JPH04228078A - 微生物由来ペルオキシダーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、微生物（Ａｒｔｈｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｒａｍｏｓｕｓ）由来のペルオキシダーゼ
をコード　するｃＤＮＡおよび該遺伝子を含む宿主細胞
を用いてペルオキシダーゼを製造する方法に関するもの
である。

【０００２】

【従来の技術】ペルオキシダーゼは、過酸化水素の存在
下で種々の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診断
用試薬として、グルコース、コレステロール、リン脂質
および尿素の定量に種々のオキシダーゼと共に使用され
ている。又、酵素免疫反応法における標識酵素としても
使用されているが、その供給源としては主に西洋ワサビ
、大根等の植物が用いられている。しかしながら、これ
らの植物由来のペルオキシダーゼには、性質が僅かずつ
異なるアイソザイムが含まれるため、診断用試薬に用い
る純粋な酵素を得るためには、多くの労力とコストが必
要となる。

【０００３】一方、微生物起源のペルオキシダーゼも各
種知られている。しかしながら、例えば、細菌及び糸状
菌の生産するチトクロームｃペルオキシダーゼやＮＡＤ
Ｈペルオキシダーゼなどは通常の西洋ワサビ及び大根の
それぞれに由来するような非特異的なペルオキシダーゼ
ではなく、その特異性の面で臨床診断用試薬に用いるに
は不適である。近年、Ｏ−ジアニシジンを水素供与体と
するペルオキシダーゼが、大腸菌及びミロセシウム属に
属する微生物から生産されたが、Ｏ−ジアニシジンは発
ガン作用を有するため、その臨床診断薬への使用は回避
される傾向にあり、やはり上記診断薬としての使用には
適していない。

【０００４】このような状況下に、本発明者らは従来の
西洋ワサビあるいは大根に由来するペルオキシダーゼと
同様に、臨床診断用試薬及び酵素免疫試験における標識
酵素などとして使用できる微生物起源のペルオキシダー
ゼを自然界からスクリーニングして、アルスロマイセス
（Ａｒｔｈｒｏｍｙｃｅｓ）属の真菌が生産するペルオ
キシダー　ゼが有効であることを見いだしている（特開
昭６１−４３９８７号）。アルスロマイセス属のペルオ
キシダーゼは、臨床診断薬及び酵素免疫試験における標
識酵素として、例えば過酸化物の測定のための化学発光
剤を用いる系での化学発光触媒能が、従来知られていた
ペルオキシダーゼに比べて著しく優れていることも明ら
かにされている（特開昭６３−２１９３９８号）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】アルスロマイセスのペ
ルオキシダーゼは、上記のとおり臨床診断薬および酵素
免疫試験の使用に理想的な酵素であるが、アルスロマイ
セスは真菌であるためその大量培養が困難で、ペルオキ
シダーゼの安価な取得が困難であるという問題がある。 また酵素の分子レベルでの作用機作を明らかにするため
には、酵素蛋白質のアミノ酸配列を知る必要がある。さ
らに、そのアミノ酸配列を知ることにより、ペルオキシ
ダーゼの分子レベルでの改良、即ち蛋白質工学的な手法
による改良が可能となる。以上の問題点を解決するため
には遺伝子工学的手法を利用する必要があるが、当該ア
ルスロマイセス属由来のペルオキシダーゼ遺伝子は取得
されておらず、当該酵素を大量に生産したり、蛋白質工
学的手法による酵素の改良が出来ない状況にあった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
問題点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、アルスロマ
イセスのペルオキシダーゼ遺伝子のｃＤＮＡを取得し、
当該遺伝子の塩基配列及び当該酵素のアミノ酸配列を明
らかにすることに成功し、本発明を完成するに至った。 これにより、アルスロマイセス属由来のペルオキシダー
ゼを例えば、培養の容易な大腸菌や酵母のような適当な
宿主で大量に生産することや、ペルオキシダーゼを遺伝
子工学的手法により改良することなどの手段を講じるこ
とが可能になった。

【０００７】すなわち、本発明は、アルスロマイセス属
由来のペルオキシダーゼ遺伝子またはそれと生物学的に
実質的に同等な遺伝子、当該遺伝子を含有する組み換え
ベクター、当該遺伝子を含有するプラスミドで形質転換
された宿主細胞、および当該細胞を培養して得られるペ
ルオキシダーゼの製造法を提供するものである。

【０００８】本発明のペルオキシダーゼ遺伝子を取得す
るには、アルスロマイセス属糸状菌を用いることができ
る。例えば、アルスロマイセス・ラモサス（Ａｒｔｈｒ
ｏｍｙｃｅｓ　ｒａｍｏｓｕｓ）（ＳＡＭ０００３と命
名され工業技術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第
８３８号；ＦＥＲＭ　ＢＰ−８３８として寄託されてい
る）を用いることが出来る。その他、　アルスロマイセ
ス属糸状菌のペルオキシダーゼと生物学的に同等の活性
を有するペルオキシダーゼを生産する微生物も存在する
可能性もあり、そのような微生物を出発材料に用いるこ
ともできる。

【０００９】なお、本明細書中において、「生物学的に
同等の」という用語を用いる場合は、本発明の遺伝子が
コードするペルオキシダーゼの性質に関して、特開昭６
１−４３９８７号に記載された製造方法で得られた酵素
と実質的に同じであり、さらに特開昭６３−２１９３９
８号に記載された優れた性質も具備する酵素を全て包含
することを意味する。

【００１０】上記出発微生物からのｍＲＮＡの単離、ｃ
ＤＮＡライブラリーの作製、スクリーニングは公知の方
法によって行うことが出来る。そのような方法は、例え
ばＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ　第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ，１９８９）　に記載されている。例示のために説明
すれば、本発明のペルオキシダーゼをコードする遺伝子
は、次のようにして得ることが出来る。

【００１１】アルスロマイセスの細胞よりｐｏｌｙＡ　
ＲＮＡを抽出する。これを鋳型としてｃＤＮＡを合成し
、クローニング用ファージベクター、例えばλｇｔ１０
に組み込み大腸菌等の宿主を形質転換する。得られたｃ
ＤＮＡライブラリーをペルオキシダーゼの部分アミノ酸
配列に対応する合成ＤＮＡプローブを用いてスクリーニ
ングすることにより、目的のペルオキシダーゼをコード
するＤＮＡ断片を含む陽性クローンを得ることが出来る
。そのようなＤＮＡプローブは、アルスロマイセス属の
培養物から目的のペルオキシダーゼ蛋白質を後述のよう
にして精製し、そのアミノ酸配列の少なくとも一部分を
明らかにし、その配列から推定して合成することが出来
る。また、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ；Ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）の手法を用
いることによりさらに長いプローブ断片を調製すること
も出来る。

【００１２】陽性クローン中に全長ｃＤＮＡが得られな
い場合は、さらに長いｃＤＮＡを得るために、上記陽性
クローンからファージＤＮＡを調製し、制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片をプローブとして同
じライブラリーをスクリーニングすると陽性クローンが
いくつか得られる。これらのクローンのファージＤＮＡ
を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して得られるＤＮＡ断片を
、適当なベクター、例えばＭ１３ｍｐ１８あるいはＭ１
３ｍｐ１９にサブクローンして、その挿入ＤＮＡ断片の
塩基配列をダイデオキシシークエンス法等によって決定
することが出来る。

【００１３】一方、精製したペルオキシダーゼ蛋白質を
分析し、アミノ酸組成、アミノ末端、カルボキシル末端
のアミノ酸配列を決定し、これと上記の方法で明らかに
したＤＮＡ塩基配列から推定されるアミノ酸配列とを比
較することにより、目的の全長ｃＤＮＡの配列を明らか
にすることが出来る。

【００１４】得られたｃＤＮＡを発現させるための宿主
細胞としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ
）などの細菌および酵母、糸状菌等を用　いることが出
来る。

