DE69116803T2

DE69116803T2 - Peroxidase-Gen von mikrobischem Ursprung

Info

Publication number: DE69116803T2
Application number: DE69116803T
Authority: DE
Inventors: Teruo Amachi; Toshihiko Ashikari; Haruyo Hatanaka; Toru Nakayama; Yuji Shibano; Motoo Sumida; Yoshikazu Tanaka
Original assignee: Suntory Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 1990-11-16
Filing date: 1991-11-18
Publication date: 1996-07-11
Anticipated expiration: 2011-11-19
Also published as: GR3018850T3; ATE133709T1; JP3399549B2; DE69116803D1; DK0486067T3; CA2055698A1; US5286638A; ES2085403T3; EP0486067A3; EP0486067B1; CA2055698C; JPH04228078A; EP0486067A2

Description

Die Erfindung betrifft eine eine Peroxidase kodierende cDNA, die aus einem Mikroorganismus (Arthromyces ramosus) stammt, und ein Verfahren zur Herstellung der Peroxidase unter Verwendung von das Gen enthaltenden Wirtszellen.
In den letzten Jahren wurden Peroxidasen, die Enzyme mit der Fähigkeit zur Oxidation verschiedener Verbindungen in Gegenwart von Wasserstoffperoxid sind, auf die gleiche Weise wie verschiedene andere Oxidasen als klinische diagnostische Reagenzien in Tests auf Glucose, Cholesterin, Phospholipiden, Harnstoff, usw. verwendet. Diese Enzyme wurden auch als markiertes Enzym in Enzym-verknüpften Immuntests eingesetzt. Sie wurden hauptsächlich aus Pflanzen, wie Meerrettich und japanischem Rettich gewonnen. Jedoch enthalten Peroxidasen, die aus diesen Pflanzen stammen, Isoenzyme mit leicht voneinander unterschiedlichen Eigenschaften, was daher deutliche Arbeitsanstrengungen erfordert, um sie auf ein solches Maß zu reinigen, daß sie als ein Diagnostikum verwendbar sind.
Andererseits kennt man einige Peroxidasen von mikrobiellem Ursprung. Jedoch sind Cytochrom-C-Peroxidasen und NADH-Peroxidasen, gewonnen aus Bakterien oder Pilzen, als klinische oder diagnostische Reagenzien im Hinblick aufihre Spezifität ungeeignet, da sie im allgemeinen weniger spezifisch sind als die üblichen, die aus Meerrettich oder japanischem Rettich stammen. Jüngst wurden Peroxidasen, die zur Reaktion mit o-Dianisidin als Wasserstoff-Donor fähig sind, aus Escherichia coli oder Mikroorganismen, die zu Gattung Myrothecium gehören, hergestellt. Jedoch ist dieses Enzym ebenfalls für die zuvor erwähnte diagnostische Verwendung aufgrund der karzinogenen Natur von o-Dianisidin ungeeignet.
Unter diesen Umständen haben die Erfinder Forschungen unternommen, um eine natürlich vorkommende Peroxidase von mikrobiellem Ursprung zu erhalten, die z. B. als klinisches diagnostisches Reagens oder als markiertes Enzym in einem Enzym-verknüpften Immuntest ähnlich zu üblichen, die aus Meerrettich oder japanischem Rettich stammen, zu erhalten. Die Erfinder haben bereits über eine Peroxidase berichtet, die aus einem Fungus, der zur Gattung Arthromyces gehört, gewonnen wurde, wobei die Peroxidase die erwünschten Eigenschaften hat (japanisches offengelegtes Patent Nr. 43987/1986). Sie klärten ferner auf, daß die Peroxidase der Gattung Arthromyces konventionellen Peroxidasen hinsichtlich der Chemilumineszenz erzeugenden Aktivität bei der Bestimmung mit einem Chemilumineszenz-Peagens auf z. B. Peroxide, als klinisches Diagnostikum oder als markiertes Enzym in einem Enzym-verknüpften Immuntest überlegen ist (siehe japanisches offengelegtes Patent Nr. 219398/1988).
Obwohl die Arthromyces-Peroxidase ein ideales Enzym zur Verwendung als klinisches Diagnostikum oder in einem Enzym-verknüpften Immuntest wie oben beschrieben ist, besteht das Problem, daß diese Peroxidase nicht zu vernünftigen Kosten hergestellt werden kann. Der Grund dafür ist, daß eine großmaßstäbliche Kultur eines Pilzes, wie Arthromyces, sehr schwierig ist. Zusätzlich war es erwünscht, die Aminosäuresequenz des Enzymproteins aufzuklären, um den Aktionsmechanismus des Enzyms auf der molekularen Stufe zu verstehen. Die Aufklärung der Aminosäureseguenz sollte es ferner ermöglichen, die Peroxidase auf molekularer Ebene zu modifizieren, nämlich unter Verwendung von Gentechnik. Zur Lösung dieser und anderer Probleme wäre die Gentechnik die am meisten geeignete Vorgehensweise. Jedoch war das Gen, das für die besagte Peroxidase aus Arthromyces kodiert, bislang nicht erhalten. Daher war es unmöglich, das Enzym in einem größeren Maßstab zu produzieren oder dasselbe unter Anwendung gentechnischer Verfahren zu modifizieren.
Fig. 1 erläutert die Schritte der Bildung des intermediären Plasmids pYE2006 bei der Konstruktion des Plasmids pYEPOD1, der das Peroxidaseprotein in Hefe exprimiert.
Fig. 2 erläutert die Schritte von pYE2006 zu pYE22m.
Fig. 3 erläutert die Schritte von pYE22m zum endgültigen pYEPOD1-Plasmid.
Fig. 4 erläutert die elektrophoretischen Muster, welche zeigen, daß die mit pYEPOD1 transformierte Hefe das Peroxidaseprotein lieferte.
Fig. 5 (a), (b) und (c) zeigen die Nukleotidseguenz der cDNA von Arthromyces-Peroxidase einschließlich der Anteile der 3'- und 5'-nicht-kodierenden Regionen. Die Aminosäuresequenz, kodiert von der cDNA, ist ebenfalls angegeben.
Die Erfinder haben intensive Untersuchungen durchgeführt, um die obigen Aufgaben zu lösen. Im Ergebnis haben sie erfolgreich eine cDNA von Arthromyces-Peroxidase erhalten und die Nukleotidsequenz des Gens und die Aminosäuresequenz des Enzyms aufgeklärt, wodurch die Erfindung abgeschlossen wurde. Dadurch wurde es möglich, Arthromyces-Peroxidase in großem Maßstab in einem geeigneten Wirt, wie E. coli oder einer Hefe, die leicht zu kultivieren ist, zu produzieren, und ferner die Peroxidase durch Anwendung gentechnischer Verfahren zu modifizieren.
