DE60224046T2

DE60224046T2 - Neue, aus bacillus licheniformis stammende aminopeptidase, die aminopeptidase codierendes gen, das gen enthaltender expressionsvektor, transformant sowie verfahren zur herstellung davon

Info

Publication number: DE60224046T2
Application number: DE60224046T
Authority: DE
Inventors: Young-Phil Lee; Seung-Won Lee; Chul-Ho Jung; Hyung-Cheol Kim; Soon-Yong Choi; Jin-Suk Kim; Hyun-Sik Kim; Jung-Woo Seo
Original assignee: LG Life Sciences Ltd
Current assignee: LG Chem Ltd
Priority date: 2001-07-06
Filing date: 2002-07-06
Publication date: 2008-12-04
Anticipated expiration: 2022-07-07
Also published as: KR100477062B1; KR20030004998A; JP2008154582A; DE60224046D1; PT1404829E; JP4599389B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue von Bacillus licheniformis stammende Aminopeptidase, ein Gen, das für die Aminopeptidase codiert, einen Expressionsvektor, der das Gen enthält, eine Zelltransformante, die mit dem Expressionsvektor transfiziert ist, und ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins vom natürlichen Typ, wobei diese verwendet wird/werden. Spezieller betrifft die Erfindung ein Gen, codierend für Aminopeptidase, welches/welche kloniert und unter Verwendung der DNA-Rekombinationstechnik hergestellt wird/werden, einen Expressionsvektor, der das Gen enthält, eine Zelltransformante, die mit dem Expressionsvektor transfiziert ist und eine rekombinante Aminopeptidase, die nötig ist, um rekombinantes humanes Wachstumshormon in einem bzw. als ein Protein vom natürlichen Typ zu produzieren und die bei hoher Ausbeute stabiler und vorteilhafter, verglichen mit herkömmlichen Verfahren zur Aufreinigung, exprimiert werden kann.
STAND DER TECHNIK
Allgemein werden rekombinante Proteine als nicht natürliche Typen bzw. Arten hergestellt, wenn sie in großem Maßstab durch die genetische Manipulation von Mikroben exprimiert werden. Im Detail werden die meisten der rekombinanten Proteine mit einem Initiator, Methionin (MET), am Aminoterminus hergestellt, wobei eine unzweckdienliche Behandlung erfolgt. Die rekombinanten Proteine, die Methionin am Aminoterminus enthalten, können immunogene Reaktionen induzieren oder instabil werden, so dass sie, in dem Fall, dass sie an Menschen oder andere Tiere verabreicht werden, nicht die intrinsische Rolle des Proteins spielen. Daher ist es sehr wichtig, ein neues Verfahren zur Herstellung eines derartigen rekombinanten Proteins als sein Protein vom natürlichen Typ zu entwickeln (siehe Nature, 1987, 326, 315; J. Bacteriol., 1987, 169, 751–757; Bio/Technology, 1990, 8, 1036–1040; Appl. Microbiol. Biotechnol., 1991, 36, 211–215).
Humanes Wachstumshormon ist ein Polypeptid-Hormon, welches ein Molekulargewicht von 22.125 Da aufweist, eine Sequenz Phe-Pro-Thr am Aminoterminus enthält und aus 191 Aminosäuren besteht, sezerniert wird aus der menschlichen Hypophyse und hauptsächlich dazu verwendet wurde, um hypophysären Zwergwuchs zu behandeln (siehe Raben, M. S., J. Clin. Endocr., 1958, 18, 901). Bis zum jetzigen Zeitpunkt ist humanes Wachstumshormon aus Hypophysen von Toten extrahiert und gereinigt worden, jedoch ist eine Bereitstellung für alle Patienten aufgrund der einschränkten Versorgung kaum möglich. Vor kurzem sind mehrere Studien hinsichtlich der Expression und Abtrennung des humanen Wachstumshormons aus Escherichia coli, Hefe und dergleichen mittels Genmanipulation durchgeführt worden. Tatsächlich ist das mittels DNA-Technologie hergestellte humane Wachstumshormon für klinische Anwendungen eingesetzt worden (im Falle von Escherichia coli siehe koreanische Patentveröffentlichungen Nr. 89-1244 und Nr. 87-701 ; offengelegte koreanische Patente Nr. 87-2258 und Nr. 84-8695 ; im Falle von Hefe siehe koreanische Patentveröffentlichung Nr. 92-99 ; offengelegte koreanische Patente Nr. 90-9973 und Nr. 90-9976 ).
Jedoch ist, falls humanes Wachstumshormon mittels Anwendung der oben beschriebenen DNA-Rekombinationstechnologie hergestellt wird, ein Methioninrest, ein Startcodon für die Proteinsynthese, zusätzlich an den Aminoterminus gebunden, abgesehen von den 191 Aminosäureresten, die in humanem Wachstumshormon vom natürlichen Typ vorhanden sind. Somit wird ein hu manes Methionylwachstumshormon hergestellt, das ausgehend von der Sequenz Met-Phe-Pro-Thr des Aminoterminus begonnen wird und aus 192 Aminosäureresten besteht. Das humane Methionylwachstumshormon weist die gleichen biologischen Aktivitäten auf wie das humane Wachstumshormon vom natürlichen Typ (Moore, J. A., Endocrinology, 1988, 122, 2920–2926) und es wurde noch nicht berichtet, dass Nebenwirkungen durch das Vorhandensein des Methionins am Aminoterminus hervorgerufen werden. Jedoch könnten in seltenen Fällen aufgrund des Methionins Antikörper gebildet werden und es wird berichtet, dass sie in einem höheren Verhältnis gebildet werden als jene, ausgehend vom Hormon vom natürlichen Typ (Lancet, 29. März 1986, 697).
