WO2015009082A1 - 아넥신 Ａ2 결합단백질, ｐ53 단백질 및 ｐ18 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

아넥신 Ａ2 결합단백질, ｐ53 단백질 및 ｐ18 단백질을 포함하는 융합 단백질 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • CDK eye 1 in-dependent kinase
  • CDK inhibitors that regulate cell cycle can be classified into two groups: CDK inhibitor protein (CIP) family and Inhibitors of cyclin-dependent kinase 4 (NK4).
  • CIP CDK inhibitor protein
  • NK4 Inhibitors of cyclin-dependent kinase 4
  • INK4 mainly inhibits the activity of CDK 4, 6 and there are pl8, pl6, p8, pl9.
  • Another embodiment provides a pharmaceutical composition for preventing and / or treating cancer comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • Figure 3 shows the results of purification by expressing the protein complexes # 1 and # 2 from the vector via SDS-PAGE.
  • Figure 5 shows the results confirming the cell growth inhibition effect according to the treatment concentration of protein complex # 2 in HCC1806 cell line.
  • One embodiment of the present invention provides a fusion protein comprising annexin A2 binding protein, p53 protein or fragment thereof, and pl8 protein.
  • the fusion protein is an in vitro stabilizing protein (I. vit ion protein), membrane transfer sequence (MTS) domain 'nuclear cytoplasmic signal
  • Another example provides a cell transformed with the recombinant vector.
  • the tumor suppressor pl8 protein plays a role in inhibiting the activity of CDK 4,6. Therefore, the fusion protein in which the transcriptional activation domain of p53 and the pl8 protein are combined and the pharmaceutical composition containing the same as an active ingredient can be very useful as a new anticancer agent.
  • the fusion protein of the present invention includes Annexin A2 binding protein (Annexin A2BP).
  • Annexin A2 binding protein binds to Annexin A2, which is specifically expressed in cancer cells, thereby enabling cancer cell targeting so that the fusion protein can selectively act only on cancer cells.
  • the annexin A2 protein may be exemplified by a protein having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, but the scope of the present invention is not limited thereto, and fragments and analogs of annexin A2 binding protein as long as the cancer cell targeting activity can be achieved. Alternatively, variants may be used.
  • the fusion protein is an in vitro stabilizing protein membrane permeation in the N-terminal direction of the p53 protein in the fusion protein comprising an annexin A2 binding protein, p53 protein and pl8 protein in the N-terminal to C-terminal order Further comprising one or more selected from the group consisting of a sequence domain and a nuclear-cytoplasmic signal domain, or in the group consisting of a membrane permeable sequence domain, a nuclear-cytoplasmic signal domain and an in vivo stabilizing protein in the C-terminal direction of the pl8 protein It may further include one or more selected.
  • the fusion protein may include an annexin A2 binding protein, a pl8 protein, and a p53 protein in an N-terminus to a C-terminus sequence, wherein the in vitro stabilizing protein is in the N-terminus direction of the P18 protein. It further comprises at least one member selected from the group consisting of a membrane permeation sequence domain and a nuclear cytoplasmic signal domain, or a membrane permeation sequence domain, a nuclear-cytoplasmic signal domain and a stabilizing protein in vivo in the C-terminal direction of the p53 protein. It may further include one or more selected from the group.
  • the term "in vitro stabi li zat ion protein 1" refers to the solubility and stability of the fusion protein outside of the fusion protein, that is, when the fusion protein is experimentally purified. of Means a protein for enhancement.
  • the ex vivo stabilizing protein is part of the fusion protein and should not induce immunogenicity in vivo.
  • the ex vivo stabilizing protein when introduced into the fusion protein, it is preferably located in the N-terminal direction of the fusion protein, but is not limited thereto.
  • the in vivo stabilizing protein may be located between pi8 and p53 in addition to both ends of the fusion protein.
  • Ubiquitin (ubiquit in, Ub) is the most conserved protein found in nature and consists of 76 amino acid sequences and is a water soluble protein that shows perfect homology between evolutionary and diverse species such as tortillas, trout and humans. Ubiquitin is also known as a protein that is stable to changes in pH, is not easily denatured even at high temperatures, and is stable to proteases.
  • ubiquitin can improve the insolubility of the fusion protein.
  • the ubiquitin or ubiquitin-like protein (Lib i qu i n—l ike protein, Ubl) may be selected from the group consisting of wild type ubiquitin, wild type ubiquitin-like protein, mutant ubiquitin and mutant ubiquitin-like protein.
  • the mutant ubiquitin means that the amino acid sequence of wild type ubiquitin is changed to another amino acid sequence, for example, wild type
  • the end may comprise an amino acid sequence cleavable by the protease or an amino acid sequence not cleaved by the protease.
  • Amino acid sequences cleavable by the protease can be identified through a search database known in the art. E.g,
  • Proteases and cleavable amino acid sequences thereof may be used.
  • the cleavable amino acid sequence is included, the fusion protein is penetrated into the cell, and then the ubiquitin or ubiquitin-like protein is cleaved by a protease in the cell, including an annexin A2 binding protein, a p53 protein and a pl6 protein. Fusion proteins are able to function in cells. After the cleavage, the fusion protein may contain a membrane transmembrane sequence domain and / or a nuclear-cytoplasmic signal domain.
  • the transmembrane sequence domain when introduced into the fusion protein, it is preferably located in the N terminal direction of the fusion protein, but is not limited thereto.
  • the nuclear-cytoplasmic signal domain in the fusion protein plays an important role in increasing the solubility of the protein, in addition to the important task of moving the fusion protein into and out of the nucleus, and when located close to the C-terminus of the fusion protein, It is more conducive to the increase.
  • N terminus, C terminus, or p53 protein and pl8 protein of the fusion protein may be included between the N terminus, C terminus, or p53 protein and pl8 protein of the fusion protein.
  • the fusion protein may further include one or more selected from the group consisting of an in vitro stabilizing protein, a membrane permeation sequence domain, a nuclear-cytoplasmic signal domain, and an in vivo stabilizing protein, and the details thereof are as described above. .
  • pl8 protein, p53 protein and annexin A2 binding protein at the N-terminus It may be selected from the group consisting of fusion proteins in the order of the C-terminal.
  • a fusion protein comprising p53 protein, pl8 protein and annexin A2 binding protein in the order of N-terminus to C-terminus. It further comprises at least one member selected from the group consisting of an ex vivo stabilizing protein, a membrane permeable sequence domain and a nuclear-cytoplasmic signal domain in the N-terminal direction, or a membrane permeable sequence domain in the C-terminal direction of the annexin A2 binding protein.
  • a fusion protein further comprising at least one selected from the group consisting of a nuclear-cytoplasmic signaling domain and STOPx2;
  • polynuclei eot i de refers to deoxyribonucleotides present in single- or double-stranded form or
  • complementary sequences include not only perfectly complementary sequences, but also substantially complementary sequences, which, for example, under the stringent conditions known in the art, may, for example, alter the amino acid sequence of the fusion protein.