Demnach stellt die Erfindung ein Peroxidasegen von Arthromyces-Ursprung oder eine Variante oder eine Mutante davon mit einer im wesentlichen identischen biologischen Aktivität, einen rekombinanten Vektor, der das Gen enthält, mit einem solchen Plasmid, der das Gen enthält, transformierte Wirtszellen, und ein Verfahren zur Herstellung der Peroxidase unter Wachsenlassen der Transformanten zur Verfügung.
Das erfindungsgemäße Peroxidasegen kann aus einem Fungus, zugehörig zur Gattung Arthromyces erhalten werden. Z. B. ist Arthromyces ramosus, der SAM 003 genannt wurde und bei der Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology unter der Hinterlegungsnummer FERM BP- 838 hinterlegt wurde, dafür erhältlich. Ferner kann es einige andere Mikroorganismen geben, die zur Produktion einer Peroxidase in der Lage sind, die im wesentlichen die identische biologische Aktivität zu der Peroxidase hat, die durch den Fungus der Gattung Arthromyces erzeugt wird. Solche Mikroorganismen sind ebenfalls als Ausgangsmaterial in der vorliegenden Erfindung einsetzbar.
Der Begriff "im wesentlichen identisch", wie hierin verwendet, soll bedeuten, daß hinsichtlich der Eigenschaften der durch das erfindungsgemäße Gen kodierten Peroxidase jedes Enzym, das im wesentlichen die gleiche biologische Aktivität wie das Enzym, erhalten nach dem Verfahren in der japanischen Patentoffenlegung Nr. 43987/1986 beschrieben, und die vorzugsweisen Eigenschaften wie in der japanischen Patentoffenlegung Nr. 219398/1988 beschrieben, hat, hiermit umfaßt ist.
Isolierung der mRNA aus dem zuvor erwähnten Ausgangs-Mikroorganismus, Herstellung einer cDNA-Bank und Screenen der Bank kann nach einem bekannten Verfahren erfolgen, z. B. nach dem wie beschrieben in Molecular Cloning, zweite Ausgabe (von Symbrook et al., Cold Spring Harbor, 1988). Z. B. kann das Gen, das die erfindungsgemäße Peroxidase kodiert, auf die folgende Weise erhalten werden.
Zuerst werden polya-RNAs aus Arthromyces-Zellen extrahiert. Aus den polyA-RNAs als Matrizen können cDNAs bei Insertion bei einem Phagen-Klonierungsvektor (z. B. λgt10) hergestellt werden, der dann zur Transformation eines Wirts, wie E. coli, verwendet wird. Anschließend wird die erhaltene cDNA-Bank unter Verwendung einer synthetischen DNA-Sonde, entsprechend einer Teilaminosäuresequenz der Peroxidase, gescreent. Auf diese Weise werden positive Klone, die ein die Zielperoxidase kodierendes DNA-Fragment enthalten, selektiert. Die zum Screenen zu verwendende DNA-Sonde kann durch Reinigen des Peroxidaseproteins aus einer Arthromyces-Kultur nach einem im folgenden beschriebenen Verfahren synthetisiert werden. Die Aminosäuresequenzen von mindestens einiger Teile davon werden bestimmt, wodurch eine geeignete Sonde beruhend auf diesen Sequenzen ausgewählt werden kann. Ferner kann ein längeres Sondenfragment durch Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Techniken hergestellt werden.
Wenn die cDNA mit gesamter Länge nicht in den positiven Klonen erhalten werden kann, kann eine längere cDNA nach dem folgenden Verfahren erhalten werden. Es wird nämlich Phagen-DNA aus einem der positiven Klone präpariert, und ein geeignetes EcoRI-Fragment aus der Phagen-DNA kann zum Screenen derselben Bank verwendet werden. Auf diese Weise werden mehrere positive Klone erhalten. Diese positiven Phasen-Klone werden mit EcoRI verdaut und die aufgetrennten DNA-Fragmente werden in einen geeigneten Vektor subkloniert (z. B. M13mp18 oder M13mp19). Die Nukleotidseguenzen der so eingefügten DNA-Fragmente werden z. B: nach dem Dideoxy-Sequenzierungsverfahren bestimmt.
Andererseits werden zur Aufklärung der gesamten Länge der cDNA der Peroxidase das gereinigte Peroxidaseprotein analysiert, um die Aminosäurezusammensetzung und die Aminosäureseguenzen in den Amino- und Carboxy-terminalen Regionen zu bestimmen, und die Ergebnisse werden mit der aus der Nukleotidsequenz der DNA, bestimmt nach dem zuvor erwähnten Verfahren, verglichen.
Beispiele von Wirtszellen zur Expression der cDNA umfassen Bakterien wie E. coli und Bacillus subtilis, Hefen und Pilze.
Die erfindungsgemäße Peroxidase kann durch Wirtszellen produziert werden, die mit einem Plasmid transformiert wurden, der dann Peroxidasegene enthält, vorzugsweise in Kombination mit der Signalsequenz für das Gen zusammen mit einem geeigneten Promoter und einem Terminator. Z. B. wird die zuvor erwähnte Transformante in einem Medium, enthaltend eine geeignete Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und Spurenmetallelemente gemäß dem Verfahren von Shinmen et al. (Agric. Biol. Chem., 50, 247-249, 1986) kultiviert. Das Zielenzym wird aus dem Zellextrakt oder vorzugsweise aus dem Kulturüberstand durch Kombination bekannter Reinigungsverfahren, wie Präzipitation, Absorption, Filtration durch Molekularsieb und Elektrophorese gereinigt. Z. B. wird der Zellextrakt oder der Kulturüberstand einer Ammoniumsulfatpräzipitation (bei ca. 75 % Sättigung) unterworfen, worauf eine Kombination von Säulen-chromatographischen Schritten (z. B. DEAE-Zellulose- Säulenchromatographie und Ultrogel-AcA44-Säulenchromatographie) folgen. Auf diese Weise kann die erfindungsgemäße Peroxidase erhalten werden. Man erwartet, daß die so erhaltene Peroxidase hervorragende Eigenschaften ähnlich zu der in der japanischen Patentoffenlegung Nr. 42987/1986 beschrieben aufweist.

