JPH11127869A - ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 ヘキシュロースリン酸イソメラーゼをコード
するＤＮＡ及び該酵素の製造法の提供。 【解決手段】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ。 （Ａ）特定のアミノ酸配列を有するタンパク質。 （Ｂ）上記特定のアミノ酸配列において、１若しくは数
個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含
むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘキシュロースリン酸
イソメラーゼ活性を有するタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヘキシュロースリ
ン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡ及びヘキシュロー
スリン酸イソメラーゼを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】メチロトローフ細菌のＣ１代謝には、リ
ブロースモノリン酸経路が知られている。この経路は、
リブロース ５−リン酸によるホルムアルデヒドの固定
に始まり、フルクトース ６−リン酸の開裂、リブロー
ス ５−リン酸の再生の３つの段階により構成されてい
る。リブロースモノリン酸経路は、いくつかの代謝系と
共役した経路であり、この経路に関与する各酵素の遺伝
子構造に興味が持たれていたが、本経路に関する報告は
少なく、遺伝子的な解析もほとんどなされていない。

【０００３】リブロースモノリン酸経路の初発反応を触
媒する３−ヘキシュロース−６−リン酸シンターゼ（3-
hexulose-6-phosphate synthase、以下「ＨＰＳ」とも
いう。）については、グラム陰性の偏性メタノール資化
菌であるメチロモナス アミノファシエンス（Methylom
onas aminofaciens）において既に精製され、これをコ
ードする遺伝子がクローニングされ、一次構造が報告さ
れている（Yanase, H.et al., FEMS Microbiol. Lett.,
135, 201-205 (1996)）。

【０００４】ところで、目的化合物分子上の特異的な位
置が、安定同位元素炭素13（¹³C）で標識されている生
化学物質は、生物代謝経路の研究に役立つ。更に近年、
代謝産物の生体内での様子を、炭素13-NMRの技術を用い
て調べる事は、いろいろな病気の診断や日々の健康診断
において、大変重要な手法になってきている。その様な
新しい技術には、ある目的の位置を炭素13で標識した化
合物が、安価に提供できる事が必要であり、また望まれ
ていた。

【０００５】本発明者らは、メタノール資化菌のホルム
アルデヒド固定経路を利用し、炭素13標識のメタノール
から、［1-¹³C］Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製方法
を確立していたが、目的化合物の合成収率はあまり高く
なかった（Biosci.Biotech.Biochem.57,308-312 (199
3)）。

【０００６】そこで、目的産物のみを効率よく生産させ
る系が望まれていた。そのような系の一つとして、標識
ホルムアルデヒドとリブロース ５−リン酸を用い、標
識Ｄ−フルクトース ６−リン酸を合成する一連の各酵
素を調製し、これらを用いた反応系で、効率よい目的標
識化合物の調製を行うという方法が考えられる。その反
応の最初の酵素であるＨＰＳは、上述したようにメチロ
モナス アミノファシエンスではその遺伝子が単離さ
れ、構造も明らかとなっている。しかし、その次の段階
の反応を触媒する酵素であるヘキシュロースリン酸イソ
メラーゼ（hexulose-phosphate isomerase、以下「ＨＰ
Ｉ」ともいう。あるいは、本酵素は、phospho-3-hexulo
isomerase、ホスホ−３−ヘキシュロイソメラーゼ、
（ＰＨＩ）ともいう。）は、部分的に精製されていたに
過ぎず、そのアミノ酸配列も遺伝子構造も知られていな
い。さらに、グラム陽性の通性メタノール資化菌である
マイコバクテリウム属細菌では、ＨＰＳ及びＨＰＩのい
ずれの酵素についてもアミノ酸配列及び遺伝子構造は報
告されていない。

【０００７】この様な状況下では、効率よい目的標識化
合物の調製系の確立の為には、ＨＰＩをコードする遺伝
子を単離し、それを用いて効率よくＨＰＩを製造する方
法が望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記観点から
なされたものであり、ＨＰＩをコードするＤＮＡ及び該
ＤＮＡの利用法を提供することを課題とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、グラム陽
性の通性メタノール資化菌であるマイコバクテリウムガ
ストリ（Mycobacterium gastri）における、リブロース
モノホスフェート経路、特にＨＰＳ及びその遺伝子につ
いて研究をしていたところ、偶然に、この株のＨＰＩを
コードする遺伝子を発見し、本発明に至った。すなわち
本発明は、下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質をコ
ードするＤＮＡである。 （Ａ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有
するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列にお
いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
キシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク
質。

【００１０】前記ＤＮＡとして具体的には、下記（ａ）
又は（ｂ）に示すＤＮＡが挙げられる。 （ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、
少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列
を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、
少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタ
ンパク質をコードするＤＮＡ。

【００１１】また、本発明は、前記ＤＮＡが、該ＤＮＡ
がコードするヘキシュロースリン酸イソメラーゼが発現
可能な形態で導入された細胞を提供する。

【００１２】本発明はさらに、前記細胞を培地で培養
し、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生
成蓄積させ、該培養物よりヘキシュロースリン酸イソメ
ラーゼを採取することを特徴とするヘキシュロースリン
酸イソメラーゼの製造法を提供する。

【００１３】尚、本発明において、「ヘキシュロースリ
ン酸イソメラーゼ活性」とは、３−ヘキシュロース ６
−リン酸とフルクトース ６−リン酸との間の異性化反
応を触媒する活性をいう。

【００１４】

【発明の実施の形態】以下、本発明について、詳細に説
明する。

【００１５】＜１＞本発明のＤＮＡ 本発明のＤＮＡは、後記実施例に示すように、マイコバ
クテリウム ガストリ染色体ＤＮＡから次のようにして
取得したものである。まず、マイコバクテリウム ガス
トリ MB19株から、ＨＰＳを精製する。ＨＰＳは、MB19
株の無細胞抽出液から、DEAE−セファロースカラムクロ
マトグラフィー、フェニルセファロースカラムクロマト
グラフィー、DEAE−セファロースカラムクロマトグラフ
ィーにより、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製す
ることができる。各精製工程において、ＨＰＳ活性は、
Methods in Enzymology Vol.188，397-401 (1990年)に
記載の方法にて測定することができる。

【００１６】次に、精製ＨＰＳの部分アミノ酸配列を決
定し、得られるアミノ酸配列情報を基に、ＰＣＲ（ポリ
メラーゼ・チェイン・リアクション）用のオリゴヌクレ
オチドプライマーを合成し、マイコバクテリウム ガス
トリ MB19株より調製したゲノムDNAを鋳型とするＰＣＲ
を行う。ゲノムDNAは、Saitoらの方法（Biochim. Bioph
ys. Acta, 72, 619-629 (1963)に記載）により取得する
ことができる。ゲノム調製に用いる菌体を得るための培
養は、メタノールを炭素源とし、さらに1%のグリシンを
添加した培地を用いると、菌体量が多く取れ、溶菌操作
が容易となる。また、溶菌酵素としては、リゾチームの
みでは十分な溶菌に至らないが、Ｎ−アセチルムラミダ
ーゼ(N-acethylmuramidase) SGを用いると効果的であ
る。

【００１７】プライマーとして、配列表の配列番号８及
び配列番号９に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドを用いると、上記ＰＣＲによって約400bpのDNA断片が
得られる。

【００１８】次に、上記のようにしてＰＣＲにより増幅
されるDNA断片をDNAプローブに用いて、マイコバクテリ
ウム ガストリ MB19株ゲノムＤＮＡのPstI切断断片ラ
イブラリーに対してコロニーハイブリダイゼーションを
行い、ポジティブクローンを取得する。

【００１９】上記のようにして得られた約4.1kbの長さ
のクローン断片のうち、約3kbについて塩基配列を決定
した結果を配列表配列番号12に示す。この領域内には３
つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在す
る。各ＯＲＦがコードするアミノ酸配列を、５’末端側
から順に、配列番号13〜15に示す。これらのうち、２番
目のＯＲＦ（ORF-2）は、ＨＰＳの部分アミノ酸配列と
完全に一致したことから、ＨＰＳをコードする遺伝子
（以下、「ｈｐｓ」ともいう）であることが示された。
一方、一番目のＯＲＦ（ORF-1）は、このＯＲＦを発現
させて得られるタンパク質の活性を調べることによっ
て、ＨＰＩをコードする遺伝子（以下、「ｈｐｉ」とも
いう）、すなわち本発明のＤＮＡであることが確認され
た。