  • substantially complementary sequences which, for example, under the stringent conditions known in the art, may, for example, alter the amino acid sequence of the fusion protein.
  • replication origins that operate in eukaryotic cells included in the vector include fl replication origin, SV40 replication origin, p ⁇ 1 replication origin, adeno replication origin, MV replication origin, and BBV replication origin. It is not limited to this.
  • promoters derived from the genome of mammalian cells eg, metallothionine promoters or mammals
  • coli W3110 Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella Enteric bacteria and strains such as typhimurium, Serratia marsisons, and various Pseudomonas species, and when transforming into eukaryotic cells, are known as host cells, yeast cells, plant cells and plant cells, e.g. Saccharanyce cerevisiae).
  • host cells yeast cells, plant cells and plant cells, e.g. Saccharanyce cerevisiae.
  • CH0 cell lines Choinese hamster ovary
  • W138 ⁇ , C0S-7, 293, HepG2, 3 ⁇ 3, RIN and MDCK cell lines and the like can be used.
  • the fusion of p53 and pl8 included in the fusion protein greatly increases the stability of p53 and ⁇ expresses P 21 gene to temporarily stop cell proliferation, express Bax gene to induce cell death, Since it plays a role of inhibiting the activity of CDK 4, 6, it is effective as an active ingredient in the prevention and / or treatment of cancer.
  • annexin A2 binding protein which is another component included in the fusion protein, binds to annexin A2 specifically expressed in cancer cells, thereby enabling cancer cell targeting so that the fusion protein can selectively act only on cancer cells. Therefore, the fusion protein of the present invention may be provided as a pharmaceutical composition for preventing and / or treating cancer.
  • a pharmaceutical composition for the prevention and / or treatment of cancer comprising the fusion protein as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, diluent and / or excipient in an amount conventionally used as necessary.
  • the fusion protein or a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the same as an active ingredient may be administered orally or parenterally.
  • parenteral administration it can be administered by intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, pulmonary administration and rectal administration.
  • oral administration because proteins or peptides are digested, oral compositions should be formulated to coat the active agent or to protect it from degradation in the stomach.
  • the composition may be administered by any device by which the composition may migrate to target cells.
  • each insert DNA fragment is a nucleotide sequence that can be cleaved with Ndel at the 5 'end, Xhol can be cleaved at the 3' end
  • Ultra-15 centrifugal filter (Mil ipore) was used to remove the salt included in the fractionation and concentrated. Purified protein concentration was measured using BSA as a standard.
  • the mixture was placed in RPMI medium (Gibco BL), and the protein complexes were treated at concentrations of 0, 0.05625, 0.1125, 0.225, 0.45, and 0.9 uM, respectively, followed by a temperature of 37 ° C, humidity of 85%, C0 2 in a C0 2 incubator for 96 hours. Incubated at 53 ⁇ 4 conditions. Comparative experiments were treated with the same protein-free buffer (0.1% arginine, 0.2% Tween20, 0.2% L— Glutathione, lXPBS (pH 7.4)) instead of the protein complex and incubated under the same conditions.

Abstract

아넥신 A2 결합단백질, p53 단백질 및 p18 단백질이 결합된 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
아넥신 A2결합단백질， p 53단백질 및 p l8단백질을 포함하는 융합 단백잘 및 이를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
【기술분야】
아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 및 pl8 단백질이 결합된 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에.관한 것이다.
【배경 기술】
세포가 증식하기 위해서는 G1기 (Gl phase) , DNA 복제기 (S phase) , G27KG2 phase)및 세포분열기 (M phase)를 거치는 일련의 단계를 순환하는데 , 이를 세포주기 (cel l cycl e)라 한다. 세포분열기는 유사분열과 세포질분열을 거쳐 세포가 증식하는 실질적인 단계이고， DNA복제기에서는 DNA가 복제되고 세포수는 변하지 않는다. 따라서, 세포주기에서 세포분열기를 제외한 DNA 복제기， G1기ᅳ G2기를 간기 ( interphase)라고 한다. G1기와 G2기는 세포주기를 조절하는 크포인트 (checkpoint )를 포함하는데， 이는 세포가 비정상적으로 증식하지 않도록 하는 중요한 역할을 한다ᅳ 체크포인트에서 세포주기의 다음 단계로 넘어가기 위한 조건이 층족되었는지를 확인한 후， 모든 조건이 만족되면 DNA 복제기 또는 세포분열기가 진행된다. 이러한 체크포인트에서의 세포 증식 조절이 제대로 이루어지지 않으면 암과 같은 비정상적인 세포 증식을 유발한다.
G1 체크포인트를 지나고， DNA 복제기， G2 체크포인트를 지나서 유사분열을 하기 위해서는 CDK ( eye 1 in-dependent kinase) 단백질의 활성이 필요하다. CDK는 단독으로 활성을 가질 수 없으며 Cyc l in 단백질과
결합되어야 키나아제 활성올 갖게 된다. Cycl in-CDK 복합체는 세포증식에 관련된 단백질들을 인산화시켜 세포 분열을 유도한다. DNA 복제기를 유도하는 단백질들은 주로 Cycl in D/E , CDK 4/6이고， CDK 4/6은
Rb(Ret inoblastoma) 단백질을 인산화시켜서 전사 인자인 E2F의 전사 활성을 갖게 한다. 세포분열기를 유도하는 단백질들은 주로 CyclinA/B, CDK2/1이며， 이들의 Cyclin-CDK 복합체는 MPF(M-phase promoting factor)라고 일컫는다. 유사분열이 완료되거나 DNA 복제가 완료되면 더 이상의 키나아제 활성이 필요하지 않으므로 Cyclin-CDK 복합체의 Cycl in이 분히!되어 CDK의 활성이 사라진다.
세포 주기 조절을 위해 Cyclin-CDK 복합체의 활성을 조절하는 많은 인자들이 존재한다. 대표적인 것으로는 G1 체크포인트에서 DNA가 손상되었을 때 작용하는 p21 단백질이 있다. DNA가 손상되었을 시에 활성되는 종양 억제인자 유전자 (tumor suppressor gene)인 p53에 의해 p21 유전자가 발현된다. p21은 DNA 복제기를 유도하는 Cyclin-CDK 복합체에 결합하여
CDK4/6/2의 키나아제 활성을 저해함으로써， Rb단백질의 인산화를 막는다. 그 결과， 세포는 G1기에 머물면서 손상된 DNA를 수리할 시간을 얻게 된다. 만일 DNA 손상이 세포가 수용하지 못할 정도로 심하면 p53은 아품토시스 유도 유전자 (apoptosis— inducing gene)인 Bax 단백질의 유전자를 발현시킨다. 즉， 세포증식의 조절에 있어서 p53의 작용은 p21 유전자를 발현시켜 세포증식을 일시적으로 정지시키는 것 (growth arrest), 또는 p53_결합 단백질인 ASPP 단백질과 결합한 p53 단백질이 Bax 유전자를 발현시켜 아픕토시스를
유발하는 것 (apoptosis inducing)의 두 가지로 나누어 볼 수 있다.
