KR101112643B1 - ＴＮＦ-α의 경쟁적 저해제로서 ＩＧＦＢＰ-５의 용도 - Google Patents

ＴＮＦ-α의 경쟁적 저해제로서 ＩＧＦＢＰ-５의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편을 포함하는 TNFR1에 특이적으로 결합하는 리간드 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 구체적으로 본 발명은 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편, 이들을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 또는 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 TNF-α 저해제 및 세포 사멸 촉진제에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, IGFBP-5 단백질은 인체 내 존재하는 단백질이므로 합성약에서 발생될 수 있는 부작용 없이 TNF-a의 과발현으로 인해 생기는 염증질환과 같은 각종 질병을 비롯하여 여러 가지 암 등의 질병에 대한 예방 및 치료가 가능하게 될 것이다.
IGFBP-5, TNF-α, TNFR1

Description

ＴＮＦ-α의 경쟁적 저해제로서 ＩＧＦＢＰ-５의 용도{Use of IGFBP-5 as a competitive inhibitor of TNF-α}
본 발명은 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편을 포함하는 TNFR1에 특이적으로 결합하는 리간드 및 이의 용도에 관한 것으로서 보다 구체적으로 본 발명은 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편, 이들을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 또는 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 TNF-α 저해제 및 세포 사멸 촉진제에 관한 것이다.
IGFBP-5는 IGF (insulin-like growth factor) binding protein family의 하나이며, 세포증식을 비롯하여 여러 세포 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. IGFBP-5는 핵으로 위치하는 신호인 NLS (nuclear localization signal)을 가지고 있어 핵에 위치하며 또한 세포 밖으로 분비되는 단백질인데 핵에서의 기능과 세포 밖으로 분비된 IGFBP-5의 기능이 아직 잘 연구되어있지 않다. 하지만 최근의 논문에서 핵에서의 IGFBP5의 기능이 transactivation의 기능을 가질 것으로 보고되 었다. IGFBP5는 크게 3가지 영역 (N-terminus, L-domain, and C-terminus)으로 이루어져 있다. N-terminus에는 IGF binding site가 위치해 있고, C-terminus에는 NLS가 있다. 그리고 L-domain과 C-terminus에 heparin binding site가 있다. IGFBP5의 glycosylation과 phosphorylation은 IGFBP5의 heparin binding을 저해하는 것으로 알려져 있지만 glycosylation과 phosphorylation의 정확한 생물학적 의미는 아직 밝혀지지 않았다.
IGFBP5는 IGF-I 혹은 IGF-II가 receptor에 결합하는 것을 방해함으로써 IGF-I, IGF-II의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있는 반면 IGF-independent 한 기능도 보고되고 있다. IGFBP5의 transgenic mice와 knockout mice를 통해 IGFBP5의 기능을 연구한 결과들도 있다. IGFBP5 transgenic mice의 경우 출생 후 치사율 (neonatal mortality) 이 높고 성장저해 및 저조한 근육발달을 보였다. 또한 암컷의 경우 불임을 보였으며 유선발달에 있어서 premature cell death를 보였다. IGFBP5 knockout mice의 경우 유선의 퇴화가 늦어지는 것을 관찰함으로써 IGFBP5의 기능은 apoptosis를 일으키는 것으로 알려졌다.
TNF-α(tumor necrosis factor-alpha)는 프로-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인으로서 염증 및 다른 유해한 질환 (예컨대, 내독소 노출에 의한 패혈증 쇼크와 같은)을 종종 유발한다고 알려져 있다. TNF-α는 대식세포, 단핵구 및 자연 킬러세포에서 분비되며 염증 및 면역 반응에 중요한 역할을 한다. TNF-α는 시험관내 또는 생체내에서 다음을 포함하는 다양한 효과를 나타낸다: (i) 맥관 혈전증(vascular thrombosis) 및 종양 괴사(tumor necrosis); (ii) 염 증(inflammation); (iii) 대식세포(macrophages) 및 호중구(neutrophils)의 활성화; (iv) 백혈구증가증(leukocytosis); (v) 세포사멸(apoptosis); and (vi) 쇼크(shock). TNF-α는 또한 다양한 형태의 암(cancer), 관절염(arthritis), 건선(psoriasis), 내독소 쇼크(endotoxic shock), 패혈증(sepsis), 자기면역질환(autoimmune diseases), 감염(infections), 비만(obesity), 및 악액질(cachexia)을 포함하는 다양한 질환과 관련되어 왔다.
본 발명자들은 IGFBP5의 새로운 기능을 연구하였다. IGFBP5 과발현 세포에서 TNFR1의 mRNA 발현이 증가되는 것을 관찰하였고 IGFBP5와 TNFR1를 같이 co-transfection 한 세포에서 TNFR1이 세포내로 internalization되는 것을 관찰함으로써 IGFBP5가 TNFR1의 리간드로 작용할 가능성이 있음을 알았다. 그리하여 IGFBP5를 안정하게 과발현시킨 세포주의 배양배지에서 분비된 IGFBP5를 정제하였다. 정제된 IGFBP5를, TNFR1을 안정하게 발현시킨 세포주에 처리하였을 때 TNFR1의 internalization이 유도됨을 관찰하였고 이 실험으로 IGFBP5가 TNFR1의 새로운 리간드임을 밝혔다. 현재까지 알려져 있는 TNFR1의 리간드인 TNF-a와의 상관관계를 연구한 결과 IGFBP5가 TNFR1 결합에 대해 TNF-a와 competitive inhibitor로 작용하는 것을 확인하였다. 이러한 결과와 일치하여 IGFBP5를 과발현하였을 때와 정제된 IGFBP5를 처리하였을 때, TNF-a에 의해 활성화된 NF-kB signaling pathway를 저해하는 것을 밝혔다. 이에 본 발명자들은 TNF-a의 과발현으로 인해 생기는 Rheumatoid arthritis를 비롯하여 여러 가지 암 등의 질병에 대한 치료제로서 IGFBP5가 사용될 수 있음을 제안한다.
본 발명의 목적은 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편, 이들을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 또는 상기 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 TNF-α 저해제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편 또는 이들을 코딩하는 유전자와 TNFR1, 둘다를 유효성분으로 포함하는 세포 사멸 촉진제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 TNF-α 저해제 또는 세포 사멸 촉진제를 포함하는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편을 포함하는 TNFR1에 특이적으로 결합하는 리간드를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편 또는 이들을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 TNF-α 저해제를 제공한다.