【００２０】上記のように、本発明のＤＮＡは、ＨＰＳ
の精製及びｈｐｓの単離に付随して偶然取得されたもの
であるが、本発明のＤＮＡの取得は、ORF-1がＨＰＩを
コードしているのではないかとの着想に基づき、ORF-1
を発現させ、発現産物の活性を確認することによりなさ
れたものである。ORF-1がコードするアミノ酸配列につ
いて、既知の種々のデータベース検索を行ったが、機能
が良く知られたポリペプチドとの高い相関は見い出せな
かった。

【００２１】尚、本発明のＤＮＡの単離に用いたマイコ
バクテリウム ガストリはグラム陽性の通性メタノール
資化菌であり、すでにｈｐｓが単離されているメチロモ
ナスアミノファシエンスはグラム陰性の偏性メタノール
資化菌であって、両者は分類学的には全く異なる。

【００２２】本発明のＤＮＡは、上記のようにして取得
されたものであるが、本発明によりその塩基配列及びコ
ードするアミノ酸配列が明らかとなったので、これらの
塩基配列又はアミノ酸配列に基づいて作製したオリゴヌ
クレオチドをプローブとするハイブリダイゼーションに
よって、マイコバクテリウム属細菌、例えばマイコバク
テリウム ガストリ MB19株のゲノムＤＮＡライブラリ
ーから取得することができる。また、上記オリゴヌクレ
オチドをプライマーとし、マイコバクテリウム属細菌の
ゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行うことによって
も、本発明のＤＮＡは得られる。

【００２３】ゲノムＤＮＡライブラリーの作製、ハイブ
リダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、
ＤＮＡの切断及び連結、形質転換等の方法は、Sambroo
k,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, C
old Spring Harbor Laboratory Press,1.21(1989)に記
載されている。

【００２４】後記実施例で得られた、本発明のＤＮＡを
含み、かつ、トリプトファンオペロンプロモーターの制
御下でＨＰＩを発現するプラスミドpT-HPIS-1を含むエ
シェリヒア コリ（Escherichia coli） JM1O9/pT-HPIS
-1は、プライベートナンバーAJ13363が付与され、平成
９年８月４日より通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県つ
くば市東一丁目１番３号）にＦＥＲＭ Ｐ−１６３６３
の受託番号で寄託され、平成１０年１月１６日にブダペ
スト条約に基づく国際寄託に移管され、ＦＥＲＭ ＢＰ
−６２２５の受託番号で寄託されている。

【００２５】本発明のＤＮＡは、コードされるＨＰＩの
活性が損なわれない限り、１若しくは複数の位置での１
若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又
は逆位を含むＨＰＩをコードするものであってもよい。
ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立
体構造における位置や種類によっても異なる。それは、
イソロイシンとバリンのように、アミノ酸によっては、
類縁性の高いアミノ酸が存在し、そのようなアミノ酸の
違いが、蛋白質の立体構造に大きな影響を与えないこと
に由来する。従って、ＨＰＩを構成するアミノ酸配列全
体に対し、３０から４０％以上、好ましくは５５〜６５
％以上の相同性を有し、ＨＰＩ活性を有するものであっ
てもよい。具体的には、前記「数個」は、２から１４０
個、好ましくは、２から９０個、より好ましくは２から
１０個である。

【００２６】上記のようなＨＰＩと実質的に同一のタン
パク質をコードするＤＮＡは、例えば部位特異的変異法
によって、特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位を含むように塩基配列を改変するこ
とによって得られる。また、上記のような改変されたＤ
ＮＡは、従来知られている変異処理によっても取得され
得る。変異処理としては、ＨＰＩをコードするＤＮＡを
ヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、及び
ＨＰＩをコードするＤＮＡを保持する微生物、例えばエ
シェリヒア属細菌を、紫外線照射またはN−メチル−N'
−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝
酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処
理する方法が挙げられる。

【００２７】また、上記のような塩基の置換、欠失、挿
入、付加、又は逆位等には、ｈｐｉを保持する微生物の
個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じる
変異（mutant又はvariant）も含まれる。

【００２８】上記のような変異を有するＤＮＡを、適当
な細胞で発現させ、発現産物のＨＰＩ活性を調べること
により、ＨＰＩと実質的に同一のタンパク質をコードす
るＤＮＡが得られる。また、変異を有するＨＰＩをコー
ドするＤＮＡまたはこれを保持する細胞から、例えば配
列表の配列番号12に記載の塩基配列のうち、塩基番号６
０８〜１２０４からなる塩基配列を有するＤＮＡとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ＨＰ
Ｉ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単離す
ることによっても、ＨＰＩと実質的に同一のタンパク質
をコードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリン
ジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッド
が形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条
件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であ
るが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば
５０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイ
ズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイ
ズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼー
ションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１
％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤ
Ｓに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げら
れる。

【００２９】このような条件でハイブリダイズする遺伝
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、市販の活性発現ベクターにつなぎＨＰ
Ｉ活性を前記の方法で測定することによって容易に取り
除くことができる。

【００３０】＜２＞ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ
の製造 上記の本発明のＤＮＡを、適当な宿主−ベクター系を用
いて発現させることにより、ＨＰＩを製造することがで
きる。ｈｐｉ遺伝子を発現させるための宿主としては、
エシェリヒア コリ（Escherichia coli）をはじめとす
る種々の原核細胞、サッカロマイセス セレビシエ（Sac
charomyces cerevisiae）をはじめとする種々の真核細
胞、動物細胞、植物細胞が挙げられるが、これらの中で
は原核細胞、特にエシェリヒア コリが好ましい。

【００３１】上記の宿主にｈｐｉ遺伝子を導入するため
のベクターとしては、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pH
SG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW11
9、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもフ
ァージＤＮＡのベクターも利用できる。これらのベクタ
ーにｈｐｉ遺伝子を連結して得られる組換えベクターで
上記宿主を形質転換することによって、ｈｐｉ遺伝子を
導入することができる。また、ｈｐｉ遺伝子を、トラン
スダクション、トランスポゾン（Berg,D.E. andBerg,C.
M.,Bio/Technol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開
平２−１０９９８５号）または相同性組換え（Experime
nts in Molecular Genetics, Cold SpringHarbor Lab.
(1972)）を用いた方法で宿主のゲノムに組み込んでもよ
い。

【００３２】また、ｈｐｉ遺伝子の発現を効率的に実施
するために、ＨＰＩをコードするＤＮＡ配列の上流に、
宿主細胞内で働くｌａｃ、ｔｒｐ、Ｐ_L等のプロモータ
ーを連結してもよい。ベクターとして、プロモーターを
含むベクターを用いると、ｈｐｉ遺伝子と、ベクター及
びプロモーターとの連結を一度に行うことができる。こ
のようなベクターとしては、ｔｒｐプロモーターを含む
pT13sNco（J. Biochem. 104, 30-34 (1988)に記載）が
挙げられる。

【００３３】形質転換は、例えば、エシェリヒア コリ
K-12について報告されているような、受容菌細胞を塩
化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方法（ M
andel,M.and Higa,A.,J.Mol.,Biol.,53,159(1970) ）
や、バチルス ズブチリスについて報告されているよう
な、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してＤ
ＮＡを導入する方法（ Duncan,C.H.,Wilson,G.A.and Yo
ung,F.E.,Gene,1,153(1977) ）を用いることができる。
あるいは、バチルス ズブチリス、放線菌類および酵母
について知られているような、ＤＮＡ受容菌の細胞を、
組換えＤＮＡを容易に取り込むプロトプラストまたはス
フェロプラストの状態にして組換えＤＮＡをＤＮＡ受容
菌に導入する方法（ Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Ge
n.,Genet.,168.111(1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hop
wood,O.A.,Nature,274,398(1978);Hinnen,A.,Hicks,J.
B.and Fink,G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75 1929(197
8)）も応用できる。これらの方法は、宿主として用いる
細胞に応じて適宜選択すればよい。