【００１５】得られたペルオキシダーゼ遺伝子および好
ましくは該遺伝子のシグナル配列を、適当なプロモータ
ーおよびターミネーターと共に含有するプラスミドで宿
主細胞を形質転換してペルオキシダーゼを製造すること
ができる。例えば、新免ら（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５０，　２４７−２４９，１９８６）により
記載された方法に従って、適当な炭素源、窒素源及び微
量の金属元素を含む培地中で、当該形質転換細胞を培養
する。得られた培養物を回収し、細胞抽出液または好ま
しくは培養上清から目的の酵素を、沈澱法、吸着法、分
子篩、電気泳動等の公知の方法を組み合わせて精製する
。例えば、硫安沈澱（約７５％飽和）処理し、種々のカ
ラムクロマトグラフィー（例えば、ＤＥＡＥ−セルロー
スカラムクロマトグラフィー及びウルトロゲルＡｃＡ４
４カラムクロマトグラフィーなど）を用いて精製するこ
とにより、所望のペルオキシダーゼが得られる。得られ
た、ペルオキシダーゼは、特開昭６１−４３９８７号に
記載されているペルオキシダーゼと同様に優れた性質を
有していることが期待される。

【００１６】

【実施例】以下に本発明を実施例に基づいて詳細に説明
する。実験の手順は、特に記載しない限り、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　第２
版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，１９８９
）　によった。

【００１７】実施例１　　ペルオキシダーゼ蛋白質のア
ミノ酸構成の分析 ペルオキシダーゼ蛋白質のアミノ酸構成の分析は、市販
のアルスロマイセス由来ペルオキシダーゼ（サントリー
から販売）を用いて行った。はじめに、アミノ酸構成を
常法により分析した。分析方法の詳細は、高橋、池中ら
の生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＩ（東京化学同人
）、綱沢、崎山らの続生化学実験講座２、蛋白質の化学
（上）に示されている。すなわち、まずペルオキシダー
ゼ蛋白質　５ｎ　ｍｏｌｅ　を６Ｎ塩酸と共に、封管し
、１１０　℃、２４時間加水分解を行った。得られた反
応液中の遊離ＰＴＨ−アミノ酸をアミノ酸分析機（アミ
ノ酸自動分析機８３５型　；日立社製）により定量し、
アミノ酸組成を決定した（第１表）。

【００１８】 ＊　　　ＡｓｘはＡｓｎとＡｓｐの合計を示す。

【００１９】＊＊　　Ｇｌｘは、ＧｌｎとＧｌｕの合計
を示す。

【００２０】＊＊＊　（　　）内の数字は、ＤＮＡ塩基
配列から計算したアミノ酸数を示す。

【００２１】次に、ペルオキシダーゼ蛋白質のアミノ末
端からのアミノ酸配列を調べるため、ペルオキシダーゼ
蛋白質を還元カルボキシメチル化したのち逆相ＨＰＬＣ
による精製を行った。すなわち、ペルオキシダーゼ１０
０　ｍｇ　（２．５　μｍｏｌｅ）を３．０ｍｌの変性
バッファー　（６Ｍ　Ｇｄｎ・ＨＣｌ，　１０　ｍＭ　
ＥＤＴＡ・２Ｎａを含むＴｒｉｓ・ＨＣｌｐＨ８．５）
に溶解し、５０℃で１時間インキュベートした。１４３
　μｍｏｌｅ　（１０　μｌ）の２−メルカプトエタノ
ールを加え、反応系を窒素置換したのち、３７℃で１時
間インキュベートした。次いで、１Ｍヨード酢酸ナトリ
ウム（変性バッファーに溶解、０．２０７　ｇ／ｍｌ）
　１５０　μｌを加え、ＮａＯＨ溶液にてｐＨを８．０
〜８．５に調整した。反応系を窒素置換し、遮光して３
７℃で１時間インキュベートした。この間反応系のｐＨ
を８．０〜８．５に維持した。反応後、反応液をＨ２Ｏ
に対して充分透析した。透析内液を以下の条件の逆相Ｈ
ＰＬＣにかけ、蛋白質画分を分取し、濃縮後凍結乾燥し
た（逆相ＨＰＬＣ条件、カラム：　Ｚｏｒｂａｘ　Ｐｒ
ｏ１０　ＰＲＯＴＥＩＮ　　ＰＬＵＳ　　２０φ；流速
：４．０　ｍｌ／ｍｉｎ；移動相：Ａ＝０．０５　％　
ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，　Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ：　Ａ：Ｂ＝
８：２　（ｖ／ｖ）、検出：　Ａ２８０）。蛋白質の回
収率は１６％であった。なお、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより
、分子量約４０Ｋと３０Ｋの２つの蛋白分子種のみを蛋
白質画分に確認した。

【００２２】上記のようにして調製した５　ｎｍｏｌの
還元カルボキシメチル化ペルオキシダーゼ蛋白質のＮ末
端のアミノ酸配列を気相プロテインシークエンサー（島
津製作所製）により分析したところ、遊離ＰＴＨ−アミ
ノ酸を検出することができず、Ｎ−末端アミノ酸が保護
されていることが明らかになった。そこで還元カルボキ
シメチル化ペルオキシダーゼ蛋白質のＮ−末端の脱保護
を以下のように行った。

【００２３】還元カルボキシメチル化ペルオキシダーゼ
溶液（ｉｎ　Ｈ２Ｏ，　１００　ｎｍｏｌ／ｍｌ）を窒
素ガス気流をふきつけることにより１００　ｎｍｏｌ／
０．５　ｍｌにまで濃縮し、ここに反応用緩衝液（０．
２５　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．０５　Ｍ　　Ｅ
ＤＴＡ，　　５　ｍＭ２−メルカプトエタノール）３０
μｌを添加し、ＮａＯＨ溶液でｐＨを７に調製した。こ
こに８５Ｕ（Ｓｉｇｍａ社のＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙ
ｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ起源）のピログルタミル
ペプチダーゼ（Ｓｉｇｍａ社の原液で５μ）を加え、３
７℃で１８　ｈｒ反応させた。反応液６０μｌ（ペルオ
キシダーゼ１２　ｎｍｏｌ）を２回に分けてシークエン
サーにアプライし、アミノ酸配列を決定した。

【００２４】その結果、Ｎ末端の保護基はピログルタミ
ル基であることが判明し、２０残基分のＮ末端領域のア
ミノ酸配列を、（Ｇｌｎ）−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｔ
ｈｒ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｓｅ
ｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｎと決定した（配列表中、２
１残基目のＧｌｎから４０残基目のＡｓｎの部分）。た
だし、（Ｇｌｎ）はピログルタミル酸であることを表す
。

【００２５】次に、ペルオキシダーゼ蛋白質の部分アミ
ノ酸配列の決定を以下のようにして行った。

【００２６】還元カルボキシメチル化ペルオキシダーゼ
４８　ｎｍｏｌｅ　（１．９　ｍｇ）を１００μｌの０
．１　ＭＮＨ４ＨＣＯ３　ｐＨ　７．９に懸濁した。こ
こにＴＰＣＫ−Ｔｒｙｐｓｉｎ　（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔ
ｏｎ）の１％溶液（ｉｎ　０．００２４　Ｎ　ＨＣｌ）
２μｌを添加し、３５℃で６時間インキュベートした。 液体中の白濁物は酵素添加後ただちに消え、溶液は透明
になった。反応後、反応液を凍結乾燥することにより反
応を停止した。凍結乾燥後、残渣を７０　％蟻酸に溶解
しＨＰＬＣに供した。