아픕토시스는 예정된 세포 죽음 (programmed cell death)이라고도 하며 세포가 조직내에서 더 이상 필요 없을 때, 바이러스의 침입을 받았거나 암세포로 변환되었을 때 등, 개체수준에서 세포의 죽음이 오히려 도움이 되면 세포 스스로 자살하는 기작이다.
세포주기를 조절하는 CDK 억제제는 크게 CIP(CDK inhibitor protein) family와 I NK4( Inhibi tors of cycl in-dependent kinase 4) 두 가지로 분류할 수 있다. CIP 에는 p21과 p27이 있다. INK4는 주로 CDK 4， 6의 활성을 저해하며 pl8, pl6, p8, pl9가 있다.
세포 증식을 조절하기 위해서는 종양 억제인자 유전자와 전암 유전자 (proto-oncogene)와의 균형이 유지되어야 한다. 종양 억제인자 유전자인 p53 단백질의 유전자가 변이 (imitation)되면， 비정상적인 세포의 아픕토시스를 유도할 수 없으므로 비정상적 세포 증식을 유발한다. 또한 정상적인 세포 증식 인자인 전암유전자가 변이 (바이러스에 의한 유전자 치환 등)되거나 과발현 되어 암유전자가 되어도 암세포와 같은 비정상적인 세포 증식,을 유도한다. 암유전자는 비정상적인 활성을 갖는 성장인자， 세포내 신호전달 단백질을 만들어 잘못된 신호 전달을 유발하기 때문에 외부의 증식 신호가 없어도 세포증식이 일어난다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이러한 사실로 볼 때， 비정상적인 세포 증식으로 인한 암을 저해하기 위해 세포 주기를 조절하는 각종 인자들을 활용한 항암제의 개발이
요구되고 있는 실정이다.
【기술적 해결방법】
일 구체예는 아넥신 A2결합단백질， p53단백질 또는 그 단편, 및 pl8 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
다른 구체예는 상기 융합 단백질올 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
다른 구체예는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터를 제공한다.
다른 구체예는 상기 재조합 백터로 형질전환된 세포를 제공한다. 다른 구체예는 상기 형질전환된 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
다른 구체예는 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 구체예는 상기 융합 단백질의 치료적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법을 제공한다.
【유리한 효과】
일 구체예에 따른 융합 단백질 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용 가능하다. 또한 상기 융합 단백질은 면역원성이 없기 때문에， 안전한 항암 치료용 단백질로서 유용하고， 암세포만을 타켓팅하여 특이적으로 작용하여 부작용이 적을 뿐 아니라， 거의 모든 종류의 암의 예방 및 /또는 예방에 적용 가능하고， 기존의 항암제가 효과를 발휘하지 못하는 고형암에도 우수한 효과를 기대할 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 일 구체예에 따른 단백질 복합체의 예를 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 일 구체예에 따른 단백질 복합체가 암 세포에 작용하는 기전을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 단백질 복합체 #1 및 #2 를 백터로부터 발현시켜 정제한 결과를 SDS-PAGE를 통해 나타낸 것이다.
# 1： A2BP-Ub-Ub (ml) -MTS-p 18 (F71N) -Ub ( m3 ) -Ub ( m4 ) -P53F-NLS
#2 : A2BP-Ub-Ub ( ml ) -MTS- 18 ( F7 IN ) -AAT-p53F-NLS
도 4는 본 발명에 따른 단백질 복합체 #1 및 #2 가 아넥신 A2 와 결합하는지를 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
#1： A2BP-Ub-Ub(ml)-MTS-pl8(F71N)-Ub(m3)-Ub(m4)-p53F-NLS
#2： A2BP-Ub-Ub (ml) -MTS- 18 ( F7 IN ) -AAT-p53F-NLS
도 5는 HCC1806 세포주에서 단백질 복합체 #2의 처리 농도에 따른 세포 성장 저해 효과를 확인한 결과를 나타낸다.
#2： A2BP-Ub-Ub (ml) -MTS- 18(F71N) -AAT-p53F-NLS
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명의 일 예는 아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 또는 그 단편， 및 pl8 단백질을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 융합 단백질은 생체외 안정화 단백질 ( in vi tro stabi l izat ion protein) , 막 투과 서열 (membrane transfer sequence , MTS) 도메인' 핵一세포질 신호
(nucleus-cytoplasm signal ) 도메인， ATT 및 ST0Px2 로 이루어진 군에서 선택된 1종.이상을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 예는 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또 다른 예는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터를 제공한다.
또 다른 예는 상기 재조합 백터로 형질전환된 세포를 제공한다.
또 다른 예는 상기 형질전환된 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은 필요에 따라서 약학적으로 허용되는 담체， 희석제 및 /또는 부형제를 통상적으로 사용되는 양으로 추가로 포함할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이， CDK (Cyc l in-dependent kinase) 단백질은 암 발생에 주요한 역할을 하고 이의 억제제로서 CIP(CDK inhibi tor protein) 계통 단백질과 INK4( Inhibi tors of cyc l in-dependent kinase 4) 계통 단백질들이 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 융합 단백질은 CIP 계통 단백질 발현을 조절하는 p53 단백질과 INK4 계통 단백질에 속하는 pl8 단백질이 연결된 것으로， CIP계통 단백질 활성과 INK4단백질 활성을 동시에 발휘하여 보다 우수한 암의 예방 및 /또는 치료 효과를 얻을 수 있다.
일 구체예에 따르면， 상기 p53 단백질은 NCBI access ion number NP 300537에 의하여 제공되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 그 단편일 수 있다. 본 명세서에서 P53 단백질은 별도의 언급이 없는 한 전장 단백질과 그 단편을 모두 의미하는 것으로 사용된다.
또한, 상기 ρ53단백질은 서열번호 l(Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn)의 아미노산 서열올 갖는 p53 단백질의 전사활성 도메인일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 p53 단백질 단편은 p53 단백질 증 Mdm2에 결합하는 부위인 인간 p53 단백질의 18 내지 26번째 아미노산 서열을 포함하는 전사활성 도메인을 의미한다. 상기 p53의 전사활성 도메인은 p53 분해 작용을 하는 Mdm2와 결합함으로써 생체 내에서의 p53의 안정성을 크게 증가시키며， p53의 작용으로 CDK 억제제 단백질을 암호화하는 p21 유전자를 발현시켜 세포증식을 일시적으로 정지시키고 p53-결합 단백질인 ASPP(apoptos i s-st imul at ing protein of p53)와 결합한 p53이 Bax 유전자를 발현시켜 세포 죽음을 유발하는 역할을 한다. 또한， 종양 억제제인 pl8단백질은 CDK 4 , 6의 활성을 저해하는 역할을 한다. 따라서 p53 의 전사활성 도메인과 pl8 단백질이 결합된 융합 단백질과 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물은 새로운 항암제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 pl8 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다. 또한， pl8 단백질은
용해도 ( solubi l i ty)를 개선하기 위한 목적으로 전체 단백질 활성에 영향을 미치지 않는 한 일부 아미노산 잔기를 변형 (치환 삭제， 부가， 결실 등)하여 사용할 수 있다.