상기 IGFBP-5 단백질은 IGF (insulin-like growth factor) binding protein family의 하나이며, 세포증식을 비롯하여 여러 세포 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 단백질을 말한다. 상기 IGFBP-5 단백질의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 염기서열은 NCBI (NM000599)에서 얻을 수 있다.
상기 변이체는 TNF-α 저해활성을 갖는 어떤 서열의 IGFBP-5 변이체도 될 수 있으나, 바람직하게는 IGFBP-5 단백질과 90%이상의 상동성을 가지는 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 용어,“상동성”이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 IGFBP-5 단백질을 코딩하는 아미노산 서열(서열번호 2)과 바람직하게는 90%이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 98%이상 동일할 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.
또한 본 발명의 IGFBP-5 단백질 또는 이의 상동체는 효소 활성을 가지는 한 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 서열 변이체란 천연의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 변이체 단백질은 야생형 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내나, 단백질의 특성이 변형된 변이체일 수 있다. 바람직하게는 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증대될 수 있다. 예를 들어, 천연의 단백질이 효소 활성을 보이는 않는 강산성이나 강알카리에서도 효소활성을 나타낼 수 있고, 저온이나 고온에서도 효소 활성을 나타낼 수 있다. 또한 아미노산 서열상의 변이와 수식으로 IGFBP-5 단백질에 반응하는 기질 특이성을 강화되거나 단백질과 반응하는 기 질의 종류가 확대된 변이체일 수 있다.
상기 단편은 TNF-α 저해활성을 갖는 어떤 IGFBP-5 단편 또는 펩타이드도 될 수 있으나, 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 L domain을 포함한다. IGFBP5 단백질은 크게 3가지 영역 (N-terminus, L-domain, and C-terminus)으로 이루어져 있고, 본 발명자들은 IGFBP5 단백질에서 TNFR1와 상호작용하는 부위가 L domain임을 밝혔다.
상기 IGFBP-5 단백질을 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 가진다. 또한, 상기 L domain를 코딩하는 유전자는 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 가진다.
본원에 사용된 용어, "유전자"는 폴리펩타이드, 전구체, 또는 RNA (예: rRNA, tRNA)를 생산하는데 필요한 코딩 서열을 포함하는 핵산 (예: DNA) 서열을 언급한다. 폴리펩타이드는 완전한 길이의 코딩 서열에 의해 코딩되거나, 완전한 길이 또는 단련의 목적하는 활성 또는 기능적 특성 (예: 효소적 활성, 리간드 결합, 시그널 도입, 면역원성 등)이 유지되는 한, 코딩 서열의 일부분에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 상기 용어는 구조 유전자의 코딩 영역 및 상기 유전자가 완전-길이의 mRNA의 길이에 상응하도록 말단에서 약 1 kb 이상의 거리로 5' 및 3' 말단의 코딩 영역에 인접하게 위치된 서열을 포함한다. 코딩 영역의 5'에 위치되고 mRNA에 존재하는 서열을 5'-비해독 서열로 언급한다. 코딩 영역의 3' 또는 아래에 위치되고 mRNA에 존재하는 서열을 3'-비해독 서열로 언급한다. 용어 "유전자"는 유전자의 cDNA와 게놈 형태 모두를 포함한다. 게놈 형태 또는 유전자의 클론은 "인트론" 또 는 "삽입 영역" 또는 "삽입 서열"로 불리는 비-코딩 서열에 의해 방해되는 코딩 영역을 포함한다. 인트론은 핵 RNA (hnRNA)로 전사되는 유전자의 절편이다; 인트론은 조절 요소, 예를 들어 인핸서를 포함할 수 있다. 인트론은 핵 또는 초기 전사물로부터 제거되거나 "스플라이싱"된다; 따라서, 인트론은 mRN 전사물에는 존재하지 않는다. mRNA는 해독 동안 기능은 초기 폴리펩타이드의 아미노산의 서열 또는 순서를 특정하는 기능을 한다.
유전자 발현은 유전자에 코딩된 유전적 정보를 유전자의 (예를 들어, RNA 폴리머라제의 효소적 작용에 의한) 전사를 통해 RNA (예: mRNA rRNA, tRNA 또는 snRNA)로 전환시키고, 단백질 코딩 유전자에 대해, mRNA의 "해독"을 통해 단백질로 전환시키는 과정을 언급한다. 유전자 발현은 과정 중의 많은 단계에서 조절될 수 있다; "상향-조절" 또는 "활성화는 유전자 발현 산물의 생성을 증가시키는 조절을 언급하며, "하향-조절" 또는 "억제"는 산물을 감소시키는 조절을 언급한다. 상향-조절 또는 하향-조절에 관련되는 분자 (예: 전사 인자)를 종종 각각 "활성화제" 및 "억제제"라 부른다. 인트론을 포함하는 것에 추가하여, 유전자의 게놈 형태는 또한 RNA 전사물에 존재하는 서열의 5' 및 3' 말단 모두에 위치된 서열을 포함할 수 있다. 이들 서열은 "플랭킹 (flanking)" 서열 또는 영역이라 언급된다 (이들 플랭킹 서열은 RNA 전사물에 존재하는 비-해독 서열에 대해 5' 또는 3'로 위치된다). 5' 플랭킹 영역은 조절 서열, 예를 들어 유전자의 전사를 조절하거나 영향을 주는 프로모터 및 인핸서를 포함할 수 있다. 3' 플랭킹 영역은 전사의 종결, 전사후 절단 및 폴리아데닐화를 지시하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 IGFBP-5 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 유효성분으로 포함하는 TNF-α 저해제를 제공한다. 이 경우, 상기 IGFBP-5 유전자는 재조합 발현 벡터의 조절요소들과 작동가능하게 연결되어 삽입되어 있다.
본원에 사용된 용어, "벡터"는 하나의 세포로부터 또 다른 세포로 DNA 절편을 전달하는 핵산 분자에 대해 사용된다. 벡터는 종종 플라스미드, 박테리오파아지 또는 식물 또는 동물 바이러스로부터 유래된다.
본원에 사용된 용어, "발현 벡터"는 목적하는 코딩 서열 및 특정 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 적합한 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA를 언급한다. 원핵세포에서의 발현에 필요한 핵산 서열은 일반적으로, 다른 서열과 함께, 프로모터, 오퍼레이터 (임의), 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 인핸서, 및 종결 및 폴리아데닐화 시그널을 이용하는 것으로 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어,“재조합 발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질, 본 발명에서는 IGFBP-5 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
상기 본원에서 사용된 용어,“작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 등을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.
