cys, Glu 73→ Cys, Arg 90→ Cys, Asp 95→ Cys 또는 Glu 131→ Cys 치환 중 적어도 하나를 포함한다. 이들 위치 중 어느 하나에서 새롭게 생성된 시스테인 잔기는 다음에 상기 뮤테인을 상기 뮤테인의 혈청 반감기를 연장시키는 모이어티, 예를 들어 PEG 또는 그의 활성화된 유도체에 접합시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시태양에서, 상기 명세의 뮤테인에 상기 모이어티들 중 하나를 접합시키기에 적합한 아미노산 측쇄를 제공하기 위해서 인공 아미노산을 돌연변이유발에 의해 도입시킬 수 있다. 일반적으로, 상기와 같은 인공 아미노산을, 보다 반응성이 되고 따라서 목적하는 모이어티에의 접합을 촉진하도록 설계한다. 인공 tRNA를 통해 도입될 수 있는 상기와 같은 인공 아미노산의 일례는 파라-아세틸-페닐알라닌이다.
일부 실시태양에서, 상기 명세에 따른 리포칼린 뮤테인은 신호 서열을 함유할 수 있다. 폴리펩티드의 N-말단의 신호 서열은 상기 폴리펩티드를 특정한 세포 구획, 예를 들어 이 콜라이의 주변세포질 또는 진핵생물 세포의 소포체로 향하게 한다. 다수의 신호 서열들이 당해 분야에 공지되어 있다. 폴리펩티드를 이 콜라이의 주변세포질로 분비시키기 위한 예시적인 신호 서열은 OmpA-신호 서열이다.
본 명세는 또한 본 발명에 개시된 바와 같은 뮤테인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자(DNA 및 RNA)에 관한 것이다. 유전자 암호의 축퇴성은 몇몇 코돈의 동일한 아미노산을 명시하는 다른 코돈에 의한 치환을 허용하므로, 상기 명세는 상기 명세의 뮤테인을 암호화하는 특정한 핵산분자로만 제한되지 않고 기능성 뮤테인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 모든 핵산 분자들을 포함한다. 이에 관하여, 본 명세는 상기 명세의 몇몇 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 핵산 서열들(서열번호 36-61, 72-81 및 86-89에 나타낸 바와 같은)을 제공한다.
따라서, 본 명세는 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 및 108 중 어느 하나의 적어도 하나의 코돈의 돌연변이를 갖는 상기 명세에 따른 뮤테인을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 여기에서 상기 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 서열 위치 61 및 153의 시스테인 잔기 중 적어도 하나를 암호화하는 코돈은 임의의 다른 아미노산 잔기를 암호화하도록 돌연변이되었다. 일부 추가의 실시태양에서, 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 79, 92 및 105 중 어느 하나의 적어도 하나의 코돈의 돌연변이를 갖는 상기 명세에 따른 뮤테인을 암호화하는 핵산 서열.
본 발명에 개시된 바와 같은 명세는 또한 상기 명세의 눈물 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 핵산 분자를 포함하며, 실험적 돌연변이유발의 지시된 서열 위치 밖의 추가적인 돌연변이를 포함한다. 상기와 같은 돌연변이는 종종 허용되거나 또는 심지어 상기 돌연변이가 뮤테인의 개선된 폴딩 효율, 혈청 안정성, 열 안정성 또는 리간드 결합 친화성에 기여하는 경우 유리한 것으로조차 입증될 수 있다.
본 출원에 개시된 핵산 분자는 상기 핵산 분자의 발현을 허용하도록 조절 서열(또는 조절 서열들)에 "작동적으로 연결될" 수 있다.
핵산 분자, 예를 들어 DNA를, 상기가 전사 및/또는 번역 조절에 관한 정보를 함유하는 서열 요소를 포함하고 상기와 같은 서열이 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 "작동적으로 연결되는" 경우 "핵산 분자를 발현할 수 있는" 또는 "뉴클레오티드 서열의 발현을 허용할 수 있는" 것으로서 지칭된다. 작동적인 연결은 상기 조절 서열 요소 및 발현되는 서열이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 이어지는 연결이다. 유전자 발현에 필요한 조절 영역의 정확한 성질은 종간에 다양할 수 있으나, 일반적으로 이들 영역은 원핵생물에서 프로모터 자체, 즉 전사의 개시를 지시하는 DNA 요소뿐만 아니라 RNA로 전사될 때 번역의 개시를 신호하는 DNA 요소를 모두 함유하는 프로모터를 포함한다. 상기와 같은 프로모터 영역은 통상적으로 전사 및 번역의 개시에 관련된 5' 비-암호화 서열, 예를 들어 -35/-10 박스 및 원핵생물 중의 샤인-달가노 요소 또는 TATA 박스, CAAT 서열, 및 진핵생물 중의 5'-캡핑 요소를 포함한다. 이들 영역은 또한 인헨서 또는 억제 요소뿐만 아니라 고유 폴리펩티드를 숙주 세포의 특정한 구획에 표적화하기 위한 번역된 신호 및 리더 서열을 포함할 수 있다.
또한, 상기 3' 비-암호화 서열은 전사 종결, 폴리아데닐화 등에 관련된 조절 요소들을 함유할 수 있다. 그러나, 이들 종결 서열이 특정한 숙주 세포에서 만족스럽게 기능성이지 않은 경우, 상기 서열을 상기 세포에서 기능성인 신호로 치환시킬 수도 있다.
따라서, 상기 명세의 핵산 분자는 조절 서열, 예를 들어 프로모터 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서 상기 명세의 핵산 분자는 프로모터 서열 및 전사 종결 서열을 포함한다. 적합한 원핵생물 프로모터는 예를 들어 tet 프로모터, lacUV5 프로모터 또는 T7 프로모터이다. 진핵생물 세포에서의 발현에 유용한 프로모터의 예는 SV40 프로모터 또는 CMV 프로모터이다.
상기 명세의 핵산 분자는 또한 벡터 또는 임의의 다른 종류의 클로닝 비히클, 예를 들어 플라스미드, 파지미드, 파지, 바큘로바이러스, 코스미드 또는 인공 염색체의 부분일 수 있다.
하나의 실시태양에서, 상기 핵산 분자는 파스미드 중에 포함된다. 파스미드 벡터는 용원성 파지, 예를 들어 M13 또는 f1의 유전자간 영역, 또는 관심 cDNA에 융합되는 그의 기능성 부분을 암호화하는 벡터를 나타낸다. 상기 세균성 숙주 세포를 상기와 같은 파지미드 벡터 및 적합한 헬퍼 파지(예를 들어 M13K07, VCS-M13 또는 R408)로 초감염시킨 후에 완전한 파지 입자가 생성되며, 이에 의해 상기 암호화된 이종 cDNA의 상기 파지 표면상에 나타난 그의 상응하는 폴리펩티드에의 물리적인 결합이 가능해진다(예를 들어 문헌[Lowman, H.B. (1997) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 401-424], 또는 문헌[Rodi, D.J., and Makowski, L. (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 10, 87-93]을 참조하시오).
상기와 같은 클로닝 비히클은, 상술한 조절 서열 및 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 핵산 서열은 차치하고, 발현에 사용되는 숙주 세포와 양립성인 종으로부터 유래되는 복제 및 조절 서열뿐만 아니라 형질전환되거나 형질감염된 세포상에 선택성 표현형을 부여하는 선별 마커를 포함할 수 있다. 다수의 적합한 클로닝 벡터들이 당해 분야에 공지되어 있으며, 상업적으로 입수될 수 있다.
상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 암호화하는 DNA 분자, 및 특히 상기와 같은 리포칼린 뮤테인의 암호화 서열을 함유하는 클로닝 벡터를 상기 유전자를 발현할 수 있는 숙주 세포내로 형질전환시킬 수 있다. 형질전환을 표준 기법을 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 상기 명세는 또한 본 발명에 개시된 바와 같은 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.
상기 형질전환된 숙주 세포를 상기 명세의 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 배양시킨다. 적합한 숙주 세포는 원핵생물, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(이 콜라이) 또는 바실러스 서브틸리스, 또는 진핵생물, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지아에, 피키아 파스토리스, SF9 또는 하이(High)5 곤충 세포, 불멸화된 포유동물 세포주(예를 들어 HeLa 세포 또는 CHO 세포) 또는 원시 포유동물 세포일 수 있다.
상기 명세는 또한 상기 명세의 뮤테인의 생성 방법에 관한 것이며, 여기에서 상기 뮤테인, 상기 뮤테인의 단편 또는 상기 뮤테인과 또 다른 폴리펩티드의 융합 단백질을 유전 공학 방법에 의해 상기 뮤테인을 암호화하는 핵산으로부터 출발하여 생성시킨다. 상기 방법을 생체내에서 수행할 수 있으며, 상기 뮤테인을 예를 들어 세균 또는 진핵생물 숙주 유기체에서 생성시키고 이어서 상기 숙주 유기체 또는 그의 배양물로부터 단리할 수 있다. 단백질을 시험관내에서, 예를 들어 시험관내 번역 시스템의 사용에 의해 생성시키는 것도 또한 가능하다.
상기 뮤테인을 생체내에서 생성시키는 경우 상기 명세의 뮤테인을 암호화하는 핵산을 재조합 DNA 기술(이미 상기에 개략된 바와 같음)에 의해 적합한 세균 또는 진핵생물 숙주 유기체내에 도입시킨다. 이를 위해서, 상기 숙주 세포를 먼저 확립된 표준 방법을 사용하여 상기 명세의 뮤테인을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 클로닝 벡터로 형질전환시킨다. 이어서 상기 숙주 세포를, 이종 DNA의 발현을 허용하고 따라서 상응하는 폴리펩티드의 합성을 허용하는 조건하에서 배양한다. 후속으로, 상기 폴리펩티드를 상기 세포로부터 또는 상기 배양 배지로부터 회수한다.
상기 명세의 일부 눈물 리포칼린 뮤테인에서, Cys 61과 Cys 153 사이의 천연 다이설파이드 결합을 제거한다. 따라서, 상기와 같은 뮤테인(또는 분자내 다이설파이드 결합을 포함하지 않는 임의의 다른 눈물 리포칼린 뮤테인)을 환원성 산화환원 환경을 갖는 세포 구획에서, 예를 들어 그람-음성 세균의 세포질에서 생성시킬 수 있다. 상기 명세의 리포칼린 뮤테인이 분자내 다이설파이드 결합을 포함하는 경우에, 미성숙 폴리펩티드를 적합한 신호 서열을 사용하여 산화성 산화환원 환경을 갖는 세포 구획으로 향하게 하는 것이 요구될 수도 있다. 상기와 같은 산화성 환경은 그람-음성 세균, 예를 들어 이 콜라이의 주변세포질에 의해, 그람-양성 세균의 세포외 환경에서 또는 진핵생물 세포의 소포체의 관강에서 제공될 수 있으며 대개는 구조적 다이설파이드 결합의 형성에 유리하다. 그러나, 상기 명세의 뮤테인을 숙주 세포, 예를 들어 이 콜라이의 시토솔에서 생성시키는 것도 또한 가능하다. 이 경우에, 상기 폴리펩티드를 용해성 및 폴딩된 상태로 직접 수득하거나 봉입체의 형태로 회수한 다음, 시험관내에서 재생시킬 수 있다. 추가적인 선택권은, 산화성 세포내 환경을 가지며, 따라서 시토솔에서 다이설파이드 결합의 형성을 허용할 수 있는 특정한 숙주 균주의 사용이다(문헌[Venturi M, et al. (2002) J. Mol. Biol. 315, 1-6]).
그러나, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 반드시 오직 유전 공학의 사용에 의해서만 생성시키거나 생산할 수 있는 것은 아니다. 오히려, 리포칼린 뮤테인을 또한 화학 합성, 예를 들어 메리필드 고상 폴리펩티드 합성에 의해서 또는 시험관내 전사 및 번역에 의해서 수득할 수 있다. 예를 들어 분자 모델링을 사용하고 이어서 원하는(설계된) 폴리펩티드를 시험관내에서 합성하고 주어진 표적에 대한 결합 활성을 조사하여 유망한 돌연변이를 확인하는 것이 가능하다. 단백질의 고상 및/또는 용액상 합성 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(예를 들어 문헌[Bruckdorfer, T. et al. (2004) Curr. Pharm. Biotechnol. 5, 29-43]을 참조하시오).
또 다른 실시태양에서, 상기 명세의 리포칼린 뮤테인을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 잘-확립된 방법을 사용하는 시험관내 전사/번역에 의해 생성시킬 수 있다.
상기 명세로부터 자명한 바와 같이, 본 명세의 리포칼린 뮤테인 또는 그의 융합 단백질 또는 접합체를 다수의 용도에 사용할 수 있다. 따라서 일반적으로, 본 발명에 개시된 뮤테인 및 그의 유도체를 그의 항체 또는 단편과 유사한 다수의 분야에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 뮤테인에 대한 다수의 가능한 용도들은 약물 분야에 존재한다.
예를 들어, 상기 명세는 피험자에서 PCSK9의 결합 및/또는 피험자에서 저-밀도 지방단백질 수용체(LDL-R)에 대한 PCSK9의 결합의 억제를 위한 상기 명세의 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 상기와 같은 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물의 용도를 포함한다. 일부 실시태양에서, 상기와 같은 용도는 상기 피험자에게 유효량의 상기 명세의 하나 이상의 뮤테인 또는 상기와 같은 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 투여함을 포함한다. 이에 관하여, 본 출원은 또한 피험자에서 PCSK9의 결합뿐만 아니라 LDL-R에 대한 PCSK9의 결합의 억제 방법을 개시하며, 상기 방법은 상기 피험자에게 유효량의 상기 명세의 하나 이상의 리포칼린 뮤테인 또는 상기와 같은 뮤테인을 포함하는 하나 이상의 조성물을 투여함을 포함한다.
상기 명세의 또 다른 태양에서, 본 명세는 PCSK9와의 복합체 형성을 위한 상기 명세의 리포칼린 뮤테인의 용도를 수반한다. 이와 관련하여 상기 각 뮤테인과 그의 리간드간의 복합체 형성은 다수의 상이한 인자들, 예를 들어 각 결합짝의 농도, 경쟁자의 존재, 사용되는 완충 시스템의 pH 및 이온 강도, 및 KD의 측정에 사용되는 실험 방법(예를 들어 단지 몇 개만 언급하자면 형광 적정, 경쟁 ELISA 또는 표면 플라스몬 공명) 또는 심지어 실험 데이터의 평가에 사용되는 수학적 연산에 의해 영향을 받음을 또한 유의한다.
일부 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 리포칼린 뮤테인을 PCSK9의 검출에 사용할 수 있다. 상기와 같은 사용은 상기 뮤테인을 적합한 조건하에서 주어진 리간드를 함유하는 것으로 의심이 가는 샘플과 접촉시키고, 이에 의해 상기 뮤테인과 상기 주어진 리간드간의 복합체의 형성을 허용하고, 적합한 신호에 의해 상기 복합체 뮤테인을 검출하는 단계들을 포함할 수 있다.
상기 검출 가능한 신호는 상기에 설명된 바와 같이 표지에 의해서, 또는 상기 결합, 즉 복합체 형성 자체에 기인한 물성의 변화에 의해 유발될 수 있다. 한 가지 예는 표면 플라스몬 공명이며, 이의 값은 결합짝들의 결합 중에 상기 짝들 중 하나가 금 호일과 같은 표면상에 고정화되는 것으로부터 변화한다.
또 다른 태양에서, 상기 명세는 상기 명세의 하나 이상의 뮤테인을 포함하는 키트 및 상기 키트를 사용하기 위한 하나 이상의 설명서를 제공한다.