BEISPIELE

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung dienen die folgenden nicht-limitierenden Beispiele, worin alle Testverfahren gemäß dem in Molecular Cloning, zweite Ausgabe (von Sambrook et al., Cold Spring Harbor, 1988), sofern nicht anders angegeben, entsprechen.

BEISPIEL 1: ANALYSE DER AMINOSÄUREZUSAMMENSETZUNG DES PEROXIDASEPROTEINS

Die Aminosäurezusammensetzung des Peroxidaseproteins wurde unter Verwendung einer kommerziellen Peroxidase von Arthromyces-Ursprung (erhältlich von Suntory, Ltd.) analysiert. Zunächst wurde die Aminosäurezusammensetzung nach dem konventionellen Verfahren, beschrieben in Einzelheiten in Seikagaku Jikken Koza 1, Tanpakushitsu no Kagaku II (von Takahashi, Ikenaka, et al., Tokyo Kagaku Dojin) und Zoku Seikagaku Jikken Koza 2, Tanpakushitsu no Kagaku (Bd. 1) (von Tsunazawa, Sakiyama et al.) analysiert. Zunächst wurden 5 nmol des Peroxidaseproteins in einem Glasröhrchen zusammen mit 6 N Salzsäure versiegelt und bei 110ºC 24 Stunden hydrolysiert. Anschließend wurden die in der Reaktionsmischung enthaltenen freien PTH-Aminosäuren in einem Aminosäureanalysator (Hitachi Automatic Amino Acid Analyzer 835) zur Bestimmung der Aminosäurezusammensetzung (siehe Tabelle 1) quantifiziert. TABELLE 1 Aminosäure (mol/mol Protein)
*: Asx bedeutet Gesamtmenge von Asn und Asp.
**:Glx bedeutet Gesamtmenge von Gln und Glu.
***:Jede der Klammern gestllten Zahlen bedeutet die auf Basis der Nukleotidsequenz berechnete Aminosäureanzahl.
Bei Untersuchung der Aminosäuresequenz aus dem Aminoterminus des Proteaseproteins wurde das Protein unter reduzierenden Bedingungen carboxymethyliert, worauf Reinigung unter Umkehrphasen-HPLC folgte. Es wurden nämlich 100 mg (2,5 µmol) der Peroxidase in 3,0 ml einer Denaturierungs-Pufferlösung [Tris HCl (pH 8,5) enthaltend 6 M Gdn HCl, 10 mM EDTA 2Na) gelöst und 1 Stunde bei 50ºC inkubiert. Anschließend wurden 143 µmol (10 µl) 2- Mercaptoethanol zugegeben, und die Atmosphäre im Reaktionssystem wurde durch Stickstoff ersetzt. Nach 1-stündiger Inkubation bei 37ºC, wurden 150 µl 1 M Natriumjodacetat (gelöst in Denaturierungs-Pufferlösung, 0,207 g/ml) zugegeben, und die Mischung wurde auf einen pH von 8,0 bis 8,5 mit NaOH eingestellt. Nach Einleiten eines Stickstoffstroms in das Reaktionssystem wurde die Mischung im Dunkeln 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Während dieses Zeitraums wurde der pH des Reaktionssystems auf 8,0 bis 8,5 aufrechterhalten. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Reaktionsmischung erschöpfend gegen H&sub2;O dialysiert. Das Dialysat wurde einer Umkehrphasen- HPLC unter den folgenden Bedingungen unterworfen, und die Proteinfraktionen wurden gesammelt, konzentriert und lyophilisiert:
Umkehrphasen-HPLC-Bedingungen: Säule = Zorbax Pro10
PROTEIN PLUS 20 ∅;
Flußrate: 4,0 ml/min;
Mobile Phase: A = 0,05 % TFE in H&sub2;O, B = CH&sub3;CN,
A : B = 8 : 2 (Volumen/Volumen)
Detektion: A&sub2;&sub8;&sub0;
Die Proteinausbeute war 16 %. Als Ergebnis der SDS-PAGE wurden nur zwei molekulare Proteinspezien (Molekulargewicht: ca. 40 K und 30 K) aus der Proteinfraktion nachgewiesen.
Die Aminosäuresequenz der N-terminalen Region des oben erhaltenen carboxymethylierten Peroxidaseproteins (5 nmol) wurde mit einem Gasphasen-Proteinsequenzator (Shimadzu Seisakusho, Ltd.) analysiert. Im Ergebnis wurde keine freie PTH-Aminosäure nachgewiesen, was darauf hindeutete, daß die N- terminale Aminosäure geschützt war. Daher wurde der N-Terminus des carboxymethylierten Peroxidaseproteins auf die folgende Weise freigelegt.
