DE69025308T2

DE69025308T2 - Enzyme die teilnehmen an c-endamidierung, herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE69025308T2
Application number: DE69025308T
Authority: DE
Inventors: Yuka Shiseido Laboratorie Fuse; Ohji Shiseido Laboratori Ifuku; Toshii Shiseido Laborator Iida; Toshihiko Shiseido La Kaminuma; Ichiro - - Kato; Jiro Shiseido Labora Kishimoto; Hiroshi - - - Okamoto; Masahiro Shiseido Labor Tajima; Mitsuo Shiseido Laborat Yanagi
Original assignee: Shiseido Co Ltd
Current assignee: Shiseido Co Ltd
Priority date: 1989-08-15
Filing date: 1990-08-14
Publication date: 1996-10-24
Anticipated expiration: 2010-08-15
Also published as: EP0438600B1; EP0884389A1; EP0438600A1; DE69025308D1; DE69033669T2; KR920701422A; EP0438600A4; DE69025308T3; KR100191224B1; WO1991002790A1; DE69033669D1; EP0438600B2; EP0666318A1; US6156555A; US5871995A; CA2039174A1; EP0666318B1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Diese Erfindung betrifft ein neues Enzym, das an einer C- terminalen Amidierung eines C-terminalen Peptid-Glycinadduktes teilnimmt, ein Verfahren zur Herstellung desselben und die Verwendung desselben. Der hier gebrauchte Ausdruck "an einer C-terminalen Amidierung teilnehmend" bedeutet, daß das Enzym eine Wirkung hat, die jede Stufe der Überführung eines C-terminalen Peptid-Glycinadduktes in seine Peptid-C-terminale amidierte Verbindung fördert.

STAND DER TECHNIK

In der Vergangenheit wurde das Enzym, das an der enzymatischen Reaktion in vivo teilnimmt, d. h. einer C-terminalen Amidierung eines C-terminalen Glycinadduktes von Peptiden (Verbindung, in der Glycin durch eine Peptid-Bindung an einen C-terminalen Rest gebunden ist), als Peptidylglycin-α-amidierende Monooxygenase bezeichnet (C-terminales amidierendes Enzym) (EC.1.14.17.3) (Bradbury und Mitarbeiter, Nature, 298, 686, 1982; Glembotski und Mitarbeiter, J. Biol. Chem., 259. 6385, 1984), und wurde angesehen als ein Enzym, das die folgende Reaktion katalysiert:
Um den Amidierungsmechanismus in vivo aufzuklären und um das Enzym für das Verfahren der Überführung der Peptide, die eine physiologische Aktivität aufweisen, zu verwenden, wurden erstmalig durch eine Amidierung des C-Endes mit dem Peptid, erzeugt durch die DNA-Rekombinationstechnik, beispielsweise Calcitonin und Gastrin, in vitro, Versuche unternommen, um dieses Enzym zu reinigen. Beispielsweise wurde von solchen berichtet, die abstammen von Rinderhypophysen-Mittellappen (Murthy und Mitarbeiter, J. Biol. Chem., 261, 1815, 1986), Schweinehypophysenlappen (Kizer und Mitarbeiter, Endocrinology, 118, 2262, 1986; Bradbury und Mitarbeiter, Eur. J. Biochem., 169, 579, 1987), des Schweineherzenvorraumes (Kojima und Mitarbeiter, J. Biochem., 105, 440, 1989), Xenopus-Körperhaut (Mizuno und Mitarbeiter, Biochem., Biophys. Res. Commun., 137, 984, 1986), von Ratten-Schilddrüsentumoren (Mehta und Mitarbeiter, Arch. Biochem., Biophys., 261, 44, 1988).
Andererseits wurden, da es schwierig ist, größere Mengen dieser gereinigten Enzyme zu erzeugen, Versuche unternommen, um die cDNA's zu isolieren, die erforderlich sind für die Expression dieser Enzyme unter Anwendung der DNA-Rekombinationstechnik, die ganz allgemein seit den vergangenen Jahren praktiziert wurde, sowie die Herstellung der Enzyme unter Anwendung derselben. Beispielsweise haben Eipper B.A. und Mitarbeiter in Mol. Endocrinol. 1, 777-790, 1987, Ohsuye K. und Mitarbeiter in Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 1275-1281, 1988; Stoffers, D.A. und Mitarbeiter in Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 735-739, 1989, sowie Glauder, J. und Mitarbeiter in Biochem. Biophys. Res. Commun., 169-551-558, 1990, von cDNA's von einem Peptid-C-terminalen amidierenden Enzym berichtet, das sich ableitet von Rinderhypophysenlappen, Froschhaut, Rattenherzenvorräumen bzw. menschlichen Schilddrüsenzellen. Weiterhin sind, obgleich nicht notwendigerweise eine zufriedenstellende Produktivität aufweisen, ebenfalls Beispiele von Peptid- C-terminalen Amidierungsenzymen bekannt, die hergestellt werden durch Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik unter Verwendung der cDNA, die sich ableitet von Fröschen und Rindern (vgl. zum Beispiel ungeprüfte japanische Patentpublikation (Kikai) Nr. 1-104168, veröffentlichte internationale Anmeldung:
WO89/02460, sowie Perkins und Mitarbeiter in Mol. Endocrinol., 4, 132-139, 1990).
Andererseits wurde berichtet, daß diese Proteine Molekulargewichte von 38, 42 oder 54 kDa beim Rind, 39 kDa bei Fröschen und 41, 50 oder 75 kDa bei Ratten haben, die voneinander sehr verschieden sind, je nach den Isolierungsmethoden usw. Beispielsweise wird in der Literatur von Bradbury und Mitarbeitern, wie oben beschrieben, Ramer und Mitarbeitern, 110, 8526- 8532 (1988) und Young und Mitarbeitern, J. Am. Chem. Soc. 111, 1933-1934 (1989) die Existenz von Reaktionsintermediären erwähnt, doch gibt es augenblicklich keine Beispiele, welche die Isolation eines Zwischenproduktes beschreiben und die Beziehung zwischen dem Zwischenprodukt und dem amidierenden Enzym.
Wie oben beschrieben, weist das das C-terminale Peptid amidierende Enzym eine sehr interessante Wirkung in vivo auf und es ist eine Zusammensetzung mit einer konstanten Reinheit, die sich von einem speziellen lebenden Körperorgan ableitet, bekannt. Dennoch können diese Zusammensetzungen nicht für die Herstellung einer C-terminalen amidierten Peptidverbindung in vivo verwendet werden, da die Reinheit und Stabilität, wie auch die Produktionskosten des Produktes nicht zufriedenstellend sind. Um diese Probleme zu lösen, ausgehend von der Premisse, daß es erforderlich ist, das Basiswissen betreffend des Enzyms zu sammeln, d. h. den Reaktionsmechanismus aufzuklären, wenn die C-terminale Amidierungsreaktion durchgeführt wird, versuchten die Erfinder, das Zwischenprodukt zu isolieren, und in konsequenter Weise gelang es ihnen, das Zwischenprodukt erfolgreich zu isolieren und die Struktur hiervon zu bestimmen. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde gefunden, daß die enzymatisch aktive Substanz, die gemäß dem Stande der Technik als C-terminales Amidierungsenzym bezeichnet wird, kein einstufiges Reaktionsprodukt ist, wie es nach dem Stande der Technik betrachtet wurde, sondern daß eine zweistufige Reaktion über das Zwischenprodukt erfolgt (entsprechend dem C-terminalen α-Hydroxylglycinaddukt).
Da es voraussehbar ist, daß eine wirksame Umwandlung eines C- terminalen Peptid-Glycinadduktes in die entsprechende amidierte Verbindung durchgeführt werden kann, durch die einzelne oder kombinierte Verwendung von Enzymen, welche die entsprechende Reaktion unter annehmbaren Bedingungen katalysieren, wurde es erforderlich, diese Enzyme bereitzustellen. Weiterhin wird es notwendig, wo die Existenz dieser Enzyme bestätigt werden kann, eine wirksame Methode zu ihrer Herstellung bereitzustellen.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Enzym bereitgestellt, das an einer C-terminalen Amidierung teilnimmt, das einwirkt auf ein C-terminales Glycinaddukt gemäß der folgenden Formel (I):
¬ (worin A darstellt einen Rest, der anders ist als eine α-Aminogruppe oder Iminogruppe und eine α-Carboxylgruppe, abgeleitet von einer natürlich vorkommenden α-Aminosäure, worin X steht für ein Wasserstoffatom oder einen Rest eines Aminosäurederivates, das an ein N-Atom durch eine Carbonylgruppe gebunden ist), unter Bildung eines C-terminalen α-Hydroxylglycinadduktes gemäß der folgenden Formel (II):
(worin A und X die gleichen Bedeutungen wie oben angegeben haben, im folgenden gelegentlich als "Enzym-I" bezeichnet), sowie ein Enzym, das an einer C-terminalen Amidierung eines C- terminalen Glycinadduktes teilnimmt, das einwirkt auf ein C- terminales α-Hydroxylglycinaddukt, das dargestellt wird durch die obige Formel (II) unter Bildung einer C-terminal amidierten Verbindung gemäß der folgenden Formel (III):
(worin A und X die gleichen Bedeutungen wie oben angegeben haben) (im folgenden gelegentlich als "Enzym-II" bezeichnet).
In den Formeln (I), (II), und in der Formel (III) besagt das Wasserstoffatom in der Klammer (H), daß kein Wasserstoffatom existiert, wenn sich A von einer α-Aminosäure mit einer α-Iminogruppe ableitet.
Durch Verwendung eines jeden dieser Enzyme oder einer Kombination hiervon kann das C-terminale Peptid-Glycinaddukt, das durch die Formel (I) dargestellt wird, wirksam in die entsprechende C-terminale amidierte Peptidverbindung überführt werden, die durch die Formel (II) dargestellt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme von der oben erwähnten, eine Enzymaktivität aufweisenden Verbindung bereitgestellt, durch die Verwendung eines speziellen Liganden, sowie ein Verfahren zur wirksamen Erzeugung dieser Enzyme durch die Verwendung einer cDNA, die diese Enzymaktivität enthaltenden Peptide codiert.
Weiterhin wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der oben erwähnten Enzyme bereitgestellt sowie ein Verfahren der Reihenuntersuchung dieser Enzym enthaltenden Verbindungen.
Weiterhin wird durch die vorliegende Erfindung eine cDNA, welche die Enzymaktivität, die sich vom Pferd ableitet, encodiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

In der Beschreibung und in den Zeichnungen stehen Buchstaben, die in einer Aminosäuresequenz durch einen Buchstaben wiedergegeben werden, für jene, die normalerweise nach dem Stande der Technik verwendet werden und "hyG" steht für α-Hydroxyglycin.
Fig. 1 ist ein HPLC-Verlauf der Herstellung von FGFhyG unter Verwendung des Enzyms-I der vorliegenden Erfindung mit FGFG als dem Substrat;
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse einer FAB-MS-Spektrumsanalyse, die durchgeführt wurde, um die Molekularstruktur des hergestellten FGFhyG zu bestätigen;
Fig. 3 ist ein Chromatogramm-Verlauf, der eine Trennung des Enzyms-I und des Enzyms-II der vorliegenden Erfindung gemäß einer Chromatographie mittels einer Mono-Q-Kolonne zeigt, wobei die offenen Quadrate die Aktivität des Enzyms-II anzeigen und die ausgefüllten Kreise die Aktivität des Enzyms-I veranschaulichen, und worin die gestrichelt gezeichnete Linie den linearen Konzentrationsgradienten von Natriumchlorid veranschaulicht;
Fig. 4 zeigt einen HPLC-Verlauf über einen Zeitverlauf bei der Herstellung von FGF-NH&sub2; durch Verwendung des Enzyms-II der vorliegenden Erfindung mit FGFhyG als dem Substrat;
Fig. 5 zeigt die Aminosäuresequenzen, die bestimmt wurden aus den C-terminalen Peptid-Amidierungsenzym-cDNA's, kloniert vom Menschen, Pferd, Rind, der Ratte, von Fröschen, in Form einer Ein-Buchstaben-Darstellung;
Fig. 6 veranschaulicht die Nukleotidsequenz der C-terminalen Amidierungsenzym-cDNA, kloniert von der Rattenhypophysen-mRNA, sowie die hieraus bestimmte Aminosäuresequenz;
Fig. 7 zeigt in schematischer Darstellung die fünf C-terminalen Amidierungsenzyme, geklont von der Rattenhypophysen-mRNA, worin der Bereich, der für das abgeschätzte Enzym codiert, durch Boxen dargestellt ist. Die Nummern zeigen die Basennummern (bp) an, wobei der Translations-Einleitungspunkt mit 1 angegeben ist, TM den Teil darstellt, der dem Membran-Transportbereich entspricht, KK die Lysin-Lysin-Sequenz darstellt und worin die Restriktionsendonukleasen durch die folgenden Abkürzungen dargestellt sind:
B (Bam HI), N (Nsi I), RI (EcoRI), RV (EcoRV), S (SphI), X (XmaI);
Fig. 8, Fig. 9 und Fig. 10 zeigen die Sephacryl S-200-Kolonnen-Chromatographieverläufe der Enzyme, exprimiert durch die Plasmide SV-a, SV-b bzw. SV-203;
Fig. 11 und Fig. 12 zeigen die Veränderungen bei der Herstellung des α-Hydroxylglycinadduktes und der C-terminalen amidierten Verbindung im Verlaufe der Zeit bei Verwendung von PheGlyPheGly als Substrat;
Fig. 13 zeigt die Nukleotidsequenz des längsten cDNA-Fragmentes unter den cDNA's, die für das Polypeptid mit einer C-terminalen Peptid-Amidierungs-Enzymaktivität codieren und stammen von isoliertem Pferd, und die Aminosäuresequenz, die hierfür codiert, in Form einer Ein-Buchstaben-Darstellung; und
Fig. 14 bzw. Fig. 15 zeigen einen Teil der Basensequenz von cDNA's, die codieren für die C-terminalen Peptid-amidierenden Enzyme, abgeleitet von der Ratte, verwendet als die Sonde (probe), die mit unterschiedlichem Restriktionsendonukleasen digestiert wurde.

BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG

Das C-terminale Glycinaddukt, das durch die Formel (I) dargestellt wird, gemäß der vorliegenden Erfindung, d. h. das Substrat der Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, kann ganz allgemein Verbindungen einschließen, die sich ableiten von Aminosäurederivaten, in denen der Rest
in der obigen Formel natürlichen oder synthetischen Ursprungs ist, insbesondere die Verbindungen, die sich ableiten von Peptiden oder Proteinen, wobei Glycin an den C-terminalen Säurerest davon gebunden ist [dargestellt durch -N(H)-A-CO-]. Als der C-terminale Aminosäurerest kann eingeschlossen sein ein Rest, der sich ableitet von einer natürlich vorkommenden Aminosäure, insbesondere einer Proteine aufbauenden Aminosäure, beispielsweise einer aliphatischen Aminosäure, wie Glycin oder Alanin; einer verzweigten Aminosäure, wie Valin, Leucin oder Isoleucin; einer hydroxylierten Aminosäure, wie Serin oder Threonin; einer sauren Aminosäure, wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure; einem Amid, wie Asparagin oder Glutamin; einer basischen Aminosäure, wie Lysin, Hydroxylysin, Arginin; einer Schwefel enthaltenden Aminosäure, wie Cystein, Cystin oder Methionin; einer aromatischen Aminosäure, wie Phenylalanin oder Tyrosin; einer heterocyclischen Aminosäure, wie Tryptophan oder Histidin; und einer Iminosäure, wie Prolin oder 4-Hydroxyprolin. Das Wasserstoffatom oder der Rest des Aminosäurederivates, das an die α-Aminogruppe oder Iminogruppe des Aminosäurerestes gebunden ist [dargestellt durch X-], ist nicht besonders beschränkt bezüglich der Art und Kettenlänge des Peptides des einzelnen Aminosäurerestes, vorausgesetzt, es ist ein Peptid, das durch eine einzelne Aminosäure- oder α-Aminogruppe gebunden ist, und weiterhin können Phosphorsäure, Zucker und andere Substituenten kovalent an den einzelnen Aminosäurerest gebunden sein und es kann ein Konjugat mit einem Lipid gebildet werden. Zu speziellen Beispielen der oben erwähnten Substituenten gehören entsprechend den entsprechenden Aminosäureresten die Substituenten an der Guanidinogruppe von Argininresten, zum Beispiel die Alkylgruppen, wie Methyl, Ethyl, usw., die Reste, die sich ableiten von Adenosindiphosphatribose, Citrullin oder Ornithin; Substituenten, die sich ableiten von der &epsi;-Aminogruppe von Lysinresten, zum Beispiel die Substituenten, die sich ableiten von Verbindungen mit einer Glycosylgruppe, Pyridoxylgruppe, Biotinylgruppe, Lipoylgruppe, Acetylgruppe, Phosphorsäure- oder δ-Hydroxylgruppe, Verbindungen mit einer δ-Glycosylgruppe, Resten, die sich ableiten von Glutaraldehyd oder Citraconsäureanhydrid, usw.; Substituenten an der Imidazolgruppe von Hystidinresten, zum Beispiel die Methylgruppe, den Substituenten, die sich ableiten von der Phosphorsäure, dem Jodatom oder Flavin; Substituenten am Prolinrest, zum Beispiel die Hydroxygruppe, Dihydroxygruppe, Glycosyloxygruppe; Substituenten an dem Benzolring von Phenylalaninresten, zum Beispiel die Hydroxygruppe oder Glycosyloxygruppe; Substituenten an der Hydroxygruppe des Tyrosinrestes, zum Beispiel die Glycosyloxygruppe, Sulfonsäuregruppe, das Jodatom, Bromatom oder Chloratom, oder eine Verbindung mit einer Hydroxygruppe, Bisether, Adenin, dem Rest, der sich von Uridin oder RNA (Ribonukleinsäure) ableitet, usw.; Substituenten an der Hydroxygruppe des Serinrestes, zum Beispiel die Methylgruppe, Glycosylgruppe, Phosphopanteteinsäure, Adenosindiphosphorsäure, Ribosyl- oder Phosphorsäure; Substituenten an der Hydroxygruppe des Threoninrestes, zum Beispiel die Glycosylgruppe, Methylgruppe oder Phosphorsäuregruppe; Substituenten an der SH-Gruppe des Cysteinrestes, zum Beispiel die Glycosylgruppe, Substituenten, die sich ableiten von Cystinyl, die Dehydroalanylgruppe, Selenatom, oder Resten, die sich ableiten von Häm oder Flavin; Substituenten an der Carboxylgruppe von Asparaginsäure- oder Glutaminsäureresten, zum Beispiel die Methylgruppe, Phosphorsäuregruppe oder τ-Carboxylgruppe; Substituenten an dem Asparagin- oder Glutaminrest, zum Beispiel die Glycosylgruppe, Pyrrolidonylgruppe oder Iminogruppe, usw.
Das Peptid mit einem Peptid-gebundenen Glycin an dem C-terminalen Rest, wie im Falle des oben angegebenen Substrates, oder sein Derivat können entweder aus natürlichen Produkten extrahiert oder durch chemische Synthese erzeugt werden oder durch eine DNA- Rekombinationstechnik erzeugt werden. Infolgedessen kann das Substrat der vorliegenden Erfindung eine Verbindung sein, die durch die Formel (I) wiedergegeben wird, wozu gehören C-terminale Glycinaddukte (d. h. Amid-gebundene Verbindungen der C- terminalen Carboxylgruppe und Glycin), zum Beispiel Peptide mit Aminosäureresten von etwa 2 bis 100, Phosphatpeptide, wie sie dargestellt werden durch Casein, Proteinkinase, Adenovirus EIA-Protein, RAS 1-Protein, usw., sowie Hydrolysate hiervon, Lipoproteine, wie zum Beispiel Thromboplastin, α&sub1;-Lipoprotein, Lipovietellin, usw., sowie Hydrolysate hiervon, Metallproteine, wie sie dargestellt werden Hämoglobin, Myoglobin, Hämocyanin, Chlorophyl, Phycocyanin, Flavin, Rhodopsin, usw., und Hydrolysate hiervon, Glycoproteine, wie sie dargestellt werden durch Collagen, Laminin, Interferon α, Seroglycoide, Avidin, usw., sowie Hydrolysate hiervon, wie auch andere physiologisch aktive Peptide des Maturationstyps mit einer amidierten C-terminalen Carboxylgruppe, zum Beispiel Calcitonin, Secretin, Gastrin, vasoaktive Intestinalpeptide (VIP), Cholecystokinin, Caerulein, pancreatische Polypeptide, ein ein Wachstumshormon freisetzender Faktor, ein Corticotropin freisetzender Faktor, ein zum Calcitoningen in Beziehung stehendes Peptid, usw. Von diesen gehören zu einem bevorzugten Substrat für die Identifizierung der Enzymaktivität der Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung D-Tyrosyl-valyl-glycin, D-Tyrosyl-tryptophanyl-glycin, Glycyl-phenylalanyl-glycin, Phenylalanyl-glycyl-phenylalanylglycin, D-Tyrosyl-leucyl-asparaginyl-glycin, Arginyl-phenylalanyl-arginyl-alanyl-arginyl-leusyl-glycin, Leucyl-methionylglycin, Glycyl-leucyl-methionyl-glycin, Phenylalanyl-glycylleucyl-methionyl-glycyl, Asparaginyl-arginyl-phenylalanyl-glycin, Tryptophanyl-asparaginyl-arginyl-phenylalanyl-glycin, Alanyl-phenylalanyl-glycin, Lysyl-alanyl-phenylalanyl-glycin, Seryl-lysyl-alanyl-phenylalanyl-glycin, Arginyl-tyrosyl-glycin, Glycyl-methionyl-glycin, Glycyl-tyrosyl-glycin, Glycyl-histidylglycin, Mistidyl-glycyl-glycin, Tryptophanyl-glycyl-glycin und Glycyl-cysteinyl-glycin und dergleichen (mit der Ausnahme von Glycin ist die L-Form angegeben, sofern nicht ausdrücklich eine Kennzeichnung als D- erfolgt). Andererseits gehören zu einem bevorzugten Substrat für die wirksame Verwendung der vorliegenden Enzymzusammensetzung die Peptide mit Glycin, die über eine Peptidbindung an die C-terminale Carboxylgruppe hiervon gebunden sind, die ein physiologisch aktives Peptid des Maturationstyps bildet durch Amidierung der oben erwähnten C-terminalen Carboxylgruppe.
Unter Einwirkung auf das Substrat, wie oben beschrieben, kann das Enzym-I der vorliegenden Erfindung ein C-terminales α-Hydroxylglycinaddukt bilden, das durch die folgende Formel (II) dargestellt wird:
[worin spezielle Beispiele des
die Bedeutungen haben, wie für die obige Formel (I) angegeben].
Die durch die Formel (II) dargestellte Verbindung kann durch Hydrolyse unter Bedingungen, die keinen nachteiligen Einfluß auf den Rest
aufweisen, durch Hydrolyse umgewandelt werden oder durch Behandlung mit dem zweiten Enzym der vorliegenden Erfindung, wie weiter unten beschrieben, unter Überführung in die entsprechende C-terminale amidierte Verbindung.
Das oben beschriebene Enzym-I hat ein Molekulargewicht von etwa 25 Kilo-Dalton (kDa) im Falle des Pferdes und von etwa 36 kDa im Falle der Ratte gemäß der Molekulargewichtsbestimmungsmethode, die sich der Verwendung der Gel-Filtration bedient. Genauer gesagt, kann das Molekulargewicht ermittelt werden nach der Gel-Filtrationsmethode, die an sich bekannt ist [zum Beispiel aus "Seikagaku Jikken Kouza 5, Enzyme Study Method, frühere Ausgabe, S. 283-298", Tokyo Kogaku Dojin (1975)]. Speziell unter Verwendung einer 50 mM Tris-HCl-Lösung (pH 7,4), enthaltend 100 mM Kaliumchlorid als Gleichgewichts- und Eluierungslösung, wurde eine Gel-Filtration über Toyopearl-HW-555 (hergestellt von der Firma Toso) durchgeführt, und das Molekulargewicht wurde mit β-Amylase bestimmt (Molekulargewicht 200 000), Alkoholdehydrogenase (Molekulargewicht 150 000), BSA (Molekulargewicht 66 000), kohlensaurer Anhydrolase (Molekulargewicht 29 000) und Cytochrome C (Molekulargewicht 15 400) als Indices.
Das Enzym-I der vorliegenden Erfindung wird weiter spezifiziert durch die folgenden physikochemischen Eigenschaften, nämlich:
(a) der optimale pH-Wert liegt bei etwa 5 bis 7 und der stabile pH-Wert bei 4 bis 9;
(b) die optimale Wirkungstemperatur liegt bei etwa 25 bis 40ºC;
(c) Metallionen und Ascorbinsäure wirken als Kofaktoren.
Die oben angegebenen Eigenschaften (a) und (b) werden gemessen unter Verwendung von üblichen Puffern, insbesondere Tris-HCl-, Mes-kaliumhydroxid-, Tes-natriumhydroxid- und Hepes-kaliumhydroxid-Puffern. Die Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann die obige Reaktion katalysieren innerhalb eines Temperaturbereiches von 1ºC bis 55ºC, wird jedoch bei 56ºC innerhalb von etwa 10 Minuten inaktiviert; eine geringe Inaktivierung läßt sich ferner bei um 40ºC feststellen.
Als Metallionen sind Cu²&spplus;, Zn²&spplus;, Ni²&spplus;, Co²&spplus;, Fe³&spplus; usw. geeignet, doch werden in besonders bevorzugter Weise Cu²&spplus; und Zn²&spplus; verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine andere Art von Enzym bereit, gemäß dem folgenden. Genauer gesagt wird ein Enzym bereitgestellt, das an einer C-terminalen Amidierung eines C-terminalen Glycinadduktes teilnimmt, das auf ein C-terminales α-Hydroxylglycinaddukt einwirkt, das durch die obige Formel (II) dargestellt wird, unter Erzeugung einer C-terminalen amidierten Verbindung, die durch die folgende Formel (III) dargestellt wird:
(worin A und X die gleiche Bedeutung wie oben angegeben haben) und Glyoxylsäure.
Das Molekulargewicht dieses Enzyms hängt auch von dem Ursprung desselben ab. Wenn es von der die Enzymaktivität aufweisenden Verbindung, wie unten beschrieben, abgetrennt wird, mit anschließender Reinigung, ist das Enzym-II ein Enzym, das an einer C-terminalen Amidierung des Glycinadduktes teilnimmt, das ein Molekulargewicht von etwa 40 kDa aufweist, wenn es sich vom Pferd ableitet, oder von etwa 43 kDa, wenn es sich von der Ratte ableitet, bestimmt nach der Molekulargewichtsbestimmungsmethode durch Gel-Filtration. Das Molekulargewicht des Enzyms-II, erzeugt unter Verwendung von cDNA, ist etwas größer und ähnlich dem Falle des Enzyms-I. Die Bedeutung und die Molekulargewichtsbestimmung des Restes
die für die Spezifizierung dieses Enzyms angewandt wird, ist die gleiche, wie sie für die Spezifizierung des Enzyms-I angewandt wird. Als bevorzugte Substrate für die Identifizierung der Enzymaktivität des Enzyms-II können α-Hydroxyglycinverbindungen verwendet werden, die den Substraten entsprechen, die speziell oben für das Enzym-I aufgelistet wurden.
Zu speziellen Beispielen gehören D-Tyrosyl-valyl-α-hydroxyglycin, D-Tyrosyl-tryptophanyl-oc-hydroxyglycin, Glycyl-phenylalanyl-α-hydroxyglycin, Phenylalanyl-glycyl-phenylalanyl-α-hydroxyglycin, D-Tyrosyl-leucyl-asparaginyl-α-hydroxyglycin, Arginylphenylalanyl-α-hydroxyglycin, Arginyl-alanyl-arginyl-leusyl-αhydroxyglycin, Leucyl-methionyl-α-hydroxyglycin, Glycyl-leucyl-methionyl-α-hydroxyglycin, Phenylalanyl-glycyl-leucyl-methionyl-α-hydroxylglycin, Asparaginyl-arginyl-phenylalanyl-αhydroxyglycin, Triptophanyl-asparaginyl-arginyl-phenylalanylα-hydroxyglycin, Alanyl-phenylalanyl-α-hydroxyglycin, Lysylalanyl-phenylalanyl-α-hydroxyglycin, Seryl-lysyl-alanyl-phenylalanyl-α-hydroxyglycin, Arginyl-tyrosyl-α-hydroxyglycin, Glycylmethionyl-α-hydroxyglycin, Glycyl-tyrosyl-α-hydroxyglycin, Glycyl-histidyl-α-hydroxyglycin, Histidyl-glycyl-α-hydroxyglycin, Triptophanyl-glycyl-α-hydroxyglycin und Glycyl-cysteinyl-αhydroxyglycin und dergleichen.
Das Enzym-II ist ferner spezifiziert durch praktisch die gleichen Eigenschaften wie das Enzym-I, wie andere physikochemischen Eigenschaften, nämlich:
(a) der optimale pH-Wert liegt bei etwa 5 bis 6 und der stabile pH-Wert liegt bei 4 bis 9; und
(b) die optimale Wirkungstemperatur liegt bei etwa 15 bis 35ºC.
Die obigen Eigenschaften (a) und (b) werden gemessen durch Verwendung üblicher Puffer, insbesondere Tris-HCl-, Mes-kaliumhydroxid-, Tes-natriumhydroxid- und Hepes-kaliumhydroxid-Puffer. Die Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann die obige Reaktion innerhalb des Temperaturbereiches von 1ºC bis 55ºC katalysieren, wird jedoch inaktiviert innerhalb von 10 Minuten bei 56ºC, wobei eine geringe Inaktivierung auch um 40ºC beobachtet wird.