본 발명의 구체적인 양태에서는, 사이토메가로 바이러스로부터 분리한 프로모터 (promoter)를 포함하며 c-Myc 단백질의 일부분을 만들며 6개의 Histindine을 만드는 유전자가 포함된 플라스미드인 pcDNA3.1-Myc-His (Invitrogen 사)를 이용하여 IGFBP-5-Myc-His를 제작하였다. 도9a의 개열지도를 갖는다. 이에 대한 대조군으로서 IGFBP-5 유전자를 포함하지 않은 pcDNA3.1-Myc-His 벡터를 사용하였다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터가 도입된 형질전환체를 유효성분으로 포함하는 TNF-α 저해제를 제공한다.
본 발명에서 숙주세포로의 “형질전환”은 핵산을 원핵세포 또는 진핵세포로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민, 바이러스벡터 이용한 트랜스펙션 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
적절한 숙주세포에는 자가 또는 타가유래의 동물세포가 될 수 있다. 본 발명의 구체적인 양태에서는, 상기 IGFBP-5-Myc-His로 형질전환된 인간 태아 신장세포주인 HEK (Human Embryonic Kidney) 293 세포주, BP5/293을 제작하였다.
TNF는 외부항원의 감염에 의해 활성화된 T-백혈세포와 macrophage에 의해 주로 생산된다. TNF는 TNFR1에 반응하여 전사조절인자인 NF-kB을 활성화 시켜 염증반응과 면역기능을 변화시킬 수 있는 유전자 발현을 유도할 수 있다. 또한, TNF-α에 의해 활성화될 NF-kB의 한 subunit인 p65는 핵으로 이동하여 세포 성장에 필요한 유전자들의 전사를 촉진시킨다. TNF-a는 조직에 따라 또는 농도에 따라 세포성장 또는 세포사멸을 일으킬 수 있다고 보고되고 있다. 하지만 본 특허에서는 TNF-a가 세포사멸이 아닌 세포성장을 촉진시키는 조건에서 IGFBP-5가 TNF-a와는 반대로 세포사멸을 일으켰음을 보여주었다. 또한 IGFBP-5가 TNFR1를 통해서 세포사멸을 일으킨다는 것을 밝혔다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편은 TNFR1에 경쟁적으로 결합하여 TNF-α이 TNFR1에 결합하는 것을 저해함으로써 TNF-α 저해제로써 사용될 수 있다. 즉, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편은 TNF-α의 경쟁적 저해제로써 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백 질, 변이체 또는 단편은 상기 TNF-α의 TNFR1에의 결합을 저해함으로써 NF-kB 활성화를 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편은 상기 NF-kB 활성화를 억제함으로써 p65의 핵이동을 저해할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편은 TNFR1 존재 하에 세포 사멸을 촉진시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편과 TNFR1, 둘다를 유효성분으로 포함하는 세포 사멸 촉진제를 제공한다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편이 TNFR1에 결합되면 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편의 세포 사멸 작용이 현저하게 촉진된다. IGFBP-5 단백질과 TNFR1는 메카니즘상의 파트너로서 서로 상호작용하여 세포 사멸 촉진 작용에 상승적 효과를 발휘한다.
상기 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편은 IGFBP-5 단백질을 코딩하는 유전자, IGFBP-5 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터 또는 형질전환체를 통해서 발현된 IGFBP-5 단백질, 변이체 또는 단편을 포함한다.
본원에 사용된 용어, "세포 사멸(apoptosis;아폽토시스)"은 세포막이나 세포소기관 등이 정상적인 형태를 유지하면서 우선 핵내의 크로마틴이 응집하여 세포전 체가 위축하면서 단편화하여 아폽토시스소체(apoptotic body)를 형성하여 세포사(細胞死)까지 이르는 경우를 말한다. 원래는 세포사의 형태학적 특징을 나타내는 용어였으나 그 후 다음과 같은 메카니즘을 포함하는 생리학적인 세포사를 의미하는 용어로써 사용되게 되었다. 이것에 대하여, 우선 세포막 및 세포질의 형태학적 변화가 일어나고 핵 및 핵막은 정상적인 형태를 유지하는 것 같은 세포사의 형태가 괴사(네크로시스)이다. 아폽토시스로 죽어가는 세포내에서는 DNA의 단편화, 즉 뉴클레오솜간에서 DNA가 무작위적으로 절단되는 현상이 일어나고, 그 DNA를 추출하여 전기영동하면 약 200염기쌍마다 사다리모양의 패턴이 나타나는 것이 특징이다. 일반적으로 세포의 아폽토시스에 의한 죽음은 같은 세포내에서의 새로운 단백질합성에 의존하고 있고 아폽토시스를 유도하는 유전자는 자살유전자(suicide gene)라고도 불리워진다. 세포가 아폽토시스에 이르는 과정은 다양하다. 예를 들면, 소위 Fas항원, 종양괴사인자(TNF) 등 몇 가지의 세포막상수용체는 세포의 아폽토시스에 이르는 신호를 전달할 수가 있다. 개체발생에 있어 형태형성의 과정이나 생장한 개체의 조직에서 항상성의 유지 등에 있어 세포사가 중요한 역할을 하고 있다. 이러한 세포사는 유전적으로 정확히 프로그램되어 있는 것으로 생각되고(프로그램세포사), 대부분의 경우 그것은 아폽토시스의 형태를 나타낸다. 또한, 가슴샘조직에 있어서는 절반의 림프구가 가슴샘조직내에서 죽음의 전기를 취하고 이것이 자기반응성 림프구배제(면역관용)에서 중요한 메카니즘의 일부라고 생각되고 있지만, 이때의 세포사도 주로 아폽토시스에 의한다. 기타, 부신피질호르몬이나 X선등, 생장인자의 고갈 등에 의하여 유동되는 림프계세포의 죽음이나 킬러세포에 의한 표적세포 파괴, 소화관상피세포의 갱신 등도 아폽토시스에 의하고 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 세포 사멸 촉진제의 스크리닝 방법을 제공한다: a) IGFBP-5 단백질과 TNFR1을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및, b) 상기 동물세포에서 IGFBP-5 단백질과 TNFR1의 상호작용이 촉진되는지 여부를 결정하는 단계. 상기 a) 단계에서 IGFBP-5 단백질과 TNFR1을 발현하는 동물세포는 자신의 IGFBP-5 유전자와 TNFR1 유전자를 발현하는 동물세포를 사용하거나 본 발명의 실시예 1과 같이 IGFBP-5 재조합 벡터와 TNFR1 재조합 벡터를 제작한 후 동물세포에 형질전환시켜 만들 수 있다. 상기 b) 단계에서 IGFBP-5 단백질과 TNFR1의 상호작용이 촉진되는지 여부는 본 발명의 실시예 4와 같이 양자의 상호작용 정도를 측정함으로써 알 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계들을 포함하는 세포 사멸 저해제의 스크리닝 방법을 제공한다: a) IGFBP-5 단백질과 TNFR1을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및 b) 상기 동물세포에서 IGFBP-5 단백질과 TNFR1의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계. 상기 a) 단계에서 IGFBP-5 단백질과 TNFR1을 발현하는 동물세포는 자신의 IGFBP-5 유전자와 TNFR1 유전자를 발현하는 동물세포를 사용하거나 본 발명의 실시예 1과 같이 IGFBP-5 재조합 벡터와 TNFR1 재조합 벡터를 제작한 후 동물세포에 형질전환시켜 만들 수 있다. 상기 b) 단계에서 IGFBP-5 단백질과 TNFR1의 상호작용이 저해되는지 여부는 본 발명의 실시예 4와 같이 양자의 상호작용 정도를 측정함으로써 알 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 TNF-α 저해제 또는 상기 세 포 사멸 촉진제를 포함하는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제를 제공한다.