【００３４】ｈｐｉ遺伝子としては、発現した時にＨＰ
Ｉ活性を有するものであればすべて含まれるが、好まし
くは、配列表の配列番号13記載のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡを含む遺伝子、又は配列表の配列番号12記載
の塩基配列のうち塩基番号６０８〜１２０４で表される
塩基配列を含むＤＮＡが挙げられる。また、前述のよう
に、コードされるＨＰＩの活性が損なわれない限り、１
若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置
換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むＨＰＩをコード
するＤＮＡを含むものであってもよい。

【００３５】上記のようにしてｈｐｉ遺伝子を導入され
た細胞を培地で培養し、ＨＰＩを培養物中に生成蓄積さ
せ、該培養物よりＨＰＩを採取することにより、ＨＰＩ
を製造することができる。培養に用いる培地は、用いる
宿主に応じて適宜選択すればよい。宿主としてエシェリ
ヒア コリを用い、ｈｐｉをｔｒｐプロモーターで発現
させる場合には、M9−カザミノ酸−グルコース培地が好
ましい。培養は、37℃で行い、培養開始後数時間後に、
ｔｒｐプロモーターの誘導剤であるインドールアクリル
酸（IAA）を終濃度25μg/mlになるよう添加し、更に培
養を続けると、菌体内にＨＰＩが蓄積する。また、適当
な分泌系を用いてＨＰＩを細胞外に分泌生産させる場合
には、ＨＰＩは培地中に蓄積する。

【００３６】上記のようにして製造されるＨＰＩは、必
要に応じて、菌体抽出液又は培地からイオン交換クロマ
トグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、溶媒沈殿等、通常の酵素の精製法を用
いて精製することができる。

【００３７】本発明により得られるＨＰＩは、炭素13標
識のメタノールから、［1-¹³C］Ｄ−グルコース ６−リ
ン酸を調製するのに利用することができる。この［1-¹³
C］Ｄ−グルコース ６−リン酸の調製は、例えば次のよ
うにして行うことができる。メタノール資化酵母キャン
ヂタ ボイヂニーより調製したアルコールオキシダーゼ
を用いてメタノールをホルムアルデヒドに酸化する。得
られたホルムアルデヒドはＨＰＳの作用で、リブロース
５−リン酸とアルドール縮合してアラビノ−３−ヘキ
シュロース ６−リン酸を生成させる。この場合、リブ
ロース ５−リン酸は不安定であるので、同じ反応系内
でリボース ５−リン酸よりホスホリボイソメラーゼの
作用でリブロース ５−リン酸に異性化し、ＨＰＳ反応
に供する。上記反応で生成したアラビノ−３−ヘキシュ
ロース ６−リン酸はＨＰＩの作用で、フルクトース ６
−リン酸に変換され、更に、これはグルコース ６−リ
ン酸イソメラーゼの作用で、グルコース ６−リン酸に
変換される。一般に、メタノール資化性細菌のＨＰＩ含
量は、ＨＰＳに比べて著しく低いため、ＨＰＩを上記反
応に利用することは困難であったが、本発明によりｈｐ
ｉが単離され、効率よくＨＰＩを製造する方法が提供さ
れたので、上記反応を実用化することが可能となった。

【００３８】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。

【００３９】

【実施例１】 マイコバクテリウム ガストリ MB19株の
ｈｐｉ遺伝子のクローニング及びＨＰＩの発現 ＜１＞３−ヘキシュロース−６−リン酸シンターゼの精
製 マイコバクテリウム ガストリ MB19株を、炭素源がメ
タノールのみの基本培地〔組成：1%(v/v)メタノール，
0.2% NaNO₃，0.2%（NH₄)₂SO₄，0.2% K₂HPO₄，0.1% KH₂P
O₄，0.02% MgS0₄・7H₂0，0.02% 酵母エキス，0.2%(v/v)
ビタミン溶液（40mgパントテン酸カルシウム塩，20mgイ
ノシトール，40mg ニコチン酸，20mg p-アミノ安息香酸
塩，40mg ピリドキシン塩酸塩，0.2mg ビオチン，40mg
チアミン塩酸塩を蒸留水100mlに溶解したもの），1%(v/
v)微量金属塩溶液（0.2g CaCl₂・2H₂O，0.2g MnS0₄・7H
₂0，0.2g ZnS0₄・7H₂0，0.02g CuS0₄・5H₂0，0.1g FeS0₄・
7H₂0，0.05g Na₂MoO₄・2H₂0，0.25g H₃B0₃，0.05g KIを
蒸留水100mlに溶解したもの）〕にて30℃、24時間、10
リッター（L）ジャー培養装置で培養を行い、その培養
液10Lから集菌（6500×g にて連続遠心）し、湿菌体80g
を得た。

【００４０】上記菌体を、濃度が10%(w/v)になるように
緩衝液Ａ（10mM Tris-HCl(pH8.2)，1mM ジチオスレイト
ール，5mM 塩化マグネシウム，0.15mM フェニルメチル
スルフォニルフルオライド）に懸濁した。次に、その懸
濁液中の菌体を、180Wの強度にて超音波破砕し、それを
120,000×gにて60分、超遠心分離した後、その上清画分
を無細胞抽出液として得た。これを緩衝液Ａで平衡化し
たDEAE−セファロースイオン交換カラムクロマトグラフ
ィーに供した。この条件で、目的のＨＰＳ蛋白質は、前
記カラムに吸着した。そこで、このカラムに対して、高
いTris-HCl濃度を含む緩衝液（100mM Tris-HCl(pH8.
2)、1mM ジチオスレイトール、5mM 塩化マグネシウム、
0.15mM フェニルメチルスルフォニルフルオライド）を
用いて、緩衝剤の濃度勾配をかけることで目的ＨＰＳ蛋
白質を溶出し、酵素活性画分を回収した結果、約19倍に
精製されたＨＰＳ標品を得ることができた。

【００４１】次に、上記ＨＰＳ標品を、3M NaCl，1mMジ
チオスレイトール，5mM 塩化マグネシウム，0.15mM フ
ェニルメチルスルフォニルフルオライドを含む10mM リ
ン酸カリウム緩衝液（pH7.0）（緩衝液Ｂ）に対して透
析し、同緩衝液で平衡化したフェニルセファロースカラ
ムによる疎水クロマトグラフィーに供した。この条件
で、ＨＰＳは吸着した。次に、エチレングリコールを含
む緩衝液（50% エチレングリコール、1mM ジチオスレイ
トール、5mM 塩化マグネシウム、0.15mM フェニルメチ
ルスルフォニルフルオライド、10mM リン酸カリウム緩
衝液（pH7.0））を用いて、このカラムに対して、濃度
勾配をかけることでタンパク質を溶出し、ＨＰＳ活性を
示す画分を集めた。この段階でＨＰＳを31倍に精製でき
た。

【００４２】更に、標品の純度を上げる為に、再度、前
記と同様の平衡化、溶出条件にて、DEAE−セファロース
カラムに供することで、ＨＰＳを収率47%、比活性42倍
で、SDS-PAGE上で単一バンドになるまで精製することが
できた。

【００４３】なお、各精製工程において、ＨＰＳ活性
は、基本的には Methods in Enzymology Vol.188，397-
401 (1990年)に記載の方法にて測定した。具体的な方法
は以下の通りである。酵素反応キュベットの中に、0.5M
リン酸カリウム緩衝液（pH7.5）0.05ml，50mM 塩化マグ
ネシウム 0.05ml，50mM リボース ５−リン酸 0.05ml，
100U/ml ホスホリボイソメラーゼ（シグマ社製）0.05m
l，水 0.15mlを入れ、そこへ活性測定の標品を0.05ml添
加し、混合した。これを30℃で２分間、プレインキュベ
ーションした後、10mM ホルムアルデヒドを 0.1ml加
え、酵素反応を開始した。30℃で5分間の反応後、0.1ml
の0.5M HClをその反応液へ添加することで、反応を停止
した。そして、その反応溶液を20倍に希釈したものへ、
Nash 試薬（Biochem. J., 55, 416 (1953)に記載）を2m
l添加し、溶液中のホルムアルデヒドの減少の程度を測
定した。なお、対照実験としては、上記のリボース ５
−リン酸の代わりに水を加えた反応系を用いた。

