JP2010530743A - 細胞増殖阻害VPgタンパク質、その断片又はその類似体、及びそれらの適用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(i)真核生物の開始因子eIF4E、好ましくは哺乳動物の開始因子eIF4E、より好ましくはヒトの開始因子eIF4Eとの結合能を有し、
(ii)アミノ酸モチーフ
VPgタンパク質若しくは少なくとも8つのアミノ酸を有するその断片若しくはその類似体を含むか又はこれらから成る、単離精製タンパク質に関する。
単離された植物ウイルスコード化VPgタンパク質、
植物ウイルスの組換えVPgタンパク質、又は
植物ウイルスの合成VPgタンパク質を含む。
PVY以外の、好ましくはポチウイルス科に、より好ましくはポチウイルス属に属する他の植物ウイルス、例えばタバコエッチウイルス(TEV)(配列番号4)、クローバー葉脈黄化ウイルス(ClYVV)(GENBANKデータベース(2006年3月30日版)におけるアクセッション番号NP_734169.1、配列番号6として本明細書中で再現)、タバコ葉脈斑紋ウイルス(TVMV)(GENBANKデータベース(2006年3月30日版)におけるアクセッション番号NP_734333.1、配列番号8として本明細書中で再現)、カブモザイクウイルス(TuMV)(配列番号10)、レタスモザイクウイルス(LMV)(GENBANKデータベース(2006年3月30日版)におけるアクセッション番号NP_734159.1、配列番号12として本明細書中で再現)、又は
カルシウイルス科に、好ましくはノロウイルス属に属するウイルス、例えばネコカルシウイルス(FCV)(UniProtKB/Swiss−Protデータベースにおけるアクセッション番号Q66914、配列番号27として本明細書中で再現)、ヒトノロウイルス(HuNoV、UniProtKB/Swiss−Protデータベースにおけるアクセッション番号P54634、及びGENBANKデータベースにおけるアクセッション番号NP_056820、それぞれ配列番号28及び配列番号29として本明細書中で再現)及びネズミノロウイルス(MNV)(GENBANKデータベースにおけるアクセッション番号YP_720001、配列番号30として本明細書中で再現)
でコードされるVPgタンパク質である。
配列番号2の41位のアルギニン(Arg)と、94位のアルギニン(Arg)との間に局在するアミノ酸配列(VPg2とも呼ばれる、配列番号14)、又は
配列番号2の41位のアルギニン(Arg)と、82位のグリシン(Gly)との間に局在するアミノ酸配列(VPg4とも呼ばれる、配列番号16)、
配列番号2の41位のアルギニン(Arg)と、66位のフェニルアラニン(Phe)との間に局在するアミノ酸配列(VPg5とも呼ばれる、配列番号18)、
配列番号2の41位のアルギニン(Arg)と、59位のアルギニン(Arg)との間に局在するアミノ酸配列(VPg1とも呼ばれる、配列番号20)、又は
配列番号2の60位のフェニルアラニン(Phe)と、94位のアルギニン(Arg)との間に局在するアミノ酸配列(VPg3とも呼ばれる、配列番号22)
を含むか又はこれらから成る。
非極性R基を有するアミノ酸
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン。
非荷電極性R基を有するアミノ酸
グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン。
荷電極性R基を有するアミノ酸(pH6.0で負に荷電)
アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸(pH6.0で正に荷電)
リシン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0で)
OH基を有するアミノ酸
セリン、スレオニン、チロシン
芳香族基を有するアミノ酸
フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン
別の分類は分子量(即ちR基の大きさ)に基づき行うことができる:
グリシン 75
アラニン 89
セリン 105
プロリン 115
バリン 117
スレオニン 119
システイン 121
ロイシン 131
イソロイシン 131
アスパラギン 132
アスパラギン酸 133
グルタミン 146
リシン 146
グルタミン酸 147
メチオニン 149
ヒスチジン(pH6.0で) 155
フェニルアラニン 165
アルギニン 174
チロシン 181
トリプトファン 204
特に好ましい保存的な置換は:
正の電荷を維持し得るような、アルギニンのリシンへの置換、及びその逆の置換、
