KR101482708B1 - 헤파린 결합 도메인을 포함하는 ｉｇｆｂｐ-5의 ｃ-말단 도메인의 신생 혈관 생성 억제제로서의 신규한 용도 - Google Patents
헤파린 결합 도메인을 포함하는 ｉｇｆｂｐ-5의 ｃ-말단 도메인의 신생 혈관 생성 억제제로서의 신규한 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 IGFBP-5(Insulin-like growth factor-binding protein 5)의 헤파린 결합 도메인(Heparin-binding domain)을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물, 상기 펩타이드를 이용하여 혈관신생을 억제하는 방법, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 펩타이드를 이용하여 암을 치료하는 방법, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인에서 유래된 신규한 혈관신생 억제 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환체에 관한 것이다.
Description
본 발명은 IGFBP-5(Insulin-like growth factor-binding protein 5)의 헤파린 결합 도메인(Heparin-binding domain)을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물, 상기 펩타이드를 이용하여 혈관신생을 억제하는 방법, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 펩타이드를 이용하여 암을 치료하는 방법, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인에서 유래된 신규한 혈관신생 억제 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환체에 관한 것이다.
IGFBP-5(Insulin-like growth factor-binding protein 5)는 IGF(insulin-like growth factor)결합 단백질 패밀리 중 하나이며, 세포증식을 비롯하여 여러 세포 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. IGFBP-5는 핵으로 위치하는 신호인 NLS(nuclear localization signal)를 가지고 있어 핵에 위치하며 또한 세포 밖으로 분비되는 단백질이다. 그러나, 아직까지 핵에서의 기능과 세포 밖으로 분비된 IGFBP-5의 기능이 아직 잘 연구되어있지 않다(Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 23;101(12):4314-9). 하지만 최근의 논문에서 핵에서의 IGFBP-5의 기능이 전사 촉진(transactivation) 기능을 가질 것으로 보고되었다.
구체적으로, IGFBP-5는 크게 3가지 영역, N-말단, L-도메인 및 C-말단으로 이루어져 있다. N-말단에는 IGF 결합 부위가 위치해 있고, C-말단에는 NLS가 위치하여 있다. 또한, L-도메인 및 C-말단 부위에는 헤파린 결합 부위(heparin binding site)가 존재한다. IGFBP-5의 글리코실화(glycosylation)와 인산화(phosphorylation)는 IGFBP-5의 헤파린 결합을 저해하는 것으로 알려져 있지만, 글리코실화 및 인산화의 정확한 생물학적 의미는 아직 밝혀지지 않았다. IGFBP-5의 작용 기전에 대하여 지금까지 알려진 바에 따르면, IGFBP-5는 IGF-I 또는 IGF-Ⅱ가 수용체에 결합하는 것을 방해함으로써 IGF-I, IGF-Ⅱ의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있으나, IGF-비의존적인 기능 역시 보고되고 있다. 또한, IGFBP-5의 형질전환 마우스(transgenic mice) 및 녹아웃 마우스(knockout mice)를 이용하여 연구한 결과에 따르면, IGFBP-5 형질전환 마우스의 경우 출생 후 치사율(neonatal mortality) 이 높고 성장저해 및 저조한 근육발달을 보였다. 또한 암컷의 경우 불임을 보였으며 유선발달에 있어서 조기 세포 사멸(premature cell death)을 보였고, IGFBP-5 녹아웃 마우스의 경우 유선의 퇴화가 늦어지는 결과를 보였다. 이러한 결과들로부터 IGFBP-5가 세포사멸 유도 작용을 할 수 있음이 알려졌다.
혈관신생은 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정으로서, 여러가지 복잡한 메커니즘이 관여하여 정교한 네트워크를 형성하고 있다. 대표적인 예로, 혈관내피세포의 수용체에 혈관신생인자가 작용하여 혈관내피세포를 증식시키는 기전 및 세포외기질 분해효소를 분비하여 혈관내피세포의 이동에 관여하는 기전, 혈관내피세포의 부착에 관여하는 기전 등이 밝혀져 있다. 혈관신생은 정상적인 발생, 즉 태아의 발생, 생식주기, 성장 및 상처치유시 필수적인 과정일 뿐만 아니라, 암, 당뇨병성 망막증과 같은 질병의 진행에도 관여하고 있다.
암과 같은 혈관신생 관련 질병의 치료를 위하여 혈관신생 억제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 혈관신생 과정에 있어 강력한 유도인자로 알려져 있는 VEGF(vascular endothelial growth factor) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)의 작용을 억제하고자 경쟁물질을 투여하는 방법 및 암세포의 전이를 억제하고자 하는 혈관내피세포에서의 인테그린 발현을 조절하는 방법 등에 대한 연구가 이루어지고 있다. 특히, VEGF는 혈관 내피세포 표면에 존재하는 두 가지 수용체, VEGFR1 및 VEGFR2 간의 결합을 통하여 다양한 생물학적 활성을 보이는 가장 강력한 혈관신생 유도인자 중 하나로서, 혈관형성(vasculogenesis) 및 혈관신생 모두에서 중심적인 기능을 수행하고 있다. 이에, VEGF의 발현 및 이의 신호전달을 감소시켜 혈관신생을 억제시키기 위한 약물에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
이에 본 발명자들은 VEGF의 발현 및 이의 신호전달을 감소시켜 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있는 펩타이드를 규명하기 위하여 예의 노력한 결과, IGFBP-5의 C-말단 도메인, 특히 C-말단 도메인에 위치한 헤파린 결합 도메인이 혈관신생을 효과적으로 억제할 수 있는 효과를 가지고 있어 상기 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드가 혈관신생 억제가 필요한 암과 같은 질병의 치료에 이용될 수 있음을 확인하였고, 또한 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인으로부터 개발한 변이된 펩타이드가 혈관신생 억제 효과를 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 IGFBP-5(Insulin-like growth factor-binding protein 5)의 헤파린 결합 도메인(Heparin-binding domain)을 유효성분으로 포함하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 이용하여 혈관신생을 억제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인에서 유래된 신규한 혈관신생 억제 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 분리된 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "IGFBP-5"는 IGFBP 패밀리에 속하는 단백질 중 하나로서 세포 증식을 비롯하여 여러 세포 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 단백질로서, N-말단 도메인, L 도메인 및 C-말단 도메인으로 구성되어 각 도메인이 서로 다른 기능을 수행할 수 있다. 본 발명에서 상기 N-말단 도메인은 IGFBP-5의 아미노산 서열에서 신호 펩타이드(Signal peptide, N-말단으로부터 20개의 아미노산으로 구성)를 제외한 아미노산을 1번으로 하였을때 1번째 내지 80번째 아미노산 부위를 의미하며, L 도메인은 81번째 내지 168번째 아미노산 부위를 의미하며, C-말단 도메인은 169번째 내지 252번째 아미노산 부위를 의미하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 C-말단 도메인, L 도메인 및 N-말단 도메인을 각각 서열번호 1, 2 및 3으로 나타내었다. 상기 IGFBP-5 단백질에 대한 정보는 미국 국립보건원(NCBI) GenBank와 같은 공지의 데이터베이스를 통하여 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession number가 NP_000590인 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명자들은 상기 세 가지 도메인 중 C-말단 도메인이 다른 도메인과 달리 특이적으로 혈관신생 억제 효과 및 이에 따른 현저한 암 성장 저해 효과를 가지며, 특히 C-말단 도메인에 위치한 헤파린 결합 도메인이 이와 같은 효과를 나타내는 것을 규명하였다. 이와 같은 C-말단 도메인의 효과는 알려진 바 없었으며, 본 발명자들에 의하여 최초로 규명된 것이다.