Eine wäßrige Lösung der carboxymethylierten Peroxidase (100 nmol/ml) wurde auf 100 nmol/0,5 ml unter Einblasen eines Stickstoffstromes konzentriert. Anschließend wurden 30 µl einer Reaktionspufferlösung (0,25 M Natriumphosphat-Pufferlösung, 0,05 M EDTA, 5 mM 2-Mercaptoethanol) zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde auf pH 7 mit NaOH eingestellt. Es wurde 85 Einheiten Pyroglutamylpeptidase (5 µl der handelsüblich erhältlichen Präparation von Bacillus Amyloliquefaciens (Sigma Co.)) zugegeben, und die Mischung wurde 18 Stunden bei 37ºC umgesetzt. Ein 60µl-Aliquot der Reaktionsmischung (12 nmol Peroxidase) wurde auf den Sequenzator in zwei Portionen gegeben, um die Aminosäuresequenz zu bestimmen.
Im Ergebnis wurde der geschützte Rest am N-Terminus als Pyroglutamyl nachgewiesen, und ferner wurde die Aminosäuresequenz der ersten 20 Reste in der N-terminalen Region wie folgt bestimmt. [Dies entspricht den Positionen 21 (Gln) bis 40 (Asn) in Fig. 5]:
(Gln)-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Val-Thr-Cys-Pro-Gly-Gly-Gln-Ser- Thr-Ser-Asn;
worin (Gln) einen Pyroglutaminsäurerest bedeutet.
Anschließend wurden die Teilaminosäuresequenzen des Peroxidaseproteins auf die folgende Weise bestimmt.
Die carboxymethylierte Peroxidase (48 nmol, 1,9 mg) wurde in 100 µl 0,1 M NH&sub4;HCO&sub3; (pH 7,9) suspendiert, wozu 2 µl einer 1%igen Lösung TPCK- Trypsin (Worthington) in 0,0024 N HCl zugegeben wurde, und die Mischung wurde bei 35ºC 6 Stunden inkubiert. Die weiße Trübung in der Flüssigkeit verschwand unmittelbar nach der Zugabe des Enzyms und die Lösung wurde klar. Nach Abschluß der Reaktion wurde die Mischung unter Abbrechen der Reaktion lyophilisiert. Der trockene Rest wurde in 70 % Ameisensäure unter Bereitstellung für den nächsten HPLC-Schritt gelöst.
Die Peptidfragmente des Trypsin-Verdaus wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter den folgenden Bedingungen aufgetrennt:
Säule = Bakerbond Widepore C&sub4; (350 Å), 6 ∅ x 250;
Flußrate = 1,0 ml/min;
Druck = 80 kg/cm²;
Temperatur = Raumtemperatur;
Mobile Phase: A = 0,05 % TFE in H&sub2;0, B = CH&sub3;CN,
A : B = 8 : 2 (Volumen/Volumen);
Detektion: A&sub2;&sub2;&sub0;).
Jeder Peak wurde weiter mit Umkehr-HPLC gereinigt. Dann wurden die Aminosäuresequenzen der gereinigten Peptide bestimmt. Die Sequenzen der folgenden 6 Peptide wurden wie folgt mit einem Gasphasen-Proteinsequenzator (Shimadzu Seisakusho, Ltd.) bestimmt. [Diese Peptide entsprechen den Regionen in Fig. 5 wie folgt: Peptid 1: Positionen von 125 (Ala) bis 154 (Arg); Peptid 2: Positionen von 162 (Ser) bis 186 (Arg); Peptid 3: Positionen von 240 (Gly) bis 261 (Phe); Peptid 4: Positionen von 275 (Thr) bis 288 (Val); Peptid 5: Positionen von 300 (Met) bis 307 (Arg); und Peptid 6: Positionen von 325 (Ala) bis 336 (Asp).]
Peptid 1: Ala-Val-Gly-Ile-Asn-His-Gly-Val-Ser-Phe-Gly-Asp-Leu-Ile- Gln-Phe-Ala-Thr-Ala-Val-Gly-Met-Ser-Asn-Cys-Pro-Gly-Ser- Pro-Arg
Peptid 2: Ser-Asn-Ser-Ser-Gln-Pro-Ser-Pro-Pro-Ser-Leu-Ile-Pro-Gly- Pro-Gly-Asn-Thr-Val-Thr-Ala-Ile-Leu-Asp-Arg
Peptid 3: Gly-Thr-Thr-Gln-Pro-Gly-Pro-Ser-Leu-Gly-Phe-Ala-Glu-Glu- Leu-Ser-Pro-Phe-Pro-Gly-Glu-Phe
Peptid 4: Thr-Ala-Cys-Arg-Trp-Gln-Ser-Met-Thr-Ser-Ser-Asn-Glu-Val
Peptid 5: Met-Ser-Val-Leu-Gly-Phe-Asp-Arg
Peptid 6: Ala-Ala-Pro-Val-Ile-Pro-Gly-Gly-Leu-Thr-Val-Asp