負の電荷を維持し得るような、アスパラギン酸のグルタミン酸への置換、及びその逆の置換、
遊離−OHを維持し得るような、スレオニンのセリンへの置換、
残基の芳香族の特徴を維持し得るような、フェニルアラニンのチロシンへの置換、及び
遊離−NH2を維持し得るような、アスパラギンのグルタミンへの置換
である。
細胞
懸濁液中で増殖させたハイファイブ昆虫(イラクサギンウワバ)細胞を、ゲンタマイシン(50mg/ml)及びアンホテリシンB(0.25mg/ml)の入ったExpress Five SFM培地(Invitrogen)中で培養した。
抗体
抗hisマウスモノクローナル抗体(MMS−156P)をBabCO(Berkeley, CA, USA)から購入した。抗eIF4Eマウスモノクローナル抗体(P−2、sc−9976)をSanta Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA, USA)から購入した。この抗体は、マウス、ラット、ヒト及びブタのeIF4Eを認識する。ヒトeIF4Eに対する抗eIF4Eウサギポリクローナル抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratoriesから購入)は、Nahum Sonenbergの寄贈であった(McGill University, Montreal Canada)。
ジャガイモYウイルス(O株、GENBANKデータベースにおけるアクセッション番号Z29526)のVPg遺伝子を、フォワードプライマー5’GGGGGGGATCCATGGGGAAAATAAA−3’(配列番号 23)及びリバースプライマー5’CCCCCAGATCTCTATTATTCATGCTCC−3’(配列番号24)と共に、鋳型としてプラスミドpPVY15(GENBANKデータベース(2006年11月14日版)におけるアクセッション番号Z29526で利用可能)を使用するPCRによって合成し、GENBANKデータベースにおけるアクセッション番号CAA82642を有するタンパク質を発現させた。AcMNPVのポリヘドリンプロモータ(配列番号25)の制御下で、VPgのcDNAをpFastBac HTb(Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)から購入)に挿入し(O'Reilly et al., 1992)、バクミド技術(Gibco BRLから購入)を使用して、hisタグ付けVPgを発現する組換えバキュロウイルスを構築した。懸濁液中のハイファイブ(イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni))細胞に、5pfu/細胞のMOIで組換えバキュロウイルスを感染させた。組換えバキュロウイルスを感染させたHF細胞の一部(100ml)を感染後72時間で回収し、300mMのNaClと、6mMのβ−メルカプトエタノールと、5%グリセロールと、0.5% Tween20と、プロテアーゼ阻害剤カクテル(Complete、Rocheから購入)とを含有する50mMのリン酸バッファ(pH7.0)10ml中で懸濁して、5サイクルの液体窒素での凍結及び37℃での解凍で溶解した。溶解(clearing)後、抽出物を重力で1mlのNi−NTAアガロース樹脂(Qiagenから購入)に通し、5mlの溶解バッファで平衡にした。300mMのNaClを含有する、250mMのイミダゾールの入った50mMのリン酸バッファ(pH7.0)500μlで5回、結合タンパク質を溶出した。10℃で48時間のインキュベーションの間、TEVプロテアーゼを用いて、融合タグをVPgから取り除いた。得られた産物を5mlのHi−Trap Heparinカラム(Amersham Pharmaciaから購入)上で精製した。タンパク質を100mMのNaClの入った50mMのリン酸バッファ(pH7.0)中のカラムに適用し、OD280が安定なレベルに達するまで同じバッファで洗浄した後、50mMのリン酸バッファ(pH7.0)中のNaClのグラジエント(100mM〜1M)で溶出した。全長hisVPgを含有する画分を回収し、希釈して、Hi−Trap Heparinカラムで用いた条件下で5mlの15S−Sourceカラム(Amersham Pharmaciaから購入)上で分画化した。MOI 5で適当なバキュロウイルスを感染させた後、HCVヘリカーゼのHisタグ付けドメインIIをHF細胞で発現させ、記載のように精製した(Boguszewska-Chachulska et al., 2004)。分子量標準として、Precision Plus Protein Dual Colour(Bio-Radから購入)とBenchMark Prestained Protein Ladder(Invitrogenから購入)を用いて、CBBによる染色によって、12% SDS−PAGE上で全ての工程を解析した。