상기 융합 단백질에서 p53 단백질과 pl8 단백질의 연결되는 순서는 제한이 없으며， N 말단 -p53 단백질 -pl8 단백질 -C 말단 또는 N 말단 -pl8 단백질 -p53단백질 -C말단 형태 모두 포함된다. 일 구체예에서， 서열번호 1의 p53 단백질 단편과 서열번호 2의 pl8 단백질이 결합된 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 아넥신 A2 결합단백질 (Annexin A2 binding protein , Annexin A2BP)을 포함한다. 아넥신 A2 결합단백질은 암세포에 특이적으로 발현되는 아넥신 A2에 결합하므로， 융합 단백질이 암세포에만 선택적으로 작용할 수 있도록 암세포 타겟팅이 가능하게 한다. 아넥신 A2 단백질로는 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 단백질올 예시할 수 있으나， 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니며, 암세포 타겟팅 활성을 달성할 수 있는 한 아넥신 A2 결합단백질의 단편， 유사체 또는 변이체를 사용해도 무방하다.
상기 융합 단백질에서 아넥신 A2 결합단백질은 p53 및 pl8 융합체의 N-말단 또는 C-말단에 위치할 수 있다. 예를 들어， 본 발명의 융합 단백질은 아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 및 pl8 단백질을 N-말단에서 C-말단의 ᅵ 순서로 포함하는 융합 단백질; 아넥신 A2 결합단백질， pl8 단백질 및 p53 단백질을 Nᅳ말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질; p53 단백질， l8 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질； 및 pl8단백질， p53단백질 및 아넥신 A2결합단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
바람직한 일 구체예에서， 상기 융합 단백질은 생체외 안정화 단백질
( in vi tro stabi l i zat ion protein) , 막 투과 서열 (membrane transfer sequence, MTS) 도메인， 핵-세포질 신호 (nucleus-cyto lasm signal )도메인, 및 생체내 안정화 단백질 ( in vivo stabi l i zat ion protein)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
이 때， 추가되는 폴리펩타이드의 융합 단백질 내 위치는 제한이 없으며, 상기 추가되는 1종 이상의 폴리펩타이드는 각각 독립적으로 융합 단백질의 N 말단, C 말단, 또는 p53 단백질과 pl8 단백질 사이에 포함될 수 있다.
바람직하게,상기 융합 단백질은 아넥신 A2결합단백질， p53단백질 및 pl8 단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서， p53 단백질의 N—말단 방향에 생체외 안정화 단백질 막 투과 서열 도메인 및 핵-세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나, pl8 단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인, 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
또한 바람직하게， 상기 융합 단백질은 아넥신 A2 결합단백질, pl8 단백질 및 p53 단백질을 N—말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서， P18 단백질의 N—말단 방향에 생체외 안정화 단백질ᅳ 막 투과 서열 도메인 및 핵ᅳ세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， p53 단백질의 C—말단 방향에 막 투과 서열 도메인, 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본원에서 용어， "생체외 안정화 단백질 ( in vi tro stabi l i zat ion protein) 1'은 상기 융합 단백질의 생체 외부에서, 즉, 상기 융합 단백질을 실험적으로 정제를 하는 경우， 상기 융합 단백질의 용해도 및 안정성을 증진시키기 위한 단백질을 의미한다. 상기 생체외 안정화 단백질은 상기 융합 단백질의 일부로써, 생체 내에서 면역원성을 유발하지 않아야 한다. 일 구체예에서， 생체외 안정화 단백질이 융합 단백질 내에 도입되는 경우， 융합 단백질의 N 말단 방향에 위치하는 것이 바람직하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 바람직하게， 생체내 안정화 단백질은 융합 단백질의 양 말단 외에 추가적으로 pi8과 p53 사이에 위치할 수 있다.
일 구체예에 따르면ᅤ 상기 생체외 안정화 단백질은 유비퀴틴 또는 유비퀴틴—유사 단백질일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
유비퀴틴 (ubiqui t in , Ub)은 자연계에서 발견되는 가장 보존적인 단백질로 76개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며， 곤층， 송어 및 인간처럼 진화적으로 다양한 종들간의 완벽한 상동성을 보이는 수용성 단백질이다. 또한， 유비퀴틴은 pH의 변화에 대해 안정하고, 고온에서도 쉽게 변성되지 않으며， 프로테아제에 대해서도 안정성이 있는 단백질로 알려져 있다.
따라서， 유비퀴틴은 상기 융합 단백질의 불용성을 개선할 수 있다.
상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질 ( Lib i qu i t i n— l ike protein , Ubl )은.야생형 유비퀴틴， 야생형 유비퀴틴 -유사 단백질， 돌연변이 유비퀴틴 및 돌연변이 유비퀴틴 -유사 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 돌연변이 유비퀴틴은 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 바꾼 것을 의미하며, 예를 들면, 야생형
유비퀴틴 (서열번호 5)의 Lys을 Arg으로 치환한 유비퀴틴， 및 /또는 야생형 유비퀴틴 C—말단 RGG를 RGA로 변경시킨 (즉 유비퀴틴 야생형
폴리펩타이드의 76번째에 존재하는 Gly이 Al a으로 치환된) 유비퀴틴을 포함한다. 일 구체예에 따르면， 상기 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로
치환한 돌연변이형 유비퀴틴에서 ,상기 치환은 야생형 유비퀴틴의 6， 11， 27 , 29， 33 , 48 및 63번째에 존재하는 Lys 중에서 선택된 1종 이상에서 이루어질 수 있으며 , 치환은 상기 Lys의 위치에서 독립적으로 또는 조합하여 이루어질 수 있다.
일 구체예에 따르면， 상기 유비퀴틴 -유사 단백질은 유비퀴틴과 그 특성이 유사한 단백질로， 예를 들어， Nedd8 , SUM으 1， SUMO-2 , NUBl , PICl , UBL3 , UBL5 및 ISG15로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 한정하지는 않는다 .