Folglich gibt es mehrere Ansätze zur Produktion eines Hormons vom natürlichen Typ, welches das Methionin nicht enthält. Konkret ist humanes Wachstumshormon mittels eines Verfahrens produziert worden, indem der Aminoterminus mit dem Carboxyterminus eines weiteren Proteins fusioniert wird; dann erfolgt ein Verdau unter Verwendung einer spezifischen Protease (siehe internationale PCT-Anmeldung WO 89/12678 ; europäische Patentanmeldung EP 20209 ; europäisches Patent EP 321940 ); und mittels eines weiteren Verfahrens, welches (1) Exprimieren des Wachstumshormons in Zellen; (2) Verdauen bzw. Abbau des Methioninrests während der Sekretion bzw. Sezernierung aus den Wirtszellen und (3) Erhalten eines humanen Wachstumshormons vom natürlichen Typ aus dem Kulturmedium umfasst (siehe europäisches Patent EP 008832 ; US-Patent USP 4755465 ; japanisches Patent JP 01273591 ; europäische Patentanmeldung EP 306673 ; koreanische Patentanmeldung Nr. 92-10932 ). Jedoch bestehen bei den oben dargelegten Verfahren einige Nachteile. Genauer gesagt ist eine komplizierte Konstruktion neuer Expressionsvektoren und sind Stufen der Transformation von Wirtszellen und gleichzeitig das Optimieren der Expressionsbedingungen mit zusätzlichen Versuchen nötig.
Andererseits kann die Aminopeptidase, im Falle dass das exogene Protein, produziert mittels Anwendung von DNA-Rekombinationstechnologien, eine zusätzliche Aminosäure am Aminoterminus einschließt, genutzt werden, um die zusätzliche Aminosäure zu entfernen. Als Ergebnis kann das exogene Protein, das die gleiche Struktur wie das Protein vom natürlichen Typ aufweist, leicht erhalten werden. Konkret kann eine spezifische Aminopeptidase, welche nur einen Methioninrest, vorhanden am Aminoterminus des humanen Methionylwachstumshormons, aufgereinigt mittels konventioneller Verfahren, abschneidet bzw. entfernt, verwendet werden, um ein humanes Wachstumshormon vom natürlichen Typ zu produzieren (siehe internationale PCT-Anmeldungen WO 86/04609 und WO 86/204527 A1 ).
Gegenwärtig ist gezeigt worden, dass verschiedene Arten von Aminopeptidasen zu einem humanen Wachstumshormon vom natürlichen Typ führen. Im Detail wurden beschrieben: Die aus Aeromonas proteolytica gereinigte Aminopeptidase (siehe internationale PCT-Anmeldung WO 86/01229 ; europäisches Patent EP 0489711 , A3, BTG Company; Prescott und Willks, Method in Enzymology, 1976, 44, 530–543), die aus Schweineniere gereinigte Aminopeptidase (siehe internationale PCT-Anmeldung WO 86/204527 A1 ; Bio/Technology, 1987, 5, 824–827, Takeda Company), die aus Dictyostelium discoidium gereinigte Dipeptidylaminopeptidase (siehe europäisches Patent EP 557076 ; US-Patent USP 5126249 , A1, Eli Lilly Company) und die Aminopeptidase aus Streptomyces thermonitripican.
Um die oben genannte Aufgabe zu lösen, sollte die Aminopeptidase nicht auf die Aminosäuresequenz eines Proteins vom natürlichen Typ einwirken, obgleich sie unnötige Aminosäurereste entfernt, die am Aminoterminus des rekombinanten Proteins vorhanden sind. Insbesondere sollte die Aminopeptidase, wenn das ursprüngliche Protein eine Aminosäuresequenz, beginnend am X-Y-Z am Aminoterminus aufweist und das rekombinante Protein die Aminosäuresequenz Met-X-Y-Z-, enthaltend ein zusätzliches Methionin am Aminoterminus, aufweist, nur den Methioninrest entfernen und danach nicht auf weitere Aminosäuren (X-Y-Z-) einwirken, so dass das rekombinante Protein produziert wird, das die gleiche Aminosäuresequenz aufweist, wie das Protein vom natürlichen Typ. Daher sollte die Aminopeptidase, die eine derartige Aufgabe erfüllt, hinsichtlich ihrer Substratspezifität, abhängig vom Zielprotein, für industrielle Anwendungen kompatibel sein. Obgleich das Enzym ein derartiges Merkmal aufweist, ist es vorteilhaft, wenn es selbst höhere intrinsische Aktivitäten aufweist.
Gegenwärtig sind mehrere zehn Aminopeptidasen aus Mikroben und dergleichen extrahiert und offenbart worden. Allgemein benötigen die meisten Enzyme Metallionen, wie Calcium, Zink oder dergleichen, zur Aktivierung. Diese Aminopeptidasen weisen verschiedene Merkmale hinsichtlich des Molekulargewichts, essentieller Metallionen, optimaler Bedingungen für die Reaktion, Substratspezifität usw. entsprechend der Mikroben auf, obgleich sie gemeinsame Aktivitäten hinsichtlich des Verdaus bzw. Abbaus von Aminosäureresten am Aminoterminus des Proteins aufweisen (siehe FEMS Microbiol. Rev., 1996, 18, 319–344). Eine derartige Aminopeptidase wird als Exopeptidase klassifiziert und weist die Eigenschaft, eine Aminosäure aus dem Aminoterminus eines Substratproteins in Reihe zu isolieren, auf.
Genauer gesagt sind diese Aminopeptidasen beschrieben und abgetrennt worden, insbesondere ausgehend von: Bacillus sp., zum Beispiel Bacillus subtilis (siehe Arch. Biochem. Biophys., 1979, 197, 63–77; Arch. Biochem. Biophys., 202, 540–545, 1980; J. Biochem., 1994, 107, 603–607; japanisches Patent JP 03285684 , Diacel-Chem Company), Bacillus stearothermophilus (siehe Meth. Enzymol., 1970, 19, 544–552; Biochem. Bi ophys. Acta, 1976, 438, 212–220; europäisches Patent EP 101653 , Unitika Company), Bacillus thuringensis (Biokhimiya, 1984, 49, 1899–1907), Bacillus licheniformis (Arch. Biochem. Biophys., 1978, 186, 383–391; Mikrobiol. Zh., 1989, 51, 49–52) und so weiter.