상기 TNF-α 과발현 관련 질환은 당업계에서 TNF-α의 과발현에 의해 유발된다고 알려진 모든 질환을 포함하며, 예컨대, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 연소성 류마티스양 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 척추관절병증(spondyloarthropathies), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 만성 심부전(chronic heart failure), 당뇨병(diabetes mellitus), 전신 홍반성 루프(systemic lupus erythematosus), 피부경화증(scleroderma), 유육종증(sarcoidosis), 크론병(Crohn's Disease), 건선(psoriasis), 다발성근염/피부근염(polymyositis/dermatomyositis), 다발성골수증(multiple myeloma), 골이형성증후군(myelodysplastic syndrome), 급성골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease), 에이즈 복합성 치매(AIDS dementiacomplex), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 우울장애(depression), 패혈증(sepsis), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 패혈증(hematosepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 베체트 증후군(Behcet's syndrome), 이식편대 숙주질환(graft-versus-host disease), 포도막염(uveitis), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 천식(asthma), 급성췌장염(acute pancreatitis), 치주질환(periodontal disease), 악액질(cachexia), 중추 신경계 부상(central nervous system injury), 암(cancer)(예컨대, 폐암(lung carcinomas), 식도암(esophagus carcinoma), 위선암(gastric adenocarcinoma) 및 전립선암(prostate carcinoma)), 바이러스성 호흡 질환(viral respiratory disease), 및 비만(obesity)로 구성된 군에서 선택될 수 있다 (참조: US2008234385 "Method For Inhibiting Tnf-Alpha"; Ogata H. et al Curr Pharm Des. 2003; 9(14): 1107-13; Moller D. R. et al J Intern Med. 2003; 253(1): 311-40; Taylor P. C. et al Curr Pharm Des. 2003; 9(14): 1095-106; Wilkinson N. et al Arch Dis Child. 2003; 88(3): 186-91; Nishimura F. et al J Periodontol. 2003; 74(1): 97-102; Weinberg J. M. et al Cutis. 2003; 71(1): 41-5; Burnham E. et al Crit Care Med. 2001; 29(3): 690-1; Sack M. et al Pharmacol Ther. 2002; 94(1-2): 123-35); Barnes P. J. et al Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2002; 42:81-98; Mageed R. A. et al Lupus 2002; 11 (12): 850-5; Tsimberidou A. M. et al Expert Rev Anticancer Ther. 2002; 2(3): 277-86; Muller T. et al Curr Opin Investig Drugs. 2002; 3(12): 1763-7; Calandra T. et al Curr Clin Top Infect Dis. 2002; 22:1-23; Girolomoni G et al Curr Opin Investig Drugs. 2002; 3(11): 1590-5; Tutuncu Z. et al Clin Exp Rheumatol. 2002; 20(6 Suppl 28): S146-51; Braun J. et al Best Pract Res Clin Rheumatol. 2002; 16(4): 631-51; Barnes P. J. et al Novartis Found Symp. 2001; 234:255-67; discussion 267-72; Brady M. et al Baillieres Best Pract Res Clin Gastroenterol. 1999; 13(2): 265-89; Goldring M. B. et al Expert Opin Biol Ther. 2001; 1(5): 817-29; Mariette X. Rev Prat. 2003; 53(5): 507-11; Sharma R. et al Int J Cardiol. 2002; 85(1): 161-71; Wang C. X. et al Prog Neurobiol. 2002; 67(2): 161-72; Van Reeth K. et al Vet Immunol Immunopathol. 2002; 87(3-4): 161-8; Leonard B. E. et al Int J Dev Neurosci. 2001; 19(3): 305-12; and Hays S. J. et al Curr Pharm Des. 1998; 4(4): 335-48).
상기 TNF-α 과발현 관련 질환은 바람직하게는 TNF-α이 강력한 유발자(potent inducer)라고 알려진 염증질환이다.
또한, 바람직하게는 TNF-α과발현 관련 질환 치료제에 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가적으로 포함될 수 있다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia. 1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA] 참조).
본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용되는"은 독성 또는 안정성 관점으로부터 인간을 포함하는 포유동물에 투여를 위해 적합함을 일반적으로 의미한다. 담체는 희석액, 부형제, 충전재, 접착제, 습윤제, 붕해제, 흡수 개선제, 계면 활성제, 흡수제 캐리어, 제약 분야에서 공통적으로 사용되는 광택제를 포함한다. 필요하다면, 향료나 감미료 등이 첨가될 수도 있다. 담체는 또한 pH, 삼투압, 점성, 무균도, 지질도, 용해도등 또다른 조건을 변형시키기 위해 약제학적으로 허용가능한 다른 부형제를 함유할 수 있다. 투여된 후 지속되거나 지연된 방출을 허용하는 약제학적으로 허용가능한 부형제 또한 포함될 수 있다.