일 구체예쎄 따르면， 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질은
C—말단에 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열 또는 프로테아제에 의해 절단되지 않는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 당업계에 공지된 검색 데이터베이스를 통해 확인할 수 있다. 예를 들어，
http://w丽. expasy.org/too ls/pept idecutter/pe^^
서 검색되는 프로테아제 및 그의 절단 가능한 아미노산 서열올 이용할 수 있다. 상기 절단 가능한 아미노산 서열이 포함되는 경우， 상기 융합 단백질이 세포 내로 투과된 다음, 세포 내의 프로테아제에 의해 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질은 절단이 되어， 아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 및 pl6 단백질을 포함하는 융합 단백질이 세포 내에서 그 기능을 할 수 있게 된다. 상기 절단 후， 융합 단백질에는 막 투과 서열 도메인 및 /또는 핵-세포질 신호 도메인 등이 포함되어 있을 수 있지만， 이들은
폴리펩타이드의 길이가 매우 짧으므로 융합 단백질의 기능에는 영향을 미치지 않는다. 또한， 세포 내의 프로테아제에 의해 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질이 절단되지 않더라도 유비퀴틴 또는 유비퀴틴 -유사 단백질은 면역원성이 없으므로 생체내에서 안전할 뿐 아니라 시스테인을 포함하지 않아서 폴딩이 되지 않으므로 융합 단백질 구조 변화를 유발하지 않고 융합 단백질이 세포 내에서 그 기능을 발휘하는데 영향을 미치지 않는다.
용어， "막 투과 (membrane transfer)"는 인 비트로 vitro) 및 /또는 인 비보 vivo) 상에서 운반 대상인 융합 단백질을 세포 내 또는 핵 내로 운반할 수 있는 능력을 의미한다.
또한, "막 투과 서열 (membrane transfer sequence, MTS)도메인 "은 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 의미한다. 상기 막 투과 서열 도메인은 그 Nᅳ말단에 단일 소수성 영역 (single hydrophobic region)을 가지고， 헬릭스 구조 (helix structure)를 형성하며， 유연성을 나타내고, 상대적으로 짧은 길이의 아미노산 (7개 내지 17개 아미노산)을 갖는 것을 특징으로 한다. 따라서， 상기 막 투과 서열 도메인의 물성은 대개 소수성을 나타낸다. 일 구체예에 따르면， 상기 막 투과 서열 도메인은 그 자체로 인지질 이중막의 세포막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드이면 모두 가능하고 특별히 한정되지 않으나， 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 막투과 서열 도메인이 융합 단백질에 도입되는 경우에， 융합 단백질의 N 말단 방향에 위치하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어， "핵-세포질 신호 (nucleus-cytopl asm signal ) 도메인 "은 융합 단백질을 핵의 내부로 수송하거나， 핵의 외부로 수송하기 위는 역할을 하는 폴리펩타이드 서열을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면， 상기 핵-세포질 신호 도메인은 NLS(nuc l eus locat ion sequence) 도메인 또는
NES(nuc leus export sequence) 도메인일 수 있다. 즉， 융합 단백질을 핵 내로 이송시키기 위해서는 상기 융합 단백질에 NLS를 포함시키고， 상기 융합 단백질을 세포질에 남아 있도특 하기 위해서는 상기 융합 단백질에 NES를 포함시칼 수 있다.
NLS 도메인은 세포질에서 핵으로 수송되는 단백질들이， NES 도메인은 핵에서 세포질로 수송되는 단백질들이 특징적으로 가지고 있는데, 상기 도메인 모두 핵막을 통과할 수 있는 아미노산 서열을 갖는 폴리템타이드를 의미하며， 상기 아미노산 서열이 특별히 한정되지는 않는다. 상기 NLS 도메인으로 사용될 수 있는 폴리펩타이드는 예를 들어， KKKRK (서열번호 7)， PKKKRKV (서열번호 8)， KRPMTKKAGQAKKKK (서열번호 9) 등일 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다.
상기 융합 단백질에서 핵-세포질 신호 도메인은 상기 융합 단백질을 핵 내외로 이동시키는 중요한 일을 하는 이외에도， 단백질의 용해도를 증가시키는데 중요한 역할을 하는데， 융합 단백질에서 C-말단에 가깝게 위치해 있는 경우， 용해도의 증가에 더욱 도움이 된다.
용어， "생체내 안정화 단백질 ( in vivo stabi l i zat i on protein) "은 상기 융합 단백질이 실질적으로 작용하는 생체 내부에서， 상기 융합 단백질이 안정적으로 존재할 수 있도록 안정성을 부여하는 단백질을 의미한다. 상기 생체내 안정화 단백질은 상기 융합 단백질의 일부로써， 생체 내에서
면역원성을 유발하지 않아야 하며， 특히, 대상에 투여된 경우， 대상의 혈액 내에서 안정성을 획득할 수 있는 단백질이면 어떠한 단백질이라도 가능하다. 일 구체예에 따르면， 상기 생체내 안정화 단백질은 MT (alpha 1
ant i tryps in) , 혈청 알부민, 혈청 알부민 결합 펩타이드 (serum albumin binding pept i de ; SABP) , 면역글로불린의 Fc 및 PEG(polyethyl eneglycol )로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나， 이에 한정되지는 않는다.
일 구체예에서， 상기 생체내 안정화 단백질이 융합 단백질에
도입되는 경우， 융합 단백질의 N말단， C말단， 또는 p53단백질과 pl8단백질 사이에 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 융합 단백질의 말단에는, 종결코돈 (stop codon)이 추가로 포함될 수 있다. 종결코돈은 2회 이상 반복하여 삽입될 수 있으며， 예를 들어 TM 서열이 2회 반복되어 삽입될 수 있다. 본 명세서 내에서는， 종결코돈이 2회 반복 삽입된 경우를 편의상 STOPx2 로 표시하기로 한다.
또한,본 발명은 아넥신 A2결합단백질， p53단백질 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 p53 단백질 단편， 및 pl8 단백질올 포함하는 융합 단백질올 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 융합 단백질은 생체외 안정화 단백질, 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인， 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 그 구체적 내용은 앞서 설명한 바와 같다.