본 발명에서 용어, "IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인"은 IGFBP-5 단백질의 C-말단 도메인에 위치한 헤파린에 결합하는 도메인으로서, 본 발명의 목적상 상기 헤파린 결합 도메인은 혈관 신생을 저해하고 암의 성장을 억제시킬 수 있는 IGFBP-5 유래의 도메인을 의미한다. 상기 IGFBP-5 유래의 헤파린 결합 도메인은 다른 단백질의 헤파린 결합 도메인과 달리 혈관 신생 억제 및 암의 성장을 억제하는 특이적 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 IGFBP-2 유래의 헤파린 결합 도메인은 혈관 신생 억제효과를 나타내지 못하는 반면, 본 발명의 IGFBP-5 헤파린 결합 도메인은 혈관 신생 억제 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 4 내지 6).
구체적으로 상기 헤파린 결합 도메인은 IGFBP-5의 201번째 내지 218번째 아미노산 부위(서열번호 4)에 위치하고 있다. 상기 201번째 내지 218번째 아미노산 부위에는 203번째 아미노산인 글리신 및 209번째 아미노산인 글루타민을 포함하는 IGF-I-결합 도메인도 위치하고 있으나, 203번째 아미노산 및 209번째 아미노산이 모두 알라닌(A)인 경우에도 혈관 신생 억제 및 암 성장 억제 효과를 나타낼 수 있음을 확인하여, 201번째 218번째 아미노산 부위의 혈관신생 억제 효과는 헤파린 결합 도메인으로부터 기인하는 것임을 제시한다. 또한, 본 발명의 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인은 상기 서열번호 4로 기재한 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 보다 더욱 바람직하게는 95% 이상, 더욱더 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 유사성을 나타내는 아미노산 서열로서 실질적으로 혈관 신생을 억제하거나 암의 성장을 억제시킬 수 있는 생물학적 서열을 모두 포함한다. 또한 이러한 유사성을 갖는 서열로서 실질적으로 혈관 신생을 억제하거나 암 성장 억제 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하며, 그 예로 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 정의되는 펩타이드일 수 있나, 이에 제한되지 않는다.
바람직하게 본 발명에서 정의되는 헤파린 결합 도메인은 하기 서열 일반식 (Ⅰ)으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
[서열 일반식 (Ⅰ)]
[N-말단- R K X1 F Y K R K X2 C K P S R G R K R -C-말단]
여기에서, X1 및 X2는 임의의 아미노산이다.
본 발명에서 사용된 아미노산 서열은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산 D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소루신 I
루신 L 리신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 발명의 헤파린 결합 도메인은 IGF-I 결합과 무관하게 혈관신생 억제 및 암 억제를 가져오므로, 상기 서열 일반식 (I)에서 IGF-I 결합에 관여하는 아미노산인 X1 및 X2의 아미노산 종류에 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 X1은 글리신 또는 알라닌일 수 있고, X2는 글루타민 또는 알라닌일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 헤파린 결합 도메인으로서, 상기 서열 일반식(I)에서 X1이 글리신이고, X2가 글루타민인 펩타이드(BP5-C peptide) 및; X1 및 X2가 알라닌인 펩타이드(BP5-mut peptide)를 사용하여, 상기 펩타이드가 IGF-I 결합에 무관하게 혈관 신생에 주요 조절자로 관여하는 VEGF, IL-6 및 TNF-알파의 발현을 저해시키고(도 4 내지 도 5), 혈관신생을 억제하는 것을 확인하였다(도 6 및 8).
본 발명에서 용어, "IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드"는 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 필수적인 부분으로 포함하는 펩타이드로서, 아미노산 길이가 18개 내지 84개이고, 바람직하게는 18개 내지 59개이며, 더욱 바람직하게는 18개 내지 32개인 펩타이드를 의미한다. 상기 펩타이드는 바람직하게는 상기 서열 일반식(Ι)을 포함하는 펩타이드이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 정의되는 펩타이드이나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 펩타이드로서 18개의 아미노산으로 구성된 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드(서열번호 4 및 5) 및 84개의 아미노산으로 구성된 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드(C-말단 도메인, 서열번호 1)가 VEGF 및 IL-6, TNF-알파의 발현을 현저히 저해시키고 NF-kB 활성을 저해시킬 뿐만 아니라, 혈관 신생 및 암의 성장을 효과적으로 저해시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드는 C-말단이 아미드화된 펩타이드일 수 있다.
