CN103642805B - 一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体 - Google Patents

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叶艳英
曾钢
曹鸣庆
马荣才
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Abstract

本发明公开了一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。该高抗TuMV的RNA,是具有下述核苷酸序列之一:1)序列表中的SEQ?ID?№.2所示的核苷酸序列;2)与1)限定的RNA序列具有90%以上同源性,且具有相同功能的RNA序列;具体的,所述同源性为95%以上;再具体的为96%以上;再具体的为97%以上;再具体的为98%以上;再具体的为99%以上。本发明的RNA和编码该RNA的RNAi载体,可用来增强植物对TuMV或草铵膦除草剂的抗性,同时也为高抗TuMV转基因植物的培育奠定了基础。

Description

一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体
技术领域
本发明属于植物抗病毒基因工程领域,具体涉及一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。
背景技术
芜菁花叶病毒(TurnipMosaicVirus,TuMV)属马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyviruse)。TuMV寄主范围十分广泛,能够侵染43科156属318种植物。TuMV是危害十字花科作物最为严重的病毒。感染病毒后的作物还容易感染霜霉病和软腐病,造成复合侵染,直接影响到产量和商品价值。
油菜是我国主要的油料作物,芜菁花叶病毒病是油菜的重要病害之一。在我国长江中下游,油菜因病毒病减产一般达20-30%,大流行年达50%左右。感病油菜不仅产量降低,而且产油率和种子萌芽率也明显降低。另据调查我国白菜因TuMV危害平均每年造成5-10%的产量损失,病害严重的地块几乎绝收。
TuMV主要是靠蚜虫以非持久性的方式传播,至少有89种蚜虫可传播该病毒。而采用杀虫剂不可能很快杀死全部的蚜虫以阻止病毒的传播,仅靠杀虫剂杀蚜防治病毒病的效果不明显,还易造成环境污染。因此寻求新的抗病方法成为了一项迫切的任务。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种高抗TuMV的RNA和编码该RNA的RNAi载体。
本发明提供的一种RNA,具有下述核苷酸序列之一:
1)序列表中的SEQID№.2所示的核苷酸序列;
2)与1)限定的RNA序列具有90%以上同源性,且具有相同功能的RNA序列;具体的,所述同源性为95%以上;再具体的为96%以上;再具体的为97%以上;再具体的为98%以上;再具体的为99%以上。
所述具有相同功能具体指具有下述任一功能:
1)增强植物对TuMV的抗性;
2)增强植物对除草剂的抗性。
所述植物具体为拟南芥或十字花科作物;所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
所述增强植物对TuMV的抗性是通过抑制TuMV复制实现的。
所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-R01。
所述除草剂具体为草铵膦除草剂。
所述RNA的编码基因也属于本发明的保护范围。
含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的;所述DNA片段为X正向—连接区—X反向;X正向为SEQIDNo.1中第15-360位核苷酸所示,X反向为X正向的反向互补片段。
具体的,所述出发载体为pBBBast。
所述的重组表达载体中,所述X正向—连接区—X反向片段具有序列表中SEQID№.3所述的第1371-2873位核酸序列。
所述重组表达载体的制备过程具体为:将具有序列表中SEQID№.3所述的核酸序列的双链DNA分子插入植物表达双元载体pBBBast的XmaI单酶切位点,即得重组表达载体pBBBTu-VPg。
所述插入前,还需在所述pBBBast的XmaI单酶切位点的两个粘性末端各补两个碱基C。
所述植物表达双元载体pBBBast为将具有序列表中SEQID№.4所示核酸序列的双链DNA分子插入载体pBBR1MCS-2的SspI酶切位点得到的重组质粒。
本发明的另一个目的是提供所述RNA、所述RNA的编码基因、所述含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌的如下至少一种应用:
1)制备抗TuMV的产品;
2)增强植物对TuMV的抗性;
3)增强植物对草铵膦除草剂的抗性。
所述应用中,所述植物具体为拟南芥或十字花科作物;所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
所述增强植物对TuMV的抗性是通过抑制TuMV复制实现的。
所述应用中,所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-R01。
所述应用中,所述除草剂具体为草铵膦除草剂。
本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法,是将所述的任一重组表达载体转入目的植物,得到转基因植物;所述转基因植物与所述目的植物相比,具有如下至少一种性状:1)对TuMV的抗性增强;2)对除草剂的抗性增强。
所述对TuMV的抗性增强是通过抑制TuMV复制实现的。
所述方法中,所述TuMV具体为TuMV-C4和/或BJ-R01。
所述方法中,所述除草剂具体为草铵膦除草剂。
所述方法中,所述目的植物具体为拟南芥或十字花科作物;所述十字花科作物具体为油菜或白菜。
附图说明
图1为中间载体的酶切验证结果,其中M为分子量标记;泳道1为pHannibal-VPg载体的酶切结果;泳道2为连入反向片段pHannibal-VPg(-)载体的酶切结果;泳道3为pHannibal空载体的酶切结果。
图2为载体pBBBTu-VPg的结构示意图。
图3为植物表达载体pBBBTu-VPg的MluI酶切检测结果图,其中M为分子量标记;泳道1为pBBBTu-VPg载体的酶切结果。
图4为T1代苗喷洒草铵膦除草剂后结果,存活的为除草剂抗性株。
图5为部分转基因T1代苗PCR鉴定结果图,其中泳道M为分子量标记;泳道1为对照col-0的结果;泳道2-8为除草剂筛选出的转基因T1代苗的结果。
图6为不同转基因高抗株系接种TuMV-C4后的图片,其中col代表野生型col-0的结果。
图7为不同转基因高抗株系接种TuMV-C4后种子收获时的图片,其中col代表野生型col-0的结果。
图8为不同转基因高抗株系接种TuMV-C4后的病情指数统计结果,其中col代表野生型col-0的结果,#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42分别代表7个转基因高抗株系的结果。
图9为转基因高抗株系#04和#42接种BJ-R01后的图片,其中col代表野生型col-0的结果。
图10为TuMV-C4接种拟南芥后,RT-PCR检测TuMV外壳蛋白基因在转基因拟南芥中的表达,其中图a为TuMV-CP片段的扩增结果图,图a中泳道1为阴性对照结果,泳道M为分子量标记,泳道2为对照Col-0的结果,泳道3-9依次为转基因高抗株系#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42的结果;图b为内参Sand基因的扩增结果图,图b中泳道M为分子量标记,泳道1为阴性对照结果,泳道2为对照Col-0的结果,泳道3-9依次为转基因高抗株系#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42的结果。
图11为TuMV-C4接种拟南芥后,荧光定量PCR分析结果,其中col代表野生型col-0的结果,#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42分别代7个转基因高抗株系的结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
1、材料
本实验所用野生型拟南芥Col-0购自ArabidopsisBiologicalResourceCenter。
北京地区芜菁花叶病毒TuMV主要的流行强致病株系TuMV-C4获自中国农业科学院蔬菜花卉所;参考文献:冯兰香、徐玲、刘佳、钮心格、李秀生,北京地区大白菜芜菁花叶病毒株系的鉴定,中国蔬菜,1988,4:11-13;公众可从北京农业生物技术研究中心获得该株系。
TuMV萝卜强致病株系BJ-R01为发明人从田间采集并保存。参考文献“叶艳英、曾钢、闫晓红、马荣才、吴才君、姚磊,江西农业大学学报,2012,34(2):264-269”。公众可从北京农业生物技术研究中心获得。
大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α菌株购自Tiangen公司,产品目录号为CB101;