Herstellung der Enzyme

Das Enzym-I und das Enzym-II der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, können nach der Trennungs-Reinigungsmethode von Enzymen hergestellt werden, die an sich bekannt ist, doch werden sie vorzugsweise nach der Herstellungsmethode der vorliegenden Erfindung hergestellt, die in der vorliegenden Beschreibung beschrieben wird. Ganz speziell ist es möglich, die Herstellungsmethode des Enzyms-I oder des Enzyms-II anzuwenden, die gekennzeichnet ist durch Behandlung der die Enzymaktivität enthaltenden Verbindung des Enzyms-I oder des Enzyms-II mit der Substrat-Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung des C-terminalen Glycinadduktes gemäß der obigen Formel (I) als dem Liganden und der Anionenaustauscher-Chromatographie.
Zu der Enzymaktivität enthaltenden Verbindung, die in dieser Methode verwendet wird, können alle jene Verbindungen gehören, welche das Enzym der vorliegenden Erfindung enthalten, und bei ihnen kann es sich um entweder solche handeln, die sich von einem Organismus ableiten, oder um solche, die künstlich bereitgestellt werden. Ganz allgemein gesprochen, können zu den Organismen mit diesen Enzymaktivitäten solche Präparate gehören, die sich ableiten von Säugern, wie dem Menschen, dem Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Kaninchen, der Ziege, Ratte, Maus usw.; von Vögeln, wie zum Beispiel dem Huhn, dem Urwaldhuhn, der Felsentaube usw.; von Reptilien, wie zum Beispiel der Steinschildkröte, der Viper, der Klapperschlange und Kobra; von Wassertieren (Tatrachian), wie Wassermolchen, Xenopus, Ochsenfrosch, Kröten usw.; von Fischen, wie zum Beispiel dem Neunauge, dem Hexenfisch, dem Ölhai, dem elektrischen Rochen, dem Stör, dem Hering, dem Lachs, Aal, Tetrodon Rubripes, der Brasse; Insekten, wie zum Beispiel Coakroach, dem Seidenwurm, der Drosophila und der Biene. Als geeignetes, zu extrahierendes Material können Homogenisate verwendet werden, die sich ableiten von solchen Organen, wie dem Gehirn, der Hypophyse, dem Magen, Herzen und der Leber, wie auch biologische Flüssigkeiten, enthaltend Körperflüssigkeiten, wie zum Beispiel Blut und Lymphflüssigkeit.
Genauer gesagt, kann das Enzym der vorliegenden Erfindung (Enzym-I oder Enzym-II) aus der biologischen Flüssigkeit mit dem vorliegenden Enzym, wie oben beschrieben, hergestellt werden, durch Substrat-Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung des C-terminalen Glycinadduktes, das durch die folgende Formel (I) dargestellt wird:
(worin A und X die oben angegebene Bedeutung haben) als dem Liganden, angewandt gegebenenfalls in Kombination mit der konventionellen Methode, wie:
(1) Fraktionierung durch Ausfällung;
(2) Heparin-Affinitäts-Chromatographie;
(3) Molekulargewicht-Fraktionierungsmethode durch Dialyse, Gel-Filtration usw.; und/oder
(4) Ionenaustauscher-Chromatographie.
Als dem oben erwähnten Liganden können sämtliche C-terminale Peptid-Glycinaddukte gemäß der obigen Formel (I) verwendet werden, doch vorzugsweise gehören hierzu die Peptide mit 2 bis 6 Aminosäureresten einschließlich Glycin als einem speziell bevorzugten Substrat für die Identifizierung der oben erwähnten Enzymaktivität. Unter diesen sind D-Tyr-Trp-Gly, Phe-Gly-Phe- Gly und Gly-Phe-Gly die bevorzugteren, doch ist die Verwendung von Phe-Gly-Phe-Gly als Ligand besonders vorteilhaft aufgrund einer starken Affinität für die Enzymzusammensetzung der vorliegenden Erfindung (auch als das vorliegende Enzym bezeichnet).
Diese Liganden werden im allgemeinen an einen in Wasser unlöslichen Träger gebunden verwendet, und es ist wichtig, daß die Carboxylgruppe des C-terminalen Glycinrestes des Peptides, das als Ligand verwendet wird, sich in einem freien Zustand befindet oder an den Trägerrest über die Aminogruppe des Aminosäurerestes an dem N-Terminal anbindbar ist. Mit anderen Worten, der Träger kann ein solcher sein, der an die Aminogruppe des Peptides gebunden werden kann, und eine aktive Gruppe, die mit der Aminogruppe reaktiv ist, kann chemisch in den Träger eingeführt werden oder alternativ kann ein im Handel zur Verfügung stehender Träger mit der aktiven Gruppe, die bereits eingeführt worden ist, verwendet werden. Die Methode der chemischen Einführung kann aus jeder beliebigen Methode bestehen, die allgemein angewandt wird. Beispielsweise, wie beschrieben in "Seikagaku Jikkenhou, Band 5, frühere Ausgabe, S. 257-281", beschrieben von Kasai, Tokyo Kagaku Dojin (1975), wird die Imidocarboxylgruppe in Agarose durch Verwendung von Bromcyanid eingeführt. Zu im Handel erhältlichen aktivierten Trägern können gehören solche vom Agarosetyp, Cellulosetyp, hydrophilen Polyvinyltyp usw., mit dem Substrat als dem Index, doch können beliebige von diesen verwendet werden. Zu den Trägern vom Agarosetyp können gehören mit CNBr aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von der Firma Pharmacia), in welchem Falle das CNBr-Verfahren angewendet wird zur Bindung des Liganden an die Aminogruppe, CH-Sepharose 4B, ECH-Sepharose 4B (sämtlich hergestellt von der Firma Pharmacia) durch die Carbodiimidmethode, Affigel 10, Affigel 15 (sämtlich hergestellt von der Firma Biorad), die mit Tresyl aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von der Firma Pharmacia) durch Anwendung der Tresylchloridmethode, usw. Zu den Trägern vom Cellulosetyp gehört Formylcellulofine (hergestellt von der Firma Chisso) unter Anwendung der Formylmethode. Zu den Trägern vom hydrophilen Polyvinyltyp können gehören AF-Carboxyltoyopearl 650, hergestellt durch Anwendung der Carbodiimidmethode, AF-Formyltoyopearl 650, hergestellt durch Verwendung der Formylmethode, AF-Tresyltoyopearl 650, hergestellt durch Verwendung der Tresylchloridmethode, AF-Epoxytoyopearl 650, hergestellt durch Verwendung der Epoxy-Aktivierungsmethode (sämtlich hergestellt von der Firma Toso), usw. Die Bindungsreaktion mit dem Liganden kann nach den Instruktionen für jeden Träger erfolgen.
Von diesen Methoden wird die Methode der Herstellung von Affigel 10 beschrieben. Die Umsetzung zwischen Affigel 10 und dem Peptid erfolgt in einem Puffer, wie Mops-kaliumhydroxid, usw. von 0,001 bis 1 M, vorzugsweise von 0,1 M. Die Reaktionsbedingungen können sein 0 bis 20ºC, 10 Minuten bis 24 Stunden, bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 11, vorzugsweise jedoch bei 4ºC, 4 bis 24 Stunden und bei einem pH-Wert von 5 bis 9. Das Mischungsverhältnis von Affigel 10 zu dem Peptid, das zur Bindung angewandt wird, kann innerhalb des Bereiches von bis zu 25 -Mol pro 1 ml Affigel liegen, da mehr gebunden wird, wenn das Peptid in einer größeren Menge innerhalb dieses Bereiches zugesetzt wird, doch werden in zweckmäßiger Weise etwa 1 bis 20 µMol im Hinblick auf die Bindungswirksamkeit verwendet. Nach der Umsetzung wird die Mischung gründlich mit dem während der Reaktion verwendeten Puffer gewaschen, und dann wird Tris-HCl (pH-Wert 8,0) zu der Endkonzentration von 50 mM zugegeben und die nicht umgesetzten aktiven Gruppen werden nach der Schüttelmethode bei 4ºC über einen Zeitraum von einer Stunde blockiert usw., wodurch das Substrat-Affinitäts-Gel hergestellt wird.
Die Substrat-Affinitäts-Chromatographie kann entweder chargenweise oder kontinuierlich durchgeführt werden mit dem in eine Kolonne eingefüllten Gel. Die Zeitdauer für das Kontaktieren der Probe mit dem Gel kann derart sein, daß das vorliegende Enzym ausreichend adsorbiert werden kann, liegt jedoch im allgemeinen bei 20 Minuten bis 24 Stunden. Nicht-adsorbierte Komponenten werden mit einem Puffer abgewaschen, der die gleiche Zusammensetzung aufweist, als derjenige, der für die Gleichgewichtseinstellung des Gels verwendet wurde, mit einer niedrigen ionischen Stärke und einem pH-Wert von 6,0 bis 11,0, vorzugsweise 7,0 bis 9,0, zum Beispiel 10 mM Hepes-kaliumhydroxid (pH- Wert 7,0). Unter anderen werden die Fraktionen, in denen die vorliegende Enzymaktivität existiert, eluiert. Die Eluierungslösung kann jede beliebige Zusammensetzung aufweisen, die mit guter Wirksamkeit zu dem vorliegenden Enzym führt, doch enthalten vorzugsweise Beispiele Puffer mit einem pH-Wert zwischen 7,0 und 9,0, enthaltend etwa 1 bis 40% Acetonitril zusammen mit 0,1 bis 1 M Natriumchlorid, wie zum Beispiel 10 mM Hepesnatriumhydroxid (pH-Wert 7,0), enthaltend 20% Acetonitril sowie 0,4 M Natriumchlorid. Ferner kann nach Einfüllung in die Kolonne die Eluierung unter Anwendung des Konzentrationsgradienten durchgeführt werden.
Ferner kann in manchen Fällen vor oder nach Durchführung der oben beschriebenen Substrat-Affinitäts-Chromatographie [im folgenden dargestellt durch (5)] oder sowohl vor- und nachher, die Fraktionierung auch durchgeführt werden durch Ausfällung, wie oben beschrieben [im folgenden dargestellt durch (1)], die Heparin-Affinitäts-Chromatographie [im folgenden dargestellt durch (2)] Dialyse, Molekulargewichts-Fraktionierung durch Gel-Filtration, usw. [im folgenden dargestellt durch (3)] und/oder Ionenaustauscher-Chromatographie [im folgenden dargestellt durch (4)]. Infolgedessen können die vorliegenden Enzyme (Enzym-I und Enzym- II) von anderen störenden Stoffen getrennt werden und zur Trennung des Enzyms-I und des Enzyms-II ist es wirksam, die Stufen (3) und/oder (4) durchzuführen. Ganz allgemein gesprochen, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Gesamtzahl der Stufen 1 bis 6 und weiterhin die obigen Stufen (5) oder (3) als Endstufe durchzuführen. Spezielle Beispiele der Kombinationen der entsprechenden Stufen können lediglich aufweisen:
Unter diesen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Stufen in der Reihenfolge durchgeführt werden:
Im folgenden werden die obigen Stufen (1) bis (4) beschrieben. Diese Stufen werden sämtlich bei 0ºC bis 10ºC, vorzugsweise bei 4ºC durchgeführt.
Als Substanz, die zur Fraktionierung gemäß der Ausfällung von (1) verwendet wird, können zugesetzt werden Salze, wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, usw., organische Lösungsmittel, wie Ethanol, Aceton, usw., Polymere, wie Polyethylenglykol usw. Die zugegebene Konzentration ist nicht besonders beschränkt, doch hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Bedingungen anzuwenden, unter denen das vorliegende Enzym mit guter Wirksamkeit gewonnen werden kann und von anderen Proteinkomponenten abgetrennt werden kann. Wenn beispielsweise 30 bis 50% gesättigtes Ammoniumsulfat, 10 bis 15% (w/v) Polyethylenglykol 6000 zugegeben werden, so gelangt das vorliegende Enzym in die ausgefällte Fraktion, wohingegen viele Proteine in dem überstehenden Teil verbleiben, wodurch die Reinigung mit guter Wirksamkeit durchgeführt werden kann. Die Zugabe kann in vorteilhafter Weise allmählich unter Rühren mit einem Rührer erfolgen. Nachdem die Mischung mindestens eine Stunde lang nach Beendigung der Zugabe stehengelassen worden ist, werden die Fraktionen, in denen das vorliegende Enzym existiert, durch Zentrifugieren gewonnen. Nachdem die ausgefällte Fraktion erhalten worden ist, wird sie in einem geeigneten Puffer gelöst. Der Puffer, vorausgesetzt, er weist einen pH-Wert von 6,0 bis 11,0, vorzugsweise 7,0 bis 9,0, auf, kann jede beliebige Zusammensetzung aufweisen, wie beispielsweise im Falle von Tris-HCl, Hepes-kaliumhydroxid, Tes-natriumhydroxid, usw. Die Konzentration ist innerhalb des Bereiches, der die Pufferwirkung zeigt, nicht besonders beschränkt, liegt jedoch vorzugsweise bei etwa 5 bis 50 mM.
Die aktive Fraktion, die gemäß (1) erhalten worden ist, kann von neuem (1) unterworfen werden oder jeder beliebigen Stufe von (2) bis (5) zugeführt werden, doch ist es bei Durchführung von (2), (4) oder (5) bei Verwendung eines Salzes, wie Ammoniumsulfat, für die Fraktionierung von (1) erforderlich, die Salzkonzentration auf ein Niveau zu vermindern, bei dem das vorliegende Enzym gebunden werden kann an das in der Stufe (3) oder in der nachfolgenden Stufe verwendete Gel unter Zugabe eines geeigneten Puffers. Andererseits können sich, wenn die Niederschläge gelöst und eine Stunde lang oder länger stehengelassen werden, oder wenn eine Dialyse durchgeführt wird, unlösliche Substanzen bilden, die durch Zentrifugieren oder Filtration entfernt werden.
Wie im Falle der Heparin-Affinitäts-Chromatographie von (2) kann sie entweder chargenweise oder kontinuierlich durch Füllung des Gels in eine Kolonne durchgeführt werden. Zu im Handel erhältlichen Gelen mit Heparin als dem Liganden können gehören Heparin-Sepharose CL-6B (Hersteller Pharmacia), Affigel-Heparin (Hersteller Biorad), Heparin-Agarose (Hersteller Sigma), AF-Heparintoyopearl 650 (Hersteller Toso).
Der biologische Extrakt wird direkt oder nach der Behandlung der Fraktion durch Ausfällung, wie in (1) gezeigt, mit dem Heparin-Affinitäts-Gel in Kontakt gebracht. Die Kontaktdauer kann derart sein, daß das vorliegende Enzym in ausreichender Weise adsorbiert wird, beträgt jedoch im allgemeinen 20 Minuten bis 12 Stunden. Die Komponenten, die keine Affinität für Heparin aufweisen, werden mit einem Puffer entfernt, der eine geringe Ionenstärke bis zu dem Ausmaß aufweist, daß kein vorhandenes Enzym bei einem pH-Wert von 6,0 bis 11,0, vorzugsweise 7,0 bis 9,0, eluiert wird, beispielsweise mit 10 mM Hepes-kaliumhydroxid (pH 7,0). Daraufhin werden die Fraktionen, die das vorliegende Enzym enthalten, eluiert. Als Eluierungslösung wird bevorzugt eine solche verwendet, die einen höheren Gewinnungsgrad der vorliegenden Enzymaktivität aufweist. Beispielsweise wird verwendet eine solche mit einem pH-Wert von 6,0 bis 11,0, die ein Salz enthält, das ganz allgemein für eine Enzymreinigung verwendet wird, wie 0,5 M-2 M Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Ammoniumsulfat usw. Die Eluierung kann gemäß dem Salz-Konzentrationsgradienten bei Packung in der Kolonne durchgeführt werden, jedoch kann auch eine einstufige Eluierung durchgeführt werden. Beispielsweise kann eine Eluierung erfolgen mit 10 mM Hepes-kaliumhydroxid-Puffer (pH-Wert 7,0), enthaltend 0,3 bis 2,0 M Natriumchlorid.
Die in der Stufe (2) erhaltene aktive Fraktion kann ferner für beliebige der Stufen (1) bis (4) bereitgestellt werden, oder wenn die Stufe (2) wiederum durchgeführt wird, vor den Stufen (4) oder (5), kann die Stufe (3) zuvor durchgeführt werden oder die Ionenstärke kann auf einen Grad vermindert werden, bei dem das vorliegende Gel an das Gel adsorbiert werden kann, das in (2), (4) oder (5) verwendet wird, durch Zugabe einer großen Menge eines Puffers von 50 mM oder weniger mit einer niedrigen Ionenstärke und einem pH-Wert von 6,0 bis 11,0, vorzugsweise 7,0 bis 9,0, zum Beispiel 5 mM Hepes-kaliumhydroxid (pH-Wert 7,0).
Wie für die Stufe der Entfernung von Substanzen eines niedrigen Molekulargewichtes durch Dialyse, Gel-Filtration, usw. von (3) kann im Falle der Dialyse die Membran, die verwendet wird, ein Abtrenn-Molekulargewicht bis zu dem Ausmaße aufweisen, daß das vorliegende Enzym nicht hindurchgelangen kann, doch liegt es vorzugsweise bei 1000 bis 10 000. Die Methode der Dialyse kann eine sein, die ganz allgemein angewandt wird und beschrieben wird, beispielsweise in "Seikagaku Jikken Kouza, Band 5, erster Band, S. 252-253", verfaßt von Soda, Tokyo Kagaku Dojin (1975), und kann über mehrere Stunden bis mehrere Tage durchgeführt werden, und zwar gegen einen Puffer mit einer niedrigen Ionenstärke eines pH-Wertes von 6,0 bis 11,0, vorzugsweise eines pH-Wertes von 7,0 bis 9,0, wie zum Beispiel 10 mM Hepeskaliumhydroxid (pH-Wert 7,0), 10 mM Tris-HCel (pH-Wert 7,5) usw. Ferner werden während der Dialyse, wenn unlösliche Substanzen ausgefällt werden, diese entfernt, beispielsweise durch Zentrifugieren, Filtration usw.
Was die Gel-Filtration anbelangt, so kann jeder beliebige Träger verwendet werden, der ganz allgemein zur Gel-Filtration verwendet wird. Vorzugsweise werden verwendet beispielsweise Sephadex G-10, G-15, G-25, G-50, G-75, G-100, Sephacryl 5-200, 5-300 (sämtlich hergestellt von der Firma Pharmacia), Toyopearl HW-40, HW-55 (hergestellt von der Firma Toso), Biogel P-2, P-4, P-6, P-10, P-30, P-60, P-100 (sämtlich hergestellt von der Firma Biorad) usw. Der zu verwendende Puffer kann die gleiche Zusammensetzung aufweisen wie die, die während der Dialyse verwendet werden. Ist die Ionenstärke jedoch zu gering, so ist zu beachten, daß eine Adsorption des vorliegenden Enzyms an das Gel erfolgen kann, weshalb die Konzentration auf 5 bis 200 mM, vorzugsweise 10 bis 20 mM eingestellt wird. Die Methode der Gel-Filtration kann durchgeführt werden nach der Methode, wie sie beispielsweise beschrieben wird in "Seikagaku Jikken Kouza, Band 5, erste Ausgabe, S. 283-298", verfaßt von Soda, Tokyo Kagaku Dojin (1975). Nachdem eine Probe in einer ausreichenden Menge zugegeben worden ist, um eine Trennungskapazität bezüglich des Bettvolumens des Gel-Filtrationsträgers zu erzielen, wird eine Eluierung durchgeführt und die Fraktion, in der die Aktivität des vorliegenden Enzyms existiert, wird gewonnen.
Die gemäß der Stufe (3) gewonnene Fraktion kann den entsprechenden Stufen (1) bis (5) unterworfen werden, ohne eine jede spezielle Behandlung.
Zur Durchführung der Ionenaustauscher-Chromatographie können beliebige Träger verwendet werden, die im Handel ganz allgemein für die Ionenaustauscher-Chromatographie erhältlich sind. Vorzugsweise werden beispielsweise verwendet Aminex, Dowex, Amberlite, SP-Sephacryl M, Asahipak, DEAE-Toyopearl, DEAE-Sephadex, CM-Sepharose, DEAE Bio-Gel A, CM-Cellulose, DEAE-Cellulofine, Partisil SCY, Mono Q und Mono S, usw. Der zu verwendende Puffer und die Anwendungsmethode können der Methode entsprechen, die für den Fall der Heparin-Affinitäts-Gelmethode beschrieben wurden. Die grundlegenden Verfahrensmethoden können denen entsprechen, wie sie ganz allgemein beschrieben werden in "Shinkiso Seikagaku Jikkenho 2, Extraction-Purification-Analysis I" (Maruzen, 1988) usw.
Die aktiven Fraktionen, die in der Stufe (4) erhalten worden sind, können einer jeden der Stufen (1) bis (5) unterworfen werden, doch, falls wiederum (4) durchgeführt wird oder (2) bis (5) vorangestellt wird, muß (3) zuvor durchgeführt werden, oder eine große Menge an Puffer eines pH-Wertes von 5,0 bis 11,0, vorzugsweise 6,0 bis 8,0, mit niedriger Ionenstärke von 50 mM oder darunter, beispielsweise Hepes-natriumhydroxid (pH-Wert 7,0), usw., muß zugesetzt werden, um die Ionenstärke auf ein Niveau zu vermindern, bei dem das vorliegende Enzym an das in (2), (4) oder (5) verwendete Gel adsorbiert wird. Nach Durchführung der Reinigungsstufen, wie oben erwähnt, kann das rohe Produkt des Enzyms der vorliegenden Erfindung erhalten werden. Ein solches rohes Enzymprodukt kann weiterhin in Form von Fraktionen isoliert werden, die Spitzen bei einem Molekulargewicht von etwa 25 000 bzw. bei einem Molekulargewicht von 40 000 aufweisen, durch Protein-Abtrennungsmittel, unter Anwendung der Gel-Filtrationsstufe (3), um ein Präparat des vorliegenden Enzyms zu erhalten.
Die entsprechenden Stufen, die oben beschrieben wurden, können durchgeführt werden unter Überwachung der Aktivität des Enzyms-I und/oder des Enzyms-II durch Verwendung der Verbindung der Formel (I) oder der Formel (II) als Substrat, unter Anwendung der Bestimmungsmethode der Aktivität des Enzyms, die eine weitere Erfindung, wie weiter unten beschrieben, darstellt, um die aktive Fraktion zu gewinnen.
Das Enzym-I und das Enzym-II der vorliegenden Erfindung können ferner hergestellt werden durch Kultivierung von Wirtszellen, die mit einem Plasmid transformiert wurden, das eine cDNA enthält, die für dieses Enzym codiert, das die cDNA exprimieren kann, und Abtrennung von einem oder beiden der Enzyme aus dem kultivierten Produkt, das erzeugt wurde und dadurch akkumuliert wurde.
Die cDNA, die für das Enzym der vorliegenden Erfindung codiert, die in dieser Methode verwendet werden kann, kann irgendeine sein, unabhängig von ihrem Ursprung, vorausgesetzt, daß sie sich von einer DNA ableitet, die für die Aminosäuresequenz eines C- terminalen Peptid-Amidierungsenzyms codiert, das existiert in Säugern, wie dem Menschen, Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Kaninchen, der Ziege, Ratte, Maus usw.; Geflügel (avian), wie dem Huhn, Truthahn, usw.; Tatrachian, wie zum Beispiel dem Frosch, usw.; Reptilien, wie zum Beispiel der Schlange, usw.; dem Fisch, wie zum Beispiel der Sardine, der Makrele, dem Aal, dem Lachs, usw., und die Sequenz von Lys-Lys existiert in annähernd dem zentralen Teil der cDNA, ist jedoch vorzugsweise eine solche, die sich von einem Säuger ableitet. Genauer gesagt ist sie ein DNA- Fragment, das für die Aminosäuresequenz, wie in Fig. 5 dargestellt, codiert, erhalten durch Einführung der Aminosäuresequenz eines C-terminalen Peptid-Amidierungssystems, das zum gegenwärtigen Zeitpunkt bekannt ist durch eine Ein-Buchstaben-Darstellung der Aminosäure, und dennoch kann der fehlende Anteil (dargestellt durch -) wie gewünscht, um die Homologie zwischen den Species zu steigern, und die cDNA mit dem Teil entsprechend dem hydrophoben Aminosäurebereich in der Umgebung des C-Terminals hiervon, das entfernt ist, in vorteilhafter Weise verwendet werden. Die entsprechenden cDNA's werden beschrieben für den Menschen, das Pferd, das Rind, die Ratte, den Frosch I bzw. den Frosch II, in Biochem. Biophys. Res. Commun. 169, 551-558, 1990; in der japanischen Patentanmeldung Nr. 2 (1990)-76331; in Mol. Endocrinol, 1, S. 777-790, 1987; in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, S. 735-739, 1989; in Biochem. Biophys. Res. Commun., 148, S. 546-552, 1987; sowie in Biochem. Biophys. Res. Commun., 150, 1275-1281, 1988. Von diesen beispielsweise entsprechen einander die Sequenz des Pferdes in Fig. 5, die 441ste und die 442ste K (Lysin) und K (Lysin) Sequenzen. Die Sequenzen sind in den cDNA's des Menschen, des Pferdes, des Rindes, der Ratte gut gespeichert. Die cDNA an dem ersteren Halbteil (5'-Seite), denn diese Sequenzen codieren für das Protein mit der Aktivität der Einwirkung auf ein C-terminales Peptid-Glycinaddukt, dargestellt durch die Formel (I) unter Erzeugung eines C-terminalen α-Hydroxylglycins, dargestellt durch die Formel (II), wohingegen die cDNA im letzteren Halbteil (3'-Seite) als die KK-Sequenzen für das Protein codieren, das die Aktivität der Einwirkung auf ein C-terminales Glycinaddukt hat, unter Bildung einer C-terminalen amidierten Verbindung, die dargestellt wird durch die Formel (III) und Glyoxylsäure. An der Stelle in der Umgebung von solchen KK-Sequenzen kann die cDNA in den ersteren Halbteil und den letzteren Halbteil getrennt werden unter Verwendung einer Restriktionsendonuklease, die an sich bekannt ist.
Beispielsweise entspricht, gemäß der Pferdesequenz in Fig. 5, der Bereich von V (Valin) von der 880sten bis I (Isoleucin) der 901ten dem oben erwähnten hydrophoben Aminosäurebereich. Infolgedessen bezieht sich der Membran-Transportbereich, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, auf den oben erwähnten hydrophoben Aminosäurebereich der beschriebenen cDNA. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß, da die cDNA, von der der oben erwähnte Bereich entfernt worden ist, nicht nur das Enzym ausscheidet, das sämtlich von dem Wirt hergestellt worden ist, sondern merklich auch die gesamte erzeugte Menge erhöht, solch eine cDNA besonders zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Da das Enzym-I und das Enzym-II codiert sind auf cDNA, gegenseitig zueinander benachbart, wie oben beschrieben, diese Enzyme jedoch separat freigesetzt werden durch Verarbeitung in dem Ausscheidungsprozeß in den Zellen, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die cDNA zu verwenden, von der der oben beschriebene Membran-Transportbereich entfernt worden ist. Eine solche cDNA kann hergestellt werden durch Abtrennung des Teiles durch Verwendung einer bekannten Restriktionsendonuklease, die an sich bekannt ist, von der bekannten cDNA, oder sie kann auch aus verschiedenen cDNA's ausgewählt werden, die erzeugt werden durch Unterschiede im Spleissen von mRNA zum Zeitpunkt der Klonierung der cDNA. Eine cDNA, die für das Enzym-I und das Enzym-I I unabhängig codiert, die, wie oben beschrieben abgetrennt wurde, kann ebenfalls verwendet werden.
Das Klonieren der cDNA, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durchgeführt werden nach der Methode, die allgemein bekannt ist, unter Verwendung einer Vielfalt von Geweben von verschiedenen Tieren, wie oben beschrieben. Speziell kann sie praktiziert werden gemäß der allgemein angewandten Methode, wie zum Beispiel der +, -Methode, der Hybridisierungsmethode, der PCR-Methode, usw. (s. zum Beispiel Methods in Enzymology, Band 152; Guide to Molecular Cloning Techniques, S.L. Berger und A.R. Kimmel, Hrsg., 1987, Verlag Academic Press, INC.; Methods in Molecular Biology, Band 4; New Nucleic Acid Techniques, J.M. Walker, Hrsg., 1988, The Humana Press Inc.; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Hrsg., 1989, Verlag Cold Spring Harbor Laboratory Press), wobei der cDNA-Bereich, der für das Protein codiert, bestimmt wird durch Bestimmung der Basensequenz des erhaltenen cDNA-Klons, und wobei die gewünschte cDNA erhalten werden kann durch Abtrennung der cDNA an etwa dem KK-Sequenzteil an dem zentralen Teil, wie oben beschrieben.
Unter Bezugnahme auf ein Beispiel der Ratte wird ein Gewebe, das reichlich ein C-terminales Peptid-Amidierungsenzym bildet, beispielsweise eine Ratten-Hypophyse, zusammen mit Guanidylthiocyanat, das die Zellen aufbricht, homogenisiert, und die RNA-Fraktion wird erhalten durch eine Cäsiumchlorid-Äquilibrierungs-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation. Anschließend wird
durch Affinitäts-Chromatographie mit einem oligo-dT-Celluloseträger eine RNA mit einer Poly-A (Poly-A&spplus;RNA) von der oben beschriebenen RNA-Fraktion isoliert.
Durch Verwendung der Poly-A&spplus;RNA als Templat wird eine genomische cDNA-Bibliothek nach der Methode erhalten, die aus dem Stande der Technik bekannt ist, vorzugsweise nach der Methode von Okayama-Berg (Mol. Cell. Biol. 2, 161, 1982). Aus diesen genomischen cDNA-Bibliotheken kann eine geeignete Sonde dazu verwendet werden, um ein positives Klon auszuklassieren, ein positives cDNA-Klon, erhalten durch Re-Klassifizierung (rescreening) durch Verwendung einer geeigneten Sonde von den verstärkten isolierten genomischen cDNA-Bibliotheken, und die Struktur der gewünschten cDNA kann bestimmt werden durch Kartierung und Sequenzierung dieser Restriktionsendonuklease. Ferner kann durch Einführung der oben erwähnten cDNA in einen Expressionsvektor und Untersuchung der Produktivität des C-terminalen amidierenden Peptidenzyms des hiermit transformierten Wirts, ein Plasmid mit der gewünschten cDNA ausgewählt werden.
Der Wirt für die Exprimierung der cDNA kann aus Zellen von Mikroorganismen bestehen, wobei solche wie E. coli., Bacillus subtilis, Hefe, usw., kultivierten Zellen, die von Insekten abstammen, von Tieren usw., in geeigneter Weise verwendet werden können. Das Expressionsplasmid kann ein beliebiges Plasmid sein, das die cDNA in diesen Zellen wirksam exprimiert. Beispielsweise kann es in geeigneter Weise aus jenen ausgewählt werden, die in Lehrbüchern, wie unten beschrieben, erwähnt werden.
Zoku Seikagaku Jikken Koza I, Idenshi Kenkyuho II - Recombinant DNA technique - Kapitel 7, Expression of Recombinant (1986), herausgegeben von der Society of Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin; Recombinant DNA, Teil D, Abschnitt II, Vectors for Expression of Cloned Genes, (1987), herausgegeben von RayWu und Lawrence Grossmann, Verlag Academic Press, INC.; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Buch 3, (1989), herausgegeben von J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Verlag Cold Spring Harbor Laboratory Press; usw.
Beispielsweise, wenn CV-1, das üblicherweise als die tierischen Kultivierungszellen verwendet wird, als Wirt verwendet wird, so kann ein Promoter des Typs pSV, pL2n, pCol, der gegebenenfalls einen Auswahl-Marker aufweist, hiermit verwendet werden. Wie für E. coli, kann ein Vektor des Typs pGH, pKYP, pHUB verwendet werden, während für Hefe ein Vektor des Typs YRp, YEp verwendet werden kann. Eine Rekombination mit diesen cDNA's dieser Vektoren sowie Transformationen, Transfektionen dieser Wirtszellen mit den rekombinierten Plasmiden können nach Verfahren der Methoden durchgeführt werden, die an sich aus der Literatur bekannt sind, wie sie oben beschrieben wurde. Die so erhaltenen transformierten Zellen können in einem Medium kultiviert werden sowie unter Kulturbedingungen, die üblicherweise angewandt werden für die Proliferation der abgeleiteten Zellen.
Das C-terminale Peptid-Amidierungsenzym, das von solchen kultivierten Produkten erzeugt und akkumuliert wurde, kann leicht von der Kulturbrühe abgetrennt werden nach Entfernung der Zellen im Falle von beispielsweise der Verwendung von tierischen kultivierten Zellen, da das produzierte Enzym aus diesen Zellen ausgeschieden wird, wobei es jedoch auch aus dem Zellenlysat isoliert werden kann, falls dies erforderlich ist. Eine solche Abtrennung und Reinigung kann nach üblichen Reinigungsverfahren für Enzyme durchgeführt werden, wie beispielsweise durch eine Kombination einer Fraktionierung durch Ausfällung, durch Heparin-Affinitäts-Chromatographie und Dialyse usw., jedoch weiterhin vorzugsweise durch gemeinsame Anwendung der Substrat- Affinitäts-Chromatographie mit der Verwendung des C-terminalen Peptid-Glycinadduktes als dem Liganden.
Gemäß Fig. 5 entspricht das Enzym-I der vorliegenden Erfindung der Aminosäuresequenz vom 42sten Rest P oder S bis zum 442sten Rest K im Falle des Menschen, des Pferdes, des Rindes und der Ratte und entspricht der Aminosäuresequenz von dem 42sten Rest P oder S bis zu dem 231sten Rest K im Falle des Pferdes und des Rindes. Andererseits entspricht das erhaltene Enzym-II der Aminosäuresequenz vom 443sten Rest D bis zum 830sten Rest K im Falle des Menschen, des Pferdes, des Rindes bzw. der Ratte. Der Ausdruck "entspricht", der hier verwendet wird, schließt jene Fälle ein, in denen ein Saccharid durch N-Acetylglucosamin gebunden ist.