펩타이드를 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서는 펩타이드의 아미노 말단 및 카르복시 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드의 C-말단은 안정성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있으며, 그 변형의 종류는 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 아미드화된 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그 길이에 따라 이 분야에서 잘 알려진 방법 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여, 융합파트너 및 본 발명의 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 이를 숙주 세포에 형질전환시킨 후, 융합 단백질 형태로 발현하고, 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 펩타이드를 절단, 분리하여 원하는 펩타이드를 생산할 수 있다. 이를 위하여 예를 들어 Factor Xa나 엔테로키나제와 같은 단백질 분해효소, CNBr 또는 하이드록실아민과 같은 화합물에 의해 절단될 수 있는 아미노산 잔기를 코딩하는 DNA 서열을 융합파트너와 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 혈관신생을 효과적으로 억제하므로, 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 조성물은 혈관신생 억제, 나아가 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "혈관신생 억제"는 기존의 혈관으로부터 새로운 혈관이 형성되는 과정을 억제하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 VEGF, IL-6 또는 TNF-α와 같은 혈관 신생에 관여하는 주요 인자의 발현 또는 활성을 감소시켜 혈관신생을 억제시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, "혈관신생 관련 질환"은 혈관신생이 증가됨에 따라 발병 또는 진행하는 질병을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 펩타이드에 의하여 치료되는 질병이라면 제한없이 포함한다. 그 예로 상기 혈관신생 관련 질환은 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증성 질환 또는 신경퇴행성 질환이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 혈관신생 관련 질환을 억제하거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 혈관신생 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질환의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 다양한 포유동물에 다양한 경로로 투여할 수 있으며, 투여의 방식은 당업계의 통상적인 방법이라면 제한없이 포함하며, 예를 들어, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 IGFBP-5의 C-말단 도메인이 L-도메인 및 N-말단 도메인과 달리 혈관신생 및 암의 성장에 주요하게 관여하는 VEGF, IL-6 및 TNF-알파의 발현을 효과적으로 저해시키고 암에 있어 주요 신호전달인자인 NF-kB의 활성을 효과적으로 저해시킬 뿐만 아니라(도 1), 대조군, L-도메인 및 N-말단 도메인에 비하여 현저한 항암효과를 나타냄을 확인하였다(도 2). 또한, 본 발명자들은 상기 C-말단 도메인 중에서 혈관신생 억제효과 및 암 억제 효과를 나타내는 부위로 헤파린 결합 도메인을 포함하는 201번째 내지 218번째 아미노산 부위(BP5-C 펩타이드)가 주요하게 작용함을 확인하였다(도 3). 또한, IGFBP-2 유래의 헤파린 결합 도메인(BP2-HBD) 및 IGF-I 결합 도메인(BP2-C)과 그 효과를 비교하여 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인의 특이적인 효과인지를 확인한 결과, VEGF, IL-6 및 TNF-알파의 발현, NF-kB 저해효과 및 혈관신생 억제 효과를 나타내지 못한 BP2-HBD 및 BP2-C와 달리 본 발명의 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드는 상기 유전자들의 발현, NF-kB 활성 및 혈관신생을 효과적으로 억제하는 결과를 나타내었다(도 4 내지 6). 뿐만 아니라, 201번째 내지 218번째 아미노산 부위의 IGF-I 결합 부위를 돌연변이시킨 BP5-mut 펩타이드 역시 VEGF 등의 유전자 발현 저해 및 혈관신생 억제 효과를 나타내어, 201번째 내지 218번째 아미노산 부위에서 헤파린 결합 도메인 부위가 상기와 같은 효과를 나타낼 수 있는 특이적인 부위임을 확인하였다(도 5 및 6). 또한, 상기 헤파린 결합 도메인을 포함하는 본 발명의 펩타이드 대표적인 펩타이드인 BP5-C 펩타이드가 현저한 항암 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명의 펩타이드가 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다(도 7). 또한, 랫트 대동맥판륜을 이용하여 혈관 발아에 미치는 영향을 확인한 결과, 본 발명의 펩타이드는 비교군과 달리 혈관 발아를 효과적으로 억제하는 결과를 나타내었다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 이용하여 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다.
상기 펩타이드 및 혈관신생 억제에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 혈관신생 억제가 필요한 개체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫트, 닭 또는 인간을 포함하는 포유류 전체를 의미할 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 포유류가 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 IGFBP-5, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인, 펩타이드, 예방 및 치료에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 용어, "암"은 본 발명의 펩타이드에 의하여 치료될 수 있는 암이라면 그 종류에 제한없이 포함하며, 구체적으로는 본 발명의 펩타이드에 의한 혈관신생 억제에 의해 치료될 수 있는 암을 포함한다. 그 예로 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종 또는 혈액암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드가 혈관신생을 억제하며, 이를 통해 암의 억제시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명의 펩타이드가 암의 예방 또는 치료에 있어 효과적으로 사용될 수 있음을 확인하였다(도 1 내지 7).
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 이용하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 펩타이드 및 암에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 암 의심 개체 내에 투여하는 것을 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 랫트, 닭 또는 인간을 포함하는 포유류 전체를 의미할 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 포유류가 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명의 상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인에서 유래된 신규한 혈관신생 억제 펩타이드를 제공한다.
상기 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인 및 혈관신생에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서는 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인에 해당하는 IGFBP-5의 201번 내지 218번 아미노산 부위(서열번호 4)에서, 203번 및 209번 아미노산을 모두 알라닌으로 변이시킨 펩타이드(서열번호 5) 역시 혈관신생 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다.
이에 따라 본 발명에서는 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성된 혈관신생 억제 펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 제공한다.
상기 펩타이드에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 바람직하게는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로, 파아지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 혈관 신생 억제 및 이를 통한 암 치료 효과가 탁월할뿐만 아니라, 분자량이 작아 혈관 및 조직 내 침투가 용이하므로, 혈관 신생 억제가 필요한 분야, 예컨대 암 또는 여러 안과질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은, IGFBP-5 C-말단 도메인의 VEGF 및 싸이토카인 발현 저해 효과를 나타낸 도로서, 도 1A는 IGFBP-5의 각 도메인을 발현하는 2774 난소암 stable 세포주를 제작한 후 WCL(whole cell lysate) 및 media에서의 발현(CM, conditioned media)을 조사한 결과를 나타낸 도이며, 도 1B는 IGFBP-5의 절단 돌연변이체(truncation mutant)를 발현하는 2774 stable 세포주에서의 VEGF 및 싸이토카인의 발현을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도이며, 도 1C는 각 BP5/2774 세포주에서 NF-kB-RE-Luc 리포터 플라스미드 및 레닐라 루시퍼라아제를 발현하는 플라스미드를 형질감염한 후 NF-kB 활성을 조사한 결과를 나타내는 도이다.
도 2a 및 b는, IGFBP-5의 C-말단 도메인의 종양 성장 저해 효과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 2a는 IGFBP-5의 각 도메인을 발현하는 2774 난소암 세포주를 누드 마우스 피하에 주사한 후 암 성장을 관찰한 사진이며, 도2b는 도2a와 같이 관찰하였던 종양의 성장을 곡선으로 나타낸 그래프 및 각 마우스에서 수거한 종양 사진을 나타내는 것이다. 각 그래프 오른쪽에 각 해당 동물에서 수거한 종양 사진을 나타내었고, N/2774, L/2774 및 C/2774는 각각 IGFBP-5의 N-말단 도메인, L-도메인 및 C-말단 도메인을 각각 발현하는 2774 stable 세포를 나타낸다.
도 3은, IGFBP-5 C-말단 도메인 유래 펩타이드의 VEGF 및 싸이토카인 발현 저해 결과를 나타낸 도로서, 도 3A는 IGFBP-5 C-말단 도메인 유래 펩타이드(BP5-C)를 2774 난소암 세포주에 30, 60 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 VEGF 및 싸이토카인 발현을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도이며, 도 3B는 BP5-C 펩타이드를 2774 세포주에 농도별로 처리한 후 NF-kB-RE-Luc 어세이를 통해 NF-kB 활성을 측정하여 그 결과를 Bar 그래프로 나타낸 도이다. 도 3에서 '0'은 펩타이드 대신 PBS를 처리한 것을 나타낸 것이며, NF-kB 활성은 PBS를 처리하였을 때의 활성을 100%로 했을 때 이에 대한 비율로 나타내었다.
도 4는, IGFBP-2와 IGFBP-5의 서열 정렬(sequence alignment)한 것을 나타낸 도로서, C-말단 도메인은 회색박스로 표시하였고, IGFBP-2의 헤파린 결합 도메인을 분홍색 박스로, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인에 해당하는 부분은 주황색으로 표시하였고, IGF-I 결합에 주요한 아미노산을 빨간색 박스로 표시하였다.