【００２７】得られたトリプシン消化物を逆相ＨＰＬＣ
にかけ、ペプチドフラグメントを分離した（逆相ＨＰＬ
Ｃ条件、カラム：Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｗｉｄｅｐｏｒ
ｅ　Ｃ４　（３５０オングストローム）　６φ　×　２
５０；流速：１．０　ｍｌ／ｍｉｎ　；圧力：８０　Ｋ
ｇ／ｃｍ２；温度：Ａｍｂｉｅｎｔ；移動相：Ａ＝０．
０５　％　ＴＦＡ　ｉｎ　Ｈ２Ｏ，Ｂ＝ＣＨ３ＣＮ：Ａ
＝８：２　（ｖ／ｖ）；検出：Ａ２２０）。得られた各
ピークを、逆相ＨＰＬＣによりさらに精製した。精製ペ
プチドのアミノ酸配列を決定した。それらの中で、つぎ
の６つのペプチドの配列を気相プロテインシークエンサ
（島津製作所製）により、以下のように決定した（各ペ
プチドは、配列表中それぞれ次のように対応する。ペプ
チド１：１２５残基目のＡｌａから１５４残基目のＡｒ
ｇまで；　　ペプチド２：１６２残基目のＳｅｒから１
８６残基目のＡｒｇまで；　　ペプチド３：２４０残基
目のＧｌｙから２６１残基目のＰｈｅまで；　　ペプチ
ド４：２７５残基目のＴｈｒから２８８残基目のＶａｌ
まで；　　ペプチド５：３００残基目のＭｅｔから３０
７残基目のＡｒｇまで；　　ペプチド６：３２５残基目
のＡｌａから３３６残基目のＡｓｐまで）。

【００２８】 　　　　ペプチド１：　　　　　　　　　　Ａｌａ−Ｖ
ａｌ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｖａ
ｌ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌ
ｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ
−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　　　　ペプチド２
：　　　　　　　　　　Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ
−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ
−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｌａ−Ｉｌｅ
−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ　　　　ペプチド３：　　　
　　　　　　　Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｈ
ｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｕ−Ｐｈｅ　　　　
ペプチド４：　　　　　　　　　　Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｃ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈ
ｒ−Ｓｅｒ−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　　　
　ペプチド５：　　　　　　　　　　Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−
Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ａｒｇ　　
　　ペプチド６：　　　　　　　　　　Ａｌａ−Ａｌａ
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　Ｖａｌ−Ａｓｐ実施例２　　アルス
ロマイセス　　ペルオキシダーゼのｃＤＮＡクローニン
グ （１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 アルスロマイセスの菌体破砕は、液体窒素中、乳鉢で磨
砕して行った。この磨砕物から、グアニジンチオシアネ
ート／塩化セシウムを用いる方法によりＲＮＡを精製し
、さらにオリゴ（ｄＴ）セルロースを用いてｐｏｌｙＡ
・ＲＮＡを分離した。グアニジンチオシアネート／塩化
セシウムを用いる方法およびオリゴ（ｄＴ）セルロース
によるｐｏｌｙＡ・ＲＮＡの精製は、例えば　Ｒ．Ｍｃ
Ｇｏｏｋｉｎ，　Ｒｏｂｅｒｔ　Ｊ．Ｓｌａｔｅｒらの
、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ　ｖｏｌ　２，　（Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ
　Ｉｎｃ．　１９８４）に示されている。

【００２９】すなわち、先ず上記磨砕物に４倍容の５Ｍ
グアニジンチオシアネート、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１０　ｍＭ　ＥＤＴＡ及び５％β
−メルカプトエタノールを加えてさらに磨砕した。この
磨砕液にＮ−ラウロイルサルコシン及び塩化セシウムを
それぞれ終濃度４％（ｗ／ｖ）及び０．１５ｇ／ｍｌと
なるように加え溶解後、１０、０００ｇ×２０分間の遠
心分離操作により上清を得た。遠心管に５．７　Ｍ　塩
化セシウム、０．　１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を加
え、この上清液を重層し、２０℃で１００，０００ｇ×
１８時間、遠心　分離した（日立ＲＰＳ２８−Ａ　ロー
ターを使用）。上清を除いて得た沈澱を１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に溶解し、６　Ｍ　酢酸ア
ンモニウムを終濃度　４％（ｖ／ｖ）及びエタノール　
を終濃度７０％（ｖ／ｖ）　になるように加え、−８０
　℃に一晩静置した後、遠心分離により沈澱を回収した
。沈澱は７０％エタノールで洗浄後、減圧乾燥し、滅菌
水に溶解した。この溶液に１０　Ｍ塩化リチウムを加え
、終濃度２Ｍとした後、氷水中に４時間静置してＲＮＡ
を得た。

【００３０】こうして得たＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セル
ロースカラムで分画した。オリゴ（ｄＴ）セルロースを
充填したカラムを１×カラム結合液〔２０　ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，０
．５　Ｍ　ＮａＣｌ，０．２％　ＳＤＳ〕で平衡化した
。次にＲＮＡ沈澱をカラム溶出液〔２０　ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，０．
２％　ＳＤＳ〕に溶解し、６５℃、５分間インキュベー
トした後、２×カラム結合液を等量加え、先に平衡化し
たオリゴ（ｄＴ）カラムに通した。カラムを１×カラム
結合液で洗浄した後、カラム溶出液をカラムに加え、溶
出されてくるＲＮＡを回収した。この画分に終濃度　０
．１５　Ｍと　なるように２　Ｍ　酢酸ナトリウムを加
え、−８０℃で一晩放置した後、遠心分離により沈澱を
得た。沈澱は７０％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥
後、滅菌水に溶解した。

【００３１】こうして得られたｐｏｌｙＡ・ＲＮＡを鋳
型として、市販のｃＤＮＡ合成キット、ｃＤＮＡ合成シ
ステム・プラス（アマシャム社製）を用いてキットに記
載された方法でｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡ
を大腸菌ファージベクターλｇｔ１０に組み込み、大腸
菌、例えばクローンテック社から購入可能なＣ６００Ｈ
ｆｌを形質転　換してｃＤＮＡライブラリーを得た。λ
ｇｔ１０を用いたｃＤＮＡライブラリーの作製は、市販
のｃＤＮＡクローニングシステム−λｇｔ１０（アマシ
ャム社製）を用いてキットに記載された方法通りに行っ
た。

【００３２】（２）合成ＤＮＡを用いたスクリーニング
アミノ酸の部分配列から考えられる塩基配列を持つＤＮ
ＡをＤＮＡシンセサイザー３７１Ａ（アプライドバイオ
システム社）を用いて合成した。