【００４４】＜２＞ｈｐｓ遺伝子のクローニング 上記のようにして得られた精製ＨＰＳをプロテインシー
ケンサーにかけ、Ｎ末端配列を30残基決定した（MKLQVA
IDLLSTEAALELAGKVAEYVDIIE(配列番号１)）。また、リジ
ルエンドベプチダーゼで精製ＨＰＳを処理し、その分解
ペプチド断片産物を逆相HPLCにて分画し、各々を上記同
様にプロテインシーケンサーにより解析することで、Ｈ
ＰＳの内部アミノ酸配列を決定した（VAEYVDIIELGTPLIK
(配列番号２)、IVFADMK(配列番号３)、ATRAQEVRALGAK
(配列番号４)、FVEMHAGLDEQAK(配列番号５)、ARVPFSVAG
GVK(配列番号６)、VATIPAVQK(配列番号７)）。

【００４５】これらのアミノ酸配列情報を基に、ｈｐｓ
遺伝子をＰＣＲにより増幅するためのＮ末端プライマー
として、配列番号８に記載の塩基配列（5'-ATGAARYTICA
RGTNGCIATHGA-3'）を有するオリゴヌクレオチドを、 そ
して内部プライマーとして配列番号９に記載の塩基配列
を有するオリゴヌクレオチド（5'-CCNGCRTGCATYTCNACRA
A‐3'）を化学合成した。これらをプライマーとして用
い、マイコバクテリウム ガストリ MB19株より調製し
たゲノムDNAを鋳型とするＰＣＲを行い、約400bpのDNA
断片を得た。鋳型に用いたゲノムDNAの取得は、Saitoら
の方法（Biochim.Biophys. Acta, 72, 619-629 (1963)
に記載）を参考に行った。培養は、菌体量が多く取れる
エタノールを炭素源とした基本培地で行ったが、そのま
までは溶菌操作に苦労するということが判明した為、培
養液に1%のグリシンを添加した。更に、リゾチームのみ
では、十分な溶菌に至らなかったので、種々の可溶化酵
素を検討したところ、Ｎ−アセチルムラミダーゼ(N-ace
thylmuramidase) SGが効果的であったので、これを用い
た。またＰＣＲは、宝酒造（株）製のEX Taq-DNA polym
eraseを用い、95℃：１分、55℃：１分、72℃：１分と
いう条件の反応を２５回行った。

【００４６】こうして、上記のようにして得られたDNA
断片を、改めてDNAプローブに用いて、各種制限酵素処
理を行ったマイコバクテリウム ガストリ MB19株ゲノ
ムDNAに対してジェノミックサザン解析を行ったとこ
ろ、このプローブは、ゲノムDNAをPstI処理することに
よって切り出される約4.1kb の大きさのDNA断片とハイ
ブリダイズすることが判った。そこで、この結果を基
に、pUC118をベクターとして、これにPstIで切断したマ
イコバクテリウム ガストリ MB19株ゲノムDNA断片を連
結して作製したゲノムライブラリーに対して、先のDNA
プローブを用いたコロニーハイブリダイゼーションを行
い、ポジティブクローンを取得した。そしてこのクロー
ンより約7.2kbpのプラスミドを得た。このプラスミドを
pUHM1と命名した。

【００４７】＜３＞ｈｐｓ遺伝子の塩基配列決定 次に、プラスミドpUHM1上の挿入DNA断片のDNA塩基配列
を約3kb決定した。結果を配列表の配列番号12に示す。
その結果、この領域内には３つのオープンリーディング
フレーム（ＯＲＦ）が存在した。各ＯＲＦがコードする
アミノ酸配列を、５’末端側から順に、配列番号13〜15
に示す。

【００４８】２番目のＯＲＦ（ORF-2）がコードするタ
ンパク質は、207アミノ酸残基からなるもので、これよ
り求めた分子量は21000であった。この値は、精製ＨＰ
Ｓのサブユニットより求めた分子量24000とほぼ一致し
た。また、ORF-2によってコードされるアミノ酸配列
（配列番号14）は、精製した蛋白質から得られた７種の
アミノ酸配列（Ｎ末端アミノ酸配列および内部アミノ酸
配列）と完全に一致し、これがＨＰＳをコードしている
遺伝子（ｈｐｓ）であることが示された。

【００４９】一方、このｈｐｓ上流のＯＲＦ（ORF-1）
のアミノ酸配列を、Blast（Basic Local Alignment Sea
rch Tool）プログラムを用いて既知の種々のデータベー
スに対して検索したところ、機能が良く知られたポリペ
プチドとの高い相関は見い出せなかった。

【００５０】＜４＞ORF‐1の発現 上記で得られたｈｐｓの上流にあるORF‐1を強制発現さ
せ、コードされるタンパク質の活性を調べることを試み
た。２種のオリゴヌクレオチド、5'-CGAAATCGATAAAAATG
ACGCAAGCCGCAGAAGCCGACGGCG-3'（配列番号１０）及び
(5'-AATTCCAGCTCTAGACAAGGCGGTACGGCG-3'（配列番号１
１）を合成し、これらをプライマーとし、プラスミドpU
HM1を鋳型としてＰＣＲを行い、ORF-1を含み、その上流
末端がClaI部位、そして、下流末端がXbaIであるDNA断
片（A）を調製した。

【００５１】一方、上記DNA断片（A）を発現させるため
の高発現用プラスミドとして、トリプトファンプロモー
ターを有するpT13sNco（J. Biochem. 104, 30-34 (198
8)に記載）を用いた。pT13sNcoを制限酵素ClaI及びXbaI
にて切断し、得られる大きいDNA断片（B）を調製した。
これに、上記のDNA断片（A）をT4 DNAリガーゼにて連結
することで、ORF-1の発現プラスミドpT-HPIS-1を構築し
た。

【００５２】このpT-HPIS-1を用いてエシェリヒア コ
リ JM1O9株を常法により形質転換し、形質転換体JM109/
pT-HPIS-1を得た。一方、DNA断片（A）を含まないプラ
スミドで形質転換した対照株としては、pT13sNcoのベク
ター部分である pTTNcoを保持するエシェリヒア コリ
JM109株（JM109/pTTNco）を用いた。

【００５３】これらの形質転換体を、M9−カザミノ酸−
グルコース培地で、37℃にて振盪培養し、約２時間後
に、トリプトファンプロモーターからの転写の誘導剤で
あるインドールアクリル酸（IAA）を終濃度25μg/mlに
なるよう添加し、更に培養を４時間続け、その後、培養
液1.5mlを集菌した。この菌体へ、0.1Mリン酸カリウム
緩衝液（pH7.5）を 0.5ml添加し、懸濁した。次に、菌
体を超音波破砕後、遠心分離（15000rpm×５分）し、可
溶性画分を酵素標品とした。

【００５４】上記酵素標品について、ＨＰＩ活性の測定
を行った。活性測定法は、ホルムアルデヒドの同化を、
最終的にグルコース−６−リン酸脱水素酵素による酸化
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸の還元
化を測定するという方法をとった。

【００５５】具体的には、反応液〔20mMリン酸カリウム
（pH7.5），1mM塩化マグネシウム，1mM リボース ５−
リン酸、0.8mM NADP⁺（酸化型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドリン酸），3U/ml ホスホリボイソメラー
ゼ（シグマ社製）、3.5U/ml ホスホグルコイソメラーゼ
（ベーリンガー社製），3.5U/ml グルコース−６−リン
酸脱水素酵素（ベーリンガー社製）、3U/ml ＨＰＳを、
0.9mlずつ分光光度計用のキュベット（標品用と対照
用）に入れ、その後、各々のキュベットに菌体可溶性画
分を0.05mlづつ加え、混合した。30℃で２分間保温後、
対照用のキュベットには水0.05mlを、標品用のキュベッ
トには0.1Mホルムアルデヒドを0.05ml加えることで反応
を開始し、NADP⁺の還元に伴う340nm波長光の吸光度上昇
を指標にＨＰＩ活性を測定した。尚、この活性測定に用
いたＨＰＳは、FEMS microbiology letter 135,201-205
(1996)に記載された公知の方法で、メチロモナス ア
ミノファシエンス 77a株由来のｈｐｓ遺伝子をエシェリ
ヒア コリに組み込んだ株を用いて量産化したＨＰＳ
を、Agric.Biol.Chem.,41,1133-1140 (1997)に記載の公
知の方法にて精製したものを用いた。