도 5는, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인의 VEGF 및 싸이토카인 발현 저해 효과를 나타낸 것으로, 도 5A는 IGFBP-5의 C-말단 도메인 펩타이드(BP5-C) 및 IGF-I-결합 도메인을 돌연변이시킨 펩타이드(BP5-mut), IGFBP-2의 헤파린 결합 도메인에 대한 펩타이드(BP2-HBD) 및 IGFBP-2의 C-말단 도메인에 대한 펩타이드(BP2-C)를 2774 세포주에 60㎍/㎖의 농도로 처리한 후, RNA를 분리하여 RT-PCR를 통해 각 펩타이드들의 VEGF와 싸이토카인 발현에 대한 영향을 분석한 결과를 왼쪽 패널에 나타내었으며, RT-PCR의 결과 밴드를 스캔한 후 PBS 처리한 결과를 100%로 하여 그에 대한 비율을 바 그래프로 오른쪽 패널에 나타내었다. 도 5B는 BP5-C 펩타이드, BP5-mut 펩타이드 및 BP2-C 펩타이드를 NF-kB-RE-Luc 리포터 플라스미드를 형질감염시킨 2774 세포주에 처리한 후 NF-kB 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인의 HUVEC 튜브 형성 및 이동 저해 결과를 나타내는 도이다. 도 6a는 HUVEC 세포주에 각각의 펩타이드를 60㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 예비 처리한 후 각각의 펩타이드가 처리된 HUVEC 세포주를 마트리젤 위에서 새로 희석한 펩타이드와 함께 6시간 배양한 다음, 현미경으로 튜브 형성 정도를 관찰한 후 사진을 촬영한 결과이다. 또한, 도 6b는 각 펩타이드의 HUVEC 이동에 대한 영향을 조사한 결과로서, 12-웰 플레이트에 1X105 세포/웰로 HUVEC 세포를 넣고 60㎍/㎖ 농도의 펩타이드를 36시간 처리한 후 200㎕ 파이펫 팁으로 웰을 긁은 다음, 사진을 찍어 이를 0시간으로 하였다. 새로 희석한 펩타이드를 60㎍/㎖로 처리하여 밤새 배양한 후 HUVEC 세포주의 이동 정도를 현미경으로 관찰하였다.
도 7은, IGFBP-5 C-말단 도메인의 암 성장 억제 효과를 나타낸 도로서, IGFBP-5 C-말단 도메인을 나타내는 펩타이드(BP5-C)의 종양 성장에 대한 영향을 알아보기 위해 2774-GFP 세포주를 누드 마우스 복강에 주사하여 난소암 모델 동물을 만든 후 펩타이드(30㎎/㎏)를 복강에 2-3일 간격으로 8회 주사한 후 종양을 관찰하였다. 마우스의 등(Dorsal) 및 배(Ventral) 부분을 펩타이드 또는 PBS를 주사하기 전(Before treatment)과 주사한 후(After treatment)에 각각 광학 이미지로 관찰하였고, 마지막 펩타이드를 주사한 다음 마우스를 희생하여 복강을 관찰하였으며 (Dissect), 종양을 수거하여 PBS를 주사한 마우스의 종양과 서로 비교하였다 (Tumor).
도 8은, 랫트 대동맥판륜(rat aortic ring)을 이용한 혈관 스프라우팅에 대한 BP5 펩타이드의 효능을 확인한 결과이다.
도 2a 및 b는, IGFBP-5의 C-말단 도메인의 종양 성장 저해 효과를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도 2a는 IGFBP-5의 각 도메인을 발현하는 2774 난소암 세포주를 누드 마우스 피하에 주사한 후 암 성장을 관찰한 사진이며, 도2b는 도2a와 같이 관찰하였던 종양의 성장을 곡선으로 나타낸 그래프 및 각 마우스에서 수거한 종양 사진을 나타내는 것이다. 각 그래프 오른쪽에 각 해당 동물에서 수거한 종양 사진을 나타내었고, N/2774, L/2774 및 C/2774는 각각 IGFBP-5의 N-말단 도메인, L-도메인 및 C-말단 도메인을 각각 발현하는 2774 stable 세포를 나타낸다.
도 3은, IGFBP-5 C-말단 도메인 유래 펩타이드의 VEGF 및 싸이토카인 발현 저해 결과를 나타낸 도로서, 도 3A는 IGFBP-5 C-말단 도메인 유래 펩타이드(BP5-C)를 2774 난소암 세포주에 30, 60 및 100 ㎍/㎖의 농도로 처리한 후 VEGF 및 싸이토카인 발현을 RT-PCR로 분석한 결과를 나타낸 도이며, 도 3B는 BP5-C 펩타이드를 2774 세포주에 농도별로 처리한 후 NF-kB-RE-Luc 어세이를 통해 NF-kB 활성을 측정하여 그 결과를 Bar 그래프로 나타낸 도이다. 도 3에서 '0'은 펩타이드 대신 PBS를 처리한 것을 나타낸 것이며, NF-kB 활성은 PBS를 처리하였을 때의 활성을 100%로 했을 때 이에 대한 비율로 나타내었다.
도 4는, IGFBP-2와 IGFBP-5의 서열 정렬(sequence alignment)한 것을 나타낸 도로서, C-말단 도메인은 회색박스로 표시하였고, IGFBP-2의 헤파린 결합 도메인을 분홍색 박스로, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인에 해당하는 부분은 주황색으로 표시하였고, IGF-I 결합에 주요한 아미노산을 빨간색 박스로 표시하였다.
도 5는, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인의 VEGF 및 싸이토카인 발현 저해 효과를 나타낸 것으로, 도 5A는 IGFBP-5의 C-말단 도메인 펩타이드(BP5-C) 및 IGF-I-결합 도메인을 돌연변이시킨 펩타이드(BP5-mut), IGFBP-2의 헤파린 결합 도메인에 대한 펩타이드(BP2-HBD) 및 IGFBP-2의 C-말단 도메인에 대한 펩타이드(BP2-C)를 2774 세포주에 60㎍/㎖의 농도로 처리한 후, RNA를 분리하여 RT-PCR를 통해 각 펩타이드들의 VEGF와 싸이토카인 발현에 대한 영향을 분석한 결과를 왼쪽 패널에 나타내었으며, RT-PCR의 결과 밴드를 스캔한 후 PBS 처리한 결과를 100%로 하여 그에 대한 비율을 바 그래프로 오른쪽 패널에 나타내었다. 도 5B는 BP5-C 펩타이드, BP5-mut 펩타이드 및 BP2-C 펩타이드를 NF-kB-RE-Luc 리포터 플라스미드를 형질감염시킨 2774 세포주에 처리한 후 NF-kB 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은, IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인의 HUVEC 튜브 형성 및 이동 저해 결과를 나타내는 도이다. 도 6a는 HUVEC 세포주에 각각의 펩타이드를 60㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 예비 처리한 후 각각의 펩타이드가 처리된 HUVEC 세포주를 마트리젤 위에서 새로 희석한 펩타이드와 함께 6시간 배양한 다음, 현미경으로 튜브 형성 정도를 관찰한 후 사진을 촬영한 결과이다. 또한, 도 6b는 각 펩타이드의 HUVEC 이동에 대한 영향을 조사한 결과로서, 12-웰 플레이트에 1X105 세포/웰로 HUVEC 세포를 넣고 60㎍/㎖ 농도의 펩타이드를 36시간 처리한 후 200㎕ 파이펫 팁으로 웰을 긁은 다음, 사진을 찍어 이를 0시간으로 하였다. 새로 희석한 펩타이드를 60㎍/㎖로 처리하여 밤새 배양한 후 HUVEC 세포주의 이동 정도를 현미경으로 관찰하였다.