일부 실시태양에서, 상기 키트는 상기에 일체되거나 또는 하나 이상의 별도의 문서로서, 내용물 또는 상기 키트 및 상기 명세의 하나 이상의 뮤테인의 용도에 관한 정보를 포함한다. 상기 키트는 희석제 중에서 재조성되도록 제형화되는 상기 명세의 하나 이상의 뮤테인을 포함할 수 있다. 상기와 같은 희석제, 예를 들어 멸균 희석제를 또한 상기 키트 중에, 예를 들어 용기내에 포함시킬 수 있다.
본 발명에 개시된 리포칼린 뮤테인을 또한 PCSK9의 분리에 사용할 수도 있다. 상기와 같은 용도는 상기 뮤테인을 적합한 조건하에서 상기 리간드를 함유하는 것으로 추측되는 샘플과 접촉시키고, 이에 의해 상기 뮤테인과 상기 리간드간에 복합체가 형성되게 하고 상기 뮤테인/리간드 복합체를 상기 샘플로부터 분리시키는 단계들을 포함할 수 있다.
PCSK9의 검출뿐만 아니라 PCSK9의 분리를 위한 상기 명세의 뮤테인의 용도에서, 상기 뮤테인 및/또는 PCSK9를 적합한 고체 상에 고정화시킬 수 있다.
일부 실시태양에서, 상기 명세의 하나 이상의 리포칼린 뮤테인을 또한, 화합물을 상기 화합물로 처리되는 미리 선택된 유기체, 조직, 기관 또는 세포에 표적화하는데 사용할 수 있으며, 여기에서 PCSK9는 상기와 같은 유기체, 조직, 기관 또는 세포 중에 존재한다. 상기와 같은 목적을 위해서, 상기 뮤테인을 복합체 형성을 허용하기 위해 관심 화합물과 접촉시킨다. 이어서 상기 뮤테인 및 상기 관심 화합물을 포함하는 복합체를 미리 선택된 유기체, 조직, 기관 또는 세포로 전달한다. 상기 용도는 특히 약물을 미리 선택된 유기체, 조직, 기관 또는 세포, 예를 들어 약물 치료가 제안된, 감염된 신체 부분에 (선택적으로) 전달하기 위해 적합하다(그러나 이들로 제한되지는 않는다). 뮤테인과 관심 화합물간의 복합체의 형성 외에, 상기 뮤테인을 또한 상기 주어진 화합물과 반응시켜 뮤테인과 화합물의 접합체를 제공할 수 있다. 상기 복합체와 유사하게, 상기와 같은 접합체는 상기 화합물을 상기 미리 선택된 유기체, 조직, 기관 또는 세포로 전달하기에 적합할 수 있다. 상기와 같은 뮤테인과 화합물의 접합체는 또한 뮤테인과 화합물을 서로 공유 결합시키는 링커를 포함할 수도 있다. 임의로, 상기와 같은 링커는 혈류 중에서 안정하나 세포 환경에서는 절단될 수 있다.
본 명세의 추가의 목적, 이점 및 특징들은 하기의 실시예 및 첨부된 도면(이들로 제한하고자 하지 않는다)의 고찰시 당해 분야의 숙련가에게 자명해질 것이다. 따라서, 본 명세를 예시적인 실시태양 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시하지만, 본 발명에 개시된 상기 중에서 구현된 명세의 변형 및 변화는 당해 분야의 숙련가들에 의해 복원될 수 있으며, 상기와 같은 변형 및 변화가 본 명세의 범위내에 있는 것으로 간주됨은 물론이다.
V. 실시예
실시예 1: 재조합 인간 PCSK9 및 인간 PCSK9 돌연변이체의 생성 및 특성화
C-말단 FLAG 태그를 함유하는 인간 PCSK9(서열번호 34)를 형질감염된 HEK293F 세포에서 발현시켰다. 600 ㎖의 형질감염된 세포를 6일 동안 DMEM/TS/0.05% BSA에서 배양하고 hPCSK9를 함유하는 상등액을 회수하였다. hPCSK9를 FLAG M2 수지에 결합시키고, 50CV 세척 완충제(10 mM 트리스/HCL pH 7.4, 150 ㎖ NaCl, 2 mM Cacl2, 10% 글리세롤)로 세척하고 100 ㎍/㎖ 3 x FLAG 펩티드를 함유하는 5 CV 세척 완충제로 용리시켰다. 상기 용리된 단백질을 슈퍼덱스(Superdex) 200 16/60 컬럼(GE 헬쓰케어)을 사용하여 젤 여과를 통해 추가로 정제하였다. 기능성을 HepG2 세포를 사용하여 LDL-R 세포-ELISA로 시험하였다.
관심 리포칼린 뮤테인의 선택 및 선별을 위해서, hPCSK9를 비오틴화시킬 수 있다. hPCSK9를 5배 몰 과잉의 EZ-링크 NHS-색원성 비오틴 시약(써모 사이언티픽(Thermo Scientific)과 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 과잉의 비오틴을 제거하고 상기 비오틴화된 단백질을 한외여과에 의해 농축시켰다. 스트렙타신 풀-다운(pull-down) 분석은 비오틴화를 입증하였다.
기능획득 hPCSK_D374Y 돌연변이체, 키노몰구스 PCSK9 및 마우스 PCSK9를 동일한 방식으로 생성시키고 특성화하였다.
실시예 2: 2x1010개의 독립적인 리포칼린 뮤테인을 갖는 라이브러리의 생성 및 PCSK9에 대한 리포칼린 뮤테인의 파지미드 선택
높은 다양성을 갖는 2x1010개의 리포칼린 뮤테인의 무작위 라이브러리를 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 무작위 돌연변이유발에 의해 생성시켰다(예를 들어 WO2007/107563을 참조하시오). PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인의 선별을 위해서, 상기 라이브러리로부터 2x1012 파지미드를 200 nM 비오틴화된 인간 및/또는 키노몰구스 PCSK9와 함께 배양하였다. 뉴트라비딘 또는 스트렙트아비딘으로 코팅된 상자성 비드를 사용하여 PCSK9/파지미드 복합체를 포획하고 이를 후속으로 자석으로 단리하였다. 결합되지 않은 파지미드를, 상기 비드를 1 ㎖ PBS/T로 8회 세척하여 제거하였다. 결합된 파지미드는, 먼저 트라이에틸아민과 배양하고 이어서 0.1M 글리신 pH 2.2와 배양함으로써 용리시켰다. 4회의 연속적인 라운드의 선택을 수행하였다.
파지 디스플레이 선별 후에 수득된 파지미드 제제의 돌연변이된 중심 카세트를 BstX1에 의한 상기 DNA의 절단 및 표준 방법을 사용하는 아가로스 젤 전기영동을 통한 후속 정제에 의해 단리하였다(문헌[Sambrook et al, (1989) Molecular cloning: a laboratory manual]). 상기 DNA를, 테트라사이클린 프로모터의 조절하에서 상기 뮤테인의 세균성 생성을 허용하는 마찬가지로 절단된 벡터 pTlc10에 삽입하였다. CaCl2-수용성 TG1-F' 세포를 결찰 혼합물로 형질전환시키고 LB/Amp 플레이트상에 도말하였다. 개별적인 콜로니들을 사용하여 2xYT/Amp 배지를 접종하고 밤새 정지기로 증식시켰다(14-18시간). 후속으로, 50 ㎕ 2xYT/Amp를 상기 정지기 배양물로부터 접종하고 37 ℃에서 3시간 동안 배양하고 이어서 0.6 내지 0.8의 OD595에 도달할 때까지 22 ℃로 이동시켰다. 1.2 ㎍/㎖ 무수테트라사이클린이 보충된 10 ㎕ 2xYT/Amp의 첨가에 의해 안티칼린 생성을 유도하였다. 배양물을 다음날 까지 22 ℃에서 배양하였다. 40 ㎕의 PBS/T 중의 5%(w/v) BSA의 첨가 및 25 ℃에서 1시간 동안의 배양 후에 배양물은 선별 분석에 사용할 준비가 되었다.
리포칼린 뮤테인의 선별을 위해서, 인간 및 키노몰구스 PCSK9(PBS/T 중의 1 ㎍/㎖)(모두 FLAG-태그를 갖는다)를 항-FLAG-태그 항체(시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(전날 PBS 중의 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 상기 플레이트상에 코팅되었다)에 의해 미세적정플레이트상에 포획하였다. 항-Flag-태그 항체는 단독으로 음성 대조군으로서 제공되었다. 후속으로 20 ㎕의 BSA-차단된 배양물을 가하고 25 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 결합된 뮤테인을 PBS/T 중에서 1:10000 희석된 양고추냉이 퍼옥시다제("HRP", 메르크(Merck) KgaA, 독일 다름스타트 소재)와 접합된 항-T7 항체로 검출하였다. 정량분석을 위해서, 20 ㎕ 콴타블루(QuantaBlu) 형광원 퍼옥시다제 기질을 가하고 320 ㎚의 여기 파장 및 430 ㎚의 방출 파장에서 측정하였다.
실시예 3: PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인의 최적화를 위한 편향된 성숙화 라이브러리의 생성
상기 실시예 2에서 리포칼린 라이브러리로부터 확인된 PCSK9-특이성 뮤테인의 최적화를 위해서, 리포칼린 뮤테인 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 7(이후부터 본 실시예에서 "모 클론(들)"이라 명명한다)을 기본으로 하는 추가적인 라이브러리들을 각각 생성시켰다. 상기 라이브러리들을 오직 선택된 위치의 부분적인 무작위화를 도출하는 방식으로 생성시켰다. 설계는 상기 선택된 위치들 각각에 대해서, 암호화된 아미노산이 70%의 확률로 각각의 모 클론 중에서 발견되는 아미노산에 상응하는 반면, 상기 아미노산이 30%의 확률로 상이한 아미노산일 수 있도록 수행되었다. 표적화된 위치의 수 N 및 편향으로서 B를 사용하여, 클론당 최확수는 Nx(1-B)이다. 예를 들어 20개 아미노산 위치가 상기 모 클론의 아미노산상에서 70% 편향으로 부분적으로 무작위화되는 경우, 상기는 상기 모 클론에 비해 평균 6개의 돌연변이를 함유하지만, 오직 표적화된 위치상에만 돌연변이체의 라이브러리를 생성시킬 것이다. 그러나, 상기 클론들이 모두 6개의 교환을 갖지는 않을 것이다: 클론당 돌연변이의 빈도는 도 11D에 묘사된 바와 같이, 이항분포를 따를 것이다.
상기와 같은 라이브러리를 조립하기 위해서, 폴리머라제 쇄 반응("PCR") 반응에서 올리고뉴클레오티드의 반복 조립(문헌[Stemmer et al, (1995) Gene 164:49-53])을 사용하였다. 상기 올리고뉴클레오티드를 표준 포스포아미다이트 화학에 의해 생성시킨다(문헌[Beaucage et al, (1981) Tetrahedron Lett. 22, 1859-62]; 문헌[McBride et al, (1983) Tetrahedron Lett. 24, 245-8]). 70% 편향의 암호화를 허용하기 위해서, 우리는 20개 표준 아미노산 각각에 대한 뉴클레오티드 트리플릿의 각 위치에 최적화된 혼합물을 계산하였다. 예를 들어 70%의 편향을 갖는 세린을 암호화하고 나머지 30% 중에 다양한 상이한 아미노산을 허용하는 혼합물을 뉴클레오시드 포스포아미다이트 구성 블록 "abc"의 혼합물에 의해 생성시키며, 여기에서 a는 85% 티미딘, 및 5% 구아니딘, 시토신 및 아데노신 각각의 혼합물에 상응하고, b는 85% 시토신 및 5%의 다른 뉴클레오시드 각각의 혼합물에 상응하며, c는 50% 구아니딘 및 50% 티미딘의 혼합물에 상응한다(도 11을 참조하시오).
상술한 기술을 사용하여, 각각 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 7을 기본으로 하는 상기 라이브러리들을 반복 PCR에 의해 생성시켰다. 후속으로, 상기 생성된 리포칼린 뮤테인을 필수적으로 개시된 바와 같이 파지미드 벡터에 매우 효율적으로 클로닝시켰다(예를 들어 문헌[Kim et al, (2009) J Am Chem Soc 131(10): 3565 -76]을 참조하시오). 상기 라이브러리의 크기는 7x109 내지 11x109 돌연변이체의 범위였다. 상기 라이브러리들을 후속의 파지 패닝(panning)에 사용하였다(실시예 4를 참조하시오).
실시예 4: PCSK9에 대해 최적화된 리포칼린 뮤테인의 파지미드 선택
최적화된 PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인의 선별을 위해서, 실시예 3에 개시된 라이브러리들로부터 2x1012 파지미드를 사용하였다. 파지미드를 0.1% 트윈-20(v/v)(즉 PBS/T), 50 mM 벤즈아미딘 및 1%(w/v) 카제인이 보충된 PBS 중에 용해시켰다. 증가된 친화성을 갖는 리포칼린 뮤테인을 선택하기 위해서, 파지미드를 0.01 내지 10 nM 범위의 감소된 농도의 비오틴화된 PCSK9 단백질과 함께 배양하였다. 다수의 경우에, 파지미드를 65 ℃에서 10분간 배양하여 증가된 내열성을 갖는 뮤테인을 선택하였다. 차단된 파지미드를 40분 동안 비오틴화된 PCSK9 단백질과 배양한 후에 0.3 mM 데스티오비오틴을 상기 용액에 가하여 유리 스트렙트아비딘 결합 부위를 포화시키고 20분 동안 배양을 계속하였다. 후속으로, 스트렙트아비딘 또는 뉴트라비딘으로 코팅된, 차단된(PBS/T 중의 1%(w/v) 카제인) 및 배수된 상자성 비드를 20분 동안 가하여 PSCK9-파지미드 복합체를 포획하였다. 복합체화되지 않은 파지미드는 상기 비드를 철저한 재현탁에 의해 1 ㎖ PBS/T로 8회 세척한 다음 자석에 의해 비드를 수거함으로써 제거하였다. 감소된 koff율을 갖는 뮤테인을 특이적으로 선택하기 위해서, 라운드 1 후에 5회의 추가적인 세척 단계, 라운드 2 후에 10회, 라운드 3 후에 15회 및 라운드 4 후에 20회의 상기 세척 단계를 수행함으로써 보다 엄격한 세척 프로노콜을 적용하거나 또는 뮤테인-PCSK9 복합체를 상이한 양(10 nM - 5 μM)의 정제된 모 뮤테인(예를 들어 서열번호 3, 4 또는 7)과 배양하여 최적화된 리포칼린 뮤테인과 모 리포칼린 뮤테인간의 PCSK9-결합 경쟁을 허용하였다. 추가로, 상기 두 방법의 조합을 적용하였다. 결합된 파지미드를 먼저 10분간 300 ㎕의 70 mM 트라이에틸아민으로 용리시킨 다음 100 ㎕의 1M 트리스-Cl pH 6.0으로 상등액을 즉시 중화시켰다. 1회의 중간 세척 주기 후에 남아있는 파지미드를 10분간 100 mM 글리신 pH 2.2로 용리시킨 다음 50 ㎕의 0.5 M 트리스-염기로 즉시 중화시켰다. 상기 두 용리 분획을 모두 모으고 재증폭을 위해서 4 ㎖의 로그-기 이 콜라이 배양물(OD550 0.45-0.6)을 감염시키는데 사용하였다. 교반하에서 30분 동안 배양 후에, 세균을 5000xg에서 2분간 원심분리에 의해 수거하고, 1 ㎖의 2xYT 배지에 재현탁시키고 3개의 큰 LB/Amp 아가 플레이트(10 g/ℓ 박토 트립톤, 5 g/ℓ 효모 추출물, 5 g/ℓ NaCl, pH 7.5, 15 g/ℓ 아가, 100 ㎍/㎖ 암피실린)상에 도말하였다. 플레이트를 32 ℃에서 밤새 배양하였다. 감염된 세포를 100 ㎍/㎖ 암피실린(2xYT/Amp)이 보충된 50 ㎖의 2xYT 배지를 사용하여 상기 아가 플레이트로부터 긁어내었다. 50 ㎖의 2xYT/Amp 배지를 0.08의 OD550에 도달하도록 적합한 부피의 세균 현탁액으로 접종하였다. 상기 배양물을 0.5의 OD550에 도달할 때까지 37 ℃에서 진탕기(160 rpm)에서 배양하고 이어서 순한 교반과 함께 15분간 및 37 ℃에서 진탕기상에서 45분간 배양에 의해 헬퍼파지로 감염시켰다(1.5x1011 pfu). 후속으로, 헬퍼파지에 의해 감염된 세균을 선택하기 위해서 가나마이신을 70 ㎍/㎖의 최종 농도로 가하였다. 최종적으로, pIII-리포칼린 단백질의 발현을 25 ng/㎖의 무수테트라사이클린의 첨가에 의해 유도하였다.