【００５６】その結果、対照株（JM109/pTTNco）から得
られた細胞抽出液を用いた場合は、ＨＰＩ酵素活性は全
く示さなかったが、JMIO9/pT-HPIS-1の抽出液を用いた
場合は、明らかなＨＰＩ酵素活性を偶然にも検出でき
た。このことから、ORF-1は、ＨＰＩをコードする遺伝
子であることが示された。

【００５７】上記のように取得されたマイコバクテリウ
ム ガストリ MB19株のｈｐｉ遺伝子と、メチロモナス
アミノファシエンス 77a株から上記と同様にしてクロ
ーニングされたｈｐｉ遺伝子について、コードされるＨ
ＰＩのアミノ酸を比較したところ、相同性が認められ
た。全く同一のアミノ酸における相同性は約30%、類似
するアミノ酸も含めた相同性は約69%であった。

【００５８】

【実施例２】 バチルス ズブチリス 168株のｈｐｉ遺
伝子の同定 ＜１＞ＨＰＳアミノ酸配列のデータベース検索 上記の実施例１のごとく取得したマイコバクテリウム
ガストリ MB19株のＨＰＩのアミノ酸配列について、既
存のアミノ酸配列のデータバンクに対して、機能未知な
ＯＲＦも含めて相同性検索を行った。なお、この検索
は、データバンクはSWISS-PROT Rel.34を用い、Genetyx
-Mac（ソフトウエア開発株式会社）の検索システムにて
行った。その結果、マイコバクテリウム ガストリ MB1
9株のｈｐｉ遺伝子のアミノ酸配列と高度に相同性のあ
るものは、バチルス ズブチリス 168株の機能未知遺伝
子であるyckF（配列番号16）であった。

【００５９】マイコバクテリウム ガストリ MB19株の
ＨＰＩのアミノ酸配列とバチルスズブチリス 168株のyc
kFがコードするアミノ酸配列（配列番号17）を比較した
ところ、全く同一のアミノ酸における相同性は約３５
％、類似するアミノ酸も含めた相同性は約７６％であっ
た。このように、本来、メタノールなどのＣ１化合物の
資化とは無関係なバチルス ズブチリスに、ＨＰＩと相
同性の高いタンパク質をコードする遺伝子が存在してい
たことは予想外であった。そこで、このyckFがＨＰＩ活
性を保持しているかどうかを調べるために、yckF遺伝子
をバチルス ズブチリスより単離し、これを発現ベクタ
ーに組み込み、得られた組換えベクターをエシェリヒア
コリ細胞中へ導入し、細胞粗抽出液中のＨＰＩ活性を
測定した。

【００６０】＜２＞バチルス ズブチリスのyckF遺伝子
のクローニング 既に、バチルス ズブチリスの全ゲノム塩基配列は決定
されているため（Nature, Vol.390, pp249, 1997）、そ
の塩基配列情報を基に、yckFを含むDNA断片をPCRにて増
幅した。用いたDNAプライマーは、Ｎ末端側の上流に制
限酵素ClaI切断部位を有するプライマーとして、配列番
号18に記載の塩基配列(5'-AAGCATCGATAAAATGAAAACGACTG
AATACGTAGCGGAA-3') を有するオリゴヌクレオチドを、
そしてＣ末端側の下流に制限酵素BamHI切断部位を有す
るプライマーとして配列番号19に記載の塩基配列(5'-AT
CTTGGATCCGGTTGTGTGATGTTATTCAAGGTTTGCG-3') を有する
オリゴヌクレオチドを化学合成した。これをプライマー
としてバチルス ズブチリス 168株より調製したゲノム
DNAを鋳型とするPCRを行い、約550bpの大きさの増幅さ
れたDNA断片を得た。なお、鋳型に用いたゲノムDNAの取
得は、Saito らの方法（Biochim. Biophys. Acta, 72,
619-629 (1963)に記載）を参考に行った。またＰＣＲ
は、宝酒造（株）製のLA-Taq酵素を用い、94℃、90秒の
熱処理後、98℃：10秒、58℃：20秒、70℃：60秒という
条件の反応を２８回行い、その後、70℃、3分間の反応
を行った。

【００６１】上記のようにして得られたDNA断片を、フ
ェノール処理、アルコール沈澱等で精製した後、適当な
酵素反応用の緩衝液に溶解し、制限酵素ClaI及びBamHI
を添加し、37℃にて１時間処理した。そして、この反応
液を0.8%アガロースのゲル電気泳動に供し、両端に各
々、ClaI、BamHI切断端をもつDNA断片を分離した。その
後、このアガロースゲルより目的のDNA断片を精製し、y
ckFを含むDNA断片を得た。

【００６２】＜２＞バチルス ズブチリスのyckF遺伝子
の発現及び酵素活性の確認 上記のようにして得られたyckF遺伝子を発現させるため
為の高発現用プラスミドとして、実施例１と同じく、ト
リプトファンプロモーターを有するpT13sNcoを用いた。
pT13sNcoを制限酵素ClaI及びBamHIにて切断し、得られ
る大きいDNA断片を調製した。これに、上記のyckFを含
むDNA断片をT4-DNAリガーゼにて連結することで、yckF
の発現プラスミドpT-Bsb-yckF1を構築した。

【００６３】このpT-Bsb-yckFを用いて、エシェリヒア
コリ JM109株を常法により形質転換し、形質転換体JM
109/ pT-Bsb-yckF1を得た。尚、JM109/ pT-Bsb-yckF1
は、プライベートナンバーAJ13441が付与され、平成１
０年５月８日より、通商産業省工業技術院生命工学工業
技術研究所（郵便番号３０５−８５６６ 日本国茨城県
つくば市東一丁目１番３号）に寄託されており、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−６３４５が付与されている。

【００６４】一方、yckFを含むDNA断片を含まないプラ
スミドで形質転換した対照株としては、pT13sNcoのベク
ター部分であるpTTNcoを保持するエシェリヒア コリ J
M109株(JM109/pTTNco)を用いた。

【００６５】これらの形質転換体を、M9-カザミノ酸-グ
ルコース培地で、37℃にて振盪培養し、約２時間後に、
トリプトファンプロモーターからの転写の誘導剤である
インドールアクリル酸を終濃度25μg/ml になるよう添
加し、更に培養を８時間続けた。その後、培養液を集菌
し、実施例１と同様にして、菌体の可溶性画分を調製し
た後、HPI活性を測定した。

【００６６】その結果、対照株(JM109/pTTNco)から得ら
れた細胞抽出液を用いた場合は、ＨＰＩ酵素活性は見ら
れなかったが、JM109/pT-Bsb-yckF1の抽出液を用いた場
合には、明らかなＨＰＩ活性を検出した。このことか
ら、バチルス ズブチリス 168株中の機能未知ＯＲＦで
あるyckF（配列番号16）は、ＨＰＩをコードするもので
あることが、はじめて明らかになった。また、バチルス
ズブチリスはメタノール等のＣ１化合物を資化するこ
とができないため、ｈｐｉ遺伝子を有するとは考えられ
ていなかったが、該遺伝子を有することが明らかとなっ
た。

【００６７】

【発明の効果】本発明方法によれば、ヘキシュロースリ
ン酸イソメラーゼをコードするＤＮＡが得られ、該酵素
を効率よく生産することが可能となり、ひいては、医療
や生化学的基礎研究に重要で必要となる標識化合物を大
量に安価に提供できることになる。

【００６８】

【配列表】

【００６９】 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Mycobacterium gastri <400> 1 Met Lys Leu Gln Val Ala Ile Asp Leu Leu Ser Thr Glu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Glu Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Tyr Val Asp Ile Ile Glu 20 25 30