【００３３】はじめにＰＣＲ法によりペルオキシダーゼ
遺伝子の部分的なクローン化を行った。つまり、精製し
たｐｏｌｙＡ・ＲＮＡからｃＤＮＡ合成キットを用いて
相補鎖を合成し、さらにそのｃＤＮＡをリンカー部分と
部分アミノ酸配列Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔ
ｈｒに対応する塩基配列からなる合成ＤＮＡ　５’−Ｃ
ＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＣＡ（ＡＧ）Ｔ
Ｃ（ＧＡＴＣ）ＡＴＧＡＣ−３’　とリンカー部分とポ
リＴからなる合成ＤＮＡ　５’−ＧＣＧＡＧＣＴＣＧＧ
ＴＡＣＣＣＧＧＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
−３’を用いてＰＣＲ法によりＤＮＡを増幅した。すな
わち、ＧｅｎｅＡｍｐ　ＴＭＫｉｔ（宝酒造）を用いキ
ットに記載された方法で反応液を調製した。反応は、９
４℃　１．５分，４５℃　２．５分，７２℃　３．４分
を２５サイクル行った。その後増幅した遺伝子を制限酵
素ＫｐｎＩと　ＢａｍＨＩで切断し、　Ｍ１３ｍｐ１８
と　Ｍ１３ｍｐ１９にクローニングした。なお両端のプ
ライマーの中にＫｐｎＩと　ＢａｍＨＩのサイトが存在
する。そのクローンをシークエンスしたところ、プライ
マーの塩基配列の他に、ペルオキシダーゼの部分アミノ
酸配列に相当する塩基配列が見つかった。従って、ペル
オキシダーゼ遺伝子の一部分が取得できた。この約０．
４ｋｂのペルオキシダーゼ遺伝子　の部分配列を含むＤ
ＮＡ断片をプローブとして約５０００クローンのｃＤＮ
Ａライブラリー　から次のようにスクリーニングを行っ
た。λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーを一枚のプレート
当り約１，０００個のプラークが出るようにまいて３７
℃で培養した。プレートに　ナイロンメンブレン（アマ
シャム社製）をおいて注射針で数カ所穴を開けプレート
とメンブレンの相互の位置を決めておく。その後メンブ
レンをはがし、プラーク側を上にして変性溶液（１．５
Ｍ　　ＮａＣｌ，０．５Ｍ　　ＮａＯＨ）に浸した濾紙
上において、７分間放置した。 次に、中和溶液（１．５Ｍ　ＮａＣｌ，０．５Ｍ　　Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ７．２，０．００１Ｍ　　　ＥＤ
ＴＡ）を含む濾紙上におき５分間放置した。風乾後、プ
ラーク側を下にしてＵＶトランスイルミネーター上に置
き２−５分間照射してＤＮＡを固定した。ＤＮＡ−ＤＮ
Ａ　ハイブリダイゼーションは、　Ｊｅｆｆｒｅｙと　
Ｆｌａｖｅｌｌ（Ｃｅｌｌ　１２：　４３９−４３９１
９７７）の方法に従い行った。即ち、ＤＮＡを固定した
メンブランフィルターを６５℃のハイブリダイゼーショ
ン溶液（６　×ＳＳＣ　、５　×デンハルト溶液、０．
５　％　ＳＤＳ、１０　μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）に
３０分間浸した。メンブランを厚手のナイロン袋に移し
、３２Ｐ　で標識した１０６　〜１０８ｃｐｍ／μｇ　
のプローブ　ＤＮＡを加えてハイブリダイゼーション溶
液中で６５℃、１６〜２０時間反応させた。ハイブリダ
イゼーション溶液を取り除いた後、メンブランフィルタ
ーを洗浄用緩衝液〔５　×ＳＳＣ　、０．１　％ＳＤＳ
（Ｗ／Ｖ）〕中６５℃で１５分間の洗浄を４回行なった
。このメンブランフィルターを乾燥した後、Ｘ線フィル
ムと増感紙を用いて　−８０℃でオートラジオグラフィ
ーを行なった。

【００３４】その結果、６個の陽性クローンが取得でき
、その中でも挿入断片の長いＣ１とＣ２　クローンにつ
いてＥｃｏＲＩで切断して、Ｍ１３ｍｐ１８　にサブク
ローニングした。サブクローンの方法は、後に示す。こ
れをＤＮＡシークエンサー　　ジェネシス２０００（デ
ュポン社製）を用いてシークエンスしたところ、さらに
既知のアミノ酸配列に相当する塩基配列が見つかり、Ｐ
ＣＲで取得した遺伝子の約　０．５ｋｂ上流からポリＡ
までを含む遺伝子を取得した。

【００３５】次に全長のｃＤＮＡを取得するためにＣ２
クローンのＮ末端側約　４００ｂｐをプローブと　して
約５０，０００個のｃＤＮＡライブラリーから上記と同
様の方法でスクリーニングを行った。得られた２０個の
ポジティブクローンのうち挿入断片の長いＣ１１　およ
び　Ｃ１３クローンをＥｃｏＲＩ　で切断しＭ１３ｍｐ
１９　にサブクローニングした。これをシークエンスし
たところＮ末端のアミノ酸配列に相当する塩基配列が見
つかった。

【００３６】（３）サブクローニング 得られた陽性クローンのそれぞれからλｇｔ１０キット
に示された方法によりファージＤＮＡを調製し、Ｅｃｏ
ＲＩで消化後、アガロースゲル電気泳動を行った。泳動
　後ゲルから目的の断片を切り出し、ジンクリーン（バ
イオ１０１社）を用い記載さ　れた操作方法に従ってＤ
ＮＡの回収、精製を行った。さらに、フェノール／クロ
ロ　ホルム抽出後、エタノール沈澱を行い、大腸菌ファ
ージベクター　Ｍ１３ｍｐ１８をＥｃｏＲＩで切断後ア
ルカリホスファターゼで脱リン酸させたものと結合し、
大腸菌ＪＭ１０　９株を形質転換した。

【００３７】（４）　　塩基配列とアミノ酸配列の比較
ペルオキシダーゼｃＤＮＡの塩基配列中、ペルオキシダ
ーゼをコードしている領域は配列表において開始コドン
ＡＴＧから始まり、終止コドンＴＧＡで終了する３６４
残基のアミノ酸配列からなる。実施例１で明らかにした
ペルオキシダーゼのアミノ末端からのアミノ酸配列は、
配列表中２１番目のＧｌｎから始まっており、これ以降
２０残基目のＡｓｎまでの合計２０残基のアミノ酸配列
はＤＮＡの配列から推定したアミノ酸配列と完全に一致
した。また、そのほかの決定した部分アミノ酸配列（ペ
プチド１：１２５残基目のＡｌａから１５４残基目のＡ
ｒｇまで；ペプチド２：１６２残基目のＳｅｒから１８
６残基目のＡｒｇまで；　　ペプチド３：２４０残基目
のＧｌｙから２６１残基目のＰｈｅまで；　　ペプチド
４：２７５残基目のＴｈｒから２８８残基目のＶａｌま
で；　　ペプチド５：３００残基目のＭｅｔから３０７
残基目のＡｒｇまで；ペプチド６：３２５残基目のＡｌ
ａから３３６残基目のＡｓｐまで）に対応する塩基配列
もみとめられた。

【００３８】以上の結果から、クローン化されたｃＤＮ
Ａは、ペルオキシダーゼ遺伝子であると決定した。塩基
配列から明かとなった開始コドンＡＴＧでコードされる
Ｍｅｔ　から２０残基目までのペプチド部分は成熟型ペ
ルオキシダーゼには存在しない配列であり、この部分が
シグナルペプチドに相当すると考えられる。

【００３９】実施例３　　ペルオキシダーゼタンパク質
の酵母での発現 実施例２で取得したアルスロマイセスのペルオキシダー
ゼの全長のｃＤＮＡを含む　ｃ１３クローンから、全長
のｃＤＮＡを切り出し、酵母の発現プラスミドに挿入し
、酵母でのペルオキシダーゼ発現プラスミドを構築した
。酵母の発現プラスミドとしてはｐＹＥ２２ｍを用いた
。ｐＹＥ２２ｍの構築は以下のような手順で行った。Ｙ
Ｒｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６，　１０
３５−１０３９（１９７９）；　Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ
，Ｄ．Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ　２８２，　
３９−４３（１９７９）；　Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ，Ｇ．
およびＣａｒｂｏｎ，Ｊ．，　Ｇｅｎｅ　１０，　１５
７−１６６（１９８０）（ＦＥＲＭ　ＢＰ−３３５５）
）からＢａｍＨＩ　とＢｇｌＩＩ　でＡＲＳ　領域（酵
母染色体複製開始点）を取り除いたプラスミドＹＲｐ７
−ａｒｓのＥｃｏＲＩ　サイトに２μｍ　ＤＮＡ　　Ｂ
−フォームよりＩＲ領域（逆位の繰り返し配列）１つを
含むＥｃｏＲＩ　断片を挿入してｐＹＥ２００１　を構
築した。このｐＹＥ２００１　の２つのＥｃｏＲＩ　サ
イトとＳａｌＩサイトをフィルインして欠失させたプラ
スミドをｐＹＥ２００６　とした（　第１図）　。ｐＹ
Ｅ２００６　のＩＲ領域の横にあるＨｉｎｄＩＩＩ　サ
イトに酵母染色体より取得した２．１　ｋｂｐ　のグリ
セルアルデヒド３リン酸デヒドロゲローゼ遺伝子（ＧＡ
ＰＤＨ）　（Ｈｏｌｌａｎｄ　ＪＰ，　Ｈｏｌｌａｎｄ
　ＭＪ，　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，　２４５，　９
８３９−９８４５（１９７９）；　Ａｓｈｉｋａｒｉ，
Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０，　５１５−５２０（１９
８９）　を挿入してｐＹＥ２０１１　を構築した。

