CN112724214A - 一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于转录因子技术领域，公开了一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L及其应用。一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L，是具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明还提供上述文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L编码的蛋白质，是具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列。本发明还提供一对扩增文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L的引物。是具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。本发明提供的的XsMYB308L基因对培育抗旱品种的转基因农作物，提高农作物的抗逆性具有重要意义。

Description

一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L及其应用

技术领域

本发明属于转录因子技术领域，本发明涉及一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L及其应用。具体涉及一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L及其在提高植物抗旱能力方面的应用。

背景技术

文冠果又名土木瓜，属于无患子科文冠果属落叶乔木或灌木，是中国重要的经济树种，已经被确定为重要的能源桔物。我国文冠果优势产区的布局与规划，极大地促进了文冠果产业的快速发展，因为文冠果产区在我国分布广泛，所以文冠果的生长和发育很容易受到地理和气候条件等因素的影响，如干旱，冻害，盐碱等。生长过程中会受到诸多环境因素的影响，冷害和干旱会导致农作物的大规模减产。文冠果为喜光树种，根深、主根发达、根幅长，能够吸收土壤深层水分，在极端干旱条件下能够生长，具有耐旱特性。但在苗期，干旱胁迫会影响文冠果地上部干物质的积累，降低苗木生长速度。干热危害是文冠果在新疆塔克拉玛干沙漠用于大面积生态能源林建设中出现的新问题，受干热胁迫不同程度危害的植株占沙漠栽植成活文冠果植株的30％左右，其中10％出现了死亡，严重影响文冠果生态能源林建设的可持续发展。因此，培育抗逆性强和综合性状良好的的抗逆新品种就成为了文冠果产业在我国发展至关重要的因素。

在长期进化过程中，植物为了适应这些不利的环境因素，在体内形成了一套既复杂且又高效的植物防卫反应机制。当植物受到逆境胁迫时，胞外的信号(高温、高盐、干旱、病原菌等)通过一系列信号转导途径级联放大进入细胞核内，通过与其他防御相关蛋白之间的相互作用，进而激活或抑制下游相关防御基因的转录，从而响应植物对相关逆境胁迫的应答反应。其中，转录因子在这一系列调控中起到非常重要的作用。在植物体内的有众多转录因子家族，MYB转录因子家族不仅成员众多且功能多样的特点。MYB蛋白具有转录因子典型的结构和功能，其蛋白质分子结构中包含高度保守的DNA结合结构域(MYB domain)及保守性相对较低的转录激活区和负调控区。MYB 蛋白可以调控植物的生长发育、初生及次生代谢，在植物抵御干旱胁迫反应中具有重要的调控作用。

干旱胁迫引发的植物生理缺水严重影响植物生长发育和农作物产量。统计显示,目前我国可耕地面积仅有1.21亿公顷,而荒漠化和盐碱化土地有2.6亿公顷，人为因素造成的废弃土地0.13亿公顷。因此干旱胁迫已成为制约我国农作物生长发育的瓶颈，弄清其抗旱机理，利用其抗旱基因改善作物的抗旱性能，具有重要的理论意义和现实意义。

目前，有关文冠果抗旱基因的研究尚少，但对于MYB转录因子的基本结构及其在拟南芥、烟草及水稻、玉米、大豆等作物抗旱基因工程中应用的研究进展，为MYB 转录因子的利用及植物抗旱遗传改良及育种提供参考。

由于物种进化的特异性和相关基因在特定物种的局限性,很难在某些物种中筛选出更多的抗旱相关基因。且并未报道MYB转录因子在提高文冠果抗旱性方面的应用。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L及其应用，本发明提供的的XsMYB308L基因对培育抗旱品种的转基因农作物，提高农作物的抗逆性具有重要意义。

本发明的第一个目的在于提供一种来源于文冠果的与抗旱有关的MYB类转录因子XsMYB308L及其编码基因。本发明的第二个目的在于提供XsMYB308L转录因子及其基因在培育植物抗旱品种中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L，是具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供上述文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L编码的蛋白质，是具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