农杆菌(Agrobacteriumtumefacieus)GV3101(pMP90),参考文献:Koncz,C.andSchell,J.(1986)ThepromoterofTL-DNAgene5controlsthetissue-specificexpressionofchimericgenescarriedbyanoveltypeofAgrobacteriumbinaryvector.Mol.Gen.Genet.204,383–396。公众可从北京农业生物技术研究中心获得该菌株。
RNAi载体pHannibal公众可从CSIRO(http://www.csiro.au/pi)获得;参考文献:WesleySV,HelliwellCA,SmithNA.Constructdesignforefficient,effectiveandhigh-throughputgenesilencinginplants[J].ThePlantJournal,2001,27(6):581-590。
高保真酶FastpfuDNAPolymerase、EasyTaq酶和分子量标记购自全式金公司。质粒小提试剂盒、胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。M-MLV反转录酶、定量PCR试剂、限制性内切酶和KlenowFragment补平酶购自TaKaRa公司。dNTP、dGTP和dCTP购自Promega公司。
实施例1、RNAi载体的制备
(一)VPg基因保守片段的制备
根据TuMV株系的保守性,选取VPg基因的第152-497位核苷酸序列共346bp的保守片段为RNA干扰靶标。
提取TuMV-C4菌株的总RNA,并反转录为cDNA,以该cDNA为模板,以下述序列(下划线部分为酶切位点EcoRI、XbaI和KpnI、ClaI)为引物,用高保真酶FastpfuDNAPolymerase进行PCR扩增:
VPgF5’-cggaattctctagaGTATCGGACACAAAAACAGGAAGT-3’;
VPgR5’-ggggtaccatcgatCTCAGTTCGTTTTCTCGCTCTGGG-3’。
PCR扩增程序:94℃5min;94℃45s,52℃30s,72℃1min,35个循环;72℃延伸7min。扩增的目的条带回收。
PCR产物经琼脂糖电泳纯化后回收。所得PCR产物经测序证明核酸序列正确,其核酸序列具有序列表中SEQID№.1所示的核酸序列,其编码的RNA的具有序列表中SEQID№.2所示的核酸序列。
(二)RNAi载体的构建
1、中间载体pHannibal-VPg的制备
1)制备过程
用ClaI和XbaI分别双酶切pHannibal载体和上述制备的PCR产物。酶切后经纯化回收约5803bp的载体骨架片段和约355bp的PCR产物片段,4℃连接过夜。连接产物经热击转化大肠杆菌DH5α。挑取克隆,提取质粒并用PstI酶切验证,获得含反向片段的中间载体pHannibal-VPg(-)。
用KpnI和EcoRI分别双酶切上述制备的PCR产物和连入反向片段的pHannibal-VPg(-)中间载体。酶切产物经纯化后回收约6148bp载体骨架片段和约368bp的PCR产物片段,4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α,挑取克隆,提取质粒并用XbaI酶切验证,获得同时含反向和正向片段的中间载体pHannibal-VPg。
2)所构建载体的酶切验证过程
用XbaI和EcoRI分别双酶切pHannibal空载体、连入反向片段的pHannibal-VPg(-)和pHannibal-VPg中间载体,酶切后电泳检测,进行验证实验。实验结果见图1。图1结果显示:pHannibal空载体经双酶切后产生5001bp和823bp两条片段,pHannibal-VPg(-)经双酶切后产生5001bp和1157bp两条片段,pHannibal-VPg经双酶切后产生5001bp、1509bp和6bp三条片段。酶切及电泳结果表明,中间载体pHannibal-VPg构建正确。
2、植物表达载体pBBBTu-VPg的制备
1)制备过程
pHannibal的RNAi发卡结构两端各含有1个NotI酶切位点。用NotI酶切含发卡结构的中间载体pHannibal-VPg,同一酶切体系中再用Klenow酶和dGTP在酶切片段的两个粘性末端各补两个碱基G,产物于1%琼脂糖凝胶电泳纯化,胶回收含发卡结构的3656bp的片段备用。经测序,所述含发卡结构的3656bp的片段具有序列表中SEQID№.3所述的核苷酸序列,所述发卡结构片段具有序列表中SEQID№.3所述的第1371-2873位核酸序列。
植物表达双元载体pBBBast可为将具有序列表中SEQID№.4所示核酸序列的双链DNA分子插入载体pBBR1MCS-2的SspI酶切位点,取代质粒pBBR1MCS-2的SspI酶切位点之间的小片段得到的重组质粒。