In den oben genannten Referenzen wurden die Aminopeptidasen gereinigt und auf ihre enzymatischen Eigenschaften unter Verwendung von Leucin-p-nitroanilid und mehreren Dipeptiden oder dergleichen als Substrat untersucht. Jedoch wurden Oligopeptide, beginnend mit der Sequenz Met-X-Pro an den Aminotermini, oder Proteine, beginnend mit Met-X-Pro an den Aminotermini, nicht als Substrat verwendet, um enzymatische Aktivitäten zu messen. Es ist daher noch nicht verifiziert, ob diese Aminopeptidasen zur Methioninentfernung bei rekombinanten Proteinen, enthaltend eine Met-X-Pro-Sequenz an ihren Aminotermini, eingesetzt werden könnten.
Ferner sind von Bacillus licheniformis stammende Aminopeptidasen wie folgt beschrieben worden. Rodriguez et al. haben die Aminopeptidase, stammend von Bacillus licheniformis ATCC 12759, gereinigt und deren enzymatische Eigenschaften untersucht. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben auch das Verfahren zur Herstellung eines humanen Wachstumshormons vom natürlichen Typ unter Verwendung der von Bacillus licheniformis stammenden Aminopeptidase, die Charakterisierung der gereinigten Aminopeptidase hinsichtlich ihrer enzymatischen Eigenschaften und ihrer Aminosäuresequenz am Aminoterminus offenbart (offengelegtes koreanisches Patent Nr. 1998-071239 ). In dieser Erfindung haben die Erfinder zur Herstellung eines Proteins vom natürlichen Typ in großem Maßstab durch DNA-Rekombinationstechnologien beschrieben, dass die Aminopeptidase nur den Methioninrest in synthetischen Substraten, Oligopeptiden, Proteinen und dergleichen entfernen kann und die spezifische Aminosäuresequenz Met-X-Pro erkennt (im Folgenden bezeichnet X eine beliebige Aminosäure, ungeachtet ihrer Art) und somit für die Produktion des humanen Wachstumshormons vom natürlichen Typ geeignet ist (offengelegtes koreanisches Patent Nr. 1998-071239 ). Diese konventionellen Verfahren haben gezeigt, dass die Aminopeptidase ausgehend von Bacillus licheniformis produziert und zur Produktion eines rekombinanten Proteins vom natürlichen Typ genutzt werden kann. Daneben haben sie nur die Information über die partielle Aminosäuresequenz des Aminoterminus bereitgestellt und das gesamte Gen der Aminopeptidase ist noch nicht bestimmt worden.
Folglich haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung versucht, eine neue Aminopeptidase zur Herstellung eines rekombinanten Proteins vom natürlichen Typ zu erhalten. Konkret haben die Erfinder ein Gen für Aminopeptidase, stammend von Bacillus licheniformis, kloniert, dessen/deren Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz bestimmt und das klonierte Aminopeptidasegen in rekombinanten Bakterienstämmen exprimiert. Dann wurde das rekombinante Protein als Aminopeptidaseaktivitäten aufweisend, als nützlich für die einfache Verwendung in anderen enzymatischen Reaktionen sowie für die Herstellung von Proteinen vom natürlichen Typ identifiziert. Folglich ist die vorliegende Erfindung erfolgreich abgeschlossen worden.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue von Bacillus licheniformis stammende Aminopeptidase, ein Gen, das für die Aminopeptidase codiert, einen Expressionsvektor, der das Gen enthält, eine Zelltransformante, die mit dem Expressionsvektor transfiziert ist, und ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins vom natürlichen Typ, wobei diese verwendet wird/werden, bereitzustellen, welche(s) zur Herstellung eines rekombinanten Proteins verwendet sowie nützlich auf andere enzymatische Reaktionen angewendet werden kann. Um die oben beschriebene Aufgabe zu lösen, stellt die vorliegende Erfindung eine von Bacillus licheniformis stammende Aminopeptidase bereit.
Genauer enthält die Aminopeptidase eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Aminosäuresequenz mit der Vollänge von SEQ ID NO: 1 und die Aminopeptidase nach Anspruch 2, welche eine Aminosäuresequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Aminosäuresequenzen, die partiell am Aminoterminus der Aminosequenz mit der Volllänge von SEQ ID NO: 1 zwischen Alanin 30 und Alanin 31 („in between 30th alanine and 31st alanine"), zwischen Lysin 39 und Asparagin 40, zwischen Asparagin 40 und Valin 41, zwischen Valin 41 und Glutamin 42 oder zwischen Glutamin 42 und Lysin 43 deletiert sind.
Daneben enthält die Aminopeptidase eine Aminosäuresequenz, die am Carboxyterminus partiell zwischen Serin 443 und Thyrosin 444 von SEQ ID NO: 1 deletiert ist.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung ein Gen bereit, codierend für die von Bacillus licheniformis stammende Aminopeptidase.
Genauer enthält das für die Aminopeptidase codierende Gen eine Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Nucleotidsequenz mit der Volllänge von SEQ ID NO: 2, oder eine Nucleotidsequenz, ausgewählt aus der Sequenzgruppe, die die Nucleotidsequenzen umfasst, deletiert auf einer oder mehreren der Nucleotidsequenz mit der Volllänge von SEQ ID NO: 2.
Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung den Expressionsvektor pLAP132 bereit, der das Gen, das für die Aminopeptidase codiert, mit der Nucleotidsequenz in der Volllänge von SEQ ID NO: 2 enthält.
Daneben stellt die vorliegende Erfindung die Escherichia coli-Transformante XLOLR/LAP132 bereit, die mit dem Expressionsvektor pLAP132 transformiert ist (Eingangsnummer: KCTC 1000 BP).
Ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins vom natürlichen Typ bereit, das die folgenden Stufen umfasst: (1) Stufe der Reinigung des rekombinanten Proteins, das eine Met-X-Pro-Sequenz am Aminoterminus enthält; (2) Stufe der Zugabe der Aminopeptidase nach Anspruch 1, 2 oder 3 zu dem Reinigungsgemisch; und (3) Stufe des Verdaus der Met-X-Pro-Sequenz am Aminoterminus des rekombinanten Proteins durch Anwendung der Aminopeptidase.