일 구체예에 따르면， 상기 융합 단백질은 아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 및 pl8 단백질을 N—말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질; 아넥신 A2 결합단백질， pl8 단백질 및 p53 단백질을 N—말단에서
C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질;
p53 단백질， pl8 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질을 N-말단에서
C—말단의 순서로 포함하는 융합 단백질; 및
pl8 단백질， p53 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한 바람직한 일 구현예에 따르면， 상기 융합 단백질은 아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 및 pl8 단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서, p53 단백질의 N-말단 방향에 생체외 안정화 단백질， 막 투과 서열 도메인 및 핵-세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， pl8 단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인, 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을추가로 포함하는 것인 융합 단백질;
아넥신 A2 결합단백질， pl8 단백질 및 p53 단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서， pl8 단백질의 N-말단 방향에 생체외 안정화 단백질, 막 투과 서열 도메인 및 핵—세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， p53 단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질;
p53 단백질， pl8 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서, 아넥신 A2 결합단백질의 . N-말단 방향에 생체외 안정화 단백질， 막 투과 서열 도메인 및 핵-세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， 아넥신 A2 결합단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 및 STOPx2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질; 및
pl8 단백질， p53 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질을 N-말단에서
C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서， 아넥신 A2 결합단백질의 N-말단 방향에 생체외 안정화 단백질， 막 투과 서열 도메인 및 핵-세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나, 아넥신 A2 결합단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
또한， 본 발명은 상기 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터， 상기 재조합 백터로 형질전환된 세포를 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 배양시키는 단계를 포함하는 융합 단백질의 제조방법을 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드 (polynuc l eot i de) " 는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는
리보뉴클레오티드의 중합체를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 RNA 게놈 서열， cDNA 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며， 특별하게 다른 언급이 없는 한 천연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다. 일예로， 본 발명의 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 핵산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라， 그 서열에
상보적인 (complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라， 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며， 이는 당업계에 공지된 엄격 조건 (str ingent condi t i ons ) 하에서， 예를 들어, 상기 융합 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의
뉴클레오티드 서열과 흔성화될 수 있는 서열을 의미한다.
상기 재조합 백터는， 숙주 세포 내에서 안정적으로 상기 융합 단백질을 발현시킬 수 있는， 발현용 백터일 수 있다. 상기 발현용 백터는 당업계에서 식물， 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 백터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 백터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 백터가 발현 백터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는， 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어，
pL 프로모터， t rp프로모터, l ac프로모터， tac프로모터， T7프로모터 등) , 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사 /해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 백터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f l 복제원점, SV40 복제원점， p鹏 1 복제원점， 아데노 복제원점， MV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한， 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물
바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터 백시니아 바이러스 7.5K프로모터 , SV40 프로모터 , 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk프로모터)가 이용될 수 있으며， 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서 형질전환된 세포는 상기 재조합 백터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며， 원핵 세포로는， 예를 들어， E. coli JM109 , E. coli BL21 , E. coli RRl , E. coli LE392 , E. coJi' , E. coli X 1776 , E. coli W3110 , 바실러스 서브틸리스， 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모넬라 티피무리움， 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며， 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서， 효 S Saccharanyce cerevisiae) , 곤층 세포， 식물 세포 및 동물 세포， 예를 들어， CH0 세포주 (Chinese hamster ovary) , W138 , ΒΗΚ , C0S-7 , 293 , HepG2 , 3Τ3 , RIN및 MDCK세포주 등이 이용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 백터의 숙주 세포 내로의 운반은， 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어， 숙주 세포가 원핵 세포인 경우， CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고， 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는， 미세 주입법， 칼슘 포스페이트 침전법， 전기 천공법， 리포좀 -매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나， 이에 한정하지는 않는다. 상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여， 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는， 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
형질 전환된 세포의 배양은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어， 형질 전환된 세포를 YT 액상 배지에 접종하여 배양을 실시한 다음， 세포 밀도가 일정 수준에 도달한 시점에서 IPTG를 배지에 첨가하여 lacl 프로모터에 의한 단백질 발현을 유도하고
배양함으로써， 세포 내 또는 배지로 분비된 단백질을 얻을 수 있다.
세포 내 또는 배지로 분비된 단백질은 당업계에 공지된 다양한 정제 방법에 따라 정제된 형태로 얻올 수 있다. 예를 들어， 암모늄 설페이트에 의한 용해도 분획화 (solubi l i ty fract ionat ion) , 크기 분별 여과 및 다양한 크로마토그래피 (크기， 전하， 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 정제 방법을 통하여 정제된 형태로 단백질을 얻을 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질이 GST에 융합된 경우에는 글루타티온이 결합된 레진 칼럼， 6x Hi s에 융합된 경우에는 Ni2+-NTA Hi s-결합 레진 칼럼을 이용하여 원하는 단백질을 용이하게 얻을 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이 , 상기 융합 단백질에 포함된 p53 및 pl8의 융합체는 p53의 안정성을 크게 증가시키고ᅳ P21 유전자를 발현시켜 세포증식을 일시적으로 정지시키며， Bax 유전자를 발현시켜 세포 죽음을 유발하고， CDK 4， 6의 활성을 저해하는 역할을 하므로, 암의 예방 및 /또는 치료에 있어서 유효성분으로 효과적이다. 또한 상기 융합 단백질에 포함된 또 다른 성분인 아넥신 A2 결합단백질은 암세포에 특이적으로 발현되는 아넥신 A2에 결합하므로 융합 단백질이 암세포에만 선택적으로 작용할 수 있도록 암세포 타겟팅이 가능하게 한다. 따라서， 본 발명의 융합 단백질은 암의 예방 및 /또는 치료용 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
따라서， 다른 예에서， 상기 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 및 /또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 상기 약학 조성물은 필요에 따라서 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및 /또는 부형제를 통상적으로 사용되는 양으로 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 덱스트로스， 수크로스, 솔비를， 만니를， 전분, 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트, 젤라틴ᅳ 규산 칼슘， 미세결정성 샐를로스， 폴리비닐피롤리돈， 셀를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나， 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제， 습윤제， 감미게， 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 상기 융합 단백질의 치료적 유효량을 암의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는， 암의 예방 및 /또는 치료 방법이 제공된다. 상기 암의 예방 및 /또는 치료 방법은 상기 투여 단계 이전에 암의 예방 및 /또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 예에서， 상기 융합 단백질의 암의 예방 및 /또는 치료에 사용하기 위한 용도, 또는 상기 융합 단백질의 암의 예방 및 /또는 치료를 위한 약물 제조에 사용하기 위한 용도가 제공된다.
상기 융합 단백질 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라 약학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액 현탁액， 시럽제 또는 유화액 형태이거나 액스제, 산제， 분말제, 과립제, 정제 또는 캅씰제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한， 상기 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고， 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
상기 융합 단백질 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입， 피하 주입， 근육 주입, 복강 주입， 내피 투여， 국소 투여， 비내 투여， 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 상기 조성물이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에ᅳ의해 투여될 수 있다. 상기 융합 단백질 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령, 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100 mg/kg 범위 내이다. 용어 "약학적 유효량" 또는 "치료적 유효량' '은 암의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미한다.