1ml当たり2×106個の細胞濃度のハイファイブ(T.ni)細胞に、MOI 5で、VPgタンパク質若しくはhisVPgを発現するバキュロウイルス、又はHCVヘリカーゼのドメインII又は空バクミドを感染させた。2000rpmで10分間の遠心分離によって、感染細胞を感染後指定時間で回収した。ペレットをPBS中で2回洗浄し、4倍の血中血球容積(packed cell volume)の低張バッファ(10mMのトリス(pH7.9)、10mMのKCl、3mMのDTT、0.1mMのEDTA、0.1mMのEGTA、0.75mMのスペルミジン、15mMのスペルミン)中で再懸濁した。細胞を氷上で30分間膨張させ、完全に破壊されたのを位相差顕微鏡で確認した。それから、1/10容量の回復(restoration)バッファ(50mMのトリス(pH7.9)、0.75mMのスペルミジン、0.15mMのスペルミン、10mMのKCl、0.2mMのEDTA、3mMのDTT、67.7%スクロース)を添加し、ホモジネートを1mlのスクロースクッション(30%スクロースの入った低張バッファ)上に積層し、3000rpmで20分間、冷蔵して遠心分離した。ペレット化した核を4倍の血中血球容積の核抽出バッファ(50mMのトリス(pH7.5)、0.42mMのKCl、6mMのDTT、0.1mMのEDTA、10%スクロース、5mMのMgCl2、20%グリセロール、0.5mMのPMSF、1ml当たり3mgのロイペプチン)中で再懸濁した。それから、4℃で30分間ゆっくりと振動させることで核を溶解させた。細胞質画分と核画分とを15% SDS−PAGE上で泳動させた後、X線フィルムを備えたECLシステムを用いて、抗eIF4E抗体でウェスタンブロット法を行った。Quantity Oneソフトウェアを備えたGelDoc2000(BioRadから購入)を用いて、eIF4Eバンドの濃度測定を実施した。
製造業者の取扱説明書に従って、Transpass P(Ozyme)を、150mMのNaClを含有する20mMのリン酸ナトリウム(pH7.0)又はPBS中で精製VPg(0.1μg/ウェル〜2μg/ウェル)と合わせた。最終容量が250μlになるまで血清無含有培地をVPg/Transpass P混合物に添加した。血清無含有培地で予め洗浄したHeLa細胞(24ウェル皿の1つのウェル当たり105個)をかかる部分の送達混合物で処理した。37℃での指定期間のインキュベーション後、細胞をタンパク質局在化(共焦点顕微鏡)及び増殖(Clontech製のLDHキット)による試験に使用した。
懸濁液中のハイファイブ(T. ni)細胞(1ml当たり2×105個の細胞)に、10 MOIでhisVPg、又はHCVヘリカーゼのhisタグ付けドメインII、又は空バクミドのいずれかを発現するバキュロウイルスを感染させた。3000rpm、4℃で、5分間の遠心分離によって、感染後48時間で細胞を回収した後、500μlのPBSで2回洗浄した。細胞を2%冷PFAで固定し、室温で10分間置き、500μlのPBSで2回洗浄して、300μlのPBSで再懸濁した。100μlの固定細胞の一部を清潔な丸型カバーガラス上に塗布し、層流フード中で乾燥しながら付着させた。翌日、スライドガラスを24ウェルプレートのウェルに乗せ、PBS 500μlによって室温で再水和した。PBSを取り除いた後、0.1%冷Triton X−100の入ったPBSで10分間、細胞を透過させ、PBSで2回洗い流し、室温で30分間、5%血清の入ったPBSで遮断した。PBSでの2回の洗浄後、室温で1時間、PBS中で100倍希釈した一次抗体(抗his又は抗ヒトeIF4E)と細胞をインキュベートした後、洗浄し、PBS中で100倍希釈した二次抗体(抗ウサギFITC又は抗マウスTexas Red)(Jackson ImmunoResearch Laboratories)と1時間インキュベートした。PBS中で希釈したヨウ化プロピジウム(0.2μg/ml〜1μg/ml)で核を染色した。3回、PBSで洗い流した後、スライドガラスは50%グリセロールを備えていた。BioRadのMRC−600/株式会社ニコンのOptiphotレーザー走査型共焦点顕微鏡によって、画像を収集した。