Verwendung des Enzyms

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung des Enzyms der vorliegenden Erfindung, wie unten beschrieben, d. h. ein Verfahren zur Herstellung eines C-terminalen Peptid-α-Hydroxylglycinadduktes, dargestellt durch die obige Formel (II), das umfaßt die Behandlung eines C-terminalen Peptid-Glycinadduktes, dargestellt durch die obige Formel (I) mit dem obigen Enzym-I, sowie ein Verfahren zur Herstellung einer C-terminalen amidierten Peptidverbindung, dargestellt durch die obige Formel (III), das umfaßt die Behandlung des obigen Adduktes, dargestellt durch die Formel (II), mit dem Enzym-II. Ferner kann durch Verwendung des Enzyms-I und des Enzyms-II in Kombination die Verbindung der Formel (I) in die Verbindung der Formel (III) in einer einzelnen Reaktionszusammensetzung überführt werden. Die Verwendung des Enzyms-II in der Stufe der Umwandlung der Verbindung der Formel (I) in die Verbindung der Formel (III) ist, wie leicht verständlich ist, bedeutsam, da die oben erwähnte Umwandlung unter milderen Enzym-Reaktionsbedingungen durchgeführt werden kann, im Vergleich mit dem Fall, bei dem lediglich das Enzym des Enzym-I-Typs vorliegt, wo es chemischen Hydrolysebedingungen unterworfen werden muß, um die Verbindung von der Formel (II) in die Formel (III) zu überführen. Insbesondere sind diese Methode geeignet für eine Behandlung von instabilen Substraten unter alkalischen Bedingungen.
Es können alle Herstellungsverfahren angewandt werden, vorausgesetzt, sie enthalten das Enzym der vorliegenden Erfindung, unabhängig von der Konzentration und Reinheit, doch ist es vorteilhaft, das das Enzym enthaltende Produkt zu verwenden, aus dem die störenden Proteine zu einem großen Teil entfernt worden sind, im Hinblick auf die Isolationsreinigung des Produktes aus der Reaktionsmischung der Verbindung der Formel (II).
Als die Verbindungen der Formeln (I) und (II) sind alle von den oben beschriebenen eingeschlossen, die Verbindungen entsprechen, die durch die Formel (I) oder die Formel (II) wiedergegeben werden, die gemäß der vorliegenden Herstellungsmethode in die Verbindung der Formel (III) überführt werden können, wie zum Beispiel Arginin-Vasotocin (AVT), lutenisierendes, Hormon freisetzendes Hormon (LH-RH), Oxytocin, Gastrin, ein die Gastrin-Sekretion förderndes Peptid (GGRP), Calcitonin (CT), vasoaktives Intestinal-Polypeptid (VIP), Throtropin freisetzendes Hormon (TRH), Melanophor stimulierendes Hormon (MSH), MSH-Freisetzung inhibierendes Hormon (MIH), Cholecystokinin-Qctapeptid (CCK-8), Substanz P (SP), Adipokinin, pankreatisches Polypeptid (PP) Wachstumshormon freisetzender Faktor, Secretin, Caerulein, Mollusken-cardiostimulierendes Neuropeptid, Vasopressin, adrenocoricotropisches Hormon (ACTH), allochroisches Hormon, Bombesin, leichtes Adaptationshormon, Motilin, Apamin, Allitecin, Eredoicin, Catcinin, Granulibellin R, Scotophobin, Hyranbatecaerulein, ein Fettsuchtzellen-Degranulationspeptid, Physaremin, Phyllocaerulein, Phyllomezcin, Promellitin, Bombinin, Mastoballan, Manitoballan-X, Mellitin-1, Lanatensin, Lanatensin-R.
Die oben beschriebene Behandlung kann in einem üblichen Puffer durchgeführt werden, insbesondere unter Zugabe von Ascorbinsäure und Catalase in der Reaktionsmischung in der Reaktion unter Verwendung des Enzyms-I, doch hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Reaktion unter den Bedingungen der Bestimmungsmethode der Enzymaktivität wie unten beschrieben durchzuführen.
Bestimmungsmethode der Enzymaktivität sowie Methode der Auswahl des neuen Enzyms durch Anwendung des Verfahrens Das Enzym-I und das Enzym-II der vorliegenden Erfindung, wie oben beschrieben, können in Übereinstimmung mit der Bestimmungsmethode der Aktivität, wie unten beschrieben, überwacht werden und die Bestimmungsmethode eignet sich zur Durchführung der Herstellungsmethode der vorliegenden Enzyme, wie oben beschrieben.
Diese Bestimmungsmethoden beruhen auf der Erkenntnis, daß die C-terminale Peptid-Amidierungsreaktion keine einstufige Reaktion ist, wie nach dem Stande der Technik angenommen wurde, sondern eine zweistufige Reaktion, die über eine Zwischenverbindung verläuft (C-terminales Peptid-α-Hydroxylglycinaddukt).
Zunächst wird die Aktivität des Enzyms-I bestimmt nach der Methode, die umfaßt die Stufe (a) des Abpufferns einer zu testenden Probe, von der angenommen wird, daß sie eine Aktivität aufweist, auf einen pH-Wert von 5 bis 8, und die Stufe (b) der Zugabe eines C-terminalen Peptid-Glycinadduktes gemäß der obigen Formel (I), L-Ascorbinsäure und Catalase zu dem Puffer mit anschließender Inkubierung, und Messung des Produktes, das durch die Formel (II) dargestellt wird, das durch Chromatographie isoliert worden ist, wie es später beschrieben wird, oder durch Messung des Produktes, das von der Verbindung (11) in die Verbindung (III) unter alkalischen Bedingungen umgewandelt und dann isoliert wurde. Als bevorzugte Isolierungsmaßnahme wird die Stufe der Bestimmung des Reaktionsproduktes durch HPLC angewandt, unter Verwendung eines Acetonitril enthaltenden Puffers (pH-Wert 6-10).
Die Aktivität des Enzyms-II wird nach der Methode bestimmt, die umfaßt die Stufe (a) des Abpufferns einer zu testenden Probe, von der erwartet wird, daß sie eine Aktivität aufweist, auf einen pH-Wert von 4 bis 8, die Stufe (b) der Zugabe eines C-terminalen α-Hydroxylglycinadduktes, das durch die Formel (II) dargestellt wird, zu dem Puffer, woran sich eine Inkubierung anschließt, und Bestimmung des Reaktionsproduktes der Formel (III) oder der Glyoxylsäure nach an sich bekannten Methoden. Die Aktivität des Enzyms-II wird ebenfalls vorzugsweise nach der oben erörterten HPLC-Methode festgestellt.
Zu der im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu testenden Probe, wie beschrieben, können gehören eine beliebige Flüssigkeit mit diesen Aktivitäten, insbesondere biologische Flüssigkeiten mit diesen Aktivitäten, nämlich Homogenisate von biologischen Organen, wie auch Körperflüssigkeiten, wie Blut und Lymphflüssigkeit, und weiterhin behandelte Lösungen von diesen, erhalten durch eine Reinigungsbehandlung, usw. Ferner gehören behandelte Lösungen, die von Mikroorganismenzellen abstammen, zu den biologischen Flüssigkeiten. Das Puffermittel, das zum Abpuffern dieser zu testenden Proben verwendet wird, ist nicht besonders auf bestimmte Puffermittel beschränkt, doch können jene, die üblicherweise verwendet werden, eingesetzt werden. Beispielsweise gehören zu ihnen Tris-chlorwasserstoffsäure sowie Hepes-kaliumhydroxid. Die Konzentration des Puffermittels in dem Puffer kann jede beliebige Konzentration sein, vorausgesetzt, daß die Pufferwirkung erreicht werden kann, wobei im allgemeinen eine Konzentration von 20 bis 200 mM geeignet ist.
Die entsprechenden Puffer können auf einen pH-Wert von 6 bis 8, vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5, im Falle der zuerst genannten Methode eingestellt werden, und einen pH-Wert von 4 bis 8, vorzugsweise um 6, im Falle der zuletzt genannten Methode. Als das C-terminale Peptid-Glycinaddukt, das dem Puffer zugesetzt wird, der im ersteren Falle hergestellt wurde, wird vorzugsweise ein solches verwendet, das ein Substrat für das Enzym darstellt, und durch die Formel (I) dargestellt wird, aufgeführt als bevorzugtes Substrat für die Identifizierung der Aktivität des Enzyms-I, wie oben beschrieben. Die Konzentration der Verbindung sollte in zweckmäßiger Weise bei etwa 0,1 µM bis 2 mM liegen. Weiterhin ist es erforderlich, L-Ascorbinsäure zuzusetzen, von der angenommen wird, daß sie als Cofaktor wirkt, sowie Catalase als aktivierendes Mittel. Allgemein gesprochen, kann die Konzentration der L-Ascorbinsäure vorzugsweise bei 0,5 bis 2 mM liegen und die Konzentration der Catalase in geeigneter Weise bei 40 bis 100 µg/ml. Ein Metallion kann ferner dem Puffer zugesetzt werden, doch ist diese Zugabe nicht besonders für die vorliegende Aktivitätsbestimmung erforderlich, wobei die Zugabe jedoch vorteilhaft ist, da gelegentlich eine höhere Aktivität erhalten wird im Vergleich zu dem Falle, in dem keine Zugabe erfolgt. Als zu verwendendes Metallion ist Zn²&spplus;, Cu²&spplus;, Ni²&spplus; Co²&spplus;, Fe³&spplus; usw. geeignet, insbesondere bevorzugt ist Cu²&spplus; und Zn²&spplus;. Die Konzentration des Metallions im Puffer kann in geeigneter Weise bei 0 bis 1000 µM, vorzugsweise 0 bis 10 µM liegen. Die Auswahl der Verbindungen, die solche Metallionen liefern, ist nicht besonders auf bestimmte Verbindungen beschränkt, sondern hierzu können gehören CuSO&sub4;, CuCl&sub2;, ZnCl&sub2;, NiCl&sub2;, CoCl&sub2;, FeCl&sub3; usw.
Bezüglich eines speziellen Beispiels einer solchen Reaktionszusammensetzung wird verwiesen auf die Reaktionszusammensetzung A des Beispiels 7, das weiter unten folgt. Andererseits wird die Reaktionszusammensetzung in dem zuletzt genannten Beispiel hergestellt durch Verwendung der entsprechenden Verbindung der Formel (II) anstelle der obigen Formel (I). In diesem Falle ist kein Cofaktor, wie Ascorbinsäure, Catalase usw., erforderlich.
Im Falle dieser beiden Bestimmungsmethoden ist die Menge der Testprobe, die verwendet wird, nicht besonders beschränkt und kann verschieden sein, doch wird sie vorzugsweise so bemessen, daß sie ein pMol/Std. oder mehr enthält, und in besonders vorteilhafter Weise 10 · pMol/Std. oder mehr, in besonders vorteilhafter Weise 10 · pMol/Std. bis zu 1 Mol/Std., bezogen auf die Menge des Substrates, das in dem Reaktionssystem vorliegt (definiert als ein Nanomol (nMol)) [die Einheit zeigt die Enzymaktivität an, die in der Substratmenge vorliegt, die umgesetzt werden kann bei 37ºC in einer Stunde (z. B. picoMol (pMol)].
Die Inkubierung kann bei 1 bis 55ºC durchgeführt werden, insbesondere im ersteren Falle vorzugsweise bei 25 bis 40ºC, und in besonders vorteilhafter Weise um 30ºC, unter Rühren über einen Zeitraum von 2 bis 24 Stunden, während die Inkubierung im letzteren Falle vorzugsweise bei 15 bis 35ºC, in besonders vorteilhafter Weise um 25ºC, erfolgt, stationär über einen Zeitraum von 1 Minute bis 48 Stunden.
Zur Bestimmung der Verbindung der Formel (II) und der Verbindung der Formel (III), die entsprechend den oben beschriebenen Stufen erzeugt werden, kann ein Verfahren angewandt werden, das messen kann durch Trennung von Substrat und Produkt, beispielsweise die Verbindung der Formel (I) und die Verbindung der Formel (II) im ersteren Falle, und die Verbindung der Formel (II) und die Verbindung der Formel (III) im letzteren Falle. Ganz allgemein gesprochen können Trennungsmessungen durchgeführt werden durch Trennung, Reinigung durch Chromatographie, wie unten beschrieben. Als chromatographisches Verfahren, das angewandt werden kann für die oben beschriebene Behandlung, können angewandt werden eine Ionenaustauscher-Chromatographie, eine Umkehrphasen-Chromatographie, eine Gel-Filtration, eine Affinitäts-Chromatographie, eine Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), eine Dünnschichtchromatographie (TLC) usw. Das Substrat, das durch die Formel (II) wiedergegeben wird, und das amidierte Produkt, das durch die Formel (III) im Reaktionssystem des letzteren Falles dargestellt wird, weisen Peptid-C-Terminals der Carboxylgruppe bzw. Amidgruppe auf, wobei die Ladungen unterschiedlich sind. Eine Ionenaustauscher-Chromatographie, eine Umkehrphasen-Chromatographie usw., die diese Eigenschaft ausnutzen, werden bevorzugt angewandt. Eine Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung des Antikörpers des Produktes kann ebenfalls wirksam eingesetzt werden. Obgleich jedoch die Trennung des Substrates, dargestellt durch die Formel (I), und des Produktes, dargestellt durch die Formel (II), im früheren Reaktionssystem, gemäß der Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung eines Azonitril enthaltenden Puffers (pH-Wert 6 bis 10, vorzugsweise pH-Wert 9) als dem Eluat erstmalig durch die vorliegenden Erfinder versucht wurde, kann in vorteilhafter Weise eine Trennungsmessung durchgeführt werden. Das Eluat sollte in besonders vorteilhafter Weise mit einem eine gerade Linie aufweisenden Konzentrationsgradienten der Acetonitril-Konzentration angewandt werden. Als Kolonne für die HPLC kann eine jede im Handel erhältliche Kolonne eingesetzt werden, die für den vorliegenden Gegenstand geeignet ist, jedoch hat es sich als besonders vorteilhaft erwiesen, eine Kolonne vom Typ Capcell Pak C18SG, 300 Å (Hersteller Shiseido) zu verwenden.
Das Substrat und das Produkt, das so voneinander getrennt wurden, können untersucht werden auf jede der chemischen oder physikalischen Markierungen (die gegebenenfalls gebunden sind) derselben. Für derartige Messungen können bekannte Markierungen, sowie bekannte Bestimmungsmethoden eingesetzt werden und im allgemeinen ist es zweckmäßig, die UV-Absorption auszunützen, die von der Aminosäure stammt, welche das Substratpeptid bildet.
Da die beschriebenen Bestimmungsmethoden genau und einfach sind, können durch Anwendung derselben auf biologische Flüssigkeiten, wie oben erwähnt, die Enzyme mit den entsprechenden Aktivitäten des Enzyms-I und des Enzyms-II erforscht werden. Derartige Forschungs- oder Untersuchungsmethoden werden als die achte bzw. die neunte Erfindung der vorliegenden Anmeldung bereitgestellt.
Zu den biologischen Flüssigkeiten, die zu erforschen sind, gehören natürlich solche, bei denen eine enzymatische Aktivität erwartet werden kann, sowie sämtliche lebenden Körperzellen, Gewebe, Extrakte von anderen Tieren und Pflanzen. Beispielsweise können Extrakte hergestellt werden nach Extraktionsmethoden ganz allgemein, wie sie beschrieben werden in "Jikken Seibutsugaku Koza 6, Saibo Bunkakuho" (Maruzen, 1984), "Seikagaku Jikken Koza 5, Kosokenkyuho (Former)" (Tokyo Kagaku Dojin, 1975), "Kiso Seikagaku Jikkenho 1, Seibutsu Zairyo no Toriatsukaikata" (Maruzen, 1974)