적절한 부형제는 예를 들어 물, 샐린, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 원하는 경우, 투여되는 약제학적 조성물은 예를 들어 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올리에이트, 트리에탄아민 소듐 아세테 이트 등과 같은 습윤제 또는 에멀젼제, pH 완충제 등과 같은 소량의 비독성 보조 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 치료제 조성물은 예컨대, 전신적 또는 경구 경로에 의한 투여 경로를 통해 주입될 수 있다. 전신적 투여의 바람직한 형태는 주사, 일반적으로 정맥 주사를 포함한다. 다른 주사 경로는 예컨대, 피하, 근육내 또는 복강이 사용될 수 있다. 전신적 투여의 대체적 수단은 담즙산 또는 푸시딘 산 또는 다른 계면 활성제과 같은 침투제를 사용한 경점막 및 경피 투여를 포한한다. 또한 본 발명의 폴리펩타이드 또는 다른 화합물은 장용제 또는 캡솔화 제제, 경구 투여제로 제제화하는 것도 가능하다. 이들 화합물의 투여는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 국소적 및/또는 부분적일 수 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 치료제 조성물은 리포좀을 포함할 수 있다. 약제학적 투여에 적합한 임의의 리포좀은 DOTAP:콜레스테롤 나노입자이다.
본 발명의 치료제 조성물이 핵산을 포함하는 양태에서, 핵산은 벡터에 포함될 수 있다. 예를 들어, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 특정 양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 일부 양태에서, 아데노바이러스는 프로타민과 함께 제형화된다. 임의의 수의 바이러스 입자가 환자에게 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 투여 당 약 108 내지 약 1014개의 바이러스 입자가 환자에게 투여된다.
핵산 조성물이 투여되는 본 발명의 일부 양태에서, 핵산 조성물은 하나 이상의 지질을 포함할 수 있다. 상술되는 어떠한 지질도 이러한 지질-핵산 조성물에 포 함될 수 있다. 이러한 지질의 예는 DOTAP 및 콜레스테롤, 또는 이의 유도체를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치료적 유효량"은 원하는 치료 요법에 따라 투여할 때, 원하는 치료적 효과 또는 반응을 일으키거나 원하는 이익을 제공하는 본 발명의 IGFBP-5 단백질 등 활성제의 함량을 의미한다. 실제로 투여되는 조성물의 양은 이상의 심각성, 투여되는 조성물, 나이, 체중, 및 각 환자의 반응, 선택된 투여 경로와 같은 치료하려는 질환에 속하는 환경에 기초하여, 의사에 의해 결정될 수 있으나, IGFBP-5 단백질 또는 그 단편인 의약의 경우, TNF-α 과발현 관련 질환 환자에게 투여할 약학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양은 0.01 내지 12.5 ㎎/㎏/day 정도가 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 있어서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 IGFBP-5 단백질, 변이체, 단편을 포함하는 TNFR1에 특이적으로 결합하는 리간드를 제공한다.
본원에 사용된 용어, "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 리간드와 수용체 또는 펩타이드의 상호작용에 대해 사용되는 경우, 상호작용이 단백질 상의 특정 구조의 존재에 의존한다는 것을 의미한다.
본 발명에 따르면, IGFBP-5 단백질은 인체 내 존재하는 단백질이므로 합성약에서 발생될 수 있는 부작용 없이 TNF-a의 과발현으로 인해 생기는 각종 질병을 비 롯하여 여러 가지 암 등의 질병에 대한 예방 및 치료가 가능하게 될 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 재조합 벡터 IGFBP-5-Myc-His과 IGFBP-5-GFP의 제작
IGFBP-5 유전자는 HEK293 세포주 (ATCC) 에서 RNA를 추출한 후 Primers (BP5F: 5'-CCGCAAGCTTATGGTGTTGCTCACCGC-3'; BP5R: 5'- GCCCGGATCCATCTCAACGTTGCTGCT-3')를 이용하여 RT-PCR하여 IGFBP-5의 유전자(cDNA)를 얻었다. 상기 RT-PCR에서 얻은 IGFBP-5 유전자를 각각 pcDNA3.1/myc-His version C (Invitrogen사)와 pEGFP-N1 (Clontech사) 벡터의 HindIII 와 BamHI site 사이에 클로닝하여 IGFBP-5-Myc-His (도 9a)와 IGFBP-5-GFP 플라스미드 (도 9b)를 제작하였다. Amino acid sequencing을 통해 돌연변이 없이 클로닝된 IGFBP-5 유전자를 확인하였다. IGFBP-5 유전자(cDNA)의 염기서열과 IGFBP-5 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 1 및 서열번호 2로 정의하였다.
실시예 2. IGFBP5의 과발현으로 인한 세포사멸
IGFBP5의 기능을 연구하기 위해 HEK293 세포주에 IGFBP-5-GFP를 transient transfection을 통해 과발현시킨 후 TUNEL 염색 방법으로 세포사멸을 측정하였다. TUNEL 방법은 다음과 같이 진행하였다. HEK293 세포를, 6 well plate를 사용하여 젤라틴 코팅한 커버글라스위에서 24시간 배양한 후, GFP mock vector를 대조군으로 하여 well 당 400ng의 IGFBP5-GFP를 Effectene (Qiagen)을 사용하여 transient transfection 하였다. Transfection 24시간 후 1X PBS 2ml 로 2회 세포를 세척하였으며, 4% paraformaldehyde를 2ml 처리하여 상온에서 10분 동안 세포를 고정하였다. PBS로 3회 세척한 후, TUNEL 용액(Roche - In Situ Cell Death Detection Kit, TMR red)으로 37℃에서 1시간 동안 염색하였다. 염색반응이 끝난 후, PBS 2ml로 2회 세포를 세척하고 커버글라스를 mounting reagent를 사용하여 슬라이드위에 부착하고 매니큐어로 sealing한 후 형광현미경에서 관찰하였다 (그림 1A). GFP 형광(녹색)을 나타내면서 TUNEL 염색(빨간색)된 세포의 수를 세었다 (그림 1B). 그 결과 GFP vector만 transfection 한 세포에 비해 IGFBP5-GFP가 과발현된 세포에서 세포사멸이 증가한 것을 관찰하였다. 따라서 IGFBP5가 세포사멸에 관여한다는 것을 확인하였다.