約60%の密集度(confluency)でスライドガラス上に播種されたHeLa細胞をPBSで3回洗浄し、2%冷PFA中で固定した。10 MOIで、細胞に、hisVPg、又はHCVヘリカーゼのhisタグ付けドメインII、又は空バクミドのいずれかを発現する、バキュロウイルスを感染させた。3000rpm、4℃で、5分間の遠心分離によって、感染後48時間で細胞を回収した後、500μlのPBSで2回洗浄した。細胞を2%冷PFAで固定し、室温で10分間置き、500μlのPBSで2回洗浄して、300μlのPBSで再懸濁した。100μlの固定細胞の一部を清潔な丸型カバーガラス上に塗布し、層流フード中で乾燥しながら付着させた。翌日、スライドガラスを24ウェルプレートのウェルに乗せ、PBS 500μlによって室温で再水和した。PBSを取り除いた後、0.1%冷Triton X−100の入ったPBSで10分間、細胞を透過させ、PBSで2回洗い流し、室温で30分間、5%血清の入ったPBSで遮断した。PBSでの2回の洗浄後、室温で1時間、PBS中で100倍希釈した一次抗体(精製ポリクローナル抗VPg抗体、抗eIF4E(MAb)抗体及び抗PML(MAb)抗体)と細胞をインキュベートした後、洗浄し、PBS中で100倍希釈した二次抗体(抗ウサギFITC又は抗マウスTexas Red)(Jackson ImmunoResearch Laboratoriesから購入)と1時間インキュベートした。PBS中で希釈したヨウ化プロピジウム(0.2μg/ml〜1μg/ml)で核を染色した。3回、PBSで洗い流した後、スライドガラスは50%グリセロールを備えていた。BioRadのMRC−600/株式会社ニコンのOptiphotレーザー走査型共焦点顕微鏡によって、画像を収集した。
HeLa細胞、B16細胞、GL26細胞及びIMR90細胞を、1つのウェル当たり1×104個の細胞で96ウェルプレートにおいて播種し、一晩培養した。VPgの一部(0.5μg/ウェル〜2μg/ウェル)を血清無含有培地に希釈し、総容量10μlを得て、室温で20分間、0.2μlのTransPass Pタンパク質トランスフェクション試薬(New England BioLabs)とインキュベートした。細胞を血清無含有培地で洗い流し、100μl/ウェルの血清無含有培地と形質導入ミックスとを含有する混合物で覆った。37℃での様々なインキュベーション時間後、1000rpmで10分間、プレートを遠心分離し、上清を新しいプレートに移した。490nmで多重標識カウンターVictor1412(Wallac)を用いて、LDH細胞傷害性検出キット(Clontech)によって、リンゴ酸デヒドロゲナーゼの放出を測定した。LDHキットのマニュアルに従って、細胞傷害性のレベルを算出した。
GST融合タンパク質として、配列番号2(VPg)、配列番号14(VPg2)、配列番号16(VPg4)、配列番号20(VPg1)、配列番号22(VPg3)及び配列番号18(VPg5)のペプチドを大腸菌での発現によって得た。ベクターpGEX−4T−1(Amersham Biosciencesから購入)でクローン化したcDNA配列(VPg、VPg1、VPg2、VPg3、VPg4又はVPg5をコードする)から標準的な方法でGST融合タンパク質を産生した。
昆虫細胞に、PVYのVPg遺伝子(配列番号1)を含有するバキュロウイルスを感染させた。共焦点顕微鏡解析によって、核と細胞質との両方のコンパートメントでの感染開始時に局在していた(図2、12hpi)開始因子eIF4Eが60hpi時点では細胞周辺で観察されたことが示された(図2、左側の欄)。VPgは、感染を通して細胞質でしか観察されなかった(図2、VPg欄)。融合(Merged)画像は、感染開始時には核でかなりの割合のeIF4Eを示していたが、感染の経過中に消失していき、24hpiでは、eIF4Eは細胞質とちょうど核周辺部とに見ることができ、60hpiでは細胞質でしか観察されず、このことはVPgとのかなりの重複を示していた。
実施例4:HeLa細胞におけるeIF4E及びPVYのVPgタンパク質のin vitro細胞局在化
植物ウイルスのVPgタンパク質がヒトeIF4Eと相互作用し、核プールの開始因子を失わせることができるか否かを確認するために、様々な条件下で、幾つかのトランスフェクション実験を実施した。しかしながら、VPgを発現する細胞を回収することができず、このことはヒト細胞に対するVPgの毒性効果を示唆していた。したがって、PVYのVPg(配列番号2)は、タンパク質を細胞内送達させる陽イオン性脂質混合物であるPro−Ject(商標)(Pierceから購入)で、HeLa細胞に直接転座させた(図5Bを参照されたい)。VPgは細胞質に局在し、天然eIF4Eの局在化に強い影響を与えた。対照HeLa細胞では、開始因子は細胞質と核とで観察された。VPgの存在下では、eIF4Eのレベルは核で大幅に低減し、細胞質に局在したVPgにかなり重複していた。
形質転換細胞、HeLa細胞及びB16細胞、並びに一次非形質転換ヒト細胞IMR90細胞へのVPg送達後に、細胞損傷の評価を可能にするLDHアッセイを適用した。VPg細胞内送達の1時間後には既に、HeLa細胞及びB16細胞の両方が有意な細胞損傷を示した。重要なことに、一次IMR90(ヒト胎児肺線維芽細胞)に導入されたVPgはこれらの増殖に影響を与えなかった(図6、IMR90)。