실시예 5: 선별에 의한 PCSK9-특이성 Tlc 뮤테인의 확인
실시예 4에 개시된 바와 같은 파지 디스플레이 선별 후 수득된 파지미드 제제의 돌연변이된 중심 카세트를 BstX1에 의한 DNA의 절단 및 표준 방법(문헌[Sambrook et al. 1989])을 사용하는 아가로스 젤 전기영동을 통한 후속 정제에 의해 단리하였다. 상기 DNA를 테트라사이클린 프로모터의 조절하에서 상기 뮤테인의 세균성 생성을 허용하는 마찬가지로-절단된 벡터에 삽입하였다. CaCl2-수용성 TG1-F' 세포를 결찰 혼합물로 형질전환시키고 LB/Amp 플레이트상에 도말하였다. 개별적인 콜로니들을 사용하여 2xYT/Amp 배지를 접종하고 밤새 정지기로 증식시켰다(14-18시간). 후속으로, 50 ㎕ 2xYT/Amp를 상기 정지기 배양물로부터 접종하고 37 ℃에서 3시간 동안 배양하고 이어서 0.6 내지 0.8의 OD595에 도달할 때까지 22 ℃로 이동시켰다. 1.2 ㎍/㎖ 무수테트라사이클린이 보충된 10 ㎕ 2xYT/Amp의 첨가에 의해 리포칼린-뮤테인 생성을 유도하였다. 배양물을 다음날 까지 22 ℃에서 배양하였다. 40 ㎕의 PBS/T 중의 5%(w/v) BSA의 첨가 및 25 ℃에서 1시간 동안의 배양 후에 배양물은 선별 분석에 사용할 준비가 되었다.
리포칼린 뮤테인의 선별을 위해서, 인간 및 키노몰구스 PCSK9(PBS/T 중의 1 ㎍/㎖)뿐만 아니라 hPCSK9-D374Y 돌연변이체(모두 FLAG-태그를 갖는다)를 항-FLAG-태그 항체(시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)(전날 PBS 중의 5 ㎍/㎖의 최종 농도로 상기 플레이트상에 코팅되었다)에 의해 미세적정플레이트상에 포획하였다. 후속으로 20 ㎕의 BSA-차단된 배양물을 가하고 25 ℃에서 1시간 동안 배양하였다. 결합된 뮤테인을 PBS/T 중에서 1:10000 희석된 HRP(메르크 KgaA, 독일 다름스타트 소재)와 접합된 항-T7 항체로 검출하였다. 정량분석을 위해서, 20 ㎕의 콴타블루 형광원 퍼옥시다제 기질을 가하고 320 ㎚의 여기 파장 및 430 ㎚의 방출 파장에서 측정하였다.
리포칼린 뮤테인의 친화성 순위를 위해서, PBS 중의 항-스트렙-태그 항체(IBA, 괴팅엔(Goettingen))를 미세적정플레이트상에 코팅하고 20 ㎕의 BSA-차단된 배양물을 가하였으며, 이는 상기 플레이트상의 리포칼린 뮤테인의 특이적인 포획을 허용하였다. 상이한 농도(0.5 내지 5 nM)의 비오틴화된 PCSK9 단백질을 가하고 특이적으로-결합된 PCSK9 단백질을 광범위한 세척 후에 엑스트라비딘-HRP(시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로 검출하였다. 정량분석을 위해서, 20 ㎕ 콴타블루를 가하고 320 ㎚의 여기 파장 및 430 ㎚의 방출 파장에서 측정하였다.
경쟁적인 리포칼린 뮤테인의 선별을, 미세적정플레이트상에 항-FLAG-태그(PBS 중의 5 ㎍/㎖)를 코팅하고 후속으로 hPCSK9-D374Y 돌연변이체(PBS/T 중의 1 ㎍/㎖)를 포획함으로써 수행하였다. 차단된 배양물을 30 nM 정제된 LDL 수용체로 조절하고 포획된 hPCSK9-D374Y 돌연변이체를 갖는 플레이트에 72시간 동안 가하였다. 이는 상기 시스템의 평형화 및 경쟁 뮤테인의 신뢰할만한 선택을 허용하였다. 결합된 수용체를 HRP-접합된 항-His-태그 항체(PBS/T 중의 1 ㎍/㎖; 아브캠(Abcam), 영국 캠브리지 소재)로 검출하였다. 정량분석을 위해서, 20 ㎕ 콴타블루 형광원 퍼옥시다제 기질을 가하고 320 ㎚의 여기 파장 및 430 ㎚의 방출 파장에서 측정하였다.
실시예 6: PCSK9에 대한 전형적인 리포칼린 뮤테인의 친화성
비오틴화된 PCSK9에 대한 리포칼린 뮤테인의 전형적인 그룹의 결합 친화성을 측정하기 위해서, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기재 분석을 바이아코어(Biacore) T200 장비(GE 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. 상기 SPR 친화성 분석(도 1)을 위해서, 비오틴 캡쳐 키트(Biotin CAPture Kit)(GE 헬쓰케어)를 사용하였다.
각각의 측정 주기에서, 비오틴 캡쳐 시약(GE 헬쓰케어)을 상기 기준 및 센서 칩 CAP(GE 헬쓰케어)의 측정 채널에 2 ㎕/분의 유량으로 5분간 적용하였다. 비오틴화된 PCSK9를 4 ㎍/㎖의 농도로 상기 측정 채널상에 2분간 10 ㎕/분의 유량으로 주입하였다. 상기 친화성을 측정하기 위해서, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 3 내지 4개 희석물을 HBS-EP + (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) 완충제 중에서 제조하고 서열번호 3, 서열번호 6, 서열번호 11, 및 서열번호 12에 대해서 500, 125, 31 및 8 nM의 농도, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10에 대해서 300, 75, 19 및 5 nM의 농도, 및 서열번호 7에 대해서 75, 19 및 5 nM의 농도를 사용하여 상기 칩 표면에 적용하였다. 상기 결합 분석을 3분의 접촉 시간, 20분의 해리 시간 및 30 ㎕/분의 유량 적용으로 수행하였다. 모든 측정을 25 ℃에서 수행하였다. 상기 센서 칩 CAP 표면의 재생을 0.25 M NaOH(2 분)와 함께 6M 구아니딘-HCl의 주입에 이어서 흐르는 완충제에 의한 여분의 세척 및 2분의 안정화 기간으로 성취하였다. 상기 측정에 앞서, 3개의 연속적인 재생 단계들로 이루어지는 하나의 컨디셔닝 주기를 수행하였다. 데이터를 바이아코어 T200 평가 소프트웨어(V 1.0)로 평가하였다. 이중 참조를 사용하였다. 1:1 결합 모델을 사용하여 원 데이터를 정합시켰다.
서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 11에 대해 생성된 정합 곡선들을 각각 도 1(A-D)에 도시한다. 예를 들어, 상기 데이터는 서열번호 3(도 1A)이 높은 친화성으로 PCSK9에 결합했음을 보인다(KD = 0.85 nM). 모든 리포칼린 뮤테인들에 대한 결합률 상수 ka 또는 kon, 해리율 상수 kd 또는 koff 및 생성되는 해리 상수 KD를 하기 표 1에 요약한다.
분자 | k on [M -1 *s -1 ] | k off [s -1 ] | K D [nM] |
서열번호 3 | 1.77E+05 | 1.50E-04 | 0.85 |
서열번호 4 | 4,79E+04 | 1,39E-04 | 2.89 |
서열번호 5 | 3,40E+04 | 1,63E-04 | 4.8 |
서열번호 6 | 5,66E+04 | 2,32E-04 | 4.1 |
서열번호 7 | 7,24E+05 | 4,84E-03 | 6.69 |
서열번호 8 | 1,54E+05 | 1,38E-03 | 8.96 |
서열번호 9 | 2,33E+05 | 4,80E-03 | 20.59 |
서열번호 10 | 5,70E+05 | 7,19E-03 | 12.61 |
서열번호 11 | 4,70E+04 | 8,90E-05 | 1.89 |
서열번호 12 | 2,44E+04 | 1,56E-04 | 6.4 |
실시예
7:
PCSK9에
대한 전형적인
리포칼린
뮤테인의
경쟁적인 작용 방식
실시예 6에 개시된 리포칼린 뮤테인이 PCSK9에 경쟁 방식으로 결합하는지의 여부를 경쟁 ELISA 포맷을 사용하여 시험관내에서 시험하였다. 상기 실험에서, 일정한 농도의 인간 PCSK9(서열번호 34) 또는 인간 PCSK9_D374Y 돌연변이체를 가변 농도의 리포칼린 뮤테인과 1시간 동안 배양하였다. 용액 중에서 상기 예비-배양 후에, 1회 분액의 상기 리포칼린 뮤테인/PCSK9 혼합물을 인간 LDL-R로 코팅된 ELISA 플레이트로 옮겨 hLDL-R과의 결합을 차단하지 않는 hPCSK9의 농도를 측정하였다.
모든 배양 단계들을 300 rpm에서 진탕하면서 수행하고, 상기 플레이트를 각 배양 단계 후에 100 ㎕ PBS-T 완충제(PBS(포스페이트 완충된 염수), 0.05% 트윈 20)로 바이오텍(Biotek) ELx405 셀렉트 CW 세척기를 사용하여 5회 세척하였다. 상기 첫 번째 단계에서, 384-웰 형광 플레이트를 20 ㎕의 재조합 인간 LDL-R(R&D 시스템스, Cat. No. 2148-LD/CF)로 4 ℃에서 밤새 PBS 중의 5 ㎍/㎖의 농도로 코팅하였다. 세척 후에, 상기 LDL-R-코팅된 웰을 실온("RT")에서 1시간 동안 100 ㎕의 PBS-T/BSA(0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 중의 2% BSA(소 혈청 알부민))로 차단하였다.
고정된 농도의 25 nM 인간 PCSK9 또는 0.25 nM 인간 PCSK9_D374Y 돌연변이체를 (i) 가변 농도의 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 29 및 서열번호 33의 기준 항체, 또는 (ii) 음성 대조군으로서 서열번호 2와 함께 용액 중에서, 300 nM의 출발 농도(PBS-T/BSA 완충제 중에서 5 pM 까지 1:3비로 연속 희석되었다)를 사용하여 배양하였다. 실온에서 1시간 후에, 20 ㎕의 반응 혼합물을 LDL-R-코팅된 ELISA 플레이트로 옮겨 RT에서 20분 동안 결합되지 않은(유리) 또는 비-경쟁적으로 결합된 PCSK9를 포획하였다. ELISA 판독 결과를 유리 hPCSK9 농도로 변환하기 위해서(하기 참조), 25/50 nM(11 단계로 1:3 연속 희석된)로 출발하여 다양한 농도의 hPCSK9 또는 hPCSK9_D374Y 돌연변이체를 함유하는 표준 곡선을 PBS-T/BSA 중에서 제조하고 또한 MSD(메소스케일디스커버리(MesoScaleDiscovery) 플레이트상에서 20분 동안 배양하였다.
결합된 PCSK9의 검출 및 정량분석을 허용하기 위해서, 잔류 상등액은 버리고 20 ㎕의 마우스-항-Flag M2-양고추냉이 퍼옥시다제("HRP")(시그마 알드리치)를 PBS-T/BSA 중에서 1:5000 희석으로 첨가하고 RT에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 20 ㎕의 콴타블루 형광원 퍼옥시다제 기질을 각 웰에 가하고 제니오스 플러스(GENios Plus) 플레이트 판독기(테칸(Tecan))를 사용하여 15분 후에 형광을 320 ㎚의 여기 파장 및 430 nM의 방출 파장에서 측정하였다.
상기 평가를 하기와 같이 수행하였다: 유리 hPCSK9 또는 hPCSK9_D374Y 돌연변이체 농도 c(hPCSK9) 유리/c(hPCSK9_D374Y)유리를 상기 측정된 표준 곡선을 사용하여 상대 형광 신호로부터 나란히 계산하고 리포칼린 뮤테인 농도, c(서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 또는 서열번호 29 및 서열번호 33의 기준 항체)에 대해 플롯팅하였다. PCSK9/LDL-R 복합체의 형성을 50%까지 차단시키는 리포칼린 뮤테인 농도(IC50)를 획득하기 위해서, 상기 곡선들을 비선형 회귀에 의해, 자유 매개변수로서 상기에서 획득된 전체 추적자 농도 c(PCSK9)tot 및 IC50 값과 함께, c(PCSK9)유리 = c(PCSK9)tot/(1+c(리포칼린 뮤테인)/IC50)에 따라 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다.
요약하면, 음성 대조군 서열번호 2는 PCSK9에 결합하지 않았으며; 대조적으로 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8은 hLDL-R에 대해 경쟁시 hPCSK9 및 hPCSK9_D374Y 돌연변이체에 대해 강한 경쟁 결합을 나타내었다. 상기 정합된 IC50 값들을 하기 표 2뿐만 아니라 도 2(A 및 B)에 나타낸다. 리포칼린 뮤테인(서열번호 3, 4 및 6-9)에 대한 경쟁적인 작용 방식을 야생형 및 돌연변이 PCSK9 모두와 함께 나타내었다. hPCSK9를 사용하는 경쟁 ELISA에서 IC50 값은 오직 25 nM의 고정 농도에 의해서만 영향을 받는다. 0.25 nM hPCSK9_D374Y 돌연변이체를 사용하는 경쟁 ELISA에서, IC50 값은 리포칼린 뮤테인의 친화성뿐만 아니라 고정된 돌연변이체 농도에 의해서 영향을 받는다.
분자 |
hPCSK9
wt
IC50[nM] |
hPCSK9
_
D374Y
IC50[nM] |
서열번호 3 | 13.8 | 0.13 |
서열번호 4 | 6.2 | 0.37 |
서열번호 6 | 10.1 | 0.21 |
서열번호 7 | 13.2 | 0.13 |
서열번호 8 | 10.7 | 0.32 |
실시예
8:
PCSK9에
대한 전형적인
리포칼린
뮤테인의
특이성 및 종 교차반응성
리포칼린 뮤테인의 특이성 및 종 교차반응성(도 3(A-D))을 결합 ELISA에서 분석하였으며, 그의 원리는 하기와 같았다: 비오틴화된 리간드(인간 PCSK9, 인간 PCSK9_D374Y, 마우스 PCSK9, 및 키노몰구스 PCSK9)를 뉴트라비딘-코팅된 ELISA 플레이트상에서 포획하고 가변 농도의 리포칼린 뮤테인을 가하였다. 결합된 리포칼린 뮤테인을 토끼 항-스트렙태그 II 항체(진스크립트(GenScript), Cat. No. A00626) 및 HRP-표지된 항-토끼-IgG 항체(잭슨 임뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch), Cat. No. 211-035-109)로 검출하였다.