本发明还提供一对扩增文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L的引物。是具有如SEQID NO.3所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种上述的文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L在提高植物抗旱能力方面的应用。

本发明与现有技术相比的有益效果是：

本发明提供的的XsMYB308L基因对培育抗旱品种的转基因农作物，提高农作物的抗逆性具有重要意义。开展MYB类转录因子在文冠果抗旱方面的研究，不仅可以在遗传水平方面揭示MYB参与文冠果干旱胁迫的作用，提高现有栽培文冠果品种的抗旱性，提高文冠果的生物产量，并进一步扩大文冠果种植区域，提供一个新的文冠果干旱胁迫表达的基因XsMYB308L，还提供一对扩增该基因的引物，也为抗性育种提供理论支撑，具有重要研究价值。

附图说明

图1是XsMYB308L与相关树种MYB308L的多重序列对比图。

图2是不同植物种MYB蛋白的系统发育关系图。

图3是XsMYB308L在沉默植物和对照植物中的表达水平图。

图4是干旱处理后XsMYB308L沉默和对照植株的表型分析图。

图5是重组质粒的PCR鉴定电泳图。

图6是干旱处理后转XsMYB308L基因植株存活率结果图。

图7是干旱处理后转XsMYB308L基因植株和对照植株的表型分析图

具体实施方式

下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。

实施例1

文冠果XsMYB308L基因的克隆

文冠果cDNA文库的构建与扩增

所有文冠果种子均采自新疆维吾尔自治区的一棵文冠果树。种子在25±3℃的黑暗中发芽约2周，直至生根，然后将幼苗移栽到混合土壤盆中，在温室中生长。从2 个月大的幼苗上切除新鲜的组织(根、茎和叶)，以确定XsMYB308L的组织特异性表达特征。为了进行表达模式分析，将2个月大的文冠果苗分别用PEG6000(15％,w/v), NaCl(200mM),ABA(0.1mM),SA(2mM)and MeJA(0.1mM)进行处理。处理后在144h 后收获叶子，然后在液氮下保存，进行RNA提取。文冠果总RNA提取步骤如下：

S1.在液氮预冷的研钵中研磨文冠果样品，在研钵中不断续加液氮防止样品融化；

S2.将研磨好的样品加入到装有1mL TRIZOL的1.5mL无菌无酶离心管中，边加边称量，取样量为50-60mg，充分匀浆，室温静置5min；

S3.加入200μL氯仿，混匀，4℃，12000g离心15min；

S4.取上清液500μL加入到新离心管中，加入200μL氯仿，混匀，4℃，12000 g离心15min；

S5.取上清液约500μL加入到新离心管中(如果沉淀依旧过多，可以再抽提一次)，加入500μL异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；

S6.4℃，12000g离心10min；

S7.弃上清，加入1mL 75％的乙醇(DEPC水配置)上轻轻洗涤沉淀。4℃， 7500g离心5min，弃上清；

S8.将管壁液体甩到管底，用移液器将液体去干净，通风橱中晾10-20min；

S9.加入适量的DEPC H₂O溶解沉淀(65℃促溶10-15min)。

按照PrimeScript RT master(Takara,中国大连)混合液中所述方法反转录成cDNA，然后用SYBR Premix Ex Taq II TaKaRa，中国大连)扩增所得cDNA。以上述cDNA为模板设计下述表1引物(扩增引物分别带Kpn I和BamH I然后连入pMD 19-T-Simple) 进行扩增。

表1 XsMYB308L基因的PCR引物序列(SEQ ID NO.4)

说明：粗体为保护碱基，下划线为酶切位点

在PCR管中配制下列混合液，反应体系如下表2所示：

表2 PCR反应体系

轻轻混匀后离心，将各小管置于PCR仪上，设置反应程序为：94℃5min，1个 cycle；94℃30s,55℃30s，72℃90s，共35个循环；72℃10min，1个cycle；产物于- 20℃保存。