质粒pBBR1MCS-2公众可以从北京农业生物技术研究中心获得;参考文献:KovachME,ElzerPH,HillDS,RobertsonGT,FarrisMA,RoopRM2nd,PetersonKM.Fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpBBR1MCS,carryingdifferentantibiotic-resistancecassettes.Gene.1995Dec1;166(1):175-6。
用XmaI单酶切植物表达双元载体pBBBast,再用Klenow酶和dCTP在两个粘性末端各补两个碱基C,产物于1%琼脂糖凝胶电泳,胶回收载体片段6559bp,再与上述制备的含发卡结构的3656bp片段4℃连接过夜,即得植物表达RNAi质粒pBBBTu-VPg,其结构示意图见图2。
2)所构建载体的酶切验证过程
将上述制备的植物表达载体pBBBTu-VPg进行MluI酶切检测。pBBBast载体本身有一个MluI酶切位点,连接上述含发卡结构的片段的CaMV启动子上另有一个MluI酶切位点,酶切后显示2条带的为阳性克隆。根据酶切条带大小可判断插入是顺时针正向连接或逆时针反向连接。正向连接酶切条带为3721bp和6494bp,反向连接条带为542bp和9673bp条带。MluI酶切检测结果见图3。图3结果表明针对VPg基因保守片段的RNAi结构已经连入植物表达双元载体pBBBast的XmaI酶切位点中,并且为正向连接。
实施例2、高抗TuMV的RNA及编码该RNA的RNAi载体的功能验证
(一)拟南芥的遗传转化及阳性苗的筛选
利用电击法将pBBBTu-VPg载体转入农杆菌GV3101(pMP90)中,采用农杆菌介导的花序浸渍法侵染拟南芥。将收获的拟南芥T0代种子播种于盛有营养土的培养托盘中,置于22℃(昼)/18℃(夜),光照周期为16h(光)/8h(暗)的人工气候室。待幼苗长出两片子叶后喷洒用水按体积数稀释500倍草铵膦除草剂(所述草铵膦除草剂为市场购买的商品化的除草剂,其中草铵膦浓度为200mg/L)筛选阳性苗。
经喷洒2-3次草铵膦除草剂筛选后,非转基因苗不能继续生长,逐渐枯黄死亡;而转基因苗长势茁壮,叶片保持绿色,T1代苗喷洒草铵膦除草剂后的结果见图4,共获得60株T1代除草剂抗性植株。随机抽取48株抗性苗的叶片,用小量快速法提取植物基因组DNA。用上述引物VPgF和VPgR进行PCR扩增检测,反应条件为:94℃5min;94℃30s,52℃30s,72℃30s,35个循环;72℃延伸7min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测,扩增出目的基因片段374bp的为转基因阳性苗。检测结果显示全部为阳性苗。部分幼苗的PCR鉴定结果见图5。
选取鉴定为阳性苗的转基因T1代苗自交留种,T2代随机抽取32个株系播种,幼苗喷洒2-3次用水按体积数稀释500倍草铵膦除草剂(所述草铵膦除草剂为市场购买的商品化的除草剂,其中草铵膦浓度为200mg/L)后统计存活/死亡比。有17个株系分离比约为3:1,初步确认为单拷贝株系,并单株自交收种子。后代继续筛选不分离株系即为纯合株系。
(二)转基因植株的抗病鉴定
随机抽取13个纯合株系进行抗病鉴定。将纯合株系、野生型Col-0和转空载体拟南芥同时进行播种,待幼苗长至8-10片莲座叶时期摩擦接种TuMV的TuMV-C4或BJ-R01毒株。接种液按病叶重/磷酸缓冲液体积(pH=7.0)约1g/10mL比例配制。每个纯合株系接种8-12株,每株接种两片较大叶片。以非转基因野生型拟南芥Col-0和转空载体拟南芥作为对照接种。接种几分钟后立即用清水冲洗叶片。在人工气候室中网罩隔离观察,20天后进行抗病鉴定及病情指数统计。
病情等级划分:0级完全无症状;1级1-2片未接种叶花叶或发黄,能抽薹;3级3-4片未接种叶花叶或发黄能抽薹;5级5-6片未接种叶花叶或发黄,影响抽薹;7级多数叶片花叶或发黄,不能抽薹;9级大部分叶片枯死,植株濒临死亡。
病情指数=100×∑(各级病株数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)
抗病接种的部分结果见图6和图7,病情指数统计结果见图8。图6结果显示,接种TuMV-C4后20天左右,对照野生型Col-0已基本枯萎死亡,转空载体对照结果与Col-0基本一致,而转基因株系表现出不同的抗性,7个株系(#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42)接种后能较好的生长,且后期能够正常结实,表现出对TuMV-C4的高度抗性。图7结果显示,到种子收获时期接种TuMV-C4的高抗转基因株系可以正常结籽;而对照Col-0的植株已经全部死亡,无种子可收获。图8结果显示,接种TuMV-C4后,病情指数统计结果显示高抗株系的抗病性比对照植株Col-0抗性提高约80%,转空载体对照结果与Col-0基本一致。