Hierbei kann das X von Met-X-Pro eine beliebige Art von Aminosäure sein.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Die oben beschriebenen und andere Aufgaben, Merkmale und andere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden ausgehend von der folgenden detaillierten Beschreibung klarer verstanden werden, wenn sie im Zusammenhang mit den begleitenden Figuren gesehen werden, in denen:
1 die Bestimmung von Aminosäuresequenzen in Peptidfragmenten der Aminopeptidase, erhalten nach Behandlung mit Trypsin, darstellt;
2 die Analyse der Aminopeptidase, stammend bzw. abgeleitet von Bacillus licheniformis und exprimiert von einer Escherichia coli-Transformante, mittels Durchführung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese darstellt;
3 die Analyse der Aminopeptidase, stammend bzw. abgeleitet von Bacillus licheniformis und exprimiert von einer Bacillus subtilis-Transformante, mittels Durchführung von SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese darstellt;
4 die Untersuchung von enzymatischen Aktivitäten der Aminopeptidase, stammend bzw. abgeleitet von Bacillus licheniformis und exprimiert durch eine Bacillus subtilis-Transformante, schematisch darstellt.
BESTE WEISE ZUR AUSFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung wie folgt deutlicher erläutert.
Es wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäße Aminopeptidase enzymatische Aktivitäten in einem Polypeptidzustand vor Nicht-Deletion des Signalpeptids (die Sequenz, bestehend aus der 1. Aminosäure bis zur 30. Aminosäure in SEQ ID NO: 1) und nach Deletion des Signalpeptids besitzt. Obgleich einige Aminosäuren am Aminoterminus und am Carboxyterminus zusätzlich zur Deletion des Signalpeptids entfernt sind, bleiben die enzymatischen Aktivitäten erhalten. Daher liegen die Aminopeptidase, enthaltend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, sowie die Aminopeptidasen, die partiell am Aminoterminus oder am Carboxyterminus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 deletiert sind, innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung.
Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Aminopeptidase die Aminosäuresequenz, die partiell am Aminoterminus deletiert ist, zwischen Alanin 30 und Alanin 31, zwischen Lysin 39 und Asparagin 40, zwischen Asparagin 40 und Valin 41, zwischen Valin 41 und Glutamin 42 oder zwischen Glutamin 42 und Lysin 43 von SEQ ID NO: 1. Stärker bevorzugt enthält die Aminopeptidase die Aminosäuresequenz, die partiell am Aminoterminus zwischen Alanin 30 und Alanin 31, zwischen Glutamin 42 und Lysin 43 deletiert ist.
Vorzugsweise enthält die erfindungsgemäße Aminopeptidase die Aminosäuresequenz, die partiell am Carboxyterminus zwischen Serin 443 und Tyrosin 444 von SEQ ID NO: 1 deletiert ist.
Stärker bevorzugt enthält die Aminopeptidase die Aminosäuresequenz, die partiell am Aminoterminus zwischen Glutamin 42 und Lysin 43 von SEQ ID NO: 1 und am Carboxyterminus zwischen Serin 443 und Tyrosin 444 von SEQ ID NO: 1 deletiert ist.
Indessen können die erfindungsgemäßen Gene, codierend für die von Bacillus licheniformis stammende bzw. abgeleitete Aminopeptidase, das Gen, codierend für die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, das Gen, codierend für die gesamte deletierte Form der Aminopeptidase, wie oben genannt, und das Gen von SEQ ID NO: 2 umfassen.
Um Funktionen und enzymatische Aktivitäten der Aminopeptidase zu untersuchen, wird die folgende Verfahrensweise bewerkstelligt, wobei das Protein, enthaltend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1, dessen Gene bzw. dessen Polypeptide in einer deletierten Form verwendet werden. Um aufzuklären, ob Polypeptide enzymatische Aktivitäten der von Bacillus licheniformis stammenden Aminopeptidase aufweisen, wird ein Gen, das für die Aminopeptidase codiert, aus der chromosomalen DNA von Bacillus licheniformis kloniert. Konkret werden zum Klonieren von Genen Polypeptide mit den enzymatischen Aktivitäten der Aminopeptidase, stammend von Bacillus licheniformis, gereinigt, mit Trypsin verdaut, um so eine Anzahl von Peptidfragmenten zu gewinnen, und dann werden die Aminosäuresequenzen bestimmt. Die Information der Aminosäuresequenzen wird genutzt, um Oligonucleotide zur Verwendung als Primer zu synthetisieren und dann DNA-Fragmente, die einem Teil des Aminopeptidasegens entsprechen, amplifiziert. Danach kann, durch Einsatz dieser DNA-Fragmente als Sonden, das Aminopeptidasegen ausgehend von der von Bacillus licheniformis abgeleiteten chromosomalen Bibliothek gefunden werden.
Die Gene der Aminopeptidase, die oben betrachtet wurden, werden mittels eines DNA-Sequenzanalysengeräts untersucht, um die Nucleotidsequenz festzustellen, wie sie in SEQ ID NO: 2 gezeigt ist. Es wurde festgestellt, dass die aus der genetischen Information von SEQ ID NO: 1 abgeleitete DNA-Sequenz genau die gleiche Aminosäuresequenz aufweist, wie die aus natürlichen Wirtszellen gereinigte Aminopeptidase. Im Ergebnis wurde das gemäß der vorliegenden Erfindung erhaltene Aminopeptidasepolypeptid unter Verwendung einer Datenbank für genetische Informationen durchmustert. Dieses Gen wurde als neue DNA-Sequenz identifiziert, die nie zuvor beschrieben wurde und die enzymatischen Aktivitäten der Aminopeptidase aufweist, wenn es in rekombinanten Mikroben exprimiert wird.