实施例2

pMD 19T-XsMYB克隆载体的构建

XsMYB308L基因PCR产物回收纯化

S1.使用北京天根生化科技公司的TIANgel Maxi Purification Kit对XsMYB308L基因的PCR产物进行回收纯化，将回收纯化的目的片段稀释成50ng/μL，参照pMD 19T使用说明，构建下列表3所述连接体系：

表3 PCR产物回收纯化连接体系

用移液枪轻柔混合均匀后，16℃连接12h。

XsMYB308L的序列分析

S2.使用生物信息学方法对其进行分析从NCBI数据库中检索XsMYB308L的同源序列，XsMYB308L基因含有一个951bp开放阅读框并且编码316个氨基酸。经 ExPASy-ProtParam tool在线预测分析，XsMYB308L蛋白的相对分子质量35651.04,理论等电点(pl)为8.98,是弱碱性蛋白。XsMYB308L蛋白的不稳定系数(Instability index) 为53.34,属于不稳定蛋白质(<40,蛋白质稳定)；脂肪族系数(Aliphatic index)为63.04,总平均亲水系数(Grand average of hydropathicity)为-0.877,表明该蛋白是亲水蛋白，由20种氨基酸组成，分子式为Formula:C₁₅₂₅H₂₄₃₇N₄₇₅O₄₈₀S₁₇。系统发育树的构建采用MEGA7 软件和bootstrap分析，以评估其统计学可靠性。

实施例3

重组病毒载体pTRV2-XsMYB308L的构建

(1)RT-PCR扩增目的干扰片段

根据XsMYB308L基因mRNA序列的3'端非编码区设计特异引物。为构建VIGS 载体的需要，在正向引物和反向引物的5'端分别添加EcoRⅠ和BamHI限制性酶切位点识别序列。以cDNA作为模板进行PCR扩增，按列表4所述反应体系反应：

表4 RT-PCR扩增目的干扰片段反应体系

反应程序为:94℃5min预变性，1个循环；94℃30s变性，55-60℃30s退火，72℃lmin延伸，35个循环；72℃10min延伸，1个循环；4℃保存。用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收纯化后连接载体，连接产物转化大肠杆菌DH5a，在Amp抗性条件下通过蓝白斑筛选转化子，阳性克隆提取质粒进行PCR检测和酶切鉴定后进行测序，对得到的序列结果进行分析。

表5 VIGS载体构建所用引物

说明：粗体为保护碱基，下划线为酶切位点

(2)酶切质粒及回收

将测序正确的重组质粒pMD 18-T-Simple-XsMYB308L以及pTRV2空载体质粒分别用 EcoRⅠ和BamH I进行酶切，按表6所述反应体系反应。

表6酶切质粒及回收反应体系

各组分混匀后37℃条件下反应4-6h，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。

(3)构建VIGS重组载体

电泳后回收目的片段和载体，用T4-DNA连接酶将其连接，反应体系如表7所示：

表7构建VIGS重组载体反应体系

各组分混匀后16℃条件下反应6-8h，将连接产物转化大肠杆菌DH5a，在Kan抗性培养基上筛选转化子，阳性克隆提取质粒后进行PCR检测和酶切鉴定。

(4)载体转化农杆菌

(a)农杆菌感受态细胞的制备

①挑取保存的农杆菌GV3101菌株在YEB固体平板上进行划线，28℃条件下倒置培养18-20h；

②挑取单菌落置于5mL含100mg/L Str和100mg/L Rif的YEB液体培养基中，28℃条件下180r/min振荡培养18-20h；

③将1mL活化好的菌液加入到100mL不含抗生素的YEB液体培养基中,28℃条件下180r/min振荡培养OD6oo至0.3-0.5；

④冰上放置30min后，4℃条件下3000r/min离心10min；

⑤弃上清后加入4mL20 mmol/L的CaCl₂溶液轻轻悬浮沉淀，4℃条件下3000r/min离心10min；

⑥弃上清后加入1mL20 mmol/L的CaCl₂再次轻轻悬浮菌体沉淀；

⑦按每管100ul分装至冰上预冷的1.5mL离心管中备用。

(b)冻融法转化农杆菌

分别将1ug含有pTRV1载体、pTRV2空载体和含有重组病毒载体pTRV2- XsMYB308L的质粒加入到农杆菌感受态细胞GV3101中，轻轻混匀后先置于冰上10 min，液氮速冻5min，最后37℃水浴5min；