도 7은, IGFBP-5 C-말단 도메인의 암 성장 억제 효과를 나타낸 도로서, IGFBP-5 C-말단 도메인을 나타내는 펩타이드(BP5-C)의 종양 성장에 대한 영향을 알아보기 위해 2774-GFP 세포주를 누드 마우스 복강에 주사하여 난소암 모델 동물을 만든 후 펩타이드(30㎎/㎏)를 복강에 2-3일 간격으로 8회 주사한 후 종양을 관찰하였다. 마우스의 등(Dorsal) 및 배(Ventral) 부분을 펩타이드 또는 PBS를 주사하기 전(Before treatment)과 주사한 후(After treatment)에 각각 광학 이미지로 관찰하였고, 마지막 펩타이드를 주사한 다음 마우스를 희생하여 복강을 관찰하였으며 (Dissect), 종양을 수거하여 PBS를 주사한 마우스의 종양과 서로 비교하였다 (Tumor).
도 8은, 랫트 대동맥판륜(rat aortic ring)을 이용한 혈관 스프라우팅에 대한 BP5 펩타이드의 효능을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 예에 제한되는 것은 아니다.
실시예
1:
IGFBP
-5의 각 도메인을
stable
하게 발현하는 2774 난소암 세포주 제작
IGFBP-5의 C-말단 도메인(서열번호 1), L-도메인(서열번호 2) 및 N-말단 도메인(서열번호 3)을 발현하는 플라스미드(pSecTaq2/Hygro A, Invitrogen) 2㎍/dish(100mm dish)로 2774 난소암 세포주에 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 형질감염(transfection)하였다. 형질감염 방법은 인비트로젠(Invitrogen) 사에서 제공한 방법으로 수행하였다.
형질감염 24시간 후에 하이그로마이신(hygromycin, 500㎍/㎖)을 함유한 DMEM(+10% FBS+페니실린 및 하이그로마이신)에 살아남은 콜로니를 채집한 다음, Myc 항체를 이용한 웨스턴 블롯 방법으로 양성 콜로니를 선정하였다.
실시예
2:
IGFBP
-5의 각 절단 돌연변이체(
truncation
mutant
)를 이용한
NF
-kB 활성 측정
IGFBP-5 절단 돌연변이체를 stable하게 발현하는 2774 세포를 24-웰 플레이트에 분주하고, 24시간 후 NF-kB-반응 요소-루시퍼라아제(NF-kB responding element-Luciferase, NF-kB-RE-Luc)와 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase)를 각각 발현하는 플라스미드를 형질감염하였다.
형질감염 7시간 후, 2774 세포를 OPTI-MEM 배지에서 밤새 무혈청 상태로 배양(serum starvation)하였다. 그 다음, 2774 세포를 용해 완충액(lysis buffer, Promega)로 용해시킨 다음, 듀얼 루시퍼라아제 어세이 키트(Dual luciferase assay kit, Promega)를 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 상기 활성 측정 실험은 3배수(triplicate)로 수행하였으며 3번의 반복 실험을 하였다.
실시예
3:
IGFBP
-5 절단 돌연변이체를 발현하는 2774 세포주를 이용한 동물실험
5주령의 누드 마우스 피하에 IGFBP-5 절단 돌연변이체를 발현하는 2774 세포주를 1X106개를 주사한 후 종양 크기를 3-4일 간격으로 측정하였다. 쥐를 희생하여 다른 조직으로의 전이 여부를 관찰하고 종양을 수거하였다. 실험에 사용한 마우스는 각 세포주마다 2마리를 사용하였으며, 한 마리당 2곳에 각각의 세포주를 주사하였다. 본 실험은 3번 반복하였다.
실시예
4:
펩타이드
합성
본 발명에서 사용한 펩타이드는 18개의 아미노산으로 구성되어 있으며 펩트론 회사(대전)로부터 합성하였다.
구체적으로, BP5-C 펩타이드는 IGFBP-5의 201번째 내지 218번째 아미노산 부위로 구성되어 있고, BP5-mut는 상기 BP5-C 펩타이드에서 203번째 아미노산인 글리신(Glycine, G)을 알라닌(Alanine, A)으로, 209번째 아미노산인 글루타민(Glutamine, Q)를 알라닌으로 변이시킨 펩타이드이며, BP2-HBD 펩타이드는 IGFBP-2 유래의 헤파린 결합 도메인 부위로서, IGFBP-2의 171번째 내지 188번째 아미노산 부위로 구성되며, BP2-C 펩타이드는 IGF-I-결합 도메인을 포함하는 C-말단 도메인 부위로서, IGFBP-2의 228번째 내지 245번째 아미노산 부위로 구성되어 있다. 상기 펩타이드의 구체적인 서열은 하기와 같다.
| 펩타이드 | 서열(N term →C term ) | 서열번호 |
| BP5-C 펩타이드 | 201RKGFYKRKQCKPSRGRKR218 | 4 |
| BP5-mut 펩타이드 | 201RKAFYKRKACKPSRGRKR218 | 5 |
| BP2-HBD 펩타이드 | 171KHHLGLEEPKKLRPPPAR188 | 6 |
| BP2-C 펩타이드 | 228KHGLYNLKQCKMSLNGQR245 | 7 |
상기 펩타이드는 PBS에 1㎍/㎖의 농도로 용해한 다음, -80℃에 앨리컷(aliquoting)하여 보관하였으며, 반복적인 얼림과 녹임을 피하여 사용하였다.