Dann wurde festgestellt, dass die reife bzw. gereifte Aminopeptidase partiell verdaut ist. Um die Zusammensetzung der Aminopeptidase am Carboxyterminus festzustellen, wurden die Aminopeptidase, gereinigt aus der rekombinanten bakteriellen Transformante, und die Aminopeptidase, gereinigt aus natürlichen Wirtszellen, Bacillus licheniformis, untersucht, um die Molekulargewichte mittels Massenspektrometrie zu bestimmen. In der Folge wurde in beiden Fällen festgestellt, dass sechs Aminosäurereste am Carboxyterminus fehlten.
Es wurde bestätigt, dass die erfindungsgemäße Aminopeptidase reift bzw. reif wird, dass die Aminopeptidase in den Zellen exprimiert wurde und dann das Signalpeptid am Aminoterminus während der extrazellulären Sekretion deletiert wurde. Daneben ist die reife Aminopeptidase auch partiell verdaut.
Folglich behält das erfindungsgemäße Aminopeptidasepolypeptid enzymatische Aktivitäten bei Vorhandensein des Signalpeptids und selbst bei partieller Verkürzung am Aminoterminus oder am Carboxyterminus bei Fehlen des Signalpeptids bei.
BEISPIELE
Praktische und gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind, wie in den folgenden Beispielen gezeigt, erläuternd.
Jedoch wird verstanden werden, dass Fachleute bei Betrachtung dieser Offenbarung Modifikationen und Verbesserungen innerhalb des Gedankens und Rahmens der vorliegenden Erfindung machen können.
<Beispiel 1> Klonierung des von Bacillus licheniformis stammenden Aminopeptidasegens
(1-1) Partielle Bestimmung der Aminosäuresequenz in aus Bacillus licheniformis gereinigter Aminopeptidase
Die vorliegenden Erfinder haben die folgende Verfahrensweise durchgeführt, um Aminopeptidaseprotein aus Bacillus licheniformis zu reinigen.
Sterilisierte Medien, enthaltend 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl pro 1 l wurden in Kolben hergestellt und der Bacillus licheniformis-Stamm KCTC 3058 wurde inokuliert, um für eine Impfkultur bei 40°C, 120 U/min für etwa 16 kultiviert zu werden. Die oben erhaltene Impfkulturbrühe wurde wiederum in neue Medien inokuliert und bei 40°C, 200–400 U/min Bewegung, mehr als 30 gelöster Sauerstoff, kultiviert. Dann wurden die Glucosekonzentrationen bei einem stündlichen Intervall gemessen und die Kultivierung war abgeschlossen, als die Aktivität von Aminopeptidase mehr als 35 U/ml erreichte. Um Zellen zu kultivieren, wurde eine Kulturbouillon, enthaltend 2 kg Pepton, 6 kg Hefeextrakt, 4 kg Kaliumphosphat, 1 kg NaCl, SAG, 15 g MgSO₄·7H₂O, 1,53 g FeSO₄·7H₂O, 1,53 g ZnSO₄·7H₂O, 1,53 g MnSO₄ und 10 kg Glucose pro 200 l destilliertes Wasser, in einem 400 l Fermentor in sterilisiertem Zustand hergestellt. Nachdem die Kultivierung abgeschlossen war, wurde eine kontinuierliche Zentrifuge zur Entfernung von Zelldebris eingesetzt und die Überstände wurden gewonnen. Der oben erhaltene Überstand wurde mit einem Konzentrator konzentriert bzw. eingeengt und ZnSO₄ wurde bis zum Erreichen von etwa 0,3 mM zugegeben. Durch drei Stufen der Säulenchromatographie wurde Aminopeptidase aus der konzentrierten Lösung gereinigt. Zur Chromatographie wurden SP-Sepharose FF, Sephacryl S-200 und DEAE-Sepharose FF im Wechsel verwendet. Es wurde festgestellt, dass die unter Anwendung der obigen Verfahrensweise gereinigte Aminopeptidase mehr als 95 Prozent Reinheit aufwies, als mit Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie analysiert wurde.
Die erhaltene Aminopeptidase wurde unter Verwendung von 10% Trichloressigsäure (TCA) präzipitiert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Das getrocknete Proteinpräzipitat wurde mit 8 M Harnstoff und 0,4 M Ammoniumbicarbonat gelöst und mit Dithiothreitol (DTT) und Iodacetamid im Wechsel behandelt, so dass die Disulfidbindungen in der Aminopeptidase gespalten wurden. Die behandelte Probe wurde wiederum in destilliertem Wasser gelöst, es wurden etwa 0,05 mg Trypsin pro 2 mg Amino peptidase zugegeben und die Behandlung erfolgte für etwa 8 Stunden bei 37°C. Die mit Trypsin behandelte Probe wurde in die Umkehrphase-Hochdruckchromatographie (RP-HPLC) injiziert und Fraktionen der größeren bzw. Hauptpeptidpeaks gesammelt. In der Umkehrphasenchromatographie wurde eine Umkehrphasensäule vom Typ Vydac C18 eingesetzt und ein linearer Konzentrationsgradient unter Verwendung von Lösungsmittel A (hochgradig gereinigtes Wasser, enthaltend 0,05% Trifluoressigsäure (TFA)) und Lösungsmittel B (hochgereinigtes Wasser, enthaltend 0,05% TFA und 80% Acetonitril), wurde angewendet. Dabei wurde die Analyse bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min durchgeführt und das Chromatogramm wurde mittels UV-Absorption bei 214 nm erhalten. Durch diese Verfahrensweise wurden mehr als 10 Peaks erhalten. Die erhaltenen Peptidproben wurden jeweils mit einem Massenspektrometer analysiert und Peptide, die aus mehr als 15 Aminosäuren bestanden, wurden ausgewählt. Die Aminosäuresequenz der ausgewählten Probe(n) wurde mittels eines Aminosäuresequenzanalysengeräts bestimmt. 1 stellt die Aminosäuresequenz ausgewählter Peptide unter Verwendung eines Buchstabens zur Bezeichnung einer Aminosäure dar. Jedes Peptid wurde in der Reihenfolge willkürlich gemäß der Elutionszeit in der Umkehrphasenchromatographie nummeriert und der mit einem Pfeil in 1 dargestellte Teil wurde als Information zum Synthetisieren der Primer aus Ribonucleotiden verwendet. Es wurde gefolgert, dass die Probe, die innerhalb dieser Peptidproben als T4 bezeichnet wurde, zwei verschiedene Peptide gleichzeitig enthielt, da zwei Aminosäuren gleichzeitig in jedem Zyklus bei der Durchführung der Aminosäuresequenzanalyse auftraten. Daneben ist die gleiche Aminosäuresequenz innerhalb dieser Peptidproben zwischen T6 und T9, T11 und T13 und T16 und T17 enthalten. Genauer ist T4 in SEQ ID NO: 4 und 5, T6 in SEQ ID NO: 6, T7 in SEQ ID NO: 7, T9 in SEQ ID NO: 8, T11 in SEQ ID NO: 9, T13 in SEQ ID NO: 10, T16 in SEQ ID NO: 11, T17 in SEQ ID NO: 12 beschrieben, die jeweils unabhängig im Sequenzprotokoll offenbart sind.