하기의 상세한 실험 프로토콜에서, 배양 및 세척 단계를 실시예 7의 경쟁 ELISA 프로토콜에서 상술한 바와 같이 수행하였다. 형광 측정에 적합한 A384-웰 플레이트(그레이너(Greiner) 플루오트랙(FLUOTRAC)(상표) 600, 검은색 편평 바닥, 고-결합)를 20 ㎕의 뉴트라비딘으로 PBS 중의 5 ㎍/㎖의 농도로 4 ℃에서 밤새 코팅하였다. 세척 후에, 상기 뉴트라비딘-코팅된 웰을 실온에서 1시간 동안 100 ㎕의 차단 완충제(PBS-T/BSA)로 차단하였다. 다시 세척 후에, 20 ㎕의 비오틴화된 리간드, 인간 PCSK9, 인간 PCSK9_D374Y, 마우스 PCSK9 또는 키노몰구스 PCSK9를 PBS-T/BSA 중의 1 ㎍/㎖의 농도로 실온에서 1시간 동안 가하였다. 과잉의 리간드를 추가의 세척 단계에 의해 제거하였다.
리포칼린 뮤테인 용액의 농도를 100 nM로 조절하고 이어서 용액들을 PBS-T/BSA 중에서 2 nM까지 1:3 비로 연속 희석하였다. 20 ㎕ 부피의 희석물을 상기 384-웰 플레이트로 옮기고 실온에서 1시간 동안 결합되게 하였다.
배양 후에, 잔류 상등액을 버리고 PBS-T/BSA 중에서 1:5.000 희석된 항-스트렙태그II 항체 20 ㎕를 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 상등액을 다시 버렸다. 결합된 항-스트렙태그 II 항체를 검출하기 위해서, 20 ㎕의 마우스 항-토끼 IgG-HRP를 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 20 ㎕의 형광원 HRP 기질(콴타블루, 피어스(Pierce))을 각 웰에 가하고, 상기 반응을 15분간 진행시켰다. 상기 플레이트상의 모든 웰의 상대 형광 단위(RFU)의 형광 강도를 사파이어(Safire) 미세플레이트 판독기(테칸)를 사용하여 판독하였다. 최대 형광 신호가 50%까지 도달하는 리포칼린 뮤테인 농도(EC50)를 획득하기 위해서, 상기 곡선들을 비선형 회귀에 의해, 자유 매개변수로서 최대 상대 형광 RFUmax 및 EC50 값과 함께, RFU = RFUmax·c(리포칼린 뮤테인)/(EC50+c(리포칼린 뮤테인))에 따라 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다. 곡선 정합을 그래프패드 프리즘 4 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.
요약하면, 인간 PCSK9, 인간 PCSK9_D374Y 돌연변이체, 마우스 PCSK9 또는 키노몰구스 PCSK9에 대한 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9의 결합이 검출될 수 있었던 반면, 음성 대조군 서열번호 2는 이들 표적 중 어느 것에도 결합을 나타내지 않았다. 상기 정합된 EC50 값을 하기 표 3에 나타낸다. 인간 PCSK9 및 키노몰구스 PCSK9에 대한 EC50 값은 필적할만하며, 이는 상기 리포칼린 뮤테인이 키노몰구스 원숭이 PCSK9와 완전히 교차반응성임을 나타낸다. 마우스 PCSK9에 대한 친화성은 유사하거나 10배까지 더 낮은 반면 인간 PCSK9_D374Y 돌연변이체에 대한 EC50 값은 인간 PCSK9에 대해 획득된 값과 유사하다.
분자 |
hPCSK9
EC50[nM] |
hPCSK9
D374Y EC50[nM] |
mPSCK9
EC50[nM] |
cPCSK9
EC50[nM] |
서열번호 3 | 1.6 | 1.2 | 4.4 | 1.8 |
서열번호 4 | 2.4 | 1.6 | 21.8 | 2.9 |
서열번호 5 | 5.1 | 2.9 | 30 | 5.7 |
서열번호 6 | 3.1 | 2.1 | 20.1 | 3.7 |
서열번호 7 | 2.8 | 0.8 | 16.3 | 3.8 |
서열번호 8 | 4.4 | 1.4 | 10.1 | 6.1 |
서열번호 9 | 5.6 | 1.1 | 16.2 | 8.4 |
실시예
9: 세포 기재 분석에서
Dil
-표지된 LDL 흡수의 하향조절의
리포칼린
뮤테인 매개된 복원
세포 기재 분석을 사용하여 표면 LDL-R 분자 수의 PCSK9-매개된 감소를 중화시키고 결과적으로 HepG2 세포에서 하향조절된 LDL 흡수를 복원시키는 PCSK9-결합 리포칼린 뮤테인(서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8)의 능력을 입증하였다. 서열번호 2는 음성 대조군으로서 제공되었다.
이에 관하여, HepG2 세포를 96-웰 폴리-d-리신-코팅된 플레이트(그레이너, 955946)에 10% FCS(송아지 태아 혈청)를 함유하는 100 ㎕/웰 DMEM(PAN P04-04510) 중의 60,000 세포/웰의 밀도로 도말하였다. 24시간 후에 상기 배지를 1% FCS(100 ㎕/웰)를 함유하는 DMEM으로 교환하였다. 18시간 후에 상기 배지를 제거하고 FCS 없이 20 ㎍/㎖ LDL-보디피(Bodipy)(등록상표)(인비트로젠, L3483)를 함유하는 50 ㎕ DMEM으로 교환하였다(세척 단계 없이). 4000 nM의 농도에서 출발하여 리포칼린 뮤테인의 연속적인 1:2 희석을 수행하였다. 하나의 희석 시리즈를 15 ㎍/㎖ PCSK9를 함유하는 DMEM에서 제조하고 대조군으로서 순수한 DMEM 중에서 또 다른 하나를 제조하였다. 리포칼린 뮤테인 및 PCSK9를 30분 동안 실온에서 예비배양하고 이어서 50 ㎕를 상기 세포에 가하여 100 nM의 최종 PCSK9 농도를 생성시켰다. 상기 플레이트상의 전체 샘플 부피는 100 ㎕이었으며 모든 샘플을 5회 반복해서 측정하였다. LDL 및 PCSK9 부재의 DMEM, LDL 및 PCSK9가 있는 DMEM, 및 LDL은 있지만 PCSK9는 없는 DMEM 중의 세포를 대조군으로서 사용하였다.
상기 샘플들이 있는 플레이트를 37 ℃에서 6시간 동안 배양한 후에 세포를 PBS로 세척하였다. 웰을 100 ㎕ PBS로 충전하고 세포의 형광을 BMG 페라스타(PheraStar) 판독기를 사용하여 485/535 ㎚에서 판독하였다.
IC50 값을 측정하기 위해서 상기 5개 반복물의 최고 및 최저값을 제외하고 남아있는 각각의 데이터 점에 대한 표준 및 표준 편차를 계산하였다. 곡선들을 비선형 회귀 "S자 용량-반응, 가변 기울기" 모델(5PL 정합)을 사용하여 그래프패드 프리즘 4에 의해 정합시켰다. 데이터를 자극 및 비-자극 세포(PCSK9가 존재/부재하는 세포)의 값에 의해 표준화하였다. 상기 정합된 곡선들을 도 4에 나타내며 계산된 IC50 값을 하기 표 4에 요약한다.
분자 | IC50[nM] |
서열번호 3 | 71.8 |
서열번호 4 | 85.8 |
서열번호 6 | 44.5 |
서열번호 7 | 95.8 |
서열번호 8 | 81.2 |
실시예
10:
PCSK9에
대한 추가적인
리포칼린
뮤테인의
친화성
비오틴화된 인간 PCSK9(hPCSK9-Bio)에 대한 추가적인 리포칼린 뮤테인의 결합 친화성을 측정하기 위해서, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기재 분석을 바이아코어 T200 장비(GE 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. 상기 SPR 친화성 분석(도 5(A-C))을 위해서 비오틴 캡쳐 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하였다.
각각의 측정 주기에서, 비오틴 캡쳐 시약(GE 헬쓰케어)을 상기 기준 및 센서 칩 CAP(GE 헬쓰케어)의 측정 채널에 2 ㎕/분의 유량으로 5분간 적용하였다. hPCSK9-Bio를 1 ㎍/㎖의 농도로 상기 측정 채널상에 10 ㎕/분의 유량으로 2분간 주입하였다. 상기 친화성을 측정하기 위해서, 서열번호 13-28의 리포칼린 뮤테인의 3 내지 4개 희석물을 HBS-EP + 완충제 중에서 제조하고 상기 뮤테인들에 대해서 128, 32, 8 및 2 nM의 농도를 사용하여 상기 칩 표면에 적용하였다. 상기 결합 분석을 3분의 접촉 시간, 15분의 해리 시간 및 30 ㎕/분의 유량 적용으로 수행하였다. 모든 측정을 25 ℃에서 수행하였다. 상기 센서 칩 CAP 표면의 재생을 0.25 M NaOH(2 분)와 함께 6M 구아니딘-HCl의 주입에 이어서 흐르는 완충제에 의한 여분의 세척 및 2분의 안정화 기간으로 성취하였다. 상기 측정에 앞서, 3개의 연속적인 재생 단계들로 이루어지는 하나의 컨디셔닝 주기를 수행하였다. 데이터를 바이아코어 T200 평가 소프트웨어(V 1.0)로 평가하였다. 이중 참조를 사용하였다. 1:1 결합 모델을 사용하여 원 데이터를 정합시켰다.
상기 리포칼린 뮤테인 중 일부에 대해 생성된 정합 곡선들을 도 5에 도시한다. 즉, 서열번호 13(도 5C), 서열번호 20(도 5A) 및 서열번호 22(도 5B)는 높은 친화성으로 인간 PCSK9에 결합하였다. 모든 뮤테인들에 대한 결합률 상수 ka 또는 kon, 해리율 상수 kd 또는 koff 및 생성되는 해리 상수 KD를 하기 표 5에 요약한다.
분자
|
K on [M -1 *s -1 ] | K off [s -1 ] | K D [nM] |
서열번호 13 | 2.75E+05 | 8.77E-05 | 0.32 |
서열번호 14 | 2.56E+05 | 1.05E-04 | 0.41 |
서열번호 15 | 2.78E+05 | 1.07E-04 | 0.38 |
서열번호 16 | 2.55E+05 | 1.29E-04 | 0.51 |
서열번호 17 | 2.49E+05 | 1.11E-04 | 0.45 |
서열번호 18 | 3.13E+05 | 1.11E-04 | 0.35 |
서열번호 19 | 2.47E+05 | 1.32E-04 | 0.53 |
서열번호 20 | 3.13E+05 | 9.73E-05 | 0.31 |
서열번호 21 | 2.45E+05 | 1.37E-04 | 0.56 |
서열번호 22 | 7.53E+05 | 2.63E-04 | 0.35 |
서열번호 23 | 8.36E+05 | 1.76E-04 | 0.21 |
서열번호 24 | 3.67E+05 | 1.15E-04 | 0.31 |
서열번호 25 | 4.36E+05 | 1.05E-04 | 0.24 |
서열번호 26 | 6.68E+05 | 2.30E-04 | 0.34 |
서열번호 27 | 7.34E+05 | 3.10E-04 | 0.42 |
서열번호 28 | 6.84E+05 | 1.98E-04 | 0.29 |
실시예
11:
PCSK9에
대한 추가적인
리포칼린
뮤테인의
종 교차반응성
비오틴화된 인간, 키노몰구스 원숭이 및 마우스 PCSK9에 대한 리포칼린 뮤테인 서열번호 13, 서열번호 20 및 서열번호 22의 결합 친화성을 측정하기 위해서, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기재 분석을 바이아코어 T200 장비(GE 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. 상기 SPR 친화성 분석(도 6(A-C))을 위해서 비오틴 캡쳐 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하였다.
하기의 실험 프로토콜에서, 포획, 샘플 결합 및 재생 단계뿐만 아니라 데이터 평가를 실시예 10에서 상술한 바와 같이 수행하였다. 상기 친화성을 측정하기 위해서, 상기 뮤테인들의 4개의 희석물을 HBS-EP + 완충제 중에서 제조하고 각각 128, 32, 8 및 2 nM의 농도를 사용하여 상기 칩 표면에 적용하였다.
서열번호 20에 대해 생성된 정합 곡선을 도 6에 도시한다. 상기 데이터는 서열번호 20이 높은 친화성으로 인간 PCSK9(도 6A) 및 키노몰구스 원숭이 PCSK9(도 6B)에 결합하였음을 보인다. 마우스 PCSK9에 대한 친화성(도 6C)은 낮다. 결합률 상수 ka 또는 kon, 해리율 상수 kd 또는 koff 및 생성되는 해리 상수 KD를 하기 표 6에 요약한다.
리간드
|
분자
|
K on | K off | K D |
[M -1 *s -1 ] | [s -1 ] | [nM] | ||
인간 PCSK9 | 서열번호 13 | 2.62E+05 | 8.31-05 | 0.32 |
키노 PCSK9 | 서열번호 13 | 2.16E+05 | 9.40-05 | 0.44 |
마우스 PCSK9 | 서열번호 13 | 1.76E+05 | 3.12-04 | 1.77 |
인간 PCSK9 | 서열번호 20 | 2.49E+05 | 7.79-05 | 0.31 |
키노 PCSK9 | 서열번호 20 | 2.00E+05 | 1.03-04 | 0.52 |
마우스 PCSK9 | 서열번호 20 | 1.77E+05 | 3.51-04 | 1.98 |
인간 PCSK9 | 서열번호 22 | 6.63E+05 | 2.58-04 | 0.39 |
키노 PCSK9 | 서열번호 22 | 3.86E+05 | 2.76-04 | 0.81 |
마우스 PCSK9 | 서열번호 22 | 3.21E+05 | 6.38-04 | 1.99 |
실시예
12: 용액 중에서
PCSK9에
대한 추가적인
리포칼린
뮤테인의
결합
용액 중에서 비오틴화된 인간 PCSK9(hPCSK9-Bio)에 대한 리포칼린 뮤테인 및 그의 PEG화된 변이체(여기에서, 분지된 PEG40을 갖는)의 결합을 경쟁 전기화학발광(ECL) 분석 포맷을 사용하여 시험관내에서 시험하였다(도 7). 상기 실험에서, 일정한 농도의 hPCSK9-Bio를 가변 농도의 리포칼린 뮤테인 서열번호 13, 서열번호 20 및 서열번호 22뿐만 아니라 PEG화된 변이체 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32와 함께 1시간 동안 배양하였다. 용액 중에서 상기 예비-배양 후에, 1회 분액의 상기 리포칼린 뮤테인/PCSK9 혼합물을 단클론 기준 항체(서열번호 29의 경쇄 및 서열번호 33의 중쇄를 포함한다)로 코팅된 ECL 플레이트로 옮겨 상기 리포칼린 뮤테인(PEG화된 및 PEG화되지 않은 형태)에 의해 차단되지 않은 hPCSK9의 농도를 측정하였으며 따라서 상기는 상기 항체에 의해 여전히 결합될 수 있었다(도 7). 상기 리포칼린 뮤테인에 대한 경쟁 작용 방식을 hPCSK9-Bio와 함께 나타내었다.