실시예 3. IGFBP5의 과발현으로 인한 TNFR1의 mRNA 발현 증가와 세포사멸 촉진
IGFBP5가 세포사멸을 촉진하는 mechanism을 연구하기 위해 Myc-tagging된 IGFBP5를 cloning하여 HEK293 세포주에 stable transfection하여 IGFBP5를 과발현하는 HEK293 세포주를 만들었다 (BP5/293). cDNA microarray 분석을 통한 BP5/293 세포주의 유전자 발현 양상을 연구하기 위해 Trizol (Invitrogen)을 사용하여 Invitrogen 사에서 제공한 방법대로 total RNA를 분리하였다. Total RNA를 정량적으로, 정성적으로 검토한 후 Genomic Tree 회사에 보내 cDNA microarray분석을 하였다. Myc-vector 만 transfection된 HEK293 세포주로부터 추출된 RNA를 대조군으로 사용하였다. 많은 유전자들의 발현에 변화가 있었는데 그 중에서도 TNFR1의 발현이 증가되었다. 이 결과를 RT-PCR (reverse-transcription PCR)로 다시 확인하였다 (그림 2). TNFR1의 RT-PCR은 3 ug 의 total RNA를 사용하여 SuperScriptII (Invitrogen)로 cDNA를 만든 후 EF Taq polymerase (한국 솔젠트사) 와 두 primer (TNFR1 F: 5'-GTGCACCTGCCATGCAGGTTTCTT-3' 와 TNFR1 R: 5'-TGTCCTCCCACTTCTGAAGGGGGT-3') 를 사용하여 솔젠트 회사에서 제공한 프로토콜에 따라 PCR을 수행하였고 그 program은 다음과 같다.
Figure 112008090992270-pat00001
cDNA 양에 관한 대조군으로서 GAPDH RT-PCR도 수행하였고 그 PCR 프로그램은 위와 같다.
TNFR1의 발현이 IGFBP5에 의한 세포사멸에 미치는 영향을 연구하기 위해 TNFR1와 IGFBP5를 HEK293에 co-transfection 하고 72시간 배양 후 MTT 방법을 사용하여 세포사멸을 조사하였다 (그림 3A). TNFR1 plasmid의 양을 고정한 채 IGFBP5의 양을 농도에 따라 증가시켰을 때 IGFBP5 만 발현시켰을 때에 비해 TNFR1을 함께 발 현시켰을 때 세포사멸이 IGFBP5 농도에 따라 증가됨을 관찰하였다. 따라서 IGFBP5에 의한 세포사멸은 TNFR1 발현으로 인해 그 효과가 더 증폭된다는 것을 알았다. 이러한 결과는 세포사멸의 또 다른 측정방법인 caspase3의 활성을 측정하였는데 Pro-caspase3가 caspase3로 분해되는 정도를 측정함으로써 caspase 3의 활성정도를 측정하는데 IGFBP5와 TNFR1이 같이 co-transfection 되었을때 pro-caspase3의 양이 감소하는 것으로 pro-caspase3의 분해가 증가하였음을 나타내었다 (그림 3B).
실시예 4. IGFBP5는 특이적으로 TNFR1와 상호작용한다.
IGFBP5가 TNFR1과 interaction 하는지 알아보기 위해 IGFBP5-Myc 과 Flag-TNFR1을 HEK293 세포주에 co-transfection 하였다. Transfection 36시간 후 RIPA buffer로 세포를 lysis 하고 whole cell lysate에서 Flag antibody를 사용하여 co-immunoprecipitation을 하였다. 또한 IGFBP5가 secretion되는 단백질임으로 conditioned media를 이용하여 co-immunoprecipitation도 수행하였다. conditioned media에서의 co-immunoprecipitation은, transfection하고 24시간 뒤 media를 제거하고 PBS로 세포를 세척한 뒤 Opti-MEM에 anti-Flag를 1/10,000로 희석하여 넣고 37oC incubator에서 8시간 incubation하였다. 그 결과 HEK293의 whole cell lysate에서는 IGFBP5와 TNFR1이 상호작용을 하지 않은 반면 conditioned media에서 두 단백질이 상호작용하는 것을 관찰하였다 (그림 4 A와 B). 따라서, conditioned media 에서 상호작용했다는 것은 IGFBP-5가 분비되어 세포막에 존재하는 TNFR1와 결합하 는 것을 의미하며 IGFBP-5가 TNFR1의 리간드라는 것을 증명하는 것이다. IGFBP5와 TNFR1의 interaction이 IGFBP5-specific 한 것인지 알아보기 위해 IGFBP family 중에서 IGFBP5와 매우 유사성이 높은 IGFBP3를 발현하는 plasmid를 사용하여 IGFBP5와 같은 조건에서 TNFR1와의 상호작용을 실험하였다 (그림 4C). 그 결과 IGFBP3는 TNFR1과 상호작용하지 않는 것을 알았다. 따라서 IGFBP5-TNFR1 상호작용은 IGFBP5-specific 함을 알았다.
IGFBP5의 TNFR1-interacting region 을 mapping 하기위해 IGFBP5의 truncation mutant를 PCR을 이용하여 만들었다 (그림 5A). 그 방법은 다음과 같다. IGFBP5-Myc plasmid를 PCR template로 사용하고 IGFBP5 N-terminal domain만 있는 construct는 BP5N5' (5'CCGCAAGCTTGCTGGGCTCCTTCGTGCACT-3') 과 BP5N3' (5‘-GCCCCTCGAGGGCAAACCCCGCGGCCGTGC-3') primer들을 사용하여 제조하였다. IGFBP5 L-domain만을 가진 construct와 IGFBP5 C-terminus 만 발현하는 construct는 각각 BP5L5' (5'-CCGCAAGCTTGCTCAACGAAAAGAGCTACC-3') 과 BP5L3' (5'-GCCCCTCGAGGCTCAGACTCCTGTCTCATC-3'), BP5C5' (5'-CCGCAAGCTTGCAGGGCCCCTGCCGCAGAC-3') 과 BP5C3' (5'-GCCCCTCGAGGCTCAACGTTGCTGCTGTCG-3') primer들을 사용하여 PCR을 하였다. IGFBP5가 GC-rich 한 유전자이기 때문에 denaturation의 효율을 높이기 위해 Taq polymerase를 제외한 모든 조성물들을 섞은 후 95℃에서 15분 가열하고 얼음물에서 5분 incubation하였다. EF-Taq DNA polymerase (한국 솔젠트사)를 넣은 후 다음과 같은 PCR program으로 25 cycle PCR을 수행하였다.