DNA-Sequenzen für das Enzym-I und das Enzym-II, die sich vom Pferd ableiten

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine cDNA-Sequenz bereitgestellt, die für ein Polypeptid codiert, das C-terminale Peptideigenschaften des Enzyms-I und des Enzyms-II aufweist. Da diese Enzyme die Möglichkeit einer ausgezeichneten Aktivität und Stabilität im Vergleich zu jenen aufweisen, die von C-terminalen Peptid-Amidierungsenzymen stammen, die aus dem Stande der Technik bekannt sind (vgl. die veröffentlichte internationale Anmeldung: WO89/1209), sind die Grüne für die Bereitstellung der obigen DNA-Sequenzen klar. Als Enzymlieferant kann ein jeder verwendet werden, vorausgesetzt, es handelt sich um ein Organ oder ein Gewebe, in dem ein solches Enzym existiert, jedoch werden vorzugsweise solche eingesetzt, die sich ableiten von Atrium, der Hypophyse, dem Gehirn oder dem Magen.
Die cDNA, die für das Peptid codiert, das die C-terminale Enzym-Amidierungsaktivität gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist, ist speziell in Fig. 13 dargestellt. In dieser Figur sind die Basensequenz des längsten cDNA-Fragmentes und die Aminosäuresequenz, die hierfür codiert, durch eine Ein-Buchstaben-Darstellung dargestellt. Der Inhalt innerhalb der Ei in der Figur ist ein gestrichener cDNA-Teil, der offensichtlich gebildet wird durch die Differenz beim mRNA-Spleissen, die als Folge der Analyse von einigen cDNA's gefunden wurde. Infolgedessen existieren auch mehrere cDNA-Arten gemäß der vorliegenden Erfindung für die Aminosäuresequenzen der Polypeptide, für die sie codieren. Beispielsweise existieren für die Aminosäuresequenz des Polypeptides mit der C-terminalen Peptid-Amidierungs- Enzymaktivität, das sich vom Pferd ableitet, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, vier Arten mit mindestens derüblichen Sequenz bis zu einer bestimmten Kettenlänge, bzw. den vier Arten von Sequenzen stromaufwärts hiervon. Aminosäuresequenzen in verschiedenen Bereichen
Die Polypeptide mit diesen Aminosäuresequenzen können nicht nur durch die vier Arten von cDNA-Sequenzen translatiert werden, sondern auch durch Verwendung einer DNA mit einer Kombination von verschiedenen Codonen, die für die gleiche Aminosäure codieren, und die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung schließen alle jene ein. Weiterhin kann festgestellt werden, daß, selbst wenn ein Teil der Aminosäuresequenz modifiziert werden kann durch Ersatz, Zusatz oder Entfernung bis zu dem Ausmaße, daß die C-terminale Amidierungs-Enzymaktivität nicht verloren gegangen ist, solche modifizierten Sequenzen für den Zweck der vorliegenden Erfindung geeignet sein können. Zu speziellen Beispielen von diesen können jene gehören, welche die gemeinsame Basensequenz aufweisen, die unten gezeigt wird und die entsprechenden verschiedenen Basensequenzanteile, die daraufhin folgen. Gemeinsame Basensequenz
Die Klonierung der cDNA der vorliegenden Erfindung kann nach der an sich bekannten Methode erfolgen durch die Verwendung von verschiedenen Geweben des Pferdes, wie im Falle der die Ratte betreffenden Beschreibung.
Im folgenden wird die cDNA-Herstellungsmethode der vorliegenden Erfindung in größerem Detail beschrieben.
Ein Gewebe, das reichlich ein C-terminales Peptid-Amidierungsenzym im Pferd bildet (im folgenden als "Plus-Gewebe" bezeichnet), beispielsweise ein Atrium des Pferdes, wird gemeinsam mit Guanidylthiocyanat homogenisiert, um die Zellen zu zerstoßen, und durch eine Cäsiumchlorid-Gleichgewichts-Dichtegradienten-Ultrazentrifugierung wird eine RNA-Fraktion erhalten. Nachfolgend wird durch Affinitäts-Chromatographie mit einer hierauf befindlichen Oligo-dT-Cellulose eine RNA mit einer Poly-A (Poly-A&spplus;RNA) aus der oben erwähnten RNA-Fraktion isoliert.
Durch Verwendung der Poly-A&spplus;RNA als dem Templat, wird eine genomische cDNA-Bibliothek nach der aus dem Stande der Technik bekannten Methode erhalten, vorzugsweise nach der Methode von Okayama-Berg (Mol. Cell. Biol. 2, 161, 1982). Die Methode von Okayama-Berg wurde wie weiter unten beschrieben durchgeführt. Das heißt, der Poly-A-Anteil der Poly-A&spplus;RNA wurde an den Poly-T- Anteil des Okayama-Berg-Vektors adsorbiert, wodurch die Reaktion der reversen Transcriptase durchgeführt wurde, um eine cDNA zu synthetisieren. Nach Zugabe einer OligodC zu dem 3'-Ende der cDNA mit einer terminalen Deoxynukleotidyltransferase wurde der Vektor DNA mit einer Restriktionsendonuklease HindIII aufgespalten. Nach Ligation eines oligodG-Linkers wurde der Vektor cyclisiert und dann wurde der RNA-Teil durch DNA ersetzt und zwar mit einer DNA-Polymerase unter Gewinnung eines cDNA enthaltenden Plasmides. Durch Verwendung dieses Plasmides wurde E. coli nach solch einer Methode transformiert, wie der Calciumchloridmethode (Strik, P. und Mitarbeiter, J. Bacteriol. 138, 1033, 1979). Durch Auswahl eines Ampicillin-resistenten Stammes mit einem flachen Plattenmedium mit zugesetztem Ampicillin wurde ein Plasmid akzeptierender Mikroorganismus bereitgestellt.
Andererseits wurden das oben erwähnte Plus-Gewebe, nämlich ein Gewebe, das reichlich ein C-terminales amidierendes Enzym produziert, und ein Gewebe, das kein solches C-terminales amidierendes Enzym produziert (im folgenden bezeichnet als "Minus-Gewebe"), beispielsweise eine Pferdeleber, hergestellt und Poly-A&spplus;RNA wurde nach der oben beschriebenen Methode von den entsprechenden Zellen isoliert. Der 5'-OH-Rest der RNA wurde mit 32 P markiert, unter Verwendung der Polynukleotid- Kinase und [τ-³²]PATP, und dieses Produkt wurde als Sonde verwendet.
Daraufhin wurde nach der Kolonie-Hybridisierungsmethode (Hanahan, D. und Mitarbeiter, Gene, 10, 63, 1980) eine Kolonie komplementär zur Sonde, die sich von dem Plus-Gewebe ableitet, jedoch nicht komplementär dem Minus-Gewebe ist, aus der cDNA-Bibliothek wie oben beschrieben ausgewählt. Somit wurde eine Plasmid-DNA von der so ausgewählten Kolonie bereitgestellt und es wurde die Basensequenz nach der Dideoxynukleotidmethode ermittelt (Messing, J. Methods in Enzymology 101, 20, 1983), usw.
Ob oder nicht es sich hierum um cDNA's des C-terminalen Peptid- Amidierungsenzyms handelt, kann festgestellt werden durch Einführung des Bereiches, der codiert oder seiner Aminosäuresequenz in ein Expressionsvektorsystem von E. coli, Bacillus substilis, Hefe, tierische Zellkulturen usw. unter Herstellung des Proteins, das für die cDNA codiert, worauf die Aktivität des amidierenden Enzyms bestimmt wird (vgl. zum Beispiel PCT/JP89/00521). Die erhaltene cDNA kann ebenfalls ausgewählt werden durch Vergleich der Homologie mit einer cDNA eines bekannten C-terminalen Amidierungsenzyms. Weiterhin kann eine teilweise Aminosäuresequenz des Enzyms, gereinigt durch Anwendung der Reinigungsmethode eines C-terminalen Pferde-Amidierungsenzyms, beschrieben in der internationalen publizierten Anmeldung WO89/12096, ebenfalls bestimmt werden mittels eines Peptid-Sequenzers, usw. und identifiziert werden als gleiche Aminosäuresequenz, die bestimmt wurde aus der cDNA. Ferner können Antikörper mit dem gereinigten Enzym als Antigen hergestellt werden, unter Verwendung des Kaninchens, der Ratte, usw., worauf die Identifizierung erfolgen kann durch Durchführung der Antigen-Antikörperreaktion mit dem Protein, das in E. coli exprimiert wird, usw., mit der cDNA, wie oben beschrieben.
Diese Identifizierungsmaßnahmen können ferner als die cDNA-Klonierungsmethode angewandt werden, die jene Charakteristika verwendet. Genauer gesagt kann die Methode eingeschlossen oder angewendet werden, in der unter den bekannten verschiedenen Arten von cDNA's von C-terminalem Amidierungssystem der Bereich mit hoher Homologie zwischen diesen Arten betrachtet wird als reich bezüglich der cDNA, die sich vom Pferd ableitet, und die cDNA- Bibliotheks-DNA wird ausgewählt als die DNA in einem solchen Bereich als Sonde; ferner die Screening-Methode unter Verwendung eines Antikörpers durch ein cDNA-Klonierungssystem durch Verwendung von λgt11-Phagen als Sonde; die Screening-Methode der cDNA- Bibliothek der Herstellung von einem Teil von Aminosäuresequenzen von dem gereinigten Enzym als synthetische DNA (verschiedene Arten) mit den Kodonen, die hiermit korrespondieren, mittels eines DNA-Synthesizers, usw., sowie Herstellung desselben als Sonde durch Anwendung eines Plasmides, einer Phage, usw.
Die DNA-Sequenz, die für das Protein mit der C-terminalen Peptid-Amidierungs-Enzymaktivität der vorliegenden Erfindung codiert, die so hergestellt wurde, kann das C-terminale Peptid- Amidierungssystem in großer Menge herstellen, durch Anbindung seiner DNA an einen geeigneten Expressionsvektor, unter Exprimierung des Enzyms mit E. coli, Bacillus subtilis, Hefe, tierischen Zellen, usw. als dem Wirt.

[Beispiele]

Die vorliegende Erfindung wird im Detail unter Bezugnahme auf Beispiele beschrieben, die in keiner Weise die vorliegende Erfindung beschränken.