【００７０】 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Mycobacterium gastri <400> 2 Val Ala Glu Tyr Val Asp Ile Ile Glu Leu Gly Thr Pro Leu Ile Lys 1 5 10 15

【００７１】

【００７２】 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Mycobacterium gastri <400> 4 Ala Thr Arg Ala Gln Glu Val Arg Ala Leu Gly Aka Lys 1 5 10

【００７３】 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Mycobacterium gastri <400> 5 Phe Val Glu Met His Ala Gly Leu Asp Glu Gln Ala Lys 1 5 10

【００７４】

【００７５】

【００７６】 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (6,11) <223> R=G or A <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> Y=T or C <220> <221> UNSURE <222> (9,18) <223> N=イノシン <220> <221> UNSURE <222> (15) <223> N=A or C or G or T <220> <221> UNSURE <222> (21) <223> H=A or C or T <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 atgaarytnc argtngcnat hga 23

【００７７】 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> UNSURE <222> (3,15) <223> N=A or C or G or T <220> <221> UNSURE <222> (6,18) <223> R=G or A <220> <221> UNSURE <222> (11) <223> Y=T or C <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 9 ccngcrtgca tytcnacraa 20

【００７８】 <210> 10 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 10 cgaaatcgat aaaaatgacg caagccgcag aagccgacgg cg 42

【００７９】 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 11 aattccagct ctagacaagg cggtacggcg 30

【００８０】 <210> 12 <211> 2967 <212> DNA <213> Mycobacterium gastri <220> <221> CDS <222> (608)..(1204) <220> <221> CDS <222> (1281)..(1901) <220> <221> CDS <222> (2146)..(2967) <400> 12 cgagctcgga aaccactccc gcatgatgtc ggtctcgggc tcgggctgat tgacgacgaa 60 ggttcccccg ctgcggccgc ggcgcgtctc gacgacccct cgttcgcgca gttccgacaa 120 cgcttcccgc agcgttgcgc cgccgacccc gaacatctcc gaaagcgcgg cctcaggggg 180 taggcgttca cctactttga gcagcccgag ggcgatcgcc ttggagattc tctcgacaat 240 cgcgtcggcc ctctcgattt ccggcaggga ccgataaatc tgcgactgga agggggtcgg 300 cgtggccaaa agtctgcgct ccgaaaatgg actacgaggt gagtcgatcc taggtcgaag 360 ccgtggcccg cggtgccgac tacggcgtcg cggttggggt tgctgacgcg cctcggcaca 420 tcaccgctgc gcacgctccg ccgggaccgt acggaggggt cagggtggct gaccaatcca 480 aaagtgtagt cagaaccgtc agaaaacagt attaccccca cccgttcgct tcgggattat 540 tggcttcagt caagccaatc atccgttcgg gccgtcacgg cccgacgacc gatcgaaggg 600 ggtaacc atg acg caa gcc gca gaa gcc gac ggc gcc gtg aag gtc gtc 649 Met Thr Gln Ala Ala Glu Ala Asp Gly Ala Val Lys Val Val 1 5 10 gga gac gac atc acc aac aac ctt tcc ctt gtt cgg gac gag gtc gcg 697 Gly Asp Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Leu Val Arg Asp Glu Val Ala 15 20 25 30 gac acc gcg gcg aaa gtc gac ccg gag cag gtg gct gtc ctc gct cgc 745 Asp Thr Ala Ala Lys Val Asp Pro Glu Gln Val Ala Val Leu Ala Arg 35 40 45 caa atc gtc cag cct gga cgg gtt ttc gtg gcg ggc gcc ggt cgc agc 793 Gln Ile Val Gln Pro Gly Arg Val Phe Val Ala Gly Ala Gly Arg Ser 50 55 60 ggg ctc gtc ctg cgc atg gcc gcc atg cgg ctg atg cac ttc ggc ctc 841 Gly Leu Val Leu Arg Met Ala Ala Met Arg Leu Met His Phe Gly Leu 65 70 75 acc gtg cac gtc gcg ggc gac acc acc acc ccg gca atc tca gcc ggc 889 Thr Val His Val Ala Gly Asp Thr Thr Thr Pro Ala Ile Ser Ala Gly 80 85 90 gat ctg ctg ctg gtg gct tcc ggc tcg ggc acc acc tcc ggt gtg gtc 937 Asp Leu Leu Leu Val Ala Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Val Val 95 100 105 110 aag tcc gcc gag acg gcc aag aag gcc ggg gcg cgc atc gcc gcc ttc 985 Lys Ser Ala Glu Thr Ala Lys Lys Ala Gly Ala Arg Ile Ala Ala Phe 115 120 125 acc acc aac ccg gat tct ccg ctg gcc ggt ctg gcc gac gcc gtg gtg 1033 Thr Thr Asn Pro Asp Ser Pro Leu Ala Gly Leu Ala Asp Ala Val Val 130 135 140 atc atc ccc gcc gcg cag aag acc gat cac ggc tcg cac att tcg cgg 1081 Ile Ile Pro Ala Ala Gln Lys Thr Asp His Gly Ser His Ile Ser Arg 145 150 155 cag tac gcc gga tcc ctt ttc gag cag gtg ctg ttc gtc gtc acc gaa 1129 Gln Tyr Ala Gly Ser Leu Phe Glu Gln Val Leu Phe Val Val Thr Glu 160 165 170 gcc gtg ttc cag tcg ctg tgg gat cac acc gag gtc gag gcc gag gaa 1177 Ala Val Phe Gln Ser Leu Trp Asp His Thr Glu Val Glu Ala Glu Glu 175 180 185 190 ctc tgg acg cgc cac gcc aac ctc gag tgacccggac ctcgacgacc 1224 Leu Trp Thr Arg His Ala Asn Leu Glu 195 aactcttact tcacattcca tacccatcgc agtacccaac agaaagaagg caccca atg 1283 Met 200 aag ctc caa gtc gcc atc gac ctg ctg tcc acc gaa gcc gcc ctc gag 1331 Lys Leu Gln Val Ala Ile Asp Leu Leu Ser Thr Glu Ala Ala Leu Glu 205 210 215 ctg gcc ggc aag gtt gcc gag tac gtc gac atc atc gaa ctg ggc acc 1379 Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Tyr Val Asp Ile Ile Glu Leu Gly Thr 220 225 230 ccc ctg atc gag gcc gag ggc ctg tcg gtc atc acc gcc gtc aag aag 1427 Pro Leu Ile Glu Ala Glu Gly Leu Ser Val Ile Thr Ala Val Lys Lys 235 240 245 gct cac ccg gac aag atc gtc ttc gcc gac atg aag acc atg gac gcc 1475 Ala His Pro Asp Lys Ile Val Phe Ala Asp Met Lys Thr Met Asp Ala 250 255 260 ggc gag ctc gaa gcc gac atc gcg ttc aag gcc ggc gct gac ctg gtc 1523 Gly Glu Leu Glu Ala Asp Ile Ala Phe Lys Ala Gly Ala Asp Leu Val 265 270 275 280 acg gtc ctc ggc tcg gcc gac gac tcc acc atc gcg ggt gcc gtc aag 1571 Thr Val Leu Gly Ser Ala Asp Asp Ser Thr Ile Ala Gly Ala Val Lys 285 290 295 gcc gcc cag gct cac aac aag ggc gtc gtc gtc gac ctg atc ggc atc 1619 Ala Ala Gln Ala His Asn Lys Gly Val Val Val Asp Leu Ile Gly Ile 300 305 310 gag gac aag gcc acc cgt gca cag gaa gtt cgc gcc ctg ggt gcc aag 1667 Glu Asp Lys Ala Thr Arg Ala Gln Glu Val Arg Ala Leu Gly Ala Lys 315 320 325 ttc gtc gag atg cac gct ggt ctg gac gag cag gcc aag ccc ggc ttc 1715 Phe Val Glu Met His Ala Gly Leu Asp Glu Gln Ala Lys Pro Gly Phe 330 335 340 gac ctg aac ggt ctg ctc gcc gcc ggc gag aag gct cgc gtt ccg ttc 1763 Asp Leu Asn Gly Leu Leu Ala Ala Gly Glu Lys Ala Arg Val Pro Phe 345 350 355 360 tcc gtg gcc ggt ggc gtg aaa gtt gcg acc atc ccc gca gtc cag aag 1811 Ser Val Ala Gly Gly Val Lys Val Ala Thr Ile Pro Ala Val Gln Lys 365 370 375 gcc ggc gca gaa gtt gcc gtc gcc ggt ggc gcc atc tac ggt gca gcc 1859 Ala Gly Ala Glu Val Ala Val Ala Gly Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Ala 380 385 390 gac ccg gcc gcc gcc gcg aag gaa ctg cgc gcc gcg atc gcc 1901 Asp Pro Ala Ala Ala Ala Lys Glu Leu Arg Ala Ala Ile Ala 395 400 405 tgatcctgat cgtttagcac tcccataacg gtggcgtccc gcatcctgaa agcagttgcg 1961 ggacgcaacc gtttggtttt tctaccctga aatagcgcat gagctcgccg ggcgcggtac 2021 tcgtctggag gcgtgtgtcg ctcggcggcg cgctccttcc tgggaagatc ccgcccgctg 2081 acactttcac gcaaccgtga ggtcgacgac gccgtaccgc cttgtcgaga gctggaattc 2141 cacc atg tcc gct gac cac ggt gat tcg agt gtg agg ccc gga cgc aac 2190 Met Ser Ala Asp His Gly Asp Ser Ser Val Arg Pro Gly Arg Asn 410 415 420 ctg ctc cgg gat ccg cgc gat cgt cgc ttg aac cgc atc gcc ggt ccg 2238 Leu Leu Arg Asp Pro Arg Asp Arg Arg Leu Asn Arg Ile Ala Gly Pro 425 430 435 tcc tcc ctt gtc ctg ttc gga gtc acg ggc gat ctc gcc cgg aag aaa 2286 Ser Ser Leu Val Leu Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys 440 445 450 ctc gtg ccc gcg gtg tac gac ctc gcc aac cgg ggt ctg ttg ccg ccg 2334 Leu Val Pro Ala Val Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro 455 460 465 agc ttt gcc ttg gtg ggc ttc ggc cgg cgc gaa tgg acg aac gag gac 2382 Ser Phe Ala Leu Val Gly Phe Gly Arg Arg Glu Trp Thr Asn Glu Asp 470 475 480 485 ttc gcc gcc gag gtc aag gcg aac gtg aag gct tac gcc cga aca cct 2430 Phe Ala Ala Glu Val Lys Ala Asn Val Lys Ala Tyr Ala Arg Thr Pro 490 495 500 ttc gac gag gcc gtg tgg gag caa ctc tcc gag ggc atc cgc ttc gtc 2478 Phe Asp Glu Ala Val Trp Glu Gln Leu Ser Glu Gly Ile Arg Phe Val 505 510 515 caa ggc gcg ttc gac gac gag acg gcg ttc aaa cgg ctg cgc gcc acg 2526 Gln Gly Ala Phe Asp Asp Glu Thr Ala Phe Lys Arg Leu Arg Ala Thr 520 525 530 ctg gag gat ctc gac gag cag cgc ggc acg cgc ggc aat tac gcc ttc 2574 Leu Glu Asp Leu Asp Glu Gln Arg Gly Thr Arg Gly Asn Tyr Ala Phe 535 540 545 tac ctt tcg atc cca ccc aag gcc ttc gaa cag gtc tgc cgc cag ctc 2622 Tyr Leu Ser Ile Pro Pro Lys Ala Phe Glu Gln Val Cys Arg Gln Leu 550 555 560 565 tcc gaa tcc ggg ctg gcg cag gcc gag aac gac aag tgg cgc cgg gtg 2670 Ser Glu Ser Gly Leu Ala Gln Ala Glu Asn Asp Lys Trp Arg Arg Val 570 575 580 gtc atc gag aag ccg ttc gga cac gac ctc gag tcg gcc cgc caa ctc 2718 Val Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asp Leu Glu Ser Ala Arg Gln Leu 585 590 595 aac gac gtc gtc gag tcc gtg ttc ccg ccg gac gcc gtg ttc cgg atc 2766 Asn Asp Val Val Glu Ser Val Phe Pro Pro Asp Ala Val Phe Arg Ile 600 605 610 gac cat tac ctg ggc aag gag acg gtc cag aac atc ctg gcc ctg cgc 2814 Asp His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg 615 620 625 ttc gcg aac cag ctc ttc gag ccg ctg tgg aac gcg aat tac gtt gac 2862 Phe Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ala Asn Tyr Val Asp 630 635 640 645 cac gta cag atc acg atg gcc gaa tcc atc ggc acc ggc ggc cgg gca 2910 His Val Gln Ile Thr Met Ala Glu Ser Ile Gly Thr Gly Gly Arg Ala 650 655 660 ggt tac tac gac ggt gtc ggc gcg gcc cgc gac gtc atc cag aac cac 2958 Gly Tyr Tyr Asp Gly Val Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His 665 670 675 ctg ctg cag 2967 Leu Leu Gln 680