BEISPIEL 2: KLONIEREN DER ARTHROMYCES-PEROXIDASE-cDNA

(1) PRÄPARATION EINER cDNA-BANK

Zellen des Arthromyces ramosus Stammes wurden in flüssigem Stickstoff in einem Mörser gemahlen. Von den gemahlenen Zellen wurde eine RNA-Fraktion nach den Verfahren unter Verwendung von Guanidinthiocyanat/Caesiumchlorid hergestellt. Dann wurde die polyA RNA-Fraktion hieraus unter Verwendung von Oligo(dT)Zellulose abgetrennt. Die Einzelheiten des Guanidinthiocyanats/- Caesiumchlorid-Verfahrens und die Reinigung von polyA RNA durch Oligo(dT)- Zellulose können z. B. bei R. McGookin, Robert J. Slater et al. (Methods in Molecular Biology, Bd. 2, Humana Press Inc., 1984) gefunden werden.
Insbesondere wurde zu den oben erhaltenen gemahlenen Zellen 4 Volumeneinheiten insgesamt von 5 M Gunaidinthiocyanat, 50 mM Tris-HCL (pH 7,5), 10 mM EDTA und 5 % ß-Mercaptoethanol zugegeben, und die erhaltene Mischung wurde weiter gemahlen. Dann wurden N-Lauroylsarcosin und Caesiumchlorid zugegeben und in der gemahlen Mischung in einer solchen Weise gelöst, daß es letztendlich eine Endkonzentration von 4 % (Gewicht/Volumen) und 0,15 g/ml ergab. Anschließend wurde die Mischung bei 10.000 g 20 Minuten unter Erhalt eines Überstands zentrifugiert. Es wurden 5,7 M Caesiumchlorid und 0,1 M EDTA (pH 7,5) in ein Zentrifugenröhrchen eingeführt, und der obige Überstand hierüber geschichtet, worauf Zentrifugation bei 20ºC bei 100.000 g für 18 Stunden mit einem Hitachi Rotator RPS28-A folgte. Nach Entfernen des Überstands wurde das erhaltene Präzipitat in 10 mM Tris-HCL (pH 7,5) gelöst. Anschließend wurden 6 M Ammoniumacetat und Ethanol in einer solchen Weise zugegeben, um schließlich eine Endkonzentration von 4 % (Volumen/Volumen) und 70 % (Volumen/Volumen) zu ergeben. Nachdem man bei-80ºC über Nacht stehengelassen hatte, wurde die Mischung unter Erhalt des Präzipitats zentrifugiert, das dann mit 70 % Ethanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und in sterilisiertem Wasser gelöst wurde. Zu dieser Lösung wurden 10 M Lithiumchlorid in einer Endkonzetration von 2 M zugegeben. Nachdem man die Mischung in Eiswasser 4 Stunden stehengelassen hatte, wurde eine RNA-Fraktion erhalten.
Die RNAs wurden dann auf einer Oligo(dT)Zellulosesäule fraktioniert. Die Säule wurde mit Oligo(dT)Zellulose gepackt und mit 1 x Säulenbindungslösung (20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,5 M NaCl, 0,2 % SDS] äquilibriert. Anschließend wurde das RNA-Präzipitat in einer Säulenelutionslösung (20 mM Tris-HCL (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,2 % SDS) gelöst und 5 Minuten bei 65ºC inkubiert. Ein gleiches Volumen von 2 x Säulenbindungslösung wurde zugegeben, und die Lösung wurde durch die Oligo(dT)Zellulosesäule, die äquilibriert worden war, geleitet. Nachdem die Säule mit 1 x Säulenbindungslösung gewaschen wurde, wurde die Säulenelutionslösung eingeführt, worauf eine RNA-Fraktion eluierte und gewonnen wurde. Zu dieser Fraktion wurden 2 M Natriumacetat in einer Endkonzentration von 0,15 M zugegeben. Nachdem man über Nacht bei -80ºC stehengelassen hatte, wurde die Mischung zentrifugiert. Das so gebildete Präzipitat wurde zweimal mit 70 % Ethanol gewaschen, unter vermindertem Druck getrocknet und in sterilisiertem Wasser gelöst.
Die so erhaltenen polya RNAs wurden als Matrizen zur Herstellung von cDNAs mit einem handelsüblichen cDNA-Synthesizer-Kit "cDNA Synthesis System Plus" (Amersham, Co.) nach den Herstellerempfehlungen verwendet. Die erhaltenen cDNAs wurden in den E. coli-Phagen-Vektor λgt10 eingefügt, und der Vektor wurde dann in den E. coli Stamm wie C600HF1 (erhältlich von Clone Tech, Col) unter Erhalt einer cDNA-Bank inseriert. Bei der Produktion der cDNA-Bank wurde das handelsübliche Kit "cDNA doning system λgt10" (Amersham, Co.) gemäß den Herstellerempfehlungen verwendet.

(2) SCREENEN UNTER VERWENDUNG SYNTHETISCHER DNA-FRAGMENTE

Die in diesem Beispiel verwendeten synthetischen DNA-Fragmente hatten Nukleotidsequenzen, die auf einer teilweisen Aminosäuresequenz der Peroxidase beruhten und mit einem DNA-Synthesizer 371A (Applied Bio-System, Co.) synthetisiert worden waren.

KLONIEREN EINER PARTIELLEN cDNA ALS SCREENING-SONDE

Zunächst erfolgte zur Klonierung eines Teilfragments des Peroxidasegens eine PCR-Reaktion wie folgt. Die komplementären Ketten wurden von den oben gereinigten polya RNAs mit einem cDNA-Synthese-Kit synthetisiert. Die erhaltenen cDNAs wurden mit der PCR-Reaktion unter Verwendung eines Sets der synthetischen DNA-Fragmente
5'-CCCTGCAGGATCCATGTGGCA(AG)TC(GATC)ATGAC-3',
enthaltend eine Linker-Region und eine Nukleotidsequenz korrespondierend zu der Teilaminosäuresequenz Trp-Gln-Ser-Met-Thr, und einem anderen synthetischen DNA-Fragment
5' -GCGAGCTCGGTACCCGGGTTTTTTTTTTTTTTTTT-3',
enthaltend eine Linker-Region und eine polyT-Kette, amplifiziert. Die Reaktionsmischung wurde unter Verwendung des Geneamp TMKits (Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß dem im Kit enthaltenen Vorschriften hergestellt. Ein Zyklus, umfassen die Reaktionen bei 94ºC für 1,5 Minuten, bei 45ºC für 2,5 Minuten und bei 72ºC für 3,4 Minuten, wurde 25mal wiederholt. Dann wurde die amplifizierte cDNA mit KpnI und BamHI gespalten und in Plasmid M13mp18 und M13mp19 kloniert. Die Restriktionsstellen waren diejenigen, welche in den Primer am jeweiligen Ende vorlagen. Als Ergebnis der Sequenzierung dieser Klone wurde ein Klon, der eine Nukleotidsequenz, die der partiellen Aminosäuresequenz der Peroxidase entsprach zusätzlich zu den Primersequenzen enthielt, identifiziert. Auf diese Weise konnte ein Teilfragment des Peroxidasegens erhalten werden.