(1-2) Klonierung des Aminopeptidasegens und Bestimmung der Nucleotidsequenz
Unter Verwendung der in Beispiel 1 (1-1) aufgeklärten Peptiddaten wurden Oligonucleotidprimer für die PCR von Aminopeptidasegenen synthetisiert. Genauer wurden der 5'-stromaufwärtige Primer (LAP-5), beschrieben in SEQ ID NO: 13, und der 3'-stromabwärtige Primer (LAP-3), beschrieben in SEQ ID NO: 14, eingesetzt, wobei diese unter Verwendung der Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16 beschrieben sind, aus den in Beispiel 1 (1-1) bestimmten Aminosäuresequenzen hergestellt wurden. Eine PCR wurde unter 32-facher Wiederholung mit einem DNA-Thermocycler durchgeführt; Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden, Annealing bei 40°C für 45 Sekunden und Verlängerung bei 72°C für 1 Minute. Dabei wurde chromosomale DNA vom Bacillus licheniformis als Matrize verwendet. Im Ergebnis wurde ein DNA-Fragment mit einer Größe von etwa 390 bp erhalten.
Währenddessen wurde genomische DNA von Bacillus licheniformis unter Anwendung des Verfahrens nach Murray und Thompson hergestellt und partiell mit dem Restriktionsenzym Sau3A verdaut und durch ein 0,8%iges Agarosegel aufgetrennt. Dann wurden die 2∼3 kb entsprechenden DNA-Fragmente isoliert. Die DNA-Fragmente wurden ligiert in den Expressionsvektor λ ZAP (Stratagene, LaJolla, USA), verdaut mit BamHI, und dem Verpackungsextrakt („packaging extract") zugegeben. Dann wurde das Verpackungsgemisch auf E. coli XL-1 Blue MRF' transferiert. Der oben hergestellte Bibliotheksfilter („library filter") wurde unter Verwendung des ³²P-markierten PCR-Fragments durchmustert und es wurden Klone, die das Aminopeptidasegen enthielten, detektiert. Im Ergebnis wurde verifiziert, dass der ausgewählte Klon das DNA-Insert mit einer Größe von etwa 2,6 kb umfasst und er wurde als „LAP 132"-Klon bezeichnet.
Die Nucleotidsequenz von LAP 132 wurde analysiert und das Ergebnis wurde in SEQ ID NO: 2 beschrieben. Im Detail bestand es aus dem ATG-Startcodon, beginnend am Nucleotid 192, und dem TAA-Stoppcodon bei 1539 und enthielt ein ORF (offenes Leseraster) von 1.347 bp, wie in SEQ ID NO: 2 und in SEQ ID NO: 3 gezeigt. Es wurde festgestellt, dass Nucleotid(sequenz) 449 Aminosäuren codiert. Die Aminosäuresequenz, codiert durch die oben aufgeklärte Nucleotidsequenzinformation, war vollständig identisch zu dem Ergebnis, das mittels der Aminosäuresequenzanalyse von Peptidfragmenten, die von der oben gereinigten Aminopeptidase stammten, erhalten wurde. Die Domäne des Aminoterminus der Aminopeptidase gemäß der vorliegenden Erfindung enthielt hydrophobe Aminosäurereste, benachbart zu kationischen Aminosäureresten, was ähnlich zu der zur Sekretion benötigten Signalsequenz war. Somit wurde gefolgert, dass die Aminopeptidase bei der Sekretion zwischen Alanin 30 und Alanin 31 verdaut bzw. gespalten wurde. Im offengelegten koreanischen Patent Nr. 1998-071239 wurde eine Aminopeptidase offenbart, deren Aminoterminus hauptsächlich bei bzw. ab Aminosäuresequenzen beginnt, die in SEQ ID NO: 17 beschrieben sind, und Aminopeptidaseformen heterogenen Typs, deren Spaltstellen bzw. gespaltete Stellen („cleaved sites") in gewissem Umfang zur vorliegenden Erfindung verschieden sind. Es wurde gefolgert, dass dieser Unterschied durch Verdau mit einer anderen extrazellulären Protease hervorgerufen wurde, nachdem die Aminopeptidase von den ursprünglichen Stämmen sekretiert worden war. Die erfindungsgemäße Aminopeptidase wurde hinsichtlich der Aminosäuresequenz mit anderen Aminopeptidasen, die in Genebank aufgezeichnet sind, verglichen, indem eine BLAST-Recherche angewendet wurde. Im Ergebnis wurde gezeigt, dass sie eine 62%ige Homologie mit der von Bacillus subtilis stammenden Aminopeptidase und eine 58% Homologie mit der von Bacillus halodurans stammenden Aminopeptidase aufweist. Die erfindungsgemäße Aminopeptidase wurde als eine neue Aminopeptidase, die zuvor nicht beschrieben worden war, identifiziert.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben den E. coli-Stamm XLOLR mit dem Aminopeptidasegen „LAP 132", das aus Bacillus licheniformis stammt, transformiert und ihn als „E. coli XLOLR/LAP 132" bezeichnet. Die Hinterlegung erfolgte bei der Internationalen Hinterlegungsstelle, der Korean Collection for Type Cultures (KCTC) des Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Republik Korea, am 26. April 2001, wobei die Eingangsnummer KCTC 1000 BP vergeben wurde.