실시예
5:
역전사
PCR
(
Reverse
transcription
PCR
)을 통한
펩타이드가
싸이
토카인의 발현에 미치는 영향 확인
실시예 4에서 합성한 펩타이드를 농도별로 혹은 각각의 펩타이드를 60㎍/㎖의 농도로 2774 세포주에 밤새 처리한 다음, 신선한(fresh) 펩타이드를 7시간 추가로 처리하여, 총 24시간 처리하였다. 그 다음, 트라이졸(Trizol, Invitrogen)로 세포를 용해시킨 다음, RNA를 분리하고, 올리고 dT(oligo dT)와 슈퍼스크립타제 Ⅲ(Superscriptase Ⅲ, Invitrogen)로 cDNA를 합성한 후, 역전사 PCR을 수행하였다. 이에 사용한 프라이머 정보는 하기 표 2와 같다.
| 프라이머 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| VEGF F | ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGG | 8 |
| VEGF R | CCGCCTCGGCTTGTCACATCTG | 9 |
| GAPDH F | GGAGTCCACTGGCGTCTTCACCACC | 10 |
| GAPDH R | CCTCCGACGCCTGCTTCACCACCTT | 11 |
| TNF-F | ACAAGCCTGTAGCCCATGTT | 12 |
| TNF-R | AAAGTAGACCTGCCCAGACT | 13 |
| IL-6-F | TGTAGCCGCCCCACACAGACAGCC | 14 |
| IL-6-R | GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTGC | 15 |
또한, PCR은 EF-Taq DNA 중합효소(Solgent, 대전)를 사용하여 수행하였으며, 이 때 사용한 PCR 프로그램의 정보는 하기 표 3과 같다. 단, TNF-a 프라이머를 사용한 PCR은 결합 온도(annealing temperature)를 57℃로 하여 35 cycles을 수행하였다.
| 온도 | 시간 | 싸이클 |
| 95℃ | 2 min | 1 cycle |
| 95℃ | 20 sec | 30 cycles |
| 60℃ | 40 sec | |
| 72℃ | 1 min | |
| 72℃ | 5 min | 1 cycle |
| 4℃ | ∞ | 1 cycle |
실시예
6: 세포 이동성 측정(
Migration
assay
)
IGFBP-5의 각 도메인에 대한 펩타이드가 HUVEC 이동에 미치는 영향을 알아보기 위하여, HUVEC 세포를 1X105세포/웰로 12-웰 플레이트에 분주한 다음, 각각의 펩타이드를 60㎍/㎖로 36시간 동안 처리하였다. 구체적으로, 각각의 펩타이드를 7시간 처리하고 신선한 펩타이드를 다시 밤새(overnight) 처리하였다.
200㎕ 팁(tip)으로 플레이트에 스크래치를 내고 새로이 희석한 펩타이드를 60㎍/㎖로 밤새 처리한 다음, 세포 이동성을 관찰하였다. 세포 이동성은 0시간 및 오버나이트 시간 지점(overnight time point)에서 현미경으로 관찰하여 사진을 찍었다. 또한, PBS를 대조군으로 처리하였다.
실시예
7: 튜브 형성 어세이(
Tube
formation
assay
)
IGFBP-5의 각 도메인에 대한 펩타이드가 HUVEC 세포의 튜브 형성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, HUVEC 세포주를 1X105세포/웰로 6-웰 플레이트에 플레이팅한 다음, 각각의 펩타이드를 60㎍/㎖로 24시간 처리하였다.
또한, 튜브 형성 어세이 전에 성장인자가 감소된 마트리젤(growth factor-reduced Matrigel, BD Bioscience)을 PBS로 1/2로 희석하여 300㎕/웰로 24-웰 플레이트에 처리한 다음, 37℃ 온도에서 1시간 동안 굳혔다. 펩타이드를 24시간 처리한 HUVEC 세포를 트립신 처리(trypsinize)하여, EGM 배지(EBM 배지로 1/3 희석하여 사용) 300㎕로 각 세포주를 현탁하고, 신선한 펩타이드를 60㎍/㎖ 처리하여 미리 준비해 둔 마트리젤 위에서 6시간 배양하였다. 그 다음, 형성된 튜브를 현미경으로 관찰하였다.
실시예
8: 난소암 모델 동물에서의
IGFBP
-5 유래
펩타이드의
암 억제 효능실험
5주령 누드 마우스의 복강에 GFP를 발현하는 2774 세포주를 5X106개를 주사하였다. 2774-GFP 세포주를 주사한 지 5일 후 광학상(Optical image) 장비(IVIS Spectrum, Caliper LifeSciences)로 종양을 관찰한 후 BP5-C 펩타이드를 마우스 kg당 30㎎의 양으로 펩타이드를 2-3일 간격으로 쥐의 복강에 8회 주사하였다. 마지막 펩타이드를 주사한 3일 후 광학상 시스템으로 쥐를 관찰하였고, 쥐를 희생하여 다른 조직으로의 전이 여부를 관찰하고 종양을 수거하였다.
실험 마우스는 BP5-C 펩타이드를 8마리에 접종하였고, 대조군의 경우 PBS를 찌른 마우스 7마리로 실험을 수행하였다.
실시예
9:
랫트
대동맥판륜(rat aortic ring)을
이용한 혈관 발아 어세이(
blood
vessel
sprouting
assay
)
랫트 대동맥판륜을 랫트로부터 추출한 후 PBS로 두 번 세척하고 1mm 크기로 자른 후 마트리젤(matrigel)이 있는 24-웰 플레이트에 넣었다. 그 다음, EGM 배지(Lonza)에 BP5-C, BP5mut, BP2-HBD, BP2-C 펩타이드를 60ug/ml로 섞어 랫트 대동맥판륜에 처리하여 6일 동안 37oC에서 배양하였다. 이때 펩타이드는 2일에 한번씩 새로운 펩타이드를 EGM 배지에 60㎍/㎖로 희석하여 처리하였다. 결과를 광학현미경으로 혈관을 촬영하여 확인하였다.
실험예
1:
IGFBP
-5의 C-말단 부위의
VEGF
및
싸이토카인
유전자 발현 저해 효과
IGFBP-5는 크게 3가지의 도메인으로 구성되어 있다(N-말단 도메인, C-말단 도메인 및 L-도메인). 본 발명자들은 IGFBP-5 각 도메인이 VEGF 및 IL-6와 TNF-알파와 같은 사이토카인의 유전자 발현을 저해하여 암의 억제 또는 혈관 신생을 억제시킬 수 있는지 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, IGFBP-5의 각 도메인을 발현하는 난소암 세포주 2774 stable 세포에서 각 절단 도메인(truncation domain)의 발현정도를 WCL(whole cell lysate)와 CM(conditioned media)을 이용한 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다(도 1A). 도 1A에 나타난 바와 같이, IGFBP-5의 각 도메인들이 2774 세포주에서 잘 발현되었으며 배지로 잘 분비됨을 알 수 있다.
상기 2774 stable cell로부터 전체 RNA를 분리한 다음, VEGF, IL-6와 TNF-알파(TNF-a)에 대한 RT-PCR을 수행한 결과, C-말단 도메인을 발현하는 2774 세포주에서 VEGF, IL-6, TNF-a 유전자 발현이 현저하게 저해되는 결과를 나타내었다(도 1B). 또한 발암에 중요한 신호전달경로이며 또한 IL-6의 하위 신호인 IL-6의 NF-kB 활성에 미치는 영향을 확인한 결과, C-말단 도메인을 발현하는 2774 세포주에서 NF-kB 활성도 현저하게 저해되어 있음을 확인하였다(도 1C).
종합하면, IGFBP-5의 C-말단 도메인의 발현은 VEGF 및 IL-6와 TNF-a와 같은 싸이토카인의 유전자 발현을 억제하며 암 성장에 중요한 신호전달경로인 NF-kB 활성을 억제한다.