모든 배양 단계들을 300 rpm에서 진탕하면서 수행하고, 상기 플레이트를 각 배양 단계 후에 80 ㎕ PBS-T 완충제(PBS, 0.05% 트윈 20)로 바이오텍 ELx405 셀렉트 CW 세척기를 사용하여 5회 세척하였다. 상기 첫 번째 단계에서, 384-웰 MSD 플레이트를 20 ㎕의 기준 항체로 4 ℃에서 밤새 PBS 중의 5 ㎍/㎖의 농도로 코팅하였다. 세척 후에, 상기 LDL-R-코팅된 웰을 실온에서 1시간 동안 60 ㎕의 PBS-T/BSA(0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS 중의 2% BSA)로 차단하였다.
고정된 농도의 10 pM hPCSK9-Bio를 다양한 농도의 상기 뮤테인과 함께 용액 중에서, 100 nM의 출발 농도(PBS-T/BSA 완충제 중에서 1.7 pM 까지 1:3 비로 연속 희석되었다)를 사용하여 배양하였다. 실온에서 1시간의 배양 후에, 20 ㎕의 반응 혼합물을 항체-코팅된 ELISA 플레이트로 옮겨 실온에서 20분 동안 결합되지 않은(유리) PCSK9를 포획하였다. ELISA 판독 결과를 유리 hPCSK9 농도로 변환시키기 위해서(하기 결합된 hPCSK9-Bio의 검출 및 정량분석 참조), 10 nM(11 단계로 1:3 연속 희석된)로 출발하여 다양한 농도의 hPCSK9-Bio를 함유하는 표준 곡선을 PBS-T/BSA 중에서 제조하고 MSD 플레이트(메소스케일디스커버리)상에서 20분 동안 배양하였다.
결합된 hPCSK9-Bio의 검출 및 정량분석을 허용하기 위해서, 잔류 상등액은 버리고 20 ㎕의 설포-태그-표지된 스트렙트아비딘(메소 스케일 디스커버리)을 PBS-T/BSA 중의 1 ㎍/㎖의 농도로 가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 계면활성제(메소 스케일 디스커버리)를 갖는 35 ㎕의 2x MSD 판독 완충제를 각 웰에 가하고 전기화학발광(ECL) 신호를, 섹터(SECTOR) 이미저 2400(메소 스케일 디스커버리)을 사용하여 15분 내에 측정하였다.
상기 평가를 하기와 같이 수행하였다: 유리 PCSK9 농도 c(hPCSK9)유리를 상기 측정된 표준 곡선을 사용하여 ECL로부터 나란히 계산하고 리포칼린 뮤테인 농도, c(리포칼린 뮤테인)에 대해 플롯팅하였다. PCSK9/기준 항체 복합체의 형성을 50%까지 차단시키는 리포칼린 뮤테인 농도(IC50)를 획득하기 위해서, 상기 곡선들을 비선형 회귀에 의해, 자유 매개변수로서 총 추적자 농도 c(PCSK9)tot 및 IC50 값과 함께, c(PCSK9)유리 = c(PCSK9)tot/(1+c(리포칼린 뮤테인)/IC50)에 따라 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다.
요약하면, 리포칼린 뮤테인 서열번호 13, 서열번호 20 및 서열번호 22뿐만 아니라 PEG화된 변이체 서열번호 30, 서열번호 31 및 서열번호 32는 기준 항체(서열번호 29 및 33을 포함한다)에 대해 경쟁시 hPCSK9-Bio에 대해 강한 경쟁 결합을 나타내었다. 상기 정합된 IC50 값들을 하기 표 7에 요약한다.
분자 | IC50[nM] |
서열번호13 | 0.16 |
서열번호20 | 0.11 |
서열번호22 | 0.09 |
서열번호30 | 0.19 |
서열번호31 | 0.53 |
서열번호32 | 0.37 |
실시예
13: 추가적인
리포칼린
뮤테인에
의한 LDL-R의
PCSK9
-
매개된
하향조절의 억제
인간 PCSK9는 LDL-R 내면화를 유도하며 따라서 세포 표면으로부터 LDL-R의 고갈을 유도한다. LDL-R의 발현을 본 분석에서 실시예 12에서 언급된 리포칼린 뮤테인(PEG화된 형태(여기에서 분지된 PEG40을 갖는)뿐만 아니라 PEG화되지 않은 형태)의 존재하에서 평가하여 LDL-R 세포 표면 고갈을 매개하는 PCSK9의 활성을 억제하는 상기 리포칼린 뮤테인의 효능을 측정하였으며, 이때 서열번호 2는 음성 대조군으로서 사용되었다.
HEPG2 세포(10,000 세포/웰)를 100 ㎍/㎖ 폴리-d-리신으로 예비-코팅한 384-웰 MSD(메소스케일 디스커버리) 플레이트 중에 24시간 부착되게 하였다. 이어서 전체 배지(1 ㎎/㎖ G418 및 10% FBS를 함유하는 DMEM)를 혈청이 결여된 또는 10% 지방단백질-결핍된 혈청을 함유하는 DMEM으로 교환하여 상기 세포 표면상에서 LDL-R의 최대 발현을 허용하였다. 이어서 세포를 PBS로 세척하고 리포칼린 뮤테인의 희석 시리즈를 100 nM PCSK9의 존재하에서 37 ℃에서 6시간 동안 배양하였다. 이어서 상기 혼합물을 순하게 톡톡 쳐서 버리고 이어서 상기 세포의 고정을 실온에서 20분간 로티(Roti)(등록상표)-히스토픽스(Histofix)의 첨가에 의해 수행하였다. 세포를 PBS로 2회 세척하고 차단 완충제(PBS/FC 4%/BSA 2%)와 함께 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 완충제를 서서히 버리고 차단 완충제 중의 1 ㎍/㎖의 염소 항-hLDL-R(R&D 시스템스, Cat. No. AF2148) 및 2 ㎍/㎖의 당나귀 항-염소-설포태그(MSD, Cat. No. R32AG-1)의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이어서 세포를 PBS로 2회 순하게 세척하고 무계면활성제 판독 완충제(MSD)를 가하였다. ECL 신호를 섹터 이미저 2400(MSD)을 사용하여 측정하였다. 상기 평가를 하기와 같이 수행하였다: ECL 신호를 경쟁자(여기에서, 리포칼린 뮤테인)의 부재하에서 PCSK9 활성에 대해 측정된 신호를 100% PCSK9 활성으로 설정하여 변환시켰다. 데이터를 그래프패드 프리즘 4 소프트웨어를 사용하여 공유 기울기를 갖는 S자 용량-반응 모델로 정합시켰다(도 8). 생성되는 IC50 및 IC90 값을 하기 표 8에 요약한다.
분자 | IC50[nM] | IC90[nM] |
서열번호 13 | 103.3 | 216.1 |
서열번호 20 | 91.7 | 192.0 |
서열번호 22 | 76.9 | 160.9 |
서열번호 30 | 82.6 | 172.8 |
서열번호 31 | 82.6 | 172.8 |
서열번호 32 | 70.7 | 147.8 |
실시예
14: 위치 포화 돌연변이유발에 의한 열-안정화된
PCSK9
-특이성
리포
칼린 뮤테인의 생성
PCSK9-특이성 뮤테인의 열 안정성을 개선시키기 위해서, 서열번호 13의 리포칼린 뮤테인을 79 및 105번 위치에서 돌연변이시켰다(도 14에 도시된 바와 같이). 서열번호 13의 열-안정화된 유도체의 라이브러리를 폴리머라제 쇄 반응에서 단독으로 또는 NNK 올리고뉴클레오티드의 반복 조립의 사용과 함께(예를 들어 WO2007/107563을 참조하시오) 상기 언급된 위치들의 포화된 무작위화를 이끌어내는 방식으로 생성시켰다. 같은 목적으로, 서열번호 22의 리포칼린 뮤테인을 92번 위치에서 히스티딘에서 프롤린으로 돌연변이시켰다(도 14에 도시된 바와 같이).
실시예 15: 선별에 의한 열-안정화된 PCSK9-특이성 뮤테인의 확인
실시예 14에 개시된 바와 같이, PCR 조립 후에 수득된 라이브러리 제제의 돌연변이유발된 중심 카세트를 테트라사이클린 프로모터의 조절하에서 리포칼린 뮤테인의 세균성 생성을 허용하는 벡터내로 삽입하였다(실시예 5에 개시된 바와 같이).
상기 최적화된 리포칼린 뮤테인의 친화성 순위를 위해서, PBS 중에서 희석된 항-스트렙-태그 항체(IBA, 괴팅엔)를 미세적정플레이트상에 코팅하고 20 ㎕의 BSA-차단된 배양물을 가하였으며, 이는 상기 플레이트상의 리포칼린 뮤테인의 특이적인 포획을 허용하였다. 상이한 농도(0.5 내지 5 nM)의 비오틴화된 PCSK9 단백질을 가하고 특이적으로-결합된 PCSK9 단백질을 광범위한 세척 후에 엑스트라비딘-HRP(시그마 알드리치, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로 검출하였다. 정량분석을 위해서, 20 ㎕ 콴타블루를 가하고 320 ㎚의 여기 파장 및 430 ㎚의 방출 파장에서 측정하였다.
열-안정화된 리포칼린 뮤테인의 선택을, 단지 리포칼린 뮤테인을 함유하는 세균성 추출물을 상기 PCSK9 표적과의 배양에 앞서 30분간 65 ℃ 이하로 가열하는 차이를 제외하고, 상술한 바와 동일한 방식으로 수행하였다. 상기 가열되지 않은 샘플에 비해 가열 단계 후에 영향을 받지 않은 결합 신호들을 나타낸 뮤테인들을 서열분석을 위해 선택하였다.
실시예 16: 최적화된 PCSK9-특이성 뮤테인의 용융 온도의 측정
PCSK9-특이성 뮤테인의 용융 온도를 측정하기 위해서, PBS(깁코(Gibco)) 중의 1 ㎎/㎖의 단백질 농도의 샘플을 모세관 나노DSC 장비(Q2000, TA 인스트루먼츠)를 사용하여 1C/분으로 주사하였다(25 내지 100 ℃). 상기 통합된 소프트웨어는 상기 나타난 온도기록도로부터 용융 온도(Tm)를 계산하였다.
2개의 리포칼린 뮤테인(서열번호 22 및 서열번호 13)에 대해 생성된 용융 온도를 상기 뮤테인으로부터 최적화된 유도체(서열번호 62-71)와 함께 하기 표 9에 요약한다. 예를 들어, 상기 데이터는 서열번호 63, 서열번호 64 및 서열번호 65의 Tm이 서열번호 13에 비해 현저하게 더 높고 용융의 개시가 13 ℃ 이하까지 이동했음을 나타낸다(도 12).
서열번호 |
Tm
[℃]
나노DSC |
용융의
개시[℃] |
서열번호 13 | 61 | 49 |
서열번호 65 | 72,8 | 62 |
서열번호 64 | 63,8 | 54 |
서열번호 66 | 69 | 53 |
서열번호 67 | 67,8 | 53 |
서열번호 68 | 65,1 | 55 |
서열번호 63 | 68,3 | 57 |
서열번호 69 | 63,7 | 55 |
서열번호 70 | 59,1 | 54 |
서열번호 71 | 65 | 56 |
서열번호 22 | 56 | 52 |
서열번호 62 | 59 | 53 |
실시예
17:
PCSK9에
대한 최적화된
리포칼린
유도체의 친화성
리포칼린 뮤테인의 전형적인 그룹의 비오틴화된 인간 PCSK9에 대한 결합 친화성을 측정하기 위해서, 표면 플라스몬 공명(SPR) 기재 분석을 바이아코어 T200 장비(GE 헬쓰케어)를 사용하여 수행하였다. 상기 SPR 친화성 분석을 위해서 비오틴 캡쳐 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하였다.
각각의 측정 주기에서, 비오틴 캡쳐 시약(GE 헬쓰케어)을 상기 기준 및 센서 칩 CAP(GE 헬쓰케어)의 측정 채널에 2 ㎕/분의 유량으로 5분간 적용하였다. 비오틴화된 PCSK9를 4 ㎍/㎖의 농도로 상기 측정 채널상에 10 ㎕/분의 유량으로 2분간 주입하였다. 상기 친화성을 측정하기 위해서, 서열번호 62-71의 3 내지 4개 희석물을 HBS-EP + (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20) 완충제 중에서 제조하고 128 nM, 32 nM, 8 nM 및 4 nM의 최종 농도를 사용하여 상기 칩 표면에 적용하였다. 상기 결합 분석을 3분의 접촉 시간, 20분의 해리 시간 및 30 ㎕/분의 유량 적용으로 수행하였다. 모든 측정을 25 ℃에서 수행하였다. 상기 센서 칩 CAP 표면의 재생을 0.25 M NaOH(2 분)와 함께 6M 구아니딘-HCl의 주입에 이어서 러닝 완충제(running buffer)에 의한 여분의 세척 및 2분의 안정화 기간으로 성취하였다. 상기 측정에 앞서, 3개의 연속적인 재생 단계들로 이루어지는 하나의 컨디셔닝 주기를 수행하였다. 데이터를 바이아코어 T200 평가 소프트웨어(V 1.0)로 평가하였다. 이중 참조를 사용하였다. 1:1 결합 모델을 사용하여 원 데이터를 정합시켰다.
서열번호 62-71의 리포칼린 뮤테인에 대해 생성된 정합 곡선들을 각각 도 13(A-J)에 도시한다. 상기 데이터는 열-안정화된 리포칼린 뮤테인(서열번호 62-71)의 친화성이 서열번호 13 및 서열번호 22의 리포칼린 뮤테인에 비해 완전히 유지됨을 나타낸다. 상기 리포칼린 뮤테인들에 대한 결합률 상수 ka 또는 kon, 해리율 상수 kd 또는 koff 및 생성되는 해리 상수 KD를 하기 표 10에 요약한다.
서열번호 | k on [M -1 *s -1 ] | k off [s -1 ] | K D [nM] |
서열번호 13 | 2,81E+05 | 6,84E-05 | 0,24 |
서열번호 65 | 2,39E+05 | 7,61E-05 | 0,32 |
서열번호 64 | 3,23E+05 | 7,25E-05 | 0,22 |
서열번호 66 | 2,51E+05 | 8,17E-05 | 0,33 |
서열번호 67 | 2,49E+05 | 7,60E-05 | 0,31 |
서열번호 68 | 2,63E+05 | 8,03E-05 | 0,31 |
서열번호 63 | 2,35E+05 | 7,84E-05 | 0,33 |
서열번호 69 | 2,63E+05 | 7,66E-05 | 0,29 |
서열번호 70 | 2,23E+05 | 7,39E-05 | 0,33 |
서열번호 71 | 2,72E+05 | 8,81E-05 | 0,32 |
서열번호 22 | 5,91E+05 | 2,19E-04 | 0,37 |
서열번호 62 | 4,98E+05 | 1,65E-04 | 0,33 |
실시예
18: 이
콜라이에서
PCSK9
-특이성
Tlc
뮤테인의
생성
PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인(서열번호 62, 82, 83 및 84)을 이 콜라이에서 발현시켰다. 각각의 리포칼린 뮤테인(서열번호 86, 87, 88 및 89)을 암호화하는 DNA를, T5 프로모터(서열번호 62, 82 및 84의 경우에) 또는 T7A3 프로모터(서열번호 83의 경우에)의 조절하에서 상기 뮤테인들의 세균성 생성을 허용하는 마찬가지로 절단된 벡터에 삽입하였다. 상기 뮤테인들을 음이온 교환 컬럼, 페닐 세파로스 컬럼, 젤 여과 컬럼 및 킬레이트화 컬럼(서열번호 82 및 84의 경우에)을 사용하는 컬럼 크로마토그래피들의 조합에 의해 세포 용해물로부터 정제하였다. 상기 정제된 뮤테인들을 최종적으로 PBS 중에 용해시켰다.