Beispiel 1

Herstellung eines Gels für eine Substrat-Affinitäts-Chromatographie

Eine Menge von 5 ml Affigel 10 wurde in ein Volumen von 10 ml Econocolumn (hergestellt von der Firma Biorad), gefüllt mit Isopropanol, einbemessen. Nachdem das Isopropanol ausgewaschen worden war, wurde das Gel mit 50 ml von 10 mM Natriumacetatpuffer (pH-Wert 4,5) und dann mit 10 ml von 0,1 M Mops-natriumhydroxidpuffer (enthaltend 80 mM Calciumchlorid, pH-Wert 7,5) gewaschen. Nachdem das Gel in eine Flasche eines Volumens von 20 ml überführt worden war, wurde es mit 10 ml des oben beschriebenen Mops-natriumhydroxidpuffers, enthaltend 40 mg (etwa 100 µMol) von Phenylalanyl-glycyl-phenylalanyl-glycin (Phe-Gly-Phe- Gly, hergestellt von der Firma Sigma), hierin gelöst und es wurde eine Schüttelreaktion bei 4ºC über 18 Stunden durchgeführt. Daraufhin wurden 0,5 ml von 1 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 8,0) zugegeben und die Schüttelreaktion wurde bei 4ºC eine Stunde lang durchgeführt, um die nicht umgesetzten aktiven Gruppen zu deaktivieren. Nachdem das Gel mit dem oben beschrieben Mops-natriumhydroxidpuffer gewaschen worden war, und zwar mit deionisiertem Wasser, wurde es in 0,02% NaN&sub3; suspendiert, in eine Kolonne eingeführt und bei 4ºC aufbewahrt. Aus der Menge des Peptides (Phe-Gly-Phe-Gly), die für die Reaktion bereitgestellt wurde, und aus der Peptidmenge in der Lösung, wurde errechnet, daß etwa 10 µMol pro 1 ml Gel gebunden waren.

Beispiel 2

Herstellung von Phenylalanyl-glycyl-phenylalanyl-hydroxylglycin als Substrat

Eine Menge von 3 mg Phenylalanyl-glycyl-phenylalanyl-glycin (FGFG) (hergestellt von der Firma Sigma) wurde ausgewogen und 50 mM Hepes-KOH-Puffer (pH-Wert 5,5), 3 mM Ascorbinsäure, 10 mM Kaliumjodid, 0,25 mg/ml Catalase, 0,25 mM Cuprisulfat, 7,5% Acetonitril sowie 200 µl einer amidierten Enzymzusammensetzung, die sich von Pferdeserum, wie in Beispiel 2 der internationalen Patentanmeldung JP89-00521 beschrieben, ableitete, wurde zugegeben, um die Gesamtmenge auf 10 ml zu bringen, worauf sich eine aeorobe Amidierungsreaktion bei 30ºC über einen Zeitraum von 20 Stunden anschloß. Die Reaktion wurde unterbrochen durch Zugabe von 10% Ameisensäure, und Phenylalanyl-glycyl-phenylalanyl-hydroxylglycin (FGFhyG) wurde durch eine Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC) abgetrennt. Die Kolonne der HPLC, die verwendet wurde, war eine Kolonne vom Typ Capscell Pack C18SG, 300 Å (hergestellt von der Firma Shiseido). Das verwendete Eluierungsmittel bestand aus 1 mM Ammoniumdicarbonat (pH-Wert 9,0) sowie Acetonitril, und es wurde ein linearer Gradient von ansteigendem Acetonitril von 0% bis 30% über einen Zeitraum von 30 Minuten angewandt. Das Peptid wurde durch die Absorption bei 214 nm festgestellt. Die Spitze von Phenylalanyl-glycyl-phenylalanyl-glycin bei 10,7 Minuten wurde nach der C-terminalen Amidierungsreaktion praktisch ausgelöscht. In Begleitung hiermit wurden die Spitzen des α-Hydroxyglycinderivates bei 9,9 Minuten und der amidierten Verbindung bei 14,5 Minuten festgestellt. Die Strukturen dieser Substanzen wurden durch FAB-MS-Spektrum-Analyse und NMR-Analyse festgestellt. Fig. 2 zeigt die Ergebnisse des FAB-MS-Spektrums in Glyzerinlösung. Die ursprüngliche Spitze stellt das Molekulargewicht von 442 dar, und als Folge der Fragmentierung wurden Fragmente von 425 und 408 m/z mit einer oder zwei -OH-Gruppen, die an dem C- Terminal, der abgespalten wurde, existierten, identifiziert, was anzeigt, daß es sich um das α-Hydroxylglycinaddukt handelt. Die Spitze bei 9,9 Min. wurde abgetrennt, in eine 10%ige Ameisensäurelösung überführt, die dann lyophilisiert wurde unter Gewinnung des Substrates für das Enzym-II der vorliegenden Erfindung. Das Substrat konnte in ähnlicher Weise hergestellt werden, auch wenn das das Enzym-I enthaltende Produkt der vorliegenden Erfindung anstelle der obigen amidierten Enzymzusammensetzung verwendet wurde. Wie oben beschrieben, ist das α-Hydroxylglycinderivat unter sauren Bedingungen stabil, jedoch instabil unter alkalischen Bedingungen und es wird in die amidierte Verbindung und Glyoxylsäure zersetzt, ungeachtet der Enzymreaktion. Infolgedessen erfolgte die C-terminale Amidierungsreaktion zu Beginn in diesem Beispiel unter sauren Bedingungen. Zu diesem Zeitpunkt wird es, wenn die Reaktion bei einem pH-Wert von 7,5 oder höher durchgeführt wird, unmöglich, das α-Hydroxylglycinderivat zu identifizieren. Das bekannte C-terminale amidierende Enzym wurde betrachtet als solches, das umgewandelt wurde von dem C-terminalen Glycinaddukt, dargestellt durch die Formel (I), wie oben beschrieben, in die C-terminale amidierte Verbindung, die durch die Formel (III) dargestellt wird, und Glyoxylsäure, da keine nicht-enzymatische Umwandlung unter den alkalischen Bedingungen eingeschlossen war und die katalytische Reaktion des Enzyms selbst die Umwandlungsreaktion von dem C-terminalen Glycinaddukt, dargestellt durch die Formel (I), in das C-terminale α-Hydroxylglycinaddukt, dargestellt durch die Formel (II) ist. Infolgedessen ist die Konversion der amidierenden Reaktion unter sauren Bedingungen durch das C-terminale amidierende Enzym im Falle des Standes der Technik im allgemeinen niedrig.

Beispiel 3

Herstellung von Enzym-I aus Pferdeserum

(1) Zu 100 ml eines im Handel erhältlichen Pferdeserums (her gestellt von der Firma Gibco) wurden allmählich unter Rühren 100 ml eines 25%igen wäßrigen Polyethylenglykols 6000 (w/v) (hergestellt von der Firma Wako Junyaku), nämlich bis zu einer Endkonzentration von 12,5% zugegeben. Die folgenden Verfahrensschritte wurden sämtlich bei 4ºC durchgeführt. Nach 12-stündigem Stehenlassen wurde die Mischung zentrifugiert (10 000 · g, 10 Min.) und die angefallenen Niederschläge wurden in 120 ml eines Hepes-kaliumhydroxidpuffers (pH-Wert 7,0) gelöst. Nach weiterem Stehenlassen über 2 Stunden wurde die unlösliche Substanz, die sich gebildet hatte, wiederum durch Zentrifugieren entfernt (10 000 · g, 10 Min.) unter Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit, enthaltend die C-terminale amidierende Enzymaktivität (127 ml).
(2) Die aktive Fraktion, erhalten in der obigen Stufe (1), wurde auf eine Kolonne aufgebracht (1,6 · 15 cm), gefüllt mit Heparin-Sepharose CL-6B (hergestellt von der Firma Pharmacia) ins Gleichgewicht gebracht mit 10 mM Hepes-kaliumhydroxidpuffer (pH-Wert 7,0). Nachdem die nicht-adsorbierten Substanzen mit 96 ml des gleichen Puffers weggewaschen wurden, erfolgte die Eluierung mit 10 mM Hepes-kaliumhydroxidpuffer (pH-Wert 7,0), enthaltend 0,5 M Natriumchlorid (Strömungsgeschwindigkeit 30 ml/Std.). Fig. 3 veranschaulicht das Eluierungsmuster. Das vorliegende Enzym-I wurde mit einem 0,5 M Natriumchlorid enthaltenden Puffer eluiert [die Fraktionen Nr. 14-16 wurden aufgefangen (100 ml)].
(3) Die obigen Fraktionen wurden einer Gel-Filtration unterworfen, unter Anwendung einer Sephadex G-25 Fine- (hergestellt von der Firma Pharmacia) Kolonnen-Chromatographie (5 cm · 23 cm). Durch Verwendung von 10 mM Hepes-KOH (pH- Wert 7,0) als Lösungsmittel, wurde die Eluierung mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 2 ml/Min. bewirkt. Die Proteine wurden ermittelt durch Absorption bei 280 nm und es wurden 100 ml der Fraktionen, enthaltend die Proteine, aufgefangen.
(4) Affigel 10-Phe-Gly-Phe-Gly-Gel, hergestellt gemäß Beispiel 1, in einer Menge von 5 ml, wurden in eine Kolonne (1,0 · 6,3 cm) gebracht und die Kolonne wurde ins Gleichgewicht gebracht mit 10 mM Hepes-kaliumhydroxidpuffer (pH-Wert 7,0), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid. In die Kolonne wurde die Probe (18,1 ml) eingeführt, die in der obigen Verfahrensstufe (3) erhalten wurde. Um zu gewährleisten, daß das Enzym-I von dem Gel adsorbiert wurde, wurde die Flüssigkeit mehrmals durch die Kolonne zirkuliert (Strömungsgeschwindigkeit 20 ml/Std.). Nach 12 Stunden wurde die Zirkulierung unterbrochen, und die nicht-adsorbierten Substanzen wurden mit 35 ml des Puffers, der für die Gleichgewichtseinstellung verwendet wurde, ausgewaschen, worauf sich eine Eluierung mit 8 mM Hepes-kaliumhydroxidpuffer (pH-Wert 7,0), enthaltend 0,4 M Natriumchlorid und 20% Acetonitril (Strömungsgeschwindigkeit 20 ml/Std.), anschloß. Die Enzym-I-Aktivität wurde lediglich in der eluierten Fraktion (10 ml) festgestellt.
(5) Das gereinigte Produkt, erhalten in der obigen Verfahrensstufe (4), wurde wiederum der Behandlung (3), wie oben beschrieben, unterworfen, dann auf eine Mono-Kolonne (hergestellt von der Firma Pharmacia, 0,5 · 5 cm) gebracht, ins Gleichgewicht gebracht mit 10 mM Hepes-kaliumhydroxidpuffer (pH-Wert 7,0) und es wurde ein linearer NaCl-Konzentrationsgradient im gleichen Puffer wie in Fig. 3 dargestellt angewandt, um die Proteine zu eluieren. Die Strömungsgeschwindigkeit lag zu diesem Zeitpunkt bei 0,5 ml/Min.
Tabelle 1 zeigt die gesamten Proteinmengen, die gesamten Enzymaktivitäten, spezifischen Aktivitäten, Ausbeuten und die Anzahl der Wiederholungen der Reinigung in den entsprechenden Stufen der Reinigung, die in den obigen Verfahrensstufen (1) bis (5) durchgeführt wurden. Tabelle 1 Herstellung von Enzym-I aus Pferdeserum Gesamtprotein Gesamtaktivität spezifische Aktivität Ausbeute fache Reinigung Serum Polyethylenglykol 6000, Ausscheidung Heparin-Sepharose CL-6B Sephadex G-25 Affigel 10-Phe-Gly-Phe-Gly Mono-Q-Kolonne *Wahrscheinlich aufgrund des Einflusses der Protease, die in dem Serum vorlag, wurden das Substrat und das Produkt teilweise zersetzt, so daß eine relativ niedrige Aktivität erhalten wurde.
Die Aktivitätsbestimmung wurde durchgeführt über die Reaktion gemäß der Ausfällungsmethode von FGFG nach FGFhyG, wie in Beispiel 2 beschrieben, und durch mengenmäßige Erfassung von FGFhyG durch HPLC, wie dort beschrieben. Die Enzymaktivität 1 U wurde definiert als die Enzymmenge, die 1 nMol von FGFhyG bei 37ºC über einen Zeitraum von 1 Stunde erzeugte.
Eine Messung der Proteinmenge erfolgte durch Anwendung der verbesserten Methode von Lowry (Bensadoun und Mitarbeiter, Anal. Biochem., 70, 265, 1976), wobei die Standardkurve hergestellt wurde unter Verwendung von Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von der Firma Sigma).
Wie in Tabelle 1 dargestellt, konnte das vorliegende Enzym um das etwa 500-fache mit einer Ausbeute von 2% gereinigt werden. Ist eine weitere Reinigung erforderlich, so können die oben beschriebenen Stufen (3) bis (5) wiederholt werden, oder es kann eine dieser Stufen wiederholt werden.

Beispiel 4

Herstellung des Enzyms-II aus Pferdeserum

Pferdeserum wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 beschrieben behandelt, mit der Ausnahme der Durchführung der entsprechenden Reinigungsstufen unter Überwachung der Aktivität des Enzyms-II.
Tabelle 2 zeigt das Gesamtprotein, die gesamten Enzymaktivitäten, die spezifischen Aktivitäten, Ausbeuten und die Anzahl der Reinigungen in den entsprechenden Reinigungsstufen (1) bis (5). Tabelle 2 Herstellung von Enzym-II aus Pferdeserum Gesamtprotein Gesamtaktivität spezifische Aktivität Ausbeute fache Reinigung Serum Polyethylenglykol 6000, Ausscheidung Heparin-Sepharose CL-6B Sephadex G-25 Affigel 10-Phe-Gly-Phe-Gly Mono-Q-Kolonne *Wahrscheinlich aufgrund des Einflusses der Protease, die in dem Serum vorlag, wurden das Substrat und das Produkt teilweise zersetzt, so daß eine relativ niedrige Aktivität erhalten wurde.
Die Aktivitätsbestimmung wurde bei 30ºC durchgeführt durch Lösen des Phenylalanyl-glycyl-phenylalanyl-hydroxylglycins (FGFhyG), erhalten gemäß Beispiel 1, in 10 mM Hepes-kaliumhydroxid (pH-Wert 6,5) zu einer Konzentration von 5 mM, worauf die Proben bei den entsprechenden Stufen zugegeben wurden, und worauf die Gesamtmenge auf 100 ml gebracht wurde. Nach einer Reaktionsdauer von 1 Stunde wurde die Reaktion durch Zugabe von 10% Ameisensäure unterbrochen und das Reaktionsprodukt wurde quantitativ bestimmt durch HPLC unter Anwendung der Bedingungen des Beispiels 2. Gleichzeitig wurde eine Vergleichsreaktion ohne Zugabe der Probe durchgeführt, um zu bestätigen, daß praktisch keine nicht-enzymatische Umwandlung erfolgt war. Das HPLC-Muster der Reaktionsmischung ist in Fig. 4 dargestellt (die Reaktionsbedingungen in der Figur sind 37ºC, pH-Wert 6,9, wobei die Reaktionszeit in der Figur angezeigt ist), und die Aktivität ist als Einheit (U) dargestellt. 1 U ist definiert als die Enzymmenge, die 1 nMol FGF-NH&sub2; bei 30ºC in einer Stunde erzeugt.
Die Messung der Proteinmasse erfolgte in gleicher Weise wie in Beispiel 3.
Wie in Tabelle 2 dargestellt, konnte das vorliegende Enzym um das etwa 1800-fache mit einer Ausbeute von 2% gereinigt werden.
In den folgenden Beispielen wird die Herstellung des Enzyms unter Verwendung einer C-terminalen Peptid-AmidierungsenzymcDNA beschrieben, die sich von einer Rattenhypophyse ableitete, doch ist die vorliegende Erfindung nicht hierauf beschränkt.

Beispiel 5

Aufbau eines Expressionsplasmides

Durch Verwendung der Poly-A&spplus;RNA, die von einer Rattenhypophyse stammte, wurden 5 cDNA-Klone erhalten (vgl. Fig. 6, Fig. 7, Seikagaku, 61, 842 (1989)).
Das DNA-Fragment von 2,58 kbp (Kilobasen-Paare) von dem cDNA-Klon 205, aufgespalten durch EcoRI-XmaI, wurde in einen Expressionsvektor eines tierischen Kulturzellensystems eingeführt, pSV2-Vektor [S. Subramani, R. Mulligan, P. Berg, Mol. Cell. Biol. 1, 854 (1981)] über einen synthetischen Linker bei HindIII-BglII, und das Plasmid wurde bezeichnet als SV-205. Daraufhin wurde das NsiI(700) - XmaI- Fragment von SV-205 durch die entsprechenden Nsil(700) - XmaI-Fragmente der cDNA-Klone 201, 202, 203, 204 ersetzt. Diese Expressionsplasmide wurden mit SV-201, SV-202, SV-203, SV-204 bezeichnet. Die SV-203 DNA wurde deletiert (von) dem DNA-Bereich, der für die Trans-Membran-Domäne codiert. Von der so erhaltenen SV-203-Plasmid-DNA wurde ein Expressionsplasmid SV-A gestaltet, welches ein Enzym exprimiert durch Einwirkung auf ein C-terminales Glycinaddukt gemäß der vorliegenden Erfindung unter Umwandlung desselben in ein C-terminales α-Hydroxylglycinaddukt. Der DNA-Teil der BamHI-Stelle [Fig. 7 B (1386)], der in der Umgebung des cDNA-Bereiches existierte, der für den KK-Sequenzteil rund um das Zentrum codierte, wurde deletiert durch Digestion mit BamHI, XmaI [Fig. 7 X(1948)], und ein synthetischer Linker:
wurde in die gespaltene Stelle eingesetzt, eine Ligation wurde durchgeführt, mit anschließender Vervollständigung des SV-A- Plasmides. Die synthetische DNA wurde in üblicher Weise synthetisiert durch Verwendung eines DNA-Synthesizers, hergestellt durch ABI und gereinigt. Die synthetische DNA wird gebildet aus der BamHI-Spaltstelle-Stopcodon-XmaI-Spaltstelle.
Danach wurde ein Expressionsplasmid SV-B gemäß der vorliegenden Erfindung, das ein Enzym für die Umwandlung eines C-terminalen α-Hydroxylglycinadduktes in eine C-terminale amidierte Verbindung und Glyoxylsäure umwandelte, aufgebaut. Die SV-203- DNA wurde an der KpnI-Stelle [Fig. 7, N (175)] gespalten, die unmittelbar abwärts des Bereiches existierte, der für das Signalpeptid codierte, und der BamHi-Stelle, die an der Stelle existierte, die der Umgebung der KK-Stelle am Zentrum entsprach, und hierin zwischen diesen gekoppelt mit einer synthetischen DNA:
um ein Expressionsplasmid SV-B zu erzeugen. Als Folge hiervon wurde der Signalpeptidbereich mit der letzteren cDNA-Teilstelle in einem Leseraster kombiniert.