【００８１】 <210> 13 <211> 199 <212> PRT <213> Mycobacterium gastri <400> 13 Met Thr Gln Ala Ala Glu Ala Asp Gly Ala Val Lys Val Val Gly Asp 1 5 10 15 Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Leu Val Arg Asp Glu Val Ala Asp Thr 20 25 30 Ala Ala Lys Val Asp Pro Glu Gln Val Ala Val Leu Ala Arg Gln Ile 35 40 45 Val Gln Pro Gly Arg Val Phe Val Ala Gly Ala Gly Arg Ser Gly Leu 50 55 60 Val Leu Arg Met Ala Ala Met Arg Leu Met His Phe Gly Leu Thr Val 65 70 75 80 His Val Ala Gly Asp Thr Thr Thr Pro Ala Ile Ser Ala Gly Asp Leu 85 90 95 Leu Leu Val Ala Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Val Val Lys Ser 100 105 110 Ala Glu Thr Ala Lys Lys Ala Gly Ala Arg Ile Ala Ala Phe Thr Thr 115 120 125 Asn Pro Asp Ser Pro Leu Ala Gly Leu Ala Asp Ala Val Val Ile Ile 130 135 140 Pro Ala Ala Gln Lys Thr Asp His Gly Ser His Ile Ser Arg Gln Tyr 145 150 155 160 Ala Gly Ser Leu Phe Glu Gln Val Leu Phe Val Val Thr Glu Ala Val 165 170 175 Phe Gln Ser Leu Trp Asp His Thr Glu Val Glu Ala Glu Glu Leu Trp 180 185 190 Thr Arg His Ala Asn Leu Glu 195

【００８２】 <210> 14 <211> 207 <212> PRT <213> Mycobacterium gastri <400> 14 Met Lys Leu Gln Val Ala Ile Asp Leu Leu Ser Thr Glu Ala Ala Leu 1 5 10 15 Glu Leu Ala Gly Lys Val Ala Glu Tyr Val Asp Ile Ile Glu Leu Gly 20 25 30 Thr Pro Leu Ile Glu Ala Glu Gly Leu Ser Val Ile Thr Ala Val Lys 35 40 45 Lys Ala His Pro Asp Lys Ile Val Phe Ala Asp Met Lys Thr Met Asp 50 55 60 Ala Gly Glu Leu Glu Ala Asp Ile Ala Phe Lys Ala Gly Ala Asp Leu 65 70 75 80 Val Thr Val Leu Gly Ser Ala Asp Asp Ser Thr Ile Ala Gly Ala Val 85 90 95 Lys Ala Ala Gln Ala His Asn Lys Gly Val Val Val Asp Leu Ile Gly 100 105 110 Ile Glu Asp Lys Ala Thr Arg Ala Gln Glu Val Arg Ala Leu Gly Ala 115 120 125 Lys Phe Val Glu Met His Ala Gly Leu Asp Glu Gln Ala Lys Pro Gly 130 135 140 Phe Asp Leu Asn Gly Leu Leu Ala Ala Gly Glu Lys Ala Arg Val Pro 145 150 155 160 Phe Ser Val Ala Gly Gly Val Lys Val Ala Thr Ile Pro Ala Val Gln 165 170 175 Lys Ala Gly Ala Glu Val Ala Val Ala Gly Gly Ala Ile Tyr Gly Ala 180 185 190 Ala Asp Pro Ala Ala Ala Ala Lys Glu Leu Arg Ala Ala Ile Ala 195 200 205