따라서, 상기와 같은 결과는 IGFBP-5의 C-말단 도메인이 특이적으로 VEGF 발현 억제 및 IL-6, TNF-a의 발현 억제, NF-kB 활성 저해를 통하여 암 성장을 억제하거나 혈관 신생을 억제시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예
2:
IGFBP
-5의 C-도메인의 암 성장 억제
IGFBP-5의 각 도메인, 특히 VEGF 및 IL-6를 비롯한 싸이토카인의 발현을 억제하는 C-말단 도메인이 실제 암 성장에 미치는 영향을 연구하기 위해 IGFBP-5의 각 도메인을 발현하는 난소암 세포주 2774를 누드 마우스 피하에 주사한 후 암 성장을 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 구체적으로, 도 2a는 IGFBP-5의 각 도메인을 발현하는 2774 난소암 세포주를 누드 마우스 피하에 주사한 후 암 성장을 관찰한 사진이며, 도2b는 도2a와 같이 관찰하였던 종양의 성장을 곡선으로 나타낸 그래프 및 각 마우스에서 수거한 종양 사진을 나타내는 것이다.
그 결과, C-말단 도메인을 발현하는 2774 세포를 주사한 마우스에서는 암의 성장이 Vec/2774를 주사한 마우스에 비해 현저하게 저해되는 결과를 나타내었으며, 특히, L-도메인 및 N-말단 도메인을 처리한 마우스에 비하여 C-말단 도메인을 처리한 마우스(C/2774)에서 암의 성장의 억제가 더욱 효과적으로 나타났다(도 2a 및 b).
따라서, 실험예 1의 결과와 종합하여 볼 때, 상기와 같은 결과는 IGFBP-5의 C-말단 도메인은 VEGF 유전자 발현을 저해함으로써 암 성장에 중요한 신생혈관생성을 억제하고, 암 성장에 중요한 NF-kB 관련 신호를 억제함으로써 암의 성장을 억제시킬 수 있음을 시사한다.
실험예
3:
IGFBP
-5 C-말단 도메인에서
유래된
펩타이드의
기능 조사
IGFBP-5의 C-말단 도메인 중에서 201번 내지 218번째 아미노산 부위(BP5-C)를 펩타이드로 합성하여 상기 BP5-C 펩타이드의 VEGF, IL-6 및 TNF-a의 유전자 발현에 대한 영향을 RT-PCR로 조사하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
그 결과, BP5-C 펩타이드 농도 의존적으로 VEGF, IL-6 및 TNF-a의 유전자 발현이 저해되는 결과를 나타내었다(도 3A). 또한 BP5-C 펩타이드는 NF-kB 활성을 효과적으로 저해시켰다(도 3B).
상기 결과들은 IGFBP-5의 C-말단 도메인을 발현하는 C/2774 stable 세포에서의 결과와 일치하는 결과로서, IGFBP-5의 C-말단 도메인에 의한 C/2774 세포주의 VEGF 및 IL-6 유전자 발현 저해에 있어 C-말단 도메인 중에서도 201 내지 218 번째 아미노산 분위가 중요하게 작용하는 부위임을 시사하는 결과이다.
실험예
4:
IGFBP
-5의
HBD
(
heparin
-
binding
domain
)를 통한
VEGF
유전자 발현 저해
IGFBP-5의 C-말단 도메인의 201 내지 218번째 아미노산 부위는 IGF-I-결합 도메인 및 헤파린 결합 도메인(HBD, Heparin-binding domain)으로 구성되어 있다. 특히, IGF-I-결합 도메인은 IGF-I과 결합하여 IGF-I이 IGF-I 수용체에 결합하는 것을 방해함으로써 VEGF 발현을 억제하며 암 성장을 억제하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 실험예에서의 BP5-C 펩타이드의 효과가 IGF-I-결합도메인에 의한 것인지를 확인하기 위하여, IGF-I-결합 도메인에서 IGF-I 결합에 중요한 역할을 하는 2개의 아미노산, 203번째 아미노산인 글리신(Glycine, G)을 알라닌(Alanine, A)으로, 209번째 아미노산인 글루타민(Glutamine, Q)를 알라닌으로 변이시킨 펩타이드(BP5-mut; 203A, 209A)를 합성하였다. 또한, IGFBP 패밀리 중에서 암 성장을 촉진하는 것으로 알려진 IGFBP-2의 IGF-I-결합도메인을 포함하는 C-말단 도메인(BP2-C) 및 IGFBP-2의 헤파린 결합 도메인(BP2-HBD)도 펩타이드로 각각 합성하여, 상기 효과가 IGFBP-5 유래의 HBD 또는 IGF-I-결합 도메인의 특이적인 효과인지를 확인하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 펩타이드를 2774 난소암 세포주에 처리하여 VEGF, IL-6 및 TNF-a 유전자 발현 양상을 RT-PCR로 조사한 결과, BP5-C와 BP5-mut 펩타이드는 VEGF 및 IL-6 유전자 발현을 억제하는 결과를 나타낸 반면(도 5A), PBS와 IGFBP-2에서 유래된 펩타이드는 아무런 변화를 나타내지 않았다. 또한, 이러한 결과와 일치하게 BP5-C와 BP5-mut 펩타이드는 NF-kB 활성 역시 저해하였다(도 5B).
따라서 상기와 같은 결과들은 VEGF 및 IL-6 유전자 발현을 저해하고 NF-kB 활성의 억제에 IGFBP-5 유래의 헤파린 결합 도메인이 중요한 기능을 한다는 것을 시사한다.
실험예
5:
IGFBP
-5 헤파린 결합 도메인의
HUVEC
세포주의 튜브 형성 및 이동 저해 효과
암 세포 성장에 중요한 영양분을 공급받기 위해 암 세포는 새로운 혈관들을 생성한다. 이러한 새로운 혈관생성에 특히 VEGF가 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인이 혈관 신생에 있어 주요 조절자인 VEGF 유전자 발현을 억제하므로 본 발명의 IGFBP-5 펩타이드가 신생혈관 생성을 억제할 수 있을 것으로 보아, IGFBP-5 펩타이드의 HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell)의 튜브형성(tube formation)에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, HUVEC에 BP5-C 펩타이드 및 BP5-mut 펩타이드의 처리시 튜브 형성이 억제되는 결과를 나타낸 반면, PBS, BP2-HBD 펩타이드, BP2-C 펩타이드의 경우 튜브 형성에 아무런 영향도 나타내지 않았다(도 6A).
또한, 다른 조직으로 전이되기 위해 암 세포들은 이동을 하므로 본 발명의 펩타이드가 암세포의 이동에 미치는 영향을 확인하기 위하여 HUVEC의 이동을 조사하였다.
그 결과, BP5-C 펩타이드 및 BP5-mut 펩타이드는 HUVEC 이동을 억제시키는 결과를 나타내었으나, PBS, BP2-HBD 및 BP2-C 펩타이드는 HUVEC 이동을 억제시키는 결과를 보이지 않았다(도 6B).