상기 융합 단백질 또는 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 투여 대상 환자는 포유류， 예컨대 인간， 원숭이 등을 포함하는 영장류， 래트, 마우스 등을 포함하는 설치류 등일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 융합 단백질 또는 약학 조성물이 예방 또는 치료 대상으로 하는 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며， 예컨대， 편평상피세포암， 소세포폐암， 비소세포폐암， 폐의 선암， 폐의 편평상피암， 복막암， 피부암, 피부 또는 안구내 혹색종， 직장암， 항문부근암, 식도암, 소장암， 내분비선암, 부갑상선암， 부신암， 연조직 육종， 요도암, 만성 또는 급성 백혈병， 림프종， 위장암， 췌장암，교아종, 경부암，난소암， 간암，방광암， 유방암 (tr iple negat ive breast cancer포함) ,결장암，대장암，자궁내막 또는 자궁암， 침샘암， 신장암, 전립선암 음문암, 갑상선암， 두경부암 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으니， 이에 한정하지는 않는다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하, 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나， 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 실시예 1: 융합 단백질의 발현 백터의 제조
본 실시예에서는 친수성 폴리펩티드의 한 종류인 유비퀴틴 야생형 단백질 또는 유비퀴틴 돌연변이형 단백질， 막 투과 서열 도메인 (MTS :
membrane trans locat ion sequence) , ρ18 , 생체내 안정화 단백질 (ΑΑΤ : al ha 1 antitrypsin), p53 단편 및 핵 위치 신호 도메인 (NLS: nucleus localization signal domain)의 순서로 연결된 세포 내 전달용 단백질 복합체를 생산하기 위한 상기 단백질 복합체의 발현 백터를 제조하였다. 또한， 상기 단백질 복합체와의 비교 실험을 위해 상기 단백질 복합체에서 하나 이상의 구성 요소를 제외한 단백질 복합체를 생산하기 위한 발현 백터를 제조하였다. 이하， 야생형 유비퀴틴을 이하 Ub7K 로 (서열번호 5)， 야생형 유비퀴틴 C-말단의 RGG를 RGA로 변경시킨 돌연변이형 유비퀴틴을 Ub7KR(G76A)
(서열번호 12) 라 명명하도록 한다. 또한， 상기 돌연이형 유비퀴틴은 합성을 용이하게 하기 위하여， 아미노산서열을 같으나 wobble sequence를 사용하여 핵산 서열이 서로 다른 4가지 핵산을 제조하였으며， 이를 Ub(ml), Ub(m3), Ub(m4)로 각각 명명하였다 (서열번호 13 내지 서열번호 16).
총 6가지 종류의 발현 백터를 (주) 제노텍에 의뢰하여 제조하였으며， 단백질 과발현을 위한 백터는 pET-21b (+) (EMD Biosciences)를 사용하였다. 한편， 상기 각각의 인서트 DNA 절편은 5' 말단에 Ndel으로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을， 3' 말단에 Xhol으로 절단될 수 있는
뉴클레오티드 서열을 포함함으로써， 상기 pET21b(+) 백터의 Ndel-X ol 절단 서열에 삽입될 수 있도록 하였다.
일 구체예에 따른 단백질 복합체의 가능한 1차 구조를 나타내는 모식도를 도 1에 나타내었다. 실시예 2: 융합 단백질의 발현 및 정제
상기 실시예 1에서 제조한 백터를 이용하여 단백질 복합체를 과발현시키기 위해， 상기 백터로 형질 전환된 E. co//' BL2 DE3)에서 발현시켰다. 이 때， 배양액으로 YT 배지를 사용하였으며， 흡광도 600醒에서 O.D.값이 0.5일 때 0.5 mM의 IPTG를 넣고 18 °C에서 16시간 동안 더 배양하였다. 상기 배양하여 얻은 세포를， 5%글리세를， 5mM β-머캅토에탄을， 0.2% Triton X-100 및 0.2 M NaCl을 포함하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 하에서 초음파로 분쇄한 후, 원심분리기 (10,000 g)를 이용하여 상층액올 얻었다. 상기 상층액을 상기 완층액으로 평형화된 Ni2+-NTA super flow 칼럼 (Qiagen)에 적용하고， 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완층액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0， 5%글리세를, 5mM β-머갑토에탄을， 0.2% Tr i ton Xᅳ 100및 I M NaCl)로 세척한 다음， 용출 완층액 (50 mM Tris-HCl， pH 8.0, 5%글리세를， 5 mM β-머캅토에탄올， 0.2% Triton X-100 및 0.2 M NaCl)으로 상기 단백질 복합체를 용출하였다. 단백질 복합체가 포함된 분획들을 모아 Amicon
Ultra-15 Centrifugal Fi lter(Mil ipore)를 이용하여 분획 증에 포함된 염을 제거하고 농축하였다. 정제된 단백질 농도는 BSA를 표준 물질로 사용하여 측정하였다.
도 3은 실시예 1에서 제작한 백터로부터 발현된 단백질 복합체들을 상기 방법에 의해 정제한 결과를 SDS— PAGE를 통해 나타낸 것이다. 도 3에서, 단백질 복합체 #1은 A2-Ub-Ub ( m 1 ) -p 18-Ub ( m3 ) -Ub (m4 ) -p53 의 순서로 결합된 단백질 복합체이고, 단백질 복합체 #2는 A2-Ub-Ub(ml)-pl8-AAT-p53의 순서로 결합된 단백질 복합체이다. 아넥신 A2 단백질과의 결합 여부를 확인하기 위해， 아넥신 A2는 따로 정제하였다. M은 사이즈 마커를 의미한다. 실시예 3: 융합 단백질의 아넥신 A2에 대한 결합성 확인
우선 실시예 2에서 수득한 단백질 복합체가 실제로 아넥신 A2에 결합하는 지 알아보기 위해 in vitro에서 결합 테스트를 실시하였다. 먼저， 아넥신 A2 결합 펩타이드를 포함하는 단백질 복합체 #1인
A2-Ub-Ub ( m 1 ) -P 18-Ub ( m3 ) -Ub ( m4 ) -P53 , 단백질 복합체 #2인
A2-Ub-Ub ( m 1 ) -p 18-AAT-p53 ( #2 ) 500 ug와 아넥신 A2 단백질 1500 ug을 1000 ul의 PBS완층액 (1 x PBS, 0.2 % Tween 20 , 100 mM arginine, 0.2 % glutathione reduced) 에 18°C에서 120분 동안 방치하여 결합 시간을 층분히 제공한 다음， 이를 Hi Load Super dex S-75 16/60 컬럼 (GE healthcare)에 로딩하여
용출하였다. 이 때 용출 조건은 ow rate 1 ml/min, PBS 완층액 (1 x PBS, 0.2 % Tween 20， 100 mM arginine, 0.2 % glutathione reduced)이며， 2 ml fraction으로 120분 동안 수득하였다. 이후，상기 용출액을 50mMTris완충액 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0， 5 %글리세를， 5 mM β-머갑토에탄올， 0.2 % Triton X-100및 I M NaCl)로 평형화된 Ni2+-NTA superf low컬럼 (Qiagen)에 적용하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 단백질 복합체를 용출하였다.