【００４０】合成ＤＮＡ　５’−ＴＡＡＡＴＡＧＡＡＴ
ＴＣＡＴＧＧＴＴＡ−３’を用いた部位特異的変異法に
より、ｐＹＥ２０１１　のＧＡＰＤＨ　遺伝子の開始コ
ドンに接して上流にＥｃｏＲＩ　サイトを導入してプラ
スミドｐＹＥ２２１１　を構築した。ｐＹＥ２２１１（
Ａｓｈｉｋａｒｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，　Ａｐｐｌ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，　３０，
　５１５−５２０（１９８９））　からＥｃｏＲＩ　と
ＳａｌＩでＧＡＰＤＨ　構造遺伝子部分を取り除き、代
わりにｐＵＣ１９　のマルチクローニングサイトのＥｃ
ｏＲＩ　からＳａｌＩの部分を挿入してプラスミドｐＹ
Ｅ２２ｍを構築した（第２図）。

【００４１】ｃ１３　クローンをＥｃｏＲＩ　で部分分
解して得られた約１．４ｋｂｐの断片（この断片がＰＯ
Ｄの全長のｃＤＮＡ断片である）を、ｐＹＥ２２ｍをＥ
ｃｏＲＩ　で消化して得られる約８．３ｋｂｐの断片と
ライゲーションし、得られたプラスミドをｐＹＥＰＯＤ
１　とした（第３図）。このプラスミドにおいてＰＯＤ
はグリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモ
ーターによって発現されるはずである。このプラスミド
で酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ｇ−１３１５　株
（Ｍａｔα，ｔｒｐ１）　（Ｈ．Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ　
ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．Ｊｐｎ．Ｓｏｃ．Ｓｔａｒｃｈ　
Ｓｃｉ．，　３４，　１４８（１９８７））　を形質転
換した。宿主としてはトリプトファン要求性株（ｔｒｐ
１）であれば他のものでも用いることができる。形質転
換の方法は、伊藤らの方法（Ｉｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，　
Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１５３，　１６３（１９
８３））によった。こうしてトリプトファンの合成能の
回復した形質転換株を得た。以下、この形質転換株をＧ
−１３１５（ｐＹＥＰ０Ｄ１）　とする。

【００４２】得られた形質転換体Ｇ−１３１５（ｐＹＥ
Ｐ０Ｄ１）　を１％カザミノ酸を加えたバークホルダー
培地（Ｐ．　Ｒ．　Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ，　Ａｍ．　
Ｊ．　Ｂｏｔ．，　３０，　２０６（１９４３））　５
ｍｌにて、３０℃で４８時間振とう培養した。このうち
、１　ｍｌを集菌して上清は、ウルトラフリーＣ３ＧＣ
（ミリポア社）を用いて、約５０倍に濃縮した。菌体は
ヤッフェらの方法（Ｍ．Ｐ．　Ｙａｆｆｅ　ｅｔａｌ．
，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ
．，　８１，　４８１９（１９８４））　で酵母菌体か
ら蛋白質を得た。これらをＳＤＳポリアクリルアミド電
気泳動を行い、ナイロンメンブレンにウェスターンブロ
ッティングして、抗アルスロマイセスペルオキシダーゼ
抗体を用いて酵素抗体法（例えば、今堀ら、続生化学実
験講座蛋白質の化学、東京化学同人（１９８７））にて
その抗体と反応するものを検出したところ、菌体外画分
、菌体内画分共にアルスロマイセスペルオキシダーゼ蛋
白とほぼ同じ位置に一本のバンドが見られた。またプラ
スミドを持たない宿主ＧＨ１３１５には同じバンドは見
られなかったことから、アルスロマイセスペルオキシダ
ーゼ蛋白が組み換え酵母で生産されていると考えられる
（第４図）。

【００４３】次に、残りの培養液４ｍｌについて、上清
と菌体中のペルオキシダーゼ活性を測った。即ち、この
培養液を集菌して上清はそのまま原液でペルオキシダー
ゼ活性を測った。菌体は１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
１ｍｌに懸濁後、超音波で破砕し、遠心分離して上清を
粗酵素液とした。活性測定は以下の方法で行った。０．
１　Ｍ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）　１ｍｌ
　に、１１．５ｍＭフェノール溶液１．３　ｍｌ、１０
　ｍＭ　４−アミノアンチピリン溶液０．２５ｍｌ及び
６　ｍＭ過酸化水素溶液０．２ｍｌ　を加え、３７℃に
予熱後これにサンプル０．２５ｍｌを加えて５　分間反
応させる。反応後２０％アジ化ナトリウム溶液０．２　
ｍｌを加え、５００　ｎｍの吸光度を測定して反応値と
する。別にコントロールとしてサンプルを加える前に　
２０％アジ化ナトリウム溶液０．２　ｍｌを加えてから
反応を行い、同様の操作によって吸光度を測定しコント
ロール値とする。ペルオキシダーゼの力価の単位（Ｕ：
　ユニット）　は１分間に１μモルの過酸化水素を消費
する酵素量として表され、サンプルのペルオキシダーゼ
力価（Ｕ／ｍｌ）　は、０．３９６　×ΔＡ５００　×
（サンプルの希釈率）で求められる。なお上式において
ΔＡ５００　は反応値からコントロール値を引いた値を
示す。測定の結果、菌体外上清には１５．６ｍｕ／ｍｌ
　の活性が認められ、菌体破砕後の上清には活性はなか
った。菌体外上清の蛋白質濃度は０．５３ｍｇ／ｍｌ　
でＰＯＤの比活性２９０ｕ／ｍｌ　から計算すると、菌
体外蛋白質の約０．０１％　が活性型のＰＯＤ　蛋白質
として存在することになる。

【００４４】次に、大腸菌での発現も試みた。発現プラ
スミドとしてはｐＫＫ２２３−３（ファルマシア社より
購入）を用いた。上記と同様に調製したｃ１３　クロー
ンのＥｃｏＲＩ　断片を、ｐｋｋ２２３−３をＥｃｏＲ
Ｉ　で消化して得られた約４．６　ｋｂｐ　の断片とラ
イゲーションし、得られたプラスミドをｐＫＰＯＤ１と
した。このプラスミドにおいて　ＰＯＤは　ｔａｃプロ
モーターによって発現されるはずである。このプラスミ
ドで大腸菌ＷＡ８０２（ＡＴＣＣ３３５２６）（Ｆ−　
ｍｅｔＢ１　ｌａｃＹ１　ｇａｌＫ２　ｇａｌＴ２２　
λ−　ｓｕｐＥ４４ｈｓｄＲ２）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ　Ｃｏｌｉ　Ｇｅｎｅｔ　ｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅ
ｎｔｅｒ　のＢ．Ｂａｃｈｍａｎｎ博士から供与）　を
形質転換し、アンピシリン耐性を獲得した形質転換株を
得た。以下、この形質転換株をＷＡ８０２（ｐＫＰＯＤ
１）　とする。

【００４５】得られた形質転換株ＷＡ８０２（ｐＫＰＯ
Ｄ１）　を２ｍｌのＬＢ培地（ＡＰ　５０　μｇ／ｍｌ
，　ＩＰＴＧ　１ｍＭ）　にて、３７℃で１５時間振と
う培養した。このうち１ｍｌを集菌してヤッフェらの方
法で菌体蛋白質を調製した。これを前記と同じく酵素抗
体法にて抗アルスロマイセスペルオキシダーゼ抗体と反
応するものを検出したところ、アルスロマイセスペルオ
キシダーゼ蛋白と同じ位置に一本のバンドが見られ、ま
たプラスミドを持たない宿主ＷＡ８０２　には同じバン
ドは見られなかったことから、アルスロマイセスペルオ
キシダーゼ蛋白が組み換え大腸菌で生産されたと考えら
れる。