离心管中加入900ul YEB液体培养基，28℃条件下180r/min振荡培养2-3h；5000r/min离心2min后弃上清液收集菌体，留200ul液体轻轻悬浮菌体后涂布于含有抗生素100mg/L Str.100mg/L Rif和50mg/L Kan的YEB固体培养基平板上，28℃条件下倒置培养36-48h。

(c)鉴定农杆菌重组子

挑取阳性单菌落接种于5mL含抗生素100mg/L Str、100mg/L Rif和50mg/L Kan 的YEB液体培养基中，28℃条件下180r/min振荡培养18-20h。以上述菌液为模板，用对应基因的特异性引物做PCR检测。

(5)病毒诱导XsMYB308L基因沉默

(a)文冠果材料的准备

将文冠果种子浸种催芽后均匀播种于栽培基质中，置于25℃条件下16h光照/8h黑暗培养。10天后，取子叶展平并且刚刚冒出真叶的文冠果幼苗用于农杆菌接种。

(b)农杆菌侵染液的制备

将携带pTRV1、pTRV2空载体和重组病毒载体pTRV2-XsMYB308L的农杆菌GV3101菌液分别加在5mL含有抗生素100mg/L Str、100mg/L Rif和50mg/L Kan 的YEB液体培养基中，28℃条件下180r/min振荡培养18-20h；

取1mL活化好的菌液加入50mL含有100mg/L.Str、100mg/L Rif、50mg/L Kan、10mmol/L MES和20mmol/L AS的YEB液体培养基中，28℃条件下180r/min振荡培养18-20h；

4000r/min离心10min收集菌体，弃上清后用重悬液(10mmol/L MgCl₂、10mmol/LMES和200mmol/L AS)重悬菌体并调OD₆₀₀至2.0，按照TRV1+TRV2、TRV1+TRV2- XsMYB308L的组合将菌液等体积混合,放置2-3h后用于文冠果侵染。

(c)农杆菌侵染文冠果叶片

用注射器针头在叶片远轴面轻轻划出小伤口，但不将其划穿；

吸取不同组合的混合菌液,用不带针头的1mL注射器分别从子叶远轴面伤口处缓缓注入，让液体慢慢的浸润周围；

将接种处理后的文冠果苗移栽到1/4Hoagland营养液中,20℃条件下60％相对湿度黑暗培养24h后，置于20±2℃条件下16h光照/8h黑暗培养。每个菌液组合接种20 株文冠果幼苗，设3次重复。

(6)XsMYB308L基因沉默效率的检测

剪取接种后培养28天的文冠果第5或第6片真叶来检测基因的沉默效率。反应

在Rotor-Gene3000荧光定量PCR仪上进行，PCR完成后在Rotor-gene6软件上查看各基因的扩增情况并导出相应的Ct值，采用2-_△△ ^Ct方法对各基因相对表达量进行分析。

实施例4

表达载体pCAMBIA1300-XsMYB308L的构建

S1.pCAMBIA1300-mCherry质粒的提取与酶切

挑取于-80℃保存的含pCAMBIA1300-mCherry质粒的大肠杆菌DH5α并涂布于含50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。挑取正常生长的单菌落溶于含有10μL无菌水200μL tube中，充分悬浮菌体，取5μL进行菌落PCR检测，将剩余的5mL菌悬液加入到含50mg/L Kan的液体LB培养基中，在37℃条件下200r/min振荡培养14～16h。

S2.目的片段与pCAMBIA1300-mCherry载体的连接

将酶切后的pCAMBIA1300-mCherry质粒与酶切后于-20℃保存的pMD 19T-XsMYB308L切胶回收基因片段以及pCAMBIA1300-mCherry载体框架。将回收纯化的目的片段稀释成50ng/μL，用T4连接酶进行目的基因与载体框架的连接，反应体系如下表8所示：