상기와 같은 결과들은 IGFBP-5 유래의 헤파린 결합 도메인이 신생혈관 생성 및 전이에 있어 중요한 기능을 수행함을 시사하는 결과이다.
실험예
6:
IGFBP
-5 C-말단 도메인에서 유래한
펩타이드의
암 억제 효과
IGFBP-5 C-말단 도메인에서 유래한 펩타이드인 BP5-C 펩타이드를 난소암 모델 동물의 복강에 2-3일 간격으로 8번 주사한 후 종양을 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
그 결과, BP5-C 펩타이드를 주사한 동물의 경우, 종양의 성장이 대조군에 비하여 현저하게 저해된 결과를 나타내었다. 종양을 수거하여 그 크기를 비교해 본 결과, PBS를 주사한 동물의 종양에 비해 BP5-C 펩타이드를 주사한 동물의 종양 크기가 현저히 감소되었다. 상기 실험예에 비추어, 본 발명의 BP5-C 펩타이드의 종양 억제 효과는 헤파린 결합 도메인에 의한 혈관 신생 억제에서 기인할 것으로 추정된다.
실험예
7:
랫트
대동맥판륜(rat aortic ring)을
이용한 혈관 발아에 대한 본 발명의
펩타이드
효능 확인
실시예 9의 방법을 이용하여 본 발명의 펩타이드(BP5-C 및 BP5-mut)와 비교군으로서, BP2-HBD 및 BP2-C를 사용하여 혈관신생에 미치는 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 비교군인 펩타이드와 달리 본 발명의 2종의 펩타이드는 모두 혈관 발아를 효과적으로 억제하는 결과를 나타내었다.
따라서, 상기 결과들을 종합하여 볼 때, 본 발명의 IGFBP-5의 헤파린 결합 도메인을 포함하는 펩타이드는 신생혈관 생성 억제제, 나아가 신생혈관 관련 질병, 예컨대 망막증 또는 암과 같은 질병의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY
<120> Novel use of C-terminal domain of IGFBP-5 comprising
heparin-binding domain as an angiogenesis inhibitor
<130> PA130955KR
<150> KR 10-2012-0112111
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<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 84
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGFBP5-C terminal domain
<400> 1
Gln Gly Pro Cys Arg Arg His Met Glu Ala Ser Leu Gln Glu Leu Lys
1 5 10 15
Ala Ser Pro Arg Met Val Pro Arg Ala Val Tyr Leu Pro Asn Cys Asp
20 25 30
Arg Lys Gly Phe Tyr Lys Arg Lys Gln Cys Lys Pro Ser Arg Gly Arg
35 40 45
Lys Arg Gly Ile Cys Trp Cys Val Asp Lys Tyr Gly Met Lys Leu Pro
50 55 60
Gly Met Glu Tyr Val Asp Gly Asp Phe Gln Cys His Thr Phe Asp Ser
65 70 75 80
Ser Asn Val Glu
<210> 2
<211> 88
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGFBP-5 L domain
<400> 2
Leu Asn Glu Lys Ser Tyr Arg Glu Gln Val Lys Ile Glu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Arg Glu His Glu Glu Pro Thr Thr Ser Glu Met Ala Glu Glu Thr Tyr
20 25 30
Ser Pro Lys Ile Phe Arg Pro Lys His Thr Arg Ile Ser Glu Leu Lys
35 40 45
Ala Glu Ala Val Lys Lys Asp Arg Arg Lys Lys Leu Thr Gln Ser Lys
50 55 60
Phe Val Gly Gly Ala Glu Asn Thr Ala His Pro Arg Ile Ile Ser Ala
65 70 75 80
Pro Glu Met Arg Gln Glu Ser Glu
85
<210> 3
<211> 80
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IGFBP-5 N-terminal domain
<400> 3
Leu Gly Ser Phe Val His Cys Glu Pro Cys Asp Glu Lys Ala Leu Ser
1 5 10 15
Met Cys Pro Pro Ser Pro Leu Gly Cys Glu Leu Val Lys Glu Pro Gly
20 25 30
Cys Gly Cys Cys Met Thr Cys Ala Leu Ala Glu Gly Gln Ser Cys Gly
35 40 45
Val Tyr Thr Glu Arg Cys Ala Gln Gly Leu Arg Cys Leu Pro Arg Gln
50 55 60
Asp Glu Glu Lys Pro Leu His Ala Leu Leu His Gly Arg Gly Val Cys
65 70 75 80
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BP5-C peptide
<400> 4
Arg Lys Gly Phe Tyr Lys Arg Lys Gln Cys Lys Pro Ser Arg Gly Arg
1 5 10 15
Lys Arg
<210> 5
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BP5-mut peptide
<400> 5
Arg Lys Ala Phe Tyr Lys Arg Lys Ala Cys Lys Pro Ser Arg Gly Arg
1 5 10 15
Lys Arg
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BP2-HBD peptide
<400> 6
Lys His His Leu Gly Leu Glu Glu Pro Lys Lys Leu Arg Pro Pro Pro
1 5 10 15
Ala Arg
<210> 7
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BP2-C peptide
<400> 7
Lys His Gly Leu Tyr Asn Leu Lys Gln Cys Lys Met Ser Leu Asn Gly
1 5 10 15
Gln Arg
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for VEGF (Forward)
<400> 8
atgaactttc tgctgtcttg gg 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for VEGF (Reverse)
<400> 9
ccgcctcggc ttgtcacatc tg 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for GAPDH (Forward)
<400> 10
ggagtccact ggcgtcttca ccacc 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for GAPDH (Reverse)
<400> 11
cctccgacgc ctgcttcacc acctt 25
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for TNF (Forward)
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acaagcctgt agcccatgtt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for TNF (Reverse)
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aaagtagacc tgcccagact 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for IL-6 (Forward)
<400> 14
tgtagccgcc ccacacagac agcc 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer for IL-6 (Reverse)
<400> 15
gaagagccct caggctggac tgc 23
Claims (17)
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 5로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 펩타이드의 C-말단이 아미드화된 것인 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 VEGF(Vascular endothelial growth factor)의 발현 또는 이의 신호전달을 감소시키는 것인 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 조성물은 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 신생혈관 녹내장 및 증식성 망막증으로 구성되는 군에서 선택되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 것인 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 5로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 암은 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 구강암, 인두암, 후두암, 폐암, 결장암, 유방암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 전립선암, 고환암, 방광암, 신장암, 간암, 췌장암, 골암, 결합 조직암, 피부암, 뇌암, 갑상선암, 백혈병, 호지킨(Hodgkin) 질환, 림프종, 다발성 골수종 및 혈액암으로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조성물.
- 서열번호 5의 아미노산 서열로 구성되는 혈관신생 억제 펩타이드.
- 제14항의 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
- 제15항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
- 제16항의 발현 벡터를 포함하는 인간을 제외한 형질전환체.
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