Beispiel 6

Expression in tierischen Kulturzellen

Die kultivierte Zelle COS-7 wurde in einem synthetischen Medium (DMEM) gezüchtet, das ein 10%iges fetales Rinderserum enthielt, und transformiert durch Verwendung des Expressionsplasmides des Beispieles 5 nach der bekannten Methode (vgl. C. Chen und H. Okayama, Mol. Cell. Biol. 7, 2745 (1987)). Bei der Transformierung wurden 20 µg des Expressionsplasmides auf 5 · 10&sup5; Zellen verwendet. Nach Kultivierung unter den Bedingungen von 3% Kohlendioxid, 35ºC und 24 Stunden, wurden die Zellen zweimal mit 10 ml eines DMEM-Mediums gewaschen, das 0,2% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, und dann weiterhin in 10 ml des DMEM-Mediums kultiviert, das 0,2% BSA enthielt, unter Bedingungen von 5% Kohlendioxid und 37ºC sowie 48 Stunden.

Beispiel 7

Aktivität des C-terminalen Amidierungssystems, erzeugt durch die rekombinierten Zellen

Die Zellenkulturbrühe, die in Beispiel 6 exprimiert wurde, wurde durch Zentrifugieren in Zellen und eine überstehende Flüssigkeit (Medium) getrennt.
Für die überstehende Flüssigkeit wurde die Enzymaktivität bestimmt. Die Aktivitätsbestimmung erfolgte grundsätzlich nach der Methode unter Verwendung von HPLC, wie sie in der Literatur beschrieben wird (J. Biol. Chem. 265, 9602-9605). Kurz gesagt, wurde die Umwandlungsaktivität des C-terminalen Glycinadduktes in das α-Hydroxylglycinaddukt bestimmt, indem die Reaktion ablaufen gelassen wurde mit der Reaktionszusammensetzung (A), wie unten angegeben, und quantitative Bestimmung des Substrates (PheGlyPheGly) und des Produktes (PheGly- PhehydroxyGly) nach einer bestimmten Reaktionsdauer.

Reaktionszusammensetzung (A)

15 µM PheGlyPheGly
5 mM CuSO&sub4;
5 µl/Reaktionsmischung 1 ml Catalase (Sigma)
100 mM MES-Puffer (pH-Wert 5,6)
1 mM Ascorbinsäure
+ Kultur-Überstand (Medium).
Die Umwandlungsaktivität des α-Hydroxylglycinadduktes in die amidierte Verbindung und Glyoxylsäure wurde in ähnlicher Weise ermittelt durch Verwendung der folgenden Reaktionszusammensetzung (B).

Reaktionszusammensetzung (B)

15 µM PheGlyPhehydroxyGly*
100 mM MES-Puffer (pH-Wert 5,6)
+ Kultur-Überstand (Medium).
*Die Reaktion wurde in der Reaktionszusammensetzung (A) ablaufen gelassen und hergestellt von dem α-Hydroxylglycinaddukt, abgetrennt durch HPLC.
Die Bestimmungsergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3 Enzymaktivität n Mole/Std./ml Medium Plasmid Substrat PheGlyPheGly PheGlyPhehydroxyGly Produkt PheGlyPhe-hydroxy Gly PheGlyPhe-NH&sub2; + Glyoxylsäure (Signal-Sequenz+N-terminale Domäne+C-terminale Domäne; gemäß Erfindung) kein Plasmid (Vergleich)
Im Medium des Transformanten mit dem SV-a-Plasmid wurde eine bemerkenswert verbesserte Aktivität zur Erzeugung des α-Hydroxylglycinadduktes festgestellt, und er nahm nicht an der Reaktion mit dem α-Hydroxylglycinaddukt als dem Substrat teil. Im Gegensatz hierzu trat in dem Stamm, transformiert mit dem SB-b-Plasmid, überhaupt keine Reaktion an dem C-terminalen Glycinaddukt auf, sondern es wurde lediglich eine Aktivität bezüglich der Umwandlung des α-Hydroxylglycinadduktes in die amidierte Verbindung festgestellt. In dem Stamm, transformiert mit dem Plasmid SV-203, mit praktisch dem gesamten Bereich der cDNA wurden beide Enzymaktivitäten festgestellt, doch waren die entsprechenden Enzymaktivitäten geringer im Vergleich mit SV-a, SV-b.
Daraufhin wurde die Frage, ob das in diesen transformierten Stämmen exprimierte Enzym ein einzelnes war oder nicht, durch Gel-Filtrationschromatographie bestätigt. Durch Verwendung einer Sephacryl S-200- (hergestellt von der Firma Pharmacia) Kolonne (1 · 95 cm) wurde die Kolonne mit einem Eluierungspuffer 10 mM HEPES-KOH (pH-Wert 7,0), 50 mM NaCl equilibriert. Die Eluierungsgeschwindigkeit lag bei 6 ml/Std. und es wurden 1 ml-Fraktionen aufgefangen. Die Ergebnisse von sowohl den beiden Enzymaktivitäten als auch den Proteinmassen, die ermittelt wurden, sind in Fig. 8 bis Fig. 10 dargestellt. Die Enzymaktivitäten, die von SV-a (Fig. 8) und von SV-b (Fig. 9) stammten, wurden zu den entsprechenden einzelnen Spitzen, wobei ferner gefunden wurde, daß die bestimmten Molekulargewichte bei 36 kDa und 54 kDa lagen, entsprechend den Molekulargewichten der Proteine, für die die cDNA's codierten, welche die entsprechenden Plasmide aufwiesen. Das Protein jedoch, das von dem SV-203-Plasmid stammte, wie in Fig. 10 dargestellt, wurde in die zwei Spitzen der Aktivität für die Erzeugung des -Hydroxylglycinadduktes ( - ) durch Einwirkung auf das C-terminale Glycin und die Aktivität für die Erzeugung der amidierten Verbindung und der Glyoxylsäure ( - ) durch Einwirkung auf das α-Hydroxylglycinaddukt getrennt. Daneben wurde gefunden, daß diese Molekulargewichte die gleichen waren wie jene der entsprechenden Enzyme, die in Fig. 8, Fig. 9 dargestellt sind und einzeln exprimiert wurden. Dieses Ergebnis zeigte, daß die KK-Sequenz, die sich im zentralen Teil des Proteins befand, das für die cDNA codiert, durch Aufarbeitung der Kulturzellen abgespalten wurde. Infolgedessen wurde gezeigt, daß die zwei Arten von Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung auch erzeugt werden können durch Exprimierung der cDNA mit einem solchen ganzen cDNA-Bereich.
Als nächstes wurde der synergistische Effekt durch Verwendung der zwei Arten von Enzymen gemäß der vorliegenden Erfindung in der C-terminalen Amidierungsreaktion durch Fig. 11 und Fig. 12 dargestellt. Fig. 11 und Fig. 12 zeigen die Veränderung in der Umwandlung von amidierter Verbindung im Verlaufe der Zeit, wenn PheGlyPheGly als Substrat verwendet wird. Die Enzymproben wurden hergestellt durch Reinigung der Medium-Überstände, erhalten durch Exprimierung von SV-a-, SV-b-Plasmiden durch die oben beschriebene Gel-Filtration und Konzentrierung der entsprechenden aktiven Fraktionen. Fig. 11 zeigt eine, die von SV-a stammt, wobei gezeigt wird, daß nur das α-Hydroxyladdukt erzeugt wird, ohne daß amidierte Verbindung erzeugt wird. Fig. 12 zeigt den Fall, in dem lediglich das Enzym verwendet wurde, das von SV-b stammt ( ), und den Fall, wenn jene in Kombination verwendet werden, die von SV-a und SV-b stammen. Es konnte gezeigt werden, daß weder das α- Hydroxyladdukt noch die amidierte Verbindung erzeugt wurde mit lediglich dem Enzym, das von SV-b stammte, wohingegen sowohl das α-Hydroxyladdukt als auch die amidierte Verbindung gut erzeugt wurden bei Verwendung von beiden Enzymen in Kombination miteinander (die Mengen an zugesetzten Enzymen waren die gleichen). Festzustellen ist, daß die Reaktionswirksamkeit erhöht wird, wenn sie nach 4 Stunden oder später verwendet wurden, und nach einer 9-stündigen Reaktion wurde eine Umwandlung erzielt, die so hoch war wie das 1,5-fache im Vergleich zu dem Falle der Verwendung von lediglich dem Enzym, das von SV-a stammte, wie in Fig. 11 dargestellt. Dies bedeutet, daß die Verwendung von beiden Enzymen ein sehr effektives Mittel zur Durchführung der C-terminalen Amidierungsreaktion ist.

Beispiel 8

Herstellung von Poly-A&spplus;RNA aus Pferdeherzenvorhöfen

(1) Herstellung der ganzen RNA

Pferdeherzenvorhöfe wurden nach einer Enukleierung schnell zerkleinert und etwa 2 g hiervon wurden in eine 50 ml fassende Plastikröhre gebracht (Nr. 2070, hergestellt von der Firma Falcon) und in flüssigem Stickstoff gefroren. Eine Menge von 20 ml Guanidinthiocyanatlösung (4 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat (pH-Wert 7,0), 0,5% Laurylsarcosinnatrium, 0,1% Antifoam A, 0,1 M 2-Mercaptoethanol) wurden zugegeben und die Zellen wurden mittels eines Polytrongerätes (Central Kagaku Boeki) zerkleinert, gefolgt durch Herausnahme und Einführung der zerstoßenen Flüssigkeit mittels einer 10 ml-Spritze (hergestellt von der Firma Terumo Co., Ltd.), ausgerüstet mit einer 18 G Injektionsnadel. Der sedimentierte Teil wurde mittels einer Zentrifugierung mit geringer Geschwindigkeit entfernt (300 · g, 5 Minuten) und 7,3 ml des Überstandes wurden in ein 3,7 ml CsTFA-Gefäß aufgebracht (hergestellt von der Firma Pharmacia, wäßrige Cäsiumtrifluoressigsäure, enthaltend 0,5 M EDTA, eingestellt auf eine Dichte von 1,64 g/ml) und behandelt mittels einer Ultra-Zentrifugierungsvorrichtung durch Verwendung eines Schwingrotors RPS-40T (hergestellt von der Firma Hitachi Seisakusho, SCP85H) bei 33 000 Umdrehungen pro Minute über einen Zeitraum von 16 Stunden. Die Niederschläge wurden mit 3 ml einer 4 M Guanidinlösung gewaschen, dann mit 3 ml von 95%igem Ethanol und daraufhin in 1,5 ml CsTFA-Lösung gelöst. Zu der Lösung wurden zugegeben 60 µl einer 5 M NaCl- Lösung, 3,9 ml Ethanol, und die Ethanol-Ausscheidung wurde bei -80ºC über einen Zeitraum von 30 Minuten herbeigeführt, mit anschließender Zentrifugierung bei 16 000 · g über einen Zeitraum von 15 Minuten, um Niederschläge zu erhalten. Die Niederschläge wurden mit 70%igem Ethanol gewaschen und dann mittels einer Anreicherungsvorrichtung (hergestellt von der Firma Sakuma Seisakusho, EC-57C) getrocknet. Nach Auflösung in sterilisierter destillierter Lösung wurde die Absorption bei 260 nm gemessen, um die RNA-Menge quantitativ zu ermitteln. Nach dieser Methode konnten 350 µg RNA von etwa 2 g Gewebe von Pferdeherzenvorhöfen gewonnen werden.

(2) Herstellung von Poly-A&spplus;RNA

Die Herstellung einer Poly-A&spplus;RNA von der ganzen RNA erfolgte durch Verwendung eines "mRNA-Reinigungs-Kits", (hergestellt von der Firma Pharmacia) nach dem beigefügten Protokoll. Eine Affinitäts-Chromatographie wurde zweimal mittels einer Oligo- (dT) Kolonne durchgeführt, unter Gewinnung von 13 µg einer Poly- A&spplus;RNA von 350 µg einer vollständigen Pferdeherzenvorhof-RNA.

Beispiel 9

Herstellung einer cDNA-Bibliothek

(1) Herstellung von cDNA

Unter Verwendung von "cDNA Synthesis System Plus" (RPN1256Y, hergestellt von der Firma Amersham) wurde eine cDNA-Synthese unter Verwendung von 5 µg einer Pferdeherzenvorhof-Poly-A&spplus;RNA durchgeführt. Das Syntheseverfahren wurde genau nach dem beigefügten Protokoll durchgeführt. Als Primer wurde ein OligodT-Nukleotid verwendet und die cDNA-Synthese-Wirksamkeit wurde aus der Radio-Aktivität errechnet nach einem synthetischen System, enthaltend [α-³²P]-dCTP. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Reverse Transcriptions-Wirksamkeit bei etwa 20% lag und die Wirksamkeit der Synthese des zweiten Stammes bei 90% oder höher lag.

(2) Herstellung der cDNA-Bibliothek

Durch Verwendung des "cDNA Cloning System gt10, version 2,0" (RPN 1257, hergestellt von der Firma Amersham) für die Verbindung mit der Phagen-DNA, und "Gigapack; Gold" (hergestellt von der Firma Stratogene) für die Packung in dem Phagen, wurde eine cDNA-Bibliothek aus der synthetischen cDNA gemäß den beigefügten Protokollen von diesen hergestellt.

(3) Infektion von E. coli

Als Wirts-Mikroorganismus wurde E. coli Y1089 (ATCC 37196) verwendet und die befähigten Zellen wurden wie unten beschrieben hergestellt. Zellen einer einzelnen Kolonie wurden in 5 ml eines NZY-Mediums inokuliert (0,5% NaCl, 1% NZ-Amin, Typ A (Wako Junyaku), 0,5% Hefeextrakt (DIFCO), 0,2% Magnesiumsulfat, pH-Wert 7,5), zugefügt mit 0,2% Maltose, und es wurde eine Schüttel-Kultivierung bei 37ºC über Nacht durchgeführt. 100 µl der Kulturbrühe wurden in 5 ml des gleichen frischen Mediums transplantiert, und nach einer Kultivierung bei 37ºC auf OD&sub6;&sub6;&sub0; = 0,5, wurde der Mikroorganismus durch Zentrifugieren abgetrennt. Die befähigten Zellen wurden hergestellt durch Suspendieren der Zellen in 1 ml einer 10 mM Magnesiumsulfatlösung.
Zu 0,2 ml der Suspension der befähigten Zellen wurden 0,1 ml der Phagen-Lösung, hergestellt wie in (2) beschrieben, gegeben und die Mischung wurde mit 3 ml von Top-Agarose (NZY-Medium, enthaltend 0,7% Typ-I-Low-EEO-Agarose (hergestellt von der Firma Sigma)) vermischt, bei einer Temperatur von 56ºC aufbewahrt, mit anschließendem Aufgießen auf das obere Teil einer NZY-Agarplatte (30 ml von NZY-Medium, enthaltend 1,5% Bactoagar (hergestellt von der Firma DIFCO), zugegeben zu der 1005- Platte, hergestellt von der Firma Falcon). Nach der Verfestigung der Top-Agarose erfolgte eine stationäre Kultivierung bei 37ºC über Nacht. Durch Identifizierung der Plaques wurden die Phagen-infizierten Zellen identifiziert.
Gemäß der oben beschriebenen Methode wurde eine Pferdeherzenvorhof-cDNA-Bibliothek mit 2,0 · 10&sup7;unabhängigen Phagen erhalten.

Beispiel 10

Isolierung des C-terminalen Amidierungsenzyms cDNA

(1) Herstellung der DNA-Sonde

Eine C-terminale Peptid-Amidierungsenzym-cDNA, die von Ratten stammte, wurde bereits isoliert und ihre Sequenz wurde berichtet (D.A. Soffer und Mitarbeiter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 735-739 (1989), Kato und Mitarbeiter, Seikagaku, 61, 842 (1989)). Die Erfinder des vorliegenden Falles zogen in Erwägung, daß in gewissem Umfang eine Homologie zwischen der Ratten-cDNA und der cDNA des C-terminalen Amidierungsenzyms, das vom Pferd stammt, besteht, beschafften sich einen Teil der Ratten-cDNA und bewirkten eine Isolierung der Pferde-cDNA unter Verwendung dieser als Sonde. Die RattencDNA war ein Geschenk der Tohoku-Universität, School of Medicine (Kato und Mitarbeiter, Seikagaku, 61, 842 (1989)), die mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und HincII wie auch mit Nsi I und Sph I digestiert wurde, wodurch die DNA-Fragmente, die in der Fig. 14 bzw. der Fig. 15 dargestellt sind, isoliert wurden, mit anschließender ³²P-Markierung durch einen Multiprime DNA Labelling Kit (hergestellt von der Firma Amersham), um eine Sonde zu gewinnen.