실시예 19: 바이아코어 분석
모든 과정을 25 ℃에서 바이아코어 T200(GE 헬쓰케어)으로 수행하였다. HBS-EP + 완충제(10 mM HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% 계면활성제 P20)를 러닝 완충제로서 사용하였다. PCSK9 단백질의 비오틴화를 표지화 시약, EZ-링크 설포-NHS-LC-LC-비오틴(써모 사이언티픽)을 사용하여 일반적인 방식으로 수행하고, 반응하지 않은 시약들은 회전 컬럼을 탈염시켜 제거하였다. 비오틴 캡쳐 키트(GE 헬쓰케어)를 사용하여 상기 비오틴화된 PCSK9 리간드를 센서 칩에 고정화시켰다. ss-DNA 올리고로 미리-고정화된, 상기 CAP 센서 칩상의 플로우셀(flowcell)을 스트렙트아비딘과 접합된 상보성 ss-DNA 올리고와 하이브리드화시킨 다음 비오틴화된 리간드를 주입하였다.
포획 실험을 위해서, 스트렙트아비딘-DNA 접합체를 20초 동안 2개의 플로우셀에 주입하고; 상기 비오틴화된 PCSK9 샘플을 러닝 완충제 중에서 1 ng/㎕로 희석하고 이어서 하나의 플로우셀에 1분간 10 ㎕/분으로 주입한 반면, 또 다른 플로우셀은 포획된 샘플 없이 방치하여 기준 표면을 제공하였다. 상기 포획 프로토콜을 20 RU 이하의 Rmax 값을 생성시키는 리간드 샘플의 포획 수준을 제공하도록 설계하였다.
각각의 동역학 실험을 위해서, 0.03 nM 내지 100 nM 범위의 가변 농도의 정제된 PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인을 분석물로서 제조하고, 300초 동안 30 ㎕/분으로 주입한 다음 30분 해리시켰다. 포획 및 기준 표면을 0.25 M 수산화 나트륨 중의 6 M 구아니딘 하이드로클로라이드의 2 분 펄스로 재생시켰다.
해리 상수(KD)를 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여 계산하였다. 원 데이터 세트를 바이아코어 T200 평가 소프트웨어(버전 1.0, GE 헬쓰케어)를 사용하여 분석하고, 상기 기준 플로우셀의 센서그램을 상기 샘플-포획된 플로우셀의 센서그램으로부터 감하였다.
실시예 20: 세포-비합류 PCSK9-LDLR TR-FRET 분석
분비된 PCSK9는 간 LDLR의 분해를 촉진하여, 혈청 LDL-C 수준의 증가를 유도한다. 따라서 PCSK9와 LDLR간의 상호작용을 방해하는 PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인은 LDLR이 혈장막으로 재순환하는 것을 증대시켜 LDL-C 흡수를 활성화시키고 결국 순환하는 LDL-C 수준을 낮춘다.
세포-비합류 TR-FRET 분석을 사용하여 PCSK9와 LDLR간의 결합에 대한 리포칼린 뮤테인(서열번호 62, 서열번호 82, 서열번호 83 및 서열번호 84)의 억제 효과를 측정하였다. 상기 분석에 사용되는 비오틴-표지된 hPCSK9(비오틴-hPCSK9)를 실온에서 1시간 동안 5배 몰 과잉의 EZ-링크 NHS 색원성 비오틴 시약(써모 사이언티픽)과의 배양에 의해 제조하고 과잉의 비오틴은 예시적인 NAP 컬럼(GE 헬쓰케어 라이프 사이언스)에 의해 제거하였다. 유로피움-표지된 LDLR(Eu-LDLR)을 선행 보고서에 개시된 바와 같이 제조하였다(문헌[Fisher TS, et al, J. Biol. Chem. (2007) 282(28), 20502-20512]).
세포-비합류 PCSK9-LDLR TR-FRET 분석을 384 웰 포맷으로 수행하였다. 최종 농도 20 nM의 비오틴-hPCSK9를 34 ㎎/㎖의 인간 혈청 알부민의 존재 또는 부재하에서 실온에서 2시간 동안 결합 완충제(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, 및 0.05%(w/v) BSA) 중의 여러 농도의 시험 리포칼린 뮤테인과 함게 배양하였다. 이어서 10 마이크로리터의 상기 비오틴-hPCSK9-리포칼린 용액 및 10 마이크로리터의 Eu-LDLR/알렉사-SA 용액(1.0 nM의 Eu-LDLR, 80 nM의 스트렙트아미딘/알렉사 플루오르 647 접합체(인비트로젠), 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, 및 0.05%(w/v) BSA)을 상기 웰에서 혼합하고 암실에서 실온에서 2시간 동안 배양한 다음 냉장고에서 밤새 배양하였다. 샘플들을 BMG 랩 시스템스 루비스타(Lab Systems Rubystar) 판독기 세트를 사용하여 판독하여 1100 ms/웰의 총 판독 시간 동안 50-μs 적분 지연 및 200-μs 적분 시간으로 20 플래시/웰을 판독하였다. FRET를 665/620 ㎚의 방출비의 측정에 의해 정량분석하였다. TR-FRET 비를 하기 공식으로부터 계산하였다.
TR-FRET 비 = (665 ㎚에서의 카운트/620 ㎚에서의 카운트) x 10,000
PCSK9/LDLR 복합체의 형성을 50%까지 차단시키는 리포칼린 뮤테인 농도(IC50)를 획득하기 위해서, 곡선들을 비선형 회귀에 의해 단일-부위 결합 모델로 정합시켰다. 곡선 정합을 칼레이다 그래프(Kaleida Graph) ver 4.1.1 소프트웨어(시너지 소프트웨어(Synergy Software))를 사용하여 수행하였다.
상기 생성된 계산된 IC50 값을 하기 실시예 21의 표 11에 요약한다.
실시예 21: PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인의 생체내 혈장 반감기
특정한 신체 영역, 유기체, 조직, 기관 또는 세포를 표적화할 수 있는 모이어티와의 리포칼린 뮤테인의 접합은 상기 신체에서의 상기 리포칼린 뮤테인의 반감기를 연장시킬 수 있다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민(HSA)의 반감기는 약 19일인 것으로 보고되었으며(문헌[Biochimica et Biophysica Acta 1830; 5526-5534, 2013]) 따라서 PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인(서열번호 62 및 서열번호 82)을, HSA에 결합하고 따라서 상기 리포칼린 뮤테인에 대해서 긴 신체 중 반감기를 나타내는 알부민 결합 단백질(예를 들어 G148 및 서열번호 85)에 접합시켰다.
알부민 결합 단백질과의 접합 효과를 관찰하고 PCSK9-특이성 리포칼린 뮤테인의 긴 혈장 반감기를 측정하기 위해서, 다수의 시험된 리포칼린 뮤테인들을 정상 래트에게 정맥내 투여하고 상기 리포칼린 뮤테인의 혈장 농도를 샌드위치 ELISA를 사용하여 측정하였다. 혈장 반감기의 측정을 위한 혈액 샘플링을 시험 리포칼린 뮤테인의 투여에 따른 다양한 시점들에서 수행하였다.
4개의 리포칼린 뮤테인에 대해 생성된 혈장 반감기를 하기와 같이 표 11에 요약한다. 예를 들어 상기 데이터는 HSA에 결합할 수 있는 모이어티에 접합된 리포칼린 뮤테인이 리포칼란 뮤테인 단독 보다 긴 반감기를 나타냄을 보인다.
분자 | 바이아코어_항PCSK9 |
바이아코어_항HSK |
LDLR결합 (IC50,nM) |
T/2 (h) |
|||||
ka (1/Ms) |
ka (1/s) |
KD (M) |
ka (1/Ms) |
ka (1/s) |
KD (M) |
|
|||
w/o HSA | w/HSA | ||||||||
서열번호 62 | 1.1 E+05 |
2.9 E-04 |
2.6 E-10 |
- | - | - | 1.36 | 0.93 | 0.99 |
서열번호 82 | 1.5 E+05 |
3.7 E-04 |
2.5 E-10 |
- | - | - | 1.68 | 1.33 | 0.86 |
서열번호 83 | 7.1 E+05 |
2.7 E-04 |
3.8 E-10 |
2.2 E+06 |
4.2 E-05 |
1.9 E-11 |
1.93 | 1.26 | 24 |
서열번호 84 | 7.5 E+05 |
3.0 E-04 |
3.9 E-10 |
2.4 E+06 |
3.0 E-05 |
1.3 E-11 |
1.09 | 1.09 | 32 |
본 발명에 예시적으로 개시된 실시태양들을 본 발명에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재하에서 적합하게 실행할 수 있다. 따라서, 예를 들어 "포함하는", "구성되는", "함유하는" 등의 용어들은 광범위하고 제한없이 판독될 것이다. 추가로, 본 발명에 사용되는 용어 및 표현들은 제한이 아닌 개시의 용어로서 사용되었으며, 상기와 같은 용어 및 표현들의 사용에서 도시되고 개시된 특징들 또는 그의 부분들의 임의의 등가물을 제외하고자 하는 것이 아니라, 다양한 변형들이 특허청구된 발명의 범위내에서 가능함을 인정하는 것이다. 따라서, 본 실시태양들을 바람직한 실시태양 및 임의의 특징들에 의해 구체적으로 개시하였지만, 이들의 변형 및 변화들이 당해 분야의 숙련가들에 의해 복원될 수 있으며, 상기와 같은 변형 및 변화들이 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주됨은 물론이다. 본 발명에 개시된 모든 특허, 특허 출원, 교과서 및 동료 평가된 공보들은 내용 전체가 본 발명에 참고로 인용된다. 더욱 또한 본 발명에 참고로 인용된 참고문헌 중의 정의 또는 용어의 사용이 본 발명에 제공된 용어의 정의와 불일치하거나 상반되는 경우, 본 발명에 제공된 상기 용어의 정의를 적용하며 상기 참고문헌 중의 상기 용어의 정의는 적용되지 않는다. 또한 일반적인 명세내에 있는 보다 좁은 종 및 아속 그룹도 또한 본 발명의 부분을 형성한다. 이는 삭제된 물질을 본 발명에서 구체적으로 인용하든 인용하지 않든 간에, 임의의 주제 물질을 상기 속으로부터 제거한다는 단서 또는 부정적인 한정과 함께 본 발명의 일반적인 개시를 포함한다. 또한, 특징들이 마쿠시 그룹에 의해 개시되는 경우, 당해 분야의 숙련가들은 상기 명세가 또한 상기 마쿠시 그룹의 임의의 개별적인 구성원 또는 구성원들의 하위그룹에 의해 개시됨을 알 것이다. 추가의 실시태양들은 하기 특허청구범위로부터 자명해질 것이다.
SEQUENCE LISTING
<110> Daiichi Sankyo Co., Ltd.