SCREENING

Ein DNA-Fragment (ca. 0,4 kb), enthaltend die Teilsequenz des Peroxidasegens, wurde als eine Sonde verwendet, und eine cDNA-Bank von ca. 5000 Klonen wurde auf die folgende Weise gescreent. Die λgt10-cDNA-Bank wurde in einer solchen Weise aufplattiert, um ca. 1000 Plaques per Platte zu ergeben, und die Platten wurden bei 37ºC inkubiert. Jede Platte wurde mit einer Nylonmembran (Amersham, Co.) abgedeckt, in die mehrere Punkte mit einer Injektionsnadel Löcher gestanzt wurden, um so die relativen Position der Membran zu der Platte festzuhalten. Anschließend wurde die Membran entfernt und sie wurde mit den Plaques mit ihrer Oberseite auf Filterpapier gelegt, die mit einer Denaturierungslösung imprägniert worden waren. (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH). Nachdem man als solches 7 Minuten stehengelassen hatte, wurde die Membran auf ein Filterpapier, imprägniert mit einer Neutralisierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,001 M EDTA) gelegt und man ließ 5 Minuten stehen. Nach Lufttrocknung wurde die Membran auf einen UV-Trans- Illuminator mit den Plaques auf der Unterseite gelegt und 2 bis 5 Minuten unter Fixierung der DNA bestrahlt.
Die DNA-DNA-Hybridisierung erfolgte nach dem Verfahren von Jeffrey und Flavell (Cell 12: 439-439, 1977). Es wurde der Membranfilter, auf dem die DNA fixiert worden war, in eine Hybridisierungslösung (6 x SSC, 5 x Denhard's Lösung, 0,5 % SDS, 10 µg/ml Lachssperma-DNA) bei 65ºC für 30 Minuten eingetaucht. Dann wurde die Membran auf eine dicke Nylontasche gelegt, und die Sonden-DNA, markiert mit ³²P (10&sup6; bis 10&sup8; cpm/µg) zugegeben. Nach der Reaktion in der Hybridisierungslösung bei 65ºC für 16 bis 20 Stunden und anschließendem Entfernen der Hybridisierungslösung wurde der Membranfilter in Waschpufferlösung [5 x SSC, 0,1 % SDS (Gewicht/Volumen)] bei 65ºC 15 Minuten 4mal gewaschen. Dann wurde der Membranfilter getrocknet und einer Autoradiographie bei -80ºC und einem sensibilisierten Papierblatt unterworfen.
Im Ergebnis wurden 6 positive Klone erhalten. Unter dieses Klonen wurden C1 und C2, die längere Insertionsfragmente enthielten, mit EcoRI gespalten und in M13mp18 subkioniert. Das Verfahren zu Subklonierung wird im folgenden beschrieben. Als die Insertionsfragmente mit einem DNA-Sequenzator Genesis 2000 (du Pont) isoliert wurden, wurden weitere Nukleotidregionen entsprechend den übrigen Teilaminosäuresequenzen gefunden. Auf diese Weise wurde die Region des Gens, die sich zwischen dem Punkt ca. 0,5 kb stromaufwärts der cDNA erhalten durch die PCR-Reaktion und die polyA-Region ausdehnte, erhalten.
Um die Gesamtlänge der cDNA zu erhalten, wurde eine cDNA-Bank von ca. 50.000 Klonen mit der N-terminalen Region (ca. 400 bp) des C2-Klons als Sonde nach dem gleichen Verfahren, wie oben beschrieben, gescreent. Unter den so erhaltenen 20 positiven Klonen wurden die Klone C11 und C13 mit längeren Insertionsfragmenten mit EcoRI verdaut und im M13mp18 subkloniert. Als Ergebnis ihrer Sequenzierung wurde eine Nukleotidsequenz entsprechend der Aminosäuresequenz am N-Terminus gefunden.

(3) SUBKLONIEREN

Phagen-DNA wurde aus jedem positiven Klon, wie oben erhalten, gemäß dem λgt10-Kit beiliegenden Instruktionen hergestellt. Nach Verdau mit EcoRI wurde die Phagen-DNA einer Agarose-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Abschluß der Elektrophorese wurde das geeignete Fragment aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA gesammelt und unter Verwendung von Gene Clean (Bio 101, Co.) gemäß den Herstellerangaben gereinigt. Nach Extraktion mit Phenol/Chloroform und Präzipitation mit Ethanol wurde die DNA mit E. coli-Phagen-Vektor M13mp18 legiert, der mit EcoRI verdaut und mit alkalischer Phosphatase dephosphoryliert worden war, und zur Transformation von E. coli Stamm JM1O9 verwendet.

(4) VERGLEICH DER NUKLEOTIDSEQUENZ MIT DER AMINOSÄURESEQUENZ

In der Peroxidase-cDNA entsprach die kodierende Region einer Aminosäuresequenz bestehend aus 364 Resten und lag im Bereich von Start-Codon ATG bis zum terminalen Codon TGA, wie in Fig. 5 angegeben. Die Aminosäuresequenz in der Amino-terminalen Region der Peroxidase, wie in Beispiel 1 bestimmt, begann mit Gln bei Position 21 in Fig. 5, und der 20. Aminosäurerest nach dem Gln (d. h. bis zu Asn an Position 40) stimmte vollständig mit der aus der cDNA-Sequenz abgeleiteten überein. Es wurden auch die Regionen der cDNA entsprechend den übrigen Teilaminosäuresequenzen gefunden, die oben bestimmt worden waren [Peptid 1: Positionen 125 (Ala) bis 154 (Arg); Peptid 2: Positionen von 162 (Ser) bis 186 (Arg); Peptid 3: Positionen von 240 (Gly) bis 261 (Phe); Peptid 4: Positionen von 275 (Thr) bis 288 (Val); Peptid 5: Positionen von 300 (Met) bis 307 (Arg); und Peptid 6: Positionen von 325 (Ala) bis 336 (ASP).]
Die Ergebnisse wiesen darauf hin, daß die klonierte cDNA das Peroxidasegen war. Die Peptidregion in Bereich von Met, kodiert durch das Start-Codon ATG bis zum 20. Rest, abgeleitet aus der Nukleotidsequenz, wurde in der reifen Form der Peroxidase nicht gefunden und entspricht daher wahrscheinlich einem Signalpeptid.