【００８３】 <210> 15 <211> 272 <212> PRT <213> Mycobacterium gastri <400> 15 Met Ser Ala Asp His Gly Asp Ser Ser Val Arg Pro Gly Arg Asn Leu 1 5 10 15 Leu Arg Asp Pro Arg Asp Arg Arg Leu Asn Arg Ile Ala Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Leu Val Leu Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu 35 40 45 Val Pro Ala Val Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Ser 50 55 60 Phe Ala Leu Val Gly Phe Gly Arg Arg Glu Trp Thr Asn Glu Asp Phe 65 70 75 80 Ala Ala Glu Val Lys Ala Asn Val Lys Ala Tyr Ala Arg Thr Pro Phe 85 90 95 Asp Glu Ala Val Trp Glu Gln Leu Ser Glu Gly Ile Arg Phe Val Gln 100 105 110 Gly Ala Phe Asp Asp Glu Thr Ala Phe Lys Arg Leu Arg Ala Thr Leu 115 120 125 Glu Asp Leu Asp Glu Gln Arg Gly Thr Arg Gly Asn Tyr Ala Phe Tyr 130 135 140 Leu Ser Ile Pro Pro Lys Ala Phe Glu Gln Val Cys Arg Gln Leu Ser 145 150 155 160 Glu Ser Gly Leu Ala Gln Ala Glu Asn Asp Lys Trp Arg Arg Val Val 165 170 175 Ile Glu Lys Pro Phe Gly His Asp Leu Glu Ser Ala Arg Gln Leu Asn 180 185 190 Asp Val Val Glu Ser Val Phe Pro Pro Asp Ala Val Phe Arg Ile Asp 195 200 205 His Tyr Leu Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe 210 215 220 Ala Asn Gln Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ala Asn Tyr Val Asp His 225 230 235 240 Val Gln Ile Thr Met Ala Glu Ser Ile Gly Thr Gly Gly Arg Ala Gly 245 250 255 Tyr Tyr Asp Gly Val Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu 260 265 270 Leu Gln

【００８４】 <210> 16 <211> 737 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (113)..(667) <400> 16 tgatccagca aaagcctgac cttgtcattg tcgggggcgg aattacaagc gcagctgata 60 aggcggaaac agcttcaaaa atgaagcagc tgattgtcca aggataactc cg atg aaa 118 Met Lys 1 acg act gaa tac gta gcg gaa att ctc aat gag tta cac aat tca gca 166 Thr Thr Glu Tyr Val Ala Glu Ile Leu Asn Glu Leu His Asn Ser Ala 5 10 15 gct tat att tct aat gaa gaa gct gac cag ctt gcc gat cac att ctt 214 Ala Tyr Ile Ser Asn Glu Glu Ala Asp Gln Leu Ala Asp His Ile Leu 20 25 30 tca tcc cac caa att ttc acc gcg ggt gcg ggg cgg tct ggc ctg atg 262 Ser Ser His Gln Ile Phe Thr Ala Gly Ala Gly Arg Ser Gly Leu Met 35 40 45 50 gca aaa tcc ttc gcg atg aga ctg atg cac atg ggc ttc aac gcc cat 310 Ala Lys Ser Phe Ala Met Arg Leu Met His Met Gly Phe Asn Ala His 55 60 65 ata gta ggt gag att ctc act ccg ccg ctc gcc gaa gga gat cta gtt 358 Ile Val Gly Glu Ile Leu Thr Pro Pro Leu Ala Glu Gly Asp Leu Val 70 75 80 att atc ggc tca gga tca ggc gag aca aag agc ttg att cat acc gca 406 Ile Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Thr Lys Ser Leu Ile His Thr Ala 85 90 95 gca aaa gca aaa agc tta cac gga att gtt gcc gct tta acc atc aat 454 Ala Lys Ala Lys Ser Leu His Gly Ile Val Ala Ala Leu Thr Ile Asn 100 105 110 ccg gaa tca agc atc gga aaa caa gcg gac ctc atc atc aga atg cct 502 Pro Glu Ser Ser Ile Gly Lys Gln Ala Asp Leu Ile Ile Arg Met Pro 115 120 125 130 ggt tcc cct aaa gac cag tct aac gga agc tat aaa acc att cag cca 550 Gly Ser Pro Lys Asp Gln Ser Asn Gly Ser Tyr Lys Thr Ile Gln Pro 135 140 145 atg gga tca tta ttt gaa caa act ttg ctg ctc ttc tat gat gca gtg 598 Met Gly Ser Leu Phe Glu Gln Thr Leu Leu Leu Phe Tyr Asp Ala Val 150 155 160 att tta aaa ctc atg gag aaa aaa ggt ctc gat tct gaa act atg ttc 646 Ile Leu Lys Leu Met Glu Lys Lys Gly Leu Asp Ser Glu Thr Met Phe 165 170 175 act cac cac gca aac ctt gaa tagcatcaca caaccggcct gaagatcagg 697 Thr His His Ala Asn Leu Glu 180 185 ccggttttat tttttctaaa ataaaacttt aaacccaaaa 737

【００８５】 <210> 17 <211> 185 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 17 Met Lys Thr Thr Glu Tyr Val Ala Glu Ile Leu Asn Glu Leu His Asn 1 5 10 15 Ser Ala Ala Tyr Ile Ser Asn Glu Glu Ala Asp Gln Leu Ala Asp His 20 25 30 Ile Leu Ser Ser His Gln Ile Phe Thr Ala Gly Ala Gly Arg Ser Gly 35 40 45 Leu Met Ala Lys Ser Phe Ala Met Arg Leu Met His Met Gly Phe Asn 50 55 60 Ala His Ile Val Gly Glu Ile Leu Thr Pro Pro Leu Ala Glu Gly Asp 65 70 75 80 Leu Val Ile Ile Gly Ser Gly Ser Gly Glu Thr Lys Ser Leu Ile His 85 90 95 Thr Ala Ala Lys Ala Lys Ser Leu His Gly Ile Val Ala Ala Leu Thr 100 105 110 Ile Asn Pro Glu Ser Ser Ile Gly Lys Gln Ala Asp Leu Ile Ile Arg 115 120 125 Met Pro Gly Ser Pro Lys Asp Gln Ser Asn Gly Ser Tyr Lys Thr Ile 130 135 140 Gln Pro Met Gly Ser Leu Phe Glu Gln Thr Leu Leu Leu Phe Tyr Asp 145 150 155 160 Ala Val Ile Leu Lys Leu Met Glu Lys Lys Gly Leu Asp Ser Glu Thr 165 170 175 Met Phe Thr His His Ala Asn Leu Glu 180 185

【００８６】 <210> 18 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <213> Artificial Sequence <400> 18 aagcatcgat aaaatgaaaa cgactgaata cgtagcggaa 40

【００８７】 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 20 atcttggatc cggttgtgtg atgttattca aggtttgcg 39

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
   をコードするＤＮＡ。 （Ａ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有
   するタンパク質。 （Ｂ）配列表の配列番号１３に記載のアミノ酸配列にお
   いて、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、
   付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、ヘ
   キシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタンパク
   質。
2. 【請求項２】 下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
   る請求項１記載のＤＮＡ。 （ａ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、
   少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列
   を含むＤＮＡ。 （ｂ）配列表の配列番号１２に記載の塩基配列のうち、
   少なくとも塩基番号６０８〜１２０４からなる塩基配列
   とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
   つ、ヘキシュロースリン酸イソメラーゼ活性を有するタ
   ンパク質をコードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１又は２記載のＤＮＡが、該ＤＮ
   Ａがコードするヘキシュロースリン酸イソメラーゼが発
   現可能な形態で導入された細胞。
4. 【請求項４】 請求項３記載の細胞を培地で培養し、ヘ
   キシュロースリン酸イソメラーゼを培養物中に生成蓄積
   させ、該培養物よりヘキシュロースリン酸イソメラーゼ
   を採取することを特徴とするヘキシュロースリン酸イソ
   メラーゼの製造法