Figure 112008090992270-pat00002
PCR 산물은 pSecTaq2/Hygro A (Invitrogen) vector에 cloning 하고 sequencing을 통해 확인하였다.
IGFBP5의 각 truncation mutant plasmid들을 TNFR1과 함께 HEK293 세포주에 co-transfection 한 후 24시간 뒤에 세포주를 PBS로 washing 하고 TNFR1 antibody를 Opti-MEM 배지에 1/10,000으로 희석하여 8시간동안 처리하였다. 배지에 RIPA buffer로 washing 한 protein-A/G-agarose beads (Santa Cruz)를 20ul/tube로 넣어 immunoprecipitation을 하고 truncation mutant의 분자량에 따라 12 혹은 15% SDS-PAGE gel을 사용하여 전기영동을 하고 Myc antibody로 western blotting을 하였다 (그림 5B). TNFR1와 interaction 하는 IGFBP5의 region은 L domain 이라는 것을 확인하였다.
실시예 5. IGFBP5는 TNFR1의 새로운 ligand 이다.
Secretion된 IGFBP5가 TNFR1과 상호작용한다는 결과는 IGFBP5가 TNFR1의 ligand로 작용할 수도 있음을 시사해준다. Ligand와 receptor의 결합은, receptor를 세포내로 internalization을 유발한다고 알려져 있다. 따라서 IGFBP5가 TNFR1의 internalization을 유발할 수 있는지를 조사하였다. Flag-TNFR1 alone 혹은 IGFBP5-GFP와 함께 HEK293 세포주에 co-transfection한 후 세포를 anti-Flag로 염색하여 confocal microscopy를 하였다. 그 결과 IGFBP5-GFP가 발현된 세포주에서 TNFR1이 internalize 되는 것에 비해 대조군인 TNFR1만 transfection 한 세포주에서는 TNFR1이 세포막에 위치해 있음을 보였다 (그림 6). 따라서 본 결과는 IGFBP5가 TNFR1의 ligand임을 제시하였다.
실시예 6. IGFBP5는 TNF-a의 competitive inhibitor이다.
IGFBP5가 기존에 잘 알려진 TNFR1의 ligand인 TNF-a에 대해 어떤 영향이 있는지 알아보기 위해 Flag-TNFR1과 IGFBP5-Myc plasmid를 co-transfection 한 후 TNF-a의 농도를 0, 25, 50, 100 ng/ml로 증가시키면서 anti-TNFR1 (1/10,000dilution) 와 함께 HEK293 세포주에 8 시간 처리한 후 배지를 수거하여 protein-A/G beads를 넣고 immunoprecipitation과 western-blotting 을 수행하였다. 그 결과 세포주에 처리한 TNF-a의 농도가 증가할수록 TNFR1와 interaction 하는 IGFBP5의 양이 훨씬 줄어드는 것을 관찰하였다 (그림 7). 이 결과는 IGFBP5와 TNF-a가 TNFR1-binding에 대해 서로 경쟁하는 것을 알 수 있었다.
따라서 TNF-a와 competitive inhibitor로서 IGFBP5가 TNFR1 downstream에도 영향을 미치는지 알아보기 위해 IGFBP5가 TNF-a에 의해 activation 된 NF-kB signaling pathway를 저해하는지를 테스트하였다. IGFBP5/293 stable cell 을 6-well plate에서 collagen으로 coating 된 cover-glass위에서 36시간 키운 후 PBS로 두 번 washing하고 serum이 없는 Opti-MEM 배지에서 2시간 배양 후 TNF-a를 100ng/ml로 2시간 처리하였다. 4% paraformaldehyde로 10분 고정한 후 0.1% Triton X-100 으로 5분 동안 permeabilize하고 3% BSA로 30분 blocking 한 후 세포를 anti-p65 [NF-kB subunit; 1/250 dilution in dilution buffer (PBS containing 0.1 % BSA, 0.05% Triton X-100)]로 1.5시간 염색하고 AlexaFluor-488로 (1/2500 dilution in dilution buffer) 1시간 염색 후 mounting하여 형광현미경에서 관찰하였다. 일반적으로 TNF-a 에 의해 activation 된 p65는 핵으로 이동하여 세포성장에 필요한 유전자들의 전사를 촉진시킨다. Vec/293 새포주에 TNF-a를 처리하였을 때 대부분의 세포주에서 p65가 핵으로 이동한 반면 IGFBP5/293 세포주에서는 대조군인 vec/293 세포주에 비해 대부분의 p65가 cytoplasm에 위치해 있음을 보였다 (그림 8A). 이것을 전체 세포수에 대해 p65가 핵으로 이동한 세포의 수를 개수하여 막대그래프로 나타내었다. 이러한 결과들은 IGFBP5가 TNFR1에 대해 TNF-a의 competitive inhibitor로 작용하는 것을 증명해준다 (그림 8B).
Secretion 된 IGFBP5 (sIGFBP5)가 TNFR1의 ligand로 작용하며 TNF-a의 competitive inhibitor라는 것을 증명하기 위해 IGFBP5-Myc-His 의 HEK293 stable 세포주를 만들고 그 세포주의 conditioned media를 수거하여 IGFBP5를 partial purification 하였다. IGFBP5 purification은 IGFBP5-Myc 단백질이 Histidine tag을 가지고 있기 때문에 Ni2+ beads (Qiagen)를 이용한 affinity chromatography를 하였다. Ni2+ beads 를 이용한 affinity chromatography는 다음과 같이 수행하였다. 150 mm culture dish에 IGFBP5/293 stable cells을 36시간 배양하여 12 ml/dish Opti-MEM media를 overnigth 처리한 후 수거하여 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5M NaCl, 5mM Imidazole이 되게 각 시약들을 처리하였다. 또한 aprotinin과 PMSF를 각각 10ug/ml, 1mM 되게 처리하였다. 약 200 ml 정도의 conditioned media를, 1x binding buffer (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5M NaCl, 5mM Imidazole in water) 로 washing 한 1.5 ml Ni2+ beads와 섞어 4°C에서 8시간 shakly incubation하였다. Incubation 후 bead를 40ml 1x washing buffer (20ml Tris-HCl, pH 7.5, 0.5M NaCl, 5mM Imidazole in water)로 3번 washing하고 10ml elution buffer (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.5 M NaCl, 40mM Imidazole in water)를 넣어 4°C에서 10분동안 incubation하는 방법으로 3번 elution하였다. Elution 된 IGFBP5는 lyophilization을 수행한 다음 1x PBS로 4°C에서 4시간씩 두 번 dialysis하였다. Eppendorf tube에 0.5-1ml 씩 분주하여 -80°C에 보관하였다. 그 purification 정도는 SDS-PAGE 전기영동 후 silver-staining과 western-blotting 방법으로 측정하였다.