BEISPIEL 3: EXPRESSION DES PEROXIDASEPROTEINS IN HEFE

Die cDNA mit gesamter Länge wurden aus dem Klon C13, enthaltend die gesamte Länge der cDNA aus Arthormyces-Peroxidase, erhalten in Beispiel 2, ausgeschnitten und in ein Hefe-Expressionsplasmid eingefügt. Auf diese Weise wurde ein Peroxidase-exprimierendes Plasmid in Hefe konstruiert.
(1) Als Hefe-Expressionsplasmid wurde pYE22m konstruiert nach dem folgenden Verfahren eingesetzt. Die ARS-Region (autonome Replikationsstelle im Hefechromosom) wurde aus Yrp7 (siehe Struhl K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1035-1039 (1979); Stinchcomb D.T. et al., Nature, 282, 29-43 (1979); Tschumper G. und Carbon J., Gene, 10, 157-166 (1980) (FERM BP- 33551)] mit BamHI und BglII entfernt. An die EcoRI-Schnittstelle des erhaltenen PlasmidsYRp7-ars wurde ein EcoRI-Framgent, enthaltend eine IR-Region (inverted repeat) von 2 µm DNA B-Form unter Konstruktion von pYE2001 eingefügt. Ein Plasmid, welches das Entfernen der beiden EcoRI-Stellen und der SalI-Schnittstelle aus pYE2001 durch Auffüll-Behandlungen erhalten wurde, wurde als pYE2006 bezeichnet (Fig. 1). In die HindIII-Schnittstelle dieses pYE2006, benachbart zur IR-Region, wurde ein Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenasegen (GAPDH) von 2,1 kb, erhalten aus dem Hefechromosom (siehe Holland JP, Holland MJ, J. Biol. Chem., 245, 9839-9845 (1979); Ashikari T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520 (1989)] unter Bildung von pYE2011 eingefügt.
Eine EcoRI-Schnittstelle wurde stromaufwärts der GAPDH-Strukturgens von pYE2011, benachbart zum Start-Codon durch Orts-spezifische Mutagenes mit einer synthetischen DNA 5'-TAAATAGAATTCATGGTTA-3' eingeführt, wodurch das Plasmid pYE2211 konstruiert wurde [Ashikan T. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520 (1989)). Die GAPDH-Strukturgenregion wurde aus pYE2211 mit EcoRI und SalI deletiert, und die EcoRI-Sali-Multikonierungsstelle von pUC19 wurde anstelle davon eingeführt, wodurch ein Plasmid pYE22m konstruiert wurde (siehe Fig. 2).
Ein Fragment von ca. 1,4 kbp, erhalten durch teilweisen Verdau des C13-Klons mit EcoRI, das die Gesamtlängen cDNA-Fragment von POD enthielt, wurde mit einem Fragment von ca. 8,3 kbp, erhalten durch Verdau von pYE22m mit EcoRI legiert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pYEPOD1 bezeichnet (Fig. 3) POD sollte in diesem Plasmid unter der Kontrolle des Glyceraldehyd-3-Phosphatdehydrogenase-Promoters exprimiert werden. Ein Hefestamm S. cerevisiae G-1315 (Mat α, tripl) [H. Yoshizumi et al., J. Jpn. Soc. Starck Sci., 34, 148 (1987)] transformiert. Andere Stämme können als Wirt verwendet werden, so lange sie Tryptophan-benötigen (trpl). Die Transformation wurde gemäß dem Verfahren, berichtet von Ito et al. (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)], durchgeführt. Auf diese Weise wurde eine Transformante, die die Fähigkeit zur Synthetisierung von Tryptophan beibehält, erhalten. Diese Transformante wurde als G-1315 bezeichnet (pYEPOD1).
Die Transformante G-1315 (pYEPOD1) wurde in 5 ml Burkholder's Medium [P.R. Burkholder, Am. J. Bot., 30, 206 (1943)], enthaltend 1 % Casaminsäuren unter Schütteln bei 30ºC für 48 Stunden inkubiert. 1 ml der Kulturbrühe wurde gesammelt und der Überstand auf ca. 50-fach durch Ultra-Fee C3GC (Milipore Co.) konzentriert. Die Hefezellen wurden nach dem Verfahren von Yaffe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4819 (1984)], unter Erhalt von Proteinen behandelt.
Diese Proteine wurde durch SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese abgetrennt und einem Western-Blotting auf einer Nylonmembran unter Nachweis von solchen unterworfen, die mit Anti-Arthromyces-Peroxidas-Antikörper in dem Enzym-markierten Antikörperverfahren [siehe z. B. Imabori et al., Zoku Seikagaku Jikken Koza: Tanpakushitsu no Kagaku, Tokyo Kagaku Dojin (1987)] regierten. Im Ergebnis wurde eine einzelne Bande bei beinahe der gleichen Position wie beim Arthromyces-Peroxidaseprotein sowohl in der extrazellulären als auch intrazellulären Fraktion gefunden. Da ein Plasmid-freier Wirt GH1315 keine solche Bande zeigt, war bestätigt, daß das Arthromyces-Peroxidaseprotein durch ihre kombinante Hefe produziert wurde (Fig. 4).
(3) Anschließend wurden die Peroxidaseaktivitäten im Überstand und den Zellen bestimmt (unter Verwendung des Rests der Kultur (4 ml)). Die Zellen und der Überstand wurden abgetrennt. Die Enzymaktivität im Überstand wurde als solche gemessen. Die Zellen wurden in 1 ml einer 10 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung suspendiert und mit Ultraschall aufgeschlossen. Nach zentrifugation wurde der Überstand als Rohenzymlösung verwendet.
Die Enzymaktivität wurde nach dem folgenden Verfahren bestimmt. Zu 10 ml einer 0,1 M Kaliumphosphat-Pufferlösung (pH 7,0) wurden 1,3 ml einer 11,5 mM Phenyollösung, 0,25 ml einer 10 mM 4-Aminoantipyrinlösung und 0,2 ml einer 6 mM Wasserstoffperoxidlösung zugegeben. Nach Vorerwärmen der Mischung auf 37ºC wurden 0,25 ml der Probe zugegeben und die Mischung wurde 5 Minuten lang umgesetzt. Nach Abschluß der Reaktion wurden 0,2 ml einer 20%igen Natriumazidlösung zugegeben und die Absorption bei 500 nm gemessen. Der erhaltene Wert wurde als Reaktionswert bezeichnet. Getrennt wurde ein Kontrollwert durch Zugabe von 0,2 ml einer 20%igen Natriumazidlösung vor Zugabe zur Probe bestimmt und dann wurde die Reaktion durchgeführt. Die auf die gleiche Weise gemessene Absorption wurde als Kontrollwert bezeichnet. Der Titer der Peroxidase wurde als Einheit (E), nämlich als Menge des Enzyms, das in der Lage ist, 1 mol von Wasserstoffperoxid innerhalb 1 Minute zu verbrauchen, bezeichnet. Der Titer (E/ml) der Probenperoxidase wurde nach der folgenden Gleichung berechnet.
Titer (E/ml) = 0,396 x Δ A&sub5;&sub0;&sub0; x (Verdünnungsverhältnis der Probe); worin Δ A&sub5;&sub0;&sub0; den Unterschied zwischen dem Reaktionswert und dem Kontrollwert bedeutet.
Als Ergebnis der Messung wurde gefunden, daß das der extrazelluläre Überstand eine Aktivität von 15,6 mu/ml zeigte, wogegen der rohe Zellextrakt eine Aktivität zeigt. Die Proteinkonzentration im extrazellulären Überstand war 0,53 mg/ml und die spezifische Aktivität von POD war 290 E/ml. Beruhend auf diesen Daten wurde geschätzt, daß ca. 0,01 % der extrazellulären Proteine das aktive POD-Protein darstellten.