【００４６】残りの１ｍｌ　の培養液は集菌後酵母の場
合と同様に粗酵素液を調製し活性を測定したが、ペルオ
キシダーゼ活性は認められなかった。

【００４７】

【発明の効果】本発明により微生物由来のペルオキシダ
ーゼ遺伝子のｃＤＮＡが取得され、その塩基配列及びア
ミノ酸配列が明らかにされた。このｃＤＮＡを含むプラ
スミドで形質転換された酵母および大腸菌は、アルスロ
マイセスのペルオキシダーゼと同じ蛋白質を生産し、特
に酵母においてはペルオキシダーゼ活性も検出された。 本発明により、アルスロマイセス属由来のペルオキシダ
ーゼを遺伝子工学的技術を利用して大量に生産すること
や、ペルオキシダーゼを蛋白工学的手法により改良する
ことなどが可能になった。

【００４８】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１３８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列 ＡＡＡＣＣＣＡＣＣＴ　ＧＴＴＣＴＡＣＴＡＣ　ＴＡＧ
ＴＣＣＴＣＴＴ　ＣＣＡＴＴＴＴＧＴＡ　ＴＴＴＧＡＡ
ＣＧＣＴ　ＧＴＴＴＣＣＧＡＣＧ　　　　　６０ＴＣＡ
ＡＧＡＡＣＧＡ　ＣＡＡＣＴ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＴＣ
　ＴＣＧ　ＣＴＴ　ＴＴＣ　ＴＣＣ　ＡＣＣ　ＴＴＣ　
ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＴＣ　　　　　１１１　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅ
ｒ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ａｌａ
　Ａｌａ　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　５　　　　
　　　　　　　　　　　　　　１０　　　　　　　　　
　ＡＴＣ　ＡＴＣ　ＧＧＴ　ＧＣＴ　ＣＴＣ　ＧＣＴ　
ＣＴＣ　ＣＣＣ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　Ｇ
ＧＡ　ＧＧＡ　ＧＧＣ　ＧＧＧ　　　　　　１５９Ｉｌ
ｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　
Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　１５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　２０　　　　　
　　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　　　　
　　　　　ＴＣＡ　ＧＴＣ　ＡＣＴ　ＴＧＣ　ＣＣＧ　
ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＴＣＣ　ＡＣＴ　ＴＣＧ　Ａ
ＡＣ　ＡＧＣ　ＣＡＧ　ＴＧＣ　ＴＧＣ　　　　　　２
０７Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　　　　　　　　３０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　３５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　４０　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　ＧＴＣ　ＴＧＧ　ＴＴＣ　ＧＡＣ　
ＧＴＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＡＧ　Ａ
ＣＣ　ＡＡＣ　ＴＴＣ　ＴＡＣ　ＣＡＡ　ＧＧＧ　　　
　　　２５５Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｖａｌ
　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　
Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　　　　４５
　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　　　　　
　　　　　　　　　　　　　５５　　　　　　　　　　
　　　　　　　　６０　　　ＴＣＣ　ＡＡＧ　ＴＧＴ　
ＧＡＧ　ＡＧＣ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　ＣＧＣ　ＡＡＧ　Ａ
ＴＴ　ＣＴＴ　ＡＧＡ　ＡＴＴ　ＧＴＴ　ＴＴＣ　ＣＡ
Ｔ　　　　　　３０３Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ
　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　
Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　６５　　　　　
　　　　　　　　　　　　　７０　　　　　　　　　　
　　　　　　　　７５　　　　　　　ＧＡＣ　ＧＣＧ　
ＡＴＣ　ＧＧＡ　ＴＴＴ　ＴＣＧ　ＣＣＧ　ＧＣＧ　Ｔ
ＴＧ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＧＧＴ　ＣＡＡ　ＴＴ
Ｃ　ＧＧＴ　　　　　　３５１Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ
　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　
Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｇ
ｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　８０　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８５　　　　　　　　　　
　　　　　　　　９０　　　　　　　　　　　ＧＧＴ　
ＧＧＡ　ＧＧＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＧＧＣ　ＴＣＣ　Ａ
ＴＣ　ＡＴＴ　ＧＣＧ　ＣＡＴ　ＴＣＧ　ＡＡＣ　ＡＴ
Ｃ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　　　　　　３９９Ｇｌｙ　Ｇｌｙ
　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　
Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇ
ｌｕ　Ｌｅｕ　　　　　　　　　　　　９５　　　　　
　　　　　　　　　　　　１００　　　　　　　　　　
　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　　　
ＧＣＣ　ＴＴＣ　ＣＣＧ　ＧＣＴ　ＡＡＴ　ＧＧＣ　Ｇ
ＧＣ　ＣＴＣ　ＡＣＣ　ＧＡＣ　ＡＣＣ　ＡＴＣ　ＧＡ
Ａ　ＧＣＣ　ＣＴＣ　ＣＧＣ　　　　　　４４７Ａｌａ
　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　
Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ａ
ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　　　　　　　１１０　　　　　
　　　　　　　　　　　　１１５　　　　　　　　　　
　　　　　　　１２０　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　ＧＣＧ　ＧＴＣ　ＧＧＴ　ＡＴＣ　ＡＡＣ　Ｃ
ＡＣ　ＧＧＣ　ＧＴＣ　ＴＣＴ　ＴＴＣ　ＧＧＣ　ＧＡ
Ｔ　ＣＴＣ　ＡＴＣ　ＣＡＡ　ＴＴＣ　　　　　　４９
５Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　
Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌ
ｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　　　１２５　　　　　
　　　　　　　　　　　　１３０　　　　　　　　　　
　　　　　　　１３５　　　　　　　　　　　　　　　
　　１４０　　　ＧＣＣ　ＡＣＴ　ＧＣＣ　ＧＴＣ　Ｇ
ＧＣ　ＡＴＧ　ＴＣＣ　ＡＡＣ　ＴＧＣ　ＣＣＴ　ＧＧ
Ｃ　ＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＧＡ　ＣＴＴ　ＧＡＧ　　　　
　　５４３Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　
Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｓ
ｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１４５　　　　　　　　　　
　　　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　　
　　１５５　　　　　　　ＴＴＣ　ＴＴＧ　ＡＣＧ　Ｇ
ＧＡ　ＡＧＡ　ＡＧＣ　ＡＡＣ　ＡＧＴ　ＴＣＣ　ＣＡ
Ｇ　ＣＣＣ　ＴＣＣ　ＣＣＴ　ＣＣＴ　ＴＣＧ　ＣＴＧ
　　　　　　５９１Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　
Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｐ
ｒｏ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　　　
　　　　　　　　　　　　１６０　　　　　　　　　　
　　　　　　　１６５　　　　　　　　　　　　　　　
　　１７０　　　　　　　　　　　ＡＴＣ　ＣＣＧ　Ｇ
ＧＴ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＡＡＣ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＡＣ
Ｔ　ＧＣＴ　ＡＴＣ　ＴＴＧ　ＧＡＴ　ＣＧＴ　ＡＴＧ
　ＧＧＣ　　　　　　６３９Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　
Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａ
ｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｇｌ
ｙ　　　　　　　　　　　１７５　　　　　　　　　　
　　　　　　　１８０　　　　　　　　　　　　　　　
　　１８５　　　　　　　　　　　　　　　ＧＡＴ　Ｇ
ＣＡ　ＧＧＣ　ＴＴＣ　ＡＧＣ　ＣＣＴ　ＧＡＴ　ＧＡ
Ａ　ＧＴＣ　ＧＴＴ　ＧＡＣ　ＴＴＧ　ＣＴＴ　ＧＣＴ
　ＧＣＧ　ＣＡＴ　　　　　　６８７Ａｓｐ　Ａｌａ　
Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖ
ａｌ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌ
ａ　Ｈｉｓ　　　　　　　１９０　　　　　　　　　　
　　　　　　　１９５　　　　　　　　　　　　　　　
　　２００　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ
ＧＴ　ＴＴＧ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＧＧ
Ｔ　ＴＴＧ　ＡＡＣ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＡＴＴ　ＴＴＣ
　ＡＧＧ　ＴＣＧ　ＣＣＴ　　　　　　７３５Ｓｅｒ　
Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ａｒ
ｇ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　　　２０５　　　　　　　　　　
　　　　　　　２１０　　　　　　　　　　　　　　　
　　２１５　　　　　　　　　　　　　　　　　２２０
　　　ＴＴＧ　ＧＡＣ　ＴＣＧ　ＡＣＣ　ＣＣＴ　ＣＡ
Ａ　ＧＴＴ　ＴＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＣ　ＣＡＧ　ＴＴＣ
　ＴＡＴ　ＡＴＣ　ＧＡＧ　ＡＣＣ　　　　　　７８３
Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｖ
ａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｔｙ
ｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　２２５　　　　　　　　　　　　　　　
　　２３０　　　　　　　　　　　　　　　　　２３５
　　　　　　　ＴＴＧ　ＣＴＣ　ＡＡＧ　ＧＧＡ　ＡＣ
Ｃ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＣＣＣ　ＧＧＡ　ＣＣＣ　ＴＣＴ
　ＣＴＣ　ＧＧＣ　ＴＴＴ　ＧＣＡ　ＧＡＧ　　　　　
　８３１Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔ
ｈｒ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅ
ｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　　　　　　　　
　　　　　　　２４０　　　　　　　　　　　　　　　
　　２４５　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０
　　　　　　　　　　　ＧＡＧ　ＣＴＣ　ＴＣＣ　ＣＣ
Ｃ　ＴＴＣ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡＡ　ＴＴＣ　ＣＧＣ
　ＡＴＧ　ＡＧＧ　ＴＣＣ　ＧＡＣ　ＧＣＴ　ＣＴＣ　
　　　　　８７９Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐ
ｈｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｍｅ
ｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　　　　
　　　　　　　２５５　　　　　　　　　　　　　　　
　　２６０　　　　　　　　　　　　　　　　　２６５
　　　　　　　　　　　　　　　ＴＴＧ　ＧＣＴ　ＣＧ
Ｃ　ＧＡＣ　ＴＣＣ　ＣＧＡ　ＡＣＣ　ＧＣＣ　ＴＧＣ
　ＣＧＡ　ＴＧＧ　ＣＡＡ　ＴＣＣ　ＡＴＧ　ＡＣＣ　
ＡＧＣ　　　　　　９２７Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ａｒ
ｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ
　　　　　　　２７０　　　　　　　　　　　　　　　
　　２７５　　　　　　　　　　　　　　　　　２８０
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＧＣ　ＡＡ
Ｔ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＡＴＧ　ＧＧＣ　ＣＡＧ　ＣＧＡ
　ＴＡＣ　ＣＧＣ　ＧＣＣ　ＧＣＣ　ＡＴＧ　ＧＣＣ　
ＡＡＧ　ＡＴＧ　　　　　　９７５Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｔｙ
ｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｌｙｓ
　Ｍｅｔ　　　２８５　　　　　　　　　　　　　　　
　　２９０　　　　　　　　　　　　　　　　　２９５
　　　　　　　　　　　　　　　　　３００　　　ＴＣ
Ｔ　ＧＴＴ　ＣＴＣ　ＧＧＣ　ＴＴＣ　ＧＡＣ　ＡＧＧ
　ＡＡＣ　ＧＣＣ　ＣＴＣ　ＡＣＣ　ＧＡＴ　ＴＧＣ　
ＴＣＴ　ＧＡＣ　ＧＴＴ　　　　　１０２３Ｓｅｒ　Ｖ
ａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓ
ｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ
　Ａｓｐ　Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３０５　　　　　　　　　　　　　　　　　３１０
　　　　　　　　　　　　　　　　　３１５　　　　　
　　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＴＣＴ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＴＣＣ
　ＡＡＣ　ＡＡＣ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＧＴＴ　
ＡＴＣ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＣ　　　　　１０７１Ｉ
ｌｅ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓ
ｎ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ
　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　
　　３２０　　　　　　　　　　　　　　　　　３２５
　　　　　　　　　　　　　　　　　３３０　　　　　
　　　　　　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＧＡＴ
　ＡＴＴ　ＧＡＧ　ＧＴＴ　ＴＣＧ　ＴＧＣ　ＣＣＧ　
ＡＧＣ　ＧＡＧ　ＣＣＴ　ＴＴＣ　ＣＣＴ　　　　　１
１１９Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｉｌ
ｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ
　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　　　　　　　　　
　　３３５　　　　　　　　　　　　　　　　　３４０
　　　　　　　　　　　　　　　　　３４５　　　　　
　　　　　　　　　　ＧＡＡ　ＡＴＴ　ＧＣＴ　ＡＣＣ
　ＧＣＣ　ＴＣＡ　ＧＧＣ　ＣＣＴ　ＣＴＣ　ＣＣＣ　
ＴＣＣ　ＣＴＣ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＴ　　
　　　１１６７Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌ
ａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ
　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　　　　　
　　３５０　　　　　　　　　　　　　　　　　３５５
　　　　　　　　　　　　　　　　　３６０　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ＴＧＡＴＣＴＧＧＴＧ　
ＡＡＧＡＴＧＧＴＡＣ　ＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴ　ＣＴＣ
ＡＣＧＡＴＣＣ　ＣＴＣＴＴＡＧＣＴＡ　ＴＴＴＡＴＣ
ＣＡＡＴ　　　１２２７ＣＴＡＴＣＴＡＣＣＴ　ＡＴＣ
ＴＡＴＧＣＡＧ　ＴＴＴＣＴＧＴＣＣＡ　ＣＣＣＴＣＡ
ＧＴＴＡ　ＴＧＡＡＴＡＴＧＡＣ　ＴＴＧＧＴＴＡＴＣ
Ｔ　　　１２８７ＧＴＧＴＡＴＣＣＧＡ　ＣＴＣＧＧＴ
ＧＣＴＴ　ＧＧＣＡＧＣＡＣＧＴ　ＧＴＡＴＧＡＴＡＴ
Ｔ　ＡＴＡＴＡＡＴＣＡＡ　ＴＣＡＴＧＡＡＣＧＣ　　
　１３４７ＡＴＴＣＣＴＣＣＧＴ　ＧＴＧＧＧＡＧＴＧ
Ｔ　ＧＣＧＴＣＴＴＴＣＴ　ＣＴＣＧＧＡＧ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１３
８４