정제된 sIGFBP5의 세포사멸을 TUNEL 방법과 caspase 3 activity 측정 방법으로 실험한 결과 sIGFBP5 역시 세포사멸과 caspase 3 activity를 촉진하는 것을 확인하였다. 이 결과는 또한 정제된 sIGFBP5가 functional 함을 보여준다.
정제된 sIGFBP5를 TNFR1/293 stable 세포주에 처리하여 TNFR1의 internalization을 관찰하였다. sIGFBP5도 transfection 결과처럼 TNFR1의 internalization을 촉진하였다. sIGFBP5를 농도에 따라 TNF-a와 함께 TNFR1/293 세 포주의 배지에 처리하였다. 그 결과 sIGFBP5의 양이 증가할수록 TNF-a에 의한 p65의 핵으로의 translocation이 줄어드는 것을 보였다. 따라서 이 실험결과는 sIGFBP5가 TNF-a의 competitive inhibitor로 작용하는 것을 보여주었다.
도 1은 IGFBP5 과발현으로 인해 세포사멸이 유도된 것을 보여준다.
도 1a는 TUNEL assay 결과를 나타낸 것이다. HEK293세포주에 IGFBP5-GFP 혹은 GFP vector만 transiently transfection 한 후 TUNEL staining을 하였다.
도 1b는 TUNEL assay 결과 염색된 세포수를 세어서 bar graph로 나타낸 것이다.
도 2는 IGFBP5/293 세포주와 Vec/293 세포주에서 TNFR1의 RT-PCR를 나타낸 것이다.
도 3은 IGFBP5에 의한 TNFR1-dependent apoptosis(세포 사멸) 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 IGFBP5와 TNFR1 혹은 vector를 HEK293 세포주에 co-transfection한 72시간 후 MTT assay를 한 결과이다.
도 3b는 IGFBP5와 TNFR1을 co-transfection 한 후 HEK293 cell lysate에서 caspase3 를 western-blot으로 분석한 결과이다.
도 4는 IGFBP5와 TNFR1의 상호작용을 나타낸 것이다.
도 4a는 HEK293 세포주에 IGFBP5-Myc과 Flag-TNFR1를 co-transfection한 후 cell lysate에서 immunoprecipitation을 한 결과이다.
도 4b는 Media에서 IGFBP5와 TNFR1의 interaction을 측정한 결과이다.
도 4c는 IGFBP3와 TNFR1을 co-transfection하여 interaction을 측정한 결과이다.
도 5는 IGFBP5에서 TNFR1와 상호작용하는 region을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명자들이 제작한 IGFBP5 truncation mutant의 모식도와 TNFR1와의 상호작용하는 정도를 나타내었다.
도 5b는 conditioned media에서 TNFR1과 각각의 IGFBP5 mutant와의 상호작용을 측정한 결과를 나타내었다.
도 6은 IGFBP5에 의한 TNFR1의 internalization 유도를 나타내는 confocal microscopy이다.
도 7은 TNF-a에 의한 IGFBP5와 TNFR1 상호작용의 저해를 나타내는 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 TNF-a에 의한 NF-kB activation을 IGFBP5가 저해하는 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 NF-kB의 한 subunit인 p65의 세포내 위치를 나타내는 형광현미경 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 도8a의 결과에서 p65가 핵으로 이동된 세포수를 세어 bar graph로 나타낸 것이다.
도 9a 및 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 재조합 벡터 IGFBP-5-Myc-His 과 IGFBP-5-GFP의 맵들을 나타낸 것이다.
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Claims (19)

  1. 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 IGFBP-5 단백질의 L 도메인(domain) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는,
    류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 연소성 류마티스양 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 척추관절병증(spondyloarthropathies), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease), 만성 심부전(chronic heart failure), 당뇨병(diabetes mellitus), 전신 홍반성 루프(systemic lupus erythematosus), 피부경화증(scleroderma), 유육종증(sarcoidosis), 크론병(Crohn's Disease), 건선(psoriasis), 다발성근염/피부근염(polymyositis/dermatomyositis), 다발성골수증(multiple myeloma), 골이형성증후군(myelodysplastic syndrome), 급성골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia), 파킨슨씨 병(Parkinson's disease), 에이즈 복합성 치매(AIDS dementiacomplex), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 우울장애(depression), 패혈증(sepsis), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 패혈증(hematosepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 베체트 증후군(Behcet's syndrome), 이식편대 숙주질환(graft-versus-host disease), 포도막염(uveitis), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 천식(asthma), 급성췌장염(acute pancreatitis), 치주질환(periodontal disease), 악액질(cachexia), 중추 신경계 부상(central nervous system injury), 암(cancer), 바이러스성 호흡 질환(viral respiratory disease), 및 비만(obesity)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 유전자는 재조합 발현 벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 L 도메인을 코딩하는 유전자는 서열번호 3의 염기서열인 것을 특징으로 하는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성된 IGFBP-5 단백질의 L 도메인(domain)이 TNFR1에 경쟁적으로 결합하여 TNF-α의 TNFR1에의 결합을 저해하는 것을 특징으로 하는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 TNF-α의 TNFR1에의 결합을 저해함으로써 NF-kB 활성화를 억제하는 것을 특징으로 하는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 NF-kB 활성화를 억제함으로써 p65의 핵이동을 저해하는 것을 특징으로 하는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 다음 단계들을 포함하는 세포 사멸 촉진제의 스크리닝 방법:
    a) IGFBP-5 단백질의 L 도메인과 TNFR1을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및
    b) 상기 동물세포에서 IGFBP-5 단백질의 L 도메인과 TNFR1의 상호작용이 촉진되는지 여부를 결정하는 단계.
  14. 다음 단계들을 포함하는 세포 사멸 저해제의 스크리닝 방법:
    a) IGFBP-5 단백질의 L 도메인과 TNFR1을 발현하는 동물세포에 임의의 약제를 처리하는 단계; 및
    b) 상기 동물세포에서 IGFBP-5 단백질의 L 도메인과 TNFR1의 상호작용이 저해되는지 여부를 결정하는 단계.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 TNF-α 과발현 관련 질환 치료제.
  19. 삭제
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