BEISPIEL 4: EXPRESSION DES PEROXIDASEPROTEINS IN E. COLI

Expression der Peroxidase in E. coli wurde untersucht. Als Expressionsplasmid wurde pKK223-3 (erworben von Pharmacia) verwendet. Das EcoRI- Fragment des Klons C13, hergestellt auf die gleiche Weise wie das oben beschriebene, wurde mit einem Fragment von ca. 4,6 kbp, erhalten durch Verdau von pKK223-3 mit EcoRI, legiert. Das so erhaltene Plasmid wurde als pKPOD1 bezeichnet. Man nimmt an, daß POD von einem tac-Promoter in diesem Plasmid exprimiert werden würde. Der E. coli Stamm WA802 (ATCC 33526) (R&supmin; metB1 lacY1 galK2 galT22 λ supE44 hsdR2) (zur Verfügung gestellt von Dr. B. Bachmann vom Eschelichia coli Genetic Stock Center) wurde mit diesem Plasmid transformiert, und auf diese Weise wurde ein Ampicillin-resistente Transformante erhalten. Diese Transformante wurde als WA802 (PKPOD1) bezeichnet.
Die Transformante WA802 (PKPOD1) wurde in 2 ml LB-Medium (AP 50 µg/ml, IPTG 1 mM) unter Schütteln bei 37ºC 15 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden aus 1 ml der Kultur geerntet und eine zelluläre Proteinfraktion wurde nach dem Verfahren von Yaffe et al. hergestellt. Proteine, die mit Anti-Arthromyces-Peroxidase-Antikörper reagierten, wurden dann nach dem zuvor erwähnten Enzym-markierten Antikörperverfahren nachgewiesen. Im Ergebnis wurde eine einzelne Bande an der gleichen Position wie bei Arthromyces-Peroxidaseprotein beobachtet. Da der Plasmid-freie Wirt WA802 keine solche Bande zeigte, nahm man an, daß das Arthromyces-Peroxidaseprotein in der rekombinanten E. coli produziert werden würde.
Ähnlich wie bei der Hefe wurden die Zellen aus der Restkultur (1 ml) geerntet, und ein roher Zellextrakt wurde hergestellt. Obwohl die Peroxidaseaktivität überprüft wurde, zeigte sie keine Peroxidaseaktivität.
Erfindungsgemäß wurde die cDNA eines Peroxidasegens vom mikrobiellen Ursprung bereitgestellt, und es wurden ihre Nukleotid- und Aminosäuresequenzen aufgeklärt. Eine Hefe und E. coli, die mit einem die zuvor erwähnte cDNA-enthaltendem Plasmid transformiert worden waren, produzieren ein mit der Arthromyces-Peroxidase identisches Protein. In der Tat wurde Enzymaktivität bei der Hefe nachgewiesen. Die Erfindung hat auch die Herstellung von Peroxidase von Arthromyces-Ursprung in einem großen Maßstab unter Verwendung gentechnischer Verfahren ermöglicht und ermöglicht ferner die Modifizierung des Peroxidasemoleküls über gentechnische Verfahren.

Claims

1. Gen, kodierend eine Peroxidase mit einer Aminosäuresequenz dargestellt durch die folgende Formel (I)

worin die Buchstaben in der Formel (I) die folgenden Aminosäuren bedeuten:

A; Alanin, C; Cystein, D; Asparaginsäure,

E; Glutaminsäure, F; Phenylalanin, G; Glycin,

H; Histidin, I; Isoleucin, K; Lysin,

L; Leucin, M; Methionin, N; Asparagin,

P; Prolin, Q; Glutamin, R; Arginin,

S; Serin, T; Threonin, V; Valin, W; Tryptophan, Y; Tyrosin.

2. Peroxidasegen mit einer Nukleotidsequenz dargestellt durch die folgende Formel (II) oder einer Nukleotidsequenz, die biologisch äquivalent dazu ist:

3. Rekombinanter Vektor mit einem Peroxidasegen nach Anspruch 1 oder 2, oder einem Gen, das biologisch äquivalent zu diesem Gen ist.

4. Hefe-Wirtszellen transformiert mit einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 3.

5. Verfahren zur Herstellung einer Peroxidase, das die Kultur von Hefe-Wirtszellen nach Anspruch 4 und die Gewinnung und Reinigung einer Peroxidase-aktiven Substanz aus dem Zellextrakt oder der Kulturbrühe umfaßt.