<120> NOVEL BINDING PROTEINS FOR PCSK9
<130> IPA150822-DE
<150> US 61/781,511
<151> 2013-03-14
<150> EP13175023.4
<151> 2013-07-04
<160> 89
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 158
<212> PRT
<213> Human
<220>
<223> Human tear lipocalin
<400> 1
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Leu Glu Ser Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn
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Leu Glu Ala Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val
50 55 60
Lys Ala Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp
65 70 75 80
Gly Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His
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Tyr Ile Phe Tyr Cys Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg Gly
100 105 110
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115 120 125
Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile
130 135 140
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<223> Mutein of human tear lipocalin
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50 55 60
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<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 16
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Ser Arg Gly Asp Ala Ile Trp Thr Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Met Tyr Ala Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Thr Met Gly Gly Ser His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Pro Tyr Gln Gly Ala Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 17
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 17
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Ser Arg Gly Asp Ala Ile Trp Thr Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Met Tyr Ala Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Ser Gly Gly Ser His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Pro His Gln Gly Ala Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 18
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 18
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Ser Arg Gly Asp Ala Ile Trp Thr Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Ala Leu Glu Gly Gly Gly Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Met Tyr Ala Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Val Val Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Gly Ala Tyr Ile Thr Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
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100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
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<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 19
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
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100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 20
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 20
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Ser Arg Gly Asp Ala Ile Trp Thr Ser Val
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 21
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 21
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Ser Arg Gly Asp Ala Ile Trp Thr Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Met Tyr Ala Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Met Gly Gly Ser His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Leu Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 22
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 22
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 23
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 23
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
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35 40 45
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 24
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 24
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gln Gly Gly Ser His
65 70 75 80
Val Glu Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 25
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 25
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Asp Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Val Ser Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Leu Tyr
85 90 95
Ser Val Gly Asn Leu Gln Gly Glu Thr Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 26
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 26
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Val Gly Gly Ser His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Lys Leu Gln Gly Glu Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 27
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 27
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Gly Ser Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asn Trp Arg Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gln Gly Gly Ser His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Lys Leu Gln Gly Glu Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 28
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 28
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Gly Ala Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Thr Gly Gly Ser His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Lys Leu Gln Gly Glu Pro Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 29
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of the light chain of antibody 31H4
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<400> 29
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly
20 25 30
Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn
35 40 45
Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala
85 90 95
Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser
100 105 110
Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
145 150 155 160
Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp
165 170 175
Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln
180 185 190
Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu
195 200 205
Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly
210 215 220
Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
<210> 30
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant of mutein shown in SEQ ID NO: 22
<400> 30
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Arg Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gln Gly Asp Arg His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
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100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 31
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant of mutein shown in SEQ ID NO: 13
<400> 31
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Ser Arg Gly Asp Ala Ile Trp Thr Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Met Tyr Ala Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Arg Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Thr Met Gly Gly Ser His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser Pro Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 32
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Variant of mutein shown in SEQ ID NO: 20
<400> 32
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Phe Ser Arg Gly Asp Ala Ile Trp Thr Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 33
<211> 472
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Amino acid sequence of the heavy chain of antibody 31H4
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<400> 33
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Ser Tyr Ala
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Asp Phe Trp Ser Ala Tyr Tyr Asp Ala
115 120 125
Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145 150 155 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165 170 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180 185 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195 200 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210 215 220
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225 230 235 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245 250 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260 265 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275 280 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290 295 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305 310 315 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325 330 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340 345 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355 360 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370 375 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385 390 395 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405 410 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420 425 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435 440 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450 455 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 34
<211> 692
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Full-length human proprotein convertase subtilisin/kexin type 9
(PCSK9) according to SWISS PROT Data Bank Accession NO: Q8NBP7
<400> 34
Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu
20 25 30
Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu
35 40 45
Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe
50 55 60
His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val
65 70 75 80
Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg
85 90 95
Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu
100 105 110
His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly
115 120 125
Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu
130 135 140
Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg
145 150 155 160
Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly
165 170 175
Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp
180 185 190
His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val
195 200 205
Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp
210 215 220
Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly
225 230 235 240
Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln
245 250 255
Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg
260 265 270
Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro
275 280 285
Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp
305 310 315 320
Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val
325 330 335
Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly
340 345 350
Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile
355 360 365
Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly
370 375 380
Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu
385 390 395 400
Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile
405 410 415
His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp
420 425 430
Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr
435 440 445
His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His
450 455 460
Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Ile Ala Arg Cys Ala Pro Asp
465 470 475 480
Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg
485 490 495
Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His
500 505 510
Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu
515 520 525
Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala
530 535 540
Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr
545 550 555 560
Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro
565 570 575
Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gln Pro Asn Gln Cys Val Gly His Arg
580 585 590
Glu Ala Ser Ile His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys
595 600 605
Lys Val Lys Glu His Gly Ile Pro Ala Pro Gln Glu Gln Val Thr Val
610 615 620
Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly
625 630 635 640
Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val
645 650 655
Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Glu Ala Val
660 665 670
Thr Ala Val Ala Ile Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gln Ala Ser
675 680 685
Gln Glu Leu Gln
690
<210> 35
<211> 580
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Plasmid pTLPC26 (XbaI-HindIII)
<400> 35
tctagataac gagggcaaaa aatgaaaaag acagctatcg cgattgcagt ggctctggct 60
ggcttcgcta ccgtagcgca ggccgcctca gacgaggaga ttcaggatgt gtcagggacg 120
tggtatctga aggccatgac ggtggacagg gagttccctg agatgaatct ggaatcggtg 180
acacccatga ccctcacgac cctggaaggg ggcaacctgg aagccaaggt caccatgctg 240
ataagtggcc ggagccagga ggtgaaggcc gtcctggaga aaactgacga gccgggaaaa 300
tacacggccg acgggggcaa gcacgtggca tacatcatca ggtcgcacgt gaaggaccac 360
tacatctttt actctgaggg cgagctccac gggaagccgg tcccaggggt gtggctcgtg 420
ggcagagacc ccaagaacaa cctggaagcc ttggaggact ttgagaaagc cgcaggagcc 480
cgcggactca gcacggagag catcctcatc cccaggcaga gcgaaaccag ctctccaggg 540
agcgcttggt ctcacccgca gttcgaaaaa taataagctt 580
<210> 36
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 3
<400> 36
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtccg 300
tatcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 37
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 4
<400> 37
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gattggcaat gtgatactgg gctgtggact tctgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atgtcttacg caggggcatt tcaggaggtg 180
aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgag 300
tgtggggggt ggcctgttcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 38
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 5
<400> 38
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gaccacgaat ggaacggcca ttactatacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgtcttatc gcggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgccggg tggccaacat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggttct 300
tggccgggct atccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 39
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 6
<400> 39
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcaccg acaactctcc catgtttacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgcagtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgatagg tggcacccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtgcc 300
gaacgcggcc gtccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 40
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 7
<400> 40
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gaccgcttta aaatcgccag ctggccccgc agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggt ggggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgcaggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtaat 300
cgtcagggcg atccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 41
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 8
<400> 41
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcaagg gccccacgcc cctctggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgttccatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgtacgg tggccgtcat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtgcc 300
agcgtgggca acccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 42
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 9
<400> 42
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacacggaac acttagccga ttgggcgaat agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgcaccaac cgggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgatagg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtgcc 300
tatccgggca gcccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 43
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 10
<400> 43
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gaccgcgcgg acatgggcga ttggcccaat agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgttcaccc gcggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgacggg tggcgaacat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtacg 300
ttaacaggcc gtccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 44
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 11
<400> 44
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gactggcgtc tcgataatga actctggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgcaggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtccg 300
cgtaatggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 45
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 12
<400> 45
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgactttg 60
gattggcaat gtgatactgg gctgtggact tctgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atgtcttacg caggggcatt tcaggaggtg 180
aaagcagtgt tagagaagac agatgaaccg ggtaaatata cggccgatgg cggtaaacat 240
gttgcctata tcattcgcag ccatgtgaaa gatcattaca tcttttatag cgagggcgag 300
tgtggggggt ggcctgttcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 46
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 13
<400> 46
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccacgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcatccgtag ccctgtcaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
catcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 47
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 14
<400> 47
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggtct tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcactcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtccg 300
catcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 48
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 15
<400> 48
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggact agcgtaacac cgatgaccct gactatactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccagggagtc 180
aaagtggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgatggg tggcagccaa 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttatcc cgaaggtccg 300
tatcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 49
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 16
<400> 49
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgttacgc caatgactct gactaccctt 120
gaaggcggca atctggaggc taaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccacgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccacgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
tatcagggcg cgccggttcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 50
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 17
<400> 50
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttttcga ggggggatgc gatttggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ctggccggag ccaggaggtg 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgccagtgg gggctctcat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtcct 300
catcaggggg ctccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 51
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 18
<400> 51
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactgcactg 120
gagggcggcg gcctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagtggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgatggg tggcagccat 240
ggggcgtaca tcactcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtccg 300
tatcggggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 52
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 19
<400> 52
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acatggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtctg 300
tatcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 53
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 20
<400> 53
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgagccg ggcaaataca ccgtgatggg aggtagccat 240
gtggcgtcca tcattcgtag ccatgttaag gatcactata tcttttaccc cgaaggtccg 300
tatcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 54
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 21
<400> 54
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacgc cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggta acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag tcaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgagccg ggcaaataca ccgcaatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tccttcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtccg 300
catcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 55
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 22
<400> 55
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gaccgcttta aaatcgccag ctggccccgc agcgtaactc cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggt ggggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgcaggg tgaccgccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtaat 300
cttcagggcg aaacggtccc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 56
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 23
<400> 56
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gaccgcttta aaatcgccag ctggccccgc agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gggggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggt ggggccgcag ccaggaagtc 180
aaagctgttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgcaggg tggtagccat 240
gtggagcata tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc caaaggtaat 300
cttcagggcg aaccggtccc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 57
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 24
<400> 57
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gaccgcttta aaatcgccag ctggccccgc agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggt ggggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgcaggg tggcagccat 240
gtggagtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtaat 300
cttcagggcg aaccggtccc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 58
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 25
<400> 58
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gaccgcttta aaatcgccag ctggccccgc agcgtaacac cgatgaccct gacaacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggt ggggccgcag ccaggatgtc 180
aaagcggttt taggaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgcaggg tgacagccat 240
gtgtcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcctttattc cgtaggtaat 300
cttcagggcg aaacggtccc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 59
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 26
<400> 59
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacaggttta agattgcttc gtggcctagg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggt ggggccggag ccaggaggtg 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgccgtggg gggctctcat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtaag 300
ttgcaggggg agccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 60
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 27
<400> 60
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacaggttta agattgggtc gtggcctagg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggc ggggccggag ccaggaggtg 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcccaggg gggctctcat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtaag 300
ctgcaggggg agccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 61
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 28
<400> 61
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacaggttta agattggtgc gtggccgagg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggt ggggccggag ccaggaggtg 180
aaagcggttt tagaaaagac cgacgaaccg ggcaaataca ccgccacggg gggctctcat 240
gtggcgtaca tcattcgtag ccatgttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtaag 300
ttgcaggggg agccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 62
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
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Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser Val
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Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
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Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser Pro Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
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Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
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Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
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Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 63
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
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100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
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Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
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<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 64
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 65
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 66
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<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 67
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
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<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 68
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
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<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 69
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<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 70
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<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 71
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115 120 125
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 62
<400> 72
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gaccgcttta aaatcgccag ctggccccgc agcgtaactc cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgaattggt ggggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccgcgcaggg tgaccgccat 240
gtggcgtaca tcattcgtag cccggttaaa gatcactata tcttttattc cgaaggtaat 300
cttcagggcg aaacggtccc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 73
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 63
<400> 73
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccgttatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcatccgtag ccctgtcaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
gggcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 74
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 64
<400> 74
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccgtgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcatccgtag ccctgtcaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
cgtcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 75
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 65
<400> 75
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<210> 76
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 66
<400> 76
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
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<210> 77
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 67
<400> 77
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aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccatgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcatccgtag ccctgtcaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
gttcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 78
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 68
<400> 78
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
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aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccatgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcatccgtag ccctgtcaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
ccgcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
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<210> 79
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 69
<400> 79
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
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gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccgttatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcatccgtag ccctgtcaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
aagcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 80
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 70
<400> 80
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccgtgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcatccgtag ccctgtcaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
aggcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 81
<211> 456
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 71
<400> 81
gcctcagacg aggagattca ggatgtgtca gggacgtggt atctgaaggc catgacggtg 60
gacttcagcc gcggggacgc gatatggacg agcgtaacac cgatgaccct gactacactg 120
gagggcggca acctggaggc gaaggtcacc atgatgtatg ccggccgcag ccaggaagtc 180
aaagcggttt tagaaaggac cgacgaaccg ggcaaataca ccatgatggg tggcagccat 240
gtggcgtaca tcatccgtag ccctgtcaaa gatcactata tcttttattc cgaaggcccg 300
ctgcagggcg cgccggtgcc aggggtgtgg ctcgtgggca gagaccccaa gaacaacctg 360
gaagccttgg aggactttga gaaagccgca ggagcccgcg gactcagcac ggagagcatc 420
ctcatcccca ggcagagcga aaccagctct ccaggg 456
<210> 82
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 82
Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser
20 25 30
Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala
35 40 45
Lys Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val
50 55 60
Leu Glu Arg Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gln Gly Asp Arg
65 70 75 80
His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe
85 90 95
Tyr Ser Glu Gly Asn Leu Gln Gly Glu Thr Val Pro Gly Val Trp Leu
100 105 110
Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu
115 120 125
Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro
130 135 140
Arg Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly
145 150
<210> 83
<211> 203
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 83
Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys
1 5 10 15
Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser Val
20 25 30
Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala Lys
35 40 45
Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val Leu
50 55 60
Glu Arg Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gln Gly Asp Arg His
65 70 75 80
Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser Pro Val Lys Asp His Tyr Ile Phe Tyr
85 90 95
Ser Glu Gly Asn Leu Gln Gly Glu Thr Val Pro Gly Val Trp Leu Val
100 105 110
Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu Lys
115 120 125
Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg
130 135 140
Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Leu Ala Glu Ala
145 150 155 160
Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly Val Ser Asp Phe
165 170 175
Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Glu Ala
180 185 190
Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro Gly
195 200
<210> 84
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Mutein of human tear lipocalin
<400> 84
Gly Ala Ser Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Lys Ala Met Thr Val Asp Arg Phe Lys Ile Ala Ser Trp Pro Arg Ser
20 25 30
Val Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala
35 40 45
Lys Val Thr Met Asn Trp Trp Gly Arg Ser Gln Glu Val Lys Ala Val
50 55 60
Leu Glu Arg Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Gln Gly Asp Arg
65 70 75 80
His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His Tyr Ile Phe
85 90 95
Tyr Ser Glu Gly Asn Leu Gln Gly Glu Thr Val Pro Gly Val Trp Leu
100 105 110
Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala Leu Glu Asp Phe Glu
115 120 125
Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr Glu Ser Ile Leu Ile Pro
130 135 140
Arg Gln Ser Glu Thr Ser Ser Pro Gly Lys Leu Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr Gly
165 170 175
Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val Glu
180 185 190
Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro Gly Lys
195 200 205
Leu Asn
210
<210> 85
<211> 48
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> Albumin binding domain (ABD)
<400> 85
Ser Leu Ala Glu Ala Lys Glu Ala Ala Asn Ala Glu Leu Asp Ser Tyr
1 5 10 15
Gly Val Ser Asp Phe Tyr Lys Arg Leu Ile Asp Lys Ala Lys Thr Val
20 25 30
Glu Gly Val Glu Ala Leu Lys Asp Ala Ile Leu Ala Ala Leu Pro Gly
35 40 45
<210> 86
<211> 456
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 62
<400> 86
gcaagtgatg aagaaattca ggatgttagc ggcacctggt atctgaaagc aatgaccgtt 60
gatcgcttta aaatcgcaag ctggcctcgt agcgttaccc cgatgaccct gaccaccctg 120
gaaggtggta atctggaagc aaaagttacc atgaattggt ggggtcgtag ccaagaagtt 180
aaagcagttc tggaacgtac cgatgaaccg ggtaaataca ccgcacaggg tgatcgtcat 240
gttgcatata tcattcgtag ccctgtgaaa gaccactaca tcttttatag cgaaggtaat 300
ctgcagggtg aaaccgttcc gggtgtttgg ctggttggtc gtgatccgaa aaataacctg 360
gaagcactgg aagattttga aaaagcagcc ggtgcacgtg gtctgagcac cgaaagcatt 420
ctgattccgc gtcagagcga aaccagcagt ccggga 456
<210> 87
<211> 459
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 82
<400> 87
ggtgcaagtg atgaagaaat tcaggatgtt agcggcacct ggtatctgaa agcaatgacc 60
gttgatcgct ttaaaatcgc aagctggcct cgtagcgtta ccccgatgac cctgaccacc 120
ctggaaggtg gtaatctgga agcaaaagtt accatgaatt ggtggggtcg tagccaagaa 180
gttaaagcag ttctggaacg taccgatgaa ccgggtaaat acaccgcaca gggtgatcgt 240
catgttgcat atatcattcg tagccatgtg aaagaccact acatctttta tagcgaaggt 300
aatctgcagg gtgaaaccgt tccgggtgtt tggctggttg gtcgtgatcc gaaaaataac 360
ctggaagcac tggaagattt tgaaaaagca gccggtgcac gtggtctgag caccgaaagc 420
attctgattc cgcgtcagag cgaaaccagc agtccggga 459
<210> 88
<211> 609
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 83
<400> 88
gcgagcgatg aagagatcca agacgtcagc ggcacctggt acctgaaagc aatgactgtc 60
gaccgtttta agatcgcgag ctggccgcgt agcgttacgc caatgaccct gacgaccctg 120
gagggcggca acttggaagc gaaggtgacg atgaattggt ggggtcgcag ccaagaagtg 180
aaagccgttc tggagcgcac ggacgagccg ggtaagtata ccgcgcaggg tgatcgtcat 240
gtggcatata tcattcgcag cccggtgaag gaccactaca ttttctactc tgagggtaat 300
ttgcagggtg aaaccgttcc tggcgtttgg ctggtcggtc gtgatccgaa aaacaatctg 360
gaagcactgg aggattttga gaaagctgcc ggtgcgcgtg gcctgtcgac cgagtctatt 420
ctgattccgc gccagtccga aacctccagc ccgggtggcg gtggtagcct ggcagaggcg 480
aaagaagcgg ctaacgctga gctggacagc tacggcgtga gcgatttcta taaacgtctg 540
atcgataagg ccaagaccgt cgagggtgtt gaagcgctga aagacgccat cctggcggca 600
ttgccgggt 609
<210> 89
<211> 630
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> DNA sequence of mutein shown in SEQ ID NO: 84
<400> 89
ggtgcaagtg atgaagaaat tcaggatgtt agcggcacct ggtatctgaa agcaatgacc 60
gttgatcgct ttaaaatcgc aagctggcct cgtagcgtta ccccgatgac cctgaccacc 120
ctggaaggtg gtaatctgga agcaaaagtt accatgaatt ggtggggtcg tagccaagaa 180
gttaaagcag ttctggaacg taccgatgaa ccgggtaaat acaccgcaca gggtgatcgt 240
catgttgcat atatcattcg tagccatgtg aaagaccact acatctttta tagcgaaggt 300
aatctgcagg gtgaaaccgt tccgggtgtt tggctggttg gtcgtgatcc gaaaaataac 360
ctggaagcac tggaagattt tgaaaaagca gccggtgcac gtggtctgag caccgaaagc 420
attctgattc cgcgtcagag cgaaaccagc agtccgggta agcttggagg tggcggaagc 480
ctggcagaag caaaagaagc agcaaacgca gaactggata gctatggtgt tagcgatttc 540
tataaacgcc tgatcgataa agccaaaacc gttgaaggtg ttgaagcact gaaagatgca 600
attctggcag cactgccggg taagcttaat 630
Claims (63)
- (a) 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 서열 위치 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 및 108 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이된 아미노산 잔기, 및
(b) 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 서열 위치 61, 101, 111, 114 및 153 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이된 아미노산 잔기를 포함하고, PCSK9에 특이적으로 결합하는, 인간 눈물 리포칼린의 뮤테인. - PCSK9의 길항물질인 리포칼린 뮤테인.