도 4은 상기 과정에 의해 용출된 단백질 복합체를 SDS-PAGE를 통해 나타낸 것이다. 도 4에서 보는 바와 같이， 아넥신 A2 결합 펩타이드를 포함하는 단백질인 단백질 복합체 #1， #2 모두 아넥신 A2 와 결합하였음을 확인할 수 있었다. 실시예 4: 암세포주를 이용한융합 단백질의 항암효과 확인
실시예 2에서 제조한 단백질 복합체 #2의 세포 내 투과 및 암세포의 치료 효능을 확인하기 위하여 , 삼중음성 (triple negative) 유방암
세포주 (HCC1806, ATCC)를 대상으로 상기 단백질 복합체의 투여에 의한 Pl8-p53 단백질의 항암 효과를 확인하였다.
상기 세포들을 각각 웰당 5X103개가 포함되도록 10%의 FBS가 포함된
RPMI 배지 (Gibco BL)에 넣고， 단백질 복합체를 각각 0， 0.05625, 0.1125, 0.225, 0.45, 0.9uM의 농도로 처리한 다음， 96시간 동안 C02배양기에서 온도 37°C, 습도 85%， C025¾의 조건으로 배양하였다. 비교 실험으로는 상기 단백질 복합체 대신 단백질 복합체가 없는 buffer (0.1% arginine, 0.2% Tween20, 0.2% L— Glutathione, lXPBS(pH 7.4))를 동일 양으로 처리하고 상기와 동일한 조건에서 배양하였다/
그 결과， 도 5에서 나타낸 바와 같이， 핵 위치 신호 도메인 (NLS) 및 인 비보 안정 단백질 (MT)을 모두 포함하는 단백질 복합체 #2는 0.9uM의 농도에서 상기 모든 세포주의 세포 성장을 50% 억제함을 확인할 수 있었다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 p53 단백질 단편， 및 pl8 단백질을 포함하는， 융합 단백질.
【청구항 2】
거 U항에 있어서， 상기 융합 단백질은
생체외 안정화 단백질 (in vitro stabilization protein),
막 투과'서열 (membrane transfer sequence , MTS) 도메인，
핵-세포질 신호 (nucleus-cytoplasm signal) 도메인， 및
생체내 안정화 단백질 (in vivo stabilization protein)
로 이투어진 군에서 선택된 1종 이상의 플리펩타이드를 추가로 포함하는 것인， 융합 단백질.
【청구항 3】
제 2항에 있어서， 상기 생체외 안정화 단백질은 야생형 유비퀴틴， 돌연변이 유비퀴틴， 및 유비퀴틴 -유사 단백질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고，
상기 야생형 유비퀴틴은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 것이고, 상기 돌연변이 유비퀴틴은 상기 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열의 6， 11， 27， 29, 33, 48및 63번째에 존재하는 Lys중 하나 이상이 Arg으로 치환된 것 , 상기 야생형 유비퀴틴의 76번째에 존재하는 Gly이 Ala으로 치환된 것 또는 상기 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열의 6， 11， 27, 29， 33, 48및 63번째에 존재하는 Lys 중 하나 이상이 Arg으로 치환되고 76번째에 존재하는 Gly이 Ala으로 치환된 것이고,
상기 유비퀴틴 -유사 단백질은 Nedd8, SUM0-1, SUMO-2, NUBl, PICl, UBL3, UBL5 및 ISG15로 구성된 군으로부터 선택된 것인，
융합 단백질.
【청구항 4】 제 2항에 있어서， 상기 막 투과 서열 도메인은 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드인， 융합 단백질.
【청구항 5]
제 2항에 있어서，상기 핵-세포질 신호 도메인은 NLS nuc leus locat i on sequence)도메인 또는 NES(nuc leus export sequence)도메인인，융합 단백질.
【청구항 6】
게 5항에 있어서， 상기 NLS 도메인은 서열번호 7 , 서열번호 8 및 서열번호 9로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진
폴리펩타이드인， 융합 단백질.
【청구항 7】 .
거 12항에 있어서, 상기 생체내 안정화 단백질 MT( alpha 1
ant i trypsin) , 혈청 알부민， 혈청 알부민 결합 펩타이드 (serum albumin binding pept ide ; SABP)， Fc 및 PEG(polyethyleneglycol )로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인， 융합 단백질.
【청구항 8】
게 1항에 있어서, 상기 융합 단백질은
아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 및 pl8 단백질올 N—말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질;
아넥신 A2 결합단백질， pl8 단백질 및 p53 단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질;
p53 단백질, pl8 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질; 및
pl8 단백질， p53 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질을 N-말단에서 Ο말단의 순서로 포함하는 융합 단백질
로 이루어진 군에서 선택된 것인， 융합 단백질.
【청구항 9】
거 18항에 있어서， 상기 융합 단백질은
아넥신 A2 결합단백질， p53 단백질 및 pl8 단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서, p53 단백질의 N-말단 방향에 생체외 안정화 단백질, 막 투과 서열 도메인 및 핵-세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나, pl8 단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인， 핵ᅳ세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질;
아넥신 A2 결합단백질， pl8 단백질 및 p53 단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서， pl8 단백질의 N-말단 방향에 생체외 안정화 단백질， 막 투과 서열 도메인 및 핵-세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， p53 단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질;
p53 단백질, pl8 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질을 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서, 아넥신 A2 결합단백질의 N-말단 방향에 생체외 안정화 단백질, 막 투과 서열 도메인 및 핵-세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， 아넥신 A2 결합단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인， 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질; 및
pl8 단백질， p53 단백질 및 아넥신 A2 결합단백질올 N-말단에서 C-말단의 순서로 포함하는 융합 단백질에 있어서， 아넥신 A2 결합단백질의 N-말단 '방향에 생체외 안정화 단백질， 막 투과 서열 도메인 및 핵—세포질 신호 도메인으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하거나， 아넥신 A2 결합단백질의 C-말단 방향에 막 투과 서열 도메인 핵-세포질 신호 도메인 및 생체내 안정화 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 추가로 포함하는 것인 융합 단백질 로 이루어진 군에서 선택된 것인， 융합 단백질.
【청구항 10]
게 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 코딩하는
폴리뉴클레오티드.
【청구항 11】
제 10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터.
【청구항 12】
제 11항의 재조합 백터로 형질전환된 세포.
【청구항 13]
제 12항의 세포를 배양시키는 단계를 포함하는， 제 1항의 융합
단백질을 제조하는 방법.
【청구항 14】
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
【청구항 15】
제 14항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암，
비소세포폐암， 폐의 선암， 폐의 편평상피암， 복막암， 피부암， 피부 또는 안구내 혹색종， 직장암， 항문부근암， 식도암， 소장암， 내분비선암, 부갑상선암, 부신암， 연조직 육종， 요도암, 만성 또는 급성 백혈병， 림프종， 위장암, 췌장암， 교아종， 경부암， 난소암, 간암， 방광암， 유방암， 결장암， 대장암， 자궁내막 또는 자궁암， 침샘암， 신장암, 전립선암， 음문암， 갑상선암， 또는 두경부암인， 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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