<Beispiel 2> Genexpression von Aminopeptidase in einer Escherichia coli-Transformante
Das klonierte Aminopeptidasegen gemäß der vorliegenden Erfindung wurde in den Expressionsvektor pBK-CMV (Stratagene, USA) subkloniert und (dieser) als Expressionsvektor „pLAP32" bezeichnet, um als Quelle des Aminopeptidasegens verwendet zu werden. Dann wurde das PCR-Fragment mit einer Größe von etwa 1,2 kb, enthaltend eine Region, die für Aminopeptidase codiert, in den Vektor pET11a (Stratagene, USA) subkloniert und (dieser) wurde als Expressionsvektor pETLAP45 bezeichnet. E. coli BL21(DE3) wurde mit dem Expressionsvektor transformiert und zur Expression eines fusionierten Proteins unter Anheftung eines His-tag-Peptids genutzt. Die Expression der Aminopeptidase im oben beschriebenen Expressionssystem wurde mittels Durchführung von SDS-PAGE verifiziert. Wie in 2 erläutert, wurde festgestellt, dass das Molekulargewicht der Aminopeptidase etwa 45 kDa bei SDS-PAGE erreichte und iden tisch zu dem war, das von seinem Gen abgeleitet wurde. In 2 stellt die Bahn M einen Standardmarker für Molekulargewichte dar; Bahn 1, E. coli, transformiert mit dem Expressionsvektor pET11a (die Expression nicht induzierend); Bahn 2, E. coli, transformiert mit dem Expressionsvektor pET11a (die Aktivierung des T7-Promotors induzierend); Bahn 3, E. coli, transformiert mit dem Expressionsvektor pETLAP45 (die Expression nicht eingeschlossen); und Bahn 4, E. coli, transformiert mit dem Expressionsvektor pETLAP45 (die Aktivierung des T7-Promotors induzierend). Der in 2 dargestellte Pfeil bezeichnet die Aminopeptidase.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben versucht, Enzymaktivitäten der Aminopeptidase, sekretiert aus einer E. coli-Transformante, nach Expression des Gens zu detektieren. Insgesamt wurden, wenn die E. coli-Transformante (ultra)schallbehandelt und analysiert wurde, die Enzymaktivitäten der Aminopeptidase aus der E. coli-Transformante in löslichen Fraktionen gefunden. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäße Aminopeptidase die gleiche Größe aufweist, wie sie aus dem Gen abgeleitet wurde, und Enzymaktivitäten zeigt.
<Beispiel 3> Genexpression einer Aminopeptidase in einer Bacillus subtilis-Transformante, Sequenzanalyse der gereinigten Aminopeptidase am Aminoterminus und Bestimmung ihres Molekulargewichts
(3-1) Genexpression einer Aminopeptidase in einer Bacillus licheniformis-Transformante
In der vorliegenden Erfindung wies ein mit HindIII-SacI verdautes DNA-Fragment, enthaltend eine Region, die für Aminopeptidase codiert, sowie einen Promotor, eine 3'- untranslatierte Region, eine Größe von etwa 2,6 kb auf und wurde in den Bacillus-Vektor pRB373 subkloniert und der resultierende Expressionsvektor wurde mit pRB373-LAP bezeichnet. Bacillus subtilis wurde mit dem Expressionsvektor transformiert und kultiviert und die Kulturbrühe wurde dann unter Verwendung von SDS-PAGE analysiert. Ausgehend von der Kulturlösung wurde beobachtet, dass die Aminopeptidase sekretiert wurde und ein Molekulargewicht von etwa 45 kDa aufwies, was mit dem von bzw. aus Bacillus licheniformis kompatibel war (siehe 3). In 3 stellt die Bahn M einen Standardmarker für das Molekulargewicht dar; Bahn 1, Bacillus subtilis, transformiert mit dem Expressionsvektor pRB373; Bahn 2, Bacillus subtilis, transformiert mit dem Expressionsvektor pRB373-LAP; und Bahn 3, Aminopeptidase, gereinigt aus Bacillus licheniformis. Der in 3 dargestellte Pfeil bezeichnet die Aminopeptidase.
(3-2) Sequenzanalyse des Aminopeptidasepolypeptids am Aminoterminus, exprimiert durch eine Bacillus subtilis-Transformante
Um die Aminopeptidase aufzureinigen, wurde eine rekombinante Bacillus subtilis-Transformante, enthaltend das erfindungsgemäße Gen, kultiviert und die Kulturbrühe wurde unter Durchführung einer SP-Sepharose-Chromatographie aufgetrennt. Die Aminosäuresequenz am Aminoterminus der gereinigten Aminopeptidase wurde mittels des Aminosäureanalysengeräts bestimmt. Als Ergebnis wurde verifiziert, dass die Sequenz der Aminopeptidase am Aminoterminus heterogen war, wie in der von natürlichen Wirtszellen stammenden Aminopeptidase gefunden, und begann mit SEQ ID NO: 17 hauptsächlich unter jenen mit SEQ ID NO: 18. Auch die mit Asn, Val und Glu begonnene bzw. beginnende Aminopeptidase existierte.
(3-3) Bestimmung des Molekulargewichts des durch die rekombinante Bacillus subtilis-Transformante exprimierten Aminopeptidasepolypeptids
Die rekombinante Bacillus subtilis-Transformante, die das Aminopeptidasegen enthielt, wurde kultiviert und die Kulturbrühe wurde zur Aufreinigung der Aminopeptidase unter Anwendung einer SP-Sepharose-Chromatographie genutzt. Das Molekulargewicht der Aminopeptidase wurde mit Massenspektrometrie untersucht und als Ergebnis wurde das Vorliegen von Substanzen, entsprechend einem Molekulargewicht von 42.956 Da, 43.241 Da und 43.468 Da, festgestellt. Dieses Ergebnis wurde mit dem aus der Sequenzanalyse von Aminosäuren in Beispiel 3 (3-2) erhaltenen verglichen und es wurde gefolgert, dass zusätzliche sechs Aminosäuren am Carboxyterminus entfernt waren. Das heißt, das in SEQ ID NO: 1 beschriebene Polypeptid, (wobei) der Aminoterminus ab SEQ ID NO: 17 beginnt und der Carboxyterminus bei bzw. auf SEQ ID NO: 19 endet, wies ein theoretisches Molekulargewicht auf, das etwa 43.241 Da entsprach. Dann wies ein weiteres Polypeptid, dem ausgehend von den obigen zwei Aminosäuren hinzugefügt waren, ein Molekulargewicht auf, das 43.468 Da entsprach und das andere Polypeptid, das in 2 Aminosäuren deletiert war, wies ein Molekulargewicht auf, das 42.965 Da entsprach, was identisch war zu den exakt aus der Massenspektrometrie erhaltenen Ergebnissen.