高抗转基因株系#04和#42接种BJ-R01后,图9结果显示,对照野生型Col-0发病显症,而高抗转基因株系#04和#42表现出较好的长势,其对BJ-R01同样具有高度的抗性。说明本发明对TuMV不同株系的抗性具有一定的广谱性。
高抗转基因株系留种,后代继续进行抗病鉴定。结果显示这些转基因株系对TuMV的高抗性可以稳定遗传。
(三)半定量和相对定量检测病毒的累积
7个高抗株系#01,#04,#12,#14,#15,#18,#42、对照Col-0及转空载体对照接种TuMV-C4后约20天,选取各株系未接种叶片用TRIzol法分别提取总RNA,用M-MLV反转成cDNA。以TuMV外壳蛋白基因的196bp保守片段为检测对象,以拟南芥SAND基因(AT2G28390)的298bp片段为内参进行半定量和荧光定量分析。
扩增TuMV-CP基因的196bp保守区段的引物序列如下所示:
CPF5’-AAAGCGTAACCAAGACCGACCAT-3’;
CPR5’-TCCATCCAAGCCGAACAAAT-3’。
扩增内参基因SAND基因298bp片段的引物序列如下所示:
SANDF5’-AAGGCAGGAAATCACCAGGTTGTC-3;
SANDR5’-TTAACGCATATGGAAGGGGAAGAC-3’。
RT-PCR反应程序:94℃5min;94℃30s,57℃30s,72℃30s,30个循环;72℃7min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
荧光定量PCR的反应以稀释40倍的cDNA为模板,SYBR-greenI做荧光指示剂,反应程序采用两步法扩增。扩增条件为:95℃30s;95℃5s,57℃30s,72℃30s,40个循环。每个株系样品进行3次重复实验,取平均值。
半定量检测结果见图10。图10结果显示,在内参基因表达量差不多一致的情况下,对照Col-0植株体内能检测到大量的病毒累积,转空载体对照结果与Col-0基本一致,而在高抗转基因株系体内只能检测到微量的病毒。
荧光定量PCR的检测结果见图11。图11结果显示,与半定量的结果一致,在对照Col-0体内检测到大量的病毒,转空载体对照结果与Col-0基本一致,而7个高抗株系植物体内几乎检测不到病毒的复制。说明利用VPg基因片段构建的RNAi载体在转基因植物抗病毒中发挥了重要作用,转基因植株的抗病性显著提高。

Claims (14)

1.一种RNA,其核苷酸序列如序列表中的SEQID№.2所示。
2.权利要求1所述的RNA的编码基因。
3.含有权利要求2所述的编码基因的重组载体。
4.根据权利要求3所述的重组载体,其特征在于:所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体,其特征在于:所述重组表达载体为将DNA片段插入出发载体的多克隆位点中得到的;所述DNA片段为X正向—连接区—X反向;X正向为SEQIDNo.1中第15-360位核苷酸所示,X反向为X正向的反向互补片段。
6.根据权利要求5所述的重组载体,其特征在于:所述X正向—连接区—X反向片段为序列表中SEQID№.3第1371-2873位核苷酸序列。
7.根据权利要求4-6任一所述的重组载体,其特征在于:所述重组表达载体的制备过程具体为:将序列表中SEQID№.3所示核苷酸序列的双链DNA分子插入植物表达双元载体pBBBast的XmaI单酶切位点,即得重组表达载体pBBBTu-VPg。
8.根据权利要求7所述的重组载体,其特征在于:所述植物表达双元载体pBBBast为将具有序列表中SEQID№.4所示核苷酸序列的双链DNA分子插入载体pBBR1MCS-2的SspI酶切位点得到的重组质粒。
9.含有权利要求2所述的编码基因的表达盒。
10.含有权利要求2所述的编码基因的宿主菌。
11.权利要求1所述的RNA、权利要求2所述的编码基因、权利要求3-8任一所述的重组载体、权利要求9所述的表达盒或权利要求10所述的宿主菌的如下至少一种应用:
1)制备抗TuMV的产品;
2)增强植物对TuMV的抗性。
12.一种培育转基因植物的方法,是将权利要求3-8任一所述的重组载体转入目的植物,得到转基因植物;所述转基因植物与所述目的植物相比具有对TuMV的抗性增强的性状。
13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于:所述目的植物为拟南芥或十字花科作物。
14.根据权利要求13所述的方法:其特征在于:所述十字花科作物为油菜或白菜。
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