(2) Plague-Hybridisierung

Nach der Methode, die bei der Infektion von E. coli in Beispiel 9 (3) beschrieben wurde, wurden etwa 500 000 Plaques pro Blatt einer Platte eines Durchmessers von 15 cm (Nr. 1058, hergestellt von der Firma FALCON) erzeugt. Die Kultivierung für die Plaque-Erzeugung erfolgte während 4 Stunden bei 37ºC. Nachdem die Platte 2 Stunden lang bei 4ºC stehengelassen worden war, wurde ein Nitrocellulosefilter (BA85, hergestellt von der Firma Schleicher & Schüell) befestigt, damit die Phagen- DNA in das Filter wandern konnte, worauf die DNA in einer alkalischen Lösung (0,5 M kaustische Soda, 1,5 M Natriumchlorid) denaturiert wurde. Nach Neutralisation mit einer neutralisierenden Lösung (1,5 M Natriumchlorid, 0,5 M Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,0) wurde die Mischung gespült mit einer 2 XSSC-Lösung (0,3 M Natriumchlorid, 30 mM Natriumcitratpuffer, pH-Wert 7,0) und nach der Trocknung an der Luft 2 Stunden auf 80ºC unter vermindertem Druck erhitzt, gefolgt durch Fixierung der DNA an das Filter.
Im Falle des Nitrocellulosefilters mit der Phagen-DNA, die hierauffixiert war, wurde eine Plaque-Hybridisierung durchgeführt unter Verwendung der in (1) hergestellten Sonde. Das Filter wurde in Lappybag (hergestellt von Iwatani) gebracht und 30 ml einer Prehybridisierungsflüssigkeit (0,75 M Natriumchlorid, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,5, 5 mM EDTA, 0,05% Ficoll, 0,05% Polyvinylpyrrolidon, 0,05% Rinderserumalbumin (Fraktion V, hergestellt von der Firma Sigma), 0,1% SDS, 0,2 mg Lachs-Sperma-DNA/ml) wurden zugegeben, worauf die Tasche mittels eines Versiegelungsgerätes versiegelt und 4 Stunden lang auf 65ºC erhitzt wurde. Die Prehybridisierungsflüssigkeit wurde verworfen und 30 ml einer Hybridisierungslösung (0,75 M Natriumchlorid, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 5 mM EDTA, 0,02% Ficoll, 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% Rinderserumalbumin, 0,1% SDS, 0,1 mg Lachs-Sperma-DNA mit etwa 1,0 · 10&sup7; cpm Radioaktivität/ml wurden zugegeben, und nach der Versiegelung wurde eine Hybridisierung 15 Stunden lang bei 65ºC durchgeführt. Das Filter wurde zweimal mit 250 ml einer Waschlösung gewaschen (0,3 mM Natriumchlorid, 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 2 mM EDTA, 0,1% SDS) und weiterhin zweimal mit 250 ml einer Waschlösung (30 mM Natriumchlorid, 2 mM Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 0,2 mM EDTA, 0,1% SDS) und an der Luft getrocknet. Der positive Klon wurde ermittelt durch Autoradiographie mittels eines Röntgenstrahlfilmes (Fuji, HR-H) unter den Exponierungsbedingungen bei -80ºC über Nacht.
Im Falle der zwei verwendeten Sonden wurden 2 000 000 Plaques entsprechend abgetrennt und es wurden etwa 1000 positive Klone erhalten. Die Phagen-DNA wurde von den positiven Plaques abgetrennt, und wiederum wurde E. coli nach der oben beschriebenen Methode einwirken gelassen, und die Plaque-Hybridisierung wurde wiederum durchgeführt, wobei die Operationen wiederholt wurden, bis ein einzelnes Plaque erhalten wurde. Normalerweise können einzelne Plaques erhalten werden, indem die Operationen zweimal wiederholt werden.

Beispiel 11

Bestimmung der cDNA-Basensequenz

Nach der Methode, die auf Seiten 371-372 in Molecular Cloning A Laboratory Manual (T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, Herausgeber, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982) beschrieben wird, wurde DNA abgetrennt und von dem klonierten Phagen gereinigt. Die DNA wurde mit einer Restriktionsenconuklease EcoRI digestiert (hergestellt von der Firma Takara Shuzo) und das cDNA-Einführungs-DNA-Fragment wurde von der Phagen-DNA abgetrennt durch Anwendung einer 1,5% Agarose- Gel-Elektrophorese. Das cDNA-Fragment wurde von dem Gel extrahiert und an der EcoRI-Stelle des E. coli-Plasmides pUC 119 (hergestellt von der Firma TakaraShuzo) durch die Ligationsreaktion eingeführt. Wenn die EcoRI-Stelle in dem cDNA-Fragment vorhanden war, wurde das cDNA-Fragment durch partielle Digestierung der Phagen-DNA mit EcoRI erhalten. Nachdem das Plasmid verstärkt worden war, wurde das cDNA-Fragment mit M13- Phagen mp 18, mp 19 (hergestellt von der Firma Takara Shuzo) subkloniert, unter Gewinnung einer einsträngigen DNA, unter Anwendung üblicher Methoden. Durch die Verwendung von Sequenase (Handelsbezeichnung, hergestellt von der Firma Toyo Boseki K.K.) unter Beachtung der angegebenen Instruktionen, wurde die DNA-Basensequenz bestimmt. Die Basensequenz der einsträngigen DNA wurde für etwa 400 Basen bestimmt, und im Falle des DNA-Fragmentes mit einer Länge, die diese Länge übertraf, wurde die Sequenz durch Subklonierung durch die Verwendung einer geeigneten Restriktionsendonuklease bestimmt. Für das cDNA-Fragment wurden die Basensequenzen von beiden Ketten des Doppelstranges bestimmt.
Fig. 13 zeigt die cDNA-Basensequenz, die bestimmt wurde für das C-terminale Pferde-Amidierungsenzym (diese Basensequenz zeigt die längste cDNA als Ergebnis von vielen cDNA-Analysen) sowie die Aminosäuresequenz (Einbuchstaben- Darstellung), die von der Basensequenz erwartet wurde. Auch konnten cDNA's, in denen ein Teil oder beide der Teile, die dargestellt sind durch [], in der Figur fehlten, bestätigt werden. Diese cDNA's werden als solche betrachtet, die sich von mRNA's ableiten durch unterschiedliche mRNA-Spleißmethoden.

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT

Die vorliegende Erfindung kann angewandt werden zur Herstellung einer C-terminalen Peptid-Amidierungsverbindung von dem entsprechenden C-terminalen Peptid-Glycinaddukt. Eine solche C-terminale Peptid-Amidierungsverbindung schließt wertvolle physiologisch aktive Substanzen ein.

Claims

1. Enzym, das die Umwandlung eines C-terminalen α-Hydroxyglycin-Peptid-Adduktes gemäß der Formel (II):

(worin A für einen Rest steht, der verschieden ist von einer α-Aminogruppe oder Iminogruppe oder einer α-Carboxylgruppe, abgeleitet von einer natürlich vorkommenden α-Aminosäure und worin X steht für ein Wasserstoffatom oder einen Rest eines Aminosäurederivates, das an das N-Atom durch eine Carbonylgruppe gebunden ist), zu einer C-terminalen amidierten Verbindung der folgenden Formel (III) katalysiert:

(worin A und X die gleiche Bedeutung wie oben angegeben haben), das jedoch nicht die Umwandlung eines C-terminalen Glycin-Peptid-Adduktes gemäß der folgenden Formel (I):

(worin A und X die oben angegebene Bedeutung haben), zu dem C-terminalen α-Hydroxyglycin-Peptid-Addukt (II) katalysiert.

2. Enzym nach Anspruch 1, für das

(a) der optimale pH-Wert bei etwa 5 bis 6 liegt, und für das der stabile pH-Wert bei 4 bis 9 liegt, und

(b) dessen optimale Wirkungstemperatur bei 15 bis 35ºC liegt.

3. Enzym nach Anspruch 1, das der Aminosäuresequenz entspricht, die ausgewählt ist aus den Aminosäuresequenzen von dem 443sten Rest P oder S bis zum 830sten Rest K des Menschen, Pferdes, Rindes und der Ratte, wie in der beigefügten Fig. 5 gezeigt wird.

4. Enzym, das die Umwandlung eines C-terminalen Glycin- Peptid-Adduktes, dargestellt durch die folgende Formel (I):

(worin A einen Rest darstellt, der verschieden ist von einer α-Aminogruppe oder Iminogruppe und einer α-Carboxylgruppe, abgeleitet von einer natürlich vorkommenden α-Aminosäure, und worin X steht für ein Wasserstoffatom oder einen Rest eines Aminosäurederivates, das an das N-Atom durch eine Carbonylgruppe gebunden ist), zu einem C-terminalen α-Hydroxyglycin-Peptid-Addukt, dargestellt durch die folgende Formel (II):

(worin A und X die oben angegebene Bedeutung haben), katalysiert, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus einer Aminosäuresequenz besteht, die ausgewählt ist aus den Aminosäuresequenzen von dem 42sten Rest P oder S bis zum 442sten Rest K des Menschen, des Rindes und der Ratte oder entsprechend der Aminosäuresequenz von dem 42sten Rest P oder S bis zum 231sten Rest K des Pferdes und des Rindes, wie es in der beigefügten Fig. 5 dargestellt ist, oder bestehend aus der Aminosäuresequenz von dem 42sten Rest P bis zu dem 442sten Rest K des Pferdes, wie es in Fig. 5 dargestellt ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms nach Anspruch 1 oder 4, bei dem die die Enzymaktivität aufweisende Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 4 behandelt wird durch eine Substrat-Affinitäts-Chromatographie durch Verwendung des C-terminalen-Glycin-Peptid-Adduktes, das durch die obige Formel (I) dargestellt wird, als dem Liganden, und Anionenaustausch-Chromatographie.

6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der Ligand ein Peptid in freiem Zustand ist oder gebunden an einen wasserunlöslichen Träger durch die Aminogruppe des Aminosäurerestes am endständigen N und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Tyr-Trp-Gly, Phe-Gly-Phe-Gly und Gly-Phe-Gly.

7. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die die Enzymaktivität aufweisende Verbindung ein Homogenisat eines Organes ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säugetiergehirnen, dem Hirnanhang und dem Herzen oder Blut eines Säugers.

8. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die die Enzymaktivität aufweisende Verbindung Pferdeserum ist.

9. Verfahren zur Herstellung eines Enzymes nach Anspruch 1 oder 4, bei dem man Wirtszellen kultiviert, die mit einem Expressionsplasmid transformiert sind, das eine DNA aufweist, die für das Enzym codiert, und Gewinnung von beiden oder einem der Enzyme aus der Kultur.

10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Wirtszellen mit einem Plasmid transformiert werden, das eine cDNA-Codierung für das Enzym nach Anspruch 1 und/oder Anspruch 4 aufweist und dazu befähigt ist,es zu exprimieren.

11. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Wirtszellen mit einem Plasmid transformiert werden, das eine cDNA aufweist, die für das Enzym des Anspruches 4 codiert und es exprimieren kann.

12. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die Wirtszellen mit einem Plasmid transformiert werden, das eine cDNA aufweist, die für das Enzym nach Anspruch 1 codiert und es zu exprimieren vermag.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 12, bei dem sich die DNA von einem Säuger ableitet.

14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem der Säuger eine Ratte oder ein Pferd ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines Enzymes, das die Umwandlung eines C-terminalen Glycin-Peptid-Adduktes gemäß der folgenden Formel (I):

(worin A darstellt einen Rest, der verschieden ist von einer α-Aminogruppe oder Iminogruppe und einer α-Garbcxylgruppe, die sich ableitet von einer natürlich vorkommenden α-Aminosäure, und worin X steht für ein Wasserstoffatom oder einen Rest eines Aminosäurederivates, der an das N-Atom durch eine Carbonylgruppe gebunden ist), zu einem C-terminalen α-Hydroxyglycin-Peptid-Addukt, dargestellt durch die folgende Formel (II):

(worin A und X die wie oben angegebene Bedeutung haben), oder eines Enzyms, das die Umwandlung eines C-terminalen Glycin-Adduktes, das auf ein C-terminales α-Hydroxyglycin- Peptid-Addukt einwirkt, das durch die obige Formel (II) wiedergegeben wird, zu einer C-terminalen amidierten Verbindung katalysiert, die durch die folgende Formel (III) wiedergegeben wird:

(worin A und X die oben angegebene Bedeutung haben, wobei das Verfahren umfaßt die Kultivierung von Wirtszellen, die transformiert sind mit einem Expressionsplasmid mit einer DNA, die für das Enzym codiert, und Gewinnung von beiden oder einem der Enzyme aus der Kultur, dadurch gekennzeichnet, daß in der DNA ein Teil entsprechend des die Membran über spannenden Bereiches ausgeschnitten worden ist.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, bei dem das kultivierte Produkt durch eine Substrat-Affinitäts- Chromatographie mit dem Liganden des C-terminalen Glycin- Peptid-Adduktes behandelt ist, das durch die obige Formel (I) wiedergegeben wird.

17. Verfahren zur Herstellung eines C-terminalen α-Hydroxyglycin-Adduktes gemäß der obigen Formel (II), das umfaßt die Behandlung eines C-terminalen Glycin-Adduktes gemäß der obigen Formel (I) mit einem Enzym gemäß Anspruch 4.

18. Verfahren zur Herstellung einer C-terminalen amidierten Verbindung, die dargestellt wird durch die obige Formel (III), das umfaßt die Behandlung eines C-terminalen α-Hydroxyglycin-Adduktes gemäß der oben angegebenen Formel (II) mit einem Enzym gemäß Anspruch 1.

19. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Enzyms gemäß Anspruch 4 mit:

(a) der Stufe des Abpufferns einer Testprobe, von der erwartet wird, daß sie eine Aktivität eines Enzyms gemäß Anspruch 1 aufweist, auf einen pH-Wert von 5 bis 8;

(b) die Stufe der Zugabe eines C-terminalen Glycin-Peptid- Adduktes gemäß obiger Formel (I), L-Ascorbinsäure und Catalase zu dem erhaltenen Puffer mit anschließender Inkubierung; und

(c) die Stufe der Bestimmung eines C-terminalen α-Hydroxyglycin-Adduktes gemäß Formel (II), gebildet durch HPLC unter Verwendung eines Acetonitrils, enthaltend ein Eluierungsmittel eines pH-Wertes von 6 bis 10.

20. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität eines Enzyms gemäß Anspruch 1 mit:

(a) der Stufe des Abpufferns einer Testprobe, von der erwartet wird, daß sie die Aktivität eines Enzyms gemäß Anspruch 2 hat, auf einen pH-Wert von 4 bis 8;

(b) die Stufe der Zugabe eines C-terminalen Glycin-Peptid- Adduktes, wiedergegeben durch die obige Formel (II) zu dem erhaltenen Puffer mit anschließender Inkubierung; und

(c) die Stufe der Bestimmung einer C-terminalen amidierten Verbindung gemäß Formel (III), die sich gebildet hat.

21. Verfahren zur Suche nach einem Enzym gemäß Anspruch 1, das umfaßt die Durchführung einer Bestimmungsmethode gemäß Anspruch 20 mit einer Testprobe.

22. Verfahren zur Suche nach einem Enzym gemäß Anspruch 4, das umfaßt die Durchführung einer Bestimmungsmethode gemäß Anspruch 19 mit einer Testprobe.

23. Verfahren zur Herstellung von Enzymen wie sie in Ansprüchen 1 und 4 definiert sind, bei dem die die Enzymaktivität enthaltenden Verbindungen von Anspruch 1 und 4 behandelt werden durch Substrat-Affinitäts-Chromatographie durch Verwendung des C-terminalen Glycin-Peptid-Adduktes, das dargestellt wird durch die obige Formel (I) als dem Liganden, und Anionenaustausch-Chromatographie.

24. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem der Ligand ein Peptid in einem freien Zustand ist oder an einen wasserunlöslichen Träger gebunden ist durch die Aminogruppe des Aminosäurerestes beim terminalen N und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D-Tyr-Trp-Gly, Phe-Gly-Phe-Gly und Gly-Phe-Gly.

25. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem Enzymaktivität enthaltende Verbindungen ein Homogenisat eines Organes sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säugetiergehirnen, Hirnanhangdrüsen und Herzen oder dem Blut eines Säugers.

26. Verfahren nach Anspruch 23, bei dem die die Enzymaktivität enthaltenden Verbindungen Pferdeserum sind.

27. Verfahren zur Herstellung von Enzymen, definiert in Anspruch 1 und Anspruch 4, das umfaßt die Kultivierung von Wirtszellen, transformiert mit DNA, die für die Enzyme codiert, und Gewinnung von beiden oder einem der Enzyme aus der Kultur.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 23 bis 27, bei dem sich die DNA von einem Säuger ableitet.

29. Verfahren nach Anspruch 28, bei dem der Säuger eine Ratte oder ein Pferd ist.

30. Verfahren zur Herstellung von Enzymen, welche die Umwandlung eines C-terminalen Glycin-Peptid-Adduktes gemäß der folgenden Formel (I):

(worin A einen Rest darstellt, der verschieden ist von einer α-Aminogruppe oder Iminogruppe oder einer α-Garboxylgruppe, die sich ableitet von einer natürlich vorkommenden α-Aminosäure, und worin X steht für ein Wasserstoffatom oder einen Rest eines Aminosäurederivates, das an das N-Atom durch eine Carbonylgruppe gebunden ist), zu einem C-terminalen α-Hydroxyglycin-Peptid-Addukt katalysiert, das dargestellt wird durch die folgende Formel (II):

(worin A und X die oben angegebene Bedeutung haben), und eines Enzymes, das die Umwandlung eines C-terminalen Glycin-Adduktes, das auf ein C-terminales α-Hydroxyglycin- Peptid-Addukt wirkt, dargestellt durch die obige Formel (II) zu einer C-terminalen amidierten Verbindung katalysiert, die dargestellt wird durch die folgende Formel (III):

(worin A und x die gleiche Bedeutung wie oben angegeben haben), das umfaßt die Kultivierung von Wirtszellen, die mit DNA transformiert sind, die für die Enzyme codiert, und Gewinnung von sowohl beiden oder einem der Enzyme aus der Kultur, dadurch gekennzeichnet, daß in der DNA ein Teil entsprechend dem die Membran überbrückenden Bereich ausgeschnitten worden ist.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 bis 30, bei dem das kultivierte Produkt durch Substrat-Affinitäts-Chromatographie mit dem Liganden des C-terminalen Glycin-Peptid- Adduktes behandelt wird, das durch die obige Formel (I) wiedergegeben wird.