Unterdessen wurde die aus einer natürlichen Wirtszelle, Bacillus licheniformis, gereinigte Aminopeptidase unter Verwendung von Massenspektrometrie durch die gleiche Verfahrensweise wie in Beispiel 1 (1-1) untersucht und das gleiche Ergebnis wie bei der rekombinanten Transformante wurde erhalten.
<Beispiel 4> Aktivitätsmessung (an) der Aminopeptidase und ihren deletierten Formen, exprimiert in einer rekombinanten E. coli-Transformante und Bacillus subtilis-Transformante
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Aminopeptidaseaktivität gemessen, wobei eine Zelllysatlösung, ultraschallbehandelt, im Falle der rekombinanten E. coli-Transformante verwendet wurde und eine in Beispiel 3 (3-1) erhaltene Kulturlösung im Falle der rekombinanten Bacillus subtilis-Transformante verwendet wurde.
Konkret wurde die Methode nach Pfleiderer eingesetzt, um die Enzymaktivitäten bzw. enzymatischen Aktivitäten der in Beispiel 2 und Beispiel 3 produzierten Aminopeptidase abzuschätzen (Pfleiderer, Meth. Enzymol., 1970, 19, 514–521). 50 μl Kulturlösung wurden einem Gemisch aus 1 M Tris (pH 8,5) (950 μl) und 0,1 M Leucin-p-nitroanilid (20 μl) in DMSO zugesetzt, für 3 Minuten bei 60°C umgesetzt, es wurden 100 μl 70%ige Essigsäure zugesetzt, die Reaktion beendet und die Absorption bei 405 nm detektiert.
Wie in 4 gezeigt, gab es einen klaren Unterschied zwischen dem Bacillus subtilis-Stamm, der mit dem Aminopeptidasegen transformiert war, und dem Bacillus subtilis-Stamm, der den Expressionsvektor enthielt. Zusätzlich bestand die aus rekombinanten Bacillus subtilis gereinigte Aminopeptidase gleichzeitig aus am Aminoterminus oder am Carboxyterminus deletierten Formen, wie in Beispiel 3 (3-2) und (3-3) gezeigt, und es wurde auch festgestellt, dass die Proben Enzymaktivitäten aufweisen. 4 ist eine Darstellung von pRB373-LAP, Bacillus subtilis, der mit dem Expressionsvektor, der das Aminopeptidasegen enthält, transformiert ist; darin stellt Δ LG, Bacillus subtilis, kultiviert in LB-Kulturbouillon, dar und ⧫ stellt pRB373, Bacillus subtilis, transformiert mit dem Expressionsvektor, der kein Aminopeptidasegen enthält, dar.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Wie deutlich gezeigt und oben bestätigt, wird gemäß der vorliegenden Erfindung das für die aus Bacillus licheniformis stammende Aminopeptidase codierende Gen kloniert und durch Verwendung einer rekombinanten bakteriellen Transformante exprimiert und es wird als neues nicht zuvor beschriebenes Gen identifiziert. Die gemäß der vorliegenden Erfindung gereinigte und aufgeklärte Aminopeptidase kann in nützlicher Weise benutzt werden, um rekombinante Proteine vom natürlichen Typ herzustellen, sowie weithin für andere Enzymreaktionen angewendet werden.

Claims

Aminopeptidase mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1.
Aminopeptidase nach Anspruch 1, die eine Aminosäuresequenz enthält, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend die Aminosäuresequenzen, die partiell am Aminoterminus der Aminosäuresequenz mit der Volllänge von SEQ ID NO: 1 zwischen Alanin 30 und Alanin 31, zwischen Lysin 39 und Asparagin 40, zwischen Asparagin 40 und Valin 41, zwischen Valin 41 und Glutamin 42 oder zwischen Glutamin 42 und Lysin 43 deletiert sind.
Aminopeptidase nach Anspruch 1 oder 2, die eine Aminosäuresequenz enthält, die am Carboxyterminus zwischen Serin 443 und Tyrosin 444 von SEQ ID NO: 1 partiell deletiert ist.
Gen, codierend für die Aminopeptidase nach Anspruch 1, 2 oder 3.
Gen nach Anspruch 4, das die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 enthält.
Expressionsvektor pLAP132, der das Gen, das für die Aminopeptidase codiert, umfassend die Nukleotidsequenz mit der Volllänge von SEQ ID NO: 2, enthält.
Escherichia-coli-Transformante XLOLR/LAP132, die mit dem Expressionsvektor pLAP132 transformiert ist (Eingangsnummer: KCTC 1000 BP).
Verfahren zur Herstellung eines Proteins vom natürlichen Typ, das die folgenden Stufen umfasst: (1) Stufe der Reinigung des rekombinanten Proteins, das eine Methionin-X-Prolin-Sequenz am Aminoterminus enthält; (2) Stufe der Zugabe der Aminopeptidase nach Anspruch 1, 2 oder 3 zu dem Reinigungsgemisch; und (3) Stufe des Verdaus der Methionin-X-Prolin-Sequenz am Aminoterminus des rekombinanten Proteins durch Anwendung der Aminopeptidase.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins vom natürlichen Typ nach Anspruch 8, in dem in der Methionin-X-Prolin-Sequenz eine beliebige Art von Aminosäure sein kann.