PVYのVPgタンパク質(配列番号2)の抗癌効果を調べるために、in vivo実験を実施した。C57BL/6マウスを、マウス神経膠腫腫瘍を誘導するGL26細胞又はB16−ova黒色腫細胞で接種した。
配列番号24:VPg遺伝子PCRプライマー
配列番号26:VPgモチーフ
Claims (20)
- 配列番号2のVPgタンパク質から成ることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質。
- 配列番号2の全長と少なくとも20%の配列同一性又は少なくとも45%の配列相同性を示すVPgタンパク質類似体から成ることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質類似体が、配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号27、配列番号28、配列番号29又は配列番号30から成る群から選択されることを特徴とする、請求項3に記載のタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のタンパク質の断片であって、前記VPgタンパク質の少なくとも8つの連続したアミノ酸を含むか又はこれらから成ることを特徴とする、タンパク質の断片。
- 配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20又は配列番号22から成る群から選択されることを特徴とする、請求項5に記載のタンパク質の断片。
- 配列番号16の全長と少なくとも60%の配列同一性又は少なくとも80%の配列相同性を示す、配列番号16で規定される断片の類似体から成ることを特徴とする、請求項6に記載のタンパク質の断片。
- 配列番号18の全長と少なくとも60%の配列同一性又は少なくとも80%の配列相同性を示す、配列番号18で規定される断片の類似体から成ることを特徴とする、請求項6に記載のタンパク質の断片。
- 配列番号16の少なくとも8個、10個、15個、20個、25個又は26個の連続したアミノ酸を含むか又はこれらから成ることを特徴とする、請求項5に記載のタンパク質の断片。
- 抗癌剤としての請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体。
- その癌細胞が前記開始因子eIF4Eを発現する癌、好ましくは神経膠腫、黒色腫又は結腸癌若しくは肺癌を治療するのに使用する、請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体。
- 前記開始因子eIF4Eが発現される癌を治療する薬物の製造のための請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体の使用。
- 被験体の単離精製開始因子eIF4Eとの結合特異性が、前記VPgタンパク質、好ましくは配列番号2のVPgタンパク質と類似している化合物をスクリーニングする方法であって、i)該eIF4Eを候補化合物及び請求項1〜9に記載のタンパク質、その断片又はその類似体と接触させる工程と、ii)該候補化合物がeIF4Eと、該タンパク質、その断片又はその類似体との間の相互作用を阻害するか否かを検出する工程とを含むことを特徴とする、方法。
- 癌を予防又は治療する薬物の調製のための請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体をコードする核酸を発現する組換えベクターの使用。
- 前記核酸が、配列番号1、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19又は配列番号21から成る群から選択されることを特徴とする、請求項14に記載の使用。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片若しくはその類似体、又は請求項14若しくは15に記載の組換えベクターと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
- 前記薬学的に許容される担体が陽イオン性脂質であることを特徴とする、請求項16に記載の組成物。
- 前記開始因子eIF4Eが発現される癌を治療するのに使用する、請求項16又は17に記載の組成物。
- トランスフェクトして、請求項1〜9のいずれか一項に記載のタンパク質、その断片又はその類似体を発現する宿主細胞。
- eIF4Eとの結合特異性が配列番号2のVPgタンパク質と類似している化合物をスクリーニングするための単離精製開始因子eIF4Eの使用。
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