【図面の簡単な説明】

【図１】ペルオキシダーゼ蛋白質を酵母で発現するプラ
スミドｐＹＥＰＯＤ１を構築する際のプラスミド中間体
ｐＹＥ２００６までの工程図である。

【図２】ｐＹＥ２００６からｐＹＥ２２ｍ迄の工程図で
ある。

【図３】ｐＹＥ２２ｍから最終生産物のプラスミドｐＹ
ＥＰＯＤ１迄の工程図である。

【図４】ｐＹＥＰＯＤ１で形質転換した酵母が、ペルオ
キシダ−ゼ蛋白質を産生することを示す電気泳動図であ
る。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アルスロマイセス・ラモサス（Ａｒｔ
   ｈｒｏｍｙｃｅｓｒａｍｏｓｕｓ　）に属する微生物由
   来のペルオキシダーゼ遺伝子またはそれと実質的に生物
   学的に同等なペルオキシダーゼ活性を有するポリペプチ
   ドをコードする遺伝子。
2. 【請求項２】　　下記式（Ｉ）で表されるアミノ酸配列
   を有するペルオキシダーゼ： 　Ｘ−　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＱＧＰＧＧ
   ＧＧＧＳＶ　ＴＣＰＧＧＱＳＴＳＮ　ＳＱＣＣＶＷＦＤ
   ＶＬ　ＤＤＬＱＴＮＦＹＱＧ　ＳＫＣＥＳＰＶＲＫＩ　
   ＬＲＩＶＦＨＤＡＩＧ　ＦＳＰＡＬＴＡＡＧＱ　ＦＧＧ
   ＧＧＡＤＧＳＩ　ＩＡＨＳＮＩＥＬＡＦ　ＰＡＮＧＧＬ
   ＴＤＴＩ　ＥＡＬＲＡＶＧＩＮＨ　ＧＶＳＦＧＤＬＩＱ
   Ｆ　ＡＴＡＶＧＭＳＮＣＰ　ＧＳＰＲＬＥＦＬＴＧ　Ｒ
   ＳＮＳＳＱＰＳＰＰ　ＳＬＩＰＧＰＧＮＴＶ　ＴＡＩＬ
   ＤＲＭＧＤＡ　ＧＦＳＰＤＥＶＶＤＬ　ＬＡＡＨＳＬＡ
   ＳＱＥ　ＧＬＮＳＡＩＦＲＳＰ　ＬＤＳＴＰＱＶＦＤＴ
   　ＱＦＹＩＥＴＬＬＫＧ　ＴＴＱＰＧＰＳＬＧＦ　ＡＥ
   ＥＬＳＰＦＰＧＥ　ＦＲＭＲＳＤＡＬＬＡ　ＲＤＳＲＴ
   ＡＣＲＷＱ　ＳＭＴＳＳＮＥＶＭＧ　ＱＲＹＲＡＡＭＡ
   ＫＭ　ＳＶＬＧＦＤＲＮＡＬ　ＴＤＣＳＤＶＩＰＳＡ　
   ＶＳＮＮＡＡＰＶＩＰ　ＧＧＬＴＶＤＤＩＥＶ　ＳＣＰ
   ＳＥＰＦＰＥＩ　ＡＴＡＳＧＰＬＰＳＬ　ＡＰＡＰ　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　（Ｉ）（但し、式（Ｉ）中、Ｘは水素原子または
   次式（ＩＩ）：ＭＫＬＳＬＦＳＴＦＡＡＶＩＩＧＡＬＡ
   ＬＰ　　　　　　（ＩＩ）　　で表されるポリペプチド
   を示し、また、式（Ｉ）および式（ＩＩ）中のアルファ
   ベットは、以下のアミノ酸を示す：Ａ；アラニン、Ｃ；
   システイン、Ｄ；アスパラギン酸、Ｅ；グルタミン酸、
   Ｆ；フェニルアラニン、Ｇ；グリシン、Ｈ；ヒスチジン
   、Ｉ；イソロイシン、Ｋ；リシン、Ｌ；ロイシン、Ｍ；
   メチオニン、Ｎ；アスパラギン、Ｐ；プロリン、Ｑ；グ
   ルタミン、Ｒ；アルギニン、Ｓ；セリン、Ｔ；スレオニ
   ン、Ｖ；バリン、Ｗ；トリプトファン、Ｙ；チロシン）
   。
3. 【請求項３】　　請求項２記載の式（Ｉ）で表されるア
   ミノ酸配列を有するペルオキシダーゼのアミノ酸配列を
   コードする遺伝子。
4. 【請求項４】　　下記式（ＩＩＩ）で表される塩基配列
   、または該塩基配列と実　質的に生物学的に同等な塩基
   配列を有するペルオキシダーゼ遺伝子： ｚ− ＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＴ
   ＣＡＧＴＣＡＣＴＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＴＣ
   ＣＡＣＴＴＣＧＡＡＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＧＴＣ
   ＴＧＧＴＴＣＧＡＣＧＴＴＣＴＡＧＡＣＧＡＴＣＴＴＣ
   ＡＧＡＣＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＡＡＧＧＧＴＣＣＡＡ
   ＧＴＧＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＧＴＴＣＧＣＡＡＧＡＴＴ
   ＣＴＴＡＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＣＣＡＴＧＡＣＧＣＧＡ
   ＴＣＧＧＡＴＴＴＴＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＧＡＣＴＧＣ
   ＴＧＣＴＧＧＴＣＡＡＴＴＣＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡ
   ＧＣＴＧＡＴＧＧＣＴＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＧＣＡＴＴ
   ＣＧＡＡＣＡＴＣＧＡＡＴＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＧＧＣ
   ＴＡＡＴＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＡＴＣ
   ＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＧＣＧＣＧＧＴＣＧＧＴＡＴＣＡ
   ＡＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＧＡＴＣＴ
   ＣＡＴＣＣＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＧＧＣ
   ＡＴＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＴＣ
   ＧＡＣＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＧ
   ＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＴ
   ＴＣＧＣＴＧＡＴＣＣＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＣＡ
   ＣＴＧＴＣＡＣＴＧＣＴＡＴＣＴＴＧＧＡＴＣＧＴＡＴ
   ＧＧＧＣＧＡＴＧＣＡＧＧＣＴＴＣＡＧＣＣＣＴＧＡＴ
   ＧＡＡＧＴＣＧＴＴＧＡＣＴＴＧＣＴＴＧＣＴＧＣＧＣ
   ＡＴＡＧＴＴＴＧＧＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴ
   ＧＡＡＣＴＣＧＧＣＴＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＣＧＣＣＴ
   ＴＴＧＧＡＣＴＣＧＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＣＧ
   ＡＴＡＣＣＣＡＧＴＴＣＴＡＴＡＴＣＧＡＧＡＣＣＴＴ
   ＧＣＴＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＡＣＴＣＡＧＣＣＣＧＧＡ
   ＣＣＣＴＣＴＣＴＣＧＧＣＴＴＴＧＣＡＧＡＧＧＡＧＣ
   ＴＣＴＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＡＡＴＴＣＣＧ
   ＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＧＡＣＧＣＴＣＴＣＴＴＧＧＣＴ
   ＣＧＣＧＡＣＴＣＣＣＧＡＡＣＣＧＣＣＴＧＣＣＧＡＴ
   ＧＧＣＡＡＴＣＣＡＴＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡ
   ＡＧＴＴＡＴＧＧＧＣＣＡＧＣＧＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣ
   ＧＣＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＴＣＴＧＴＴＣＴＣＧ
   ＧＣＴＴＣＧＡＣＡＧＧＡＡＣＧＣＣＣＴＣＡＣＣＧＡ
   ＴＴＧＣＴＣＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴ
   ＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＴＴＡ
   ＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣＴＴＡＣＴＧＴＣＧＡＴＧＡ
   ＴＡＴＴＧＡＧＧＴＴＴＣＧＴＧＣＣＣＧＡＧＣＧＡＧ
   ＣＣＴＴＴＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＧＣＴＡＣＣＧＣＣＴ
   ＣＡＧＧＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＴＣＣ
   ＴＧＣＴＣＣＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　（ＩＩＩ）（但し、式（
   ＩＩＩ）中、Ｚは無であるか、または式（ＩＶ）： ＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＣＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴ
   ＴＣＧＣＴＧＣＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＧＣＴＣＴ
   ＣＧＣＴＣＴＣＣＣＣ　　　　　　　　　　　　　　　
   　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＩＶ）で表され
   る塩基配列を示す）。
5. 【請求項５】　　請求項３または４に記載のペルオキシ
   ダーゼ遺伝子、または該遺伝子と実質的に生物学的に同
   等な遺伝子を有する組換えベクター。
6. 【請求項６】　　請求項５記載の組換えベクターにより
   形質転換された宿主細胞。
7. 【請求項７】　　請求項６記載の宿主細胞を培養し、そ
   の細胞体内または培養液からペルオキシダーゼ活性物質
   を回収することを特徴とするペルオキシダーゼの製造法
   。