- PCSK9에 대한 LDL-R의 결합에 대해서 경쟁적인 리포칼린 뮤테인.
- PCSK9에 대한, 서열번호 29 및 서열번호 33을 포함하는 단클론 항체의 결합에 대해서 경쟁적인 리포칼린 뮤테인.
- LDL-R의 PCSK9-매개된 하향조절을 완전히 또는 부분적으로 억제할 수 있는 리포칼린 뮤테인.
- PCSK9의 존재하에서 LDL 흡수를 복원시킬 수 있는 리포칼린 뮤테인.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
비-인간 영장류 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편에 10 nM 이하의 해리 상수(KD)로 결합하는 리포칼린 뮤테인. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
마우스 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편에 10 nM 이하의 해리 상수(KD)로 결합하는 리포칼린 뮤테인. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 PCSK9 또는 그의 단편에 10 nM 이하의 해리 상수(KD)로 결합하는 리포칼린 뮤테인. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 PCSK9 또는 그의 단편에 1 nM 이하의 해리 상수(KD)로 결합하는 리포칼린 뮤테인. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 PCSK9 또는 그의 단편에 0.1 nM 이하의 해리 상수(KD)로 결합하는 리포칼린 뮤테인. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
인간 PCSK9 또는 그의 단편에 1 pM 이하의 해리 상수(KD)로 결합하는 리포칼린 뮤테인. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Arg 26→ Ser, Phe, Trp, His 또는 Thr. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Glu 34→ Asn, Thr, Arg 또는 Gly, Leu 56→ Met, Ser, Gln, Phe, His 또는 Asn. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Ser 58→ Lys, Ala, Arg, Trp 또는 Pro. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Met 31→ Ala, Gly, His, Pro, Ser Aps, Glu 또는 Gln. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Leu 33→ Tyr, Trp, Tyr, Phe, Pro 또는 Ala. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Ser 61→ Trp 또는 Phe, Asp 80→ Ser, Met, Pro, Ile, Gln, Tyr, Ser, Val 또는 Thr. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Glu 104→ Leu, Pro, Ser, Ala, Asn, Thr, Lys 또는 Asp. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: His 106→ Pro, Gln, Gly, Arg, Val, Thr, Asn 또는 Leu. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Lys 108→ Gln, Ala, Trp, Tyr, Arg, Asp, Asn, Ser, Glu 또는 Thr. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Glu 27→ Arg, Ser, Gln, Thr, Phe, Lys, Ala 또는 Arg. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Pro 29→ Gly, Asp, Asn, Ile, Leu 또는 Met. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Asn 32→ Ile, Leu, Tyr, Met 또는 Trp. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Leu 105→ Cys, Tyr, Trp, Glu, Arg, Ser, His, Ala, Val, Asp, Pro, Gly 또는 Lys. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Phe 28→ Cys, Arg, Lys, Trp, Asp, Gly, His, Leu 또는 Asn. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Glu 30→ Arg, Asp, Thr, Ser, Gly, Ala 또는 Asn. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Ile 57→ Tyr, Trp, His, Gln, Thr 또는 Arg. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 적어도 하나를 함유하는 뮤테인: Lys 83→ Arg, Ser, Gln, Thr 또는 Glu. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환 세트 중 하나를 포함하는 뮤테인:
(a) Arg 26→ Phe; Asn 32→ Ile; Glu 34→ Thr; Leu 56→ Met; Ser 58→ Ala 및 Lys 83→ Ser,
(b) Arg 26→ Trp; Asn 32→ Leu; Glu 34→ Thr; Leu 56→ Ser 및 Ser 58→ Ala,
(c) Arg 26→ His; Asn 32→ Tyr; Glu 34→ Thr; Leu 56→ Ser; Ser 58→ Arg 및 Lys 83→ Gln;
(d) Arg 26→ Phe; Asn 32→ Met; Glu 34→ Thr; Leu 56→ Gln; Ser 58→ Ala 및 Lys 83→ Thr;
(e) Asn 32→ Trp; Glu 34→ Arg; Leu 56→ Asn; Ser 58→ Trp 및 Lys 83→ Ser,
(f) Arg 26→ Phe; Asn 32→ Leu; Glu 34→ Thr; Leu 56→ Phe; Ser 58→ Ala 및 Lys 83→ Arg,
(g) Arg 26→ Thr; Asn 32→ Trp; Glu 34→ Asn; Leu 56→ His; Ser 58→ Pro 및 Lys 83→ Ser,
(h) Asn 32→ Trp; Glu 34→ Asn; Leu 56→ Phe; Ser 58→ Arg 및 Lys 83→ Glu,
(i) Arg 26→ Trp; Asn 32→ Leu; Glu 34→ Thr; Leu 56→ Met; Ser 58→ Ala 및 Lys 83→ Ser, 또는
(j) Asn 32→ Trp; Glu 34→ Gly; Leu 56→ Gln; Ser 58→ Ala 및 Lys 83→ Gln. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환 세트 중 하나를 포함하는 뮤테인:
(a) Glu 27→ Ser; Phe 28→ Arg; Pro 29→ Gly; Glu 30→ Asp; Met 31→ Ala; Leu 33→ Trp; Ile 57→ Tyr; Asp 80→ Met; Glu 104→ Pro; Leu 105 → Tyr; His 106→ Gln; Lys 108→ Ala,
(b) Glu 27→ Gln; Phe 28→ Cys; Pro 29→ Asp; Glu 30→ Thr; Met 31→ Gly; Leu 33→ Trp; lle 57→ Tyr; Leu 105→ Cys; His 106→ Gly; Lys 108 →Trp,
(c) Glu 27→ Glu; Phe 28→ Trp; Pro 29→ Asn; Glu 30→ Gly; Met 31→ His; Leu 33→ Tyr; Ile 57→ Tyr; Asp 80→ Pro; Glu 104→ Ser; Leu 105 → Trp; His 106→ Pro; Lys 108→ Tyr,
(d) Glu 27→ Thr; Phe 28→ Asp; Pro 29→ Asn; Glu 30→ Ser; Met 31→ Pro; Leu 33→ Phe; Ile 57→ Tyr; Asp 80→ Ile; Glu 104→ Ala; Leu 105 → Glu; His 106→ Arg; Lys 108→ Arg,
(e) Glu 27→ Phe; Phe 28→ Lys; Pro 29→ Ile; Glu 30→ Ala; Met 31→ Ser; Leu 33→ Pro; Ile 57→ Trp; Asp 80→ Gln; Glu 104→ Asn; Leu 105→ Arg; His 106→ Gln; Lys 108→ Asp,
(f) Glu 27→ Lys; Phe 28→ Gly; Pro 29→ Pro; Glu 30→ Thr; Met 31→ Pro; Leu 33→ Trp; Ile 57→ His; Asp 80→ Tyr; Glu 104→ Ala; Leu 105 → Ser; His 106→ Val; Lys 108→ Asn,
(g) Glu 27→ Glu; Phe 28→ His; Pro 29→ Leu; Glu 30→ Ala; Met 31→ Asp; Leu 33→ Ala; Ile 57→ Gln; Asp 80→ Ile; Glu 104→ Ala; Leu 105 → Tyr; His 106→ Pro; Lys 108→ Ser,
(h) Glu 27→ Ala; Phe 28→ Asp; Pro 29→ Met; Glu 30→ Gly; Met 31→ Asp; Leu 33→ Pro; Ile 57→ Thr; Asp 80→ Thr; Glu 104→ Thr; His 106 → Thr; Lys 108→ Arg,
(i) Glu 27→ Arg; Phe 28→ Leu; Pro 29→ Asp; Glu 30→ Asn; Met 31→ Glu; Leu 33→ Trp; Ile 57→ Tyr; Asp 80→ Gln; Glu 104→ Pro; Leu 105 → Arg; His 106→ Asn; Lys 108→ Ala,
(j) Glu 27→ Lys; Phe 28→ Asn; Pro 29→ Met; Glu 30→ Gly; Met 31→Gln; Leu 33→ Pro; Ile 57→ Arg; Asp 80→ Ile; Glu 104→ Asp; Leu 105→ Arg; His 106→ Leu; Lys 108→ Thr, 또는
(k) Glu 27→ Ser; Phe 28→ Arg; Pro 29→ Gly; Glu 30→ Asp; Met 31→Ala; Leu 33→ Trp; Ile 57→ Tyr; Asp 80→ Met; Glu 104→ Pro; Leu 105→ Gly; His 106→ Gln; Lys 108→ Ala. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환 조합을 포함하는 뮤테인: Arg 26→ Phe; Glu 27→ Ser; Phe 28→ Arg; Pro 29→ Gly; Glu 30→ Asp; Met 31→ Ala; Asn 32→ Ile; Leu 33→ Trp; Glu 34→ Thr; Leu 56→ Met; Ile 57→ Tyr; Ser 58→ Ala; Lys 83→ Ser; Glu 104→ Pro 및 Lys 108→ Thr. - 제32항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 하나 이상을 또한 포함하는 뮤테인: Thr 43→ Ile 또는 Ala, Glu 45→ Gly, Asn 48→ Gly, Glu 63→ Gly, Ala 66→ Vla, Glu 69→ Vla, Lys 70→ Arg, Ala 79→ Thr, Met 또는 Vla, Asp 80→ Met 또는 Ser, Gly 82→ Ser, His 84→ Gln, Vla 85→ Gly, Tyr 87→ Ser, Ile 88→ Thr 또는 Leu, His 92→ Pro, Leu 105→ His, Gly 또는 Tyr 및 His 106→ Gln 또는 Arg. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환 조합을 포함하는 뮤테인: Glu 27→ Phe; Phe 28→ Lys; Pro 29→ Ile; Asn 32→ Trp; Leu 33→ Pro; Glu 34→ Arg; Leu 56→ Asn; Ile 57→ Trp; His 106→ Gln 및 Lys 108→ Glu. - 제34항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린에 비해 하기의 아미노산 치환들 중 하나 이상을 또한 포함하는 뮤테인: Glu 43→ Gly 또는 Ala, Glu 45→ Gly, Ser 58→ Trp 또는 Arg, Glu 63→ Asp, Glu 69→ Gly, Lys 70→ Arg, Asp 80→ Gln, Val 또는 Thr, Gly 82→ Asp, Lys 83→ Ser 또는 Arg, Ala 86→ Glu 또는 Ser, Phe 99→ Leu, Glu 102→ Lys 또는 Val, Glu 104→ Asn 또는 Lys 및 Pro 106→ Thr. - 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린의 아미노산 서열에 관하여 28번 또는 105번 위치에서 고유 아미노산의 시스테인 잔기에 의한 아미노산 치환을 포함하는 뮤테인. - 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
성숙한 인간 눈물 리포칼린의 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 뮤테인. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 3-28, 62-71 및 82 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 갖는 뮤테인. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 23에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 갖는 뮤테인. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 13에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 갖는 뮤테인. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 20에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 갖는 뮤테인. - 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 22에 제시된 바와 같은 아미노산 서열 또는 그의 단편 또는 변이체를 갖는 뮤테인. - 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
표지 모이어티에 접합된 뮤테인. - 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
피험자내의 특정한 신체 영역, 유기체, 조직, 기관 또는 세포를 표적화할 수 있는 모이어티에 접합된 뮤테인. - 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
뮤테인의 혈청 반감기를 연장시킬 수 있는 모이어티에 접합된 뮤테인. - 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
폴리알킬렌 글리콜 분자에 접합된 뮤테인. - 제46항에 있어서,
서열번호 30-32 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 접합된 뮤테인. - 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
알부민 결합 단백질에 접합된 뮤테인. - 제48항에 있어서,
서열번호 83-84 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 접합된 뮤테인. - 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
융합물에 신규의 특성을 부여할 수 있는 모이어티에 융합된 뮤테인. - PCSK9에 결합하는, 인간 눈물 리포칼린의 하나 이상의 뮤테인의 생성 방법으로서,
(a) 인간 눈물 리포칼린을 암호화하는 핵산 분자에 대해
(i) 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 26-34, 56-58, 80, 83, 104-106 및 108 중 임의의 하나 이상, 및
(ii) 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 61, 101, 111, 114 및 153 중 임의의 하나 이상
에서 돌연변이유발을 가하여, 인간 눈물 리포칼린의 하나 이상의 뮤테인(들)을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자(들)를 수득하고,
(b) (a)에서 수득한 하나 이상의 핵산 분자(들)를 발현 시스템에서 발현시켜, 인간 눈물 리포칼린의 하나 이상의 뮤테인(들)을 수득하고,
(c) (b)에서 수득한 하나 이상의 뮤테인(들)을 추가로 선별함을 포함하는 방법. - 제51항에 있어서,
단계 (c)가
(ci) PCSK9 또는 그의 면역원성 단편을 제공하고,
(cii) 선별을 통해 수득한 하나 이상의 뮤테인(들)을 상기 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편과 접촉시켜, 상기 PCSK9 또는 그의 면역원성 단편과 이들에 대한 결합 친화성을 갖는 뮤테인간에 복합체가 형성되게 하고,
(cii) 결합 친화성이 없거나 실질적으로 없는 하나 이상의 뮤테인(들)을 제거함을 추가로 포함하는 방법. - 제51항 또는 제52항에 있어서,
단계 (c)에서의 선별을 경쟁 조건하에서 수행하는 방법. - 제51항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서,
단계 (a)가 (a)(iii) 인간 눈물 리포칼린을 암호화하는 핵산 분자에, 성숙한 인간 눈물 리포칼린의 선형 폴리펩티드 서열의 아미노산 서열 위치 79, 92 및 105 중 임의의 하나 이상에서 돌연변이유발을 가함을 추가로 포함하는 방법. - 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항의 뮤테인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
- 서열번호 31-61, 72-81 및 86-89 중 어느 하나에 제시된 바와 같은 핵산 분자.
- 제55항 또는 제56항의 핵산 분자를 함유하는 숙주 세포.
- 피험자에서 PCSK9의 결합을 위한 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 조성물의 용도.
- 피험자에서 PCSK9의 LDL-R에의 결합을 억제하기 위한 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인 또는 이러한 뮤테인을 포함하는 조성물의 용도.
- (a) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인을 적합한 조건하에서 PCSK9를 함유하는 것으로 의심이 가는 시험 샘플과 접촉시켜, 상기 뮤테인과 PCSK9 또는 그의 도메인 또는 단편간에 복합체가 형성되게 하고,
(b) 상기 복합체를 적합한 신호에 의해 검출함을 포함하는, PCSK9의 검출을 위한 상기 뮤테인의 용도. - (a) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인을 적합한 조건하에서 PCSK9를 함유하는 것으로 추정되는 샘플과 접촉시켜, 상기 뮤테인과 PCSK9 또는 그의 도메인 또는 단편간에 복합체가 형성되게 하고,
(b) 상기 복합체를 상기 샘플로부터 분리시킴을 포함하는, PCSK9의 분리를 위한 상기 뮤테인의 용도. - (a) 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인을 화합물과 접합시키고,
(b) 상기 뮤테인/화합물 복합체를 상기 화합물로 치료하려는 미리 선택된 유기체, 조직, 기관 또는 세포로 전달하는 단계들을 포함하는, 상기 화합물을 상기 미리 선택된 유기체, 조직, 기관 또는 세포에 표적화하기 위한 상기 뮤테인의 용도. - 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 따른 뮤테인을 포함하는 키트.
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