表8目的基因与载体连接反应体系

用移液枪轻柔混合均匀后16℃连接14h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α在抗性培养基上筛选转化子，挑取阳性克隆提取质粒进行酶切鉴定。

实施例5

烟草转化

S1.烟草苗脱毒

在超净工作台上，先将烟草种子置于75％的乙醇中漂洗30s，然后移入含3％次氯酸钠溶液的烧杯中浸泡10分钟，浸泡结束后立即倒掉溶液并用无菌水充分漂洗种子4 次，随后播种于含MS固体培养基的无菌培养皿上，用封口膜密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养2周；待烟草出苗后，单株移入含MS固体培养基的无菌组培瓶中培养3周。

S2.烟草苗预培养

在超净工作台上，将烟草叶片去叶柄，划伤边缘及叶表面并剪成1cm×1cm大小后置于含MS预培养基(MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA，pH6.0)的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养2d。

S3.农杆菌侵染液的制备

分别将含有CoMYB3和CoMYB70基因重组表达载体的农杆菌GV3101菌液加入到的YEB液体筛选培养基中，在28℃条件下200r/min摇床充分振荡培养18h用于活化菌种。随后取1mL活化后的农杆菌菌液转入50mL无抗生素的YEB液体培养基中，在28℃条件下200r/min摇床充分振荡培养至OD600值为0.5时用于侵染烟草叶片。

S4.共培养

将预培养后的叶片放入侵染液中，在100r/min条件下摇床振荡培养5min后立即取出并除净残液，然后置于含MS预培养基的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下黑暗共培养2-3d，在叶片切口处有微小菌斑出现即可。

S5.转化苗的筛选

将共培养烟草叶片置入含500mg/L Car的无菌水的烧杯中轻柔漂洗直至无絮状菌丝出现，随后用无菌滤纸吸干叶表面残余液体并置于含筛选培养基(MS培养基+500 mg/LCar+50mg/L Kan，Ph6.0)的无菌培养皿上，密封后放入人工气候箱，在25±3℃条件下16h光照/8h黑暗培养至分化出苗。

S6.继代和生根培养

选择生长点完好且在抗生素培养基上生长状态良好的芽，将其完整切下后移入1/2MS培养基中(1/2MS培养基+300mg/L Car+50mg/L Kan，pH5.8)进行生根培养， 3周后重新剪切生长点进行继代培养。

S7.转化烟草的分子检测

参照天根生化科技有限公司的基因组DNA提取试剂盒方法提取未转化的野生型烟草(WT)和Kan筛选后的转化烟草的叶片基因组DNA，以上述基因组DNA为模板，利用文冠果XsMYB308L基因特异性引物进行扩增，用1％琼脂糖凝胶电泳验证目的条带大小，有3个转基因株系扩增出与目的基因大小相同的条带，而WT植株无扩增条带，如图3所示，表明XsMYB308L基因已成功地转入烟草。

应用实验研究

实施例获得的转XsMYB308L基因烟草的生理分析；

抗旱实验：把转基因植株与未转基因植株置于烟草正常的生长条件下停止给水，直至大部分野生型植株失水死亡时复水，复水3天后统计存活率。

抗旱实验中，连续24天不给水，大部分野生型植株失水死亡，进行复水，3天后统计存活率。其中野生型对照有15.6％的植株存活；转基因株系3、4全部存活，株系1和株系2存活率分别为86.7％和80％(图6)。可见转基因烟草植株的抗旱性得到了提高。

以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (4)

1.一种文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L，其特征是，具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种如权利要求1所述的文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L编码的蛋白质，其特征是，是具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1-2任一项所述的文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L在提高植物抗旱能力方面的应用。

4.一种用于扩增如权利要求1-3所述的文冠果干旱诱导转录因子XsMYB308L的引物，其特征是，具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

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